KR20140000529A

KR20140000529A - 간암 진단 마커 및 치료제로서의 ｄｂｃ１

Info

Publication number: KR20140000529A
Application number: KR1020120067754A
Authority: KR
Inventors: 남석우; 배현진
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2012-06-25
Publication date: 2014-01-03
Also published as: KR101385783B1

Abstract

본 발명은 간암을 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 간암 진단용 마커, 진단용 키트, 마이크로어레이, 간암 진단용 조성물 및 상기 간암 진단용 마커를 이용한 간암의 진단 방법과 간암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 간암 마커 유전자인 DBC1(deleted in breast cancer-1)은 정상 조직에 비해 간암 조직에서 특이적으로 발현양이 증가되어 있어, 상기 유전자의 발현을 억제할 경우, 간암세포의 증식 억제를 통해 간암의 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있으므로 상기 본 발명에서 발굴한 DBC1유전자는 간암의 진단 및 치료를 위한 타겟으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

간암 진단 마커 및 치료제로서의 ＤＢＣ１{Deleted in breast cancer-1 as a marker for the diagnosis of hepatocellular carcinomas and as a therapeutic agent thereof}

본 발명은 간암을 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 간암 진단용 마커, 진단용 키트, 마이크로어레이, 간암 진단용 조성물 및 상기 간암 진단용 마커를 이용한 간암의 진단 방법과 간암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)은 해마다 50 만명이 사망하는 세계에서 5번째로 일반적인 종양이다(Okuda 2000). HCC 환자의 생존률은 지난 20년에 걸쳐 개선되지 않았고 사망률과 거의 동일한 발병률을 지니고 있다 (Marrero, Fontana et al. 2005). B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 감염되어 발병하는 만성 간염 및 아플라톡신 B1 (aflatoxin B1)과 같은 발암물질에의 노출은 HCC에 대한 주요 위험 인자로 알려져 있다 (Thorgeirsson and Grisham 2002).

또한, 세포주기 기작에서 G1 단계로 진행하는 세포주기 조절물질들의 변화가 간암 형성에 관련되어 있다는 보고도 있다[Hui 등, Hepatogasteroenterology 45:1635-1642, 1998]. 이외에도 DNA 돌연변이와 유전자 발현의 유전적 변화(genetic alteration)등이 간암 환자조직에서 확인된다고 보고되고 있다(Park 등, Cancer Res. 59:307-310, 1999; Bjersing 등, J. Intern. Med. 234:339-340,1993; Tsopanomichalou 등, Liver 19:305-311, 1999; Kusano 등, Hepatology 29:1858-1862, 1999; Keck 등,Cancer Genet. Cytogenet. 111:37-44, 1999).

이와 같이 간암의 발생과 진행은 몇몇 특정 유전자들에 의해 이루어지는 것이 아니라 암의 악성화가 진행되면서 발생하는 세포 내 다양한 신호전달과 조절 기작에 관여하는 많은 유전자들의 복합적인 상호작용에 의한 것임을 알 수 있다. 따라서 몇몇 특정한 유전자들에 중점을 두고 간암의 형성 기작을 연구하는 것은 매우 국한된 연구에 지나지 않기 때문에 정상 간세포와 간암 세포주들 사이의 다량의 유전자 발현 정도를 비교 분석하여 간암에 관련된 새로운 유전자들을 발굴할 필요가 있다.

이러한 최근의 분자적 고찰은, p53, 베타 카테닌 및 AXIN1와 같은 종양 억제 유전자 또는 종양발생 유전자의 유전자 변형이 HCC에 대한 진행과 연관되어 있을 가능성을 발견하였지만(de La Coste, Romagnolo et al. 1998; Satoh, Daigo et al. 2000; Pang, Ng et al. 2003), 이러한 체세포 돌연변이의 빈도는 실제 HCC에서는 낮게 나타나는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이러한 유전적 변화가 개개인의 종양에 대한 임상적 특징에 반영되는지도 불분명하다. 그러므로 대부분의 환자에서 HCC의 기초를 이루는 유력한 분자적 기전에 대한 연구가 여전히 과제로 남아 있는 실정이다 (Nam, Park et al. 2005).

따라서 보다 정확하고 간암의 발병원인을 분석하고 간암을 예측 또는 진단할 수 있는 새로운 마커의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 간암(HCC) 조직에서 DBC1(deleted in breast cancer-1)의 발현이 정상 조직과는 차별되게 발현됨을 확인하였고, 나아나 DBC1의 발현을 억제하였을 경우, 간암 세포의 증식을 억제함을 통해 간암의 발병을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2011-0101119호

따라서 본 발명의 목적은 간암을 진단할 수 있는 마커로서 DBC1(deleted in breast cancer-1) 유전자를 이용한 간암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 DBC1(deleted in breast cancer-1)의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 간암 마커인 DBC1(deleted in breast cancer-1)의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는 간암의 발병을 예측 또는 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 DBC1(deleted in breast cancer-1) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 물질은 DBC1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 항체일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DBC1 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간암은 인간 간세포암(HCC, hepatocellular carcinoma)일 수 있다.

또한, 본 발명은 DBC1(deleted in breast cancer-1)의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 DBC1을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열을 갖는 siRNA duplexes일 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 간암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 DBC1(deleted in breast cancer-1) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간암의 발병을 예측 또는 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계는 추가적으로 SIRT1(sirtuin type deacetylase) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 더 측정할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 DBC1 및 SIRT1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자들(DBC1 및 SIRT1)이 코딩하는 단백질의 수준을 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 DBC1 및 SIRT1의 수준이 모두 증대되는 경우 간암 양성으로 판정될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 간암 마커 유전자인 DBC1(deleted in breast cancer-1)은 정상 조직에 비해 간암 조직에서 특이적으로 발현양이 증가되어 있어, 상기 유전자의 발현을 억제할 경우, 간암세포의 증식 억제를 통해 간암의 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있으므로 상기 본 발명에서 발굴한 DBC1유전자는 간암의 진단 및 치료를 위한 타겟으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 두 개의 광범위한 간암 환자 집단(GSE14520, GSE25097)에서 SIRT1 및 DBC1 유전자 발현 양상을 나타낸 것이다.
도 2는 인간 간세포암(HCC) 조직에서 SIRT1 및 DBC1의 비정상적인 발현 정도를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과이다.
도 3은 DBC1와 SIRT1 사이에 상호관련 여부를 조사하기 위해, 공동-면역침강법 및 웨스턴 블랏팅법을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 간암세포주(HepG2, SNU-182)에서 SIRT1 또는/및 DBC1의 발현 저해에 따른 세포 생존율을 MTT 에세이를 통해 분석한 결과이다.
도 5는 간암세포주인 SNU-182 세포에서 siRNA를 도입하여 DBC1을 저해한 경우, 에토포시드-매개된 p53 과아세틸레이션(etoposide-induced hyperaceylation)에 미치는 정도를 웨스턴 블럿을 통해 분석한 결과이다.

본 발명은 DBC1(deleted in breast cancer-1) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 새로운 마커를 연구하던 중, 간암 세포 또는 간암 조직에서 정상에 비해 특이적으로 발현이 증가되는 DBC1의 유전자를 발굴하였고, 이를 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있다는 사실을 확인하였다. 따라서 본 발명은 DBC1 유전자의 간암 진단 마커로의 신규 용도를 제공함에 그 특징이 있다.

DBC1(deleted in breast cancer-1)은 KIAA1967로도 알려져 있는 유전자로서 유방암에서 흔히 결손되는 것으로 보고되고 있으며, 8p21 염색체 상에 추정되는 종양 억제 유전자로 제안되어지고 있다. DBC1과 관련된 몇몇 연구를 통해, DBC1은 다양한 인자들과 결합하는 과정을 조절함으로써 세포 생존을 조절할 수 있는 것이 알려져 있다.

특히 DBC1은 SIRT1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1) 활성을 음성 조절(negative control)함으로써 p53-매개된 세포자연사(apoptosis)를 유도하는 것으로도 알려져 있지만, 간암과 관련하여 DBC1 및 SIRT1의 상호작용에 대해서는 지금까지 알려진 바가 없다.

본 발명에서는 간암 조직 및 간암 세포주에서 DBC1과 SIRT1이 동시에 과발현됨을 확인하였고, 또한 DBC1이 SIRT1의 활성을 음성적으로 조절하지 않는 것을 최초로 규명하였다. 따라서 기존에 보고된 바 있는 DBC1의 종양 억제자로의 역할과는 전혀 상이한 결과를 확인하였다.

본 발명의 하기 실시예1에서는, 간암 조직에서의 DBC1 및 SIRT1의 발현 양상을 조사한 결과, 비-암성 조직들과 비교하여 간암 조직에서 상기 DBC1 및 SIRT1 유전자의 과발현을 확인하였으며, 특히 SIRT1 단백질의 과발현 이외에 DBC1이 과발현되는 것으로 나타나 기존에 보고된 바 있는 DBC1의 종양 억제자(DBC1이 SIRT1의 음성 조절자로서 기능하는 것)로의 역할과는 전혀 상이한 결과를 나타냈다(도 1 및 도 2 참조). 또한 DBC1 및 SIRT1 사이의 상호작용 여부를 공동-면역침강분석법 및 웨스턴 블랏팅을 통해 분석한 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이 간암 세포에서 DBC1 및 SIRT1이 상호관계가 있는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 하기 실시예<2-1>에서는 siRNA 도입을 통한 SIRT1 또는/및 DBC1의 발현 저해에 따른 간암세포의 생존율을 측정한 결과, SIRT1 또는 DBC1 유전자 각각을 저해하는 경우, 간암세포주인 HepG2, SNU-182에서 모두 종양 세포 성장이 두드러지게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, DBC1 발현이 저해되는 경우, 상기 두 개의 세포주에서 세포 생존율이 두드러지게 감소되는 것으로 나타났다. 그러나 DBC1 및 SIRT1의 양쪽을 동시에 저해하는 경우, 상승적인 종양 세포 억제 효과는 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

또한, 본 발명의 하기 실시예<2-2>에서는 DBC1의 SIRT1의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 DBC1의 억제에 따른 SIRT1 디아세틸라아제 활성 억제 여부를 실험한 결과, 간암세포주인 SNU-182 세포에서 DBC1을 저해한 경우, 에토포시드-매개된 p53 과아세틸레이션(etoposide-induced hyperaceylation) 상태에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이는 폐암세포주인 A549 세포에서 DBC1을 저해한 경우, 에토포시드 처리에 반응에 따른 p53의 아세틸레이션 상태가 감소되는 것과 상반되는 결과이다.

따라서 이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 상기 본 발명에 따른 마커 유전자인 DBC1의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 양을 측정함을 통해 간암의 여부를 진단할 수 있다는 사실을 알 수 있었고, 더 나아가 간암세포에서는 DBC1이 SIRT1 활성에 기능적인 영향을 미치지 못하는 것을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 DBC1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 유전자의 발현 수준은, 바람직하게 상기 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 DBC1유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 상기 DBC1의 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다. 바람직하게 상기 DBC1 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.

상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 상기 본 발명의 DBC1 마커 유전자로부터 발현된 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.

상기 “항체”는 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 제조된 것을 사용할 수 있는데, 상기 항체의 제조는 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 간암 진단용 마커 또는 상기 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 간암 진단용 키트는 상기 마커 유전자인 DBC1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명의 간임 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 간암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 간암 진단용 마커를 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 DBC1 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 DBC1 마커 유전자의 발현수준 또는 그 발현 단백질 수준을 측정하는 방법을 통해 간암을 예측 및 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 상기 방법은, (a) 간암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 DBC1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 간암의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 마커 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 간암 환자 또는 간암 의심환자에서의 마커 유전자의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 간암의 발병 여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

보다 구체적으로 상기 간암의 발병을 예측 또는 진단하는 방법은 본 발명에 따른 간암 마커 유전자인 DBC1 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 증가되었을 경우, 간암이 유발된 것으로 판단할 수 있다.

또한, 본 발명의 일실시예에서, (a) 단계는 추가적으로 SIRT1(sirtuin type deacetylase) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 더 측정할 수 있다.

SIR2(silent information regulator 2) 유전자 패밀리 멤버는 원시세균에서 진핵세포까지 매우 잘 보존되어 있다. Sir2 단백질은 NAD-의존성 단백질 탈아세틸화효소로서 기능하며, 히스톤 아세틸화를 조절함으로써 사일런싱을 매개하는 것으로 생각된다. 인간은 시르투인(sirtuin)이라 불리는 Sir2에 유사성을 갖는 7개의 단백질을 가지며, Sir2의 인간 동족체인 SIRT1이 p53 종양 억제제에 결합하여 이를 조절한다는 것이 밝혀졌다 (Luo J 등, Cell 107: 137-148, 2001; Vaziri H 등, Cell 107: 149-159, 2001; Cohen HY 등, Science 305:390-392, 2004; 및 Brunet A 등, Science 303: 2011-2015, 2004). 즉 SIRT1은 p53 단백질을 탈아세틸화하며, p53 단백질의 전사인자로서의 능력을 약화시킨다고 알려져 있다. 그러나 SIRT1 활성을 야기하는 분자적 조절 기작들은 여전히 규명되지 않은 상태이다.

본 발명의 하기 실시예1에서는 간암 조직 및 간암 세포주에서 DBC1 및 SIRT1 유전자 발현이 동시에 증대되는 것을 확인할 수 있었으며(도 2 참조), 또한 하기 실시예<2-1>에서는 siRNA를 이용하여 DBC1 또는/및 SIRT1 유전자 발현을 저해시킨 경우 간암 세포의 세포 생존률이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

따라서 이러한 결과를 통해, DBC1 및 SIRT1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자들(DBC1 및 SIRT1)이 코딩하는 단백질의 수준을 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 DBC1과 더불어 SIRT1의 수준이 모두 증대되는 경우 간암 양성으로 판정할 수 있다.

나아가 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 간암 진단용 마커 유전자 또는 그 발현 단백질을 포함하는 간암 세포 또는 조직에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 선택된 유전자의 발현양 또는 그 발현 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, 상기 선택된 유전자의 발현양 또는 그 발현 단백질의 양 또는 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 간암을 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 유전자 또는 단백질을 포함하는 간암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기시료는 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 올리고뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA), shRNA 또는 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가 또는 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 간암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.

상기에서 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 DBC1(deleted in breast cancer-1)의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

바람직하게 상기 DBC1의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드 서열번호 1로 표시되는 DBC1의 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, siRNA 또는 shRNA일 수 있고, 상기 siRNA는 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열을 갖는 siRNA 이중나선(duplexes)일 수 있다.

본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "RNAi"는 RNA Interference를 지칭하는 말로, 우리말로 풀이하면 RNA 간섭이라는 뜻을 지니고 있다. RNA 간섭은 대부분의 생물체 사이에서 잘 보존되어 있는 특이적 유전자억제 현상이다. 바이러스 감염에 대한 방어나 트랜스포손을 억제하기 위하여 혹은 비정상적 mRNA를 제거하기 위하여 세포가 사용하는 유전자 감시기작의 일종으로 생각되고 있다. 특히, small RNA에 의한 유전자 억제현상을 넓은 의미에서 RNA간섭이라 하고, 좁은 의미의 RNA 간섭은 siRNA에 의한 mRNA 분해 현상을 뜻한다. 또한 RNA간섭은 siRNA를 이용한 유전자 억제 실험 기술을 뜻하기도 한다.

본 발명에서 "siRNA라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(상기 마커 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 상기 마커 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.

또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.

또한, 상기 마커 단백질의 발현 및 활성을 증가시키거나 감소시키는 물질로서 상기 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 간암의 예방 또는 치료용 조성물은 간암을 치료할 수 있는 약학적 조성물로서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 투여란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 상기에서 유효량 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 >

조직 샘플

10개의 간암 조직 및 간암 조직 주변의 정상 조직을 서울 연세대학교 의과대학으로부터 얻었다. 본 연구는 한국 가톨릭 대학의 IRB(institutional review board)로부터 승인 받았으며(CUMC11U010), 헬싱키 선언에 따라 모든 환자로부터 동의를 받았다.

세포 배양

간암 세포주(cell line)인 인간 HCC 세포주, HepG2(wt p53), SNU-182 (mt p53), 및 비소세포폐암 세포주 A549(wt p53)는 ATCC(american type culture collection, manassa, VA)로부터 구입하였다. 상기 세포들은 10% FBS(sigma, St Louis, MO) 및 100 units/ml의 페니실린-스트렙토마이신(invitrogen, carlsbad, CA)이 첨가된 RPMI1640(Lonza, Walkersville, MD) 배지에서 배양하여 이후 실험들에서 사용하였다.

siRNA 를 이용한 세포 형질전환

상기 세포 배양을 통해 준비된 간암 세포주들은 이들 세포내에서 SIRT1과 DBC1 유전자 사일런싱을 위해 작은 간섭 RNA(siRNA)를 이용하여 형질전환시켰다. SIRT1, DBC1의 유전자 사일런싱을 위한 특이적인 siRNAs(표 1 참조) 및 음성 대조군-siRNA는 Ambion(Austin, TX)로부터 구입하였다. SIRT1 발현 플라스미드인 pcDNA 3.1-SIRT1-myc-His는 Dr. Kouzarides(University of Cambridge, UK)로부터 얻었다. 유전자 사일런싱을 위해 SIRT1 및 DBC1의 siRNAs 최종 농도는 각각 50 및 200nM를 사용하였다. SIRT1 과발현 유도를 2μg의 SIRT1 발현 플라스미드들을 사용하였으며, 대조군으로는 Mock(empty)을 사용하였다. 그리고 모든 형질전환은 제조자의 지시에 따라 리포펙타민 2000TM 시약(Invitrogen)을 이용하여 수행하였다. 시그마에서 구입한 20μM의 에토포시드(etoposide)를 12시간 세포에 처리하는 과정을 통해 DNA 손상을 유도하였다.

SIRT1, DBC1의 유전자 사일런싱을 위한 특이적인 siRNAs

유전자	염기서열		서열번호
DBC1	센스	5'-CAGCUUGCAUGACUACUUU-3'	2
DBC1	안티센스	5'-AAAGUAGUCAUGCAAGCUG-3'	3
SIRT1	센스	5'-UGCTUGUGAGGCUCUAUCC-3'	4
SIRT1	안티센스	5'-AAAGUAGUCAUGCAAGCUG-3'	5

웨스턴 블랏 및 공동 면역침강법( co - immunoprecipitation )

조직 내 단백질과 세포용해물은 1 mM의 phenylmethane-sulfonylfluoride (PMSF, Sigma) 및 1X Complete protease inhibitor cocktail tablets(Roche, Mannheim, Germany)이 첨가된 Radio Immunoprecipitation (RIPA) 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.25% sodium deoxycholate)를 이용하여 준비하였다. 웨스턴 블랏을 위해 먼저 SDS-PAGE를 통해 단백질(10μg)을 분리한 후, 폴리비닐리덴 다이플로라이드(PVDF, Bio-rad Laboratories, Hercules, CA) 멤브레인으로 이동시켰다. 이후 항-SIRT1, 항-p53, 항-GAPDH(santa cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 항-DBC1(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) 및 항-acetylated p53(cell signaling, Danvers, MA)을 이용하여 상기 멤브레인과 반응시켰다. ECL plus 웨스턴 블랏팅 검출 시스템(Millipore, Billerica, MA)을 이용하여 검출 시그널을 분석하였으며, LAS 3000 이미지 분석기(Fuji Photo Film, Japan)를 이용하여 단백질들의 발현 정도를 확인하였다.

면역침강법을 위해 sodium deoxycholate free RIPA buffer로 세포들을 용해하였으며, 세포 용해물(1~2mg)은 1~2μg의 항-his(Applied Biological Materials, BC, Canada) 또는 항-SIRT1(santa cruz)과 함께 4에서 밤새도록 반응시킨 후, 50μl의 protein-A-agarose(millipore)를 첨가하여 4에서 4시간 동안 회전시키면서 반응시켰다. 샘플들은 적절한 1차 항체로 웨스턴 블랏팅을 통해 분석되었다.

MTT 에세이

6-웰 플레이트에 SNU-182 세포들을 분주한 다음, 각각의 siRNA로 세포들을 형질전환시켰다. 그리고 24시간이 경과한 후, 상기 세포에 에토포시드(etoposide)를 12시간 동안 처리하였다. 에토포시드 처리 후, 0.5mg/ml 농도의 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 시료를 세포에 처리하여 37에서 1시간 동안 배양하였다. 모든 측정들은 3번씩 수행되었으며, 각각의 실험들은 적어도 3번씩 반복하였다.

< 실시예 1>

인간 간세포암( HCC ) 조직에서의 DBC1 및 SIRT1 의 비정상적 과발현

<1-1> 간암 조직에서의 SIRT1 및 DBC1 의 발현 양상

본 실험에서는 간암에 있어서 SIRT1 및 DBC1의 발현 양상과 이들의 상호작용 여부를 확인하기 위해, 두 개의 광범위한 간암 환자 집단에서 SIRT1 및 DBC1 유전자 발현을 분석하였다. 상기 두 개 집단의 마이크로어레이 데이터는 National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) database (accession numbers GSE14520, GSE25097)를 이용하였다.

그 결과 도 1에서 나타난 바와 같이, 두 개의 광범위한 간암 환자 집단에서 SIRT1 및 DBC1 유전자 발현은 두드러진 차이를 나타내지 않았다.

본 발명자들은 또한 인간 간세포암(HCC) 조직 및 그 주변의 비-암성 조직들을 한쌍으로하여 무작위적으로 선별된 10개의 조직들에서 SIRT1 및 DBC1 단백질 과발현 여부를 웨스턴 블랏팅을 통해 조사하였다.

그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, SIRT1 및 DBC1 단백질은 비-암성 조직과 비교하여 간세포암(HCC)에서 두드러지게 과발현 되는 것을 확인할 수 있었는데, 이는 기존에 보고된 바 있는 DBC1의 종양 억제자(DBC1이 SIRT1의 음성 조절자로서 기능하는 것)로의 역할과는 전혀 상이한 결과를 나타내는 것이다.

<1-2> SIRT1 및 DBC1 의 상관관계

상기 실시예<1-1>를 통해, 비-암성 조직과 비교하여 간암 조직에서 SIRT1 및 DBC1 단백질이 두드러지게 과발현되는 것을 확인할 수 있었는데, 이는 기존에 보고된 DBC1의 SIRT1 음성 조절자로서 기능과는 다른 결과를 나타내는 것이다. 따라서 본 발명자들은 역의로 DBC1와 SIRT1 사이에 상관관계가 있을 것으로 예상하였으며, 이에 본 실험에서는 간암세포주에서 웨스턴 블랏 분석 및 면역침강법을 이용 DBC1와 SIRT1의 관련성을 조사하였다.

웨스턴 블랏 분석 및 면역침강법은 상기에서 기술한 내용과 동일하게 진행되었다. 간략하게는 간암세포주인 SNU-182 세포에 1μg의 His-tagged SIRT1 발현 플라스미드(pcDNA3.1-STRT1-myc-His plasmids)를 도입하였으며, 플라스미드가 도입된 세포들을 배양 후 세포를 용해하여 세포용해물을 수득한 후 항-his 항체를 이용하여 면역침강법을 실시하였다. 그리고 웨스턴 블랏팅을 통해 침강된 단백질들을 검출하였다. 본 실험에서는 또한 세포 내 DBC1 및 SIRT1 사이의 상호작용 여부를 공동-면역침강분석법 및 웨스턴 블랏팅을 통해 분석하였는데, 항-SIRT1 항체를 이용하여 면역침강한 후 항-DBC1 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 실시하였다.

그 결과 도 3A에서 나타낸 바와 같이, 대조군인 Mock(pcDNA3.1-myc-His plasmids)과 비교하여 His-tagged SIRT1 발현 플라스미드(pcDNA3.1-STRT1-myc-His plasmids)를 도입한 세포용해물에서 항-his 면역침강법을 통해 수득한 침전물 내에 DBC1 단백질이 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 3B에서 나타낸 바와 같이, 항-SIRT1 항체를 이용하여 면역침강한 후 항-DBC1 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 실시한 경우도, 상기 도 3A의 결과와 동일하게 SIRT1과 동시에 DBC1이 검출되는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과들은 간암 세포에서 DBC1 및 SIRT1이 서로 상호작용한다는 것을 나타낸 것이다.

< 실시예 2>

SIRT1 및 DBC1 발현 억제를 통한 간암세포주의 성장 억제 효과

<2-1> SIRT1 및 DBC1 의 발현 저해에 따른 간암세포의 생존율

본 실험에서는 간암세포주(HepG2, SNU-182)에서 SIRT1 및 DBC1의 발현 저해에 따른 암 세포 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 유전자에 특이적인 siRNA를 이용하여 SIRT1 및 DBC1의 유전자 발현을 저해한 후, 간암세포 생존율을 MTT 에세이를 통해 측정하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, siRNA 도입에 따른 SIRT1 또는 DBC1 유전자의 발현을 각각 저해하는 경우, 간암세포주인 HepG2, SNU-182에서 모두 종양 세포 성장이 두드러지게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, DBC1 발현이 저해되는 경우, 상기 두 개의 세포주에서 세포 생존율이 두드러지게 감소되는 것으로 나타났다. 그러나 DBC1 및 SIRT1의 양쪽을 동시에 저해하는 경우, 상승적인 종양 세포 억제 효과는 나타나지 않았다.

<2-2> DBC1 의 억제에 따른 SIRT1 디아세틸라아제 활성 억제 여부

이전 연구에서, 폐암세포주인 A549 세포 및 골육종세포주인 U20S 세포에서 siRNA에 의한 DBC1의 저해하는 경우, SIRT1 디아세틸라아제 활성을 억제함으로써 에토포시드-유도된 p53 아세틸레이션을 약화시키는 것으로 보고되었다. 따라서 본 실험에서는 간암세포에도 DBC1이 SIRT1 활성에 기능적 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여 간암세포주인 SNU-182를 이용하였다.

먼저 폐암세포주인 A549 세포 및 간암세포주인 SNU-182 세포에서 에토포시드-유도된 과아세틸레이션(etoposide-induced hyperaceylation)을 수행하였다. 이를 위해 먼저 A549 세포 및 SNU-182 세포에서 SIRT1 및 DBC1 발현 저해를 위해 siRNA(50 도는 200nM)를 도입한 후, 20μM 농도의 에토포시드를 12시간 동안 처리하여 p53의 과발현을 유도하였다. SIRT1 및 DBC1의 넉다운 및 p53 아세틸레이션은 웨스턴 블랏을 이용하여 분석하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 폐암세포주인 A549 세포에서 DBC1을 저해한 경우, 에토포시드 처리에 반응에 따른 p53의 아세틸레이션 상태가 감소되는 것으로 나타났다. 이에 반해 SNU-182 세포에서 DBC1을 저해한 경우, 에토포시드-매개된 p53 과아세틸레이션 상태에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

이러한 결과를 통해, 간암세포에서는 DBC1이 SIRT1 활성에 기능적인 영향을 미치지 못하는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

DBC1: deleted in breast cancer-1
SIRT1: silent mating-type information regulation 2 homologue 1

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Deleted in breast cancer-1 as a marker for the diagnosis of hepatocellular carcinomas and as a therapeutic agent thereof <130> PN1206-317 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15840 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DBC1 polynucleotide sequence <400> 1 gcacttccgc tccccagttg ccgcgggatg gcaagccggc gtgggggaag ggagaggtcg 60 gcggagacga gggagggacc atatccggga gagcggcagc ttccgaccag tggtcgcgct 120 tccggagagg cgcttccggt ggcggcggca gcagcggctg tggtggttcc gggtgtcttt 180 gtccccccgg tgtcgctgcc ctggcccgca ggtgggttgg ggggccccct gccgcccctc 240 tgccccttcg cccctccgcc cctccgctgg ccgaggggct gcgagggccg ggcggcgaag 300 atgcgtgggg cgcggaaggg gccgagcccc tctttggact gcaagtcccg tctccctggc 360 aacggcctcg gccttggggg cgggcgggag gaggagaaac cgcgcgcctc agtcctccct 420 tggtggcctc gccgcggctc tgctgggaga cccggcgctg gcggctgctg aggccggagc 480 ggagggcccg ggagcgtggg agcaggaggg tggcgcgcag ccggtttcgc gtttggtcgg 540 ccagggagct gccttcccac cagccggtcg aggaaacaac gggtcgggct tccggggaga 600 gggcccacac agtctcctcg ccggcaccgg cctcctccat ttttccgggc cttgcgtgga 660 gggttttggc ggatgttttt gaacgaagga atgtcatcgg ggctctctcg agcccctcac 720 cccgccagct actctggggg tggcgtggca tagtgagagg agcgctaagt tgttgggagg 780 cctgggtgtg agtagcagtt ttgtcactac ctggttatgt ggccccgggc aagtctcttg 840 atctctctga gcatcagttt ccttgtctgt aaaacagcat gacagtatca tgcaccacta 900 ggttattgtc agggcaaact ggaacaatgt aatttcttgt ttcatttctt tcttctctat 960 attctctcca tccattgctt tcattcattc ttattaccca cctccctgtt ttccgaaata 1020 tccttactta agattctcca cttttccggg tatagatgga aatttccctt ataagctgtt 1080 aatttctttc tttttggatt gaagcctttt ccccacgact ctgaaagagg acagcgttcc 1140 caatgtccca gtttaagcgc cagcggatca acccgcttcc agggggacgc aacttctcag 1200 gtgatcactg ttctccctac ctggcctcat cctgggaagt atgtgctctg gagttagttt 1260 ggggtttccc tggtggagag caatttgctg ctgatgttcc tctggaaagc aggagatgcc 1320 cacagtgatt gccagtgaag ctctgtggag gagctggctg gagctgtagc ctttggattt 1380 accacatcct ttggttgact cgtgcttaag 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tggggccttc tggcttgtgt gctgacagtg 2280 tggtgaaggg ccgtctgccc cagctgggtg agaaggtgct ggtgaaggct gcatacaacc 2340 caggccaggc agtgccctgg aatgctgtca aggtgcaaac gctctccaac caggtattca 2400 tatctcctta gcatgtgcat tggaaaggga agggatggaa gcccctgtgc cctgacagct 2460 gggcaaaacc ctgacttttg tcaggggggt gggactgcat ctttccaagg tagtgagtgc 2520 ctcaaccatg gggtcccctg aatttcctgg ctcctgttct gcagccccta ctgaagtccc 2580 cagcacctcc tcttctgcat gtagcagccc tgggccagaa gcaagggatc ctgggagctc 2640 agcctcagtt gatcttccag cctcaccgga ttcccccact ctttcctcag aagcgtgagt 2700 acgagtggca ctgttgttgg gtgtggcatt atggggtagt ttagatcaat ggactttcag 2760 gttgctgctc ttagcataga ggtgggtact tctatgtact ggaagaaagg tgggcaatct 2820 ggataggtgt ttagggtttt tttttttttt ttttttgatg gagtctcgct ctgttgccca 2880 ggctggagtg caatgacacg atctcggctc attgcaacct ctgcctcctg ggttcaagca 2940 attctcctgc ctcagcttcc cccgtagctg ggattacagg cgcccgccac catgaccggc 3000 taattttttt tgagagaaag tcttgctctg tcacccaggc tagagtacag tggcgcgatc 3060 tcggctcact gcaagctccg cctcctgggt 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agtttctcag cttttaattt atgaaggact 5640 cagccacatt aatgttttgc atggaagcca agctttattt tgaattcctg gctttgggat 5700 gcagagaaca atgtctccat tgagctgcta ctgctgtgct gtggttttta gacaggtgta 5760 cccagctggg ctctgctgct gcaagtcctg agaggtcagc ccctggtgct gccttacaac 5820 ctcctgacaa tgtacaggaa gcggaggaaa gtggccacac agtgtacagc gttgagtgga 5880 ccataacagt ttagctagag gccgacagca ttcctgcgag ctggagagtt gtcaaagtgg 5940 ctttggcatg ggtcttctat tagaaacatg ggctactgac atcccatcgg ggctagagaa 6000 gaaggccact tttggatgga gatgctcatg cacatggaag tgaccaaggc caacagaaaa 6060 gagcaggcat catgataaat ctcttcagct tagtcactgg ggtgtgaaca gggaaatgac 6120 ccaggcaggt ctaaaaggca gaacaagaac cttctggtga atacaatcaa ctcagttacc 6180 caggcacaga gaaatggcag tgggttttat ttctctcatg tgacatgggg ggttttcccc 6240 ttatcagtct ggcacgttat aatgaatggt ctaaaggttt tttctcctca actattttta 6300 tttattgtac ccatatctat tgcacttata acgtagttat agtgtaatac tgtggtgact 6360 tattataaaa atgtgtaaag cagtacatgc tattatataa aattaaaata atataaatac 6420 ataaaattaa aataatataa atacgtaggc caggcgcggt ggctcatgcc tgtaatccta 6480 gcactttggg aggctgaggc gggcggatta cttgaagtca ggagttcaaa accagcctgg 6540 ccaagatggt gaaaccctga ctctactaaa aatacaaaaa ttagccaggc atggcggtgg 6600 gtacctgtaa tcccagctac tcgggaggct gaggcaggag aattgcttga acccgggagg 6660 cagaagttgc agtgagctga gatcacgcca ctgcattcct gcctgggcaa cagagcaaga 6720 ctctgtctca aaaaaaaaaa aaaaaaaagt atatatatgt gtgtgtgtgt gtgtatgtgt 6780 gtgtatatat gtgtgtatat atgtgtgtgt gtatacatat gtgtgtgtgt atatatatat 6840 gtaaaaatat gtgtggtttc taccttcttt ctctttaaag gtaactgttg ttaacaggta 6900 ggtattaaag aattttagaa aataattttg aaaaggaaaa tctcttgcca ctcttttctc 6960 ctgtgttcta gtttttatct atacatgtgc atactttttg caattttaat cttacagttc 7020 aaattatttt tgtgtattta taaacagttt tccatattgc agcataatcc tgagtgtttt 7080 aatggctgcg tgattgtttg tatttactat gaaaatttgg gtattgctga gtatgtattt 7140 ggttttttac tctcagttta tgctgcttca tatttttcca ctatgtgtag tctttcttct 7200 tcttttgaat taactttctt gggacaaatt ttcaagagtg taattactgg agcaaatggt 7260 ttgagtgttt ttatgacttt aatgtgtatt 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cttggtctgt agctttcctg ttgtgtcttc aaagcttggt 10680 tcgcagtgtg tgctcattga gtgctgactg gaaactgaag cccttgcctg tgaacgtggt 10740 gtctgcgtgg agttgtcact aaagaagtta gtacctcctt ttgccatgtg caggtggcgc 10800 tttgccgagt ttcagtacct gcagccggga cccccccggc ggcttcagac agtggtggtg 10860 tacctgccgg atgtctggac catcatgcct actttggagg agtgggaggc cctgtgccag 10920 cagaaagctg cagaggcagc tcccccaacc caggaggcac aaggggtaag gctgtgcctt 10980 agccagcagc gggggatata ggtggcctaa tcccgggacc cagagggtct catttcagct 11040 gttgtcacag gaaacggagc ctactgaaca ggcacctgat gccttggagc aagcagcaga 11100 cacttctaga cggaacgcag aaactccaga ggccaccaca cagcaggaaa cggacactga 11160 tctcccagag gcccctccac cccccctaga acctgctgtc atcgcacgcc ctggctgtgt 11220 aaacctgtcc ctccatggga ttgtggagga tcggaggcca aaggaaagga tctcttttga 11280 ggcaggtgtc aagagtcttg gggaggctgt gggctgggat ttgtgggcct gaagcagtct 11340 ttcttcctga tgctcatgga ccctcccacc tccccatcag gtgatggtgc tggccgagct 11400 gtttctggag atgctccaga gggattttgg ctatagagtt tataagatgc tactgagcct 11460 tcctgaaaag gtcgtgtccc cacctgaacc tgagaaggag gaggcggcca aggaagaagc 11520 caccaaggag gaagaagcca tcaaagagga ggtggtcaag gagcccaagg atgaggcaca 11580 gaatgagggc ccggctacag agtcagaggc cccgctggtg agtaccctgc cacctcgggc 11640 tgtcatagtg cttaccgtga ccgcgcacct ttaccccggg ctctgttccg agcgcttcct 11700 gtgccttagc tcattccctg cacccttgct cggcatggac tgaggccgca cagctagtaa 11760 gtagcacacc tagtgcaagg gaaggtggcg cagagtgcag ggagcatggc tgagcagcct 11820 gacagcacag aaacccttgt cactgagaac gcttggcaga gtggggtgct ttgattgcct 11880 gatggttaac tagaaaattt tgtaggccgg gcgctgtagc tcacccctgt aatcccagca 11940 ctttgggaga ccgaggtggg cagatcatga ggtcaggagt ttgagaccag cctggccaat 12000 atagtgaaac gccgtctcta ctaaaaatac aaaaattagc cgggtgtggt ggtgcatgcc 12060 tgttttctca gctactcggg aggctgaggc aggagaatcg cttgaacccg ggaggcggag 12120 gttgcagtga gccgaggtcg cgccactgca gtccagcctg ggcgagagag taagactctc 12180 tgtctcaaaa aagaaaaaaa aagatttgta aaccttttct aaaatactag tctgcttttt 12240 tttttttttt tttttttttt tttttgggga gatggagtct tgctctgtca cccaggctga 12300 agtgcagtgg cgcaacctcg gctcactgca acctctgcct cccaggttca aacgattctc 12360 ctgcctcagc ctctctccag taggtgggat tacaggcacc taccaccatg cccagctaat 12420 ttttgtagag atggggtttc accatgttgg cctggctggt cttgaactcc tgacctcagg 12480 agtgctggga ttacaggtgt gagccaccat ggccagctgc tgcttgttta aatactatca 12540 atcaaatgaa tgtaatttct tctgggacca agatcaactc ctgaggaaaa aagcccaggt 12600 gtctggcgat gccctggcat gctctgaatc ccacttaatg aaattaaata catgaaatga 12660 gacggtatct gtagagccct ccatacagtg cctggggcat agttgatact caggtgtcag 12720 ccatgcttac tattggtaat tatggtaact gcctgccttt tccttataac ctttgtctgc 12780 ctctgtagaa ggaggatggg cttttgccca aaccactctc ttctggggga gaggaagaag 12840 aaaaaccccg gggcgaggct tctgaggacc tgtgtgagat ggccctggac ccagaactgt 12900 tgcttctgag ggatgatgga gaggaggagt ttggtatgtt gagtggtgag aggggagctt 12960 gcaggcttgg gatgtggctt tccacctgtg gccaagctgg ttttcatttt tgtactgtgg 13020 agttgggtgg gccctgctct ccatttatct tggcctttct gtagcaggag caaagctgga 13080 ggattcggag gtccggtccg ttgcctcaaa ccagtcagag atggagttct cttcacttca 13140 ggacatggtg aggcctcttc tcgaccactc tgggtctcag tggtggtgag gcttggcaag 13200 gcctctggcc cactcctggg agaaggatgc ttaccagtga cttcctttct tgatggaccc 13260 aacacacagt gtggtccttg gctcatggaa gggcacgttc ataggctcca ggagaacatt 13320 tcagtgtctg ttggggtgaa tgggagaggg gtatttgatc ctctcctgag agaggagcac 13380 aggagctttt gccaaagtgg gccagagagg aaggctggct tgggcgtgat gaacatcagg 13440 caaggtgctt gatgttttgt tttttagaga cggggtttcg ctgtgttgcc caggctggag 13500 cacagtggtt attcacaggc atgaatatag tgcactgcag cctcgaactc ctgggttcaa 13560 gtgattctcc tgccttagcc tccccagcag ctgggacttc aggcatgcat cactgcatgt 13620 ggcccaagcc actggattct ggacaggctg aatcctgggc gatagagcca ctgagggaac 13680 tatttgcaaa tcctgctcat ctttgttttc tttgcagccc aaggagctgg atccctctgc 13740 tgtgctcccc ttagactgtc tgcttgcttt tgtgttcttt gatgccaact ggtgtggcta 13800 cttgcaccgg cgagacttag agaggatcct ccttaccctt gggatccggc tcagtgcaga 13860 gcaggtacct tctttcctct gccccagcac atgggcacag gcctgcactt actcctgctc 13920 taggttcccg cccatggcca gggtcgggga cggggccttc tgatcagcag atgtgttttc 13980 tgcaggccaa gcagctggtc agcagggtgg tgacccagaa catctgccag taccggagcc 14040 ttcagtacag ccgccaggag ggcctggatg gtggccttcc cgaggaggtg ctcttcggta 14100 tgttctgggg ccctgcagcc ttcctggggc acgggcaggg caggctgccc tctctggaga 14160 ctccatcctg aattcttttt cacggttctc tctaggaaac ctggacctgc tgccccctcc 14220 tgggaaaagc acgaagccag gtgctgcccc cacagaacac aaagccttgg tgtcccacaa 14280 tggcagcctg attaacgtgg ggagcctgct gcagcgcgcg gagcagcagg acagcggccg 14340 gctctaccta gagaacaaga tccacacact ggagctgaag ctgggtgagg gcctggggct 14400 gcagccacca tggggtcaca tgcagaccag tagggaacct gctgcttagg ctcaggccct 14460 gccctgtgct ctgggccttg atggagcagc cgtccccgtt tccttctcca ccttgcagag 14520 gagagccata accgtttctc agccactgaa gtaaccaata agacgctggc ggcagagatg 14580 caggagctgc gagtccggct ggcggaggcc gaggagaccg cccggacggc ggagcgacag 14640 aagagccagc tccagcggct gctgcaggag ctccgcaggc gtctgacccc cctgcagctg 14700 gagatccagc gggtggtgga aaaggtaagg tgggggtgga ccaggaggca gcacagctcc 14760 tttccctgag ctccaaaagt ccccagaagg gcgcttgccc gtgtcgggag tgaccagagg 14820 gccagcaggc accggcttcg tctttccatc gcttgccagg cagtgtgccc ctggttgcag 14880 gttctctggg aattgagcag tcagcagcgt gcagtgggag cttcccagca ggaggcagtc 14940 cgcagtccgc agtcctcaga tcaccttgcc aggcccgatt ctgggtacat catctgtttc 15000 aaacaggctg acagctgggt ggagaaggag gagccggcac ctagcaactg acggcctcgc 15060 acggaactgc catcctgtga gggcagcggt ggcgcccggc aaagttggag cccttgcggt 15120 accagaaagc agcgagagcg agacctggga gccagggcag gggtggctga ccccatgctc 15180 agcctctagg ggacggcagg ccatcaggct gggggctgtg ctatgtggga tggatgtgtg 15240 aggaaccccg gttccactta acaactaaat acaacatctt ttgcacccct agaatgtcat 15300 tttgccctca accttggtat ttctcctggg gcccttttag tcttgtgctg actttctcct 15360 gtcctcttcc agtttagaat aagacagggg agaaaaaggc ttttcgagtg tgggacaagg 15420 tctgatgtca gtgaacggaa ctgaagagca agacatggag cctggctggg gctaagcagc 15480 cccctcctcc ggatggcaca ggctctgcta ggttccggac acaggcttct gggggaaggg 15540 tctcccttgg ccatcacggg aatggagtcc atgctagaaa gagctcagtg ttgggctggg 15600 tttgccagta gaacactgcg ttccagtcac cccggtcttg ccagaagaaa ccagcacctc 15660 tttcccgtgg ctcctgtgtt cagaatgtgg tattggctct ggcccagcct tctcccctgt 15720 tacccataat tcttgcctct ttccataatc cgtggtttca gtttgacttt gtatataaag 15780 ttggggtttt tttttttttt ttttggcttg ttttttaaat aaaccaaagt caaaaacaaa 15840 15840 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DBC1 siRNA sense sequence <400> 2 cagcuugcau gacuacuuu 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DBC1 siRNA antisense sequence <400> 3 aaaguaguca ugcaagcug 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIRT1 siRNA sense sequence <400> 4 ugctugugag gcucuaucc 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIRT1 siRNA antisense sequence <400> 5 aaaguaguca ugcaagcug 19

Claims

DBC1(deleted in breast cancer-1) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 물질은 DBC1의 유전자 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 항체인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 DBC1 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간암은 인간 간세포암(HCC, hepatocellular carcinoma)인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
DBC1(deleted in breast cancer-1)의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 DBC1을 암호화하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA인 것을 특징으로 하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 siRNA는 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열을 갖는 siRNA duplexes인 것을 특징으로 하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물.
(a) 간암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 DBC1(deleted in breast cancer-1) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 간암의 발병을 예측 또는 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 (a) 단계는 추가적으로 SIRT1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1) 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 더 측정하는 것을 특징으로 하는 간암의 발병을 예측 또는 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 DBC1 및 SIRT1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자들(DBC1 및 SIRT1)이 코딩하는 단백질의 수준을 측정한 결과 정상 대조군과 비교하여 DBC1 및 SIRT1의 수준이 모두 증대되는 경우 간암 양성으로 판정되는 것을 특징으로 하는 간암의 발병을 예측 또는 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암의 발병을 예측 또는 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.