KR20210088053A - 마이크로rna를 이용한 당뇨병성 신경병증의 진단 방법 및 진단 키트 - Google Patents

마이크로rna를 이용한 당뇨병성 신경병증의 진단 방법 및 진단 키트 Download PDF

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KR20210088053A
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Abstract

당뇨병성 신경병증의 진단 방법이 제공된다. 상기 진단 방법은 진단 대상의 miRNA 발현수준을 측정하는 단계 및 상기 측정한 miRNA 발현수준을 정상 대조군의 miRNA 발현수준과 비교하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA는, miR-25, miR-23a 및 miR-142-3p로 이루어진 제1 miRNA군, miR-9, miR-29c 및 miR-134-5p로 이루어진 제2 miRNA군 및 miR-145 및 miR-182로 이루어진 제3 miRNA군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

Description

마이크로RNA를 이용한 당뇨병성 신경병증의 진단 방법 및 진단 키트{METHOD AND KIT FOR DIAGNOSIS OF DIABETIC NEUROPATHY USING MICRO-RNA}
본 발명은 당뇨병성 신경병증을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단 키트에 대한 것으로서, 구체적으로는 당뇨병성 신경병증의 지표가 될 수 있는 마이크로RNA를 이용하여 당뇨병성 신경병증을 진단하는 방법 및 키트에 대한 것이다. 더 구체적으로는, 서로 상반된 양상의 발현수준을 보이는 마이크로RNA들을 이용하여 당뇨병성 신경병증 진단의 정확도를 높일 수 있는 방법 및 키트에 대한 것이다.
제1형 당뇨병(type 1 diabetes mellitus) 및 제2형 당뇨병(type 2 diabetes mellitus)의 흔한 미세혈관 합병증인 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy)은 당뇨병 환자에서 말초신경 기능 장애의 징후 및/또는 증상의 존재로 정의된다. 인구 및 임상 기반 연구는 20년간 제1형 당뇨병이 지속된 후에 당뇨병성 신경병증의 유병률이 20%이고 10년간의 제2형 당뇨병에서는 약 10%-15%가 50%까지 증가함을 시사한다. 이러한 연구에도 불구하고, 서로 밀접하게 연관된 수많은 원인 메커니즘과 명확한 진단법 확립의 어려움 때문에 당뇨병성 신경병증의 병리 생리학은 명확하게 정의되지 않았다.
당뇨병성 신경병증의 진단 접근법은 복잡하고 아직까지 표준화되지 않았으며 결과의 감도 및 특이성을 증가시키기 위해 일반적으로 다양한 정성적 및 정량적 방법들의 조합으로 구성되어 왔다.
특히 종래의 방법으로는 명백한 임상 증상, 무증상 질환 과정을 가진 환자 또는 당뇨병성 신경병증 발달 후보를 확인하기 이전의 초기 이상에 대한 효과적인 선별이 불가능하였다. 당뇨병성 신경병증에 대한 신뢰성 있는 진단 방법이 결여된 것만큼이나 종래 사용되던 치료 요법에 대해서는 복잡성도 존재하였다. 당뇨병성 신경병증 발달에 대한 인과적 치료가 부재할 경우, 종래의 치료법은 종종 혈당 조절과 통증 관리의 조합으로 구성되었다.
이러한 문제점을 해결하고자 본 발명자는 당뇨병성 신경병증에 연관된 마이크로 RNA(micro-RNA 또는 miRNA, 이하, 'miRNA'로 약칭함)를 이용하는 방안에 주목하였다.
miRNA는 수 내지 수십개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 비번역 RNA로, 전사단계에서 RNA 침묵(RNA silencing), 그리고 전사 후 단계에서 유전자의 발현을 조절하는 기능을 수행한다. 이러한 miRNA의 기능은 mRNA 내의 상보서열과의 염기쌍의 형성을 통해 수행되는 것으로 알려져 있다(Bartel, D.P., Cell, 136(2): 215-233, 2009).
miRNA는 최초에 예쁜 꼬마선충(C. elegans)에서 발견된 이후, 동물, 식물 및 바이러스에 유전자 발현의 조절기구로 활용되고 있음이 알려지면서 다양한 종류의 miRNA들이 속속 보고되고 있고, miRNA 유전자의 돌연변이 등에 기인하는 기능의 부조화에 의해 암 등 특정 질병이 발생할 수 있음이 알려지고 있다(Pontual et al., Nat. Genet., 43(10): 1026-1030, 2011; Lu et al., Nature 435(9): 834-838, 2005).
Bartel, D.P., Cell, 136(2): 215-233, 2009 Pontual et al., Nat. Genet., 43(10): 1026-1030, 2011; Lu et al., Nature 435(9): 834-838, 2005
이에 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 당뇨병성 신경병증 하에서 고발현(over-expression) 또는 저발현(under-expression)되는 miRNA의 발현수준을 측정하여 정상 대조군과 비교함으로써 당뇨병성 신경병증을 간단하게 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 당뇨병성 신경병증 하에서 서로 다른 양상의 발현수준을 보이는 miRNA들을 조합하여 발현수준을 측정함으로써 진단의 정확도를 높이는 것이다.
아울러, 이와 같은 방법을 이용한 당뇨병성 신경병증의 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 당뇨병성 신경병증 하에서 고발현 또는 저발현되는 miRNA의 발현수준을 측정하여 정상 대조군과 비교함으로써 당뇨병성 신경병증을 간단하게 진단할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 당뇨병성 신경병증의 진단 방법은 진단 대상의 miRNA 발현수준을 측정하는 단계 및 상기 측정한 miRNA 발현수준을 정상 대조군의 miRNA 발현수준과 비교하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA는, miR-25, miR-23a 및 miR-142-3p로 이루어진 제1 miRNA군, miR-9, miR-29c 및 miR-134-5p로 이루어진 제2 miRNA군 및 miR-145 및 miR-182로 이루어진 제3 miRNA군에서 선택되는 하나 이상이다.
상기 제1 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 낮은 경우에 상기 제2 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 높은 경우에 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다.
또한, 상기 제1 miRNA군에서 선택된 하나 이상의 miRNA와 상기 제2 miRNA군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 모두 측정하여 정상 대조군과 비교할 수 있다.
또는, 상기 제1 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 낮은 반면 상기 제2 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 높은 경우, 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다.
몇몇 실시예에서, 상기 제1 및/또는 제2 miRNA군에서 선택된 하나 이상의 miRNA와 상기 제3 miRNA군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 모두 측정하여 정상 대조군과 비교할 수 있다.
상기 제1 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 낮은 반면 상기 제3 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상과 정상 대조군의 발현수준이 실질적인 차이가 없는 경우, 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다.
또는, 상기 제2 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 높은 반면 상기 제3 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상과 정상 대조군의 발현수준이 실질적인 차이가 없는 경우, 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다.
또한, 상기 제1 miRNA군에서 선택된 miRNA와 상기 제2 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 각각 낮고 높은 반면 상기 제3 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상과 정상 대조군의 발현수준이 실질적인 차이가 없는 경우, 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다.
상기 miRNA의 발현수준을 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소연쇄반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method; RPA), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및/또는 유전자 칩 분석법을 이용할 수 있다.
상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 당뇨병성 신경병증의 진단 키트는 miR-25, miR-23a 및 miR-142-3p로 이루어진 제1 miRNA군, miR-9, miR-29c 및 miR-134-5p로 이루어진 제2 miRNA군 및 miR-145 및 miR-182로 이루어진 제3 miRNA군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 검출재를 포함한다.
여기서, 상기 검출재는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
또한, 상기 검출재는, 상기 제1 miRNA군에서 선택되는 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 제2 miRNA군에서 선택되는 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브 및 상기 제3 miRNA군에서 선택되는 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브 중 2 이상을 포함할 수 있다.
기타 실시예의 구체적인 사항들은 상세한 설명에 포함되어 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 당뇨병성 신경병증 하에서 특정 발현 양상을 보이는 miRNA들의 발현수준을 측정하여 정상 대조군과 비교함으로써 당뇨병성 신경병증을 간단하게 진단할 수 있다.
또한, 당뇨병성 신경병증 하에서 서로 다른 양상의 발현수준을 보이는 miRNA들을 조합하여 발현수준을 측정함으로써 진단의 정확도를 높일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 실험군과 대조군에서 miR-25, miR-23a 및 miR-142-3p의 상대적인 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 실험군과 대조군에서 miR-9, miR-29c 및 miR-134-5p의 상대적인 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험군과 대조군에서 miR-145 및 miR-182의 상대적인 발현량을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
즉, 본 발명이 제시하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, '및/또는'은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 또, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. '내지'를 사용하여 나타낸 수치 범위는 그 앞과 뒤에 기재된 값을 각각 하한과 상한으로서 포함하는 수치 범위를 나타낸다. '약' 또는 '대략'은 그 뒤에 기재된 값 또는 수치 범위의 20% 이내의 값 또는 수치 범위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '진단'이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy)의 진행 또는 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 뿐만 아니라, 당뇨병성 신경병증의 발병 가능성을 확인하는 것으로도 해석될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 'miRNA (micro-RNA)'란, 수 내지 수십개 정도의 뉴클레오티드로 구성된 비번역 RNA을 의미하며, 특정 적응증을 진단할 수 있는 진단 마커로 활용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 miRNA는 당뇨병성 신경병증과 직간접적인 상관관계를 갖기 때문에 그 발현수준을 측정함으로써 당뇨병성 신경병증의 진단이 가능하다.
본 기술분야의 당업자라면 상기 miRNA와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성이 유지되는 서열을 갖도록 변형된 miRNA도 본 발명의 miRNA와 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '진단 대상'이란, 해당 적응증을 진단하기 위한 환자, 개체, 또는 이들에게서 분리한 혈액, 체액, 분비물, 조직, 시료 등의 검체를 의미한다. 본 발명의 miRNA는 환자 또는 개체의 혈액, 체액, 조직, 신경세포나 신경조직 등을 채취하여 검출함으로써 그 발현수준을 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '정상 대조군'이란, 해당 적응증을 가지고 있지 않은 환자, 개체, 또는 이들에게서 분리한 혈액, 체액, 분비물, 시료 등으로서, 해당 적응증에 관련된 miRNA이 정상 수준으로 발현되어 진단 대상의 miRNA 발현수준을 평가하기 위한 기준이 될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '프라이머'란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxylgroup)를 가지는 핵산서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '프로브'란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
이하 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy)의 진단 방법은 진단 대상의 miRNA 발현수준을 측정하는 단계 및 상기 측정한 miRNA 발현수준을 정상 대조군의 miRNA 발현수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 miRNA는 당뇨병성 신경병증을 진단할 수 있는 지표가 되는 것으로서, miR-25, miR-23a 및 miR-142-3p로 이루어진 제1 miRNA군; miR-9, miR-29c 및 miR-134-5p로 이루어진 제2 miRNA군; 및 miR-145와 miR-182로 이루어진 제3 miRNA군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 다른 몇몇 실시예에서, 제1 miRNA군은 miR-25, miR-23a 및 miR-142-3p으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 개 이상, 또는 복수개를 포함할 수 있다. 또 다른 몇몇 실시예에서, 제2 miRNA군은 miR-9, miR-29c 및 miR-134-5p으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 개 이상, 또는 복수개를 포함할 수 있다. 또 몇몇 실시예에서, 제3 miRNA군은 miR-145와 miR-182으로 이루어진 군으로부터 선택된 한 개 이상을 포함할 수 있다. 또 다른 몇몇 실시예에서, 제1 miRNA군, 제2 miRNA군, 및 제3 miRNA군은 상기에서 언급된 miRNA 외에 다른 miRNA를 더 포함할 수도 있다.
진단 대상에서 당뇨병성 신경병증이 진행 또는 발병되었거나 당뇨병성 신경병증의 발병 위험이 있는 경우, 제1 miRNA군에 속한 miR-25, miR-23a 및 miR-142-3p의 발현수준은 정상 대조군에 비해 낮을 수 있고, 제2 miRNA군에 속한 miR-9, miR-29c 및 miR-134-5p의 발현수준은 정상 대조군에 비해 높을 수 있다. 동시에, 제3 miRNA군에 속한 miR-145와 miR-182의 발현수준은 정상 대조군과 실질적으로 차이가 없을 수 있다.
즉, 제1 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준이 정상 대조군보다 낮고, 및/또는 제2 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준이 정상 대조군보다 높다면 진단 대상의 당뇨병성 신경병증 가능성은 높은 것으로 진단할 수 있다.
한편, 하나의 miRNA는 다양한 병리학적 작용에 대해 다양한 방식으로 상관관계를 가질 수 있고, 당뇨병성 신경병증 또한 제1 및 제2 당뇨병을 포함한 수많은 병리학적 원인에 기인하는 다인성 질환이기 때문에 특정 miRNA가 고발현 또는 저발현되었다는 사실만으로 당뇨병성 신경병증을 단정적으로 진단하는 것은 비합리적이다.
예를 들어, 제1 miRNA군에 속한 miR-25, miR-23a 또는 miR-142-3p만의 발현수준을 측정하였을 때 정상 대조군보다 발현수준이 낮더라도 이것이 반드시 당뇨병성 신경병증의 존재를 의미하는 것은 아니다. 상기 miR-25, miR-23a 또는 miR-142-3p의 저발현은 당뇨병성 신경병증과는 관련이 없는, 예를 들어, 종양에 의한 신경성 동통(neuropathic pain)이 있는 경우에도 나타날 수 있기 때문이다. 이는 제2 miRNA군에 속한 miR-9, miR-29c 또는 miR-134-5p이 고발현된 경우도 마찬가지이다.
따라서, 동일 적응증에서 서로 상이한 양상의 발현수준을 보이는 miRNA들을 조합하여 측정하면 진단 결과의 정확도를 높일 수 있음에 착안하여 본 발명의 발명자들은 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 몇몇 실시예에서는 제1 miRNA군에서 선택된 하나 이상의 miRNA와 제2 miRNA군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 모두 측정하여 정상 대조군과 비교할 수 있고, 이에 따라 측정된 결과 상기 제1 miRNA군의 miRNA는 정상 대조군보다 발현수준이 낮은 반면 상기 제2 miRNA군의 miRNA는 정상 대조군보다 발현수준이 높다면 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다. 이러한 방식은 제1 miRNA 단일군 또는 제2 miRNA 단일군에서 선택된 miRNA만을 측정하여 진단한 결과보다 정확도 측면에서 유리하다고 할 수 있다.
보다 구체적으로, 제1 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준이 정상 대조군보다 낮고, 이와 동시에 제2 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준이 정상 대조군보다 높을 경우 진단 대상의 당뇨병성 신경병증 가능성이 현저하게 높은 것으로 진단할 수 있다.
한편, 제3 miRNA군에 속한 miR-145 및 miR-182는 당뇨병성 이외의 신경병증 하에서는 이상발현될 수 있지만 당뇨병성 신경병증에서는 정상 대조군과 발현수준의 차이가 없다는 특징이 있기 때문에, 이를 제1 miRNA군 및/또는 제2 miRNA군에 속한 miRNA와 조합하여 사용한다면 당뇨병성 신경병증의 진단 정확도를 보다 높일 수 있다.
몇몇 실시예에서는 제1 miRNA군 또는 제2 miRNA군에서 선택된 하나 이상의 miRNA와 제3 miRNA군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 모두 측정하여 정상 대조군과 비교할 수 있다. 즉, 상기 제1 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준은 정상 대조군보다 낮은 반면 상기 제3 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준은 정상 대조군과 실질적인 차이가 없다면 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단함으로써 진단의 정확성을 높일 수 있다. 마찬가지로, 상기 제2 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준은 정상 대조군보다 높은 반면 상기 제3 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준은 정상 대조군과 실질적인 차이가 없다면 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다. 제3 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준이 정상 대조군과 실질적인 차이가 없다는 것은 양자 간의 차이가 약 10% 내, 또는 약 5% 내, 또는 약 3% 내, 또는 약 1% 내에 있음을 의미할 수 있다.
예시적인 실시예에서, 제1 miRNA군 내지 제3 miRNA군에서 각각 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 모두 측정하여 정상 대조군과 비교함으로써 당뇨병성 신경병증 진단의 정확도를 극대화할 수 있다. 즉, 상기 제1 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준은 정상 대조군보다 낮고 상기 제2 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준은 정상 대조군보다 높은 반면 상기 제3 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준은 정상 대조군과 실질적인 차이가 없다면 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단할 수 있다.
miRNA 발현수준의 측정은 표적 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 이용한 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소연쇄반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method; RPA), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩 분석법 등으로 수행될 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 프라이머 또는 프로브는 표적 miRNA와 상보적인 염기서열을 갖는 것일 수 있으나, 그 서열이 100% 상보적이어야 하는 것은 아니며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위 내에서 적절하게 서열의 변형이 가해진 것 또한 상기 프라이머 또는 프로브에 포함되는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 본 기술분야의 당업자라면 표적 miRNA의 상보적인 염기서열과 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 가장 바람직하게는 80% 이상의 상동성이 유지되는 서열을 갖는 것 또한 상기 표적 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브와 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.
상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 당뇨병성 신경병증의 진단 키트는 miR-25, miR-23a 및 miR-142-3p로 이루어진 제1 miRNA군; miR-9, miR-29c 및 miR-134-5p로 이루어진 제2 miRNA군; 및 miR-145와 miR-182로 이루어진 제3 miRNA군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 검출재를 포함할 수 있고, 검출재는 위와 같은 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
제1 내지 제3 miRNA군의 miRNA와 프라이머/프로브에 대한 설명은 상술한 바와 같으므로, 이에 대한 구체적인 설명은 생략한다.
몇몇 실시예에서, 당뇨병성 신경병증의 진단 키트는 제1 내지 제3 miRNA군에서 각각 선택되는 miRNA에 각각 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브 중 2 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는 제3 miRNA군에서 선택되는 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 필수적으로 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 제1 내지 제3 miRNA군에서 각각 선택되는 miRNA에 각각 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 모두 포함할 수 있다. 이에 따라 당뇨병성 신경병증 진단의 정확도를 높일 수 있음은 상술한 바와 같다.
예시적인 실시예에서, 당뇨병성 신경병증의 진단 키트는 미리 측정된 정상 대조군의 제1 내지 제3 miRNA군에서 선택된 miRNA의 발현수준을 나타내는 지표, 표식, 수치 등을 포함할 수 있고, 이에 따라 진단 대상의 miRNA 발현수준을 측정하여 정상 대조군과 바로 비교함으로써 당뇨병성 신경병증을 즉시 진단할 수 있다.
이하에서는 본 발명의 실시예들을 구체적인 실험예를 통해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 당뇨병성 신경병증이 유발된 동물 모델의 제조
Balb/C 생쥐(20-25g, 수컷)를 Shanghai Animal Laboratory Center에서 구입하였다. 실험동물은 섭씨 22℃ 항온실에 60%의 습도로 유지하고 낮과 밤 주기를 12시간으로 설정한 동물실에 보관하였다.
일부 생쥐(실험군)의 복강에 스트렙토조토신(Strreptozotocin; STZ)을 150mg/kg로 주입하여 당뇨 및 신경병증성 표현형(neuropathic phenotype)을 유발시켰다(single high dose model; SHD-STZ). 포도당 측정기(AccuChek, Roche Diagnostic, GmbH, Germany)를 이용하여 혈당을 모니터링하며 일정 수치 이상의 생쥐를 희생시켜 척수 조직을 얻었다. 스트렙토조토신을 처리하지 않은 생쥐(대조군)도 희생시켜 마찬가지로 척수 조직을 얻었다.
실험예 2: 세포 배양
분리된 척수 조직 세포들을 0.01% poly-L-ornithine(Sigma)과 laminin (0.02mg/ml, Collaborative Research, Bedford, USA)로 밤새 처리한 커버 유리슬라이드 표면에서 배양하였다. 세포들은 5% fetal bovine serum (GIBCO, Australia), 5% horse serum, 2mM glutamine, 그리고 1% penicillin-streptomycin을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle's medium(DMEM)에서 48시간 배양하였다.
실험예 3: 세포 배양액으로부터 miRNA 추출 및 발현수준 측정
세포 배양액으로부터 총 RNA를 추출하기 위해 RNAiso Plus가 사용되었다. Prime Script TM RT Master Mix와 qPCR(quantitative polymerase chain reaction)에 의한 RNA 역전사는 SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRaBio Technology, Dalian, China)를 사용하여 수행되었다. 실시간 PCR(real-time PCR)을 위해 Applied Biosystems 7900 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA)이 사용되었다. 실험군과 대조군의 타겟 miRNA의 상대적인 발현수준은 2-△△Ct 법으로 계산하여 비교하였다. 통계분석은 IBM SPSS Statistics ver. 20.0 (IBM Co., Armonk, NY)를 사용하여 수행되었다. P<0.05는 유의한 것으로 간주되었다.
[결과]
실험군과 대조군의 miR-25, miR-23a, miR-142-3p, miR-9, miR-29c, miR-134-5p, miR-145 및 miR-182의 발현수준을 비교하였으며, 그 결과는 도 1 내지 도 3과 같았다. 구체적으로, 도 1과 같이 miR-25, miR-23a 및 miR-142-3p (제1 miRNA군)은 실험군의 발현수준이 대조군보다 유의적으로 낮았고, 도 2와 같이 miR-9, miR-29c 및 miR-134-5p (제2 miRNA군)은 실험군의 발현수준이 대조군보다 유의적으로 높았으며, 도 3과 같이 miR-145와 miR-182 (제3 miRNA군)은 실험군과 대조군의 발현수준에 유의적인 차이가 없었다.
당뇨병성 신경병증의 진단 방법은 복잡하고 표준화되지 않은 만큼 그 진단 정확성 또한 떨어지는 실정이다. 그러나 본 발명의 상술한 바와 같이, 서로 다른 양상의 발현수준을 보이는 다양한 관련 miRNA의 발현 양상을 관찰함으로써 당뇨병성 신경병증을 비교적 간단하고 정확하게 진단할 수 있다.
이상에서 본 발명의 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다.
따라서 본 발명의 범위는 이상에서 예시된 기술 사상의 변경물, 균등물 내지는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성요소는 변형하여 실시할 수 있다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

  1. 진단 대상의 miRNA 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정한 miRNA 발현수준을 정상 대조군의 miRNA 발현수준과 비교하는 단계를 포함하되,
    상기 miRNA는,
    miR-25, miR-23a 및 miR-142-3p로 이루어진 제1 miRNA군;
    miR-9, miR-29c 및 miR-134-5p로 이루어진 제2 miRNA군; 및
    miR-145 및 miR-182로 이루어진 제3 miRNA군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신경병증의 진단 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 낮은 경우에, 상기 제2 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 높은 경우에 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신경병증의 진단 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 miRNA군에서 선택된 하나 이상의 miRNA와 상기 제2 miRNA군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 모두 측정하여 정상 대조군과 비교하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신경병증의 진단 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 제1 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 낮은 반면 상기 제2 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 높은 경우, 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신경병증의 진단 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 및/또는 제2 miRNA군에서 선택된 하나 이상의 miRNA와 상기 제3 miRNA군에서 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 모두 측정하여 정상 대조군과 비교하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신경병증의 진단 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 낮은 반면 상기 제3 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상과 정상 대조군의 발현수준이 실질적인 차이가 없는 경우, 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신경병증의 진단 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제2 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 높은 반면 상기 제3 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상과 정상 대조군의 발현수준이 실질적인 차이가 없는 경우, 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신경병증의 진단 방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 제1 miRNA군에서 선택된 miRNA와 상기 제2 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상이 정상 대조군보다 발현수준이 각각 낮고 높은 반면 상기 제3 miRNA군에서 선택된 miRNA는 진단 대상과 정상 대조군의 발현수준이 실질적인 차이가 없는 경우, 당뇨병성 신경병증의 가능성이 높은 것으로 진단하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신경병증의 진단 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA의 발현수준을 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소연쇄반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소연쇄반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method; RPA), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및/또는 유전자 칩 분석법을 이용하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신경병증의 진단 방법.
  10. miR-25, miR-23a 및 miR-142-3p로 이루어진 제1 miRNA군;
    miR-9, miR-29c 및 miR-134-5p로 이루어진 제2 miRNA군; 및
    miR-145 및 miR-182로 이루어진 제3 miRNA군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 검출재를 포함하는 당뇨병성 신경병증의 진단 키트.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 검출재는 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신경병증의 진단 키트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 검출재는,
    상기 제1 miRNA군에서 선택되는 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브;
    상기 제2 miRNA군에서 선택되는 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브; 및
    상기 제3 miRNA군에서 선택되는 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브 중 2 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신경병증의 진단 키트.
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