CN109306373B - 用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒 - Google Patents
用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒 Download PDFInfo
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- CN109306373B CN109306373B CN201811302188.XA CN201811302188A CN109306373B CN 109306373 B CN109306373 B CN 109306373B CN 201811302188 A CN201811302188 A CN 201811302188A CN 109306373 B CN109306373 B CN 109306373B
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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Abstract
本发明涉及一种用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒，建立了人类基因组成熟tRNA谱的检测方法。本发明克服了tRNA检测步骤冗余、基因组编码tRNA冗余和tRNA表达标准化等困难，只需要使用本发明的新型接头和引物组即可应用常规qPCR完成人类基因组中所有成熟tRNA水平的检测，实现快速、准确、高通量检测成熟tRNA谱的转录水平变化。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及tRNA合成生物学、遗传学以及qPCR检测方法学，具体涉及用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒。
背景技术
tRNA是氨基酸的载体，主要参与遗传密码的识别，是联系基因组遗传信息和蛋白功能的重要分子。目前人类基因组中含有编码415个tRNA基因，由于tRNA分子片段较小，大约在70bp左右，常规方法不能检测此类小RNA分子。此外，还有如下几个原因导致检测这类小RNA分子存在困难：
第一、成熟tRNA需通过共价连接氨基酸分子才能行使功能，所以在接头连接之前需要首先去除连接的氨基酸；
第二、tRNA具有高度稳定的三叶草结构且含有大量的转录后碱基修饰，因此常规方法不能获得tRNA的cDNA分子；
第三、人类基因组编码了冗余的tRNA拷贝，高通量检测所有tRNA十分繁杂；
第四，由于tRNA分子短，结构复杂，常规方法获得cDNA步骤冗长，大大限制tRNA检测方法的应用。
目前tRNA检测的高通量测序的检测方法已经建立了，但是其试验设备依赖性强、试验周期长、价格昂贵，大大的限制了tRNA生物学的研究。
qPCR技术由美国Applied Biosystems公司于1996年推出，其作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。目前尚没有使用常规qPCR技术实现tRNA检测的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组、试剂盒及应用。
本发明还提供了相应的人类基因组成熟tRNA谱检测方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5phos/TCGTAGGGTCCGAGGTATTCACGATGrGrN，SEQ ID NO.1；5phos表示5’端起始碱基有磷酸基团修饰，TCGTAGGGTCCGAGGTATTCACGAT为脱氧核糖核酸序列，GrGr为核糖核酸序列，N为任意碱基。
用于人类基因组成熟tRNA谱检测的引物组，包括如SEQ ID NO.2～115所示的57对引物，见表1。
表1.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的引物组
注：R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T
用于人类基因组成熟tRNA谱检测的试剂盒，包括上述接头和引物组。
一种人类基因组成熟tRNA谱检测方法，具体步骤如下：
(1)抽提总RNA的同时，tRNA去氨基酸；
(2)将步骤(1)所得抽提总RNA与上述接头混合，孵育，得含有连接tRNA的混合液；
(3)将步骤(2)所得混合液与特异性下游引物混合物混合配置成退火溶液，连接tRNA退火化；所述特异性下游引物混合物为上述引物组中的下游引物混合物；
(4)退火化的连接tRNA与mRNA共反转录；
(5)qPCR检测。
优选的，步骤(1)中，总RNA抽提过程中，洗脱前加入10μl脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入20μl TE缓冲液洗脱，即可在总RNA抽提的同时实现tRNA去氨基酸。
优选的，步骤(2)中，抽提总RNA与接头的配比为20ng：1pm。
优选的，步骤(2)中，孵育的具体方法如下：
(2-1)配置退火溶液，90℃孵育3分钟；
(2-2)加入退火缓冲液，37℃孵育20分钟；
(2-3)配置连接反应体系，37℃孵育60分钟。
进一步优选的，步骤(2-1)中，退火溶液的组成如下：接头2μl(20pm)，总RNA400ng，无RNA酶水补充至9μl。
更进一步优选的，步骤(2-2)中，加入1μl 10×Tris-HCl(50mM，pH8.0)。
更进一步优选的，步骤(2-3)中，连接反应体系的组成如下：步骤(2-2)所得溶液10μl，连接酶缓冲液(NEB,M0239L)2μl，T4RNA连接酶(NEB,M0239L)0.1μl，无RNA酶水7.9μl。
优选的，步骤(3)中，退火溶液的组成如下：步骤(2)所得混合液20μl，特异性下游引物混合物3.42μl，无RNA酶水0.58μl。
优选的，步骤(3)中，退火化的条件为：65℃孵育5分钟，立即冰上孵育5分钟。
优选的，步骤(4)的具体方法：加入共反转录反应液，按照说明书提供的步骤操作，37℃孵育15分钟，85℃孵育5s。
进一步优选的，加入6μl 5×Prime Script RT Master Mix共反转录反应液。
优选的，步骤(5)中，qPCR的反应体系如下：2×SYBRTM Green PCR Master Mix 5μl，cDNA 2μl，上游引物混合物(10pm)0.25μl，下游引物混合物(10pm)0.25μl，双蒸水2.5μl；反应程序如下：95℃预变性30s，95℃变性10s，58.3℃退火延伸30s，72℃延伸30s，45次循环，95℃、60s，65℃、60s，65-95℃、15s，每个循环增加0.3℃。
上述接头、引物组或试剂盒在人类基因组成熟tRNA谱检测中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明利用荧光定量PCR仪检测SYBR荧光染料的特点，将根据GtRNA2.0公布的人类基因组tRNA基因序列设计用于荧光定量的PCR引物和新型接头，经反复试验，优化qPCR反应体系和反应参数，建立了检测人类基因组成熟tRNA谱的试剂盒及方法。
本发明简化了RNA提取和去氨基酸步骤，设计了新型接头用于成熟tRNA的连接，创新性的提出了tRNA和mRNA共反转录方法。本发明克服了tRNA检测步骤冗余、基因组编码tRNA冗余和tRNA表达标准化等困难，只需要使用本发明的新型接头和引物组即可应用常规qPCR完成人类基因组中所有成熟tRNA水平的检测，实现快速、准确、高通量检测成熟tRNA谱的转录水平变化。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明的试验原理图；
图2为戊型肝炎病毒(HEV)细胞感染模型tRNA谱差异比较分析。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例：
qPCR检测人类肝癌细胞系戊型肝炎病毒(HEV)细胞感染模型tRNA谱差异比较分析
1.试验材料
人肝癌细胞系(Huh7.0)(JCRB No.：JCRB0403)，Huh7.0-HEV细胞模型和Huh7.0-HEV-luc细胞模型是将HEV基因组全长RNA或HEV-luc RNA转染Huh7.0后获得，参考文献(Shukla,P.,et al.(2012)."Adaptation of a genotype 3 hepatitis E virus toefficient growth in cell culture depends on an inserted human gene segmentacquired by recombination."J Virol 86(10):5697-5707.)制备，RNA抽提:NucleoSpin@RNA(MACHEREY-NAGEL,740955.250)，脱酰基缓冲液(50ml):5×Tris-HCl(100mM,pH9.0)，退火缓冲液(50ml):10×Tris-HCl(50mM,PH8.0)，T4RNA连接酶(dsRNA连接酶)(NEB,M0239L)，5×Prime Script RT Master Mix(Takara,RR036Q)，Applied Biosystems SYBRTM GreenPCR Master Mix(Applied Biosystems:4344463)。
2.试验方法(参考图1)
2.1采用NucleoSpin@RNA试剂盒抽提Huh7.0非感染细胞系和HEV-(Luc)感染细胞系
具体步骤与试剂盒说明书相同，本发明将去氨基酸步骤和RNA抽提合并以简化步骤，即在洗脱前加入10μl脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入20μl TE缓冲液洗脱。
2.2将抽提的tRNA与新型接头连接
具体步骤如下：
1.取400ng总RNA，加入2μl(20pm)tRNA接头，最后加无RNA酶水补充至9μl，在90℃孵育3分钟。
2.在上述反应液体中加入1μl 10×Tris-HCl(50mM，pH8.0)，37℃孵育20分钟。
3.在上述反应液中加入连接酶缓冲液2μl，T4RNA连接酶0.1μl，无RNA酶水7.9μl，37℃孵育60分钟。
2.3mRNA与tRNA共反转录
具体步骤如下：
1.在2.2中连接产物20μl，加入特异性下游引物混合液3.42μl，加入无RNA酶水0.58μl补充至24μl，在65℃孵育5分钟，立即冰上孵育。
2.在上述体液中加入6μl 5×Prime Script RT Master Mix共反转录反应液，在37℃孵育15分钟，85℃孵育5s。
2.4qPCR反应体系配置及程序
具体步骤如下：
1.利用
Premix Ex TaqTM II试剂对各tRNA和内参基因GAPDH的转录情况进行检测，tRNA谱检测的引物组序列如表1中所示，qPCR反应体系配置：
PremixEx TaqTM II加入5μl；上下游引物(10pm)各0.25μl；cDNA模板2μl；加入双蒸水补充至10μl。2.Real-Time PCR反应条件：
预变性95℃30s；变性95℃10s；退火延伸58.3℃30s；延伸72℃30s，45次循环
95℃60s，65℃60s，65℃-95℃每个循环增加0.3℃，绘制溶解曲线以确定扩增产物是否为特异。
2.5采用2-ΔΔCt法计算HEV细胞感染模型的tRNA谱差异
结论：
如图2所示，所有的基因组编码的成熟tRNA均可被检测到，且Ct值低于35(阈值为0.1)。在Huh7.0-HEV-luc细胞模型中，大部分的成熟tRNA表达量比非感染细胞低，然而在Huh7.0-HEV细胞模型中，大部分的成熟tRNA表达量比非感染细胞高。以上两种细胞系tRNA谱的比较分析可以表明，tRNA-Gly-CCC、tRNA-Pro-GGG和tRNA-Pro-UGG是共同上调的tRNA；tRNA-Arg-CCU和tRNA-Val-TAC共同下调的tRNA。这些数据对于揭示病毒调节细胞tRNA谱提供了重要的参考和技术支持。本发明可以广泛的应用于人类tRNA生物学的研究，以及相关的研究领域。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 四川农业大学
西北民族大学
<120> 用于人类基因组成熟tRNA谱检测的接头、引物组和试剂盒
<160> 115
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gtcctccgct ctaccarctg a 21
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
catccttagg tcgctggttc ga 22
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gtcctccgct ctaccarctg a 21
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
atccagcrat ccgagttcra at 22
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
agtccagagt gctaaccatt acacc 25
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
atccagcgat ccgagttcra rt 22
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
agtccagagt gcthaccatt acacc 25
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
aaccgaacgg tgagtagttc aaga 24
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
tagccgaacg ctctgaccg 19
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
acygaaagat trgtggtkcr ag 22
<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
acagycraay gcgctaac 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ttaatctgag ggtccrgggt tc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
agtctgatgc tctaccract gag 23
<210> 78
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
taatcycagg gtcgtgggtt cg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gagtcycatg ctctaccgac tgag 24
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
cacgaggtct tgggctgatt c 21
<210> 81
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
tgataagtac actctctacc actgagct 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
tcacgcggga gaccgg 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
aggcggggat actcaccact a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
ttcaccsmsg yggcccg 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
arcsmsgaat cctarccrct agac 24
<210> 86
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gattcggcgc tctcaccg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
ctaaccacta gaccaccagg ga 22
<210> 88
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
ctttaaagtc atatgtagct gggttcaa 28
<210> 89
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
gttacatagc ttatagagtt gcttttga 28
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
gatcaagagg tcccyggttc a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
agtcaaatgc tctaccmctg agc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gatcagaagg ttgcgtgttc aaatc 25
<210> 93
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
ggagtcagac gcgctacc 18
<210> 94
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
gatcagaaga ttcyaggttc gactcc 26
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
agtcagacgc gttatccatt gc 22
<210> 96
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
gatcagaaga ttgmrggttc gartc 25
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
agtcagacgc cttatccatt aggc 24
<210> 98
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gakcwgrrga ttgwgggttc gagtcc 26
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
arkcwgaygc cttatccatt aggc 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
taatgccagg gtcgaggttt cg 22
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
agcagcacgc tctaaccaac 20
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
aatccattgt gctctgcacg c 21
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
agtccatcgc cttaaccact cg 22
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
aatycaragg ttcygggttc g 21
<210> 105
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
aagtccaryg cgctcrtc 18
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
taagccaggg attgtgggtt c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
aggccartgc cttatccatt agg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
acgcrggagg cccrggt 17
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
caggcragaa ttctaccact gaacc 25
<210> 110
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
caagcagttg acccgggttc 20
<210> 111
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
aaggcagcta tgcthaccac tatacc 26
<210> 112
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
ckkgmgmccc gggttcra 18
<210> 113
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
arkckwgmat kmtaccactr macc 24
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
aaacctgtag ctgtctagyg acaga 25
<210> 115
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
aagcctgcac cccagacc 18
Claims (6)
1.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的引物组，其特征在于，包括表1中如SEQ ID NO.2～115所示的57对引物：
表1.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的引物组
其中，R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T，H＝A/C/T，B＝C/G/T，V＝A/C/G，D＝A/G/T，N＝A/C/G/T。
2.用于人类基因组成熟tRNA谱检测的试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的接头和权利要求1所述的引物组。
3.一种非疾病诊断目的的人类基因组成熟tRNA谱检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)抽提总RNA的同时，tRNA去氨基酸；
(2)将步骤(1)所得抽提总RNA与核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示接头混合，孵育，得含有连接tRNA的混合液；
(3)将步骤(2)所得混合液与特异性下游引物混合物混合配置成退火溶液，连接tRNA退火化；所述特异性下游引物混合物为权利要求2所述引物组中的下游引物混合物；
(4)退火化的连接tRNA与mRNA共反转录；
(5)qPCR检测；
步骤(2)中，孵育的具体方法如下：
(2-1)配置退火溶液，90℃孵育3分钟；
(2-2)加入退火缓冲液，37℃孵育20分钟；
(2-3)配置连接反应体系，37℃孵育60分钟；
步骤(5)中，qPCR的反应体系如下：2×SYBRTM Green PCR Master Mix 5μl，cDNA 2μl，10pm上游引物混合物0.25μl，10pm下游引物混合物0.25μl，双蒸水2.5μl，tRNA谱检测的引物组序列如权利要求1中表1所示；反应程序如下：95℃预变性30s，95℃变性10s，58.3℃退火延伸30s，72℃延伸30s，45次循环，95℃、60s，65℃、60s，65-95℃、15s，每个循环增加0.3℃。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，总RNA抽提过程中，洗脱前加入10μl脱酰基缓冲液在37℃孵育40分钟，然后加入20μlTE缓冲液洗脱，即可在总RNA抽提的同时实现tRNA去氨基酸。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，退火化的条件为：65℃孵育5分钟，立即冰上孵育5分钟。
6.权利要求1所述引物组或权利要求2所述试剂盒在非疾病诊断目的的人类基因组成熟tRNA谱检测中的应用。
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