CN112105746B - 一种rna化学修饰的单基因单碱基分辨率检测方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种检测RNA目标位点X的化学修饰的方法,其包括:(1)获得RNA样品,在RNA样品中选择包含RNA目标位点X的目标RNA区段;(2)SELECT步骤;(3)PCR扩增步骤;(4)将所述PCR阈值循环数与PCR阈值循环数参比值比较,或者将所述PCR扩增产物量与PCR扩增产物量参比值比较,以确定目标RNA位点X是否存在目标化学修饰。还提供了一种鉴定RNA修饰酶或RNA去修饰酶底物靶位点的方法和一种用于定量转录本中RNA修饰率的方法。
Description
技术领域
本公开涉及分子生物学领域,具体涉及一种RNA化学修饰的单基因单碱基分辨率检测方法。
背景技术
在生命的三个领域即细菌、古生菌、真核生物中发现了超过100种RNA的化学修饰。表观转录组标记N6-甲基腺苷(m6A)是真核mRNA和长非编码RNA(lncRNA)中最丰富的转录后RNA修饰。这些标记通常由m6A修饰酶(Writer)形成,已经鉴定出人类m6A修饰酶(甲基转移酶复合物)的几个亚单位:METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429和RBM15(RNA结合基序蛋白15),并且位于MAT2A发夹和剪接体U6 snRNA中的m6A由METTL16引入。m6A被称为去修饰酶的AlkB家族双加氧酶(例如人的FTO和ALKBH5)去除。m6A结合蛋白可以读取m6A标记。已知m6A标记会影响RNA加工和代谢,包括前体mRNA剪接、出核、mRNA稳定性和翻译。因此,m6A标记在许多生物学过程如干细胞分化、昼夜节律、紫外线诱导的DNA损伤和疾病发病机制中发挥调节作用。
迄今为止转录组范围的m6A的检测方法依赖于m6A-抗体免疫沉淀(m6A-IP),这主要归因于m6A的甲基的惰性反应性。第一个开发的方法m6A-测序(或MeRIP-seq)结合了m6A-IP和高通量测序来定位大约200个核苷酸的RNA区段内的m6A位点。随后,m6A研究人员开发了PA-m6A-seq和miCLIP方法,以更高的分辨率绘制m6A标记。具体而言,PA-m6A-seq在体内掺入4-硫尿苷(4SU)以在UV(365nm)暴露下将抗m6A抗体与RNA交联,从而在约23个核苷酸分辨率下定位m6A位点;miCLIP在UV(254nm)暴露下使RNA与抗m6A抗体交联,并且基于逆转录诱导的突变或截断,可以以单核苷酸分辨率鉴定m6A残基。由于抗m6A抗体的特异性和低交联产率的问题,PA-m6A-seq或miCLIP方法仅识别m6A位点有限的部分,并且这两种方法在m6A研究中都没有像m6A/MeRIP-seq那样被广泛使用。
尽管m6A测序提供了转录组范围的信息,但是对于研究m6A的生物学功能来说,非常需要一种检测单个转录物的特定m6A修饰的方法。m6A-IP-qPCR方法被广泛用于功能性m6A研究;然而,它不提供单碱基分辨率,不能定量,并且取决于m6A抗体的特异性。已经开发了几种方法来检测单核苷酸分辨率的m6A标记。迄今为止,基于RNase H的SCARLET方法是唯一能够定量检测单个mRNA或lncRNA中m6A的方法,但其非常耗时,而且需要放射性标记,这限制了其更广泛的应用。
发明内容
本公开的提供了一种检测RNA目标位点X的化学修饰的方法,其包括:
(1)获得RNA样品,在RNA样品中选择包含RNA目标位点X的目标RNA区段;
(2)SELECT步骤:在目标RNA区段内、在RNA目标位点X的上游和下游分别设计上游探针Px1和下游探针Px2,利用所述下游探针Px2通过DNA聚合酶进行延伸,并用连接酶连接上游探针Px1和延伸后的下游探针Px2,得到SELECT产物;
其中,上游探针Px1与目标RNA位点X的上游互补配对,且上游探针Px15’末端的第一个核苷酸和位于目标RNA位点X上游与目标RNA位点X距离1nt的核苷酸互补配对;
下游探针Px2与目标RNA位点X的下游互补配对,且下游探针Px23’末端的第一个核苷酸和位于目标RNA位点X下游与目标RNA位点X距离1、2、3、4、5、6、7、8、9或10nt的核苷酸互补配对;
优选地,上游探针Px1与目标RNA位点X的上游互补配对的序列长度为15-30nt;下游探针Px2与目标RNA位点X的上游互补配对的序列长度为15-30nt;
(3)PCR扩增步骤:将步骤(2)获得的SELECT产物进行PCR扩增,确定PCR阈值循环数或PCR扩增产物量,优选通过qPCR荧光信号确定PCR阈值循环数,或优选通过聚丙烯酰胺凝胶电泳确定PCR扩增产物量;和
(4)将所述PCR阈值循环数与PCR阈值循环数参比值比较,或者将所述PCR扩增产物量与PCR扩增产物量参比值比较,以确定目标RNA位点X是否存在目标化学修饰。
在本公开的一些实施方案中,所述化学修饰选自m6A修饰、m1A修饰、假尿苷修饰和2′-O-甲基化修饰。
在本公开的一些实施方案中,所述DNA聚合酶选自Bst 2.0 DNA聚合酶或Tth DNA聚合酶,优选Bst 2.0 DNA聚合酶;所述连接酶选自SplintR连接酶、T3 DNA连接酶、T4 RNA连接酶2、T4 DNA连接酶,优选SplintR连接酶或T3 DNA连接酶。
在本公开的一些实施方案中,在步骤(4)中,所述PCR阈值循环数参比值是PCR阈值循环数第一参比值或者PCR阈值循环数第二参比值,其中:
所述PCR阈值循环数第一参比值为:
通过与所述目标RNA区段相同的方法确定的第一参比序列的PCR阈值循环数,所述第一参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游引物3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游引物5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列,且所述第一参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰;或者
其中,所述PCR阈值循环数第二参比值为:
通过与所述目标RNA区段相同的方法确定的第二参比序列的PCR阈值循环数,所述第二参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游引物3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游引物5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列,且所述第二参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X2存在目标修饰。
需要说明的是,在本文中提到“具有相同核苷酸序列”时,不考虑核苷酸上的修饰。也就是说,具有相同核苷酸序列的两个RNA修饰状态或修饰种类可以相同或不同。
在本公开的一些实施方案中,当所述PCR阈值循环数大于PCR阈值循环数第一参比值时,则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰;或者
当所述PCR阈值循环数等于PCR阈值循环数第二参比值时,则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰。
在本公开的一些实施方案中,当所述PCR阈值循环数与PCR阈值循环数第一参比值多至少0.4-10个循环,优选至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10个循环时,则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰。
在本公开的一些实施方案中,当所述PCR阈值循环数与PCR阈值循环数第一参比值多至少0.4-10个循环,优选至少0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10个循环时,则确定RNA目标位点存在目标化学修饰。
在本公开的一些实施方案中,在步骤(4)中,所述PCR扩增产物量参比值是PCR扩增产物量第一参比值或者PCR扩增产物量第二参比值,其中:
所述PCR扩增产物量第一参比值为:
通过与所述目标RNA区段相同的方法确定的第一参比序列的PCR扩增产物量,所述第一参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列,且所述第一参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰;或者
其中,所述PCR扩增产物量第二参比值为:
通过与所述目标RNA区段相同的方法确定的第二参比序列的PCR扩增产物量,所述第二参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列,且所述第二参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X2存在目标修饰。
在本公开的一些实施方案中,当所述PCR扩增产物量小于PCR扩增产物量第一参比值时,则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰;或者
当所述PCR扩增产物量等于PCR扩增产物量第二参比值时,则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰。
在本公开的一些实施方案中,方法还包括以下步骤:
(c)控制初始RNA输入量:在所述目标RNA区段内,任选一个RNA非目标位点N,优选地,所述RNA非目标位点N位于所述RNA目标位点X的上游6nt至下游2nt处;在所述RNA非目标位点N的上游和下游分别设计上游探针Pn1和下游探针Pn2,利用所述下游探针Pn2通过DNA聚合酶进行延伸,并用连接酶连接上游探针Pn1和延伸后的下游探针Pn2,得到SELECT产物;
将SELECT产物进行PCR扩增,确定PCR阈值循环数;
根据PCR阈值循环数控制初始RNA输入量,使目标RNA区段与第一参比序列或第二参比序列的初始RNA输入量相等;
其中,所述第一参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:当N位点位于X位点上游时,核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与N位点的上游探针Pn1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列;当N位点位于X位点下游时,核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与N位点下游探针Pn2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列;且所述第一参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰;或者
所述第二参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:当N位点位于X位点上游时,核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与N位点的上游探针Pn1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列;当N位点位于X位点下游时,核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与N位点下游探针Pn2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列;且所述第二参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰。
在本公开的一些实施方案中,所述SELECT步骤在包含以下的反应体系中进行:
RNA样品,优选地所述RNA样品为细胞提取的总RNA或mRNA;更优选地,所述总RNA或mRNA浓度为10ng、1ng、0.2ng、0.02ng或更低;或者更优选地,所述总RNA或mRNA浓度为10ng、100ng、1μg、10μg或更高;
dNTP,优选dTTP,更优选5-100μM的dTTP;
DNA聚合酶,优选Bst 2.0DNA聚合酶、更优选0.0005-0.05U的Bst 2.0DNA聚合酶、最优选0.01U的Bst 2.0DNA聚合酶;
连接酶,优选SplintR连接酶、更优选0.1-2U的SplintR连接酶、最优选0.5U的SplintR连接酶。在本公开的一些实施方案中,所述SELECT步骤在30-50℃、优选37-42℃、更优选40℃的反应温度下进行。
在本公开的一些实施方案中,在步骤(1)之前还包括以下步骤:
分别用RNA去修饰酶或RNA去修饰酶与EDTA的混合物处理所述RNA样品;其中,用RNA去修饰酶处理的RNA样品用作第一参比序列;
优选地,所述RNA去修饰酶是FTO或ALKBH5。
在本公开的一些实施方案中,RNA样品是细胞中提取的总RNA、mRNA、rRNA或lncRNA。
本公开还提供了一种鉴定RNA修饰酶或RNA去修饰酶底物靶位点的方法,其包括:
(1)制备RNA修饰酶或RNA去修饰酶缺陷型细胞、或RNA修饰酶或RNA去修饰酶低表达细胞,培养后,提取RNA;
(2)根据权利要求1的步骤(1)-(3)确定针对RNA目标位点X的PCR阈值循环数或PCR扩增产物量;
(3)将所述PCR阈值循环数与PCR阈值循环数参比值比较,或者将所述PCR扩增产物量与PCR扩增产物量参比值比较,以确定所述RNA修饰酶或RNA去修饰酶是否在所述RNA目标位点X进行化学修饰,
其中,所述PCR阈值循环数参比值为正常细胞通过与RNA修饰酶或RNA去修饰酶缺陷型细胞、或RNA修饰酶或RNA去修饰酶低表达细胞相同的方法获得的PCR阈值循环数,
所述PCR扩增产物量参比值为正常细胞通过与RNA修饰酶或RNA去修饰酶缺陷型细胞、或低表达细胞相同的方法获得的PCR扩增产物量;
其中,所述靶位点是单基因单位点;
优选地,当所述PCR阈值循环数小于PCR阈值循环数参比值时,则所述RNA修饰酶或去修饰酶在所述RNA目标位点进行化学修饰;
或者,优选地,当所述PCR扩增产物量大于PCR扩增产物量参比值时,所述RNA修饰酶或去修饰酶在所述RNA目标位点进行化学修饰。
在本公开的一些实施方案中,所述RNA化学修饰为选自m6A修饰、m1A修饰、假尿苷修饰和2′-O-甲基化修饰,优选为m6A修饰;所述RNA化学修饰酶包括m6A修饰酶;优选地,所述m6A修饰酶为甲基转移酶复合物或METTL16;所述甲基转移酶复合物选自以下的任意成员或其组合:METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429(又称VIRMA或VIRILIZER)、HAKAI、ZC3H13、RBM15和RBM15B;所述RNA去修饰酶是FTO或ALKBH5。
本公开还提供了一种用于定量转录本中RNA修饰率的方法,其包括:
(1)获得RNA样品,在RNA样品中选择包含RNA目标位点X的目标RNA区段;
(2)确定所述RNA样品中目标RNA区段的含量,其包括:
(2a)在所述目标RNA区段内,任选一个RNA非目标位点N,优选地所述RNA非目标位点N位于所述RNA目标位点X的上游6nt至下游2nt处;在所述RNA非目标位点N的上游和下游分别设计上游探针Pn1和下游探针Pn2,利用所述下游探针Pn2通过DNA聚合酶进行延伸,并用连接酶连接上游探针Pn1和延伸后的下游探针Pn2,得到SELECT产物;将SELECT产物进行PCR扩增,获得PCR阈值循环数N;
(2b)将参比序列梯度稀释成一系列浓度,分别采用步骤(1a)的方法获得与各浓度对应的PCR阈值循环数Nn,根据浓度和PCR阈值循环数Nn确定标准曲线1;优选地,所述一系列浓度在0.1fmol至3fmol之间,优选在0.2fmol至2.8fmol之间,更优选在0.2fmol至2.4fmol之间;
其中,参比序列是第一参比序列、第二参比序列、或两者以任意比例的混合物,
所述参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:当N位点位于X位点上游时,核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与N位点的上游探针Pn1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列;当N位点位于X位点下游时,核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与N位点下游探针Pn2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列,
且所述第一参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰,所述第二参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰;
优选地,所述参比序列的长度为至少40nt;
(2c)将PCR阈值循环数N与标准曲线1比较,确定所述RNA样品中目标RNA区段的含量;
(3)将第一参比序列与第二参比序列按一系列摩尔浓度比混合得到一系列混合物,对混合物应用权利要求1的(2)SELECT步骤和(3)PCR扩增步骤,获得PCR阈值循环数A1或PCR扩增产物量A2,根据摩尔比和PCR阈值循环数A1或者根据摩尔比和PCR扩增产物量A2确定标准曲线2;优选地,所述RNA样品与第一参比序列或与第二参比序列以10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8和0∶1的摩尔浓度比混合;;
(4)对所述样品RNA应用权利要求1的(2)SELECT步骤和(3)PCR扩增步骤,获得PCR阈值循环数B1或PCR扩增产物量B2;和
(5)通过PCR阈值循环数B1或PCR扩增产物量B2与标准曲线2比较,计算出RNA样品中RNA目标位点X的修饰率。
在本公开的一些实施方案中,RNA样品是细胞中提取的总RNA、mRNA、rRNA或lncRNA。
本公开提供了一种基于单碱基延伸和连接的PCR扩增方法,用于单基因单碱基分辨率检测RNA中的化学修饰。原理是:RNA中的化学修饰,例如m6A修饰,阻碍(i)DNA聚合酶的单碱基延伸活性和(ii)连接酶的切口连接效率,并采用基于qPCR的检测。该方法命名为SELECT法。在本公开的一个优选实施方案中,具有PCR接头的两个合成DNA寡核苷酸(称为上游探针和下游探针)与RNA互补退火但在m6A位点相对处留下核苷酸间隙。存在于RNA模板中的化学修饰,例如m6A修饰,选择性地阻碍Bst DNA聚合酶介导的Up探针的单碱基延伸。重要的是,尽管两个选择步骤中的第一步不是100%有效(仍然会在RNA模板中从给定的修饰位点形成少量延伸产物),但第二步的切口连接再次降低了所形成的产物量。也就是说,RNA模板中的任何化学修饰,例如m6A修饰,用于选择性地阻止连接酶在上游探针和下游探针之间的切口连接活性。因此,化学修饰,例如m6A修饰,在经过两轮选择后,与由未修饰的RNA模板形成的产物相比,由含化学修饰例如m6A修饰的RNA模板形成的最终连接产物的量显著减少,因此能够对化学修饰例如m6A修饰的与未修饰的靶模板进行简单的基于qPCR的检测定量。图1示出了SELECT法检测m6A的示意图。
本公开的方法可以准确、高效地在许多类型的RNA例如rRNA、lncRNA、mRNA中以单碱基分辨率鉴定化学修饰位点例如m6A修饰位点;还可以精确定量转录本中RNA修饰率;并可用于验证各种化学修饰酶例如m6A修饰酶的特定靶位点;灵敏度高,可用于低丰度RNA或极低丰度RNA的检测;无需放射性标记,环境友好。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例和现有技术的技术方案,下面对实施例和现有技术中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了SELECT法检测m6A的示意图。在单管反应中对RNA中m6A进行两步选择:在第一步中,m6A通过阻碍DNA聚合酶延长靶序列的能力,从而阻碍在下游探针上与m6A位点相对的位置上添加胸苷;在第二步中,RNA模板中存在的m6A标记选择性地阻止DNA连接酶催化上游探针和下游探针之间的切口连接;然后,使用qPCR定量最终的延伸和连接的产物。
图2示出了对N位点选择的评价。(a)qPCR的阈值循环(CT)柱形图,显示SELECT法检测Oligo1-m6A与Oligo1-A中X,X-1,X-2,X-4,X-6,X+1和X+2位点的结果;(b)qPCR的阈值循环(CT)柱形图,显示SELECT法检测Oligo2-m6A与Oligo2-A中X,X-1,X-2,X-4,X-6位点的结果;在该测定中使用1fmol RNA;误差表示平均值±s.d;2个生物重复×2个技术重复。
图3示出了使用优化的SELECT法对寡核苷酸模型进行m6A检测的结果。(a)qPCR的阈值循环(CT)的实时荧光扩增曲线和柱形图,显示SELECT法检测Oligo1-m6A v.s.Oligo1-A的X位点和N位点(输入对照)的结果;(b)qPCR的阈值循环(CT)的实时荧光扩增曲线和柱形图,显示SELECT法检测Oligo2-m6A v.s.Oligo2-A的X位点和N位点(输入对照)的结果;误差表示平均值±s.d;3个生物重复×2个技术重复;Rn是与被动参比染料(ROX)的荧光标准化相关的良好的原始荧光。
图4示出了SELECT法结合PCR和TBE-PAGE检测Oligo1-m6A v.s.Oligo1-A寡核苷酸模型的结果。
图5示出了通过Oligo1-m6A与Oligo1-A的不同比例混合验证SELECT法选择性的结果。(a)SELECT法检测具有已知m6A比例的Oligo1-m6A与Oligo1-A的混合物,得到的实时荧光扩增曲线;(b)SELECT法检测的相对产物(归一化为2%的100%m6A的2CT值)与m6A比例之间的线性关系。
图6示出了qPCR(左侧y轴)的阈值循环(CT)柱形图和不同CT(ΔCT)(右侧y轴)的线形图,显示用于SELECT法的7种连接酶:SplintR连接酶(a)、T3 DNA连接酶(b)、T4 RNA连接酶2(c)、T4 DNA连接酶(d)、T7 DNA连接酶(e)、9°NTMDNA连接酶(f)和Taq DNA连接酶(g)的性能测试结果。误差表示平均值±s.d;2个生物重复×2个技术重复。
图7示出了qPCR CT(左侧y轴)的柱形图和不同CT(ΔCT)(右侧y轴)的线形图,显示用于检测Oligo1-m6A与Oligo1-A中X位点SELECT法下列反应条件的优化:温度(a)、dTTP浓度(b)、Bst 2.0 DNA聚合酶剂量(c)和SplintR连接酶剂量(d)。误差表示平均值±s.d;2个生物重复×2个技术重复。
图8示出了dTTP和dNTP对SELECT法检测Oligo1-m6A与Oligo1-A中X位点和N位点的影响。误差表示平均值±s.d;3个生物重复×2个技术重复。
图9示出了用于SELECT法的qPCR引物的扩增效率。SELECT法检测Oligo1产生的DNA片段,TA克隆pGEM-T载体中。(a)通过Sanger测序确认的Oligo1 qPCR扩增子的序列;(b)CT与重组质粒浓度lg的线性图。从斜率-3.39计算,我们设计的qPCR引物的扩增效率为97.2%。误差表示平均值±s.d;2个生物重复×3个技术重复。
图10示出了更多下游探针用于SELECT法的结果,其中下游探针3’末端的第一个核苷酸和位于目标RNA位点X下游与目标RNA位点X距离2nt(a)、3nt(b)、4nt(c)的核苷酸互补配对。
图11示出了SELECT法与FTO辅助的去甲基化步骤的组合总RNA或polyA-RNA中m6A位点的结果。(a)FTO辅助的SELECT法检测m6A;(b)从大肠杆菌纯化的重组FTO蛋白的考马斯蓝染色;(c)UPLC-MS/MS检测RNA中m6A含量,FTO在从HeLa或HEK293T细胞分离的总RNA或polyA-RNA中的m6A去甲基化活性,EDTA螯合辅因子Fe2+并使FTO失活。
图12示出了qPCR的阈值循环(CT)的实时荧光扩增曲线和柱形图,显示SELECT法检测Hela细胞28S rRNA(30ng)的A2511中的m6A4190和A4194位点(输入对照)的结果。
图13示出了qPCR的阈值循环(CT)的实时荧光扩增曲线和柱形图,显示SELECT法检测Hela细胞IncRNA MALAT1(10ng)的m6A2515、m6A2577、m6A2611和A2511、A2624(输入对照)的结果。
图14示出了qPCR的阈值循环(CT)的实时荧光扩增曲线和柱形图,显示SELECT法检测HEK293细胞mRNA H1F0(1μg)的m6A1211和A1207(输入对照)的结果。
图15示出了HEK293细胞mRNA H1F0中的推定m6A位点在几个报告的m6A测序数据中作图。
图16示出了采用FTO辅助的SELECT法检测28S rRNA的m6A4190和A4194位点(输入对照)和lncRNA MALAT1中m6A2577和A2614(输入对照),所得的延伸和连接产物的PCR扩增的PAGE凝胶电泳结果。对于m6A4190,A4194,m6A2577和A2614这四个位点,PCR产物长度分别为79bp、79bp、100bp和101bp,PCR循环数分别为22、21、29和25个。。
图17示出了FTO辅助的SELECT结果的CT柱形图,使用不同量的polyA-RNA检测lncRNA MALAT1中的m6A2577位点(a)和A2614位点(b);误差表示平均值±s.d;2个生物重复×3个技术重复。
图18示出了SELECT法定量转录本中的m6A修饰率的结果。
图19示出了SELECT法鉴定m6A修饰酶METTL3的生物靶位点的结果。(a)SELECT法结合用于鉴定m6A修饰酶的生物学靶位点的遗传学方法;(b)Western印迹显示METTL3+/-HeLa杂合细胞中METTL3蛋白水平降低;(c)UPLC-MS/MS显示对照细胞和METTL3+/-HeLa杂合细胞中的总m6A水平;(d)qPCR的阈值循环(CT)的实时荧光扩增曲线和柱形图,显示SELECT法检测对照与METTL3+/-细胞中的lncRNA MALAT1中的m6A2515和A2511(输入对照)的结果,确定MALAT1的2515位点是METTL3的生物学靶位点。误差表示平均值±s.d;2个生物重复×3个技术重复。
图20示出了SELECT法鉴定m6A修饰酶METTL3的生物靶位点的结果。(a)MALAT1的qPCR扩增CT与逆转录混合物的相对浓度lg的线性图,从斜率-3.26计算,我们设计的MALAT1qPCR引物的扩增效率为102.7%;(b)在对照和METTL3+/-样品中MALAT1区段的实时荧光扩增曲线,CT值显示在表中。通过Qubit测量总RNA的量,并通过qPCR定量来自对照和METTL3+/-样品的总RNA中MALAT1的量。用2ΔCT法计算,METTL3+/-中的MALAT1是对照中的1.526倍。在此,使用来自METTL3+/-细胞的2μg总RNA和来自对照细胞的3.05μg总RNA;误差表示平均值±s.d;2个生物重复×3个技术重复。
图21示出了SELECT法用于鉴定其他类型的RNA修饰的实时荧光扩增曲线和柱形图,显示了SELECT法检测Oligo4-m1A与Oligo4-A(a),Oligo1-Am与Oligo1-A(b)、Oligo5-Ψ与Oligo5-U(c)的X位点和N位点的结果。所用的RNA的浓度为1fmol。误差表示平均值±s.d;2个生物重复×3个技术重复。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案、及优点更加清楚明白,以下参照附图并举实施例,对本公开进一步详细说明。如无特殊说明,实施例中所用的试剂和实验材料均为常规市售试剂和实验材料,实施例中所用的方法为本领域技术人员所熟知的常规方法。
实验方法:
1、细胞培养和RNA提取
在37℃、5%CO2下,在含有10%FBS(购自Gibco)和1%青霉素-链霉素(购自Corning)的DMEM培养基(购自Corning)中培养HeLa细胞、HEK293T细胞以及由CRISPR/cas9产生的METTL3+/-杂合HeLa细胞。根据制造商的说明书,用TRIzol试剂(购自ThermoFisherScientific)提取总RNA。用Dynabeads Oligo(dT)25(购自ThermoFisher Scientific,货号61002)按照制造商的说明书从总RNA中进行两轮ployA选择以分离PolyA-RNA。
2、蛋白质印迹
通过蛋白质印迹检测对照细胞和METTL3+/-杂合HeLa细胞中METTL3的蛋白质水平,其中METTL3+/-杂合HeLa细胞由CRISPR/Cas9敲除获得,对照细胞是通过CRISPR/Cas9使用非靶向sgRNA获得的HeLa细胞,对照细胞中METTL3基因没有受到上述敲除。简言之,收集对照细胞和METTL3+/-细胞,与2×SDS上样缓冲液(100mM Tris-HCl,pH 6.8,1%SDS,20%甘油,25%β-巯基乙醇,0.05%溴酚蓝)混合,然后在95℃孵育15分钟。12000转/分钟离心后,通过SDS-PAGE分离样品并从凝胶转移至PVDF膜。用METTL3抗体(购自Cell SignalingTechnology)和ACTIN抗体(购自CWBIO)进行抗体染色。最后,在Tanon 5500化学发光成像系统中对膜进行成像。
3、SELECT法
将总RNA、polyA-RNA或合成的RNA寡核苷酸与40nM上游探针,40nM下游探针和5μMdTTP(或dNTP)在17μl 1×CutSmart缓冲液(50mM醋酸钾,20mM Tris-醋酸,10mM醋酸镁,100μg/ml BSA,pH7.9,于25℃)中混合。通过在以下温度梯度下孵育混合物以使探针与RNA退火:90℃,1分钟;80℃,1分钟;70℃,1分钟;60℃,1分钟;50℃,1分钟,然后40℃,6分钟。随后,在混合物中加入含有0.01U Bst 2.0 DNA聚合酶、0.5U SplintR连接酶和10nmol ATP的3μl混合物,得到20μl体积的最终反应混合物。将最终反应混合物在40℃下孵育20分钟,在80℃下变性20分钟并在4℃下保持,得到SELECT产物。
4、qPCR
将步骤3中获得的SELECT产物在Applied Biosystems ViiATM7实时PCR系统(Applied Biosystems,USA)中进行实时定量PCR(qPCR)反应。20μl qPCR反应体系由2×Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(购自Yeasen)、200nM qPCR上游引物(qPCRF)、200nMqPCR下游引物(qPCRR)、2μl上述SELECT产物和余量ddH2O组成。qPCR在以下条件下运行:95℃,5分钟;(95℃,10s;60℃,35s)×40个循环;95℃,15s;60℃,1分钟;95℃,15s(以0.05℃/s的升温速率收集荧光);4℃,保持。通过QuantStudioTM Real-Time PCR软件v1.3分析数据。
5、TBE-PAGE电泳分析PCR产物
在进行qPCR前,取2μl的SELECT产物与2×Taq Plus Master Mix(购自Vazyme)和400nM qPCR上游引物、400nM qPCR下游引物混合,得到总体积25μl的混合物,进行X位点(29个循环)和N位点的PCR(26个循环)。使10μl PCR产物在冰水浴中用0.5%TBE缓冲液,在12%非变性TBE-PAGE凝胶上进行电泳。用YeaRed核酸胶染色剂(购自Yeasen)染色TBE-PAGE凝胶,并用Tanon 1600凝胶成像系统(Tanon)拍照。
6、基于不同连接酶的连接及qPCR
将80fmol合成的RNA寡核苷酸与40nM T上游引物(SEQ ID NO.6),40nM下游引物(SEQ ID NO.7)在18μl 1×反应缓冲液中混合。需要说明的是,与SELECT中所用的引物相比,T上游引物在3’末端多加了一个碱基T。这是由于该方法中没有采用DNA聚合酶进行逆转录以合成m6A或A对位的T,因此需要在3’末端人为引入碱基T。使用1×CutSmart缓冲液(50mM醋酸钾,20mM Tris-醋酸,10mM醋酸镁,100μg/ml BSA,pH7.9,于25℃下)检测SplintR连接酶、T4 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2(dsRNA连接酶)。
使用1×T3 DNA连接酶反应缓冲液(66mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1mM ATP,1mMDTT,7.5%PEG 6000,pH7.6,于25℃下)检测T3 DNA连接酶和T7 DNA连接酶。
使用1×9°N DNA连接酶反应缓冲液(10mM Tris-HCl,600μM ATP,2.5mM MgCl2,2.5mM DTT,0.1%Triton X-100,pH 7.5,于25℃下)检测9°N DNA连接酶。
1×Taq DNA连接酶反应缓冲液(20mM Tris-HCl,25mM醋酸钾,10mM醋酸镁,10mMDTT,1mM NAD,0.1%Triton X-100,pH 7.6,于25℃下)检测Taq DNA连接酶。
通过在以下温度梯度下孵育混合物以使探针与RNA退火:90℃,1分钟;80℃,1分钟;70℃,1分钟;60℃,1分钟;50℃,1分钟;然后40℃,6分钟。在上述经退火的混合物中加入包含具有指定浓度的连接酶和10nmol ATP(仅在SplintR连接酶、T4 DNA连接酶和T4 RNA连接酶2的检测中加入)的2μl混合物。最终的反应混合物在37℃反应20分钟,然后在95℃变性5分钟,并在4℃保持。随后,按照与步骤3相同的方法进行qPCR。
7、重组FTO蛋白的克隆、表达和纯化
将截短的人FTO cDNA(ΔN31)亚克隆到pET28a载体中。将质粒转化到BL21-Gold(DE3)大肠杆菌感受态细胞中。FTO蛋白的表达和纯化按照本领域技术人员熟知的程序(例如参见G.Jia,et al.,Nat.Chem.Biol.2011,7,第885-887页)进行。用12%SDS-PAGE电泳鉴定纯化的FTO蛋白。
8、FTO介导的m6A去甲基化反应
按照本领域技术人员熟知的方法(例如参见例如参见G.Jia,et al.,Nat.Chem.Biol.2011,7,第885-887页),用FTO蛋白处理总RNA或polyA-RNA。对于实验组:将40μg总RNA或2μgpolyA-RNA与FTO、50mM HEPES(pH 7.0)、2mM L-抗坏血酸、300μM α-酮戊二酸(α-KG)、283μM(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O和0.2U/μl RiboLock RNase抑制剂(购自ThermoFisher Scientific)混合,在37℃下反应30分钟。通过加入20mM EDTA淬灭反应。对于对照组:应在去甲基化反应之前加入20mM EDTA。通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀回收RNA,随后用SELECT法检测。
9、通过UPLC-MS/MS进行m6A定量
将200ng RNA用1U核酸酶P1(购自Wako)在10mM醋酸铵缓冲液中于42℃消化2小时,然后在100mM MES(pH6.5)中与1U rSAP(购自NEB)于37℃孵育4小时。将消化的样品以15,000rpm离心30分钟,并将5μl溶液注入UPLC-MS/MS中。在UPLC(SHIMADZU)中通过ZORBAX SB-Aq柱(Agilent)分离核苷酸,并通过Triple QuadTM 5500(AB SCIEX)检测。基于母离子和子离子m/z转变定量核苷酸:对于A,m/z为268.0至136.0,对于m6A,m/z为282.0至150.1。用市售的核苷酸作出标准曲线,并根据标准曲线精确计算m6A/A的比率。
在本文中,术语“循环阈值(CT)”,又称阈值循环数,是指qPCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数。
在本文中,术语“上游”是指DNA序列或信使核糖核酸(mRNA)中远离转录或翻译起始位点的位置和/或方向,即靠近5′端的位置或朝向5′方向。术语“下游”是指DNA序列或信使核糖核酸(mRNA)中远离转录或翻译起始位点的位置和/或方向,即靠近3′端的位置或朝向3′方向。
在本文中,术语“目标RNA位点X上游与目标RNA位点X距离1nt的核苷酸”是指目标RNA位点X上游与目标RNA位点X相邻位置的核苷酸。例如,将目标RNA位点X定义为第0位,则目标RNA位点X上游与目标RNA位点X距离1nt的核苷酸为第-1位,目标RNA位点X下游与目标RNA位点X距离1nt的核苷酸为第+1位。
在本文中,RNA修饰酶是指,能够对RNA中核苷酸进行化学修饰的酶。例如:m6A修饰酶能够将A转化为m6A,m6A修饰酶包括例如(1)甲基转移酶复合物和(2)METTL16。甲基转移酶复合物选自以下的任意成员或其组合:METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429(又称VIRMA或VIRILIZER)、HAKAI、ZC3H13、RBM15和RBM15B。在RNA中形成m1A修饰、假尿苷修饰和2′-O-甲基化修饰的酶也属于RNA修饰酶。
在本文中,RNA去修饰酶是指,去除RNA中核苷酸上化学修饰的酶,将修饰的核苷酸转化为普通的A、U、C或G。FTO和ALKBH5是m6A的去修饰酶。m6A修饰和m1A修饰在去修饰酶作用下转化为A。假尿苷修饰在去修饰酶作用下转化为U。
表1.本公开使用的RNA寡核苷酸模型
注:1.碱基A、U、C、G左侧的小写字母r表示该核苷酸为核糖核苷酸;
2.划线部分表示m6A经典保守基序。
表2.实验方法步骤6中qPCR所用的引物
注:5phos表示5’磷酸化。
表3.本公开SELECT法中使用的探针
表4.用于SELECT产物的qPCR的引物
名称 | 序列(5′->3′) |
qPCRF | ATGCAGCGACTCAGCCTCTG(SEQ ID NO.51) |
qPCRR | TAGCCAGTACCGTAGTGCGTG(SEQ ID NO.52) |
MALAT1_qPCRF | GACGGAGGTTGAGATGAAGCT(SEQ ID NO.53) |
MALAT1_qPCRR | ATTCGGGGCTCTGTAGTCCT(SEQ ID NO.54) |
实施例1 SELECT法结合qPCR检测m6A RNA寡核苷酸模型中的m6A修饰
对具有内部X位点(X=m6A或A)的2种寡核苷酸模型42-mer RNA Oligo1(SEQ IDNO.1)和Oligo2(SEQ ID NO.2)执行SELECT法。按照X位点是否存在甲基化修饰,将寡核苷酸模型分成4类:Oligo1-m6A、Oligo1-A、Oligo2-m6A、Oligo2-A。
(1)初始RNA输入量的控制
由于初始RNA输入量直接影响qPCR扩增循环,发明人同时检测了寡核苷酸模型中的非m6A修饰位点(又称N位点)以控制初始RNA输入量(图2a)。理论上,用SELECT法检测Oligo1-m6A和Oligo1-A中的N位点时,将得到相同数目的qPCR循环阈值(CT),这也表明初始RNA输入量相等;同理,对于用SELECT法检测Oligo2-m6A和Oligo2-A中的N位点时,也将得到相同数目的qPCR循环阈值。
发明人在X位点上游6nt至下游2nt(X-6到X+2)处使用SELECT法以确定N位点。结果显示,除m6A上下游各1bp处的位点(m6A±1)之外的任何非m6A修饰位点均可以用作N位点以控制初始RNA输入量(参见图2b和2c)。在本实施例中,各个寡核苷酸模型中均选用X-6位点(即X位点上游6nt处的位点)作为N位点控制初始RNA输入量。
(2)SELECT法结合qPCR检测m6A RNA寡核苷酸模型中的m6A修饰
根据上述实验方法步骤3的SELECT法,通过Bst 2.0 DNA聚合酶和SplintR连接酶与Oligo1-m6A、Oligo1-A、Oligo2-m6A、Oligo2-A分别反应,分别得到Oligo1-m6A、Oligo1-A、Oligo2-m6A、Oligo2-A的SELECT产物。
将SELECT产物在Applied Biosystems ViiATM7实时PCR系统(AppliedBiosystems,USA)中进行qPCR反应。通过QuantStudioTM Real-Time PCR软件v1.3分析数据。图3a和3b分别显示了SELECT法检测Oligo1-m6A、Oligo1-A、Oligo2-m6A、Oligo2-A的X位点(图3a左图、图3b左图)和N位点(图3a右图、图3b右图)的结果,其中N位点结果用作输入对照。
可以看出,当控制RNA输入量相同时(即Oligo1-m6A与Oligo1-A的N位点扩增的CT相同;对于Oligo2-m6A与Oligo2-A的N位点扩增的CT相同),对于含有GGXCU序列的Oligo1,Oligo1-m6A与A-oligo的X位点扩增的循环阈值差异(ΔCT)高达7.6个循环;对含有GAXCU序列的Oligo2,ΔCT高达4个循环(图3a和3b),证明本公开的SELECT法可以有效地区分m6A修饰的位点和未修饰的位点。
实施例2 SELECT法结合PCR和TBE-PAGE检测m6A RNA寡核苷酸模型中的m6A修饰
将实施例1中获得的Oligo1-m6A和Oligo1-A的SELECT产物采用实验方法3先进行PCR再进行TBE-PAGE电泳分析。图1c显示了TBE-PAGE凝胶电泳检测结果。可以看出,与Oligo1-m6A和Oligo1-A的N位点、Oligo1-A的X位点相比,对于Oligo1-m6A的X位点,几乎观察不到PCR产物条带。可见,相对于未经甲基化修饰的腺苷(A),本公开的SELECT法对m6A具有显著的选择性(图4)。
实施例3 SELECT法的选择性的验证
为了精确评估本公开的SELECT法的性能,将Oligo1-m6A与Oligo1-A分别以0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1的比例混合,并用SELECT法结合qPCR进行检测。结果示于图5a,qPCR的相对产物量(用100%m6A的2C T值归一化的2C T值)与样品中的m6A比例成线性比例。进行3次实验重复。误差线,平均值±s.d。Rn(Normalized reporter)是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
本公开的SELECT法具有非常高的灵敏度,如图5b所示,SELECT法可以在0.25fmol至100fmol的目标模板浓度下区分A和m6A位点。对于1fmol RNA Oligo1样品,观察到测试X位点的最大ΔCT为7.62个循环,表明SELECT法对RNA中m6A的选择性相对于A高达196.7倍(27.62)。
实施例4 SELECT法结合qPCR检测m6A RNA寡核苷酸模型中的m6A修饰
根据实验方法的步骤6的方法,利用实施例1的寡核苷酸模型Oligo1(SEQ IDNO.1)作为模板,分别测试了7种连接酶的性能:SplintR连接酶、T3 DNA连接酶、T4 RNA连接酶2、T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、9°N DNA连接酶、Taq DNA连接酶。结果示于图6,可以看出,SplintR连接酶、T3 DNA连接酶、T4 RNA连接酶2和T4 DNA连接酶对m6A有选择性,其中SplintR连接酶、T3 DNA连接酶的选择性良好,SplintR连接酶的连接效率较高,适用于低微量样品的检测。
实施例5 SELECT法反应条件测试-1
根据实施例1的方法,本公开扩展了延伸和连接步骤的反应条件,确定了简单的单管反应系统。具体地,本实施例测试了以下反应条件:三个反应温度:37℃、40℃、42℃(图7a);dTTP的六个浓度:0、5μM、10μM、20μM、40μM、100μM(图7b);Bst 2.0DNA聚合酶的五个用量:0、0.0005U、0.002U、0.01U、0.05U(图7c);SplintR连接酶的五个用量:0、0.1U、0.5U、1U、2U(图7d)。
由图7a-d可以看出,SELECT法在37-42℃下、在5-100μM的dTTP、0.0005-0.05U的Bst 2.0DNA聚合酶、0.1-2U的SplintR连接酶下均表现出对m6A的良好选择性。最优的反应条件是:反应温度40℃,dTTP用量5μM,Bst 2.0DNA聚合酶用量0.01U,SplintR连接酶用量0.5U。
根据实施例1的方法,将dTTP替换为dNTP,发现dNTP可用于延伸步骤(参见图8)。
通过SELECT法检测Oligo1产生的DNA片段在pGEM-T载体中进行TA克隆。通过Sanger测序确认的Oligol qPCR扩增子的序列(参见图9a)。用于SELECT的探针包括两部分:qPCR衔接子和RNA模板的互补链(熔解温度应超过50℃)。将SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9针对SEQ ID NO.1进行SELECT检测所得到的PCR扩增子克隆到pGEM-T载体中,用Nanodrop进行定量,逐级稀释(10倍稀释一级)为标准样品进行荧光定量PCR检测,绘制曲线,计算衔接子扩增效率。我们测试了针对m6A状态的靶向X位点的引物的扩增特异性和效率,根据斜率-3.39计算,我们设计的qPCR引物的扩增效率为97.2%,证实我们的qPCR衔接子设计足以进行qPCR扩增(参见图9b)。
实施例6 SELECT法反应条件测试-2
根据实施例1的方法,本公开设计了更多下游探针:3’末端的第一个核苷酸和位于目标RNA位点X下游与目标RNA位点X距离2nt、3nt、4nt的核苷酸互补配对。结果如图10所示,这些下游探针均能够实现良好的检测效果。
实施例7 FTO去甲基化活性验证
FTO是m6A去甲基化酶;它是Fe2+和α-KG依赖性的,当在反应体系中加入EDTA以螯合游离的Fe2+时,m6A位点不能通过FTO去甲基化。图11a显示了FTO辅助的SELECT法检测m6A的过程。图11b显示了从大肠杆菌纯化的重组FTO蛋白的考马斯蓝染色的SDS-PAGE图。
根据实验方法的步骤1的方法分别提取Hela细胞的总RNA和HEK293T细胞的总RNA,Hela细胞的polyA-RNA。实验组采用FTO+EDTA处理,对照组采用FTO处理。具体步骤如下:对于实验组:将40μg总RNA或2μg polyA-RNA与FTO、50mM HEPES(pH 7.0)、2mM L-抗坏血酸、300μM α-酮戊二酸(α-KG)、283μM (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O和0.2U/μl RiboLock RNase抑制剂(购自Thermo Fisher Scientific)混合,在37℃下反应30分钟。通过加入20mM EDTA淬灭反应。对于对照组:在去甲基化反应之前加入20mM EDTA。通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀回收RNA。FTO+EDTA或FTO处理后的样品用实验方法的步骤3所述的SELECT法检测。进行3次重复实验,误差棒表示平均值±s.d。
图11c显示了FTO在从HeLa或HEK293T细胞分离的总RNA或polyA-RNA中的m6A去甲基化活性。可以看出,经FTO处理的Hela细胞总RNA、Hela细胞polyA-RNA和HEK293T细胞总RNA中m6A水平显著降低:FTO能够去除Hela RNA样品和HEK293T RNA样品中大约90%的m6A位点,而FTO+EDTA不能去除m6A位点。
实施例8 FTO辅助的SELECT法检测rRNA、lncRNA和mRNA中的m6A修饰
需要说明的是,28S rRNA用HeLa细胞总RNA进行检测,IncRNA MALAT1用polyA-RNA进行检测,mRNA H1F0用HEK293T细胞总RNA进行检测。
实验组采用FTO+EDTA处理,对照组采用FTO处理。具体步骤如下:实验组将40μg总RNA或2μg polyA-RNA与FTO、50mM HEPES(pH 7.0)、2mM L-抗坏血酸、300μM α-酮戊二酸(α-KG)、283μM (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O和0.2U/μl RiboLock RNase抑制剂(购自Thermo FisherScientific)混合,在37℃下反应30分钟。通过加入20mM EDTA淬灭反应。对于对照组:在去甲基化反应之前加入20mM EDTA。通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀回收RNA。FTO+EDTA或FTO处理后的样品用实验方法的步骤3所述的SELECT法检测。在SELECT法中,各种RNA的用量分别为:Hela细胞28S rRNA,30ng;Hela细胞IncRNA MALAT1,10ng;HEK293T细胞mRNA H1F0,1μg。在Hela细胞28S rRNA中检测M6A4190位点和A4194位点(输入对照);在Hela细胞IncRNAMALAT1中检测m6A2515位点和A2511位点(输入对照)、以及m6A2577位点、m6A2611位点和A2614位点(输入对照),在HEK293T细胞mRNA H1F0中检测m6A1211位点和A1207(输入对照)。进行3次重复实验,误差表示平均值±s.d。
结果显示,SELECT法与FTO去甲基化步骤的组合能够清楚地鉴定Hela细胞中28SrRNA上存在的已知m6A4190位点(图12,左),并且针对相同rRNA上的已知非m6A位点(A4194,N位点)进行同时分析,作为输入对照的N位点显示FTO与FTO-EDTA处理的样品之间没有差异(图12,右)。
SELECT法与FTO去甲基化步骤的组合能够清楚地鉴定来自HeLa细胞的lncRNAMALAT1转录物上的三个已知m6A位点m6A2515、m6A2577和m6A2611;用于控制初始RNA输入量的MALAT1转录物上两个非m6A位点A2511和A2614在FTO与FTO+EDTA处理的样品之间没有差异(图13)。
除了对上述已知m6A位点的再次确认之外,我们用本公开的SELECT法与FTO去甲基化步骤的组合,对已报道的来自HEK293T和HeLa细胞的m6A测序数据推定的mRNA转录物上的m6A位点(H1F0的3′UTR中的1211位点,参见图15)进行了检测。结果证实了在HEK293T细胞的mRNA中1211位点被m6A修饰(图14)。由此可见,本公开的SELECT法是一种简单而高效的方法,能够准确高效地鉴定来自生物样品的rRNA、lncRNA和mRNA分子上的m6A位点。
FTO辅助的SELECT方法还可以使用PAGE电泳分析鉴定细胞m6A位点(参见图16)。
另外,采用本实施例的方法,还确定了输入量的检测限可降至0.2ng polyA-RNA(约200~1400个细胞)(参见图17)。
实施例9 SELECT法定量转录本中的m6A修饰率
还利用本公开的SELECT法确定了HeLa细胞中MALAT1 lncRNA在已知的m6A2515位点的m6A修饰率。根据来自HeLa细胞MALAT1的包含m6A2515的第2488-2536位的序列,合成由49个核苷酸组成的RNA Oligo3(SEQ ID NO.3)作为标准RNA,其中内部包含X位点,X=m6A或A。首先,使用不同量的具有A的标准RNA或具有m6A的标准RNA的,或两种标准RNA的混合物在A2511位点进行实验方法步骤3的SELECT法,并产生线性图以定量细胞MALAT1转录本的量。结果发现,3μg HeLa总RNA含有0.936±0.048fmol的MALAT1转录物(图18a)。通过将Oligo3-m6A与Oligo3-A和3μg HeLa总RNA混合,得到一系列具有已知的m6A修饰率的0.936fmol的标准RNA混合物,然后进行SELECT法分析MALAT1 m6A2515位点的修饰率。使用具有不同m6A修饰率的0.936fmol标准RNA混合物在m6A2515位点进行实验方法步骤3的SELECT法,并产生线性图以定量生物样品中MALAT1 m6A2515位点的绝对m6A修饰率。结果显示,在HeLa中MALAT1m6A2515位点的m6A修饰率为0.636±0.027(图18b)。SCARLET等人已报道测量的MALAT1m6A2515位点的m6A修饰率为0.61±0.03。因此,SELECT可以准确方便地确定总RNA中的m6A修饰率。
图18用于测定HeLa中MALAT1的m6A2515位点的m6A修饰率的SELECT。a)在3μg HeLa总RNA中定量MALAT1转录物。在MALAT1 A2511位点进行SELECT分析,进行标准RNA(O1igo3)和3μg HeLa总RNA的一系列量梯度。实时荧光扩增曲线显示在左图中。通过标准曲线(右图)计算的MALAT1转录物的量在3μg HeLa总RNA中为0.936±0.048fmol。b)在HeLa中MALAT1的m6A2515位点处的m6A修饰率的定量。通过将Oligo3-m6A与Oligo3-A和3μg HeLa总RNA混合,得到一系列具有已知的m6A修饰率的0.936fmol的标准RNA混合物,然后进行SELECT法分析MALAT1 m6A2515位点的修饰率。左图示出了实时荧光扩增曲线,右图示出了标准曲线,通过标准曲线计算的HeLa细胞中MALAT1 2515位点处的m6A修饰率为0.636±0.027。误差棒表示平均值±标准差。2个生物重复×2个技术重复。
实施例10 SELECT法鉴定m6A修饰酶METTL3的生物靶位点
SELECT法也是m6A代谢功能研究的有力工具,它也可以与遗传学方法结合使用,以验证特定的m6A修饰酶是否能够修饰特定的m6A位点。使用MALAT1 lncRNA的m6A2515位点作为验证实验系统。已有报道称,含有催化亚基METTL3的两个m6A修饰酶-METTL16可以结合MALAT1转录物,但是负责2515位点的m6A修饰的酶尚未得到证实。本公开使用CRISPR/Cas9系统来产生METTL3+/-HeLa杂合细胞;值得注意的是纯合的METTL3-/-细胞是致死的。图19a显示出,与对照相比,METTL3+/-HeLa杂合细胞中m6A显著减少。
使用抗METTL3抗体的蛋白质印迹实验,证实了杂合细胞的METTL3水平降低(图19b)。根据实验方法的步骤9中的UPLC-MS/MS进行m6A定量,UPLC-MS/MS分析显示METTL3+/-细胞中polyA-RNA的总m6A水平显着低于对照细胞(图19c)。随后,利用实验方法的步骤3的SELECT法检测,与对照相比,METTL3+/-细胞中2515位点的m6A修饰程度显著降低(图19d)。与METTL3在甲基化2515位点中的特定作用一致,在用于控制初始RNA输入量的非m6A 2511位点的扩增中未观察到显着差异。因此,确定MALAT1的2515位点是METTL3的生物学靶位点。
注意m6A介导mRNA降解,为了确保SELECT法中来自对照组的总RNA和METTL3+/-细胞含有等量的MALAT1转录物,发明人还进行了qPCR分析以调整输入总RNA的量(参见图20)。
实施例11 SELECT法用于鉴定其他类型的RNA修饰
发明人通过实施例1的SELECT法结合qPCR检测,利用表1列出的寡核苷酸模型Oligo3(SEQ ID NO.3)、Oligo4(SEQ ID NO.4)、Oligo5(SEQ ID NO.5)和表3中列出的上游探针和下游探针,还有效地鉴定出了其他类型的RNA修饰:N1-甲基腺苷(m1A)和2′-O-甲基腺苷(Am),但不能区分假尿苷(Ψ)(参见图21)。
以上所描述的实施例仅仅是本公开一部分、而不是全部的实施例。基于本公开中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本公开保护的范围。
Claims (46)
1.一种检测RNA目标位点X的化学修饰的方法,其包括:
(1)获得RNA样品,在RNA样品中选择包含RNA目标位点X的目标RNA区段;
(2)SELECT步骤:在目标RNA区段内、在RNA目标位点X的上游和下游分别设计上游探针Px1和下游探针Px2,利用所述下游探针Px2通过DNA聚合酶进行延伸,并用连接酶连接上游探针Px1和延伸后的下游探针Px2,得到SELECT产物;
其中,上游探针Px1与目标RNA位点X的上游互补配对,且上游探针Px1 5’末端的第一个核苷酸和位于目标RNA位点X上游与目标RNA位点X距离1nt的核苷酸互补配对;
下游探针Px2与目标RNA位点X的下游互补配对,且下游探针Px2 3’末端的第一个核苷酸和位于目标RNA位点X下游与目标RNA位点X距离1、2、3、4、5、6、7、8、9或10nt的核苷酸互补配对;
(3)PCR扩增步骤:将步骤(2)获得的SELECT产物进行PCR扩增,确定PCR阈值循环数或PCR扩增产物量;和
(4)将所述PCR阈值循环数与PCR阈值循环数参比值比较,或者将所述PCR扩增产物量与PCR扩增产物量参比值比较,以确定目标RNA位点X是否存在目标化学修饰。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述化学修饰选自m6A修饰、m1A修饰、假尿苷修饰和2'-O-甲基化修饰。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述上游探针Px1与目标RNA位点X的上游互补配对的序列长度为15-30nt;所述下游探针Px2与目标RNA位点X的上游互补配对的序列长度为15-30nt。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,通过qPCR荧光信号确定PCR阈值循环数,或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳确定PCR扩增产物量。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述DNA聚合酶选自Bst 2.0DNA聚合酶或Tth DNA聚合酶;所述连接酶选自SplintR连接酶、T3 DNA连接酶、T4 RNA连接酶2、T4 DNA连接酶。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述DNA聚合酶选自Bst 2.0DNA聚合酶;所述连接酶选自SplintR连接酶或T3 DNA连接酶。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤(4)中,所述PCR阈值循环数参比值是PCR阈值循环数第一参比值或者PCR阈值循环数第二参比值,其中:
所述PCR阈值循环数第一参比值为:
通过与所述目标RNA区段相同的方法确定的第一参比序列的PCR阈值循环数,所述第一参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游引物3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游引物5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列,且所述第一参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰;或者
其中,所述PCR阈值循环数第二参比值为:
通过与所述目标RNA区段相同的方法确定的第二参比序列的PCR阈值循环数,所述第二参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游引物3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游引物5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列,且所述第二参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X2存在目标修饰。
8.根据权利要求7所述的方法,其中:
当所述PCR阈值循环数大于PCR阈值循环数第一参比值时,则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰;或者
当所述PCR阈值循环数等于PCR阈值循环数第二参比值时,则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰。
9.根据权利要求8所述的方法,其中,当所述PCR阈值循环数与PCR阈值循环数第一参比值多0.4-10个循环时,则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,所述PCR阈值循环数与PCR阈值循环数第一参比值多0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10个循环时,则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰。
11.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤(4)中,所述PCR扩增产物量参比值是PCR扩增产物量第一参比值或者PCR扩增产物量第二参比值,其中:
所述PCR扩增产物量第一参比值为:
通过与所述目标RNA区段相同的方法确定的第一参比序列的PCR扩增产物量,所述第一参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列,且所述第一参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰;或者
其中,所述PCR扩增产物量第二参比值为:
通过与所述目标RNA区段相同的方法确定的第二参比序列的PCR扩增产物量,所述第二参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列,且所述第二参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X2存在目标修饰。
12.根据权利要求11所述的方法,其中:
当所述PCR扩增产物量小于PCR扩增产物量第一参比值时,则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰;或者
当所述PCR扩增产物量等于PCR扩增产物量第二参比值时,则确定所述RNA目标位点X存在目标化学修饰。
13.根据权利要求1所述的方法,其还包括以下步骤:
控制初始RNA输入量:在所述目标RNA区段内,任选一个RNA非目标位点N;在所述RNA非目标位点N的上游和下游分别设计上游探针Pn1和下游探针Pn2,利用所述下游探针Pn2通过DNA聚合酶进行延伸,并用连接酶连接上游探针Pn1和延伸后的下游探针Pn2,得到SELECT产物;
将SELECT产物进行PCR扩增,确定PCR阈值循环数;
根据PCR阈值循环数控制初始RNA输入量,使目标RNA区段与第一参比序列或第二参比序列的初始RNA输入量相等;
其中,所述第一参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:当N位点位于X位点上游时,核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与N位点的上游探针Pn1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列;当N位点位于X位点下游时,核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与N位点下游探针Pn2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列;且所述第一参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰;或者
所述第二参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:当N位点位于X位点上游时,核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与N位点的上游探针Pn1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列;当N位点位于X位点下游时,核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与N位点下游探针Pn2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列;且所述第二参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰。
14.根据权利要求13所述的方法,其中,所述RNA非目标位点N位于所述RNA目标位点X的上游6nt至下游2nt处。
15.根据权利要求1所述的方法,其中,所述SELECT步骤在包含以下的反应体系中进行:RNA样品、dNTP、DNA聚合酶和连接酶。
16.根据权利要求15所述的方法,其中,所述RNA样品为细胞提取的总RNA或mRNA。
17.根据权利要求16所述的方法,其中,所述总RNA或mRNA浓度为10ng、1ng、0.2ng、0.02ng或更低。
18.根据权利要求16所述的方法,其中,所述总RNA或mRNA浓度为10ng、100ng、1μg、10μg或更高。
19.根据权利要求15所述的方法,其中,所述dNTP为dTTP。
20.根据权利要求19所述的方法,其中,所述dNTP为5-100μM的dTTP。
21.根据权利要求15所述的方法,其中,所述DNA聚合酶为Bst 2.0DNA聚合酶。
22.根据权利要求21所述的方法,其中,所述DNA聚合酶为0.0005-0.05U的Bst 2.0DNA聚合酶。
23.根据权利要求22所述的方法,其中,所述DNA聚合酶为0.01U的Bst2.0DNA聚合酶。
24.根据权利要求15所述的方法,其中,所述连接酶为SplintR连接酶。
25.根据权利要求24所述的方法,其中,所述连接酶为0.1-2U的SplintR连接酶。
26.根据权利要求25所述的方法,其中,所述连接酶为0.5U的SplintR连接酶。
27.根据权利要求1所述的方法,其中,所述SELECT步骤在30-50℃的反应温度下进行。
28.根据权利要求27所述的方法,其中,所述SELECT步骤在37-42℃的反应温度下进行。
29.根据权利要求28所述的方法,其中,所述SELECT步骤在40℃的反应温度下进行。
30.根据权利要求1所述的方法,其中,在步骤(1)之前还包括以下步骤:
分别用RNA去修饰酶或RNA去修饰酶与EDTA的混合物处理所述RNA样品;其中,用RNA去修饰酶处理的RNA样品用作第一参比序列。
31.根据权利要求30所述的方法,其中,所述RNA去修饰酶是FTO或ALKBH5。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法,其中,所述RNA样品是细胞中提取的总RNA、mRNA、rRNA或lncRNA。
33.一种鉴定RNA修饰酶或RNA去修饰酶底物靶位点的方法,其包括:
(1)制备RNA修饰酶或RNA去修饰酶缺陷型细胞、或RNA修饰酶或RNA去修饰酶低表达细胞,培养后,提取RNA;
(2)根据权利要求1的步骤(1)-(3)确定针对RNA目标位点X的PCR阈值循环数或PCR扩增产物量;
(3)将所述PCR阈值循环数与PCR阈值循环数参比值比较,或者将所述PCR扩增产物量与PCR扩增产物量参比值比较,以确定所述RNA修饰酶或RNA去修饰酶是否在所述RNA目标位点X进行化学修饰,
其中,所述PCR阈值循环数参比值为正常细胞通过与RNA修饰酶或RNA去修饰酶缺陷型细胞、或RNA修饰酶或RNA去修饰酶低表达细胞相同的方法获得的PCR阈值循环数,
所述PCR扩增产物量参比值为正常细胞通过与RNA修饰酶或RNA去修饰酶缺陷型细胞、或低表达细胞相同的方法获得的PCR扩增产物量;
其中,所述靶位点是单基因单位点。
34.根据权利要求33所述的方法,其中,当所述PCR阈值循环数小于PCR阈值循环数参比值时,则所述RNA修饰酶或去修饰酶在所述RNA目标位点进行化学修饰;
或者,当所述PCR扩增产物量大于PCR扩增产物量参比值时,所述RNA修饰酶或去修饰酶在所述RNA目标位点进行化学修饰。
35.根据权利要求34所述的方法,其中,所述RNA化学修饰为选自m6A修饰、m1A修饰、假尿苷修饰和2'-O-甲基化修饰;所述RNA化学修饰酶包括m6A修饰酶。
36.根据权利要求35所述的方法,其中,所述RNA化学修饰为m6A修饰。
37.根据权利要求35所述的方法,其中,所述m6A修饰酶为甲基转移酶复合物或METTL16。
38.根据权利要求37所述的方法,其中,所述甲基转移酶复合物选自以下的任意成员或其组合:METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、HAKAI、ZC3H13、RBM15和RBM15B。
39.一种用于定量转录本中RNA修饰率的方法,其包括:
(1)获得RNA样品,在RNA样品中选择包含RNA目标位点X的目标RNA区段;
(2)确定所述RNA样品中目标RNA区段的含量,其包括:
(2a)在所述目标RNA区段内,任选一个RNA非目标位点N;在所述RNA非目标位点N的上游和下游分别设计上游探针Pn1和下游探针Pn2,利用所述下游探针Pn2通过DNA聚合酶进行延伸,并用连接酶连接上游探针Pn1和延伸后的下游探针Pn2,得到SELECT产物;将SELECT产物进行PCR扩增,获得PCR阈值循环数N;
(2b)将参比序列梯度稀释成一系列浓度,分别采用步骤(2a)的方法获得与各浓度对应的PCR阈值循环数Nn,根据浓度和PCR阈值循环数Nn确定标准曲线1;
其中,参比序列是第一参比序列、第二参比序列、或两者以任意比例的混合物,
所述参比序列至少包含核苷酸序列II,所述核苷酸序列II具有与所述目标RNA区段中的核苷酸序列I相同的核苷酸序列,其中:当N位点位于X位点上游时,核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与N位点的上游探针Pn1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与X位点的下游探针Px2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列;当N位点位于X位点下游时,核苷酸序列I为所述目标RNA区段上自与X位点的上游探针Px1 3’末端核苷酸互补配对的核苷酸起至与N位点下游探针Pn2 5’末端核苷酸互补配对的核苷酸止的核苷酸序列,
且所述第一参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰,所述第二参比序列中与所述目标RNA区段的所述RNA目标位点X相对应的RNA目标位点X1不存在目标修饰;
(2c)将PCR阈值循环数N与标准曲线1比较,确定所述RNA样品中目标RNA区段的含量;
(3)将第一参比序列与第二参比序列按一系列摩尔浓度比混合得到一系列混合物,对混合物应用权利要求1的(2)SELECT步骤和(3)PCR扩增步骤,获得PCR阈值循环数A1或PCR扩增产物量A2,根据摩尔比和PCR阈值循环数A1或者根据摩尔比和PCR扩增产物量A2确定标准曲线2;
(4)对所述样品RNA应用权利要求1的(2)SELECT步骤和(3)PCR扩增步骤,获得PCR阈值循环数B1或PCR扩增产物量B2;和
(5)通过PCR阈值循环数B1或PCR扩增产物量B2与标准曲线2比较,计算出RNA样品中RNA目标位点X的修饰率。
40.根据权利要求39所述的方法,其中,所述RNA非目标位点N位于所述RNA目标位点X的上游6nt至下游2nt处。
41.根据权利要求39所述的方法,其中,步骤(2b)中所述一系列浓度在0.1fmol至3fmol之间。
42.根据权利要求41所述的方法,其中,所述一系列浓度在0.2fmol至2.8fmol之间。
43.根据权利要求42所述的方法,其中,所述一系列浓度在0.2fmol至2.4fmol之间。
44.根据权利要求39所述的方法,其中,所述参比序列的长度为至少40nt。
45.根据权利要求39所述的方法,其中,所述RNA样品与第一参比序列或与第二参比序列以10:0、8:2、6:4、4:6、2:8和0:1的摩尔浓度比混合。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的方法,其中,所述RNA样品是细胞中提取的总RNA、mRNA、rRNA或lncRNA。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103525907A (zh) * | 2013-08-12 | 2014-01-22 | 山东大学齐鲁医院 | 肝衰竭预后的gstm3基因甲基化定量检测法及试剂盒 |
CN105008551A (zh) * | 2013-03-08 | 2015-10-28 | 国立大学法人熊本大学 | Rna修饰的简易检测方法及用该检测方法的2型糖尿病的检查方法 |
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CN108103090A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-06-01 | 中山大学附属第医院 | 靶向RNA甲基化的RNA Cas9-m6A修饰载体系统及其构建方法和应用 |
Family Cites Families (2)
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---|---|---|---|---|
US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
WO2015103293A2 (en) * | 2013-12-30 | 2015-07-09 | Miroculus Inc. | Systems, compositions and methods for detecting and analyzing micro-rna profiles from a biological sample |
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---|---|---|---|---|
CN105008551A (zh) * | 2013-03-08 | 2015-10-28 | 国立大学法人熊本大学 | Rna修饰的简易检测方法及用该检测方法的2型糖尿病的检查方法 |
CN103525907A (zh) * | 2013-08-12 | 2014-01-22 | 山东大学齐鲁医院 | 肝衰竭预后的gstm3基因甲基化定量检测法及试剂盒 |
CN107326078A (zh) * | 2017-07-19 | 2017-11-07 | 宁波大学 | 一种胱硫醚β‑合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及测定方法 |
CN108103090A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-06-01 | 中山大学附属第医院 | 靶向RNA甲基化的RNA Cas9-m6A修饰载体系统及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
RNA修饰检测技术;马士清等;《生命科学》;20180430;第30卷(第4期);全文 * |
Simultaneous sequencing of oxidized methylcytosines produced bu TET/JBP dioxygenases in Coprinopsis cinerea;Lukas Chaves等;《PNAS》;20141118;第118卷(第48期);全文 * |
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