JP6447829B2 - Ｒｎａ修飾の簡易検出法、及び該検出法を用いた２型糖尿病の検査方法 - Google Patents

Ｒｎａ修飾の簡易検出法、及び該検出法を用いた２型糖尿病の検査方法 Download PDF

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Description

本発明は、逆転写法を用いてＲＮＡ修飾を検出する方法に関する。本発明はまた、逆転写法と核酸増幅法、例えばＰＣＲ法を組み合わせて、ＲＮＡにおける修飾を検出するとともに、修飾の程度を定量する方法に関する。より詳しくは、ＲＮＡの修飾部位を含む領域と結合するプライマー、及びＲＮＡの修飾部位を含まない領域と相補的に結合するプライマーを含む、少なくとも２種類のプライマーを用いて逆転写を行い、次いで核酸増幅、例えばＰＣＲを行うことにより、該修飾を検出及び／又は定量する方法に関する。本発明はまた、該検出方法を用いた、２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査方法に関する。
トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、ｍＲＮＡの情報（コドン）を解読して、対応するアミノ酸を合成中のポリペプチド鎖に転移させるアダプター分子であり、タンパク翻訳において中心的な役割を有する小分子ＲＮＡである。ｔＲＮＡのアンチコドンループは化学修飾を受けるが、これは、翻訳の忠実度（ファイデリティ）に必要であり、特にアンチコドンに位置する３４番の塩基及びアンチコドンすぐ近傍の３７番の塩基における化学修飾は、翻訳の正確性を制御する重要な役割を有する。また、ｔＲＮＡのアンチコドンループの化学修飾の破綻は、疾患に関係していると考えられている。
２型糖尿病は、環境因子及び遺伝因子の組み合わせによって発症する疾患であり、世界中で患者は２億人を超えており、多くの国において患者数は増加している。２型糖尿病は、インスリン抵抗性及び／又は膵臓β細胞でのインスリン分泌の異常を特徴としているが、主要なメカニズムはまだ議論されている。２００７年以降、世界各国で２型糖尿病患者を対象とした大規模遺伝子多型疫学研究が精力的に行われ、糖尿病の罹患と相関のある遺伝子一塩基多型（ＳＮＰ）が多く同定されている。中でも、Cdkal1（cdk5 regulatory associated protein 1-like 1）のＳＮＰｓは、２型糖尿病の発症と最も高い相関があることが多くの論文で報告されている。そして、Cdkal1遺伝子の危険対立遺伝子（リスクアレル）を保有している人では、ブドウ糖応答性インスリン分泌が悪いが、肥満、インスリン抵抗性とは相関がないことが明かとされている。また、アジア人種がこの遺伝子リスクアレルを多く保有しており、リスクアレル保有者の表現型を加味すると、Cdkal1のＳＮＰｓはアジア人種型２型糖尿病の発症に関与していると推察されている。
そして、Cdkal1の生理機能は、リジンに対応するｔＲＮＡの３７番目のアデニンをチオメチル化して、２−メチルチオ−Ｎ6−スレオニルカルバモイルアデノシン（ｍｓ2ｔ6Ａ）とする酵素であることが明らかにされた（非特許文献１：Arragain S., et al. J. Biol. Chem. 285, 28425-28433 (2010) 、及び非特許文献２：富澤ら、上原記念生命科学財団研究報告書、25 (2011） 論文番号77）。ｍｓ2ｔ6Ａ修飾は、リジンコドンの正確なデコーディング（decoding）に必要であり（非特許文献１）、同種コドン（cognate codons）の読み誤りを防ぐのに、特に翻訳速度が比較的早い場合に読み誤りを防ぐのに重要な役割を果たしていることが示された（非特許文献３：富澤ら、Endocrine Journal 2011, 58 (10), 819-825）。
Cdkal1欠損マウスにおいては、ミトコンドリアＡＴＰ生成及び第一相インスリン分泌が損なわれることが観察されること、そして、膵臓β細胞特異的Cdkal1ノックアウトマウスは、２型糖尿病の病態を示し、膵島肥大と血中グルコースの制御障害が観察され、高脂肪食で誘発される小胞体ストレスに対して過敏であることが報告されている（非特許文献３、及び非特許文献４：Wei, F. Y. et al. J. Clin. Invest. 121, 3598-3608 (2011)）。
すなわち、本発明者らにより、遺伝的あるいは環境的な要因によりCdkal1の発現量や活性が低下すると、リジンｔＲＮＡのチオメチル化が低下し、その結果、インスリンの翻訳精度が低下し、２型糖尿病が発症するというメカニズムが示され、リジンｔＲＮＡのチオメチル化は糖尿病発症と密接に関連することが判った。一方、ミトコンドリアＤＮＡがコードするミトコンドリアｔＲＮＡにもチオメチル化が存在する。ミトコンドリアｔＲＮＡのチオメチル化はCdk5rap1によって修飾され、Cdk5rap1遺伝子の一塩基多型変異は白斑症の発症と相関することが報告されている（非特許文献１，及び比特許文献５：Reiter, V. et al. Nucleic Acids Res. 40, 6235-6240(2012）)。このようにｔＲＮＡのチオメチル化は疾患の新たなバイオマーカーとして注目されている。
ｔＲＮＡのチオメチル化を検出する方法としては、質量分析法を利用した検出法が一般的に使用されている（非特許文献６：Suzuki, T. et al. Method. Enzymol. 425, 211-229 (2007)）。質量分析法では、まず、組織や細胞からｔＲＮＡを精製したのち、ヌクレアーゼによりｔＲＮＡを数個のオリゴヌクレオチドまで消化する。その後、消化されたオリゴヌクレオチドを精製し、逆相液体クロマトグラフィ及び質量分析機にて分析することによりチオメチル化を検出する。しかし、この質量分析によるチオメチル化の検出は、多量のＲＮＡ（mg単位）を必要とするが、臨床サンプルは量が一般的に限られ、mg単位のサンプルを入手することが困難である。そのため、臨床サンプルを用いて、質量分析によりチオメチル化を検出することは困難である。また、質量分析によるチオメチル化検出法は、上述したように多くの前処理が必要であるため、チオメチル化を検出するまでに数日かかり、迅速な検出ができないばかりか、コストが嵩むという問題がある。更には、多くの試料を同時に扱うことは困難である。その上、質量分析機は非常に高価であり、また、使用するためには熟練した経験が必要とされるため、一般的な医療機関や研究室で分析を行うのは困難であるという問題がある。
上記したように、質量分析法は時間及びコストがかかり、更には、多量の臨床サンプルを入手することは困難であるという問題のため、ＲＮＡのチオメチル化の検出法として質量分析法は臨床応用に対応できない。従って、ＲＮＡのチオメチル化を効率よく、つまり迅速にそして安価に検出でき、更には、少ないサンプルを用いて検出できる、新しい検出法が望まれていた。
Arragain S., et al. J. Biol. Chem. 285, 28425-28433 (2010) 富澤ら、上原記念生命科学財団研究報告書、25 (2011) 論文番号77 富澤ら、Endocrine Journal 2011, 58 (10), 819-825 Wei, F. Y. et al. J. Clin. Invest. 121, 3598-3608 (2011) Reiter, V. et al. Nucleic Acids Res. 40, 6235-6240(2012） Suzuki, T. et al. Method. Enzymol. 425, 211-229 (2007)
本発明は、少量のＲＮＡ試料を用いて、ＲＮＡに存在する修飾を検出及び／又は定量する方法を提供することを目的とする。本発明は、更には、ｔＲＮＡに存在する修飾、例えば、チオメチル化を検出及び／又は定量する方法を提供することを目的とする。
本発明はまた、ＲＮＡに存在する修飾を検出及び／又は定量することにより、該修飾に関連する疾患又はそのリスクを診断する方法を提供することを目的とする。例えば、リジンｔＲＮＡのチオメチル化を検出及び／又は定量することにより、ヒト２型糖尿病又はそのリスクを診断する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究した結果、逆転写法及び核酸増幅法（例えば、定量ＰＣＲ法）を併用することにより、ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ）における修飾（例えば、チオメチル化）を検出する方法を見いだし、本発明を完成した。
本発明は以下の通りである。
（１）ＲＮＡに存在するＲＮＡ修飾を検出するための方法であって、
以下の２つの工程：
ａ．第１プライマーを用いて、該ＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する工程、ここで、該第１プライマーは、該ＲＮＡ上の該ＲＮＡ修飾を有する部位を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
ｂ．第２プライマーを用いて、該ＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する工程、ここで、該第２プライマーは、該ＲＮＡ上の該ＲＮＡ修飾を有する部位より３’側の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
をそれぞれ別々又は同時に行い、それぞれの工程から生成されたｃＤＮＡ量の差を測定することにより該ＲＮＡ修飾を検出する方法。
（２）前記工程ａとｂを別々に行う前記（１）に記載の方法。
（３）前記ｃＤＮＡ量の差を核酸増幅反応又は蛍光法により測定する前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記核酸増幅反応が、定量ＰＣＲ法又はリアルタイム定量ＰＣＲ法を用いて行われる、前記（３）に記載の方法。
（５）前記ｃＤＮＡ量の差を、核酸増幅反応における核酸の増幅速度の差として測定する、前記（４）に記載の方法。
（６）前記ＲＮＡがｔＲＮＡである前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の方法。
（７）前記ＲＮＡに存在するＲＮＡ修飾が、ｔＲＮＡに存在するチオメチル化、メチル化又はタウリン化である、前記（６）に記載の方法。
（８）前記ｔＲＮＡに存在するチオメチル化が、Ｌｙｓに対応するｔＲＮＡ、Ｔｒｐに対するｔＲＮＡ、Ｐｈｅに対するｔＲＮＡ、又はＳｅｒ（ＵＣＮ）に対するｔＲＮＡのいずれかの３７番目のアデノシンのチオメチル化である、前記（７）に記載の方法。
（９）前記ｔＲＮＡに存在するチオメチル化が、Ｌｙｓに対応するｔＲＮＡの３７番目のアデノシンのチオメチル化である、前記（８）に記載の方法。
（１０）前記ＲＮＡがヒト組織又はヒト血液由来のＲＮＡを含む、前記（１）〜（９）のいずれか一つに記載の方法。
（１１）前記ＲＮＡがヒト末梢血由来のＲＮＡを含む前記（１０）に記載の方法。
（１２）ＲＮＡに存在するＲＮＡ修飾率が既知の少なくとも２つの試料、及びＲＮＡ修飾率が未知の試料、のそれぞれについて前記（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の方法を行い、それぞれの試料について測定されたｃＤＮＡ量の差を示すパラメーターを比較することにより、未知の試料中のＲＮＡ修飾率を測定する方法。
（１３）前記核酸増幅反応が定量ＰＣＲ法又はリアルタイム定量ＰＣＲ法であり、かつ前記パラメーターが、第１のプライマー及び第２のプライマーを用いた際の標的核酸増幅のための閾値サイクル数（threshold cycle）の差である、前記（１２）に記載の方法。
（１４）ＲＮＡに存在するＲＮＡ修飾率が未知の試料について前記（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の方法を行い、その試料について測定されたｃＤＮＡ量の差を示すパラメーターを予め決められている検量線と比較することにより、未知の試料中のＲＮＡ修飾率を測定する方法。
（１５）前記核酸増幅反応が定量ＰＣＲ法又はリアルタイム定量ＰＣＲ法であり、かつ前記パラメーターが、第１のプライマー及び第２のプライマーを用いた際の標的核酸増幅のための閾値サイクル数（threshold cycle）の差である、前記（１４）に記載の方法。
（１６）ＲＮＡ試料（例えば、ヒト組織又はヒト血液由来の試料）中のＲＮＡに存在するＲＮＡ修飾を検出するためのキットであって、
該ＲＮＡ上の該ＲＮＡ修飾を有する部位を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである第１のプライマー、および
該ＲＮＡ上の該ＲＮＡ修飾を有する部位より３’側の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである第２のプライマー、
を含むキット。
（１７）前記ＲＮＡがｔＲＮＡである前記（１６）に記載のキット。
（１８）前記ＲＮＡに存在するＲＮＡ修飾が、ｔＲＮＡに存在するチオメチル化である、前記（１７）に記載のキット。
（１９）前記ｔＲＮＡに存在するチオメチル化が、Ｌｙｓに対応するｔＲＮＡ、Ｔｒｐに対するｔＲＮＡ、Ｐｈｅに対するｔＲＮＡ、又はＳｅｒ（ＵＣＮ）に対するｔＲＮＡのいずれかの３７番目のアデノシンのチオメチル化である、前記（１８）に記載のキット。
（２０）さらに、ＰＣＲを行うための別のプライマーを含む、前記（１６）〜（１９）のいずれか一つに記載のキット。
（２１）前記（９）に記載の方法を用いて、前記ｔＲＮＡが由来する被験者が２型糖尿病患者又はそのリスクがあるか否かを判定する方法。
（２２）前記ｔＲＮＡは、被験者の組織又は血液（好ましくは末梢血）に由来するｔＲＮＡである前記（２１）に記載の方法。
（２３）前記（９）に記載の方法を用いて、前記ｔＲＮＡが由来する被験者のインスリン分泌能を検定する方法。
（２４）前記ｔＲＮＡは、被験者の組織又は血液（好ましくは末梢血）に由来するｔＲＮＡである前記（２３）に記載の方法。
本発明によれば、少量のサンプルを用いて、迅速にそして安価に、ＲＮＡの修飾、例えばｔＲＮＡのチオメチル化を検出できるので、臨床サンプル（例えば、組織又は血液）を用いた種々の遺伝的異常（例えば、これに限定されないが、２型糖尿病の遺伝的感受性）の検出方法として有用である。
左図は、３７番目のアデニンがチオメチル化されている、リジンに対応するｔＲＮＡを示している。右図は、Cdkal1によるチオメチル化反応を示している。 本発明の一つの態様である第１及び第２のリバースプライマーを用いたＲＮＡ修飾の検出方法における、逆転写法及びそれに引き続く定量ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ−ＭｔＲ法）の手順の概略を、リジンｔＲＮＡをモデルとして示した図である。 野生型及びCdkal1 KOマウスから精製したリジンｔＲＮＡを用いて、逆転写法及び定量ＰＣＲ法により、リジンｔＲＮＡのｍｓ2修飾を検出した結果である。 精製ＲＮＡを用いた結果を、計算修飾率（calculated ratio）と期待される修飾率（expected ratio）をそれぞれ、Ｙ軸及びＸ軸にプロットした図である。 野生型マウス及びCdkal1 KOマウスから単離した粗精製ＲＮＡを用いて、逆転写及び定量ＰＣＲ法により、リジンｔＲＮＡのｍｓ2修飾を検出した結果である。 粗精製ＲＮＡを用いた結果を、計算修飾率（calculated ratio）と期待される修飾率（expected ratio）をそれぞれ、Ｙ軸及びＸ軸にプロットした図である。 野生型マウス及びCdkal1 KOマウスから単離した粗精製ＲＮＡ（2ng）を用いて、逆転写及び定量ＰＣＲ法により、リジンｔＲＮＡのｍｓ2修飾を検出した結果を、計算修飾率（calculated ratio）と期待される修飾率（expected ratio）をそれぞれ、Ｙ軸及びＸ軸にプロットした図である。 Cdkal1 ＳＮＰ（rs775840）の２型糖尿病関連リスクアレルをもつ人（Ｒｉｓｋ群）及び健常人（Cdkal1 ＳＮＰのリスクアレルをもたない人）（Ｎｏｎ−ｒｉｓｋ群）の末梢血からの粗精製ＲＮＡを用いて、逆転写及び定量ＰＣＲ法により、リジンｔＲＮＡのｍｓ2修飾を検出した結果である。 Cdkal1 ＳＮＰ（rs775840）の２型糖尿病関連リスクアレルをもつ人（図９ｂ）及び健常人（Cdkal1 ＳＮＰのリスクアレルをもたない人）（図９ａ）の末梢血からの精製ＲＮＡを用いて質量分析した結果である。図９ｃは、全リジンｔＲＮＡ（ｍｓ2ｔ6Ａ＋ｔ6Ａ）中のｍｓ2未修飾リジンｔＲＮＡ（ｔ6Ａ）の割合を示している。 ミトコンドリアｔＲＮＡのＡ３７におけるｍｓ2修飾を質量分析した結果である。上段は、ｍｓ2修飾されたオリゴヌクレオチド、下段は、ｍｓ2修飾されていないオリゴヌクレオチドのマスクロマとグラムを示している。 Cdkal1遺伝子変異を有する群（ホモで有する（Ｃ／Ｃ）群およびヘテロで有する群（Ｇ／Ｃ））と有さない群（Ｇ／Ｇ）のそれぞれの個体群におけるリジンＲＮＡのチオメチル化修飾度を示している。 リジンｔＲＮＡのチオメチル化修飾度とインスリン分泌能との相関を示している。
以下、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施態様に限定されるものではない。
本発明は、ＲＮＡ試料中のＲＮＡ上に存在する修飾を、第１のプライマー及び第２のプライマーを用いて逆転写することにより検出することを特徴とする。より具体的には、第１のプライマーを用いてＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成し、そのｃＤＮＡの量を、第２のプライマーを用いてＲＮＡから逆転写により生成されるｃＤＮＡの量と比較することにより、ＲＮＡ上に存在する修飾を検出することを特徴とする。
本発明の検出方法の対象とするものは、ＲＮＡであり、例えば、これに限定されないが、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ−ｌｉｋｅ ｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡをあげることができ、好ましくは、ｔＲＮＡ，ｒＲＮＡ、又はｓｎＲＮＡであり、より好ましくは、ｔＲＮＡである。
また、検出対象とするｔＲＮＡも特に限定されず、例えば、Ｌｙｓに対応するｔＲＮＡ、Ｔｒｐに対するｔＲＮＡ、Ｐｈｅに対するｔＲＮＡ、又はＳｅｒ（ＵＣＮ）に対するｔＲＮＡ等をあげることができる。
また、本発明において「ＲＮＡ試料」とは、特に制限されず、ＲＮＡの種類や含有量にかかわらず、ＲＮＡが含まれている試料を意味する。ＲＮＡ試料として、例えば、哺乳動物組織、臓器又は血液、例えばヒト組織、臓器又はヒト血液由来のＲＮＡを含む試料をあげることができるが、好ましくは、被験者に過度の負担をかけずまた採取が容易であるヒト末梢血由来のＲＮＡを含む試料である。血液からの白血球ＲＮＡの採取方法は、特に限定されないが、例えば、全血をフィコール比重遠心法で処理して白血球を濃縮した後、ＲＮＡ抽出を行う方法や、ＲＮＡ採血管、例えば、パクスジーンＲＮＡ採血管（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）に血液を採った後に、製造者のプロトコールに従い白血球を分離することなしに直接ＲＮＡ試料とする方法、をあげることができる。
本発明の検出方法において、検出できるＲＮＡ修飾は、例えば、これに限定されないが、チオメチル化、メチル化、及びタウリン化をあげることができ、好ましくは、チオメチル化、及びメチル化、より好ましくはチオメチル化である。特定の疾患との関連が判っている或いは推定されているＲＮＡ修飾の場合は、本発明の方法を用いてその修飾を検出又は定量することにより、その疾患に罹っている或いはそのリスクがあるかを判定することができる。例えば、既に記載しているように、リジンに対するｔＲＮＡの３７番目のアデノシンのチオメチル化は、２型糖尿病と関連しているので、そのＲＮＡ修飾を検出又は定量することにより、２型糖尿病に罹っている或いはそのリスクがあるかを判定できる。
本発明の方法において検出できるＲＮＡ修飾と、その修飾との関連が判っている疾患（すなわち、本発明の方法を用いて、その疾患に罹っている或いはそのリスクがあるかを判定できる疾患）は、例えば、タウリン化とミトコンドリア脳筋症、チオメチル化と糖尿病、メチル化とＸ染色体連鎖性精神遅滞をあげることができる。
本発明で用いられる第１プライマーとは、本発明の検出方法において検出すべきＲＮＡ修飾を有する部位（例えば、これに限定されないが、チオメチル化された塩基）を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドであり、逆転写法、及び必要に応じて本発明においてそれに組み合わされるＰＣＲ法のそれぞれで、プライマーとして機能する限りその長さは特に制限はなく、例えば、１０塩基以上、好ましくは、１０〜３０塩基、より好ましくは、１５〜２０塩基である。オリゴヌクレオチド（プライマー）の設計において用いられる上記ＲＮＡ修飾を有する部位を含む領域は、該修飾部位を含む限り特に制限がないが、領域の（中心より）５’側にＲＮＡ修飾部位が位置するように選択するのが好ましい。このように第１プライマーを設計することにより、逆転写を、ＲＮＡ修飾を有する部位の影響を受けずに又は影響を小さくして行うことができる。
本発明で用いられる第２プライマーとは、本発明の検出方法において検出すべきＲＮＡ修飾を有する部位（例えば、これに限定されないが、チオメチル化された塩基）より３’側の任意の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドであり、逆転写法、及び必要に応じて本発明においてそれに組み合わされるＰＣＲ法のそれぞれで、プライマーとして機能する限りその長さは特に制限はなく、例えば、１０塩基以上、好ましくは、１０〜３０塩基、より好ましくは、１５〜２０塩基である。第２プライマーが相補的に結合する領域がＲＮＡ修飾を有する部位の３’側に存在するため、逆転写において、ＲＮＡ修飾（例えば、これに限定されないが、チオメチル化）が逆転写を阻害する。そのため、上記のように設計された第２プライマーを用いて逆転写を行うと、修飾されたｔＲＮＡの量が多いほど、逆転写産物の量が低下する、という反比例の相関が観察される。一方、第１プライマーを用いた逆転写はＲＮＡ修飾とは非依存的にｃＤＮＡを生成するので、第２プライマーを用いて生成されるｃＤＮＡ量は、第１プライマーを用いて生成されるｃＤＮＡ量より少なくなる。第２プライマーが相補的に結合する上記３’側の任意の領域は、特に制限がなく、逆転写においてＲＮＡ修飾が逆転写を少なくとも部分的に、好ましくは実質的に阻害する限り、いずれの領域でもよいが、上記３’側の任意の領域は、ＲＮＡ修飾部位から離れすぎずまた近づきすぎないように設計するのが好ましく、例えば、ＲＮＡ修飾部位からおおよそ３〜１０塩基、好ましくはおおよそ３〜５塩基はなれたところから始まるように設計するのが好ましい。
このように、ＲＮＡ修飾部位との位置関係において第１プライマー及び第２プライマーを設計することにより、それぞれのプライマーを用いた逆転写による生成されるｃＤＮＡ量に差異がより生じやすくなる。
また、本発明で用いる第１プライマー及び／又は第２プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などで標識されてもよい。放射性同位元素としては、例えば、125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃをあげることができ、酵素としては、例えば、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素をあげることができ、蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン、Alex Fluorをあげることができ、発光物質としては、例えば、ルミノールをあげることができる。
本発明において用いる第１及び第２プライマーは、検査対象であるＲＮＡ及び標的とするＲＮＡ修飾（その位置及びその種類）に基づいて、標的の領域と相補的に結合するように設計し、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。このような第１及び第２プライマーは、各々別個に、水又は適当な緩衝液（例えば、ＴＥ緩衝液）中に適当な濃度となるように溶解し、約-20℃で保存することができる。
本発明の特徴の一つである、第１プライマーにより生成されるｃＤＮＡ量と第２プライマーにより生成されるｃＤＮＡ量の差の検出は、その差を検出できる限り、任意の方法を用いることができるが、例えば、核酸増幅法（核酸増幅反応）、質量分析法等をあげることができるが、好ましくは核酸増幅法である。核酸増幅法を用いることにより、ｃＤＮＡの量の差を、迅速にそして安価に測定することができる。なお、逆転写時に蛍光標識したヌクレオチドを用いることにより、その後の核酸増幅法によるｃＤＮＡ量の差の検出を省くことも可能となるが、検出感度及び検出精度の点より、逆転写法と核酸増幅法を組み合わせるのが好ましい。
核酸増幅反応としては、定量ＰＣＲ又はリアルタイム定量ＰＣＲをあげることができるが、好ましくは、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮを用いたインターカレーション法、又はＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法をあげることができ、これらの方法を用いることにより、ＲＮＡ修飾の検出ばかりだけでなく、測定対象試料間の比較、さらにはＲＮＡ修飾の定量が可能となる。また、検出目的であれば、第１プライマー及び第２プライマーを別々の蛍光物質で標識して、マルチプレックス解析を行うことにより、少ない試料で迅速にＲＮＡ修飾を検出することも可能である。
第１プライマー又は第２プライマーを用いて生成されたｃＤＮＡを増幅する上記核酸増幅反応において用いるプライマーは、逆転写産物である生成されたｃＤＮＡと相補的に結合する一対のプライマー（リバースプライマーとフォワードプライマー）であれば特に制限なく用いることができるが、好ましくは、一対のプライマーの一方は、第１プライマーと同じである。
また、本発明の一つの態様である、第１及び第２プライマーを用いてＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成し、次いで、生成されたｃＤＮＡをリアルタイム定量ＰＣＲにより増幅する工程は、別々に行っても、或いは、逆転写に用いたプライマーと同じプライマーをＰＣＲに用いて、リアルタイム装置の中で逆転写反応も行うＯｎｅ−ｓｔｅｐ定量ＲＴ−ＰＣＲであってもよい。
ＰＣＲ法を組み合わせた本発明の検出法において、第１プライマーにより生成されるｃＤＮＡ量と第２プライマーにより生成されるｃＤＮＡ量の差の検出は、ＤＮＡの増幅を経時的に（ＰＣＲのサイクル数の増加とともに）観察して検出しても、或いは、任意のＰＣＲのサイクル数におけるＤＮＡ量の差として検出してもよい。
本発明の一つの態様である、逆転写法と定量ＰＣＲ法を組み合わせたＲＮＡ修飾の検出方法は、検出感度が非常に高く、例えば、僅か1ngの全ＲＮＡを用いてＲＮＡ修飾があるか否かの検出をすることが可能であり、従来の質量分析法に比べて約１０００倍以上の感度を有する。また、逆転写後にＰＣＲを行うという、２ステップのＲＴ−ＰＣＲ法或いは１ステップＲＴ−ＰＣＲ法であるため、短時間、例えば２〜３時間以内で検出操作を終了でき、また、多量のサンプルを同時に処理することも可能である。さらには、質量分析法に比べて、必要となる機器も安価であり、操作も簡便である。
本発明の別の一つの態様においては、ＲＮＡ試料中のＲＮＡに存在するＲＮＡ修飾を検出するためのキットであり、ＲＮＡ修飾を有する部位を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである第１プライマー、及びＲＮＡ修飾を有する部位より３’側の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである第２プライマーを含むキットである。また、上記キットは、第１及び第２プライマーを含み、更に検出法に応じて、検出を行うのに必要な他の成分を構成として含んでもよい。例えば、ＰＣＲ法を行うための、別のプライマー（フォワードプライマー及び／又はリバースプライマー）やＰＣＲを行うための、反応緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ等をさらに含むことができる。
本発明のさらに別の一つの態様においては、ＲＮＡ試料中のｔＲＮＡに存在するチオメチル化を検出するための方法であって、ｔＲＮＡに対して相補的に結合する少なくとも２つのプライマー、すなわち、検出すべきチオメチル化された塩基を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである第１プライマー、及び検出すべきチオメチル化された塩基より３’側の任意の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする。
第１プライマー及び第２プライマーは、上記条件を満たし、かつ、逆転写法、及び必要に応じて本発明においてそれに組み合わされるＰＣＲ法のそれぞれでプライマーとして機能する限り特に制限はなく設計することができ、その長さは、特に制限がないが、例えば、１０塩基以上、好ましくは、１０〜３０塩基、より好ましくは、１５〜２０塩基に設計できる。
第１プライマーは、上記のように標的のチオメチル化塩基部位を含む領域と相補的に結合するに設計され、より好ましくは、標的のチオメチル化塩基部位がプライマーのほぼ中心の位置に対応するように設計する。この第１プライマーを利用して逆転写を行うと、チオメチル基に非依存的に逆転写が行われ、逆転写産物の量はｔＲＮＡの全量に相関する。一方、第２プライマーは、標的のチオメチル化塩基部位より３’側に位置するように設計されているので、チオメチル化部位のチオメチル基が逆転写の効率を阻害するため、第２プライマーを用いて逆転写を行うと、チオメチル化されたｔＲＮＡの量が多いほど、逆転写産物の量が低下する、という反比例の相関が生じる。その結果、ｔＲＮＡのチオメチル化の程度に相関して、第２プライマーを用いて生成されるｃＤＮＡ量は、第１プライマーを用いて生成されるｃＤＮＡ量より少なくなる。
本発明のさらに一つの態様においては、上記のチオメチル化の検出において、第１プライマーと第２プライマーから生成されるｃＤＮＡ量の差を、逆転写後に、さらに、上記した核酸増幅法、例えば、リアルタイムＰＣＲ（例えば、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮを用いたインターカレーション法、又はＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法）を用いて測定することができる。また、上記したように、２ステップのＲＴ−ＰＣＲ法或いは１ステップＲＴ−ＰＣＲ法のいずれも用いることができる。
本発明のさらに別の一つの態様において、上記のｔＲＮＡのチオメチル化を検出する方法を用いて、被験者由来のｔＲＮＡのチオメチル化（リジンに対応するｔＲＮＡの３７番目のアデニンのチオメチル化）を検出することにより、被験者が２型糖尿病患者又はそのリスクがあるか否かを判定する方法が提供される。それにより、２型糖尿病の正確で、簡便かつ迅速な検査が可能であり、２型糖尿病の発症前検査、リスク検査、早期検査も可能である。
本発明において「被験者」とは、特に制限されず、２型糖尿病患者、２型糖尿病に対する感受性を有する者、及び健常人を含む。
また、本発明の検査方法を用いて、２型糖尿病を発症した患者から採取した試料を検査することにより、２型糖尿病の原因としてｔＲＮＡのチオメチル化に異常があるか否かを判断可能である。
本発明の別の一つの態様において、２型糖尿病に対する遺伝的感受性の検査キットが提供され、該キットは、少なくとも、リジンに対応するｔＲＮＡの３７番目のアデノシンを含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである第１プライマー、及びリジンに対応するｔＲＮＡの３７番目より３’側の任意の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである第２プライマーを含む。
上記したように、本発明の検出方法を用いると、短時間・低コスト・高感度でＲＮＡ修飾（例えば、チオメチル化）を検出することが可能である。また、本発明を用いれば、僅かなＲＮＡ試料（例えば、検体の末梢血からのｔＲＮＡ）を用いて、ＲＮＡ修飾（例えば、ｔＲＮＡのチオメチル化）を検出し、疾患（例えば、糖尿病）の発症リスクの診断を行うことができ、更には、患者に対しては、テーラーメード医療（個人の体質に合わせた治療、例えば治療薬の種類や投薬方法）を開発することができる。
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１：ｔＲＮＡのチオメチル化の検出
（１）リジンに対応するｔＲＮＡ（ｔＲＮＡLys（UUU））のチオメチル化
２型糖尿病の発症と最も高い相関があるＳＮＰｓが確認されているCdkal1は、リジンに対応するｔＲＮＡの３７番目のアデノシンをチオメチル化して、２−メチルチオ−Ｎ6−スレオニルカルバモイルアデノシン（ｍｓ2ｔ6Ａ）とする酵素である。チオメチル修飾（３７Ａ（ｍｓ2））されたリジンｔＲＮＡ及びCdkal1によるチオメチル化反応を図１に模式的に示す。
（２）ｔＲＮＡLys（UUU）の検出
ｔＲＮＡLys（UUU）の検出の概略図を図２に示す。ｔＲＮＡLys（UUU）のユニーク部位（チオメチル化部位）を標的とするように２つのリバースプライマーを用いて逆転写を行った。第１のリバースリバースプライマーは、チオメチル化部位（３７番目のアデノシン）を含む特異的領域にアニールするように設計し、一方、第２のリバースプライマーは、チオメチル化部位の３’方向の下流の特異的配列にアニールするように設計した。まず、ｔＲＮＡLys（UUU）を線状化し（Ｓｔｅｐ１）、ついで、第１又は第２のリバースプライマーを用いて、逆転写を行った（Ｓｔｅｐ２）。その後、第１のリバースプライマー又は第２のリバースプライマーのいずれかによって生成されたｃＤＮＡを、定量ＰＣＲを行って増幅した（Ｓｔｅｐ３）。
完全に修飾されたｔＲＮＡLys（UUU）の逆転写においては、３７番目のアデノシンのｍｓ2修飾が逆転写を減衰させるので、第２のリバースプライマーによって生成されるｃＤＮＡ量は、第１のリバースプライマーによって生成されるｃＤＮＡ量より少なくなる。一方、部分的に修飾されたｔＲＮＡLys（UUU）の場合は、修飾の減少に応じて、第２のリバースプライマーによって生成されるｃＤＮＡ量は、第１のリバースプライマーによって生成されるｃＤＮＡ量に近づく。
（３）ＲＮＡの単離
（３−１）粗精製ＲＮＡの単離
全ＲＮＡ単離物（粗精製ＲＮＡ）は、細胞又は組織（マウス肝臓）より、ＴＲｌｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いたグアニジンチオシアネート／フェノール／クロロフォルム法により、製造元のプロトコールに従い単離した。
（３−２）ＲＮＡの精製
個々のｔＲＮＡLys（UUU）は、Miyauchi, et al. Nucleic Acids Res. 35, e24 (2007) に記載の方法に従い、往復循環クロマトグラフィ（ＲＣＣ）法を用いて精製した。
（３−３）末梢血からのＲＮＡの単離
全ＲＮＡ（粗精製ＲＮＡ）は、１．５ｍｌの末梢血から、QIAamp RNA Blood Mini Kit（Qiagen）を用いて製造元のプロトコールに従って単離した。精製ＲＮＡは、５０ｍｌの末梢血から、過剰のQIAamp RNA Blood Mini Kit（Qiagen）の低張液を加えて赤血球を破壊し、その後、ＴＲｌｚｏｌを用いて白血球中の全ＲＮＡを精製することにより、単離した。
（４）質量分析
単離・精製したそれぞれのｔＲＮＡ（ｔＲＮＡLys（UUU）、ｔＲＮＡTrp、ｔＲＮＡPhe、ｔＲＮＡSer(UCN)、及びｔＲＮＡLeu(UUR)を消化してオリゴヌクレオチドにした後、Weiら（非特許文献４）に記載の方法に従って、液体クロマトグラフィ／質量分析を行った。
（５）プライマー
ｔＲＮＡLysのｍｓ2修飾を測定するために設計したプライマー配列（フォワードプライマー（forward primer）配列（配列番号２）、第１リバースプライマー（reverse Primer ｒ１）配列（配列番号３）、第２リバースプライマー（reverse Primer ｒ２）配列（配列番号４））を、ｔＲＮＡLys配列（配列番号１）（ｍｓ2修飾部位である３７番目のアデノシン（Ａ３７）を矢印で示す）とともに以下の表１に示す。
Figure 0006447829
 マウスミトコンドリアｔＲＮＡTrp、ｔＲＮＡPhe、及びｔＲＮＡSer(UCN)、及びｔＲＮＡLeu(UUR)のｍｓ2修飾を測定するために設計したプライマー配列（フォワードプライマー（forward primer）配列、第１リバースプライマー（reverse Primer ｒ１）配列、第２リバースプライマー（reverse Primer ｒ２）配列）を、それぞれのｔＲＮＡ配列（ｍｓ2修飾部位であるＡ３７を矢印で示す）とともに以下の表２に示す。
Figure 0006447829
 ヒトミトコンドリアｔＲＮＡTrp、ｔＲＮＡPhe、及びｔＲＮＡSer(UCN)、及びｔＲＮＡLeu(UUR)のｍｓ2修飾を測定するために設計したプライマー配列（フォワードプライマー（forward primer）、第１リバースプライマー（reverse Primer ｒ１）配列、第２リバースプライマー（reverse Primer ｒ２）配列）を、それぞれのｔＲＮＡ配列（ｍｓ2修飾部位であるＡ３７を矢印で示す）とともに以下の表３に示す。
Figure 0006447829
（６）逆転写及び定量ＰＣＲ（本明細書中、ｔＲＮＡのチオメチル化の検出のために用いる際は、「ｑＰＣＲ−ＭｔＲ」という場合がある）
細胞又は組織（例えば、肝臓）より単離した全ＲＮＡ（粗精製又は精製ＲＮＡ）を、特にことわりのない限り、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水で１００ng/mlに調製した。ゲノムの混入を避けるために、２０μlの反応液中、２μl（２００ng）の全ＲＮＡを５UnitsのＤＮａｓｅＩ（Roche）で、３７℃で２０分間分解し、次いで、７５℃で１０分間処理することにより、ＤＮａｓｅＩを熱不活性化した。ＤＮａｓｅ処理後に、消化した全ＲＮＡの２．５μlを、２０μMの第１リバースプライマー又は第２リバースプライマーを含む１μｌの溶液と混合し、次いで、６５℃で１０分間、熱変性を行った後、少なくとも５分間氷上にて急速に冷却した。氷上にて、組換え逆転写酵素（Transcriptor、Roche）を終濃度が、０．５unit/μlとなるように添加した。逆転写を、１０μlの全反応容量中で、５５℃で３０分間行い、次いで、８５℃で５分間、熱不活性化を行った。第１又は第２リバースプライマーから合成されたｃＤＮＡについて、SYBR Premix Ex Taq Kit（Takara）及びABI PRISM 7300 Real-Time PCRシステム（Applied biosystems）を用いて、製造元のプロトコールに従い、定量ＰＣＲを行った。
（７）ノックアウトマウス及び細胞培養
Cdkal1ノックアウトマウスは、Wei, F. Y. et al. J. Clin. Invest. 121, 3598-3608 (2011)（非特許文献４）に記載の方法に従って作成した。偏在的なCdk5rap1の発現を取り除くために、ｌｏｘＰ配列よってに隣接されたCdk5rap1のエクソン４及び５をもったトランスジェニックマウスを、ＣＡＧプロモーターの制御下にあるＣｒｅリコンビナーゼを発現しているトランスジェニックマウスと交配させた。全ての動物実験は、熊本大学の動物倫理委員会の承認を得た手順書（ID:B24-134、B24-132）に従って行った。
（８）トランスフェクション
ＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＢＳを含む高グルコース濃度ＤＭＥＭ培地（Invitrogen）で培養した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、以下のようにして行った。ＨｅＬａ細胞を、２４ウェルプレートに、３０％の密度になるように播種した。２４時間後、細胞に、ヒトCdk5rap1をターゲットとするｓｉＲＮＡ（Dharmacon）又はネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（Ambion）を、LIpofectamine RNAiMAX試薬（Invitrogen）を用いて、終濃度５０nMにて導入した。トランスフェクション３日後に、全ＲＮＡを上記の方法を用いて単離した。
（９）Cdkal1の一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）の同定
QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen）を用いて、２００μlの末梢血からゲノムＤＮＡを精製し、蒸留水で１０ng/μlとなるように調製した。Cdkal1のＳＮＰ（rs7754840）は、Taqman SNP Genotyping Assay Kit（Applied biosystems）を用いて検査した。ヒトのゲノム試料を用いた実験は、熊本大学の倫理委員会の承認（承認番号：ゲノム１５９）を得て行った。
実施例２：野生型マウス及びCadKal1 KOマウスの精製ＲＮＡを用いたｍｓ2修飾の検出
上記に記載のＲＮＡの単離方法に従い、野生型マウスの肝臓より３７番目のアデノシンがｍｓ2によって完全に修飾されているｔＲＮＡLys（UUU）を、CadKal1 KOマウスの肝臓よりｍｓ2修飾が完全に止められているｔＲＮＡLys（UUU）を精製した。精製したそれぞれのｔＲＮＡLys（UUU）を用いて、逆転写、次いで定量ＰＣＲを行った。結果を図３に示す。図３ａは、野生型マウスからのｔＲＮＡLys（UUU）を用いてｑＰＣＲ−ＭｔＲを行った結果を、図３ｂは、CadKal1 KOマウスからのｔＲＮＡLys（UUU）を用いてｑＰＣＲ−ＭｔＲを行った結果を示している。
完全にｍｓ2修飾された野生型ｔＲＮＡLys（UUU）をテンプレートとして用いた場合は、第２のリバースプライマー（ｒ２）によって得られる閾値サイクル数（threshold cycle：CT）ＣＴr2は、第１のリバースプライマー（ｒ１）によって得られる閾値サイクル数ＣＴr1に比べて、顕著に増加していた（図３ａ）。一方、ｍｓ2修飾を欠いているｔＲＮＡLys（UUU）の場合は、ＣＴr2は、ＣＴr1に近づいていた。これらの結果より、第２のリバースプライマーを用いた場合は、３７番目のアデノシンのｍｓ2修飾よって逆転写が減ぜられているが、第１のリバースプライマーを用いた場合は、逆転写に影響がないことが確認された。すなわち、ＣＴr2はｍｓ2修飾の程度を反映し、ＣＴr1は、ｔＲＮＡ試料中の全ｔＲＮＡ分子を反映していることが判った。
実施例３：試料中のｔＲＮＡにおけるｍｓ2修飾率の測定
慣用のｄｄＣＴ法と以下の計算モデルを用い、修飾率を表す指標として、任意の試料中のＣＴr1とＣＴr2間の差（ｄＣＴr2r1＝ＣＴr2−ＣＴr1）を用いることができる。すなわち、ｄＣＴr2r1値が小さければ小さいほど、ｔＲＮＡのｍｓ2修飾は少ない。また、以下の計算式に基づき、ｔＲＮＡのｍｓ2修飾率について既知の２つの参照試料を用いて、未知の試験試料中のｔＲＮＡのｍｓ2修飾率を求めることができる。
Figure 0006447829
 ｍｓ2修飾をもつｔＲＮＡ分子の総数をＬms、ｍｓ2修飾をもたないｔＲＮＡ分子の総数をＬt6とし、全ＲＮＡ分子数をＬtotalとする。従って、絶対修飾率（ｘ）は以下の式で表される。
Figure 0006447829
 逆転写の間、ｍｓ2修飾をもつｔＲＮＡは、第１のリバースプライマー（ｒ１）又は第２のリバースプライマー（ｒ２）によって、それぞれの率、ＲＴms r1又はＲＴms r2で転写される。一方、ｍｓ2修飾をもたないｔＲＮＡは、第１のリバースプライマー（ｒ１）又は第２のリバースプライマー（ｒ２）によって、それぞれの率、ＲＴt6 r1又はＲＴt6 r2で転写される。ｒ１による逆転写は、ｍｓ2修飾とは関係ないので、以下の式（３）で表され、一方、ｒ２による逆転写は、ｍｓ2修飾により減ぜられるので、以下の式（４）で表される。
Figure 0006447829
 Ｌms及びＬt6を含む全ＲＮＡ試料を用いて逆転写を行うと、以下の式（５）〜（７）のように表すことができる。
Figure 0006447829
 ここで、Ｒ0又はＭ0は、それぞれ、プライマーｒ１又はｒ２を用いて生成されたｃＤＮＡ量である。Ｒ0a又はＭ0aは、それぞれ、修飾率ａの全ＲＮＡ試料を用いて、プライマーｒ１又はｒ２で生成されたｃＤＮＡ量である。以下の方程式（８）は、引き続いてのＰＣＲによる指数関数的増幅を示している。
Figure 0006447829
 ここで、ＸTは、標的分子の閾値数（threshold number）であり、CTxは、標的増幅のための閾値サイクル数（threshold cycle）であり、Ｅは、標的増幅効率である。
修飾率ａの任意の試料からプライマーｒ１又はｒ２により生成されたｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行っている間は、以下の関係式（９）で表される。
Figure 0006447829
 Ｒ0aでＭ0aを割ると、以下の式（１０）が与えられる。
Figure 0006447829
 ここで、ＣＴr2aは、プライマーｒ２によって生成されるＭ0aの増幅の閾値サイクル数であり、ＣＴr1aは、プライマーｒ１によって生成されるＲ0aの増幅の閾値サイクル数である。
修飾率ａ又はｂの試料を比較すると、以下の式（１１）となる。
Figure 0006447829
 一方、式（４）と式（７）から以下の式（１２）が求められる。
Figure 0006447829
 修飾率ｗ、ｋ又はｓの個々の試料から以下（１３）の式が導かれる。
Figure 0006447829
 もし、修飾率ｗ及びｋが既に判っていれば、修飾率ｓを式（１３）から求められる。修飾率ｗ、ｋ、ｓが判らない場合でも、それぞれの間の修飾率の相対比較は、以下の式で表されるように、ｄＣＴr2r1を用いて容易である。
Figure 0006447829
実施例４：種々のｍｓ2修飾率のｔＲＮＡの測定
本発明の原理を用いて、種々のｍｓ2修飾率のｔＲＮＡの試料を測定した。野生型マウスからの精製ｔＲＮＡLys（UUU）とCadKal1 KOマウスからの精製ｔＲＮＡLys（UUU）を、表に示した割合で組み合わせることにより、種々のｍｓ2修飾率（２５、５０、７５、及び１００％）をもつｔＲＮＡを調製し、ｑＰＣＲ−ＭｔＲを行った。ｄｄＣＴ値は、サンプル１のｄＣＴr2r1値から各サンプルのｄＣＴr2r1値を引くことにより算出した。計算修飾率（calculated modification ratio）は、実施例３の式に従って算出した。結果を以下の表４に示す。
Figure 0006447829
 通常のｄＣＴ値は、ｍｓ2修飾率の減少にともなって減少した。また、完全にｍｓ2修飾されたｔＲＮＡ試料（Sample No.5）とｍｓ2修飾がないｔＲＮＡ試料（Sample No.1）を参照として、一部がｍｓ2修飾された試料（Sample Nos. 2〜4）の、計算上の修飾率と期待される修飾率を比較したところ、計算値が期待値を正確に予測できることが判った（図４）。これにより、修飾率が判っているｔＲＮＡを参照試料として用いて、或いは、予め求めておいた標準検量線を用いて、未知の試料中のｔＲＮＡの修飾率を測定できることが判った。
実施例５：粗精製ＲＮＡを用いたｍｓ2修飾の測定
少量の粗精製ＲＮＡを用いて、ｑＰＣＲ−ＭｔＲにより、ｍｓ2修飾の測定を行った。野生型マウスとCadKal1 KOマウスのそれぞれから、２００ngの全ＲＮＡを単離し、第１又は第２のリバースプライマーを用いて、ｑＰＣＲ−ＭｔＲを行った。結果を図５に示す。図５ａは、野生型マウスからの粗精製ＲＮＡを用いてｑＰＣＲ−ＭｔＲを行った結果を、図５ｂは、CadKal1 KOマウスからの粗精製ＲＮＡを用いてｑＰＣＲ−ＭｔＲを行った結果を示している。精製ｔＲＮＡLys（UUU）を用いた実験結果と一致し、CadKal1 KOマウスからの全ＲＮＡから得られたＣＴr2値は、野生型マウスからの全ＲＮＡから得られたＣＴr2値に比べて顕著に減少していた。
さらに、実施例４と同様に、野生型マウスからの全ＲＮＡ（粗精製ＲＮＡ）とCadKal1 KOマウスからの全ＲＮＡ（粗精製ＲＮＡ）を、特定の割合で組み合わせることにより、種々のｍｓ2修飾率（２５、５０、７５、及び１００％）をもつＲＮＡを調製し、同様にしてｑＰＣＲ−ＭｔＲを行った。各SampleのｄＣＴr2r1値は、Sample１のｄＣＴr2r1値をもとに標準化し、ｄｄＣＴ値として示している。結果を以下の表５に示す。
Figure 0006447829
 ｄＣＴ値は、ｍｓ2修飾率の減少にともなって減少した。また、完全にｍｓ2修飾されたｔＲＮＡ試料（Sample No.5）とｍｓ2修飾がないｔＲＮＡ試料（Sample No.1）を参照として、一部がｍｓ2修飾された試料（Sample Nos. 2〜4）の、計算上の修飾率と期待される修飾率を比較したところ、計算値が期待値を正確に予測できることが判った（図６）。これにより、全ＲＮＡを用いた場合でも、修飾率が判っている参照試料を用いて、或いは、予め求めておいた標準検量線を用いて、未知の試料中のｔＲＮＡの修飾率を測定できることが判った。
実施例６：少量の粗精製ＲＮＡを用いたｍｓ2修飾の測定
実施例５と同様にして測定を行った。但し、用いた全ＲＮＡ量は、２ngとした。野生型マウス及びCadKal1 KOマウスから得られた全ＲＮＡを、１ng/μlとなるように調製し、第１又は第２のリバースプライマーを用いて、ｑＰＣＲ−ＭｔＲを行った。結果を以下の表６及び図７に示す。ＲＮＡ量が２ngでも、十分に検出できることが判った。
Figure 0006447829
実施例７：末梢血からのＲＮＡ試料を用いた測定
Cdkal1 ＳＮＰ（rs775840）の２型糖尿病関連リスクアレルをもつ人及び健常人（Cdkal1 ＳＮＰのリスクアレルをもたない人）から末梢血を採取し、以下の実験を行った。末梢血試料から単離した全ＲＮＡ（粗精製ＲＮＡ）の１００ngを用いて、第１又は第２のリバースプライマーを用いて、ｑＰＣＲ−ＭｔＲを行った。ヒトのｔＲＮＡLys（UUU）の絶対ｍｓ2修飾率を求めるための参照が入手できないので、ｄＣＴr2r1値を用いて、相対修飾レベルを測定した。Cdkal1 ＳＮＰ（rs775840）の２型糖尿病関連リスクアレルをもつ人（個体数：６）及び健常人（個体数：７）のそれぞれの末梢血１．５mlから単離した全ＲＮＡのｄＣＴr2r1値を、修飾指標（Modification Index）として比較した。結果を図８に示す。Cdkal1 ＳＮＰのリスクアレルをもつ人のｄＣＴr2r1値は、健常人のｄＣＴr2r1値に比べて顕著に低かった。これは、２型糖尿病関連Cdkal1 ＳＮＰをもつ人において、ｍｓ2修飾が抑制されていることを示している。
ｑＰＣＲ−ＭｔＲの結果を、質量分析により確認した。Cdkal1 ＳＮＰのリスクアレルをもつ人及び健常人、それぞれの末梢血３０mlから単離した全ＲＮＡ５０μgを用いてｔＲＮＡLys（UUU）を精製し、精製ｔＲＮＡLys（UUU）の質量分析を行った。結果を図９に示す。図９ｂがリスクアレルをもつ人の結果であり、図９ａが健常人の結果である（マスクロマトグラム：ｍｓ2ｔ6Ａ（ｍ／ｚ４５９）、ｔ6Ａ（ｍ／ｚ４１３））。非修飾率は、ｔ6Ａとｍｓ2ｔ6Ａの合計領域に対するｔ6Ａ領域の比として標準化した。同じ個体から単離した全ＲＮＡを用いて３回実験した平均を示している。図９ｃに示されるように、リスクアレルをもつ人のｍｓ2未修飾ｔＲＮＡLys（UUU）は、１．４７倍に増加していた。
実施例８：
ミトコンドリアｔＲＮＡ試料を用いた測定
哺乳動物のミトコンドリアｔＲＮＡも、２−メチルチオ−Ｎ6−スレオニルカルバモイルアデノシン（ｍｓ2ｔ6Ａ）修飾を受けている。ミトコンドリアｔＲＮＡにおいては、ｔＲＮＡTrp、ｔＲＮＡPhe、及びｔＲＮＡSer(UCN)は、ｍｓ2ｔ6Ａ修飾を受けているが、ｔＲＮＡLeu(UUR)は、ｍｓ2ｔ6Ａ修飾を受けていない。哺乳動物細胞においては、Cdk5rap1が、Ａ３７において、Ｎ6−イソペンテニルアデノシン（ｉ6Ａ）を、ｍｓ2ｉ6Ａに変換している。
Cdk5rap1ノックアウト（Cdk5rap1 KO）マウスにおけるミトコンドリアｔＲＮＡのｍｓ2ｉ6Ａ修飾を、第１又は第２のリバースプライマーを用いて、ｑＰＣＲ−ＭｔＲを行うことにより、システマチックに調べた。野生型マウス及びCdk5rap1 KOマウスからそれぞれ全ＲＮＡ（粗精製ＲＮＡ）を調製し、前記表３に示されるプライマーを用いて、それぞれの、ｔＲＮＡTrp、ｔＲＮＡPhe、ｔＲＮＡSer(UCN)、及びｔＲＮＡLeu(UUR)のｄＣＴr2r1値を測定した。
結果を、以下の表７に示す。野生型マウス（ＷＴ）のｔＲＮＡTrp、ｔＲＮＡPhe、及びｔＲＮＡSer(UCN)のｄＣＴr2r1値は、Cdk5rap1 KOマウスから得られたｄＣＴr2r1値に比べて顕著に大きかった。このことは、ノックアウトマウスにおいて、ｔＲＮＡTrp、ｔＲＮＡPhe、及びｔＲＮＡSer(UCN)のｍｓ2修飾が抑制されていることを示している。一方、野生型マウスのｔＲＮＡLeu(UUR)のｄＣＴr2r1値は、Cdk5rap1 KOマウスから得られたｄＣＴr2r1値と殆ど同じであった。
Figure 0006447829
 また、野生型マウス及びCdk5rap1 KOマウスの肝臓から単離・精製した、ミトコンドリアｔＲＮＡTrp、ｔＲＮＡPhe、及びｔＲＮＡSer(UCN)のそれぞれについて、質量分析によりｍｓ2修飾を確認したところ、ｔＲＮＡTrp、ｔＲＮＡPhe、及びｔＲＮＡSer(UCN)のｍｓ2修飾が消失していることが確認され、ｑＰＣＲ−ＭｔＲの結果と一致した。結果を図１０に示す。
実施例９：ＨｅＬａ細胞を用いたｔＲＮＡのｍｓ2修飾の測定
Cdk5rap1に対するｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞（KD）及びコントロールのｓｉＲＮＡを導入したＨｅＬａ細胞（Control）を調製し、それぞれの細胞から、実施例１に記載の方法に従って、粗精製ＲＮＡを単離した。単離した粗精製ＲＮＡを用いて、第１又は第２のリバースプライマーを用いて、ｑＰＣＲ−ＭｔＲを行い、ｔＲＮＡTrp、ｔＲＮＡPhe、ｔＲＮＡSer(UCN)、及びｔＲＮＡLeu(UUR)のｄＣＴr2r1値を測定した。結果を、以下の表８に示す。
Figure 0006447829
 ＨｅＬａ細胞を用いた結果も、マウスを用いた結果と同様に、Controlの細胞から得られたｔＲＮＡTrp、ｔＲＮＡPhe、及びｔＲＮＡSer(UCN)のｄＣＴr2r1値は、Cdk5rap1をノックダウン（KD）した細胞から得られたｄＣＴr2r1値に比べて顕著に大きかった。一方、ControlｔＲＮＡLeu(UUR)のｄＣＴr2r1値は、Cdk5rap1 KDのｄＣＴr2r1値と殆ど同じであった。
実施例１０：Cdcak1遺伝子変異とｔＲＮＡLys（UUU）の修飾の相関の検討
実施例１に従い、ヒトの末梢血液よりＤＮＡ及びＲＮＡを抽出した。実施例１（９）の方法に従い、糖尿病の発症と関わるCdkal1遺伝子変異を同定し、危険型Cdkal1変異をホモで持つ群（C/C、n=20）、非危険型Cdkal1 変異をホモで持つ群（G/G、n=31）及びヘテロ群（G/C、n=35）に分けた。次に各群のＲＮＡを用いてＰＣＲ法を行ってｔＲＮＡLys（UUU）の修飾を測定して、相対的修飾率を検討した。結果を図１１に示す。その結果、糖尿病発症のリスクを高める危険型Cdkal1遺伝子変異を持つ群は、非危険型Cdkal1変異を持つ群より有意にチオメチル化の修飾率が低下した。P<0.05を有意とする。検定はANOVAを用いた。
実施例１１：チオメチル化とインスリン分泌能の相関の検討
ｔＲＮＡLys（UUU）のチオメチル化とインスリン分泌能の相関を検討するために、ヒトにおける糖負荷試験を常法に従って実施した。一晩絶食したボランティア２８人（Cdkal1変異遺伝子型：C/C, n=9、G/C, n=12、G/G, n=7）に７５グラムのブドウ糖を含む溶液（トレランG）を飲んでもらい、飲む前と飲んで３０分後に採血し、血中インスリン、血糖値を基にインスリン分泌能(Corrected insulin response)を算出した。また、同血液サンプルよりＲＮＡを精製し、ＰＣＲ法によりチオメチル化修飾の度合いの検出し、インスリン分泌能とチオメチル化の度合いとの相関を検討した。結果を図１２に示す。その結果、チオメチル化修飾が低いほど、インスリン分泌能が低いという正の相関が認められた。
上記の記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
本発明の検出方法を用いて、短時間・低コスト・高感度でＲＮＡ修飾（例えば、チオメチル化）を検出することができる。また、本発明の検出方法を用いて、僅かなＲＮＡ試料（例えば、末梢血からのｔＲＮＡ）を用いて、ＲＮＡ修飾（例えば、ｔＲＮＡのチオメチル化）を検出し、疾患（例えば、糖尿病）の発症リスクの診断を行うことができる。

Claims (21)

  1. ｔＲＮＡに存在するＲＮＡ修飾を検出するための方法であって、
    前記ＲＮＡ修飾が、チオメチル化、メチル化又はタウリン化であり、
    以下の２つの工程：
    ａ．第１プライマーを用いて、該ｔＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する工程、ここで、該第１プライマーは、該ｔＲＮＡ上の該ＲＮＡ修飾を有する部位を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
    ｂ．第２プライマーを用いて、該ｔＲＮＡから逆転写によりｃＤＮＡを生成する工程、ここで、該第２プライマーは、該ｔＲＮＡ上の該ＲＮＡ修飾を有する部位より３’側の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
    をそれぞれ別々又は同時に行い、それぞれの工程から生成されたｃＤＮＡ量の差を測定することにより該ＲＮＡ修飾を検出する方法。
  2. 前記工程ａとｂを別々に行う請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｃＤＮＡ量の差を核酸増幅反応又は蛍光法により測定する請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記核酸増幅反応が、定量ＰＣＲ法又はリアルタイム定量ＰＣＲ法を用いて行われる、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ｃＤＮＡ量の差を、核酸増幅反応における核酸の増幅速度の差として測定する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ｔＲＮＡに存在するチオメチル化が、Ｌｙｓに対応するｔＲＮＡ、Ｔｒｐに対するｔＲＮＡ、Ｐｈｅに対するｔＲＮＡ、又はＳｅｒ（ＵＣＮ）に対するｔＲＮＡのいずれかの３７番目のアデノシンのチオメチル化である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記ｔＲＮＡに存在するチオメチル化が、Ｌｙｓに対応するｔＲＮＡの３７番目のアデノシンのチオメチル化である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ｔＲＮＡがヒト組織又はヒト血液由来のｔＲＮＡを含む、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
  9. 前記ｔＲＮＡがヒト末梢血由来のｔＲＮＡを含む請求項８に記載の方法。
  10. ｔＲＮＡに存在するＲＮＡ修飾率が既知の少なくとも２つの試料、及びＲＮＡ修飾率が未知の試料、のそれぞれについて請求項１〜９のいずれか一つに記載の方法を行い、それぞれの試料について測定されたｃＤＮＡ量の差を示すパラメーターを比較することにより、未知の試料中のＲＮＡ修飾率を測定する方法。
  11. 前記核酸増幅反応が定量ＰＣＲ法又はリアルタイム定量ＰＣＲ法であり、かつ前記パラメーターが、第１のプライマー及び第２のプライマーを用いた際の標的核酸増幅のための閾値サイクル数（threshold cycle）の差である、請求項１０に記載の方法。
  12. ｔＲＮＡに存在するＲＮＡ修飾率が未知の試料について請求項１〜９のいずれか一つに記載の方法を行い、該試料について測定されたｃＤＮＡ量の差を示すパラメーターを予め決められている検量線と比較することにより、未知の試料中のＲＮＡ修飾率を測定する方法。
  13. 前記核酸増幅反応が定量ＰＣＲ法又はリアルタイム定量ＰＣＲ法であり、かつ前記パラメーターが、第１のプライマー及び第２のプライマーを用いた際の標的核酸増幅のための閾値サイクル数（threshold cycle）の差である、請求項１２に記載の方法。
  14. 試料中のｔＲＮＡに存在するＲＮＡ修飾を検出するためのキットであって、
    前記ＲＮＡ修飾が、チオメチル化、メチル化又はタウリン化であり、
    該ｔＲＮＡ上の該ＲＮＡ修飾を有する部位を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである第１のプライマー、および
    該ｔＲＮＡ上の該ＲＮＡ修飾を有する部位より３’側の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである第２のプライマー、
    を含むキット。
  15. 前記ＲＮＡ修飾が、ｔＲＮＡに存在するチオメチル化である、請求項１４に記載のキット。
  16. 前記ｔＲＮＡに存在するチオメチル化が、Ｌｙｓに対応するｔＲＮＡ、Ｔｒｐに対するｔＲＮＡ、Ｐｈｅに対するｔＲＮＡ、又はＳｅｒ（ＵＣＮ）に対するｔＲＮＡのいずれかの３７番目のアデノシンのチオメチル化である、請求項１５に記載のキット。
  17. さらに、ＰＣＲを行うための別のプライマーを含む、請求項１４〜１６のいずれか一つに記載のキット。
  18. 請求項７に記載の方法を用いて、前記ｔＲＮＡが由来する被験者が２型糖尿病又はそのリスクがあるか否かを判定する方法（但し、医師による診断行為を除く）。
  19. 前記ｔＲＮＡは、被験者の組織又は血液に由来するｔＲＮＡである請求項１８に記載の方法。
  20. 請求項７に記載の方法を用いて、前記ｔＲＮＡが由来する被験者のインスリン分泌能を検定する方法（但し、医師による診断行為を除く）。
  21. 前記ｔＲＮＡは、被験者の組織又は血液に由来するｔＲＮＡである請求項２０に記載の方法。
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