JP2022547564A - 新規なクラス２のｉｉ型及びｖ型ｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓ ｒｎａ誘導型エンドヌクレアーゼ - Google Patents
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Abstract
本明細書では、新規なクラス２のＩＩ型及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９及びＣａｓｌ２エンドヌクレアーゼ、ならびにそれらを含むシステムが提供される。また、その製造方法、及び使用方法も提供される。例示的な使用方法は、治療及び診断の用途に有用な、標的ＤＮＡの改変及び標的ＤＮＡの検出を含む。診断用途のいくつかは、標的配列に結合した酵素のコラテラルなヌクレアーゼ活性を利用することができる。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／０５８，４４８号及び２０１９年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８９８，３４０号の優先権を主張するものであり、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年７月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／０５８，４４８号及び２０１９年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／８９８，３４０号の優先権を主張するものであり、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子提出されたテキストファイルの説明
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は「ＣＡＢＩ＿００２＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」である。このテキストファイルは４５６ｋｂであり、２０２０年９月１０日に作成されたものであり、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で電子的に提出されることになる。
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は「ＣＡＢＩ＿００２＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」である。このテキストファイルは４５６ｋｂであり、２０２０年９月１０日に作成されたものであり、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で電子的に提出されることになる。
細菌の適応免疫システムは、ＲＮＡ誘導型核酸切断のためのＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ））及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を保持している。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＲＮＡ誘導型の核酸干渉を介して、細菌及び古細菌に適応免疫を付与する働きをする。インベーダーに対する免疫をもたらすために、プロセシングされたＣＲＩＳＰＲアレイ転写物（ｃｒＲＮＡ）は、スペーサーとして知られるｃｒＲＮＡのインベーダー由来セグメントに対して相補的な配列を持つ核酸を認識するＣａｓタンパク質含有サーベイランス複合体とアセンブルする。
クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは合理化されたバージョンであり、ＲＮＡに結合した単一のＣａｓタンパク質（エフェクターエンドヌクレアーゼタンパク質）が標的配列への結合とその切断に関与する。これらの最小限のシステムは、そのプログラム可能な性質により、ゲノム操作の分野に革命を起こし続ける汎用的な技術として利用されやすくなっている。
しかしながら、改良されたクラス２のＩＩ型及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼバリアントが求められている。本明細書では、そのようなバリアント、その製造方法、試験方法、及び使用方法が提供される。
本明細書では、新規なクラス２のＩＩ型及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型システム、その製造方法、及び使用方法が提供される。より具体的には、新規なＣａｓ９バリアント、新規なＣａｓ１２ａバリアント、及び新規なＣａｓ１２サブタイプが提供される。
一態様では、本明細書では、（ａ）Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４タンパク質、またはＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４タンパク質をコードする核酸と、（ｂ）Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４ ｇＲＮＡをコードする核酸と、を含むエンジニアリングされたシステムであって、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質が、天然には一緒に存在しないものであり、ｇＲＮＡが、標的ＤＮＡ中の標的配列にハイブリダイズすることができ、ｇＲＮＡが、Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質と複合体を形成することができる、エンジニアリングされたシステムが提供される。
別の態様では、本明細書では、（ａ）標的ＤＮＡ中の標的配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列を含むターゲッターＲＮＡと、（ｂ）ターゲッターＲＮＡとハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖を形成することができるアクチベーターＲＮＡであって、アクチベーターＲＮＡを含む、アクチベーターＲＮＡと、を含むエンジニアリングされた一分子ｇＲＮＡであって、ターゲッターＲＮＡとアクチベーターＲＮＡとが互いに共有結合しており、一分子ｇＲＮＡが、Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質と複合体を形成することができ、標的配列へのスペーサー配列のハイブリダイゼーションが、Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質を標的ＤＮＡに標的化することができる、エンジニアリングされた一分子ｇＲＮＡが提供される。
別の態様では、本明細書では、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質及び単一のガイドＲＮＡを含むエンジニアリングされたシステムであって、ｇＲＮＡ及びクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質が、天然には一緒に存在しないものであり、ｇＲＮＡが、標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズすることができ、ｇＲＮＡが、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質と複合体を形成することができ、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質がコラテラル活性を有し、ｔｒａｃｒＲＮＡの使用なしでＲＮＡを含む一本鎖ポリヌクレオチドをコラテラル切断することができる、エンジニアリングされたシステムが提供される。いくつかの実施形態では、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質は、一本鎖ＲＮＡをコラテラル切断することができる。いくつかの実施形態では、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質は、一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをコラテラル切断することができる。
別の態様では、本明細書では、（ａ）Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑタンパク質、またはＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑタンパク質をコードする核酸と、（ｂ）Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑ ｇＲＮＡ、またはＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑ ｇＲＮＡをコードする核酸と、を含むエンジニアリングされたシステムであって、ｇＲＮＡ及びＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質が、天然には一緒に存在しないものであり、ｇＲＮＡが、標的ＤＮＡ中の標的配列にハイブリダイズすることができ、ｇＲＮＡが、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質と複合体を形成することができる、エンジニアリングされたシステムが提供される。
別の態様では、本明細書では、配列番号１１６または配列番号１１７のスキャフォールド配列と、標的ＤＮＡ中の標的配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列とを含む、エンジニアリングされた一分子ｇＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ウイルスＤＮＡ、植物ＤＮＡ、菌類ＤＮＡ、または細菌ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的配列は、表６ａ～６ｆのいずれかに提供される標的の配列である。いくつかの実施形態では、標的は、コロナウイルスである。いくつかの実施形態では、標的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡはｃＤＮＡであり、逆転写により得られる。
別の態様では、本明細書では、試料中の標的ＤＮＡをする検出する方法であって、（ａ）試料を、（ｉ）Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質；（ｉｉ）標的ＤＮＡ中の標的配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列を含むＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑ ｇＲＮＡ；及び（ｉｉｉ）ｇＲＮＡのスペーサー配列とハイブリダイズしない標識されたディテクターオリゴヌクレオチドと接触させることと、（ｂ）Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質による標識されたディテクターの切断によって生じる検出可能なシグナルを測定し、それにより標的ＤＮＡを検出することと、を含む、方法が提供される。この方法は、例えば、試料中のウイルスまたは細菌病原体の検出など、診断に有用である。
別の態様では、本明細書では、標的ＤＮＡを改変する方法であって、（ａ）標的ＤＮＡを、（ｉ）Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、Ｃａｓ９．４、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質；及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ中の標的配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列を含むＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、Ｃａｓ９．４、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑ ｇＲＮＡと接触させること、を含む方法が提供される。本方法は、遺伝子治療用途、及び治療用送達目的の細胞の生成、及び細胞株の調製に有用である。
様々な実施形態では、本明細書では、本明細書に記載のエンジニアリングされたシステムのタンパク質またはポリヌクレオチドのいずれかを含む、組成物、医薬組成物、ベクター、宿主細胞、及びキットが提供される。
本明細書では、新規なクラス２のＩＩ型及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型システム、その製造方法、及び使用方法が提供される。
定義
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、一本鎖ＤＮＡ；二本鎖ＤＮＡ；複数鎖ＤＮＡ；一本鎖ＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ；複数鎖ＲＮＡ；ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド；ならびにプリン及びピリミジン塩基、または他の天然、化学的もしくは生化学的改変された、非天然、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、一本鎖ＤＮＡ；二本鎖ＤＮＡ；複数鎖ＤＮＡ；一本鎖ＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ；複数鎖ＲＮＡ；ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド；ならびにプリン及びピリミジン塩基、または他の天然、化学的もしくは生化学的改変された、非天然、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
「ハイブリダイズ可能」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ）が、配列特異的で逆平行な様式で、温度及び溶液イオン強度の適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ条件下で、別の核酸に、非共有結合、すなわちワトソン－クリック塩基対及び／またはＧ／Ｕ塩基対の形成、「アニール」、または「ハイブリダイズ」することを可能にするヌクレオチドの配列を含む（すなわち、核酸は相補的な核酸に特異的に結合する）ことを意味する。
ポリヌクレオチドの配列は、標的核酸の配列と１００％相補的でなくても、特異的にハイブリダイズ可能であることが理解される。さらに、ポリヌクレオチドは、介在または隣接するセグメントがハイブリダイゼーションイベントに関与しないように、１以上のセグメント上でハイブリダイズしてもよい（例えば、ループ構造またはヘアピン構造、「バルジ」など）。
核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間の相補性パーセントは、任意の簡便な方法を使用して決定することができる。例示的な方法としては、ＢＬＡＳＴプログラム（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）、またはギャッププログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）、例えばＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）を使用する初期設定を使用すること、が挙げられる。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、コード化及び非コード化アミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、及び改変ペプチドバックボーンを有するポリペプチドが含まれ得る。
「ベクター」または「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンであり、これに別のＤＮＡセグメント、すなわち「インサート」を付着させて、細胞内で付着したセグメントの複製を実現することができる。
分子生化学及び細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）；Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）；ａｎｄ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準的な教科書に見出すことができ、これらの開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
値の範囲が提供される場合、文脈によって特に明示されない限りは、下限値の単位の１０分の１まで、その範囲の上限値及び下限値の間の各途中の値、ならびにその指定範囲内の他のあらゆる指定値または途中の値が、本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてよく、さらに、指定範囲内の特に除外される限界を条件として、本発明に包含される。指定範囲が限界値の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界値のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
別段の定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されたすべての刊行物は、刊行物が引用されたことに関連する方法及び／または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り、複数形の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「Ｃａｓ１２ａ．１タンパク質」への言及は、複数のそのようなＣａｓ１２ａ．１タンパク質を含み、「ｇＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」への言及は、当業者に知られている１以上のｇＲＮＡ及びその等価物などへの言及を含む。さらに、許請求の範囲が任意の要素を除外するように起草されてもよいことに留意されたい。したがって、本記載は、特許請求の範囲の要素の列挙に関して「単に」、「のみ」などの排他的な専門用語の使用、または「否定的な」制限の使用のための先行する基準として機能することが意図される。
Ｉ．クラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型システム
本明細書では、新規なクラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型タンパク質及びそのガイドＲＮＡ（「ガイドＲＮＡ」は本明細書では互換的に「ｇＲＮＡ」と呼ぶ）が提供され、これらは本開示のクラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型システムを構成する。本明細書で使用する場合、ｇＲＮＡは、ＲＮＡヌクレオチドのみを含んでもよく、ＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドを含んでもよく、またはＤＮＡヌクレオチドのみを含んでもよく、したがって、ｇＲＮＡと呼ばれる一方で、ＲＮＡ－ヌクレオチドを含まなくてもよい。
本明細書では、新規なクラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型タンパク質及びそのガイドＲＮＡ（「ガイドＲＮＡ」は本明細書では互換的に「ｇＲＮＡ」と呼ぶ）が提供され、これらは本開示のクラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型システムを構成する。本明細書で使用する場合、ｇＲＮＡは、ＲＮＡヌクレオチドのみを含んでもよく、ＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドを含んでもよく、またはＤＮＡヌクレオチドのみを含んでもよく、したがって、ｇＲＮＡと呼ばれる一方で、ＲＮＡ－ヌクレオチドを含まなくてもよい。
したがって、本明細書では、（ａ）Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４タンパク質、またはＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４タンパク質をコードする核酸と、（ｂ）Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４ ｇＲＮＡ、またはＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４ ｇＲＮＡをコードする核酸と、を含むシステムであって、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質が、天然には一緒に存在しないものであり、ｇＲＮＡが、標的ＤＮＡ中の標的配列にハイブリダイズすることができ、ｇＲＮＡが、Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質と複合体を形成することができる、システムが提供される。本明細書で使用される「Ｃａｓ９．１～Ｃａｓ９．４」は、Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、Ｃａｓ９．４を指すことを理解されたい。
これらの要素について、以下で順に説明する。
ａ．クラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型タンパク質
本明細書では、新規なクラス２のＩＩ型及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えば、新規なＣａｓ９タンパク質（Ｃａｓ９バリアント）及び新規なＣａｓ１２ａタンパク質（Ｃａｓ１２ａバリアント）、ならびに新規なＣａｓ１２サブタイプが提供される。
本明細書では、新規なクラス２のＩＩ型及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えば、新規なＣａｓ９タンパク質（Ｃａｓ９バリアント）及び新規なＣａｓ１２ａタンパク質（Ｃａｓ１２ａバリアント）、ならびに新規なＣａｓ１２サブタイプが提供される。
表１は、本開示の新規なＣａｓ９タンパク質のタンパク質配列を示す。いくつかの実施形態では、本開示の新規なＣａｓ９タンパク質は、メタゲノミクス試料からバイオインフォマティクス法を用いて推定される。
配列番号１は、本開示の新規なＣａｓ９バリアントであるＣａｓ９．１（１０３８アミノ酸長）を表す。図３Ａは、新規なＣａｓ９．１遺伝子周辺のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓクラスターの概略図である。図４Ａは、Ｃａｓ９タンパク質の主要な触媒アミノ酸、及びＣａｓ９タンパク質ファミリーの選択された代表における保存されたモチーフのアライメントを示す。図４Ｂは、Ｃａｓ９．１、及びＣａｓ９タンパク質ファミリーの他の選択された代表のＲｕｖＣ１、ブリッジヘリックス、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインのアライメントを示す。
配列番号２は、本開示の新規なＣａｓ９バリアントであるＣａｓ９．２（１３７５アミノ酸長）を表す。図３Ｃは、新規なＣａｓ９．２遺伝子周辺のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓクラスターの概略図である。図４Ｃは、Ｃａｓ９．２、及びＣａｓ９タンパク質ファミリーの他の選択された代表のＲｕｖＣ１、ブリッジヘリックス、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインのアライメントを示す。
配列番号１０は、本開示の新規なＣａｓ９バリアントであるＣａｓ９．３（１０３１アミノ酸長）を表す。図３Ｄは、新規なＣａｓ９．３遺伝子周辺のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓクラスターの概略図である。図４Ｄは、Ｃａｓ９．３、及びＣａｓ９タンパク質ファミリーの他の選択された代表のＲｕｖＣ１、ブリッジヘリックス、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインのアライメントを示す。
配列番号１１は、本開示の新規なＣａｓ９バリアントであるＣａｓ９．４（１３２９アミノ酸長）を表す。図３Ｆは、新規なＣａｓ９．４遺伝子周辺のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓクラスターの概略図である。図４Ｅは、Ｃａｓ９．４、及びＣａｓ９タンパク質ファミリーの他の選択された代表のＲｕｖＣ１、ブリッジヘリックス、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインのアライメントを示す。
本明細書において使用される場合、Ｃａｓ９．１には、配列番号１と、それに対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質が含まれる。したがって、本明細書では、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質と、それに対して少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するタンパク質が提供される。配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質と、それに対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸もまた本明細書で提供される。
本明細書において使用される場合、Ｃａｓ９．２には、配列番号２と、それに対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質が含まれる。したがって、本明細書では、配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質と、それに対して少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するタンパク質が提供される。配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質と、それに対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸もまた本明細書で提供される。
本明細書において使用される場合、Ｃａｓ９．３には、配列番号１０と、それに対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質が含まれる。したがって、本明細書では、配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質と、それに対して少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するタンパク質が提供される。配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質と、それに対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸もまた本明細書で提供される。
本明細書において使用される場合、Ｃａｓ９．４には、配列番号１１と、それに対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質が含まれる。したがって、本明細書では、配列番号１１のアミノ酸配列を含むタンパク質と、それに対して少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するタンパク質が提供される。配列番号１１のアミノ酸配列を含むタンパク質と、それに対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸もまた本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９タンパク質は、触媒活性を持ったＣａｓ９タンパク質、例えば、触媒活性を持ったＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質である。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９タンパク質は、標的配列から遠位にある部位で切断する、例えば、Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４．４タンパク質は、標的配列から遠位にある部位で切断する。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９タンパク質は、触媒活性を伴わないＣａｓ９タンパク質、例えば、Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質は触媒活性を伴わない（ｄＣａｓ９．１、ｄＣａｓ９．２、ｄＣａｓ９．３、またはｄＣａｓ９．４タンパク質）。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９タンパク質は、ニッカーゼＣａｓ９タンパク質、例えば、Ｃａｓ９．１ニッカーゼ、Ｃａｓ９．２ニッカーゼ、Ｃａｓ９．３ニッカーゼ、またはＣａｓ９．４ニッカーゼタンパク質である。
本開示のＣａｓ９タンパク質は、アプタマーを含むように改変することができる。
本開示のＣａｓ９タンパク質は、ドメイン、例えば、二重作用Ｃａｓタンパク質を生成するための触媒ドメインにさらに融合させることができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、さらに塩基エディターに融合される。
ｂ．クラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型タンパク質のｇＲＮＡ
本開示は、本開示の新規なＣａｓ９タンパク質の活性を標的ＤＮＡ内の特定の標的配列に指向するＤＮＡ標的化ＲＮＡを提供する。これらのＤＮＡ標的化ＲＮＡは、本明細書では「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。一般に、本明細書で提供される場合、Ｃａｓ９バリアントｇＲＮＡは、第１のセグメント（本明細書では「標的化ＲＮＡ」、「ＤＮＡ標的化セグメント」、または「ＤＮＡ標的配列」とも呼ばれる）及び第２のセグメント（本明細書では「アクチベーターＲＮＡ」または「タンパク結合配列」とも呼ばれる）を含む。また、本明細書では、本開示のＣａｓ９ ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が提供される。
本開示は、本開示の新規なＣａｓ９タンパク質の活性を標的ＤＮＡ内の特定の標的配列に指向するＤＮＡ標的化ＲＮＡを提供する。これらのＤＮＡ標的化ＲＮＡは、本明細書では「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。一般に、本明細書で提供される場合、Ｃａｓ９バリアントｇＲＮＡは、第１のセグメント（本明細書では「標的化ＲＮＡ」、「ＤＮＡ標的化セグメント」、または「ＤＮＡ標的配列」とも呼ばれる）及び第２のセグメント（本明細書では「アクチベーターＲＮＡ」または「タンパク結合配列」とも呼ばれる）を含む。また、本明細書では、本開示のＣａｓ９ ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が提供される。
ｉ．ターゲッターＲＮＡ
本開示のＣａｓ９バリアントｇＲＮＡのターゲッターＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列（ｇＲＮＡの標的配列；ＤＮＡ標的配列；スペーサー配列）に相補的なヌクレオチド配列を含む。ターゲッターＲＮＡは、互換的にｃｒＲＮＡと呼ぶことができる。ｇＲＮＡのターゲッターＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的に標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ターゲッターＲＮＡのヌクレオチド配列は様々であり、標的ＤＮＡ内でｇＲＮＡ及び標的ＤＮＡが相互作用する位置を決定する。対象ｇＲＮＡのターゲッターＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように（例えば、遺伝子エンジニアリングによって）改変することができる。
本開示のＣａｓ９バリアントｇＲＮＡのターゲッターＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列（ｇＲＮＡの標的配列；ＤＮＡ標的配列；スペーサー配列）に相補的なヌクレオチド配列を含む。ターゲッターＲＮＡは、互換的にｃｒＲＮＡと呼ぶことができる。ｇＲＮＡのターゲッターＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的に標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ターゲッターＲＮＡのヌクレオチド配列は様々であり、標的ＤＮＡ内でｇＲＮＡ及び標的ＤＮＡが相互作用する位置を決定する。対象ｇＲＮＡのターゲッターＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように（例えば、遺伝子エンジニアリングによって）改変することができる。
ターゲッターＲＮＡは、約１２ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、ターゲッターＲＮＡは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）から約８０ｎｔ、約１２ｎｔから約５０ｎｔ、約１２ｎｔから約４０ｎｔ、約１２ｎｔから約３０ｎｔ、約１２ｎｔから約２５ｎｔ、約１２ｎｔから約２０ｎｔ、または約１２ｎｔから約１９ｎｔの長さを有することができる。例えば、ターゲッターＲＮＡは、約１９ｎｔから約２０ｎｔ、約１９ｎｔから約２５ｎｔ、約１９ｎｔから約３０ｎｔ、約１９ｎｔから約３５ｎｔ、約１９ｎｔから約４０ｎｔ、約１９ｎｔから約４５ｎｔ、約１９ｎｔから約５０ｎｔ、約１９ｎｔから約６０ｎｔ、約１９ｎｔから約７０ｎｔ、約１９ｎｔから約８０ｎｔ、約１９ｎｔから約９０ｎｔ、約１９ｎｔから約１００ｎｔ、約２０ｎｔから約２５ｎｔ、約２０ｎｔから約３０ｎｔ、約２０ｎｔから約３５ｎｔ、約２０ｎｔから約４０ｎｔ、約２０ｎｔから約４５ｎｔ、約２０ｎｔから約５０ｎｔ、約２０ｎｔから約６０ｎｔ、約２０ｎｔから約７０ｎｔ、約２０ｎｔから約８０ｎｔ、約２０ｎｔから約９０ｎｔ、または約２０ｎｔから約１００ｎｔの長さを有することができる。
一般に、Ｃａｓ９の天然のプロセシングされていないｐｒｅ－ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート及び隣接するスペーサー（ＤＮＡ分子への標的化を可能にするｃｒＲＮＡの部分）を含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピートを含むこと、及びプロセシングされていないｐｒｅ－ｃｒＲＮＡから成熟ｇＲＮＡへのダイレクトリピート変異は、ｇＲＮＡの安定性を改善し得る。
表２は、本開示のＣａｓ９バリアントの天然に存在するｃｒＲＮＡの天然に存在するダイレクトリピート配列を示す。
いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡは、本開示のエンジニアリングされたｇＲＮＡに組み込むことができる、天然に存在しないエンジニアリングされたダイレクトリピート配列を含む。
ｉｉ． スペーサー配列
本開示のｇＲＮＡは、標的ＤＮＡに対して相補的なスペーサー配列を含む。より具体的には、標的ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的配列またはスペーサー配列）に対して相補的なターゲッターＲＮＡのヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有することができる。例えば、標的ＤＮＡの標的配列に対して相補的なターゲッターＲＮＡのＤＮＡ標的配列は、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔの長さを有することができる。例えば、標的ＤＮＡの標的配列に対して相補的なターゲッターＲＮＡのＤＮＡ標的配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）～約８０ｎｔ、約１２ｎｔ～約５０ｎｔ、約１２ｎｔ～約４５ｎｔ、約１２ｎｔ～約４０ｎｔ、約１２ｎｔ～約３５ｎｔ、約１２ｎｔ～約３０ｎｔ、約１２ｎｔ～約２５ｎｔ、約１２ｎｔ～約２０ｎｔ、約１２ｎｔ～約１９ｎｔ、約１９ｎｔ～約２０ｎｔ、約１９ｎｔ～約２５ｎｔ、約１９ｎｔ～約３０ｎｔ、約１９ｎｔ～約３５ｎｔ、約１９ｎｔ～約４０ｎｔ、約１９ｎｔ～約４５ｎｔ、約１９ｎｔ～約５０ｎｔ、約１９ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ～約６０ｎｔの長さを有することができる。標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列）に対して相補的なターゲッターＲＮＡのヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的配列）は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有することができる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡの標的配列に対して相補的なターゲッターＲＮＡのＤＮＡ標的配列は、２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡの標的配列に対して相補的なターゲッターＲＮＡのＤＮＡ標的配列は、１９ヌクレオチド長である。
本開示のｇＲＮＡは、標的ＤＮＡに対して相補的なスペーサー配列を含む。より具体的には、標的ＤＮＡの標的ヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的配列またはスペーサー配列）に対して相補的なターゲッターＲＮＡのヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有することができる。例えば、標的ＤＮＡの標的配列に対して相補的なターゲッターＲＮＡのＤＮＡ標的配列は、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、または少なくとも約４０ｎｔの長さを有することができる。例えば、標的ＤＮＡの標的配列に対して相補的なターゲッターＲＮＡのＤＮＡ標的配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）～約８０ｎｔ、約１２ｎｔ～約５０ｎｔ、約１２ｎｔ～約４５ｎｔ、約１２ｎｔ～約４０ｎｔ、約１２ｎｔ～約３５ｎｔ、約１２ｎｔ～約３０ｎｔ、約１２ｎｔ～約２５ｎｔ、約１２ｎｔ～約２０ｎｔ、約１２ｎｔ～約１９ｎｔ、約１９ｎｔ～約２０ｎｔ、約１９ｎｔ～約２５ｎｔ、約１９ｎｔ～約３０ｎｔ、約１９ｎｔ～約３５ｎｔ、約１９ｎｔ～約４０ｎｔ、約１９ｎｔ～約４５ｎｔ、約１９ｎｔ～約５０ｎｔ、約１９ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ～約６０ｎｔの長さを有することができる。標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列）に対して相補的なターゲッターＲＮＡのヌクレオチド配列（ＤＮＡ標的配列）は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有することができる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡの標的配列に対して相補的なターゲッターＲＮＡのＤＮＡ標的配列は、２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡの標的配列に対して相補的なターゲッターＲＮＡのＤＮＡ標的配列は、１９ヌクレオチド長である。
ターゲッターＲＮＡのスペーサー配列と、標的ＤＮＡの標的配列との相補性割合は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であることができる。いくつかの実施形態では、ターゲッターＲＮＡのＤＮＡ標的配列と、標的ＤＮＡの標的配列との相補性割合は、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の、１～２５個の連続した最も５’側のヌクレオチドにおいて、１００％である。いくつかの実施形態では、ターゲッターＲＮＡのＤＮＡ標的配列と、標的ＤＮＡの標的配列との相補性割合は、約１～２５個の連続ヌクレオチドにおいて、少なくとも６０％である。いくつかの実施形態では、ターゲッターＲＮＡのＤＮＡ標的配列と、標的ＤＮＡの標的配列との相補性割合は、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の、１～２５個の連続した最も５’側のヌクレオチドにおいて１００％であり、残りにおいては、限りなく０％に近い。このような場合、ＤＮＡ標的配列は、１～２５ヌクレオチド長であるとみなすことができる。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９ ｇＲＮＡのスペーサー配列は、哺乳類生体における標的配列に向けられる。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、非哺乳類生体における標的配列に向けられる。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９ ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ヒトの配列である標的配列に向けられる。いくつかの実施形態では、標的配列は非ヒト霊長類の配列である。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９ ｇＲＮＡのスペーサー配列は、治療標的に選択される標的配列に向けられる。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９ ｇＲＮＡのスペーサー配列は、診断標的に選択される標的配列に向けられる。例えば、このような実施形態では、本開示の標識ｄＣａｓ９、及び、診断標的ＤＮＡに向けられるｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ、または、標的ＤＮＡを含む細胞、または、標的ＤＮＡを含む試料と接触する。
ｉｉｉ．アクチベーターＲＮＡ
本開示のＣａｓ９バリアントｇＲＮＡのアクチベーターＲＮＡは、本開示のその同族Ｃａｓ９バリアントと結合する。アクチベーターＲＮＡは、互換的にｔｒａｃｒＲＮＡとも呼ばれることができる。ｇＲＮＡは、結合したＣａｓ９タンパク質を、標的ＤＮＡ内の特異的ヌクレオチド配列に、上述したターゲッターＲＮＡを介して案内する。Ｃａｓ９バリアントｇＲＮＡのアクチベーターＲＮＡは、互いに相補的な、ヌクレオチドの２つの伸長物を含む。
本開示のＣａｓ９バリアントｇＲＮＡのアクチベーターＲＮＡは、本開示のその同族Ｃａｓ９バリアントと結合する。アクチベーターＲＮＡは、互換的にｔｒａｃｒＲＮＡとも呼ばれることができる。ｇＲＮＡは、結合したＣａｓ９タンパク質を、標的ＤＮＡ内の特異的ヌクレオチド配列に、上述したターゲッターＲＮＡを介して案内する。Ｃａｓ９バリアントｇＲＮＡのアクチベーターＲＮＡは、互いに相補的な、ヌクレオチドの２つの伸長物を含む。
ｉｖ．二重分子Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本開示の新規のＣａｓ９タンパク質用の、二重分子（２分子）Ｃａｓ９ ｇＲＮＡを本明細書で提供する。このようなｇＲＮＡは、２つの個別ＲＮＡ分子（アクチベーターＲＮＡ－ｔｒａｃＲＮＡ；及び、標的化ＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ）を含む。主題の二重分子ｇＲＮＡの２つのＲＮＡ分子はそれぞれ、互いに相補的なヌクレオチドの伸長物が、その２つのＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチドがハイブリダイズして、ｇＲＮＡの二本鎖ＲＮＡデュプレックスを形成するように含む。
いくつかの実施形態では、本開示の新規のＣａｓ９タンパク質用の、二重分子（２分子）Ｃａｓ９ ｇＲＮＡを本明細書で提供する。このようなｇＲＮＡは、２つの個別ＲＮＡ分子（アクチベーターＲＮＡ－ｔｒａｃＲＮＡ；及び、標的化ＲＮＡ－ｃｒＲＮＡ）を含む。主題の二重分子ｇＲＮＡの２つのＲＮＡ分子はそれぞれ、互いに相補的なヌクレオチドの伸長物が、その２つのＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチドがハイブリダイズして、ｇＲＮＡの二本鎖ＲＮＡデュプレックスを形成するように含む。
二重分子ｇＲＮＡは、ターゲッターＲＮＡの、アクチベーターＲＮＡとの制御された（即ち、条件的）結合を可能にするように設計することができる。アクチベーターＲＮＡとターゲッターＲＮＡの両方が、本開示のＣａｓ９バリアントとの機能的複合体内で結合しない限り、二重分子ｇＲＮＡは機能的ではないため、二重分子ｇＲＮＡは、アクチベーターＲＮＡとターゲッターＲＮＡとの結合を誘発性とすることにより誘発性（例えば、薬剤誘発性）となることができる。一非限定例として、ＲＮＡアプタマーを使用して、アクチベーターＲＮＡのターゲッターＲＮＡとの結合を調節（即ち、制御）することができる。したがって、アクチベーターＲＮＡ及び／またはターゲッターＲＮＡは、ＲＮＡアプタマー配列を含むことができる。
二重分子ガイドを修飾して、アプタマーを含めることができる。
ｖ．単一分子Ｃａｓ９バリアントｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本開示の新規のＣａｓ９タンパク質用の、単一分子ｇＲＮＡ（本明細書では互換的に、ｓｇＲＮＡとも呼ばれる）を含む、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡを本明細書で提供する。
いくつかの実施形態では、本開示の新規のＣａｓ９タンパク質用の、単一分子ｇＲＮＡ（本明細書では互換的に、ｓｇＲＮＡとも呼ばれる）を含む、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡを本明細書で提供する。
したがって、
ａ．標的ＤＮＡ内で標的配列とハイブリダイズ可能なターゲッターＲＮＡ、及び
ｂ．ターゲッターＲＮＡとハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡデュプレックスを形成可能なアクチベーターＲＮＡであって、当該アクチベーターＲＮＡがアクチベーターＲＮＡを含む、アクチベーターＲＮＡ
を含み、ターゲッターＲＮＡ及びアクチベーターＲＮＡが互いに共有結合し、単一分子ｇＲＮＡが、本開示の新規のＣａｓ９タンパク質との複合体を形成可能であり、ターゲッターＲＮＡの標的配列へのハイブリダイゼーションが、本開示のＣａｓ９タンパク質が、標的ＤＮＡを標的化することが可能である、組み換え単一分子ｇＲＮＡを、本明細書で提供する。
ａ．標的ＤＮＡ内で標的配列とハイブリダイズ可能なターゲッターＲＮＡ、及び
ｂ．ターゲッターＲＮＡとハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡデュプレックスを形成可能なアクチベーターＲＮＡであって、当該アクチベーターＲＮＡがアクチベーターＲＮＡを含む、アクチベーターＲＮＡ
を含み、ターゲッターＲＮＡ及びアクチベーターＲＮＡが互いに共有結合し、単一分子ｇＲＮＡが、本開示の新規のＣａｓ９タンパク質との複合体を形成可能であり、ターゲッターＲＮＡの標的配列へのハイブリダイゼーションが、本開示のＣａｓ９タンパク質が、標的ＤＮＡを標的化することが可能である、組み換え単一分子ｇＲＮＡを、本明細書で提供する。
主題の単一分子ｇＲＮＡは、互いに相補的なヌクレオチドの２つのセグメント（ターゲッターＲＮＡ及びアクチベーターＲＮＡ）を含み、介在ヌクレオチド（「リンカー」または「リンカーヌクレオチド」）により共有結合可能であり、ハイブリダイズし、アクチベーターＲＮＡの二本鎖ＲＮＡデュプレックス（ｄｓＲＮＡデュプレックス）を形成することにより、ステムループ構造がもたらされる。いくつかの実施形態では、ターゲッターＲＮＡ及びアクチベーターＲＮＡは、ターゲッターＲＮＡの３’末端、及びアクチベーターＲＮＡの５’末端を介して共有結合する。他の実施形態では、アクチベーターＲＮＡは、ターゲッターＲＮＡの５’末端、及びアクチベーターＲＮＡの３’末端を介して共有結合する。
いくつかの実施形態では、ターゲッターＲＮＡ及びアクチベーターＲＮＡは、５’→３’方向に配置される。
いくつかの実施形態では、アクチベーターＲＮＡ及びターゲッターＲＮＡは、５’→３’方向に配置される。
いくつかの実施形態では、単一分子ｇＲＮＡは、対応する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ及び／またはｃｒＲＮＡの配列と比較して、１つ以上の配列変更を含む。
いくつかの実施形態では、ターゲッターＲＮＡ及びアクチベーターＲＮＡは、リンカーを介して互いに共有結合する。
存在する場合、単一分子ｇＲＮＡのリンカーは、約３ヌクレオチド長～約３０ヌクレオチド長を有することができる。例示的実施形態では、単一分子ｇＲＮＡのリンカーは、４、５、６、または７ｎｔである。
例示的な単一分子ｇＲＮＡは、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡデュプレックスを形成する、ヌクレオチドの２つの相補性伸長物を含む。いくつかの実施形態では、単一分子ｇＲＮＡ（または、伸長物をコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの、２つの相補性伸長物のうちの片方は、アクチベーターＲＮＡの一方に少なくとも約６０％同一である。例えば、単一分子ｇＲＮＡ（または、伸長物をコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの、２つの相補性伸長物のうちの片方は、アクチベーターＲＮＡに少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一である。
ｇＲＮＡのタンパク質－結合ドメインの構造を確実に保存したまま、アクチベーターＲＮＡ及びターゲッターＲＮＡセグメントを組み換えることができる。したがって、人工的なタンパク質－結合ドメイン（二重分子または単一分子版のいずれか）を設計するために、ＤＮＡ標的化ＲＮＡの、自然に存在するタンパク質－結合ドメインのＲＮＡ折り畳み構造を考慮に入れることができる。
単一分子ｇＲＮＡのアクチベーターＲＮＡは、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、アクチベーターＲＮＡは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔの長さを有することができる。
本開示の単一分子及び二重分子ｇＲＮＡの両方に関してもまた、アクチベーターＲＮＡのｄｓＲＮＡデュプレックスは、約６ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｂｐの長さを有することができる。例えば、アクチベーターＲＮＡのｄｓＲＮＡデュプレックスは、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｂｐ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｂｐ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、または約８ｎｔ～約１５ｎｔの長さを有することができる。例えば、アクチベーターＲＮＡのｄｓＲＮＡデュプレックスは、約８ｎｔ～約１０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１８ｎｔ、約１８ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２５ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約３５ｎｔ、約３５ｎｔ～約４０ｎｔ、または約４０ｎｔ～約５０ｎｔの長さを有することができる。いくつかの実施形態では、アクチベーターＲＮＡのｄｓＲＮＡデュプレックスは、８～１５塩基対の長さを有する。ハイブリダイズして、アクチベーターＲＮＡのｄｓＲＮＡデュプレックスを形成するヌクレオチド配列間での相補性割合は、少なくとも約６０％であることができる。例えば、ハイブリダイズして、アクチベーターＲＮＡのｄｓＲＮＡデュプレックスを形成するヌクレオチド配列間での相補性割合は、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であることができる。いくつかの実施形態では、ハイブリダイズして、アクチベーターＲＮＡのｄｓＲＮＡデュプレックスを形成するヌクレオチド配列間での相補性割合は１００％である。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９ ｇＲＮＡ（単一分子ｇＲＮＡであるか、または二重分子ｇＲＮＡであるかを問わない）のスペーサー配列は、哺乳類生体、例えばヒトまたは非ヒト霊長類における標的配列に向けられる。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９のｇＲＮＡのスペーサー配列は、細菌における標的配列に向けられる。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９のｇＲＮＡのスペーサー配列は、ウイルスにおける標的配列に向けられる。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９のｇＲＮＡのスペーサー配列は、植物における標的配列に向けられる。
いくつかの実施形態では、本開示の単一分子Ｃａｓ９ ｇＲＮＡを修飾して、アプタマーを含めることができる。
ｖｉ．ｇＲＮＡアレイ
本開示のＣａｓ９ ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡアレイとして提供することができる。
本開示のＣａｓ９ ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡアレイとして提供することができる。
ｇＲＮＡアレイは、一列に配列される２つ以上のｇＲＮＡを含み、２つ以上の個別のｇＲＮＡに処理することができる。したがって、いくつかの実施形態では、前駆体Ｃａｓ９ ｇＲＮＡアレイは、２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、２、３、４、または５個）のｇＲＮＡ（例えば、前駆体分子として一列に配置される）を含むことができる。いくつかの実施形態では、２つ以上のｇＲＮＡがアレイ（前駆体ｇＲＮＡアレイ）に存在することができる。本開示のＣａｓ９タンパク質は、前駆体ｇＲＮＡアレイを個別のｇＲＮＡに切断することができる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡアレイは、２つ以上のｇＲＮＡ（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上のｇＲＮＡ）を含む。所与のアレイのｇＲＮＡは、同一の標的ＤＮＡの異なる標的部位を標的にすることができる（即ち、当該異なる標的部位にハイブリダイズする案内配列を含むことができる）。いくつかの実施形態では、前駆体ｇＲＮＡアレイの２つ以上のｇＲＮＡは、同一の案内配列を有する。いくつかの実施形態では、前駆体ｇＲＮＡアレイは、同一の標的ＤＮＡ内に、異なる標的部位を標的にする２つ以上のｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前駆体ｇＲＮＡアレイは、異なる標的ＤＮＡを標的にする２つ以上のｇＲＮＡを含む。
ＩＩ．クラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡガイドシステム
本開示の、新規のクラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡガイドシステムを構成する、新規のクラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型タンパク質及びそのｇＲＮＡを本明細書で提供する。
本開示の、新規のクラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡガイドシステムを構成する、新規のクラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型タンパク質及びそのｇＲＮＡを本明細書で提供する。
クラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質及び単一ガイドＲＮＡを含む組み換えシステムであって、ｇＲＮＡ及びクラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質が、共に自然に生じず、ｇＲＮＡが標的ＤＮＡ内で標的配列にハイブリダイズ可能であり、ｇＲＮＡが、クラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質との複合体を形成可能であり、クラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質がコラテラル活性を有し、ｔｒａｃｒＲＮＡを用いることなく、ＲＮＡを含む一本鎖ポリヌクレオチドを並行して切断可能である、上記システムを本明細書で提供するいくつかの実施形態では、クラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含む、または配列番号４に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、クラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質は、一本鎖ＲＮＡを並行して切断可能である。いくつかの実施形態では、クラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質は、一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを並行して切断可能である。
（ａ）Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑタンパク質、または、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑタンパク質をコードする核酸；及び、（ｂ）Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑ ｇＲＮＡ、または、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑ ｇＲＮＡをコードする核酸を含む組み換えシステムであって、ｇＲＮＡ、及びＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質が共に自然に生じず、ｇＲＮＡが標的ＤＮＡ内で標的配列にハイブリダイズ可能であり、ｇＲＮＡが、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質との複合体を形成可能である、上記システム、もまた、本明細書において提供する。
構成成分は順次以下に記載する。
ａ．クラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型タンパク質
新規のＣａｓ１２ａバリアント、及び新規のＣａｓ１２亜型を含む、新規のクラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、例えば、本開示の新規のＣａｓ１２タンパク質を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、本開示の新規のＣａｓ１２タンパク質は、バイオインフォマティクス法を用いて推論されている。
新規のＣａｓ１２ａバリアント、及び新規のＣａｓ１２亜型を含む、新規のクラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、例えば、本開示の新規のＣａｓ１２タンパク質を本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、本開示の新規のＣａｓ１２タンパク質は、バイオインフォマティクス法を用いて推論されている。
表３ａは、本開示の新規のＣａｓ１２タンパク質のタンパク質配列を示す。表２ｂは、本開示の新規のＣａｓ１２ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号３は、本開示の新規のＣａｓ１２ａバリアントである、Ｃａｓ１２ａ．１（１２５４アミノ酸長）を表す。Ｃａｓ１２ａ．１は、メタゲノミクス試料から単離し、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｉｃｒａｒｃｈａｅｏｔａ古細菌由来であると推論した。配列、機能、及び構造的特徴に基づくと、Ｃａｓ１２ａ．１はＣａｓ１２ａ亜型であると考えられる。図５Ａは、新規のＣａｓ１２ａ．１遺伝子周辺でのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓクラスターの略図である。図６Ａは、Ｃａｓ１２ａタンパク質に対する鍵となる触媒アミノ酸、及び、Ｃａｓ１２ａタンパク質ファミリーの選択された代表物における保存モチーフのアライメントを示す。図６Ｂは、Ｃａｓ１２ａ．１、及び、Ｃａｓ１２ａタンパク質ファミリーの他の選択された代表物に対する、ＲｕｖＣ１、Ｂｒｉｄｇｅヘリックス、ＲｕｖＣＩＩ、及びＲｕｖＣＩＩＩドメインのアライメントを示す。配列番号１３は、本開示のＣａｓ１２ａ．１をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号４は、本開示の新規のＣａｓ１２亜型である、Ｃａｓ１２ｐ（１２８１アミノ酸長）を表す。Ｃａｓ１２ａ．１は、メタゲノミクス試料から単離し、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ細菌由来であると推論した。本明細書に記載する配列、機能、及び構造的特徴に基づくと、Ｃａｓ１２ｐは、今日まで識別されたＣａｓ１２ファミリーの他のメンバーとは異なるが故に、新規のＣａｓ１２酵素である。この新規のＣａｓ１２亜型は、他のＣａｓ１２タンパク質では見られない特有の性質、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡを用いることなく、ＲＮＡまたはＤＮＡ含有配列、例えば、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖キメラＲＮＡ／ＤＮＡを並行して切断する能力を有する。表３ａ内の配列番号２２２もまた、配列番号４のＣａｓ１２ｐのＮ末端切断であることに留意されたい。
配列番号１４は、本開示のＣａｓ１２ｐをコードするヌクレオチド配列を提供する。図５Ｃは、新規のＣａｓ１２ｐ遺伝子周辺でのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓクラスターの略図である。図６Ｂ．１は、ＵＳ２０１６０２０８２４３のＣａｓ１２ａ．１と配列番号８１のアライメントを示し、４６．８％の配列同一性を有し、図６Ｃは、ＵＳ １０，２５３３６５のＣａｓ１２ａ．１と配列番号３のアライメントを示し、４６．５％の配列同一性を示す。
図６Ｄは、下線を引いたＲｕｖＣモチーフを有するＣａｓ１２ｐのアミノ酸配列を示す（配列番号４）。Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５で参照されるＦｎＣａｓ１２ａ配列を、Ｒｕｖモチーフの識別のための参照として使用した。図６Ｅは、別のＣａｓ１２酵素であるＣａｓ１２ｇ１との、Ｃａｓ１２ｐのアライメントを示す。この図は、Ｃａｓ１２ｐの、Ｃａｓ１２ｇ１とのアライメントを示す。Ｃａｓ１２ｇ１は、ＲＮＡを並行して切断する（ｔｒａｎｓ切断する）能力を有することが報告されているものの、配列相同性は、プログラムＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａにより読み込まれると、８．９％未満である。酵素と、保存ドメインの欠落とにおける非常に低い相同性は、これらが異なる酵素ファミリーのメンバーであることを示している。さらに、Ｃａｓ１２ｇ１は、ｔｒａｃｒ配列の存在が必要であり、Ｃａｓ１２ｐは必要とせず、さらなる機能的差異をもたらしている。
以下の図では、Ｃａｓ１２ｐタンパク質の構造は、Ｓｗｉｓｓ ＭｏｄｅｌサーバーによるＦｎ Ｃａｓ１２ａ構造に基づきモデリングした。タンパク質間での配列同一性は、３８．３４％である。モデルは、Ｃａｓ１２ｐタンパク質の配列全体をカバーした。図６ＦはＳｗｉｓｓ Ｍｏｄｅｌサーバーを用いるＣａｓ１２ｐの構造分析を示す。図６Ｇは、Ｃａｓ１２ｐにおける非保存アミノ酸残基の空間予測を示す。非保存残基は、タンパク質露出表面に位置することが確認される。これらの差は、基質との第１の接触、及び溶媒相互作用の変化を反映する可能性がある。図６Ｈは、Ｃａｓ１２ｐの表面にまたがる電荷分布の概算を示す。図６Ｆに示すモデルを用いると、Ｐｙｍｏｌソフトウェアにより生成した真空静電特性により、タンパク質の表面にまたがる電荷分布の概算のモデリングが可能となった。正から負への変化は、白から黒で表され、白の領域は、最も正の領域を表している。白の楕円は、両方の位置における活性部位の溝を強調している。図は、ＦｎＣａｓ１２ａと比較しての、Ｃａｓ１２ｐタンパク質の活性部位の溝における、正電荷のわずかな変化を示す。正電荷の増加は、負電荷の基質とのより強力な相互作用と関連する可能性があり、Ｃａｓ１２ｐの、ＲＮＡ及びＤＮＡ基質に対する増加した親和性を説明することができた。図６Ｉは、タンパク質配列に基づく、Ｃａｓ１２ｐとＦｎＣａｓ１２ａとの予測される構造差を示す。ＦｎＣａｓ１２ａにおいて、ＰＡＭ相互作用ドメインにおける領域６９６～７０６は、標的ＤＮＡの結合及び切断と関係し、Ｗｅｄｇｅ ＩＩＩ領域における領域８４２～８５２は、プレｃＲＮＡ処理に関係する（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ，２０１７）。位置６９９における配列ＫＮＧＮＰＱＫＧＹ（配列番号１１３）、及び位置８４４におけるＰＡＫＥ（配列番号１１４）の欠失を考慮すると、Ｃａｓ１２ｐと比較した差異に、酵素は、これらの領域において低い相同性を示す。これらの領域の触媒関連性により、配列変化を、触媒を用いて確認される変化と関連させることが可能である。欠失は、Ｃａｓ１２ｐの二次構造に影響を及ぼすことが予測される。図はＣａｓ１２ｐのモデル（ライトグレー）とＦｎＣａｓ１２ａの構造（ダークグレー）との重複画像を示し、欠失配列は黒で示す。配列ＫＮＧＮＰＱＹ（配列番号１１５）の欠失は、ループ短縮で反映される。ＰＡＫＥ配列（配列番号１１４；ループにおけるさらなる変化に追加される）の欠失により、ループ長が減少し、Ｃａｓ１２ｐの当該位置における負電荷が減少する。図６Ｊは、Ｓｗｉｓｓ Ｍｏｄｅｌサーバーによる構造分析に基づく、Ｃａｓ１２ｐのＲｕｖＣＩＩＩドメイン構造解析を示す。Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５で参照されるＦｎＣａｓ１２ａ配列を、Ｒｕｖモチーフの識別のための参照として使用した。ＲｕｖＣＩＩＩ領域はＣａｓ１２ｐ、及びプロトタイプＣａｓ１２ａタンパク質上で保存されるものの、Ｃａｓ１２ｐは、ドメインを囲む配列上にいくつかの差異を有する。これらの変化が存在することで、（黒色で示すように）Ｃａｓ１２ｐの二次構造に影響が及び、この酵素の異なるＲＮＡ切断活性を考慮することができる。図に示す構造モデルにおいて、研究した酵素、及びＣａｓ１２ｐのモデルのＲｕｖＣＩＩＩ領域の構造体の重複画像。Ｃａｓ１２ｐの二次構造の変化を円で囲み、黒色で示す。図９Ｂ、９Ｃ、及び１７は、この新規のＣａｓ１２ｐ酵素の、固有の並行活性を示す。
配列番号５は、本開示の新規のＣａｓ１２であるＣａｓ１２ｑ（１１３７アミノ酸長）を表す。図５Ｅは、新規のＣａｓ１２ｑ遺伝子周辺でのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓクラスターの略図である。図６Ｋは、本開示の新規のＣａｓ１２タンパク質であるＣａｓ１２ｑに関して下線を引いたＲｕｖＣモチーフを有するＣａｓ１２ｑ配列を示す。Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５で参照されるＦｎＣａｓ１２ａ配列を、Ｒｕｖモチーフの識別のための参照として使用した。配列番号１５は、本開示のＣａｓ１２ｑをコードするヌクレオチド配列を示す。
本明細書で使用する場合、Ｃａｓ１２ａ．１は配列番号３、及び、当該配列に対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質を含む。したがって、配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、当該配列番号に対して少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するタンパク質を本明細書で提供する。配列番号３のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、当該配列番号に対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸もまた、本明細書で提供する。
本明細書で使用する場合、Ｃａｓ１２ｐは配列番号４、及び、当該配列に対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質を含む。したがって、配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、当該配列番号に対して少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するタンパク質を本明細書で提供する。配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、当該配列番号に対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸もまた、本明細書で提供する。
配列番号２２２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、当該配列番号に対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質もまた、本明細書で提供する。配列番号２２２のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、当該配列番号に対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸もまた、本明細書で提供する。
本明細書で使用する場合、Ｃａｓ１２ｑは配列番号５、及び、当該配列に対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質を含む。したがって、配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、当該配列番号に対して少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するタンパク質を本明細書で提供する。配列番号５のアミノ酸配列を含むタンパク質、及び、当該配列番号に対して少なくとも７０％～９９．５％の配列同一性を有するタンパク質をコードする核酸もまた、本明細書で提供する。
表３ｂは、本開示の新規のＣａｓ１２タンパク質に対する、例示的なヌクレオチド配列、及び例示的なコドン最適化核酸配列を示す。
表４ａは、本明細書で例示する本開示の新規のＣａｓ１２タンパク質の、構造的及び機能的特徴を示す。表４ｂは、対応するＣＲＩＳＰＲアレイの天然スペーサーの数及び配列を示す。表中の空のセルは、値／性質が存在しないことを示すのではなく、本明細書では例示されていないことを示す。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２タンパク質は、触媒的に活性なＣａｓ１２タンパク質、例えば、触媒的に活性なＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質である。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２タンパク質は、標的配列に対して遠位の部位にて切断する、例えば、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質は、標的配列に対して遠位の部位にて切断する。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２タンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓ１２タンパク質である、例えば、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質は、触媒的に不活性（ｄＣａｓ１２ａ．１、ｄＣａｓ１２ｐ、またはｄＣａｓ１２ｑタンパク質）である。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２タンパク質は、ニッカーゼＣａｓ１２タンパク質、例えば、Ｃａｓ１２ａ．１ニッカーゼ、Ｃａｓ１２ｐニッカーゼ、またはＣａｓ１２ｑニッカーゼタンパク質である。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２タンパク質を修飾して、アプタマーを含めることができる。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２タンパク質をさらにドメイン、例えば触媒ドメインに融合して、二重作用Ｃａｓタンパク質を産生することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質をさらに、ベースエディターに融合することができる。
ｂ．クラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型タンパク質のコラテラル活性
標的化ＤＮＡ内の標的配列を切断する能力に加えて、本開示のＣａｓ１２タンパク質は、コラテラル（ｔｒａｎｓ－切断活性）、即ち、標的ＤＮＡの検出により活性化されると、非標的化一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）またはＲＮＡを無差別に切断する能力もまた有する。あらゆる理論またはメカニズムに束縛されるものではないが、一般的には、本開示のＣａｓ１２タンパク質がｇＲＮＡにより活性化されると（これは、試料が、ｇＲＮＡがハイブリダイズする標的配列を含む（即ち、試料が標的化ＤＮＡを含む）ときに生じる）、Ｃａｓ１２は、ｇＲＮＡの標的配列を含まないオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラＲＮＡ／ＤＮＡ）（ｇＲＮＡのガイド配列がハイブリダイズしない、非標的オリゴヌクレオチド）を無差別に切断するヌクレアーゼになることができる。したがって、標的化ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）が試料に（例えば、いくつかの実施形態では、閾値量を超えて）存在する場合、結果は、試料中での一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、一本鎖キメラＲＮＡ／ＤＮＡ）の切断であることができ、これは、任意の便利な検出法を用いて（例えば、標識検出器ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを用いて）検出することができる。
標的化ＤＮＡ内の標的配列を切断する能力に加えて、本開示のＣａｓ１２タンパク質は、コラテラル（ｔｒａｎｓ－切断活性）、即ち、標的ＤＮＡの検出により活性化されると、非標的化一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）またはＲＮＡを無差別に切断する能力もまた有する。あらゆる理論またはメカニズムに束縛されるものではないが、一般的には、本開示のＣａｓ１２タンパク質がｇＲＮＡにより活性化されると（これは、試料が、ｇＲＮＡがハイブリダイズする標的配列を含む（即ち、試料が標的化ＤＮＡを含む）ときに生じる）、Ｃａｓ１２は、ｇＲＮＡの標的配列を含まないオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラＲＮＡ／ＤＮＡ）（ｇＲＮＡのガイド配列がハイブリダイズしない、非標的オリゴヌクレオチド）を無差別に切断するヌクレアーゼになることができる。したがって、標的化ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）が試料に（例えば、いくつかの実施形態では、閾値量を超えて）存在する場合、結果は、試料中での一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、一本鎖キメラＲＮＡ／ＤＮＡ）の切断であることができ、これは、任意の便利な検出法を用いて（例えば、標識検出器ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを用いて）検出することができる。
したがって、試料中で標的ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ）を検出するための方法及び組成物を本明細書で提供する。利用される検出器であることができる非標的オリゴヌクレオチドを切断するための方法及び組成物もまた提供する。これらの実施形態を以下でさらに詳述する。
ｃ．クラス２Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型タンパク質用のｇＲＮＡ
本開示は、本開示の新規のＣａｓ１２タンパク質の活性を、標的ＤＮＡ内の特異的標的配列に向ける、ＤＮＡ標的化ＲＮＡを提供する。本開示の新規のＣａｓ９タンパク質に関して上述したとおり、これらのＤＮＡ標的化ＲＮＡは、本明細書では「ｇＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。一般に、本明細書で記載するように、Ｃａｓ１２のｇＲＮＡは、共にｃｒＲＮＡと呼ばれる、スペーサー（ＤＮＡ標的配列）とＣａｓ１２ａ「タンパク質結合配列」の両方を含む、単一のセグメントを含む。本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列もまた、本明細書で提供する。
本開示は、本開示の新規のＣａｓ１２タンパク質の活性を、標的ＤＮＡ内の特異的標的配列に向ける、ＤＮＡ標的化ＲＮＡを提供する。本開示の新規のＣａｓ９タンパク質に関して上述したとおり、これらのＤＮＡ標的化ＲＮＡは、本明細書では「ｇＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。一般に、本明細書で記載するように、Ｃａｓ１２のｇＲＮＡは、共にｃｒＲＮＡと呼ばれる、スペーサー（ＤＮＡ標的配列）とＣａｓ１２ａ「タンパク質結合配列」の両方を含む、単一のセグメントを含む。本開示のＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列もまた、本明細書で提供する。
ｉ．スペーサー配列
本開示のＣａｓ１２タンパク質は、単一のｃｒＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（単一のガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）である一方で、本開示のＣａｓ９タンパク質は、ｃｒＲＮＡ及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなる二重ＲＮＡシステムによりガイドされる。本開示のＣａｓ１２ガイドのｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の配列（ＤＮＡ標的配列またはスペーサー）に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。
本開示のＣａｓ１２タンパク質は、単一のｃｒＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（単一のガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）である一方で、本開示のＣａｓ９タンパク質は、ｃｒＲＮＡ及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）からなる二重ＲＮＡシステムによりガイドされる。本開示のＣａｓ１２ガイドのｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の配列（ＤＮＡ標的配列またはスペーサー）に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。
本開示のＣａｓ１２ ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分は、約２５～５０ｎｔの長さを有することができる。いくつかの実施形態では、長さは約４０～４３ｎｔであることができる。
Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐに対する成熟ガイドスキャフォールドを、対応するＣＲＩＳＰＲ座位からコンピューターにより推論した。図３８は、Ｃａｓ１２ａ．１（５’ ａａａｕｕｕｃｕａｃｕｇｕａｇｕａｇａｕ ３’）（配列番号１１６；パネルＡ）、及びＣａｓ１２ｐ（５’ ａｇａｕｕｕｃｕａｃｕｕｕｕｇｕａｇａｕ ３’）（配列番号１１７、パネルＢ）に対するスキャフォールドの二次構造を示す。これらの成熟スキャフォールドを次に、変更可能な標的化スペーサー配列と結合させ、ｓｇＲＮＡを生じさせた。したがって、いくつかの実施形態では、配列番号１１６または配列番号１１７のスキャフォールド配列、及び、標的ＤＮＡ内で標的配列とハイブリダイズ可能なスペーサー配列を含む、組み換え単一分子ｇＲＮＡを本明細書で提供する。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡはウイルスＤＮＡ、植物ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、または細菌ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的配列は、表６ａ～６ｆのいずれかに示す標的の配列である。いくつかの実施形態では、標的はコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、標的はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡはｃＤＮＡであり、逆転写により入手されている。
Ｃａｓ１２ ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化スペーサー配列は一般に、ハイブリダイゼーション（即ち、塩基対形成）により、配列特異的な方法で標的ＤＮＡと相互作用する。そのため、ＤＮＡ標的配列のヌクレオチド配列は変化し得、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとが相互作用する、標的ＤＮＡ内での位置を決定することができる。主題のＣａｓ１２ ｇＲＮＡのＤＮＡ標的配列を（例えば、遺伝子組み換えにより）修飾して、標的ＤＮＡ内で所望の配列にハイブリダイズすることができる。
主題のＣａｓ１２ ｇＲＮＡのＤＮＡ標的配列は、約８ヌクレオチド長～約３０ヌクレオチド長を有することができる。例えば、長さは２３ヌクレオチドであることができる。
ｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的化スペーサー配列と、標的ＤＮＡの標的配列との相補性割合は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であることができる。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ－ＲＮＡのＤＮＡ標的配列と、標的ＤＮＡの標的配列との相補性割合は、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の、１～２３個の連続した最も５’側のヌクレオチドにおいて、１００％である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的配列と、標的ＤＮＡの標的配列との相補性割合は、約１～２３個の連続ヌクレオチドにおいて、少なくとも６０％である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡのＤＮＡ標的配列と、標的ＤＮＡの標的配列との相補性割合は、標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の、１～２３個の連続した最も５’側のヌクレオチドにおいて１００％であり、残りにおいては、限りなく０％に近い。このような場合、ＤＮＡ標的配列は、１～２３ヌクレオチド長であるとみなすことができる。
一般に、Ｃａｓ１２の、自然の未処理プレｃｒＲＮＡは、直接反復及び隣接スペーサー（ＤＮＡ分子を標的化可能なｃｒＲＮＡの部分）を含む。いくつかの実施形態では、未処理プレｃｒＲＮＡ由来の直接反復及び直接反復変異は、本開示のＣａｓ１２ ｇＲＮＡに含まれ、ｇＲＮＡ安定性を改善する。
表５ａは、細菌ＤＮＡで認められるような直接反復配列、すなわち、本開示のＣａｓ１２タンパク質のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座での天然に存在する予測した（推定）直接反復配列を示す。これらは、細菌のＤＮＡで認められるような天然配列、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座コンティグで予測した天然配列である。本開示のｇＲＮＡは、スペーサーに結合した直接反復の一部を有する。
いくつかの実施形態では、当該ｃｒＲＮＡは、天然に存在しない、遺伝子操作した直接反復配列を含む。表５ｂは、本開示の遺伝子操作したｇＲＮＡに組み込むことができる、天然に存在しない、遺伝子操作した直接反復配列を示す。
天然に存在しない、遺伝子操作した直接反復配列の予測ＲＮＡ二次構造を、図７Ａ～７Ｃに示す。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２ ｇＲＮＡのスペーサー配列は、哺乳類生物での標的配列を対象としている。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、非哺乳類での標的配列を対象としている。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２ ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ヒトの配列である標的配列を対象としている。いくつかの実施形態では、標的配列は、非ヒト霊長類の配列である。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２ ｇＲＮＡのスペーサー配列は、哺乳類生物、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類での標的配列を対象としている。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２ ｇＲＮＡのスペーサー配列は、細菌での標的配列を対象としている。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２ ｇＲＮＡのスペーサー配列は、ウイルスでの標的配列を対象としている。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２ ｇＲＮＡのスペーサー配列は、植物での標的配列を対象としている。
本開示のＣａｓ１２ ｇＲＮＡは、アプタマーを含むように修飾することができる。
ｉｉ．ＰＡＭの特異性
ＴＣＴＮとＴＧＴＮは、それぞれ、Ｃａｓ１２ａ．１とＣａｓ１２ｐの効率的なＰＡＭ配列として同定している。
ＴＣＴＮとＴＧＴＮは、それぞれ、Ｃａｓ１２ａ．１とＣａｓ１２ｐの効率的なＰＡＭ配列として同定している。
ｉｉｉ．ｇＲＮＡアレイ
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２ ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡアレイとして提供することができる。
いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ１２ ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡアレイとして提供することができる。
本開示のそのようなｇＲＮＡアレイは、直列に配列した２つ以上のｇＲＮＡを含み、そして、２つ以上のｇＲＮＡを個々にプロセシングすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、前駆体Ｃａｓ１２ ｇＲＮＡアレイは、２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、２つ、３つ、４つ、または５つ）のｇＲＮＡ（例えば、前駆体分子として直列に配列したもの）を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上のｇＲＮＡが、アレイ（前駆体ｇＲＮＡアレイ）に存在することができる。本開示のＣａｓ１２タンパク質は、前駆体ｇＲＮＡアレイを、個々のｇＲＮＡへと開裂することができる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ ｇＲＮＡアレイは、２つ以上のｇＲＮＡ（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上のｇＲＮＡ）を含む。所与のアレイのｇＲＮＡは、同じ標的ＤＮＡの異なる（すなわち、ハイブリダイズするガイド配列を含むことができる）標的部位を標的にすることができる。いくつかの実施形態では、前駆体ｇＲＮＡアレイの２つ以上のｇＲＮＡは、同じガイド配列を有する。いくつかの実施形態では、前駆体ｇＲＮＡアレイは、同じ標的ＤＮＡ内の異なる標的部位を標的とする２つ以上のｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前駆体ｇＲＮＡアレイは、異なる標的ＤＮＡを標的とする２つ以上のｇＲＮＡを含む。
ＩＩＩ．使用の方法－修飾と治療法
ａ．標的ＤＮＡの修飾
本明細書では、本開示の新規のＣａｓ９及びＣａｓ１２タンパク質の使用を提供する。したがって、本明細書では、標的ＤＮＡを修飾する方法を提供しており、当該方法は、標的ＤＮＡを、本明細書に記載したあらゆるＣａｓ９システムまたはＣａｓ１２システムの１つと接触させることを含む。このような方法は、治療用途で有用である。
ａ．標的ＤＮＡの修飾
本明細書では、本開示の新規のＣａｓ９及びＣａｓ１２タンパク質の使用を提供する。したがって、本明細書では、標的ＤＮＡを修飾する方法を提供しており、当該方法は、標的ＤＮＡを、本明細書に記載したあらゆるＣａｓ９システムまたはＣａｓ１２システムの１つと接触させることを含む。このような方法は、治療用途で有用である。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、染色体の一部である。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで、染色体の一部である。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、細胞にある染色体の一部である。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、染色体外ＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは細胞内にあり、当該細胞を：古細菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核生物単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻類細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞からなる群から選択する。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、寄生虫のＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ウイルスＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、細菌ＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、当該修飾は、標的ＤＮＡに二本鎖切断を導入することを含む。
いくつかの実施形態では、当該接触は、非相同末端結合または相同組換え修復を許容する条件下で起こる。
いくつかの実施形態では、当該方法は、標的ＤＮＡを、ドナーポリヌクレオチドと接触させることを含み、また、当該ドナーポリヌクレオチド、当該ドナーポリヌクレオチドの一部、当該ドナーポリヌクレオチドのコピー、または当該ドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を、標的ＤＮＡに組み込む。
いくつかの実施形態では、当該方法は、細胞を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることを含んでおらず、また、標的ＤＮＡを、当該標的ＤＮＡ内のヌクレオチドを削除するように修飾する。
ｂ．治療用途
本開示は、新規Ｃａｓ９タンパク質、新規Ｃａｓ１２ａタンパク質、及び新規Ｃａｓ１２タンパク質サブタイプ、遺伝子操作したシステム、当該システムの要素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、及び治療法で使用するための当該システムの要素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターまたは送達システムを提供する。当該治療法は、遺伝子またはゲノム編集、または遺伝子治療を含み得る。当該治療方法は、本開示の新規Ｃａｓ９タンパク質及びＣａｓ１２タンパク質の使用及び送達を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書では、標的ＤＮＡを修飾する方法を提供しており、当該方法は、標的ＤＮＡ、当該標的ＤＮＡを含む細胞、または対象を、当該標的ＤＮＡを有する細胞、本明細書に記載したあらゆるＣａｓ９システムまたはＣａｓ１２システムの１つと接触させることを含む。
本開示は、新規Ｃａｓ９タンパク質、新規Ｃａｓ１２ａタンパク質、及び新規Ｃａｓ１２タンパク質サブタイプ、遺伝子操作したシステム、当該システムの要素をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、及び治療法で使用するための当該システムの要素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターまたは送達システムを提供する。当該治療法は、遺伝子またはゲノム編集、または遺伝子治療を含み得る。当該治療方法は、本開示の新規Ｃａｓ９タンパク質及びＣａｓ１２タンパク質の使用及び送達を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書では、標的ＤＮＡを修飾する方法を提供しており、当該方法は、標的ＤＮＡ、当該標的ＤＮＡを含む細胞、または対象を、当該標的ＤＮＡを有する細胞、本明細書に記載したあらゆるＣａｓ９システムまたはＣａｓ１２システムの１つと接触させることを含む。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、染色体の一部である。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで、染色体の一部である。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、細胞にある染色体の一部である。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、染色体外ＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは細胞内にあり、当該細胞を：古細菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核生物単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻類細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞からなる群から選択する。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、細胞の外部にある。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞内にある。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで、細胞内にある。
いくつかの実施形態では、当該修飾は、標的ＤＮＡに二本鎖切断を導入することを含む。
いくつかの実施形態では、当該接触は、非相同末端結合または相同組換え修復を許容する条件下で起こる。
いくつかの実施形態では、当該方法は、標的ＤＮＡを、ドナーポリヌクレオチドと接触させることを含み、また、当該ドナーポリヌクレオチド、当該ドナーポリヌクレオチドの一部、当該ドナーポリヌクレオチドのコピー、または当該ドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を、標的ＤＮＡに組み込む。
いくつかの実施形態では、当該方法は、細胞を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることを含んでおらず、また、標的ＤＮＡを、当該標的ＤＮＡ内のヌクレオチドを削除するように修飾する。
いくつかの実施形態では、治療方法は、関心を寄せた遺伝子の標的配列、及び／または関心を寄せた遺伝子の調節領域を含む標的ＤＮＡの修飾に関係しており、当該方法は、当該標的ＤＮＡ、本開示のＣａｓ９タンパク質と、１つ以上のＣａｓ９タンパク質、及び、本開示のＣａｓ１２タンパク質と、１つ以上のＣａｓ１２ ｇＲＮＡ、本開示のＣａｓ９タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチドと、１つ以上のＣａｓ９ ｇＲＮＡ、または、本開示のＣａｓ１２タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチドと、１つ以上のＣａｓ１２ ｇＲＮＡを含む細胞を送達することを含む。
いくつかの実施形態では、関心を寄せた遺伝子は、真核細胞、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類細胞内にある。
いくつかの実施形態では、関心を寄せた遺伝子は、植物細胞内にある。
いくつかの実施形態では、当該送達は、本開示のＣａｓ９タンパク質（または、そのタンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド）、及び１つ以上のＣａｓ９ ｇＲＮＡを、細胞に送達することを含む。
いくつかの実施形態では、当該送達は、本開示のＣａｓ１２タンパク質（または、そのタンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチド）と、１つ以上のＣａｓ１２ ｇＲＮＡを、細胞に送達することを含む。
いくつかの実施形態では、当該送達は、本開示のＣａｓ９タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチドと、１つ以上のＣａｓ９ ｇＲＮＡを、細胞に送達することを含む。
いくつかの実施形態では、当該送達は、本開示のＣａｓ１２タンパク質をコードする１つ以上のヌクレオチドと、１つ以上のＣａｓ１２ ｇＲＮＡを、細胞に送達することを含む。
細胞に向けたＣａｓ９またはＣａｓ１２成分の送達は、当業者に公知のあらゆる様々な送達方法で達成することができる。例えば、当該成分を、脂質と組み合わせることができるが、これに限定されない。別の例として、当該成分を、粒子と組み合わせる、または粒子、例えば、ナノ粒子に製剤するが、これらに限定されない。
核酸及び／またはタンパク質を宿主細胞に導入する方法は当該技術分野で公知であり、あらゆる簡便な方法を使用して、対象の核酸（例えば、発現構築物／ベクター）を、標的細胞（例えば、原核細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞など）に導入することができる。適切な方法として、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などがある。
ｇＲＮＡは、例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ分子として導入することができる、またはＲＮＡ分子（または、該当する場合には、キメラ／ハイブリッド分子）として直接に提供することができる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質を、当該タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、発現ベクター、ウイルスベクターなど）として提供する。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質をタンパク質として（例えば、関連するｇＲＮＡを持たずに、または関連するｇＲＮＡと共に、すなわち、リボ核タンパク質複合体－ＲＮＰとして）直接に提供する。ｇＲＮＡのように、本開示のＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質は、あらゆる簡便な方法：当業者に公知の方法で、細胞に導入する（細胞が提供を受ける）ことができる。例示として、本開示のＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質は、（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸の有無に関係なく）細胞に直接に注射することができる。別の例として、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質と、ｇＲＮＡとを使用して事前に形成した複合体を、細胞（例えば、真核細胞）に、（例えば、注射、ヌクレオフェクション；例えば、本開示のＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質にコンジュケートした、ｇＲＮＡにコンジュケートした１つ以上の成分にコンジュケートしたタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）；などを介して）導入することができる。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｇＲＮＡ；本開示のＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸；など）、及び／またはポリペプチド（例えば、本開示のＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質）を、粒子内の細胞（例えば、標的宿主細胞）に送達する、または粒子と会合させる。いくつかの実施形態では、当該粒子は、ナノ粒子である。
本開示のＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質（または、当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ）、及び／またはｇＲＮＡ（または、当該ｇＲＮＡをコードする１つ以上の発現ベクターなどの核酸）を、粒子または脂質エンベロープを使用して、同時に送達し得る。
ｉ．関心を寄せた標的細胞
適切な標的細胞（ゲノムＤＮＡなどの標的ＤＮＡを含むことができるもの）として：細菌細胞；古細菌細胞；単一細胞の真核生物の細胞；植物細胞；藻類細胞、例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ、Ｃ． ａｇａｒｄｈなど；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；動物細胞；無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物など）に由来する細胞；昆虫（例えば、蚊；ミツバチ；農業病害虫；など）に由来する細胞；クモ形類動物（例えば、クモ；ダニ；など）に由来する細胞；脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）に由来する細胞；哺乳類（例えば、げっ歯類に由来する細胞；ヒトに由来する細胞；非ヒト哺乳類に由来する細胞）に由来する細胞；げっ歯類（例えば、マウス、ラット）の細胞；ウサギ目の動物（例えば、ウサギ）の細胞；有蹄動物（例えば、ウシ、ウマ、ラクダ、ラマ、ビクナ、ヒツジ、ヤギなど）の細胞；海洋哺乳類（例えば、クジラ）、アザラシ、ゾウアザラシ、イルカ、アシカ；など）の細胞などがあるが、これらに限定されない。
適切な標的細胞（ゲノムＤＮＡなどの標的ＤＮＡを含むことができるもの）として：細菌細胞；古細菌細胞；単一細胞の真核生物の細胞；植物細胞；藻類細胞、例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ、Ｃ． ａｇａｒｄｈなど；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；動物細胞；無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物など）に由来する細胞；昆虫（例えば、蚊；ミツバチ；農業病害虫；など）に由来する細胞；クモ形類動物（例えば、クモ；ダニ；など）に由来する細胞；脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）に由来する細胞；哺乳類（例えば、げっ歯類に由来する細胞；ヒトに由来する細胞；非ヒト哺乳類に由来する細胞）に由来する細胞；げっ歯類（例えば、マウス、ラット）の細胞；ウサギ目の動物（例えば、ウサギ）の細胞；有蹄動物（例えば、ウシ、ウマ、ラクダ、ラマ、ビクナ、ヒツジ、ヤギなど）の細胞；海洋哺乳類（例えば、クジラ）、アザラシ、ゾウアザラシ、イルカ、アシカ；など）の細胞などがあるが、これらに限定されない。
あらゆるタイプの細胞（例えば、幹細胞、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵子腫、精原細胞、など）、成体幹細胞、体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋肉細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞；あらゆる段階の胚、例えば、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞などの段階のゼブラフィッシュ胚のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの胚細胞）に、関心を寄せ得る。
細胞は、細胞株または初代細胞に由来し得る。標的細胞を、単細胞生物とし得る、及び／または培養で増殖し得る。細胞が初代細胞であれば、あらゆる簡便な方法で、個体から回収し得る。例えば、白血球は、アフェレーシス療法、白血球除去療法、密度勾配分離などで簡便に回収し得る、その一方で、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織に由来する細胞は、生検で簡便に回収することができる。
ｇＲＮＡは、標的核酸に対してハイブリダイズする特異性を提供するので、開示した方法における関心を寄せた有糸分裂細胞、及び／または有糸分裂した後の細胞は、あらゆる生物の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単一細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ、Ｃ． ａｇａｒｄｈなど、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物など）の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）の細胞、哺乳類の細胞、げっ歯類の細胞、ヒトの細胞、など）を含み得る。
植物細胞として、単子葉植物の細胞と、双子葉植物の細胞がある。これらの細胞を、根茎の細胞、葉部の細胞、木質部の細胞、師部の細胞、形成層の細胞、頂端分裂組織の細胞、柔組織の細胞、厚角組織の細胞、厚膜組織の細胞などとすることができる。植物細胞として、小麦、トウモロコシ、米、ソルガム、キビ、大豆などの農作物の細胞がある。植物細胞として、農産物用果実及びナッツ植物、例えば、アプリコット、オレンジ、レモン、リンゴ、スモモ、ナシ、アーモンドなどを生産する植物の細胞がある。
細胞（標的細胞）の例として：原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単一細胞真核生物の細胞、原生動物細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果物、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種子、トマト、米、カッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、綿、大麻、タバコ、顕花植物、球果植物、裸子植物、被子植物、シダ、ヒカゲノカズラ、ツノゴケ、ゼニゴケ、コケ類、双子葉植物、単子葉植物など）、藻類細胞（例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ、Ｃ． ａｇａｒｄｈ、など）、海藻（例えば、昆布）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコに由来する細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺皮動物、線形動物など）に由来する細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）に由来する細胞、哺乳類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ）；げっ歯動物（例えば、ラット、マウス）；非ヒト霊長類；ヒト；ネコ科動物（例えば、ネコ）；イヌ科動物（例えば、イヌ）に由来する細胞；など）があるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は、天然生物に由来しない細胞である（例えば、細胞を、合成的に作り出した細胞；別名、人工細胞とすることができる）。
細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞（例えば、確立した培養細胞株）とすることができる。細胞を、エクスビボ細胞（個体に由来する培養細胞）とすることができる。細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞（例えば、個体内での細胞）とすることができる。細胞を、単離した細胞とすることができる。細胞を、生物の体内にある細胞とすることができる。細胞を、生物とすることができる。
適切な細胞として、ヒト胚性幹細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自己移植した拡張心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、成体幹細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、胚性幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種異系細胞、及び出生後幹細胞がある。
いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、及び内皮細胞、または幹細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはマクロファージである。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。幹細胞として、成体幹細胞がある。成体幹細胞は、体性幹細胞とも称する。
成体幹細胞は、分化した組織に存在するが、自己再生の特性と、複数の細胞型、すなわち、通常は、幹細胞が認められる組織において一般的な細胞型を生み出す能力を保持している。体性幹細胞の無数の例は、当業者に公知のものであり、筋幹細胞；造血幹細胞；上皮幹細胞；神経幹細胞；間葉系幹細胞；乳房幹細胞；腸幹細胞；中胚葉幹細胞；内皮幹細胞；嗅覚幹細胞；神経堤幹細胞；などがある。
関心を寄せた幹細胞として、哺乳類の幹細胞がある、また、用語「哺乳類」は、ヒト；非ヒト霊長類；飼育動物及び家畜；イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウサギなどの動物園用動物、実験動物、スポーツ用動物、またはペット動物など、哺乳類に分類されるあらゆる動物のことを指す。いくつかの実施形態では、幹細胞は、ヒトの幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、げっ歯類（例えば、マウス；ラット）の幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、非ヒト霊長類の幹細胞である。
ｉｉ．標的
関心を寄せたあらゆる遺伝子を、修飾のための標的として機能させることができる。
関心を寄せたあらゆる遺伝子を、修飾のための標的として機能させることができる。
特定の実施形態では、標的は、がんに関係する遺伝子である。特定の実施形態では、標的は、免疫疾患、例えば、自己免疫疾患に関係する遺伝子である。特定の実施形態では、標的は、神経変性疾患に関係する遺伝子である。特定の実施形態では、標的は、神経精神疾患に関係する遺伝子である。特定の実施形態では、標的は、筋肉疾患に関係する遺伝子である。特定の実施形態では、標的は、心臓疾患に関係する遺伝子である。特定の実施形態では、標的は、糖尿病に関係する遺伝子である。特定の実施形態では、標的は、腎臓疾患に関係する遺伝子である。
ｉｉｉ．前駆体ｇＲＮＡアレイ
本明細書で提供する治療方法は、前駆体ｇＲＮＡアレイの送達を含むことができる。本開示のＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質は、例えば、前駆体のエンドリボ核酸分解的開裂によって、前駆体ｇＲＮＡを成熟ｇＲＮＡへと開裂することができる。本開示のＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質は、前駆体ｇＲＮＡアレイ（直列に配列した２つ以上のｇＲＮＡを含む）を、２つ以上の個々のｇＲＮＡへと開裂することができる。
本明細書で提供する治療方法は、前駆体ｇＲＮＡアレイの送達を含むことができる。本開示のＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質は、例えば、前駆体のエンドリボ核酸分解的開裂によって、前駆体ｇＲＮＡを成熟ｇＲＮＡへと開裂することができる。本開示のＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質は、前駆体ｇＲＮＡアレイ（直列に配列した２つ以上のｇＲＮＡを含む）を、２つ以上の個々のｇＲＮＡへと開裂することができる。
ＩＶ．使用の方法－検出及び診断用途
標的ＤＮＡでの標的配列を開裂する能力に加えて、本開示のＣａｓ１２タンパク質は、付随能力（トランス開裂活性）、すなわち、標的ＤＮＡを検出して一旦活性化すると、非標的オリゴヌクレオチド（ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）を無差別に開裂する能力も有する。理論またはメカニズムに拘束されるものではないが、一般的に、ｇＲＮＡがハイブリダイズする標的配列を試料が含んでいる（すなわち、当該試料が、標的ＤＮＡを含む）場合には、本開示のＣａｓ１２タンパク質がｇＲＮＡで一旦活性化すると、Ｃａｓ１２は、一本鎖の標準オリゴヌクレオチド（すなわち、非標的一本鎖オリゴヌクレオチド、すなわち、ｇＲＮＡのガイド配列がハイブリダイズしない一本鎖オリゴヌクレオチド）を無差別に開裂するヌクレアーゼになる。したがって、当該標的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）が（例えば、いくつかの実施形態では、閾値を超える量で）試料に存在していると、あらゆる簡便な検出方法（例えば、標識した一本鎖ディテクターＤＮＡ、標識したディテクターＲＮＡ、または標識したディテクターＤＮＡ／ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドを使用するもの）を使用して検出することができる試料を含むオリゴヌクレオチドを開裂（副次的）する。
標的ＤＮＡでの標的配列を開裂する能力に加えて、本開示のＣａｓ１２タンパク質は、付随能力（トランス開裂活性）、すなわち、標的ＤＮＡを検出して一旦活性化すると、非標的オリゴヌクレオチド（ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）を無差別に開裂する能力も有する。理論またはメカニズムに拘束されるものではないが、一般的に、ｇＲＮＡがハイブリダイズする標的配列を試料が含んでいる（すなわち、当該試料が、標的ＤＮＡを含む）場合には、本開示のＣａｓ１２タンパク質がｇＲＮＡで一旦活性化すると、Ｃａｓ１２は、一本鎖の標準オリゴヌクレオチド（すなわち、非標的一本鎖オリゴヌクレオチド、すなわち、ｇＲＮＡのガイド配列がハイブリダイズしない一本鎖オリゴヌクレオチド）を無差別に開裂するヌクレアーゼになる。したがって、当該標的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）が（例えば、いくつかの実施形態では、閾値を超える量で）試料に存在していると、あらゆる簡便な検出方法（例えば、標識した一本鎖ディテクターＤＮＡ、標識したディテクターＲＮＡ、または標識したディテクターＤＮＡ／ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドを使用するもの）を使用して検出することができる試料を含むオリゴヌクレオチドを開裂（副次的）する。
したがって、本明細書では、試料に含まれる標的ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ）を検出する方法及び組成物を提供する。非標的オリゴヌクレオチド（例えば、検出手段として使用するもの）を開裂する方法及び組成物も提供する。
本明細書で使用する「ディテクター」は、一本鎖または二本鎖であり、かつ、ｇＲＮＡのガイド配列（すなわち、非標的のディテクターオリゴヌクレオチド）とハイブリダイズしない、あらゆる性質のオリゴヌクレオチドを含む。例示的なディテクターとして、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓ及びｄｓ領域を含むＲＮＡ、及びＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドを含むｓｓまたはｄｓオリゴヌクレオチドがある（本明細書では、ｓｓ＝一本鎖；及び、ｄｓ＝二本鎖を使用する）が、これらに限定されない。
本開示のＣａｓ１２タンパク質の副次的活性に基づいた検出方法は：
（ａ）試料を：（ｉ）本開示のＣａｓ１２タンパク質；（ｉｉ）Ｃａｓ１２タンパク質に対して結合する領域と、標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列とを含むｇＲＮＡ：及び（ｉｉｉ）ｇＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしないディテクター、を含むｇＲＮＡと接触させる；及び
（ｂ）Ｃａｓ１２タンパク質が当該ディテクターを開裂して生成する検出可能なシグナルを測定する、それにより、標的ＤＮＡを検出する、ことを含むことができる。
（ａ）試料を：（ｉ）本開示のＣａｓ１２タンパク質；（ｉｉ）Ｃａｓ１２タンパク質に対して結合する領域と、標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列とを含むｇＲＮＡ：及び（ｉｉｉ）ｇＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしないディテクター、を含むｇＲＮＡと接触させる；及び
（ｂ）Ｃａｓ１２タンパク質が当該ディテクターを開裂して生成する検出可能なシグナルを測定する、それにより、標的ＤＮＡを検出する、ことを含むことができる。
ｇＲＮＡがハイブリダイズする標的ＤＮＡを試料が含んでいる（すなわち、当該試料が、標的ＤＮＡでの標的配列を含んでいる）場合に発生する活性化、すなわち、対象とするＣａｓ１２タンパク質のｇＲＮＡによる活性化が一旦起こると、当該Ｃａｓ１２は、当該試料に存在するディテクターオリゴヌクレオチド（非標的ｓｓオリゴヌクレオチドを含む）を非特異的に開裂するエンドリボヌクレアーゼとしての機能を活性化することができる。したがって、標的ＤＮＡが当該試料に存在する場合、当該試料においてディテクターオリゴヌクレオチドの開裂を招き、そして、あらゆる簡便な検出方法を使用して（例えば、標識したディテクターオリゴヌクレオチドを使用して）検出することができる。
ディテクターオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、またはｓｓ及びｄｓ領域を含むディテクター）を開裂する方法及び組成物も提供する。そのような方法は、核酸の集団、すなわち、標的ＤＮＡと、複数の非標的ｓｓオリゴヌクレオチドとを含む当該集団を、（ｉ）本開示のＣａｓ１２タンパク質；及び、（ｉｉ）ｇＲＮＡ、すなわち、Ｃａｓ１２エフェクタータンパク質に対して結合する領域と、当該標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列とを含み、また、当該Ｃａｓ１２タンパク質が、非標的ｓｓオリゴヌクレオチドを開裂する当該ｇＲＮＡと接触させる、ことを含むことができる。
したがって、本明細書では、試料における標的ＤＮＡを検出する方法を提供しており、当該方法は：
（ａ）当該試料を：
（ｉ）本開示のＣａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質）；
（ｉｉ）標的ＤＮＡでの標的配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列を含むｇＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）当該ｇＲＮＡのスペーサー配列とハイブリダイズしない標識したディテクターオリゴヌクレオチドと接触させる；及び
（ｂ）標識した当該ディテクターオリゴヌクレオチドをＣａｓ１２タンパク質が開裂して生成する検出可能なシグナルを測定する、それにより、標的オリゴヌクレオチドを検出する、ことを含む。
（ａ）当該試料を：
（ｉ）本開示のＣａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質）；
（ｉｉ）標的ＤＮＡでの標的配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列を含むｇＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）当該ｇＲＮＡのスペーサー配列とハイブリダイズしない標識したディテクターオリゴヌクレオチドと接触させる；及び
（ｂ）標識した当該ディテクターオリゴヌクレオチドをＣａｓ１２タンパク質が開裂して生成する検出可能なシグナルを測定する、それにより、標的オリゴヌクレオチドを検出する、ことを含む。
いくつかの実施形態では、当該方法は、上記したものに加えて、陽性対照試料での陽性対照標的ＤＮＡを検出することをさらに含む、当該検出は：
（ｃ）当該陽性対照試料を：
（ｉ）本開示のＣａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質）；
（ｉｉ）Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質に対して結合する領域と、陽性対照標的ＤＮＡとハイブリダイズする陽性対照スペーサー配列とを含む陽性対照ｇＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）当該陽性対照ｇＲＮＡの陽性対照スペーサー配列とハイブリダイズしない標識したディテクターオリゴヌクレオチドと接触させる；及び
（ｄ）標識した当該ディテクターをＣａｓ１２タンパク質が開裂して生成する検出可能なシグナルを測定する、それにより、陽性対照標的ＤＮＡを検出する、ステップをさらに含む。
（ｃ）当該陽性対照試料を：
（ｉ）本開示のＣａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質）；
（ｉｉ）Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質に対して結合する領域と、陽性対照標的ＤＮＡとハイブリダイズする陽性対照スペーサー配列とを含む陽性対照ｇＲＮＡ；及び
（ｉｉｉ）当該陽性対照ｇＲＮＡの陽性対照スペーサー配列とハイブリダイズしない標識したディテクターオリゴヌクレオチドと接触させる；及び
（ｄ）標識した当該ディテクターをＣａｓ１２タンパク質が開裂して生成する検出可能なシグナルを測定する、それにより、陽性対照標的ＤＮＡを検出する、ステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、当該接触ステップは、無細胞環境、例えば、細胞の外部で実施することができる。その他の実施形態では、当該接触ステップは、細胞内で実施することができる。当該接触ステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞内で実施することができる。当該接触ステップは、ｉｎ ｖｉｖｏで、細胞内で実施することができる。検出方法の当該接触ステップは、二価の金属イオンを含む組成物で実施することができる。
本明細書に記載した通り、ｇＲＮＡは、ＲＮＡとして、または当該ｇＲＮＡをコードする核酸（例えば、組換え発現ベクターなどのＤＮＡ）として提供することができる。
測定ステップの前の接触は、測定ステップの前のあらゆる時間、例えば、５秒～２時間以上続けることができる。いくつかの実施形態では、当該試料を、当該ステップの前に、４５分以内の時間をかけて接触させる。いくつかの実施形態では、当該試料を、当該ステップの前に、３０分以内の時間をかけて接触させる。いくつかの実施形態では、当該試料を、当該ステップの前に、１０分以内の時間をかけて接触させる。いくつかの実施形態では、当該試料を、当該ステップの前に、５分以内の時間をかけて接触させる。いくつかの実施形態では、当該試料を、当該ステップの前に、１分以内の時間をかけて接触させる。いくつかの実施形態では、当該試料を、当該ステップの前に、５０秒～６０秒の時間をかけて接触させる。いくつかの実施形態では、当該試料を、当該ステップの前に、４０秒～５０秒の時間をかけて接触させる。いくつかの実施形態では、当該試料を、当該ステップの前に、３０秒～４０秒の時間をかけて接触させる。いくつかの実施形態では、当該試料を、当該ステップの前に、２０秒～３０秒の時間をかけて接触させる。いくつかの実施形態では、当該試料を、当該ステップの前に、１０秒～２０秒の時間をかけて接触させる。
本明細書で提供する検出方法は、高感度で標的ＤＮＡを検出することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の検出方法を使用して、複数のＤＮＡ（当該標的ＤＮＡ、及び複数の非標的ＤＮＡなど）を含む試料に存在する標的ＤＮＡを検出することができる、また、当該標的ＤＮＡは、５～１０∧９コピーの非標的ＤＮＡあたり１つ以上のコピーで存在する。
いくつかの実施形態では、試料に含まれる標的ＤＮＡを検出する検出方法に関して、検出の閾値は、１０ｎＭ以下である。用語「検出の閾値」は、本明細書では、検出を行うにあたって試料に存在していなくてはならない最小量の標的ＤＮＡを説明するために使用している。したがって、例示として、検出の閾値が１０ｎＭであり、そして、標的ＤＮＡが１０ｎＭ以上の濃度で試料に存在していると、シグナルを検出することができる。いくつかの実施形態では、対象とする組成物または方法は、検出のアトモル（ａＭ）感度を示す。いくつかの実施形態では、対象とする組成物または方法は、検出のフェムトモル（ｆＭ）感度を示す。いくつかの実施形態では、対象とする組成物または方法は、ピコモル（ｐＭ）の検出感度を示す。いくつかの実施形態では、対象とする組成物または方法は、ナノモル（ｎＭ）の検出感度を示す。
ａ．標的ＤＮＡ
標的ＤＮＡは、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖（ｄｓＤＮＡ）とすることができる。一本鎖標的ＤＮＡのＰＡＭ配列については、選択の優先順位や要件などはない。
標的ＤＮＡは、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖（ｄｓＤＮＡ）とすることができる。一本鎖標的ＤＮＡのＰＡＭ配列については、選択の優先順位や要件などはない。
標的ＤＮＡの供給源は、あらゆる供給源とし得る。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、ウイルスまたは細菌のＤＮＡ（例えば、ＤＮＡウイルスまたは細菌のゲノムＤＮＡ）である。したがって、検出方法を、（例えば、試料に含まれる）核酸の集団でのウイルスまたは細菌のＤＮＡの存在の検出用とすることができる。ＲＮＡを運搬する生物の事例では、例えば、ＲＮＡウイルス（例えば、コロナウイルス）の場合、本開示の目的のために、逆転写などのステップを、ＲＮＡを運搬する生物を含む試料に対して行ってｃＤＮＡを生成する、そして、当該ｃＤＮＡが標的ＤＮＡである、ことを理解されたい。
標的ＤＮＡの例示的な供給源を、表６ａ～６ｆに提供するが、これらに限定されない。
呼吸器標的
呼吸器感染症に関連するウイルス及び細菌から得たＤＮＡも標的になり得る。関心を寄せた標的のリストは、表６ｃに示す例を含み得る。
呼吸器感染症に関連するウイルス及び細菌から得たＤＮＡも標的になり得る。関心を寄せた標的のリストは、表６ｃに示す例を含み得る。
性感染症標的
性感染症に関連するウイルス及び細菌から得たＤＮＡも標的になり得る。関心を寄せた標的のリストは、表６ｄに示す例を含み得る。
性感染症に関連するウイルス及び細菌から得たＤＮＡも標的になり得る。関心を寄せた標的のリストは、表６ｄに示す例を含み得る。
その他の標的
その他のＤＮＡも標的にし得る。別の例として、妊婦／動物の胚の性別を決定するための雄性遺伝子、及び植物及び種子の性別を決定するための雄性遺伝子も標的にし得る。関心を寄せたさらなる標的の例は、以下の表６ｅに示すものを含み得る。
その他のＤＮＡも標的にし得る。別の例として、妊婦／動物の胚の性別を決定するための雄性遺伝子、及び植物及び種子の性別を決定するための雄性遺伝子も標的にし得る。関心を寄せたさらなる標的の例は、以下の表６ｅに示すものを含み得る。
ＤＮＡ標的の供給源を提供するその他の関心を寄せた標的を、表６ｆに示す。
例示標的配列のリストを、表６ｇに示すが、これらに限定されない。
ｂ．試料
本明細書で使用する用語「試料」は、（例えば、標的ＤＮＡが、ＤＮＡの集団内に存在するか否かを決定するための）ＤＮＡを含むあらゆる試料を意味するために使用する。上記したように、当該ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、相補的ＤＮＡなどとし得る。
本明細書で使用する用語「試料」は、（例えば、標的ＤＮＡが、ＤＮＡの集団内に存在するか否かを決定するための）ＤＮＡを含むあらゆる試料を意味するために使用する。上記したように、当該ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、相補的ＤＮＡなどとし得る。
検出を目的とした試料は、複数の核酸を含む。したがって、いくつかの実施形態では、試料は、２つ以上（例えば、３つ以上、５つ以上、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または５，０００個以上）の核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む。検出方法は、試料（例えば、ＤＮＡなどの核酸の複合混合物）に存在する標的ＤＮＡを検出するための非常に感度の高い方法として使用することができる。
いくつかの実施形態では、試料は、配列が互いに相違する５つ以上のＤＮＡ（例えば、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または５，０００個以上のＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、試料は、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１０∧３個以上、５×１０∧３個以上、１０∧４個以上、５×１０∧４個以上、１０∧５個以上、５×１０∧５個以上、１０∧６個以上、５×１０∧６個以上、または１０∧７個以上のＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、試料は、１０～２０個、２０～５０個、５０～１００個、１００～５００個、５００～１０∧３個、１０∧３～５×１０∧３個、５×１０∧３～１０∧４個、１０∧４～５×１０∧４個、５×１０∧４～１０∧５個、１０∧５～５×１０∧５個、５×１０∧５～１０∧６個、１０∧６～５×１０∧６個、または５×１０∧６～１０∧７個、または１０∧７個を超える数のＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、試料は、５～１０∧７個のＤＮＡ（例えば、配列が互いに相違するもの）（例えば、５～１０∧６個、５～１０∧５個、５～５０，０００個、５～３０，０００個、１０～１０∧６個、１０～１０∧５個、１０～５０，０００個、１０～３０，０００個、２０～１０∧６個、２０～１０∧５個、２０～５０，０００個、または２０～３０，０００個のＤＮＡ）を含む。
いくつかの実施形態では、試料は、配列が互いに相違する２０個以上のＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、試料は、細胞溶解物（例えば、真核細胞溶解物、哺乳類細胞溶解物、ヒト細胞溶解物、原核細胞溶解物、植物細胞溶解物など）に由来するＤＮＡを含む。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、真核細胞などの細胞、例えば、ヒト細胞などの哺乳類細胞に由来するＤＮＡを含む。
試料は、あらゆる供給源から得ることができる、例えば、精製したＤＮＡの合成結合物を試料にすることができる；細胞溶解物、ＤＮＡ濃縮細胞溶解物、または細胞溶解物から単離及び／または精製したＤＮＡを、試料にすることができる。患者から（例えば、診断目的で）得たものを、試料にすることができる。透過処理した細胞を、試料にすることができる。架橋細胞を、試料にすることができる。組織切片に入れたものを、試料にすることができる。
試料は、標的ＤＮＡと複数の非標的ＤＮＡとを含むことができる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡは、非標的ＤＮＡの５～１０∧９個のコピーあたり１つ以上のコピーで試料に存在する。
適切な試料として、尿、血液、血清、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、鼻咽頭、中咽頭、鼻咽頭／中咽頭、吸引物、または生検試料があるが、これらに限定されない。したがって、患者に関する用語「試料」は、血液及び生物学的起源のその他の液体試料、生検標本などの固体組織試料、または、組織培養物、またはそれに由来する細胞、及びその子孫を含む。調達をした試料を、試薬を用いた処理；洗浄；または、がん細胞などの特定の細胞集団の濃縮など、あらゆる方法で取扱いをしたものを試料とすることもできる。試料は、スワブ、例えば、鼻咽頭用スワブ、中咽頭用スワブ、または鼻咽頭／中咽頭用スワブを使用して得ることができる。試料を、ＤＮＡなどの特定のタイプの分子を濃縮したものとすることができる。試料として、血液、血漿、血清、吸引物、脳脊髄液（ＣＳＦ）などの臨床試料、そして、外科的切除で得た組織、生検で得た組織、培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織試料、臓器、骨髄などの生物学的試料がある。「生物学的試料」は、それら（例えば、がん性細胞、感染細胞など）に由来する液体、例えば、そのような細胞（例えば、細胞溶解物、またはＤＮＡを含むその他の細胞抽出物）から得られるＤＮＡを含む試料を含む。
試料は、様々な細胞、組織、臓器、または無細胞液のいずれかを含む、またはそれらから得ることができる。適切な試料の供給源として、真核細胞、細菌細胞、及び古細菌細胞がある。適切な試料の供給源として、単細胞生物、及び多細胞生物がある。適切な試料の供給源として、真核生物の単一細胞；植物または植物細胞；藻類細胞；真菌細胞；動物細胞、組織、または臓器；無脊椎動物の細胞、組織、または臓器；脊椎動物の細胞、組織、体液、または臓器；哺乳類（例えば、ヒト；非ヒト霊長類；有蹄動物；ネコ；ウシ；ヒツジ；ヤギなど）に由来する細胞、組織、体液、または臓器がある。適切な試料供給源として、線虫、原生動物などがある。適切な試料供給源として、寄生蠕虫、マラリア原虫などの寄生虫がある。
適切な試料供給源として、６つの界のいずれかに属する細胞、組織、または生物がある。
適切な試料供給源として、生物から得た細胞、体液、組織、または臓器；生物から単離した特定の細胞または細胞の集団；などがある。例えば、生物が植物である場合の適切な供給源として、木質部、師部、形成層、葉部、根茎などがある。生物が動物である場合、適切な供給源として、特定の組織（例えば、肺、肝臓、心臓、腎臓、脳、脾臓、皮膚、胎児組織など）、または特定の細胞型（例えば、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、星状膠細胞、マクロファージ、グリア細胞、膵島細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球など）がある。
いくつかの実施形態では、試料の供給源は、（または、罹患したことが疑われている細胞、体液、組織、または臓器である。
いくつかの実施形態では、試料の供給源は、正常な（罹患していない）細胞、体液、組織、または臓器である。
いくつかの実施形態では、試料供給源は、（または、病原体に感染したことが疑われている細胞、組織、または臓器である。例えば、試料供給源は、感染し得る、または、感染し得ない個体とすることができる－そして、当該試料は、個体から回収したあらゆる生物学的試料（例えば、血液、唾液、生検、血漿、血清、気管支肺胞洗浄液、喀痰、糞便試料、脳脊髄液、細針吸引液、スワブ試料（例えば、頬スワブ、頸部スワブ、鼻スワブ）、間質液、滑液、鼻汁、涙液、バフィーコート、粘膜試料、上皮細胞試料（例えば、上皮細胞擦過物）など）とすることができる。いくつかの実施形態では、当該試料は、無細胞液体試料である。
いくつかの実施形態では、当該試料は、細胞（尿、血液、血清、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、鼻咽頭、中咽頭、鼻咽頭／中咽頭、吸引物、及び生検）を含むことができる液体試料である。病原体として、ウイルス、真菌、寄生蠕虫、原虫、マラリア寄生虫、マラリア原虫寄生虫、トキソプラズマ寄生虫、住血吸虫寄生虫などがある。「寄生蠕虫」として、回虫、犬糸状虫、及び、植食性線虫（線形動物門）、吸虫（吸虫綱）、鉤頭虫門、及び条虫（条虫綱）がある。原虫感染症として、Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．に起因する感染症、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ性赤痢、バベシア症、バランチジウム症、チャガ病、コクシジウム症、マラリア、及び、トキソプラズマ症がある。寄生虫／原虫病原体などの病原体の例として：Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉがあるが、これらに限定されない。真菌病原体として、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、及びＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓがあるが、これらに限定されない。病原性ウイルスとして、ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス、例えば、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）；免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）；インフルエンザウイルス；デング；ウエストナイルウイルス；ヘルペスウイルス；黄熱病ウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；パピローマウイルス；などがある。病原性ウイルスでは：パピローマウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）；ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））；ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスリンパ球向性ウイルス、バラ色粃糠疹、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）；アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マスタデノウイルス、シアデノウイルス）；ポックスウイルス（天然痘、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス；タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス；伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））；パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４ Ｇ１）；ジェミニウイルス科；ナノウイルス科；フィコドナウイルス科；などのＤＮＡウイルスを含めることができる。病原体として、例えば、ＤＮＡウイルス［例えば：パポバビム（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオマビム）；ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））；ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスリンパ球向性ウイルス、バラ色粃糠疹、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）；アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マスタデノウイルス、シアデノウイルス）；ポックスウイルス（例えば、天然痘、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、牛丘疹性口内炎ウイルス、タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））；パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカビム、ブファビム、ヒトｐａｒｖ４Ｇ１）；ジェミニウイルス科；ナノウイルス科；フィコドナウイルス科；など］、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、ライム病スピロヘータ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、単純ヘルペスウイルスＩＩ、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン－バーウイルス、ネズミ白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イボウイルス、ブルータングウイルス、猫白血病、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス４０、マウス乳腺腫瘍ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、ウエストナイルウイルス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒａｎｇｅｌｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ ｂｏｖｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｔｒｏｐｉｃａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｐａｒｖａ、Ｔａｅｎｉａ ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ、Ｔａｅｎｉａ ｏｖｉｓ、Ｔａｅｎｉａ ｓａｇｉｎａｔａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ ｃｏｒｔｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ． ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ． ｏｒａｌｅ、Ｍ． ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ｍ． ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ、及びＭ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含めることができる。
ｃ．検出可能なシグナルの測定
一般的に、検出方法は、本開示のＣａｓ１２が生成する検出可能なシグナルを測定するステップを含む。検出可能なシグナルは、ｓｓオリゴヌクレオチドが開裂した際に生成するあらゆるシグナルとすることができる。検出のステップは、蛍光をベースとした検出と関連付けることができる。そのような検出方法の読み出しは、あらゆる簡便な読み出しとすることができる。実施可能な読み出しの例として：ゲルでのバンド（例えば、開裂した産物と、開裂していない基質を示すバンド）の視覚的分析、視覚またはセンサーをベースとした色の有無の検出（すなわち、色検出法）、磁気シグナルの有無（または、特定量の磁気シグナルの有無）、及び電気シグナルの有無（または、特定量の電気シグナルの有無）があるが、これらに限定されない。
一般的に、検出方法は、本開示のＣａｓ１２が生成する検出可能なシグナルを測定するステップを含む。検出可能なシグナルは、ｓｓオリゴヌクレオチドが開裂した際に生成するあらゆるシグナルとすることができる。検出のステップは、蛍光をベースとした検出と関連付けることができる。そのような検出方法の読み出しは、あらゆる簡便な読み出しとすることができる。実施可能な読み出しの例として：ゲルでのバンド（例えば、開裂した産物と、開裂していない基質を示すバンド）の視覚的分析、視覚またはセンサーをベースとした色の有無の検出（すなわち、色検出法）、磁気シグナルの有無（または、特定量の磁気シグナルの有無）、及び電気シグナルの有無（または、特定量の電気シグナルの有無）があるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、測定は、例えば、検出したシグナルの量を使用して、試料に存在する標的ＤＮＡの量を決定することができるという意味で、定量的である。いくつかの実施形態では、測定は、例えば、検出可能なシグナルの有無が、標的ＤＮＡ（例えば、ウイルス、ＳＮＰなど）の有無を示すことができるという意味で、定性的である。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ（複数可）（例えば、ウイルス、ＳＮＰなど）が、特定の閾値濃度を超えて存在しない限り、検出可能なシグナルは（例えば、所与の閾値レベルを超えて）存在しない。いくつかの実施形態では、検出の閾値を、提供するＣａｓ１２タンパク質の量を変更して滴定することができる。
本開示の組成物及び方法は、あらゆるＤＮＡ標的を検出するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の検出方法を使用して、試料（例えば、標的ＤＮＡと、複数の非標的ＤＮＡとを含む試料）に含まれる標的ＤＮＡの量を決定することができる。試料に含まれる標的ＤＮＡの量の決定は、試験試料から生成した検出可能なシグナルの量を、リファレンス試料から生成した検出可能なシグナルの量と比較する、ことを含むことができる。試料に含まれる標的ＤＮＡの量の決定は：試験測定値を生成する検出可能なシグナルを測定する；リファレンス試料が生成した検出可能なシグナルを測定して、リファレンス測定値を得る；及び、試験測定値をリファレンス測定値と比較して、試料に存在する標的ＤＮＡの量を決定する、ことを含むことができる。
いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、または２４０分未満で検出することができる。
いくつかの実施形態では、（例えば、細胞ゲノムＤＮＡでのウイルスＤＮＡまたはＳＮＰなどの標的ＤＮＡの存在を検出するための）対象とする組成物及び／または方法の感度は、検出を核酸増幅と組み合わせることで、高めることができる。
いくつかの実施形態では、試料に含まれる核酸は、Ｃａｓ１２と接触させる前に増幅する；特定の実施形態では、Ｃａｓ１２は、増幅が終了するまで不活性状態のままとする。いくつかの実施形態では、試料に含まれる核酸は、Ｃａｓ１２との接触と同時に増幅する。増幅は、プライマーを使用して行うことができる。検出方法の全処理時間に関係するので、増幅は、５秒以上、最長で２４０分以上かけて行うことができる。
様々な増幅方法及び構成要素は、当業者に公知のものであり、また、あらゆる簡便な方法を使用することができる。
核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ｑＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、等温ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ランダムプライマーＰＣＲ、ヘミネステッドＰＣＲ、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）、コロニーＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、デジタルＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、低変性温度－ＰＣＲでの共増幅（ＣＯＬＤ－ＰＣＲ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、配列間特異的ＰＣＲ（ＩＳＳ－ＰＣＲ）、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、逆ＰＣＲ、及び熱非対称インターレースＰＣＲ（ＴＡＩＬ－ＰＣＲ）を含むことができる。
いくつかの実施形態では、増幅は、等温増幅である。したがって、等温核酸増幅法は、実験室環境の内外で実施することができる。等温増幅法の例として：ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、分岐（ＲＡＭ）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）、シングルプライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅（ＳＭＡＲＴ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、ゲノム指数関数的増幅反応（ＧＥＡＲ）、及び等温多重置換増幅（ＩＭＤＡ）があるが、これらに限定されない。
ｄ．ディテクターオリゴヌクレオチド
本開示の新規なＣａｓ１２タンパク質は、コラテラル切断（トランス切断）活性を有する。Ｃａｓ１２ａ．１の場合、このタンパク質は、ガイドが標的とするＤＮＡの結合時、ｓｓＤＮＡを付随的に切断する能力を有する。Ｃａｓ１２ｐの場合、このタンパク質は、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、キメラｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ、及び他のＲＮＡを含めたオリゴヌクレオチドを含むすべてのタイプのオリゴヌクレオチドを付随的に切断する二重の能力を有する。これらの特性は、このアッセイを使用する場合のディテクターオリゴヌクレオチドを設計する際に考慮される。
本開示の新規なＣａｓ１２タンパク質は、コラテラル切断（トランス切断）活性を有する。Ｃａｓ１２ａ．１の場合、このタンパク質は、ガイドが標的とするＤＮＡの結合時、ｓｓＤＮＡを付随的に切断する能力を有する。Ｃａｓ１２ｐの場合、このタンパク質は、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、キメラｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ、及び他のＲＮＡを含めたオリゴヌクレオチドを含むすべてのタイプのオリゴヌクレオチドを付随的に切断する二重の能力を有する。これらの特性は、このアッセイを使用する場合のディテクターオリゴヌクレオチドを設計する際に考慮される。
いくつかの実施形態では、検出方法は、試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む試料）を、ｉ）本開示のＣａｓ１２タンパク質、ｉｉ）ｇＲＮＡ（または前駆体ｇＲＮＡアレイ）、及びｉｉｉ）該ｇＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしないディテクターと接触させることを含む。例えば、いくつかの実施形態では、検出方法は、試料を、蛍光発光色素ペアを含む標識ディテクター（Ｃａｓ１２ａ．１の場合はディテクターｓｓＤＮＡ、Ｃａｓ１２ｐの場合は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びそれらの組み合わせを含むディテクター）と接触させることを含む。本開示のＣａｓ１２タンパク質は、活性化（標的ＤＮＡにハイブリダイズするｇＲＮＡによって）された後、この標識ディテクターを切断する能力を有し、測定される検出可能なシグナルは、蛍光発光色素ペアによって生じる。例えば、いくつかの実施形態では、検出方法は、試料を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペアもしくはクエンチャー／フルオロペア、またはその両方を含む標識ディテクターと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、検出方法は、試料を、ＦＲＥＴペアを含む標識ディテクターと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、検出方法は、試料を、フルオロ／クエンチャーペアを含む標識ディテクターと接触させることを含む。
蛍光発光色素ペアは、ＦＲＥＴペアまたはクエンチャー／フルオロペアを含む。ＦＲＥＴペア及びクエンチャー／フルオロペアの両実施形態では、これら色素の一方の発光スペクトルは、当該ペアの他方の色素の吸収スペクトルの領域と重なる。本明細書で使用される場合、「蛍光発光色素ペア」という用語は、「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペア」及び「クエンチャー／フルオロペア」の両方を包含するように使用される総称である。「蛍光発光色素ペア」という用語は、「ＦＲＥＴペア及び／またはクエンチャー／フルオロペア」という句と同義で使用される。
いくつかの実施形態（例えば、ディテクターがＦＲＥＴペアを含む場合）では、標識ディテクターは、切断される前に、ある量の検出可能なシグナルを生じる。測定される検出可能なシグナルの量は、標識ディテクターが切断されると減少する。いくつかの実施形態では、標識ディテクターは、切断される前に第一の検出可能なシグナルを（例えば、ＦＲＥＴペアから）生じ、該標識ディテクターが切断されると第二の検出可能なシグナルを（例えば、クエンチャー／フルオロペアから）生じる。従って、いくつかの実施形態では、標識ディテクターは、ＦＲＥＴペア及びクエンチャー／フルオロペアを含む。
いくつかの実施形態では、標識ディテクターは、ＦＲＥＴペアを含む。
ＦＲＥＴのドナー及びアクセプター部分（ＦＲＥＴペア）は、当業者には既知であり、任意の便宜的なＦＲＥＴペア（例えば、任意の便宜的なドナー及びアクセプター部分のペア）を使用することができる。適切なＦＲＥＴペアの例としては、表７に記載のものが挙げられるがこれらに限定されない。ＵＳ１０，２５３，３６５に示されるＦＲＥＴペアは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、該ＦＲＥＴペアは、５’６－ＦＡＭ及び３ＩＡＢｋＦＱ（Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）－ＦＱ）である。
いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、標識ディテクターが切断される際に生じる（例えば、いくつかの実施形態では、標識ディテクターは、クエンチャー／フルオロペアを含む）。
任意の蛍光標識が使用され得る。蛍光標識の例としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、ＡＴＴＯ色素（例えば、ＡＴＴＯ ３９０、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ色素、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ色素、Ｓｅｔａ色素、ＩＲＩＳ色素、ＳｅＴａｕ色素、ＳＲｆｌｕｏｒ色素、Ｓｑｕａｒｅ色素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド、オレゴングリーン、パシフィックブルー、パシフィックグリーン、パシフィックオレンジ、量子ドット、及びテザー蛍光タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。
クエンチャー部分の例としては、ダーククエンチャー、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））（例えば、ＢＨＱ－０、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、ＢＨＱ－３）、Ｑｘｌクエンチャー、ＡＴＴＯクエンチャー（例えば、ＡＴＴＯ ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（Ｄａｂｓｙｌ）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ色素（例えば、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、ＱＳＹ ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ならびに金属クラスター、例えば、金ナノ粒子等が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、クエンチャー部分は、ダーククエンチャー、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））（例えば、ＢＨＱ－０、ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２、ＢＨＱ－３）、Ｑｘｌクエンチャー、ＡＴＴＯクエンチャー（例えば、ＡＴＴＯ ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（Ｄａｂｓｙｌ）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ色素（例えば、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、ＱＳＹ ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ならびに金属クラスターから選択される。
いくつかの実施形態では、標識ディテクターの切断は、比色分析の読み出し値を測定することによって検出され得る。例えば、フルオロフォアの放出（例えば、ＦＲＥＴペアからの放出、クエンチャー／フルオロペアからの放出等）は、検出可能なシグナルの波長シフト（ひいては色シフト）を生じ得る。従って、いくつかの実施形態では、対象標識ディテクターの切断は、色シフトによって検出され得る。かかるシフトは、１つの色（波長）のシグナルの量の減少、別の色の量の増加、１つの色と別の色の比の変化等によって表され得る。
本明細書に提供するように、標識ディテクターは、核酸模倣物であり得る。ポリヌクレオチド模倣物としては、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＣｅＮＡ、及びモルホリノ核酸が挙げられる。
標識ディテクターはまた、１つ以上の置換糖部分を含むこともできる。
標識ディテクターはまた、修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
ｅ．陽性対照
本明細書に提供する検出方法はまた、陽性対照標的ＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、該方法は、対照標的ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む陽性対照ｇＲＮＡを使用することを含む。いくつかの実施形態では、該陽性対照標的ＤＮＡは、様々な量で提供される。いくつかの実施形態では、該陽性対照標的ＤＮＡは、様々な既知濃度で、対照非標的ＤＮＡとともに提供される。
本明細書に提供する検出方法はまた、陽性対照標的ＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、該方法は、対照標的ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む陽性対照ｇＲＮＡを使用することを含む。いくつかの実施形態では、該陽性対照標的ＤＮＡは、様々な量で提供される。いくつかの実施形態では、該陽性対照標的ＤＮＡは、様々な既知濃度で、対照非標的ＤＮＡとともに提供される。
ｆ．ｇＲＮＡアレイ
いくつかの実施形態では、該方法は、試料を、前駆体ｇＲＮＡアレイに接触させることを含み、本開示の新規なＣａｓ１２タンパク質が、該前駆体ｇＲＮＡアレイを切断し、当該ｇＲＮＡを生じる。
いくつかの実施形態では、該方法は、試料を、前駆体ｇＲＮＡアレイに接触させることを含み、本開示の新規なＣａｓ１２タンパク質が、該前駆体ｇＲＮＡアレイを切断し、当該ｇＲＮＡを生じる。
いくつかの実施形態では、かかるｇＲＮＡアレイは、２つ以上のｇＲＮＡ（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上のｇＲＮＡ）を含む。所与のアレイのｇＲＮＡは、同じ標的ＤＮＡの異なる標的部位を標的とすることができ（すなわち、それにハイブリダイズするガイド配列を含むことができ）（例えば、それにより検出の感度を上げることができる）、及び／または異なる標的ＤＮＡ（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、特定のウイルスの異なる株等）を標的とすることができ、例えば、ウイルスの複数の株を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、前駆体ｇＲＮＡアレイの各ｇＲＮＡは、異なるガイド配列を有する。
いくつかの実施形態では、該前駆体ｇＲＮＡアレイは、同じ標的ＤＮＡ内の異なる標的部位を標的とする２つ以上のｇＲＮＡを含む。例えば、かかる状況は、いくつかの実施形態では、いずれかが標的ＤＮＡにハイブリダイズした際に、本開示のＣａｓ９またはＣａｓ１２タンパク質を活性化することによって検出の感度を上げることができる。従って、いくつかの実施形態では、対象組成物（例えば、キット）または方法は、２つ以上のｇＲＮＡを含む（前駆体ｇＲＮＡアレイという状況で、または前駆体ｇＲＮＡアレイという状況ではなく、例えば、該ｇＲＮＡは、成熟ｇＲＮＡであり得る）。
いくつかの実施形態では、該前駆体ｇＲＮＡアレイは、異なる標的ＤＮＡを標的とする２つ以上のｇＲＮＡを含む。例えば、かかる状況は、潜在的な標的ＤＮＡのファミリーのいずれか１つが存在する場合に陽性シグナルを生じ得る。かかるアレイは、転写物のファミリーを、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）等の変化に基づいて、標的化するために使用することができる（例えば、診断目的のため）。これは、複数の異なるウイルス株のいずれか１つが存在するかどうかを検出するためにも役立つ可能性がある。これはまた、細菌またはウイルスの複数の異なる種、株、分離株、またはバリアントのいずれか１つが存在するかどうかを検出するためにも役立つ可能性がある。従って、いくつかの実施形態では、対象組成物（例えば、キット）または方法は、２つ以上のｇＲＮＡを含む（前駆体ｇＲＮＡアレイという状況で、または前駆体ｇＲＮＡアレイという状況ではなく、例えば、該ｇＲＮＡは、成熟ｇＲＮＡであり得る）。
Ｖ．組成物
本明細書に提供するのは、本開示のＣａｓ９タンパク質及び／またはＣａｓ９ｇＲＮＡを含む組成物及び医薬組成物であり、これらは、任意に、医薬的に許容される担体及び／またはタンパク質安定化緩衝液、及び／または核酸安定化緩衝液を含み得る。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ９タンパク質及び／またはＣａｓ９ｇＲＮＡは、凍結乾燥形態で提供される。
本明細書に提供するのは、本開示のＣａｓ９タンパク質及び／またはＣａｓ９ｇＲＮＡを含む組成物及び医薬組成物であり、これらは、任意に、医薬的に許容される担体及び／またはタンパク質安定化緩衝液、及び／または核酸安定化緩衝液を含み得る。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ９タンパク質及び／またはＣａｓ９ｇＲＮＡは、凍結乾燥形態で提供される。
本明細書に提供するのは、本開示のＣａｓ１２タンパク質及び／またはＣａｓ１２ｇＲＮＡを含む組成物及び医薬組成物であり、これらは、任意に、医薬的に許容される担体及び／またはタンパク質安定化緩衝液、及び／または核酸安定化緩衝液を含み得る。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ１２タンパク質及び／またはＣａｓ１２ｇＲＮＡは、凍結乾燥形態で提供される。
本明細書に提供するのは、本開示のｇＲＮＡ及び／またはｇＲＮＡアレイ（本開示のＣａｓ９タンパク質、及び／または本開示のＣａｓ１２タンパク質との使用に適合するもの）、ならびに任意にタンパク質安定化緩衝液を含む組成物である。
本明細書に提供するのは、配列番号１、２、３、４、２２２、５、１０、１１、または１２に対して７０％～９９．５％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。本明細書に提供するのは、これらのタンパク質、及び任意に医薬的に許容される担体を含む組成物である。本明細書に提供するのは、これらのタンパク質及び任意にタンパク質安定化緩衝液である。
本明細書に提供するのは、本開示のＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ１２タンパク質のいずれかをコードする配列をコードするＤＮＡポリヌクレオチドである。同様に提供するのは、かかるＤＮＡポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターである。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓ９またはＣａｓ１２をコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ９またはＣａｓ１２をコードする核酸はさらに、真核細胞系での発現に有用な核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む。
本明細書に提供するのは、本開示のｇＲＮＡのいずれかをコードする配列を含むＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡである。同様に提供するのは、かかるＤＮＡポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターである。いくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。
同様に本明細書に提供するのは、本明細書に提供する組み換えベクターのいずれかを含む宿主細胞である。
ＶＩ．キット
本明細書に提供するのは、治療用途及び診断用途が挙げられるがこれらに限定されない様々な用途に有用な、本明細書に記載の操作されたＣａｓ９及びＣａｓ１２システムの１つ以上の成分を含むキットである。
本明細書に提供するのは、治療用途及び診断用途が挙げられるがこれらに限定されない様々な用途に有用な、本明細書に記載の操作されたＣａｓ９及びＣａｓ１２システムの１つ以上の成分を含むキットである。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、（ａ）Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３もしくはＣａｓ９．４タンパク質、またはＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３もしくはＣａｓ９．４タンパク質をコードする核酸、及び（ｂ）Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３もしくはＣａｓ９．４のｇＲＮＡ、またはＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３もしくはＣａｓ９．４のｇＲＮＡをコードする核酸を含むキットであり、該ｇＲＮＡ及び該Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３またはＣａｓ９．４タンパク質は、天然では同時に生じることはなく、該ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズすることが可能であり、該ｇＲＮＡは、該Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３またはＣａｓ９．４タンパク質と複合体を形成することが可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供するのは、（ａ）Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑタンパク質、またはＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑタンパク質をコードする核酸、及び（ｂ）Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑのｇＲＮＡ、またはＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑのｇＲＮＡをコードする核酸を含むキットであり、該ｇＲＮＡ及び該Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質は、天然では同時に生じることはなく、該ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズすることが可能であり、該ｇＲＮＡは、該Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質と複合体を形成することが可能である。
例示的な実施形態では、本明細書に提供するのは、診断キットである。例示的な実施形態では、該試薬成分は、凍結乾燥形態で提供される。いくつかの実施形態では、該試薬成分は、個々に（凍結乾燥または非凍結乾燥のいずれかで）提供され、他の実施形態では、該試薬成分は、予備混合された形で（凍結乾燥または非凍結乾燥のいずれかで）提供される。
以下は、実施例１０に例示される、本開示の新規なＣａｓ１２タンパク質（Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、及びＣａｓ１２ｑ）の１つを使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、すなわち、ＲＮＡウイルスの検出に有用な例示的なキットの試薬成分である。
（１）疾患ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム遺伝子の逆転写及びループ媒介等温増幅（ＲＴ－ＬＡＭＰ）用の試薬、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーセット及び酵素を含む凍結乾燥反応ミックス。
（２）ヒトハウスキーピング遺伝子ＲＮＡｓｅ Ｐの逆転写及びＲＴ－ＬＡＭＰ増幅用の試薬、対照ＲＮＡｓｅ Ｐプライマーセット及び酵素を含む凍結乾燥反応ミックス。
（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２増幅産物の検出用の試薬及びＣａｓ１２ｐ－ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体を含む凍結乾燥反応ミックス。かかるミックスはまた、標識レポーター、例えば、５’ＦＡＭ－３’クエンチャーｓｓＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドレポーター、または５’ＦＡＭ－３’クエンチャー一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡキメラベースのオリゴヌクレオチドレポーターを含み得る。
（４）ＲＮＡｓｅ Ｐ増幅産物の検出用の試薬及びＣａｓ１２ｐ－ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体を含む凍結乾燥反応ミックス。かかるミックスはまた、標識レポーター、例えば、５’ＦＡＭ－３’クエンチャーＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドレポーターを含み得る。
図２３は、例示的なキットに含まれる本開示の凍結乾燥ビーズの例示的なストリップを示す。各ビーズは、水で再懸濁され、検出アッセイに使用され得る。例示的なビーズは各々、ＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｐ）、所望の標的用のｇＲＮＡ（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２用のｇＲＮＡ）、標識レポーター、緩衝液、及びヌクレアーゼフリー水を含む。
ＶＩＩ．実施形態の列挙
本明細書に提供するのは、本開示の例示的、非限定的な実施形態の列挙である。
本明細書に提供するのは、本開示の例示的、非限定的な実施形態の列挙である。
実施形態１．
ａ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４タンパク質、またはＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４タンパク質をコードする核酸、及び
ｂ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４のｇＲＮＡをコードする核酸を含む、操作されたシステムであって、前記ｇＲＮＡ及び前記Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質は、天然では同時に生じることはなく、前記ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズすることが可能であり、前記ｇＲＮＡは、前記Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質と複合体を形成することが可能である、前記システム。
ａ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４タンパク質、またはＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４タンパク質をコードする核酸、及び
ｂ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４のｇＲＮＡをコードする核酸を含む、操作されたシステムであって、前記ｇＲＮＡ及び前記Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質は、天然では同時に生じることはなく、前記ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズすることが可能であり、前記ｇＲＮＡは、前記Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質と複合体を形成することが可能である、前記システム。
実施形態２．
ａ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質、及び
ｂ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４のｇＲＮＡを含む、実施形態１に記載のシステム。
ａ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質、及び
ｂ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４のｇＲＮＡを含む、実施形態１に記載のシステム。
実施形態３．
ａ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質をコードする核酸、及び
ｂ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４のｇＲＮＡをコードする核酸を含む、実施形態１に記載のシステム。
ａ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質をコードする核酸、及び
ｂ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４のｇＲＮＡをコードする核酸を含む、実施形態１に記載のシステム。
実施形態４．前記ｇＲＮＡが、単一分子ｇＲＮＡである、実施形態１～３のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態５．前記ｇＲＮＡが、デュアル分子ｇＲＮＡである、実施形態１～３のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態６．前記Ｃａｓ９．１タンパク質が、配列番号１、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態７．前記Ｃａｓ９．２タンパク質が、配列番号２、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態８．前記Ｃａｓ９．３タンパク質が、配列番号１０、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態９．前記Ｃａｓ９．４タンパク質が、配列番号１１、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１０．前記標的配列が、表６ａ～６ｆのいずれかに示す標的の配列である、実施形態１～７のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１１．前記標的配列が、ヒトの配列である、実施形態１～７のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１２．前記標的配列が、非ヒト霊長類の配列である、実施形態１～７のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１３．前記Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質が、触媒活性タンパク質である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１４．前記Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質が、前記標的配列に対して遠位部位で切断する、実施形態１３に記載のシステム。
実施形態１５．前記Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質が、触媒活性のないタンパク質である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１６．前記Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質が、ニッカーゼ活性を含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態１７．
ａ．クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質、及び
ｂ．単一のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、操作されたシステムであって、前記ｇＲＮＡ及び前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質は、天然では同時に生じることはなく、前記ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズすることが可能であり、前記ｇＲＮＡは、前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質と複合体を形成することが可能であり、前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質は、コラテラル活性を有し、ｔｒａｃｒＲＮＡなしで、ＲＮＡを含む一本鎖ポリヌクレオチドを付随的に切断することが可能である、前記システム。
ａ．クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質、及び
ｂ．単一のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、操作されたシステムであって、前記ｇＲＮＡ及び前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質は、天然では同時に生じることはなく、前記ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズすることが可能であり、前記ｇＲＮＡは、前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質と複合体を形成することが可能であり、前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質は、コラテラル活性を有し、ｔｒａｃｒＲＮＡなしで、ＲＮＡを含む一本鎖ポリヌクレオチドを付随的に切断することが可能である、前記システム。
実施形態１８．前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質が、配列番号４、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む、実施形態１７に記載のシステム。
実施形態１９．前記標的配列が、表６ａ～６ｆのいずれかに示す標的の配列である、実施形態１７～１８のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態２０．前記標的配列が、ヒトの配列である、実施形態１７～１８のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態２１．前記標的配列が、非ヒト霊長類の配列である、実施形態１７～１８のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態２２．前記標的配列が、細菌またはウイルスの配列である、実施形態１７～１８のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態２３．前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質が、一本鎖ＲＮＡを付随的に切断することが可能である、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態２４．前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質が、一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを付随的に切断することが可能である、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態２５．
ａ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑタンパク質、またはＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑタンパク質をコードする核酸、及び
ｂ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑのｇＲＮＡ、またはＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑのｇＲＮＡをコードする核酸を含む、操作されたシステムであって、前記ｇＲＮＡ及び前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質は、天然では同時に生じることはなく、前記ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズすることが可能であり、前記ｇＲＮＡは、前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質と複合体を形成することが可能である、前記システム。
ａ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑタンパク質、またはＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑタンパク質をコードする核酸、及び
ｂ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑのｇＲＮＡ、またはＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑのｇＲＮＡをコードする核酸を含む、操作されたシステムであって、前記ｇＲＮＡ及び前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質は、天然では同時に生じることはなく、前記ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズすることが可能であり、前記ｇＲＮＡは、前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質と複合体を形成することが可能である、前記システム。
実施形態２６．
ａ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質、及び
ｂ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑのｇＲＮＡを含む、実施形態２５に記載のシステム。
ａ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質、及び
ｂ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑのｇＲＮＡを含む、実施形態２５に記載のシステム。
実施形態２７．
ａ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質をコードする核酸、及び
ｂ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑのｇＲＮＡをコードする核酸を含む、実施形態２５に記載のシステム。
ａ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質をコードする核酸、及び
ｂ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑのｇＲＮＡをコードする核酸を含む、実施形態２５に記載のシステム。
実施形態２８．前記Ｃａｓ１２ａ．１タンパク質が、配列番号３、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態２９．前記Ｃａｓ１２ｐタンパク質が、配列番号４、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態３０．前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質が、配列番号２２２、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態３１．前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質が、配列番号５、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態３２．前記標的配列が、表６ａ～６ｆのいずれかに示す標的の配列である、実施形態２５～３１のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態３３．前記標的配列が、ヒトの配列である、実施形態２５～３１のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態３４．前記標的配列が、非ヒト霊長類の配列である、実施形態２５～３１のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態３５．前記標的配列が、細菌またはウイルスの配列である、実施形態２５～３１のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態３６．前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質が、触媒活性Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質である、実施形態２５～３４のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態３７．前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質が、前記標的配列に対して遠位部位で切断する、実施形態３６に記載のシステム。
実施形態３８．前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質が、触媒活性のないＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質である、実施形態２５～３４のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態３９．前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質が、ニッカーゼ活性を含む、実施形態２５～３４のいずれか１つに記載のシステム。
実施形態４０．
ａ．標的ＤＮＡの標的配列とハイブリダイズすることが可能なスペーサー配列を含むターゲッターＲＮＡ、及び
ｂ．前記ターゲッターＲＮＡとハイブリダイズし、二本鎖のＲＮＡ二重鎖を形成することが可能なアクチベーターＲＮＡであって、あるアクチベーターＲＮＡを含む、前記アクチベーターＲＮＡを含む、操作された単一分子ｇＲＮＡであって、
前記ターゲッターＲＮＡ及び前記アクチベーターＲＮＡは、互いに共有結合的に連結され、前記単一分子ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質と複合体を形成することが可能であり、前記標的配列への前記スペーサー配列のハイブリダイゼーションは、前記Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質を前記標的ＤＮＡに対して標的化することが可能である、前記操作された単一分子ｇＲＮＡ。
ａ．標的ＤＮＡの標的配列とハイブリダイズすることが可能なスペーサー配列を含むターゲッターＲＮＡ、及び
ｂ．前記ターゲッターＲＮＡとハイブリダイズし、二本鎖のＲＮＡ二重鎖を形成することが可能なアクチベーターＲＮＡであって、あるアクチベーターＲＮＡを含む、前記アクチベーターＲＮＡを含む、操作された単一分子ｇＲＮＡであって、
前記ターゲッターＲＮＡ及び前記アクチベーターＲＮＡは、互いに共有結合的に連結され、前記単一分子ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質と複合体を形成することが可能であり、前記標的配列への前記スペーサー配列のハイブリダイゼーションは、前記Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質を前記標的ＤＮＡに対して標的化することが可能である、前記操作された単一分子ｇＲＮＡ。
実施形態４１．前記ターゲッターＲＮＡ及び前記アクチベーターＲＮＡが、５’から３’の方向に配置される、実施形態４０に記載のｇＲＮＡ。
実施形態４２．前記アクチベーターＲＮＡ及び前記ターゲッターＲＮＡが、５’から３’の方向に配置される、実施形態４０に記載のｇＲＮＡ。
実施形態４３．前記ターゲッターＲＮＡ及び前記アクチベーターＲＮＡが、リンカーを介して互いに共有結合的に連結される、実施形態４０～４２のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
実施形態４４．前記単一分子ｇＲＮＡが、対応する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ及び／またはｃｒＲＮＡの配列と比較して、１つ以上の配列修飾を含む、実施形態４０～４３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
実施形態４５．前記ターゲッターＲＮＡが、前記標的ＤＮＡの配列に対して、１００％の相補性を有する約１０～５０ヌクレオチドのスペーサー配列を含む、実施形態４０～４４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
実施形態４６．前記ターゲッターＲＮＡが、前記標的ＤＮＡの配列に対して、１００％未満の相補性を有する約１０～５０ヌクレオチドのスペーサー配列を含む、実施形態４０～４４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
実施形態４７．前記標的配列が、表６ａ～６ｆのいずれかに示す標的の配列である、実施形態４０～４６のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
実施形態４８．前記Ｃａｓ９．１タンパク質が、配列番号１の配列またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態４０～４７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
実施形態４９．前記Ｃａｓ９．２タンパク質が、配列番号２の配列またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態４０～４７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
実施形態５０．前記Ｃａｓ９．３タンパク質が、配列番号１０の配列またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態４０～４７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
実施形態５１．前記Ｃａｓ９．４タンパク質が、配列番号１１の配列またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態４０～４７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
実施形態５２．配列番号１１６または配列番号１１７の足場配列及び標的ＤＮＡの標的配列とハイブリダイズすることが可能なスペーサー配列を含む、操作された単一分子ｇＲＮＡ。
実施形態５３．前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡ、植物ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、または細菌ＤＮＡを含む、実施形態５２に記載のｇＲＮＡ。
実施形態５４．前記標的配列が、表６ａ～６ｆのいずれかに示す標的の配列である、実施形態５２に記載のｇＲＮＡ。
実施形態５５．前記標的が、コロナウイルスである、実施形態５２に記載のｇＲＮＡ。
実施形態５６．前記標的が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、実施形態５２に記載のｇＲＮＡ。
実施形態５７．前記標的ＤＮＡが、ｃＤＮＡであり、逆転写によって得られたものである、実施形態５２に記載のｇＲＮＡ。
実施形態５８．標的ＤＮＡを修飾する方法であって、前記標的ＤＮＡを、実施形態１～３９に記載のシステムのいずれか１つと接触させることを含む前記方法であり、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列とハイブリダイズし、それにより、前記標的ＤＮＡの修飾が生じる、前記方法。
実施形態５９．前記標的ＤＮＡが、染色体外ＤＮＡである、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０．前記標的ＤＮＡが、染色体の一部である、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６１．前記標的ＤＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ染色体の一部である、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６２．前記標的ＤＮＡが、ｉｎ ｖｉｖｏ染色体の一部である、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６３．前記標的ＤＮＡが、細胞の外側にある、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６４．前記標的ＤＮＡが、細胞の内側にある、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６５．前記標的ＤＮＡが、遺伝子及び／またはその調節領域を含む、実施形態６４に記載の方法。
実施形態６６．前記細胞が、古細菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻類細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞からなる群から選択される、実施形態６４または６５に記載の方法。
実施形態６７．前記修飾が、前記標的ＤＮＡに二本鎖切断を導入することを含む、実施形態５８～６６のいずれかに記載の方法。
実施形態６８．前記接触が、非相同末端結合または相同組み換え修復を許容する条件下で生じる、実施形態５８～６７のいずれかに記載の方法。
実施形態６９．前記接触が、前記標的ＤＮＡとドナーポリヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチド、前記ドナーポリヌクレオチドの一部、前記ドナーポリヌクレオチドのコピー、または前記ドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が、前記標的ＤＮＡに統合される、実施形態５８～６７のいずれかに記載の方法。
実施形態７０．前記細胞とドナーポリヌクレオチドを接触することを含まない、または前記標的ＤＮＡが、前記標的ＤＮＡ内のヌクレオチドが削除されるように修飾される、実施形態５８～６７のいずれかに記載の方法。
実施形態７１．試料に含まれる標的ＤＮＡを検出する方法であって、
ａ．前記試料を、
ｉ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質、
ｉｉ．標的ＤＮＡの標的配列とハイブリダイズすることが可能なスペーサー配列を含むＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑのｇＲＮＡ、及び
ｉｉｉ．前記ｇＲＮＡの前記スペーサー配列とハイブリダイズしない標識ディテクターと接触させること、ならびに
ｂ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質による前記標識ディテクターの切断によって生じる検出可能なシグナルを測定し、それによって前記標的ＤＮＡを検出することを含む、前記方法。
ａ．前記試料を、
ｉ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質、
ｉｉ．標的ＤＮＡの標的配列とハイブリダイズすることが可能なスペーサー配列を含むＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑのｇＲＮＡ、及び
ｉｉｉ．前記ｇＲＮＡの前記スペーサー配列とハイブリダイズしない標識ディテクターと接触させること、ならびに
ｂ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質による前記標識ディテクターの切断によって生じる検出可能なシグナルを測定し、それによって前記標的ＤＮＡを検出することを含む、前記方法。
実施形態７２．前記標識ディテクターが、標識一本鎖ＤＮＡを含む、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３．前記標識ディテクターが、標識ＲＮＡを含む、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７４．前記標識ＲＮＡが、一本鎖ＲＮＡである、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７５．前記標識ディテクターが、標識一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７６．前記標識ディテクターが、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、実施形態７１～７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７７．前記試料を、前駆体ｇＲＮＡアレイと接触させることを含む、実施形態７１～７６のいずれか１つに記載の方法であって、前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質が、前記前駆体ｇＲＮＡアレイを切断し、前記ｇＲＮＡを生じる、前記方法。
実施形態７８．前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、実施形態７１～７７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７９．前記標的ＤＮＡが、二本鎖である、実施形態７１～７８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８０．前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡ、植物ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、または細菌ＤＮＡである、実施形態７１～７９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８１．前記標的配列が、表６ａ～６ｆのいずれかに示す標的の配列である、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２．前記標的が、コロナウイルスである、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８３．前記標的が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、実施形態８２に記載の方法。
実施形態８４．前記標的ＤＮＡが、ｃＤＮＡであり、逆転写によって得られたものである、実施形態７１～８３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８５．前記標的ＤＮＡが、ヒト細胞に由来する、実施形態７１～７９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８６．前記標的ＤＮＡが、ヒト胎児またはがん細胞ＤＮＡである、実施形態８５に記載の方法。
実施形態８７．前記タンパク質が、配列番号３、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含むＣａｓ１２ａ．１である、実施形態７１～８６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８８．前記タンパク質が、配列番号４、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含むＣａｓ１２ｐである、実施形態７１～８６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８９．前記タンパク質が、配列番号２２２、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含むＣａｓ１２ｐである、実施形態７１～８６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９０．前記タンパク質が、配列番号５、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性のアミノ酸配列を含むＣａｓ１２ｑである、実施形態７１～８６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９１．前記試料が、細胞溶解物に由来するＤＮＡを含む、実施形態７１～８７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９２．前記試料が、細胞を含む、実施形態７１～８７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９３．前記試料が、尿、血液、血清、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、鼻咽頭、口腔咽頭、鼻咽頭／口腔咽頭、吸引、または生検試料である、実施形態７１～８７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９４．前記試料に存在する前記標的ＤＮＡの量を測定することを含む、実施形態７１～９３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９５．検出可能なシグナルの前記測定が、視覚に基づく検出、センサーに基づく検出、色検出、金ナノ粒子に基づく検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学検出、及び半導体に基づく感知のうちの１つ以上を含む、実施形態９４に記載の方法。
実施形態９６．前記標識ディテクターが、修飾核酸塩基、修飾糖部分、及び／または修飾核酸結合を含む、実施形態７１～９５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９７．さらに、陽性対照試料に含まれる陽性対照標的ＤＮＡを検出することを含む、実施形態７１～９６のいずれか１つに記載の方法であって、前記検出が、
ａ．前記陽性対照試料を、
ｉ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質、
ｉｉ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質に結合する領域、及び前記陽性対照標的ＤＮＡとハイブリダイズする陽性対照スペーサー配列を含む陽性対照ｇＲＮＡ、ならびに
ｉｉｉ．前記陽性対照ｇＲＮＡの前記陽性対照スペーサー配列とハイブリダイズしない標識ディテクターと接触させること、ならびに
ｂ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質による前記標識ディテクターの切断によって生じる検出可能なシグナルを測定し、それによって前記陽性対照標的ＤＮＡを検出することを含む、前記方法。
ａ．前記陽性対照試料を、
ｉ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質、
ｉｉ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質に結合する領域、及び前記陽性対照標的ＤＮＡとハイブリダイズする陽性対照スペーサー配列を含む陽性対照ｇＲＮＡ、ならびに
ｉｉｉ．前記陽性対照ｇＲＮＡの前記陽性対照スペーサー配列とハイブリダイズしない標識ディテクターと接触させること、ならびに
ｂ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質による前記標識ディテクターの切断によって生じる検出可能なシグナルを測定し、それによって前記陽性対照標的ＤＮＡを検出することを含む、前記方法。
実施形態９８．前記検出可能なシグナルが、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、または２４０分未満で検出可能である、実施形態７１～９７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９９．さらに、前記試料に含まれる前記標的ＤＮＡを、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写増幅（ＴＭＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、分枝（ＲＡＭ）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅（ＳＭＡＲＴ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、ゲノムの指数関数的増幅反応（ＧＥＡＲ）、または等温多重置換増幅（ＩＭＤＡ）によって増幅することを含む、実施形態７１～９８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１００．前記試料に含まれる標的ＤＮＡが、１００ｕＭ未満の濃度で存在する、実施形態７１～９９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０１．配列番号１、２、３、４、５、１０、１１、または２２２に対して７０％～９９．５％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
実施形態１０２．前記タンパク質の前記配列が、生物情報学的に推定されたものである、実施形態１０１に記載のタンパク質。
実施形態１０３．実施形態１０１に記載のタンパク質のいずれか、及び任意に医薬的に許容される担体を含む、組成物。
実施形態１０４．実施形態１０１に記載のタンパク質のいずれかを含む組成物であって、任意に、医薬的に許容される担体、核酸安定化緩衝液及び／またはタンパク質安定化緩衝液を含む、前記組成物。
実施形態１０５．実施形態１０１に記載のタンパク質のいずれかを含む組成物であって、前記タンパク質が、凍結乾燥される前記組成物であり、任意に、さらに、ループ媒介等温増幅用の標識ディテクター、逆転写酵素、及び試薬のうちのいずれか１つ以上を含む、前記組成物。
実施形態１０６．実施形態１０１に記載のタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡポリヌクレオチド。
実施形態１０７．実施形態１０６のＤＮＡポリヌクレオチドを含む、組み換え発現ベクター。
実施形態１０８．単一の前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結される、実施形態１０７に記載の組み換え発現ベクター。
実施形態１０９．実施形態１０６～１０８のいずれか１つに記載のＤＮＡポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
実施形態１１０．実施形態１～３９に記載の操作されたシステムのいずれか、及び任意に、医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
実施形態１１１．実施形態１～３９に記載の操作されたシステムのいずれかを含む組成物であって、任意に、核酸安定化緩衝液及び／またはタンパク質安定化緩衝液を含む、前記組成物。
実施形態１１２．実施形態４０～５７に記載の単一分子ｇＲＮＡのいずれか、及び任意に、医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
実施形態１１３．実施形態４０～５１に記載の単一分子ｇＲＮＡのいずれか、及び任意に、核酸安定化緩衝液及び／またはタンパク質安定化緩衝液を含む、組成物。
実施形態１１４．実施形態３、２７に記載の核酸、または実施形態４０～５１に記載のｇＲＮＡのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡポリヌクレオチド。
実施形態１１５．実施形態１１４に記載のＤＮＡポリヌクレオチドを含む、組み換え発現ベクター。
実施形態１１６．単一の前記ｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結される、実施形態１１５に記載の組み換え発現ベクター。
実施形態１１７．実施形態１１４～１１６のいずれか１つに記載のＤＮＡポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
実施形態１１８．実施形態１～３９に記載の操作されたシステムのいずれかのうちの１つ以上の成分を含む、キット。
実施形態１１９．１つ以上の成分が、凍結乾燥される、実施形態１１８に記載のキット。
実施形態１２０．前記１つ以上の成分が、Ｃａｓ１２ｐ、標識ＲＮＡレポーター、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に向けられたｇＲＮＡを含む、実施形態１１８～１１９のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１２１．クラス２のＩＩ型またはクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を、メタゲノミクス試料から単離する方法であって、生物情報学に基づく方法の使用を含む、前記方法。
実施形態１２２．前記クラス２のＩＩ型またはクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が、配列番号１、２、３、４、５、１０、１１、及び２２２からなる群から選択される、実施形態１２１に記載の方法。
以下の実施例は、例示の目的で含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１：新規なクラスＩＩのＩＩ型及びＶ型エンドヌクレアーゼの同定及び検証
クラス２のＩＩ型及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座の同定
メタゲノム配列をＮＣＢＩから入手し、まとめて推定ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座のデータベースを構築した。ＣＲＩＳＰＲアレイを、ＣｒｉｓｐｒＣａｓＦｉｎｄｅｒソフトウェアを使用して同定した。フィルタリングの基準は、ｃａｓ遺伝子及びＣＲＩＳＰＲアレイに隣接する５００ａａ超の推定クラスＩＩのＩＩ型及びＶ型エフェクターであった。配列を、ＨＭＭプロファイルを使用してＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａで並べた。本明細書に記載の新規なＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、Ｃａｓ９．４、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ及びＣａｓ１２ｑタンパク質を同定した。
クラス２のＩＩ型及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座の同定
メタゲノム配列をＮＣＢＩから入手し、まとめて推定ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座のデータベースを構築した。ＣＲＩＳＰＲアレイを、ＣｒｉｓｐｒＣａｓＦｉｎｄｅｒソフトウェアを使用して同定した。フィルタリングの基準は、ｃａｓ遺伝子及びＣＲＩＳＰＲアレイに隣接する５００ａａ超の推定クラスＩＩのＩＩ型及びＶ型エフェクターであった。配列を、ＨＭＭプロファイルを使用してＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａで並べた。本明細書に記載の新規なＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、Ｃａｓ９．４、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ及びＣａｓ１２ｑタンパク質を同定した。
発現プラスミド及び非コード要素の生成
これらのＣａｓタンパク質を検証する最小の条件を確立し、クローニング戦略にした。最小ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、獲得タンパク質を除去すること及び単一のスペーサー（Ｓｐ１）で最小アレイを生成することによって設計した。この天然のＳｐ１配列を、標的の検出及びＰＡＭスクリーニングアッセイのため、天然に存在する配列の長さを有する既知の特定の標的配列（ＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＣＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡＧＴＴ、配列番号１１８）で置き換えた。Ｅ．ｃｏｌｉのＣＲＩＳＰＲエフェクター及び／またはアクセサリータンパク質のコドン最適化タンパク質配列を、ｌａｃ及びＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターの転写制御下、ｐＥＴベースの発現ベクター（ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に入れた。
これらのＣａｓタンパク質を検証する最小の条件を確立し、クローニング戦略にした。最小ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、獲得タンパク質を除去すること及び単一のスペーサー（Ｓｐ１）で最小アレイを生成することによって設計した。この天然のＳｐ１配列を、標的の検出及びＰＡＭスクリーニングアッセイのため、天然に存在する配列の長さを有する既知の特定の標的配列（ＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＣＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡＧＴＴ、配列番号１１８）で置き換えた。Ｅ．ｃｏｌｉのＣＲＩＳＰＲエフェクター及び／またはアクセサリータンパク質のコドン最適化タンパク質配列を、ｌａｃ及びＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターの転写制御下、ｐＥＴベースの発現ベクター（ＥＭＤ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に入れた。
人工的合成
Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、Ｃａｓ９．１及びＣａｓ９．２用に、発現ベクターを人工的に合成した。エフェクタープラスミドのコドン最適化、合成、及びクローニングは、提供者（ＧｅｎｅＳｒｉｐｔ）によって生成された。両方の推定転写方向を検討するため、隣接制限部位をＣＲＩＳＰＲアレイに加え、ＤＮＡ断片をクローニングした（ＩＤＴ）。これを、同じ要素で反対方向に行い、第二の構築物バリアントを創出した。図１Ａ～１Ｂは、Ｃａｓ９．１及びＣａｓ９．２に関する発現ベクターマップを示す。図２Ａ～２Ｃは、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、及びＣａｓ１２ｑに関する発現ベクターマップを示す。ベクター配列を、表８に示す。
Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、Ｃａｓ９．１及びＣａｓ９．２用に、発現ベクターを人工的に合成した。エフェクタープラスミドのコドン最適化、合成、及びクローニングは、提供者（ＧｅｎｅＳｒｉｐｔ）によって生成された。両方の推定転写方向を検討するため、隣接制限部位をＣＲＩＳＰＲアレイに加え、ＤＮＡ断片をクローニングした（ＩＤＴ）。これを、同じ要素で反対方向に行い、第二の構築物バリアントを創出した。図１Ａ～１Ｂは、Ｃａｓ９．１及びＣａｓ９．２に関する発現ベクターマップを示す。図２Ａ～２Ｃは、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、及びＣａｓ１２ｑに関する発現ベクターマップを示す。ベクター配列を、表８に示す。
タンパク質発現及び精製
Ｃａｓ１２のコード配列をＧｅｎｅＳｒｉｐｔによってコドン最適化及び合成し、その後、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にＮ末端６×Ｈｉｓタグとともにクローニングした。Ｃａｓ１２発現プラスミドで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ）を形質転換した。タンパク質発現のため、単一のクローンを第一に５ｍＬの液体ＬＢチューブにて終夜培養し、その後、４００ｍｌの新たな液体ＬＢ（ＯＤ６００ ０．１）に接種した。細胞を、ＯＤ６００が０．８になるまで振盪しながら２００ｒｐｍにて３７℃で増殖させ、次いでＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように加えた後、この細胞を３７℃にて約２時間さらに培養し、その後、細胞を回収した。細胞を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ及び５％グリセロール）に、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｒｏｇｅｍａ）及び５ｍｇ／ｍｌのリゾチームとともに再懸濁した。３７℃で１５分間のインキュベーション後、細胞を１０分間、１０秒オン及び１０秒オフのサイクルで超音波処理して溶解した。細胞残屑及び不溶性粒子を遠心分離（１５，０００ｒｐｍで３０分間）によって除去した。遠心分離後、その上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ２５Ｌ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、２０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ａで平衡化した５ｍＬのＣｒｕｄｅ ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。溶出を、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに０．５Ｍのイミダゾールを加えたもの）の段階勾配で行った。溶出液を透析緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ及び５％グリセロール）で透析した。
Ｃａｓ１２のコード配列をＧｅｎｅＳｒｉｐｔによってコドン最適化及び合成し、その後、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にＮ末端６×Ｈｉｓタグとともにクローニングした。Ｃａｓ１２発現プラスミドで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ）を形質転換した。タンパク質発現のため、単一のクローンを第一に５ｍＬの液体ＬＢチューブにて終夜培養し、その後、４００ｍｌの新たな液体ＬＢ（ＯＤ６００ ０．１）に接種した。細胞を、ＯＤ６００が０．８になるまで振盪しながら２００ｒｐｍにて３７℃で増殖させ、次いでＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように加えた後、この細胞を３７℃にて約２時間さらに培養し、その後、細胞を回収した。細胞を、２０ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ及び５％グリセロール）に、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｒｏｇｅｍａ）及び５ｍｇ／ｍｌのリゾチームとともに再懸濁した。３７℃で１５分間のインキュベーション後、細胞を１０分間、１０秒オン及び１０秒オフのサイクルで超音波処理して溶解した。細胞残屑及び不溶性粒子を遠心分離（１５，０００ｒｐｍで３０分間）によって除去した。遠心分離後、その上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ２５Ｌ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、２０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ａで平衡化した５ｍＬのＣｒｕｄｅ ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。溶出を、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに０．５Ｍのイミダゾールを加えたもの）の段階勾配で行った。溶出液を透析緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ及び５％グリセロール）で透析した。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びバリアント
直接反復配列の変異を含めると、ｇＲＮＡの安定性が改善され得る。本明細書に提供する３種のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２システムの直接反復配列は、ステムループ領域内に２つのＡ：Ｕ塩基対を有する。このステムループの熱安定性を高めることが、その同族Ｃａｓ１２へのロード用に適切にフォールドされるｃｒＲＮＡの割合を増やし、それによりヌクレアーゼ活性を高めると期待される（Ｐｅｎｇｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。これらのＡ：Ｕ塩基対を、本開示のＣＲＩＳＰＲシステムの直接反復配列においてＣ：Ｇで置き換え、ＲＮＡフォールディングの最小自由エネルギー予測に基づく新たな、安定性の高い、非天然バリアントを創出した。
直接反復配列の変異を含めると、ｇＲＮＡの安定性が改善され得る。本明細書に提供する３種のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１２システムの直接反復配列は、ステムループ領域内に２つのＡ：Ｕ塩基対を有する。このステムループの熱安定性を高めることが、その同族Ｃａｓ１２へのロード用に適切にフォールドされるｃｒＲＮＡの割合を増やし、それによりヌクレアーゼ活性を高めると期待される（Ｐｅｎｇｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。これらのＡ：Ｕ塩基対を、本開示のＣＲＩＳＰＲシステムの直接反復配列においてＣ：Ｇで置き換え、ＲＮＡフォールディングの最小自由エネルギー予測に基づく新たな、安定性の高い、非天然バリアントを創出した。
本開示のＣａｓタンパク質の、細菌ＤＮＡで見られるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座で予測（推定）される天然に存在する直接反復配列を上記表２及び５ａに示す（ＤＮＡ配列として示す）。新規なバリアントを上記表５ｂに示す（ＤＮＡ配列として表す）。予測される二次構造を図７Ａ～７Ｃに示す。全直接反復配列、またはその直接反復配列の一部が、機能的非天然ｇＲＮＡを形成し、本開示のＣａｓタンパク質に結合すると予測される。本実施例で使用される直接反復配列バリアント及びスペーサーを形成するＲＮＡは、Ｓｙｎｔｈｅｇｏによって合成された。
図３Ｂ、３Ｅ、３Ｇ、５Ｂ、５Ｄ、及び５Ｆは、予測されるＣａｓ９．１、Ｃａｓ９．３、Ｃａｓ９．４、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、及びＣａｓ１２ｑ ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの反復配列の二次構造（フォールディング）を示す。これらの予測を構築するため、公開されているＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバーツールを使用した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応（ＩＶＴ）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７転写キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して行い、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を製造業者の指示に従って用いて精製した。ＲＮＡを、Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２％アガロースゲルにて可視化した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７転写キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して行い、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を製造業者の指示に従って用いて精製した。ＲＮＡを、Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２％アガロースゲルにて可視化した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ標的切断アッセイ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ標的切断アッセイに使用した以下の鋳型配列を表９に示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ標的切断アッセイに使用した以下の鋳型配列を表９に示す。
ｇＢｌｏｃｋ（表９）は、ＩＤＴによって合成された約１００～５００ｎｔの二本鎖ＤＮＡ鋳型であり、それらの配列は、目的の標的を含む。１ｕｇのｇＢｌｏｃｋ標的配列を含む特異的切断アッセイを、緩衝液ＮＥＢ３にて、３０ｎＭのＣａｓ（Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、Ｃａｓ９．４、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、Ｃａｓ１２ｑ）、３０ｎＭの特定の配列に対するｃｒＲＮＡで、３７℃にて２時間にわたって行う。反応を７０℃にて１０分間で停止させる。生成物を、ＰＣＲ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してクリーンアップし、ＳＹＢＥＲ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で予め染色した１％アガロースゲルで可視化する。切断のタイプ（突出／平滑）を識別するため、消化産物のアリコートを１％のアガロースゲルで泳動し、切断された標的に対応するバンドをＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してゲル抽出した。精製した産物を、特定のプライマーを使用して配列決定し、ＤＮＡＳＴＡＲＴにより分析した。コラテラル活性アッセイに関しては、発明者らは、緩衝液ＮＥＢ３を、３０ｎＭのＣａｓ（Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、Ｃａｓ９．４、Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、Ｃａｓ１２ｑ）、３０ｎＭのｃｒＲＮＡ及び標的配列を含む１ｎＭのｓｓＤＮＡアクチベーターとともに、３７℃にて１０、２０、４０及び６０分間にわたって使用した。反応を、２５０ｎＭのＭ１３ｓｓＤＮＡまたはＭ１３ｄｓＤＮＡプラスミド（ＮＥＢ）の添加によって開始した。反応を、７０℃にて１０分間で停止させた。生成物を、ＳＹＢＥＲ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で予め染色した２％アガロースゲルで分離した。
コラテラル活性の蛍光検出
蛍光検出を行ってコラテラル活性を測定することができる。３０ｎＭのＣａｓ１２を、３０ｎＭのｃｒＲＮＡ及び５０ｎＭのＤＮａｓｅＡｌｅｒｔ（商標）基質（ＩＤＴ）とともに、緩衝液ＮＥＢ２．１にて３７℃で、反応最終体積４０μｌで複合体とした。この反応は、蛍光プレートリーダーにて、最大３０分間、３７℃、ＨＥＸチャンネル（λｅｘ：５３６ｎｍ、λｅｍ：５５６ｎｍ）で２分ごとに蛍光測定を行って観察することができる。得られるデータを、標的の非存在下で得られる読み出し値を使用して、バックグラウンド補正することができる。ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡ及びｄｓＲＮＡ／ｓｓＲＮＡのコラテラル切断のＦＱ検出には、それぞれ、ＤＮａｓｅＡｌｅｒｔ（商標）（ＩＤＴ）及びＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（登録商標）－１を使用した。
蛍光検出を行ってコラテラル活性を測定することができる。３０ｎＭのＣａｓ１２を、３０ｎＭのｃｒＲＮＡ及び５０ｎＭのＤＮａｓｅＡｌｅｒｔ（商標）基質（ＩＤＴ）とともに、緩衝液ＮＥＢ２．１にて３７℃で、反応最終体積４０μｌで複合体とした。この反応は、蛍光プレートリーダーにて、最大３０分間、３７℃、ＨＥＸチャンネル（λｅｘ：５３６ｎｍ、λｅｍ：５５６ｎｍ）で２分ごとに蛍光測定を行って観察することができる。得られるデータを、標的の非存在下で得られる読み出し値を使用して、バックグラウンド補正することができる。ｄｓＤＮＡ／ｓｓＤＮＡ及びｄｓＲＮＡ／ｓｓＲＮＡのコラテラル切断のＦＱ検出には、それぞれ、ＤＮａｓｅＡｌｅｒｔ（商標）（ＩＤＴ）及びＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（登録商標）－１を使用した。
シス及びトランス切断の速度
初速度（Ｖ０）を線形回帰のフィッティングによって計算し、基質濃度に対してプロットし、Ｘが基質濃度であり、Ｙが酵素速度である次式：Ｙ＝（Ｖｍａｘ×Ｘ）／（Ｋｍ＋Ｘ）に従ってミカエリスメンテン定数を決定することができる（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。代謝回転数（ｋｃａｔ）は、次式：ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／Ｅｔによって決定され、ここでは、Ｅｔ＝０．１ｎＭである。
初速度（Ｖ０）を線形回帰のフィッティングによって計算し、基質濃度に対してプロットし、Ｘが基質濃度であり、Ｙが酵素速度である次式：Ｙ＝（Ｖｍａｘ×Ｘ）／（Ｋｍ＋Ｘ）に従ってミカエリスメンテン定数を決定することができる（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）。代謝回転数（ｋｃａｔ）は、次式：ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／Ｅｔによって決定され、ここでは、Ｅｔ＝０．１ｎＭである。
実施例２：エンドヌクレアーゼ活性の測定
ｃｒＲＮＡのみが供給された本開示の新規なＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで標的ＤＮＡを切断することができるかどうかを調べた。Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐをｉｎ ｖｉｔｒｏで設計し、過剰発現させ、精製し、特定の標的に対するｃｒＲＮＡと複合体を形成するために使用した。Ｃａｓ１２タンパク質及びｃＲＮＡの存在は、ＤＮＡ切断を媒介するための活性複合体を形成するのに十分であることが分かった。
ｃｒＲＮＡのみが供給された本開示の新規なＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで標的ＤＮＡを切断することができるかどうかを調べた。Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐをｉｎ ｖｉｔｒｏで設計し、過剰発現させ、精製し、特定の標的に対するｃｒＲＮＡと複合体を形成するために使用した。Ｃａｓ１２タンパク質及びｃＲＮＡの存在は、ＤＮＡ切断を媒介するための活性複合体を形成するのに十分であることが分かった。
実施例３：ＰＡＭ配列特異性の測定
本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐのＰＡＭ配列切断依存性作用を実証するため、特定の標的配列の後に、１０種の異なるＰＡＭモチーフを設計した。これらを使用して、調べた１０種のモチーフのうち、ＴＣＴＮ及びＴＧＴＮを、それぞれ、Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐに有効なＰＡＭ配列であると同定した。図８は、Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐの性能を、蛍光アッセイを使用して測定した１０種のＰＡＭモチーフに対するＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐのＰＡＭ配列の選好の棒グラフを示す。得られた蛍光データは、バックグラウンドを差し引いた。
本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐのＰＡＭ配列切断依存性作用を実証するため、特定の標的配列の後に、１０種の異なるＰＡＭモチーフを設計した。これらを使用して、調べた１０種のモチーフのうち、ＴＣＴＮ及びＴＧＴＮを、それぞれ、Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐに有効なＰＡＭ配列であると同定した。図８は、Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐの性能を、蛍光アッセイを使用して測定した１０種のＰＡＭモチーフに対するＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐのＰＡＭ配列の選好の棒グラフを示す。得られた蛍光データは、バックグラウンドを差し引いた。
実施例４：Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐのコラテラル活性ならびにそれらがｓｓＤＮＡ及びＲＮＡレポーターを切断する能力の実証
本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐタンパク質が、ｄｓＤＮＡまたはＲＮＡを切断することができるかどうかを調べた。Ｃａｓ１２ａ．１－ｇＲＮＡ複合体またはＣａｓｐ－ｇＲＮＡ複合体を、試料（陽性及び陰性）ならびにレポーターと混合し、標的の存在下で反応させた。これらの実施例では、特別なｓｓＤＮＡ蛍光標識レポーター（５’ＦＡＭ－ＴＴＡＴＴＡＴＴ－３ＩＡＢｋＦＱ３’－ＩＤＴ）（配列番号１２１）及び市販の蛍光標識レポーターＲＮＡレポーター（カタログ番号１１－０４－０３－０３－ＩＤＴ）を使用した。
本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐタンパク質が、ｄｓＤＮＡまたはＲＮＡを切断することができるかどうかを調べた。Ｃａｓ１２ａ．１－ｇＲＮＡ複合体またはＣａｓｐ－ｇＲＮＡ複合体を、試料（陽性及び陰性）ならびにレポーターと混合し、標的の存在下で反応させた。これらの実施例では、特別なｓｓＤＮＡ蛍光標識レポーター（５’ＦＡＭ－ＴＴＡＴＴＡＴＴ－３ＩＡＢｋＦＱ３’－ＩＤＴ）（配列番号１２１）及び市販の蛍光標識レポーターＲＮＡレポーター（カタログ番号１１－０４－０３－０３－ＩＤＴ）を使用した。
図９Ｂは、本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐタンパク質のコラテラル活性を、ハンタウイルスを例示的な標的として使用して示す。Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐを、ハンタを標的とするそれぞれのｇＲＮＡとともにインキュベートし、１ｕＭの複合体を形成し、１０ｎＭの濃度でＤＮＡ標的に暴露した。このミックスに加えたのは、蛍光標識ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡレポーターで、１～０．５ｕＭの濃度であった。対照には、この特異的ＤＮＡ標的を含めなかった。コラテラル活性は、標的の存在下でのみ認められた。Ｃａｓ１２ａ．１は、これらの条件下では、ｓｓＤＮＡに対してｓｓＤＮＡコラテラル切断を示すが、ＲＮＡには示さない。一方、Ｃａｓ１２ｐは、ｓｓＤＮＡ及びＲＮＡレポーターの両方にコラテラル切断活性を示した。本明細書に提供する本実施例及び他の実施例に使用したＲＮＡ基質は、ＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（登録商標）－１基質（２５本の使い捨てチューブ。カタログ番号１１－０４－０３－０３－ＩＤＴ）であった。本明細書に提供する本実施例及び他の実施例に使用した例示的なｓｓＤＮＡレポーターは、（５’ＦＡＭ－ＴＴＡＴＴＡＴＴ－３ＩＡＢｋＦＱ３’－ＩＤＴ）（配列番号１２１）であった。
図９Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活化ウイルスを標的として試料に使用して、Ｃａｓ１２ｐが、ｓｓＤＮＡ及びＲＮＡレポーターの両方のコラテラル切断を示すことを示している。
実施例５：熱安定性試験
Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐの活性を、異なる温度で調べた。
Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐの活性を、異なる温度で調べた。
図１０は、Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐタンパク質の２５℃での活性を、１ｕＭの複合体、３００ｎＭのレポーターＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓｐｎ２標的）を使用して、読み出しの終点として１分及び５分で示す。
図１０及び１４は、Ｃａｓ１２ｐが、３７℃におけるものと同様に２５℃でも良好に機能することを示す。
図１５は、２５℃でのレポーター切断による蛍光シグナルの生成におけるＣａｓ１２ｐのＬｂＣａｓ１２ａに対する性能の差を示す。ＬｂＣａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｐを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮ遺伝子を標的とするそれぞれのｇＲＮＡとともにインキュベートし、１ｕＭの複合体を形成した。標的は、両方で同じであり、１０ｎＭの濃度で提供した。６００ｎＭのｓｓＤＮＡレポーターを、反応ミックス（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ）に加えた。コラテラル切断を、蛍光によって測定し、読み出しをリアルタイムで行った。図１６は、実施例１０に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を標的として使用した２５℃でのＣａｓ１２ｐのＬｂＣａｓ１２ａに対する性能の差を示す。
実施例６：様々な塩濃度の試験
Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐの活性を様々なＮａＣｌ濃度で調べた。Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐは、機能を維持することが示された。図１１は、これら２種のタンパク質の様々なＮａＣｌ濃度での活性を示す。得られた蛍光データは、バックグラウンドを差し引いた。
Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐの活性を様々なＮａＣｌ濃度で調べた。Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐは、機能を維持することが示された。図１１は、これら２種のタンパク質の様々なＮａＣｌ濃度での活性を示す。得られた蛍光データは、バックグラウンドを差し引いた。
実施例７：様々な市販の緩衝液の試験
様々な市販の緩衝液中で、本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐは、異なる性能を示した。図１２は、３種の異なる市販の緩衝液中での本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐの性能を示す。得られた蛍光データは、バックグラウンドを差し引いた。
様々な市販の緩衝液中で、本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐは、異なる性能を示した。図１２は、３種の異なる市販の緩衝液中での本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐの性能を示す。得られた蛍光データは、バックグラウンドを差し引いた。
実施例８：ハンタウイルスの検出のためのＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐの使用
ハンタウイルスは、主にげっ歯類によって広がるウイルスのファミリーであり、世界中で人々に様々な疾患の症状を引き起こし得る。任意のハンタウイルスによる感染は、人々にハンタウイルス病を引き起こし得る。以下に記載するのは、本開示の新規なＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐタンパク質のハンタウイルス検出のための使用である。
ハンタウイルスは、主にげっ歯類によって広がるウイルスのファミリーであり、世界中で人々に様々な疾患の症状を引き起こし得る。任意のハンタウイルスによる感染は、人々にハンタウイルス病を引き起こし得る。以下に記載するのは、本開示の新規なＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐタンパク質のハンタウイルス検出のための使用である。
プライマー設計及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイドの選択
以下に示すのは、ハンタウイルスゲノムのアンデスウイルスセグメントＳの完全配列である。
以下に示すのは、ハンタウイルスゲノムのアンデスウイルスセグメントＳの完全配列である。
以下の例示的な配列を、ハンタウイルス検出のためのスペーサーｇＲＮＡの標的として選択した：ＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＣＴＡＣ（配列番号７０）（上記下線部分）。他の配列を標的に使用することもできる。
ＣＲＩＳＰＲガイドの設計及び合成
ハンタウイルス標的配列に特異的なスペーサーでｇＲＮＡを設計した。以下に示すのは、ガイドである（直接反復配列（一重下線）＋標的相補配列（二重下線）を含む）：
ハンタウイルス標的配列に特異的なスペーサーでｇＲＮＡを設計した。以下に示すのは、ガイドである（直接反復配列（一重下線）＋標的相補配列（二重下線）を含む）：
ｇＲＮＡの自然な発現及びプロセシングのため、Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐの直接反復配列ならびに標的相補配列を含む最小アレイを、Ｃａｓ発現ベクターにクローニングした。このＣＲＩＳＰＲ複合体を、ｉｎ ｖｉｖｏにて、発現細菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）コンピテントＥ．ｃｏｌｉで形成し、細菌抽出物から精製した。他の変形では、このガイドをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、Ｃａｓタンパク質と複合体にすることができる。
この複合体を、蛍光色素を有する分子レポーターを含むミックスに加えた。調べる試料をこのミックスに加えた。調べる試料は、対象から直接採取した試料でも、対象から採取した後に希釈及び／または処理した試料でも、対象から採取した試料に由来するＤＮＡ（増幅してもよい）もしくはＲＮＡでもよく、または、調べる試料は、試料由来のＲＮＡから作製したｃＤＮＡでもよい。この試料をさらに、例えば、ＲＰＡ（リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、例えば、ＲＰＡ ＴｗｉｓｔＡｍｐ Ｂａｓｉｃ（ＴＡＢＡＳ０３）を使用）を使用して増幅してもよい。
このＣＲＩＳＰＲ複合体の形成用の成分を、混合する順で表１０に示す。この複合体を作製し、室温で１０分間インキュベートした。
ＣＲＩＳＰＲミックスの形成用の成分を、混合する順で表１１に示す。
結果の読み出し
反応を、蛍光プレートリーダーにて、最大３０分間、３７℃にて、ＨＥＸチャンネル（λｅｘ：５３６ｎｍ、λｅｍ：５５６ｎｍ）で２分ごとにまたは最終的な終点で蛍光測定を行って観察した。得られるデータを、標的の非存在下で得られる読み出し値を使用して、バックグラウンド補正する。
反応を、蛍光プレートリーダーにて、最大３０分間、３７℃にて、ＨＥＸチャンネル（λｅｘ：５３６ｎｍ、λｅｍ：５５６ｎｍ）で２分ごとにまたは最終的な終点で蛍光測定を行って観察した。得られるデータを、標的の非存在下で得られる読み出し値を使用して、バックグラウンド補正する。
図９Ａは、ハンタ標的での本開示のＣａ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐタンパク質の特異的切断活性を示す。ｐＧＥＭプラスミドをハンタ標的とともにクローニングし（ｐＧＥＭ－Ｈａｎｔａ）、Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐの特異的切断活性を実証するために使用した。Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐを、ハンタ標的を標的とするそれぞれのｇＲＮＡとともにインキュベートし、ｇＧＥＭ－Ｈａｎｔａプラスミドまたは標的を含まないｇＧＥＭプラスミドに３７℃で２時間暴露した。矢印は、ｐＧＥＭ－Ｈａｎｔａプラスミドが切断され、ｐＧＥＭが切断されないことを示し、この切断が、ハンタ標的に特異的であることを実証している。
図１３に示す通り、コラテラル活性を使用して、ハンタウイルスＲＮＡを、１時間未満で、ピコモル濃度で検出することができた。図１３は、本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐのＲＰＡなしでの感度曲線を、３０分間測定した様々な標的濃度に関して示す。
実施例９：Ｃａｓ１２ｐの特性評価
Ｃａｓ１２ｐをさらに特徴づけ、ＬｂＣａｓ１２ａ（配列番号１２２（ＵＳ９７９０４９０）の配列番号２４２）と比較し、本新規Ｃａｓ１２サブタイプの特性を裏付けた。
Ｃａｓ１２ｐをさらに特徴づけ、ＬｂＣａｓ１２ａ（配列番号１２２（ＵＳ９７９０４９０）の配列番号２４２）と比較し、本新規Ｃａｓ１２サブタイプの特性を裏付けた。
図１４は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡから逆転写した標的ＤＮＡのＣａｓ１２ｐによる蛍光検出量が、３７℃と２５℃で等しいことを示しており、熱安定性及び室温での機能を示す。
図１５及び下記は、室温でのＣａｓ１２ｐのＬｂＣａｓ１２ａに対する速度論的性能を示す。
図１６は、室温でのＣａｓ１２ｐのＬｂＣａｓ１２ａに対する性能の差をさらに示す。
上記の通り、図９Ａは、上記実施例に記載の通り例示的なハンタウイルス標的での本開示のＣａ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐタンパク質の特異的切断活性を示す。図９Ｂは、上記実施例に記載の通り本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐタンパク質のコラテラル活性を、ハンタウイルスを例示的な標的として使用して示す。図９Ｃは、実施例１０に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的用の新規なＣａｓ１２ｐタンパク質のコラテラル活性を示す。
図１７は、例として様々な標的（ハンタウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）で調べたｓｓＤＮＡ及びＲＮＡレポーターの両方を切断するＣａｓ１２ｐの能力を示す。Ｃａｓ１２ｐを、ハンタウイルスまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに向けたｇＲＮＡとともにインキュベートし、１ｕＭの複合体を形成し、１０ｎＭの濃度でＤＮＡ標的に暴露し、ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡ蛍光標識レポーターを１～０，５ｕＭの濃度でミックスに加えた。対照は、この特異的ＤＮＡ標的を有さなかった。コラテラル活性は、ｓｓＤＮＡ及びＲＮＡの両方に関して、標的の存在下でのみ認められた。
実施例１０：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのＣａｓ１２ａ．１の使用
ここで提供するのは、感染急性期での上気道検体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのＣａｓ１２ｐの使用例である。陽性結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡの存在を示す。患者の病歴及び他の診断情報とのさらなる臨床相関を使用して、患者の感染状況を特定することができる。
ここで提供するのは、感染急性期での上気道検体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのＣａｓ１２ｐの使用例である。陽性結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡの存在を示す。患者の病歴及び他の診断情報とのさらなる臨床相関を使用して、患者の感染状況を特定することができる。
アッセイ
ＲＮＡを、１４０μｌの鼻咽頭／口腔咽頭試料から、ＱＩＡｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）をユーザーガイドの指示通りに使用し、６０μｌに溶出して精製した。ＲＮＡをすぐに試験しなかった場合は、そのＲＮＡを－７０℃未満で保存した。
ＲＮＡを、１４０μｌの鼻咽頭／口腔咽頭試料から、ＱＩＡｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）をユーザーガイドの指示通りに使用し、６０μｌに溶出して精製した。ＲＮＡをすぐに試験しなかった場合は、そのＲＮＡを－７０℃未満で保存した。
ＲＮＡ精製後、ＣＡＳＰＲ Ｌｙｏ－ＣＲＩＳＰＲ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２キットを使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡの検出を、図１８に概説しかつ以下に説明する２段階の手順を使用して行った。
ステップ１：精製ＲＮＡを逆転写及び増幅に供した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムの高度に保存されたＮ遺伝子を標的とするように特異的に設計したプライマーセットでの逆転写ループ媒介等温増幅（ＲＴ－ＬＡＭＰ）を使用した５μｌの精製ＲＮＡの逆転写及び増幅を行った。
このＲＴ－ＬＡＭＰ反応は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡのＮ遺伝子の特定の配列を増幅する合計三（３）つのプライマーペアを基にした。
このＲＴ－ＬＡＭＰ反応を、反応ミックスを６２℃で３０分間インキュベートすることによって行った。
ステップ２：ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の後、増幅したウイルス標的の検出を、Ｃａｓ１２ａ．１＋ステップ１の増幅ウイルスＮ遺伝子配列を標的とするｇＲＮＡ（単一分子ガイド）を含むＣａｓ１２ａ．１リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）を使用して行った。ウイルスＲＮＡから作製したｃＤＮＡにおいてｇＲＮＡが標的とする配列は、次の通りである：ＧＡＴＣＧＣＧＣＣＣＣＡＣＴＧＣＧＴＴＣＴＣＣ（配列番号１１９）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡが試料に存在し、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応で増幅された場合、ＲＮＰ複合体のｇＲＮＡが、ＤＮＡ標的に結合し、Ｃａｓ１２ａ．１のコラテラル切断活性を誘発することができ、これにより、５’ＦＡＭ－３’クエンチャー一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ－ＤＮＡ）レポーター分子が分解され、蛍光発光を生じる。蛍光測定は、蛍光機能を備えた標準的なプレートリーダーで行うことができる。
アッセイは、開始から終了まで、すなわち、試料の採取から結果の読み出しまで、６０分未満で行われる。図１８は、本実施例に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出のための概略ワークフローを示す。
さらなる陰性対照、陽性対照、及び抽出対照を含めた。
陰性対照：アッセイのランの任意の潜在的なコンタミネーションを識別するためにヌクレアーゼフリー水を使用した。
陽性対照：標的配列と同一の合成配列を２０００ｃｐ／ｍｌの濃度で別のバイアルに提供した。この陽性対照は、このアッセイが予想通り機能することを検証した。
抽出対照：抽出手順の適切な性能を保証するために、ヒトハウスキーピング遺伝子ＲＮＡｓｅ Ｐ（例えば）を標的とするプライマーセットをＲＴ－ＬＡＭＰ反応ミックスに含めた。
使用した試薬を凍結乾燥形態で提供し、オペレーターの手作業のミスの原因を減らした。
結果
陰性対照（ＮＴＣ）に関しては、終点（ｔ＝２０分）で測定された蛍光（ＩＦ）とランの開始時（ｔ＝０分）の蛍光間で比率値を計算した。
陰性対照（ＮＴＣ）に関しては、終点（ｔ＝２０分）で測定された蛍光（ＩＦ）とランの開始時（ｔ＝０分）の蛍光間で比率値を計算した。
陽性対照及び臨床試料に関しては、終点（ｔ＝２０分）で測定された試料の反応蛍光（ＩＦ）と２０分での対応する有効な陰性鋳型対照の反応蛍光測定値間で比率値を計算した。
陽性対照（ＰＣ）の場合
臨床試料の場合
陽性対照（ＰＣ）の場合
対照及び試料に関する比率値を計算した後、結果を以下の対照アッセイの基準に従って計算した。
本実施例では、未知の臨床試料に関して：陽性試料は、比率値＞３（試料の反応及び陰性対照の反応間で、ｔ＝２０分における蛍光発光に最小３倍の増加）を有する。
本実施例では、陰性試料は、比率値＜３（試料の反応及び陰性対照の反応間で、ｔ＝２０分における蛍光発光に３倍未満の増加）を有する。陰性結果を支持するため、ＲＮＡｓｅ Ｐが値＞３（試料の反応及び陰性対照の反応間で、ｔ＝２０分における蛍光発光の増加）を有することが期待される。
性能評価－分析感度、検出限界
検出限界（ＬｏＤ）試験は、少なくとも９５％の確率で検出できるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の最低濃度（ゲノムコピー（ｃｐ）／μＬ投入量）を確立した。
検出限界（ＬｏＤ）試験は、少なくとも９５％の確率で検出できるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の最低濃度（ゲノムコピー（ｃｐ）／μＬ投入量）を確立した。
ＬｏＤを決定するために、全不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の段階希釈液を陰性鼻咽頭試料に混入させ、上記手順に従って処理した。
ＬｏＤは、３つの異なる希釈液（１０コピー／μｌ、５コピー／μｌ、２．５コピー／μｌ）を３反復で試験することによって決定され、３／３反復が陽性となった最低濃度（５コピー／μｌ）に対応していた。この予備的ＬｏＤ（５コピー／μｌ）は、予備的ＬｏＤの０．５倍－１倍－１．５倍－２倍での試験を各濃度について２０反復で行うことによって確認された。ＬｏＤは、少なくとも１９／２０反復が標的に対して陽性となった最低濃度であった。
ＬｏＤは、検出率９５％（１９／２０）となった７．５コピー／μＬにおいて確認された。結果を以下の表にまとめる。
性能評価－分析感度、包含性
包含性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイプライマー及びｇＲＮＡを、２０２０年５月１６日現在にＧＩＳＡＩＤで利用できる４７０３個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のアライメントと比較することによって実証された。データセットは、全ゲノム配列（２９０００ｂｐ超）のみを考慮すること、ならびに（Ｎの）配列決定データが曖昧であり動物に由来している低質な配列を除去することによってさらに絞り込まれた。このｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ解析は、利用されたそのプライマー及びｇＲＮＡ配列が、流布しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全ての利用可能な配列との９９．９％の相同性を有することを示していた。
包含性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイプライマー及びｇＲＮＡを、２０２０年５月１６日現在にＧＩＳＡＩＤで利用できる４７０３個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のアライメントと比較することによって実証された。データセットは、全ゲノム配列（２９０００ｂｐ超）のみを考慮すること、ならびに（Ｎの）配列決定データが曖昧であり動物に由来している低質な配列を除去することによってさらに絞り込まれた。このｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ解析は、利用されたそのプライマー及びｇＲＮＡ配列が、流布しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全ての利用可能な配列との９９．９％の相同性を有することを示していた。
性能評価－分析特異性
アッセイ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特異的検出のために設計された一組のプライマー及び独特なｇＲＮＡに基づいていた。
アッセイ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特異的検出のために設計された一組のプライマー及び独特なｇＲＮＡに基づいていた。
分析特異性を評価するために、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔツールを使用するｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ解析をまず実施して、プライマー／ｇＲＮＡ配列のいずれかと呼吸器の病原性生物との間に潜在的な交差反応性が何ら存在しないことを確認した。
結果を表１３にまとめる。
これらの結果は、ごく少数の微生物がそれらのゲノム配列と、アッセイに含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーまたはｇＲＮＡの少なくとも１つとの間に８０％を上回る相同性を有することを示していた。
ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ評価を裏付けるために、同じ病原体を試験管内で潜在的交差反応性及び干渉の両方について調べた。
合計２２種の病原体に関する分析は、抽出手順の溶解ステップの間にゲノムＤＮＡ／ＲＮＡか不活化株かのどちらかを表１５に示す濃度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性鼻咽頭試料中に混入させることによって実施され、本明細書に記載のアッセイを用いて試験された。各病原体を３反復で試験した。いかなる偽陰性結果も切り捨てるために、各試料に対してＲＮアーゼＰアッセイを並行して行った。
キットに含まれていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーまたはｇＲＮＡのどちらかとの８０％を上回る相同性を示した微生物に対しては、干渉分析による評価も行った。いかなる潜在的干渉も検出するために、３倍のＬｏＤのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２２．５ｃｐ／μｌ）の存在下で交差反応性試験に用いたのと同じプロトコールに倣うことによって分析を実施した。
試験した病原体についての全ての陰性結果は、ＲＮアーゼＰアッセイでの陽性結果によって裏付けられた。
結論として、ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ解析及び試験管内分析に基づけば、アッセイに含まれるプライマー／ｇＲＮＡと呼吸器内の最も一般的な病原体との間には交差反応性も干渉もないことが予期された。
臨床評価
上気道感染症の兆候及び症候を有する成人男女患者からの臨床試料としての鼻咽頭スワブを使用して、アッセイの臨床評価を実施した。
上気道感染症の兆候及び症候を有する成人男女患者からの臨床試料としての鼻咽頭スワブを使用して、アッセイの臨床評価を実施した。
性能を評価するために合計で３０個の陽性試料及び３０個の陰性試料を採取し、ＲＮＡ抽出のためにＱＩＡｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉキットを使用し、続いて（表１５中に「Ｃａｓ１２ａ．１に基づくアッセイ」と記される）記載の手順を用いて試験した。全ての試料に、比較方法としてＲＴ－ＰＣＲ検査を用いた試験も行って、陽性及び陰性一致パーセント値を得た。結果は表１５に示されており、対照方法との１００％の陽性一致パーセント（ＰＰＡ）及び１００％の陰性一致パーセント（ＮＰＡ）を示している。
実施例１１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのＣａｓ１２ｐの使用
ここでは、感染症の急性期の間の上気道検体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのＣａｓ１２ｐの使用の一例を示す。陽性結果はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの存在を示す。患者履歴及び他の診断情報とのさらなる臨床的相関関係を利用して患者感染状態を判定することができよう。
ここでは、感染症の急性期の間の上気道検体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのＣａｓ１２ｐの使用の一例を示す。陽性結果はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの存在を示す。患者履歴及び他の診断情報とのさらなる臨床的相関関係を利用して患者感染状態を判定することができよう。
アッセイ
鼻咽頭／鼻スワブを５００ｕＬの溶解用緩衝液の中に挿入し、２分間ボルテックスに掛け、１００ｕＬの溶解試料を１．５ｍＬ容チューブ内に移し、９５℃で５分間加熱する。
鼻咽頭／鼻スワブを５００ｕＬの溶解用緩衝液の中に挿入し、２分間ボルテックスに掛け、１００ｕＬの溶解試料を１．５ｍＬ容チューブ内に移し、９５℃で５分間加熱する。
試料処理後、図１９にまとめており以下に概要が示される２ステップ手順を用いて、ＣＡＳＰＲ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌｙｏ－ＣＲＩＳＰＲ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２キットを使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡの検出を行った。
ステップ１：溶解試料を逆転写及び増幅に供した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムの２つの高度に保存されたＮ遺伝子及び１つの高度に保存されたＯＲＦ１ａｂ遺伝子を指向するように特別に設計されたプライマー組を使用する逆転写ループ媒介等温増幅（ＲＴ－ＬＡＭＰ）を用いて１０μｌの溶解試料の逆転写及び増幅を行った。
ＲＴ－ＬＡＭＰ反応は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡのＮ遺伝子中の２つの特異な配列及びＯＲＦ１ａｂ遺伝子中の１つの特異な配列を増幅する合計３（９）対のプライマーに基づいていた。
ＲＴ－ＬＡＭＰ反応は、反応混合物を６２℃で６０分間インキュベートすることによって実施された。
ステップ２：ＲＴ－ＬＡＭＰ反応後、増幅ウイルス標的の検出は、Ｃａｓ１２ｐと、ステップ１からの増幅ウイルスＮ及びＯＲＦ１ａｂ遺伝子配列を指向する３つのｇＲＮＡ（単一分子ガイド）とを含むＣａｓ１２ｐリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）を使用して行われた。ｇＲＮＡの標的となる、ウイルスＲＮＡから作られたｃＤＮＡの中の配列は以下のとおりである：ＧＡＴＣＧＣＧＣＣＣＣＡＣＴＧＣＧＴＴＣＴＣＣ（配列番号１１９）、ＡＵＧＧＣＡＣＣＵＧＵＧＵＡＧＧＵＣＡＡＣＣＡ（配列番号１２０）、及びＵＧＵＧＣＵＧＡＣＵＣＵＡＵＣＡＵＵＡＵＵＧＧ（配列番号１２３）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡが試料中に存在し、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応中に増幅された場合、ＲＮＰ複合体からのｇＲＮＡはＤＮＡ標的に結合してＣａｓ１２ｐの付帯的な切断活性を誘発することができ、これによって５’ＦＡＭ－３’失活剤一本鎖レポーター分子が分解され、蛍光の発光がもたらされる。蛍光測定は、蛍光利用が可能な標準的プレートリーダーにおいて実施され得る。
アッセイは、開始から終了まで－試料を得てから結果を読み出すまで、７５分以内に行われた。図１８及び図１９はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのワークフローの概略を示す。
付加的な陰性、陽性及び抽出対照を含めた。
陰性対照：アッセイ実施のいかなる潜在的汚染も同定するために、ヌクレアーゼを含有しない水を使用した。
陽性対照：標的配列と同一である合成配列を、別個のバイアルに２０００ｃｐ／ｍｌの濃度で供給した。陽性対照は、アッセイが予期したとおりに機能していることを立証した。
抽出対照：抽出手順の適切な遂行を保証するために、（例えば）ヒトハウスキーピング遺伝子ＲＮアーゼＰを指向するプライマー組をＲＴ－ＬＡＭＰ反応混合物中に含ませた。
使用した試薬は凍結乾燥形態で提供され、手作業による作業者過誤の根源を減らした。
結果
陰性対照（ＮＴＣ）については、終点（ｔ＝５分）で測定された蛍光（ＩＦ）と試験開始時（ｔ＝０分）の蛍光との間で比率値を算出した。
陰性対照（ＮＴＣ）については、終点（ｔ＝５分）で測定された蛍光（ＩＦ）と試験開始時（ｔ＝０分）の蛍光との間で比率値を算出した。
陽性対照及び臨床試料については、終点（ｔ＝５分）で測定された試料反応の蛍光（ＩＦ）と、対応する有効陰性鋳型対照反応の５分での蛍光測定値との間で比率値を算出した。
対照及び試料の比率値が算出された時点で、対照アッセイのための以下の基準に従って結果を算出した：
この実施例において、未知の臨床試料について陽性試料は２．５以上の比率値を有する（ｔ＝５分において試料反応と陰性対照反応との間での蛍光発光の増大が最低でも２．５倍になる）であろう。
この実施例において、陰性試料は２．５以下の比率値を有する（ｔ＝５分において試料反応と陰性対照反応との間での蛍光発光の増大が２．５倍未満になる）であろう。陰性結果を裏付けるには、ＲＮアーゼＰが２．５以上の値（ｔ＝５分において試料反応と陰性対照反応との間での蛍光発光の増大）を有することが予期されよう。
性能評価－分析感度、検出限界
検出限界（ＬｏＤ）試験は、少なくとも９５％の確率で検出できるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の最低濃度（ゲノムコピー（ｃｐ）／μＬ投入量）を確立した。
検出限界（ＬｏＤ）試験は、少なくとも９５％の確率で検出できるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の最低濃度（ゲノムコピー（ｃｐ）／μＬ投入量）を確立した。
ＬｏＤを決定するために、全不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の段階希釈液を、陰性鼻腔マトリックスを含んだ溶解用緩衝液に混入させ、上記手順に従って処理した。
ＬｏＤは、３つの異なる希釈液（２５コピー／μｌ、１２．５コピー／μｌ、６．１２５コピー／μｌ）を３（５）反復で試験することによって決定され、３／３反復が陽性となった最低濃度（２５コピー／μｌ）に対応していた。この予備的ＬｏＤ（２５コピー／μｌ）は２０反復で確認された。ＬｏＤは、少なくとも２０／２０反復が標的に対して陽性となった最低濃度であった。
ＬｏＤは、検出率１００％（２０／２０）となった２５コピー／μＬにおいて確認された。結果を以下の表にまとめる。
性能評価－分析感度、包含性
包含性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイプライマー及びｇＲＮＡを、２０２０年５月１６日現在にＧＩＳＡＩＤで利用できる４７０３個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のアライメントと比較することによって実証された。データセットは、全ゲノム配列（２９０００ｂｐ超）のみを考慮すること、ならびに（Ｎの）配列決定データが曖昧であり動物に由来している低質な配列を除去することによってさらに絞り込まれた。このｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ解析は、利用されたそのプライマー及びｇＲＮＡ配列全体が、流布しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全ての利用可能な配列との１００％の相同性を有することを示していた。
包含性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイプライマー及びｇＲＮＡを、２０２０年５月１６日現在にＧＩＳＡＩＤで利用できる４７０３個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列のアライメントと比較することによって実証された。データセットは、全ゲノム配列（２９０００ｂｐ超）のみを考慮すること、ならびに（Ｎの）配列決定データが曖昧であり動物に由来している低質な配列を除去することによってさらに絞り込まれた。このｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ解析は、利用されたそのプライマー及びｇＲＮＡ配列全体が、流布しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全ての利用可能な配列との１００％の相同性を有することを示していた。
性能評価－分析特異性
アッセイ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特異的検出のために設計された一組のプライマー及びｇＲＮＡに基づいていた。
アッセイ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特異的検出のために設計された一組のプライマー及びｇＲＮＡに基づいていた。
分析特異性を評価するために、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔツールを使用するｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ解析をまず実施して、プライマー／ｇＲＮＡ配列のいずれかと呼吸器の正常及び病原性生物との間に潜在的な交差反応性が何ら存在しないことを確認した。
結果を表１８にまとめる。
これらの結果は、ごく少数の微生物がそれらのゲノム配列と、アッセイに含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーまたはｇＲＮＡの少なくとも１つとの間に８０％を上回る相同性を有することを示していた。
ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ評価を裏付けるために、同じ病原体を試験管内で潜在的交差反応性及び干渉の両方について調べた。
合計２２種の病原体に関する分析は、ゲノムＤＮＡ／ＲＮＡか不活化株かのどちらかを表１９に示す濃度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陰性溶解試料中に混入させることによって実施され、本明細書に記載のアッセイを用いて試験された。各病原体を３反復で試験した。いかなる偽陰性結果も切り捨てるために、各試料に対してＲＮアーゼＰアッセイを並行して行った。
キットに含まれていたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーまたはｇＲＮＡのどちらかとの８０％を上回る相同性を示した微生物に対しては、干渉分析による評価も行った。いかなる潜在的干渉も検出するために、３倍のＬｏＤのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（７５ｃｐ／μｌ）の存在下で交差反応性試験に用いたのと同じプロトコールに倣うことによって分析を実施した。
試験した病原体についての全ての陰性結果は、ＲＮアーゼＰアッセイでの陽性結果によって裏付けられた。
結論として、ｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ解析及び試験管内分析に基づけば、アッセイに含まれるプライマー／ｇＲＮＡと呼吸器内の最も一般的な病原体との間には交差反応性も干渉もないことが予期された。
臨床評価
上気道感染症の兆候及び症候を有する成人男女患者からの臨床試料としての鼻咽頭スワブを使用して、アッセイの臨床評価を実施した。
上気道感染症の兆候及び症候を有する成人男女患者からの臨床試料としての鼻咽頭スワブを使用して、アッセイの臨床評価を実施した。
性能を評価するために合計で４７個の陽性試料及び４３個の陰性試料を採取した。全ての試料に、比較方法としてＲＴ－ＰＣＲ検査を用いた試験も行って、陽性及び陰性一致パーセント値を得た。結果は表２０に示されており、対照方法との９７．９％の陽性一致パーセント（ＰＰＡ）及び１００％の陰性一致パーセント（ＮＰＡ）を示している。
図２０は、切断活性の３０～６０分後にＣａｓ１２ｐのバックグラウンド信号が最小限に抑えられていることを示す。これは、低いウイルス濃度で利点をもたらすものであり、凍結乾燥形態の安定性を示唆している。図２１は、室温でＣａｓ１２ｐを使用した診断アッセイが紙形式で読み出され得ることを示す。図２２は、室温でＣａｓ１２ｐを使用した診断アッセイがウェルプレートにおいて蛍光検出器で読まれ得ることを示す。
実施例１２：Ｃａｓ１２ｐ及びＲＮＡガイドを使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出
ＲＮＡ系レポーターを有する凍結乾燥ビーズを使用して患者及び対照試料においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出した。実施例１１に記載の試料のサブセットをこの実施例のために使用した。Ｃａｓ１２ｐをその各々のｓｇＲＮＡと前インキュベートし、標識ＲＮＡレポーターを加えた後、凍結乾燥プロセスを行った。前増幅されたＲＴ－ＬＡＭＰ生成物を投入物として使用した。ＲＴ－ＬＡＭＰ反応のための投入物は、患者及び陰性対照の鼻咽頭スワブからの溶解試料であった。図１９は、Ｃａｓ１２ｐ／ガイド複合体を使用し、ＲＮＡレポーターを使用して試料からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのワークフローを示す。図２４は、Ｃａｓ１２ｐ及びＲＮＡレポーターを使用して凍結乾燥形態の患者試料及び陰性対照試料から３７℃で３０分でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出した結果を示す（ｎ＝１６）。
ＲＮＡ系レポーターを有する凍結乾燥ビーズを使用して患者及び対照試料においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを検出した。実施例１１に記載の試料のサブセットをこの実施例のために使用した。Ｃａｓ１２ｐをその各々のｓｇＲＮＡと前インキュベートし、標識ＲＮＡレポーターを加えた後、凍結乾燥プロセスを行った。前増幅されたＲＴ－ＬＡＭＰ生成物を投入物として使用した。ＲＴ－ＬＡＭＰ反応のための投入物は、患者及び陰性対照の鼻咽頭スワブからの溶解試料であった。図１９は、Ｃａｓ１２ｐ／ガイド複合体を使用し、ＲＮＡレポーターを使用して試料からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのワークフローを示す。図２４は、Ｃａｓ１２ｐ及びＲＮＡレポーターを使用して凍結乾燥形態の患者試料及び陰性対照試料から３７℃で３０分でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出した結果を示す（ｎ＝１６）。
実施例１３：特異的切断活性の試験
図２５：本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐがそのガイドと複合化したときにｄｓＤＮＡを切断できるか否かを調査した。これらの例において、標的は、Ｐｒｏｍｅｇａから市販されているｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙベクター（カタログ番号Ａ１３６０）にクローニングされたハンタウイルスｄｓＤＮＡ配列（１００ｐｂ）であった。陰性対照は、空のｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙベクターを含むものであった。陽性対照は、ｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙベクター／ＮＥＢからのＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（カタログ番号Ｒ０１１１Ｌ）による切断によって線形化されたハンタｄｓＤＮＡ標的を含むものであった。手順は以下のとおりであった：市販のＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）２．１（カタログ番号Ｂ７２０２Ｓ）の中で１００ｎＭのＣａｓ１２ａ．１またはＣａｓ１２ｐを室温で１５分間、ハンタ配列を指向する１００ｎＭのｓｇＲＮＡと複合化させた。ガイドと複合化していないＣａｓ酵素を有する対照を含めた。次に、５ｎｇ／ｕＬの標的を加えて２０ｕＬの終反応体積とした。反応物を３７℃または２５℃で０、３０、６０または９０分間インキュベートし、５０ｍＭのＥＤＴＡの添加によって停止した。その後、試料を１２０００ｇで１０分間にわたって遠心分離に掛け、ＮＥＢからの６Ｘ Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ（カタログ番号Ｂ７０２４Ｓ）と混合した。試料を０．８％ＴＢＥ－アガロースゲルで分析した。ＮＥＢからのＦａｓｔ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（カタログ番号Ｎ３２３８Ｓ）を使用して種の分子量を評価した。電気泳動後にゲルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳＹＢＲ（商標）Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（カタログ番号Ｓ１１４９４）の新鮮な溶液で３０分間染色し、ＶｅｒｓａＤｏｃ（商標）撮像システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で撮像した。図１はアッセイの結果を示す。Ｃａｓ１２ａ．１は３７℃で９０分後にプラスミド全体を線形化することができた一方、Ｃａｓ１２ｐは同等の結果をもたらすのに６０分しか続かなかった。
図２５：本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐがそのガイドと複合化したときにｄｓＤＮＡを切断できるか否かを調査した。これらの例において、標的は、Ｐｒｏｍｅｇａから市販されているｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙベクター（カタログ番号Ａ１３６０）にクローニングされたハンタウイルスｄｓＤＮＡ配列（１００ｐｂ）であった。陰性対照は、空のｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙベクターを含むものであった。陽性対照は、ｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙベクター／ＮＥＢからのＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（カタログ番号Ｒ０１１１Ｌ）による切断によって線形化されたハンタｄｓＤＮＡ標的を含むものであった。手順は以下のとおりであった：市販のＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）２．１（カタログ番号Ｂ７２０２Ｓ）の中で１００ｎＭのＣａｓ１２ａ．１またはＣａｓ１２ｐを室温で１５分間、ハンタ配列を指向する１００ｎＭのｓｇＲＮＡと複合化させた。ガイドと複合化していないＣａｓ酵素を有する対照を含めた。次に、５ｎｇ／ｕＬの標的を加えて２０ｕＬの終反応体積とした。反応物を３７℃または２５℃で０、３０、６０または９０分間インキュベートし、５０ｍＭのＥＤＴＡの添加によって停止した。その後、試料を１２０００ｇで１０分間にわたって遠心分離に掛け、ＮＥＢからの６Ｘ Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ（カタログ番号Ｂ７０２４Ｓ）と混合した。試料を０．８％ＴＢＥ－アガロースゲルで分析した。ＮＥＢからのＦａｓｔ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（カタログ番号Ｎ３２３８Ｓ）を使用して種の分子量を評価した。電気泳動後にゲルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳＹＢＲ（商標）Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（カタログ番号Ｓ１１４９４）の新鮮な溶液で３０分間染色し、ＶｅｒｓａＤｏｃ（商標）撮像システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で撮像した。図１はアッセイの結果を示す。Ｃａｓ１２ａ．１は３７℃で９０分後にプラスミド全体を線形化することができた一方、Ｃａｓ１２ｐは同等の結果をもたらすのに６０分しか続かなかった。
図２６：本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐがそのガイドと複合化したときにｓｓＤＮＡを切断できるか否かを調査した。これらの例において、標的は、ハンタウイルスを指向する、ＩＤＴからの特別注文の７０ヌクレオチドの長さのｓｓＤＮＡ蛍光標示配列（３’ＦＡＭ－ｓｓＤＮＡ）（５’－ＴＣＡ ＴＴＴ ＡＧＡ ＡＡＧ ＴＡＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＴＴ ＡＧＣ ＧＡＡ ＡＧＣ ＣＡＡ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＧＣ ＴＧＣ ＣＡＣ ＴＧＡ ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＧＴ Ｔ－３’－６－ＦＡＭ、配列番号１２４）からなるものであった。陰性対照は、同じくハンタウイルスを指向する、ＩＤＴからの特別注文の１２０ヌクレオチドの長さのアンチセンスｓｓＤＮＡ配列（ＡＳｓｓＤＮＡ）（５’－ＧＣＴ ＡＴＣ ＴＴＡ ＡＴＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＣＴＡ ＴＣＣ ＴＣＡ ＡＡＣ ＧＴＴ ＣＴＡ ＴＴＡ ＡＴＧ ＧＣＣ ＧＴＧ ＴＣＡ ＡＴＣ ＡＡＴ ＡＴＣ ＴＡＣ ＴＴＴ ＣＴＡ ＡＡＴ ＧＡＡ ＡＣＴ ＴＴＴ ＡＣＡ ＴＣＡ ＧＴＧ ＧＣＡ ＧＣＴ ＣＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＴＴＣ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＴＣ－３’、配列番号１２５）を含んでいた。手順は以下のとおりであった：市販のＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）２．１（カタログ番号Ｂ７２０２Ｓ）の中で１０ｐｍｏｌのＣａｓ１２ａ．１またはＣａｓ１２ｐを室温で１５分間、ハンタ配列を指向する１０ｐｍｏｌのｓｇＲＮＡと複合化させた。ガイドと複合化していないＣａｓ酵素を有する対照を含めた。次に、１０ｐｍｏｌの３’ＦＡＭ－ｓｓＤＮＡあるいはＡＳｓｓＤＮＡを加えて１０ｕＬの終反応体積とした。反応物を３７℃で０、０．５、１または５分間インキュベートし、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの２Ｘ Ｎｏｖｅｘ（商標）ＴＢＥ－Ｕｒｅａ試料用緩衝液（カタログ番号ＬＣ６８７６）の添加及びその後の９５℃で３分間の加熱によって停止した。試料を１２０００ｇで１０分間にわたって遠心分離に掛け、Ｂｉｏ－Ｒａｄからの１５％Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＢＥ－Ｕｒｅａ Ｇｅｌ（カタログ番号４５６６０５６）で分析した。ＩＤＴからのオリゴ長標準（カタログ番号５１－０５－１５－０２）を使用して種の分子量を評価した。ゲルをまずＶｅｒｓａＤｏｃ（商標）撮像システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で撮像し、次いで、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳＹＢＲ（商標）Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（カタログ番号Ｓ１１４９４）の新鮮な溶液で３０分間染色して、ＡＳｓｓＤＮＡの非蛍光標示配列、及び非蛍光標示ラダーを可視化した。図２はアッセイの結果を示す。Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐは、約４０ヌクレオチドの長さの生成物（Ｐ）の生成を伴う３’ＦＡＭ－ｓｓＤＮＡ基質（Ｓ）の特異的ｓｓＤＮＡ切断を実証した。２つのＣａｓ酵素はＡＳｓｓＤＮＡ配列（ＮＴＣ）を切断することができなかった。反応は数秒～数分の時間枠内で起こった。
図２７：本開示のＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐがそのガイドと複合化したときにｓｓＲＮＡを切断できるか否かを調査した。これらの例において、標的は、ハンタウイルスを指向する、試験管内での転写（ＩＶＴ）によって得られたｓｓＲＮＡ配列からなるものであった。陰性対照は、ＩＤＴからの特別注文の６５ヌクレオチドの長さの非標的ｓｓＲＮＡ配列（５’－ＴＡＡ ＧＣＧ ＣＣＣ ＴＴＧ ＣＧＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＣＡＧ ＣＣＴ ＴＣＧ ＧＧＴ ＴＧＧ ＴＴＧ ＣＣＴ ＴＴＴ ＡＧＴ ＧＣＡ ＡＧＧ ＧＣＧ ＣＧＡ ＴＴＡ ＴＴ－３’、配列番号１２６）を含んでいた。陽性対照は、ハンタウイルスを指向する、ＩＤＴからの特別注文の１２０ヌクレオチドの長さのｓｓＤＮＡ配列（５’－ＧＡＴ ＴＴＴ ＡＧＣ ＧＡＡ ＡＧＣ ＣＡＡ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＧＣ ＴＧＣ ＣＡＣ ＴＧＡ ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＧＴ ＴＴＣ ＡＴＴ ＴＡＧ ＡＡＡ ＧＴＡ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＣＡＣ ＧＧＣ ＣＡＴ ＴＡＡ ＴＡＧ ＡＡＣ ＧＴＴ ＴＧＡ ＧＧＡ ＴＡＧ ＡＴＴ ＡＡＧ ＧＡＴ ＴＡＡ ＧＡＴ ＡＧＣ－３’、配列番号１２７）を含んでいた。手順は以下のとおりであった：市販のＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）２．１（カタログ番号Ｂ７２０２Ｓ）の中で１５０ｎＭのＣａｓ１２ａ．１またはＣａｓ１２ｐを室温で１５分間、ハンタ配列を指向する１５０ｎＭのｓｇＲＮＡと複合化させた。ガイドと複合化していないＣａｓ酵素を有する対照を含めた。次に、５ｎｇ／ｕＬのｓｓＲＮＡあるいは非標的ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡを加えて１０ｕＬの終反応体積とした。反応物を３７℃で０、１または３時間インキュベートし、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの２Ｘ Ｎｏｖｅｘ（商標）ＴＢＥ－Ｕｒｅａ試料用緩衝液（カタログ番号ＬＣ６８７６）の添加及びその後の６５℃で３分間の加熱によって停止した。試料を１２０００ｇで１０分間にわたって遠心分離に掛け、Ｂｉｏ－Ｒａｄからの１５％Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＢＥ－Ｕｒｅａ Ｇｅｌ（カタログ番号４５６６０５６）で分析した。ＮＥＢからのＬｏｗ Ｒａｎｇｅ ｓｓＲＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（カタログ番号Ｎ０３６４Ｓ）を使用して種の分子量を評価した。ゲルをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＳＹＢＲ（商標）Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（カタログ番号Ｓ１１４９４）の新鮮な溶液で３０分間染色し、ＶｅｒｓａＤｏｃ（商標）撮像システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で撮像した。図３はアッセイの結果を示す。Ｃａｓ１２ａ．１もＣａｓ１２ｐも、特異的ｓｓＲＮＡ切断活性を示さなかった。
実施例１４：Ｃａｓ１２ｐの非特異的ヌクレアーゼ活性の特性評価
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ実験の説明：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）を採用して、Ｃａｓ１２ｐ酵素の非特異的ヌクレアーゼ活性によって生成する生成物を追跡評価した。最低限の長さを確保し、存在し得る加水分解生成物の数を最小限に抑えるために、保護されたＤＮＡ（Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＴＡＴＴ、配列番号１２８）及びＲＮＡ（ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＵｒＵｒＡｒＵｒＵ、配列番号１２９）レポーターを使用した。Ｃ及びｒＣ塩基上の記号（＊）は、ヌクレアーゼ分解に対して耐性であるホスホロチオエート結合の存在を表す。対応するレポーターとのＣＲＩＳＰＲ反応は、１×の結合用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００ｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．９）を含有する溶液において複合体を７５ｎＭのＣａｓ１２ｐ：７５ｎＭのｓｇＲＮＡ：２０ｎＭの活性化剤：２．５ｕＭのＤＮＡレポーター、または７５ｎＭのＣａｓ１２ｐ：７５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤：１．２５ｕＭのＲＮＡレポーターの終濃度にして実施された。反応物を、ＤＮＡレポーターについては２５℃で１時間、またはＲＮＡレポーターについては３７℃で６時間にわたってインキュベートした（反応のＴ１、図２８及び図３０）。レポーター添加前にＣｒｉｓｐｒ反応物を加熱することによって陰性対照として反応物の時間ゼロ（Ｔ０、図２９及び図３１）を作った。反応物を精製し、スタンフォード大学のＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）－Ｖｏｙａｇｅｒ－ＤＥ ＲＰ－ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析計で分析した。各反応物について、Ｊｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１２によって提案されたような、あり得る全てのＤＮＡ／ＲＮＡ切断生成物及び予期される全てのオーバーハングの予測ｍ／ｚ（質量対電荷比率）を用いて一覧表を作成した。実測ｍ／ｚは、Ｐｅｒｌスクリプトの使用によって上記一覧表と関係付けられた。反応の主たる信号に対するピークの相対強度を算出した。ＤＮＡレポーター加水分解は独特な切断生成物（図２８）をもたらした一方、ＲＮＡレポーターの加水分解は、３’のヒドロキシド及びホスフェート末端を両方とも含む複数の断片を生成した（図３０）。全ての場合において、主たる加水分解種は、保護された配列の後にある２つのヌクレオチド、及び３’ヒドロキシド末端を含有するものであった。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ実験の説明：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）を採用して、Ｃａｓ１２ｐ酵素の非特異的ヌクレアーゼ活性によって生成する生成物を追跡評価した。最低限の長さを確保し、存在し得る加水分解生成物の数を最小限に抑えるために、保護されたＤＮＡ（Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＴＡＴＴ、配列番号１２８）及びＲＮＡ（ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＣ＊ｒＵｒＵｒＡｒＵｒＵ、配列番号１２９）レポーターを使用した。Ｃ及びｒＣ塩基上の記号（＊）は、ヌクレアーゼ分解に対して耐性であるホスホロチオエート結合の存在を表す。対応するレポーターとのＣＲＩＳＰＲ反応は、１×の結合用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００ｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．９）を含有する溶液において複合体を７５ｎＭのＣａｓ１２ｐ：７５ｎＭのｓｇＲＮＡ：２０ｎＭの活性化剤：２．５ｕＭのＤＮＡレポーター、または７５ｎＭのＣａｓ１２ｐ：７５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤：１．２５ｕＭのＲＮＡレポーターの終濃度にして実施された。反応物を、ＤＮＡレポーターについては２５℃で１時間、またはＲＮＡレポーターについては３７℃で６時間にわたってインキュベートした（反応のＴ１、図２８及び図３０）。レポーター添加前にＣｒｉｓｐｒ反応物を加熱することによって陰性対照として反応物の時間ゼロ（Ｔ０、図２９及び図３１）を作った。反応物を精製し、スタンフォード大学のＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）－Ｖｏｙａｇｅｒ－ＤＥ ＲＰ－ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析計で分析した。各反応物について、Ｊｏｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１２によって提案されたような、あり得る全てのＤＮＡ／ＲＮＡ切断生成物及び予期される全てのオーバーハングの予測ｍ／ｚ（質量対電荷比率）を用いて一覧表を作成した。実測ｍ／ｚは、Ｐｅｒｌスクリプトの使用によって上記一覧表と関係付けられた。反応の主たる信号に対するピークの相対強度を算出した。ＤＮＡレポーター加水分解は独特な切断生成物（図２８）をもたらした一方、ＲＮＡレポーターの加水分解は、３’のヒドロキシド及びホスフェート末端を両方とも含む複数の断片を生成した（図３０）。全ての場合において、主たる加水分解種は、保護された配列の後にある２つのヌクレオチド、及び３’ヒドロキシド末端を含有するものであった。
図２８～２９は、レポーターとしてオリゴＤＮＡを使用したＣａｓ１２ｐ反応のマススペクトルデータを示す。図３０～３１は、レポーターとしてオリゴＲＮＡを使用したＣａｓ１２ｐ反応のマススペクトルデータを示す。
実施例１５：キメラ（ハイブリッド）ガイドの使用の特性評価
部分的にＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドからなっているガイド配列（ハイブリッドガイド、キメラガイド）を試験し、それらが効率的な付帯的Ｃａｓ１２ｐ活性を支援できることを見定めた。ｓｇＲＮＡの３’でのＤＮＡヌクレオチドによる部分的置換え（Ｈｙｂｒｉｄ４ＤＮＡ、５’ＡＧＡＵＵＵＣＵＡＣＵＵＵＵＧＵＡＧＡＵＧＵＧＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＡＵ（ＴＧＧＣ）３’、配列番号１３０）、または５’及び３’の両方でのＤＮＡヌクレオチドによる置換え（Ｈｙｂｒｉｄ３／４ＤＮＡ、５’（ＡＧＡ）ＵＵＵＣＵＡＣＵＵＵＵＧＵＡＧＡＵ ＧＵＧＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＡＵ（ＴＧＧＣ）３’、配列番号１３１）は、非改変型ガイド配列（ｓｇＲＮＡ、５’ＡＧＡＵＵＵＣＵＡＣＵＵＵＵＧＵＡＧＡＵ ＧＵＧＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＡＵＵＧＧＣ３’、配列番号１３２）と比較してその活性を維持した。３’での８ＤＮＡヌクレオチドの部分的置換えは、Ｃａｓ１２ｐの付帯的切断活性の完全な欠損をもたらした（Ｈｙｂｒｉｄ８ＤＮＡ、５’ＡＧＡＵＵＵＣＵＡＣＵＵＵＵＧＵＡＧＡＵ ＧＵＧＧＣＡＧＣＵＣＡＡ（ＡＡＡＴＴＧＧＣ）３’、配列番号１３３）。
部分的にＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドからなっているガイド配列（ハイブリッドガイド、キメラガイド）を試験し、それらが効率的な付帯的Ｃａｓ１２ｐ活性を支援できることを見定めた。ｓｇＲＮＡの３’でのＤＮＡヌクレオチドによる部分的置換え（Ｈｙｂｒｉｄ４ＤＮＡ、５’ＡＧＡＵＵＵＣＵＡＣＵＵＵＵＧＵＡＧＡＵＧＵＧＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＡＵ（ＴＧＧＣ）３’、配列番号１３０）、または５’及び３’の両方でのＤＮＡヌクレオチドによる置換え（Ｈｙｂｒｉｄ３／４ＤＮＡ、５’（ＡＧＡ）ＵＵＵＣＵＡＣＵＵＵＵＧＵＡＧＡＵ ＧＵＧＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＡＵ（ＴＧＧＣ）３’、配列番号１３１）は、非改変型ガイド配列（ｓｇＲＮＡ、５’ＡＧＡＵＵＵＣＵＡＣＵＵＵＵＧＵＡＧＡＵ ＧＵＧＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＡＵＵＧＧＣ３’、配列番号１３２）と比較してその活性を維持した。３’での８ＤＮＡヌクレオチドの部分的置換えは、Ｃａｓ１２ｐの付帯的切断活性の完全な欠損をもたらした（Ｈｙｂｒｉｄ８ＤＮＡ、５’ＡＧＡＵＵＵＣＵＡＣＵＵＵＵＧＵＡＧＡＵ ＧＵＧＧＣＡＧＣＵＣＡＡ（ＡＡＡＴＴＧＧＣ）３’、配列番号１３３）。
Ｃａｓ１２ｐをその各々のｓｇＲＮＡまたはハイブリッドガイドと前インキュベートした（１ｕＭの複合体）。４０μｌの反応物質の中に１×の結合用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００ｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．９）及び６００ｎＭのＴＴＡＴＴＡＴＴ ｓｓＤＮＡ ＦＱレポーター（配列番号１２１）基質を含有する溶液においてＣａｓ１２ｐ複合体を３７．５ｎＭのＣａｓ１２ｐ：３７．５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤の終濃度に希釈することによって反応を開始した。反応物質（４０μｌ、３８４ウェルマイクロプレート形式）を蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２）内で、１分ごとに蛍光測定を行いつつ４０分間にわたって２５℃でインキュベートした（ｓｓＤＮＡ ＦＱ基質＝λｅｘ：４８５ｎｍ、λｅｍ：５３８ｎｍ）。結果は、３０分後に発生した最大蛍光信号の定量を示した。鋳型なしの陰性対照（ＮＴＣ）の蛍光値は、標的プラスミドの非存在下で行われた反応から算出された。エラーバーは平均±標準偏差を表し、ｎ＝３反復である。
図３２は、使用されたＤＮＡ－ＲＮＡキメラガイドが効率的な付帯的Ｃａｓ１２ｐ活性を可能にすることを示している。
実施例１６：付帯的切断活性の特性評価
図３３は、以下の基質を使用したＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐタンパク質／ガイド複合体の付帯的活性を示しているアガロースゲルを示す：（Ａ）Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（カタログ番号Ｎ４０４０Ｓ、ＮＥＢ）、及び（Ｂ）Ｍ１３ｍｐ１８ ＲＦ Ｉ二本鎖ＤＮＡ（カタログ番号Ｎ４０１８Ｓ、ＮＥＢ）。Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐは付帯的活性及びｓｓＤＮＡ環状ＤＮＡの切断を呈するが（図３３、パネルＡ）、ｄｓＤＮＡ環状ＤＮＡについてはそうでない（図３３、パネルＢ）。１×の結合用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００ｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．９）及び１ｕＬのＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（カタログ番号Ｎ４０４０Ｓ、ＮＥＢ）及びＭ１３ｍｐ１８ ＲＦ Ｉ二本鎖ＤＮＡ（カタログ番号Ｎ４０１８Ｓ、ＮＥＢ）を含有する溶液においてＣａｓ１２ｐ／ガイド、またはＣａｓ１２ａ．１／ガイド複合体を３７．５ｎＭのＣａｓ１２ｐ：３７．５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤、または７５ｎＭのＣａｓ１２ａ．１：７５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤の終濃度に希釈することによって２５℃で１時間にわたる反応を開始した。Ｃａｓ酵素、ガイドまたは活性化剤を含まない対照群を含め、非付帯的切断を観察した。
図３３は、以下の基質を使用したＣａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐタンパク質／ガイド複合体の付帯的活性を示しているアガロースゲルを示す：（Ａ）Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（カタログ番号Ｎ４０４０Ｓ、ＮＥＢ）、及び（Ｂ）Ｍ１３ｍｐ１８ ＲＦ Ｉ二本鎖ＤＮＡ（カタログ番号Ｎ４０１８Ｓ、ＮＥＢ）。Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐは付帯的活性及びｓｓＤＮＡ環状ＤＮＡの切断を呈するが（図３３、パネルＡ）、ｄｓＤＮＡ環状ＤＮＡについてはそうでない（図３３、パネルＢ）。１×の結合用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００ｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．９）及び１ｕＬのＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（カタログ番号Ｎ４０４０Ｓ、ＮＥＢ）及びＭ１３ｍｐ１８ ＲＦ Ｉ二本鎖ＤＮＡ（カタログ番号Ｎ４０１８Ｓ、ＮＥＢ）を含有する溶液においてＣａｓ１２ｐ／ガイド、またはＣａｓ１２ａ．１／ガイド複合体を３７．５ｎＭのＣａｓ１２ｐ：３７．５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤、または７５ｎＭのＣａｓ１２ａ．１：７５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤の終濃度に希釈することによって２５℃で１時間にわたる反応を開始した。Ｃａｓ酵素、ガイドまたは活性化剤を含まない対照群を含め、非付帯的切断を観察した。
切断効率 Ｃａｓ１２ｐは少なくともＴ、ＡまたはＣホモポリマーレポーター（長さ７ｎｔ）について同程度の切断効率を示し、これに対し、Ｃａｓ１２ａ．１は、ポリＣ切断においてより高い効率を示したが、ポリＡ及びポリＴ配列も切断した。Ｃａｓ１２ｐは蛍光の増加を証拠としてＡまたはＣホモポリマーレポーターに対して２５℃で切断を呈したが、Ｃａｓ１２ａ．１は５’６－ＦＡＭ－ＴＴＡＴＴＡＴＴ－３ＩＡＢｋＦＱ３’レポーター配列（配列番号１２１）に対して３７℃で切断応答を示したにすぎなかった。
４０μｌの反応物質の中に１×の結合用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００ｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．９）、及び６００ｎＭのｓｓＤＮＡ ＦＱレポーター基質（ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）からの５’６－ＦＡＭ－ＴＴＡＴＴＡＴＴ－３ＩＡＢｋＦＱ３’（配列番号１２１）、５’６－ＦＡＭ－ＡＡＡＡＡＡＡ－３ＩＡＢｋＦＱ３’、５’６－ＦＡＭ－ＴＴＴＴＴＴＴ－３ＩＡＢｋＦＱ３’、５’６－ＦＡＭ－ＣＣＣＣＣＣＣ－３ＩＡＢｋＦＱ３’、または５’６－ＦＡＭ－Ｃ＊ＧＧＧＣ＊ＧＧＧ－３ＩＡＢｋＦＱ３’）を含有する溶液においてＣａｓ１２ｐまたはＣａｓ１２ａ．１複合体を３７．５ｎＭのＣａｓ１２ｐ：３７．５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤、または７５ｎＭのＣａｓ１２ａ．１：７５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤の終濃度に希釈することによって反応を開始した。反応物質（４０μｌ、３８４ウェルマイクロプレート形式）を蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２）内で、１分ごとに蛍光測定を行いつつ２５℃または３７℃でインキュベートした（ｓｓＤＮＡ ＦＱ基質＝λｅｘ：４８５ｎｍ、λｅｍ：５３８ｎｍ）。標的プラスミドの非存在下で行われた反応から得られた蛍光値を差し引くことによってバックグラウンド補正蛍光値を算出した。エラーバーは平均±標準偏差を表し、ｎ＝３反復である。図３４は、２５℃及び３７℃でのホモポリマーレポーターの差次的な切断効率を示す。結果は、Ｃａｓ１２ｐがポリＴ、ポリＡ及びポリＣを切断した一方、Ｃａｓ１２ａ．１がポリＣ切断に対する優先傾向を示したことを示している。
ＲＮＡレポーターとしてＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ）からの、特別注文のｓｓＲＮＡ ５’６－ＦＡＭ ｒＡｒＵｒＡｒＵｒＡｒＵｒＡ－３ＩＡＢｋＦＱ３’、及びＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（商標）（市販のＲＮＡレポーター）を使用して、トランス切断活性（付帯的活性）の特異性を試験した。結果は、Ｃａｓ１２ｐは使用されたＲＮＡレポーターを切断できるが、Ｃａｓ１２ａ．１はできないことを示していた。検出アッセイは、４０μｌの反応物質の中に１×の結合用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００ｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．９）及び６００ｎＭのＲＮＡ ＦＡＭＱレポーター基質（ｓｓＲＮＡ ５’６－ＦＡＭ ｒＡｒＵｒＡｒＵｒＡｒＵｒＡ－３ＩＡＢｋＦＱ３、及びＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（Ｃａｔ Ｎ １１－０４－０３－０３－ＩＤＴ）を含有する溶液においてＣａｓ１２ｐまたはＣａｓ１２ａ．１複合体を３７．５ｎＭのＣａｓ１２ｐ：３７．５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤、または７５ｎＭのＣａｓ１２ａ．１：７５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤の終濃度にして３７℃で実施された。反応物質を蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２）内でインキュベートし、標的プラスミドの非存在下で行われた反応から得られた蛍光値を差し引くことによってバックグラウンド補正蛍光値を算出した。エラーバーは平均±標準偏差を表し、ｎ＝３反復である。図３５はこれらのデータの結果を示し、Ｃａｓ１２ａ．１のではないがＣａｓ１２ｐの、ＲＮＡレポーターを切断する付帯的切断能力を示している。
Ｃａｓ１２ｐについて、ＤＮＡ及びＲＮＡレポーターを使用する付帯的切断（トランス切断）活性の速度論を評価した。ＲＮＡ基質を使用した実験は、ｓｓＤＮＡレポーターに比べてたったの３倍しか遅くないｓｓＲＮＡの切断速度を示した。ｓｓＲＮＡ基質に対するＣａｓ１２ａ．１の切断速度はｓｓＤＮＡのときに比べて少なくとも１．１０４倍遅く、ｓｓＤＮＡがＣａｓ１２ａ．１による付帯的切断のために選択される基質であることを裏付けている。検出アッセイは、４０μｌの反応物質の中に１×の結合用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００ｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．９）及び６００ｎＭのｓｓＤＮＡ ＦＡＭＱレポーター基質（ｓｓＤＮＡ ５’６－ＦＡＭ ＴＴＡＴＴＡＴＴ－３ＩＡＢｋＦＱ３（配列番号１２１））またはＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（Ｃａｔ Ｎ １１－０４－０３－０３－ＩＤＴ））を含有する溶液においてＣａｓ１２ｐまたはＣａｓ１２ａ．１複合体を３７．５ｎＭのＣａｓ１２ｐ：３７．５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤、または７５ｎＭのＣａｓ１２ａ．１：７５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤の終濃度にして使用して３７℃で実施された。反応物質を蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２）内で、１分ごとに蛍光測定を行いつつ最大４０分間にわたってインキュベートした（λｅｘ：５３５ｎｍ、λｅｍ：５９５ｎｍ）。標的プラスミドの非存在下で行われた反応から得られた蛍光値を差し引くことによってバックグラウンド補正蛍光値を算出した。得られたデータを、以下の等式：切断割合＝Ａ×（１－ｅｘｐ（－ｋ×ｔ））に従って単一指数関数的減衰曲線に近似し（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）、式中、Ａは曲線の振幅であり、ｋは一次速度定数であり、ｔは時間である。エラーバーは平均±標準偏差を表し、ｎ＝３反復である。図３６はこれらのデータの結果を示し、レポーターとしてＤＮＡ及びＲＮＡを使用したＣａｓ１２ｐ及びＣａｓ１２ａ．１の付帯的切断活性の速度論を示している。
ＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドで構成されたレポーターは効率的な付帯的Ｃａｓ１２ｐ及びＣａｓ１２ａ．１活性をもたらした。ＦＱ Ｈｙｂｒｉｄ／５６－ＦＡＭ／ＴＴ ｒＡｒＵｒＵ ＡＴＴ／３ＩＡＢｋＦＱ／または／５６－ＦＡＭ／ＴＴ ＡＴｒＵ ｒＡｒＵｒＵ／３ＩＡＢｋＦＱ／は、ｓｓＤＮＡまたはＲＮＡレポーター（ｓｓＤＮＡ ＦＡＭＱレポーター基質（ｓｓＤＮＡ ５’６－ＦＡＭ ＴＴＡＴＴＡＴＴ－３ＩＡＢｋＦＱ３（配列番号１２１））、またはＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（Ｃａｔ Ｎ １１－０４－０３－０３－ＩＤＴ）））に比べて維持されたＣａｓ１２ｐ付帯的活性をもたらした。Ｃａｓ１２ａ．１は、ｓｓＤＮＡと比較してキメラレポーターのトランス切断のわずかに低下した効率を示した。４０μｌの反応物質の中に１×の結合用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００ｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．９）及び６００ｎＭのｓｓＤＮＡ ＦＡＭＱレポーター基質（ｓｓＤＮＡ ５’６－ＦＡＭ ＴＴＡＴＴＡＴＴ－３ＩＡＢｋＦＱ３（配列番号１２１）、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラレポーター（／５６－ＦＡＭ／ＴＴ ｒＡｒＵｒＵ ＡＴＴ／３ＩＡＢｋＦＱ／、／５６－ＦＡＭ／ＴＴ ＡＴｒＵ ｒＡｒＵｒＵ／３ＩＡＢｋＦＱ／、またはＲＮａｓｅＡｌｅｒｔ（Ｃａｔ Ｎ １１－０４－０３－０３－ＩＤＴ））を含有する溶液においてＣａｓ１２ｐまたはＣａｓ１２ａ．１複合体を３７．５ｎＭのＣａｓ１２ｐ：３７．５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤、または７５ｎＭのＣａｓ１２ａ．１：７５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤の終濃度に希釈することによって反応を開始した。反応物質を蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２）内で、１分ごとに蛍光測定を行いつつ最大４０分間にわたってインキュベートした（λｅｘ：５３５ｎｍ、λｅｍ：５９５ｎｍ）。標的プラスミドの非存在下で行われた反応から得られた蛍光値を差し引くことによってバックグラウンド補正蛍光値を算出した。エラーバーは平均±標準偏差を表し、ｎ＝３反復である。図３７はこれらのデータの結果を示す。
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、上記は、別記の特許請求の範囲によって画定されるものである本発明の範囲を限定せずに例示することを意図したものである。他の態様、利点及び改変形態は以下の範囲に含まれる。
実施例１７：Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐ成熟ガイドの特性評価及び検証
成熟ガイドの足場配列を、対応するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からｉｎ ｓｉｌｉｃｏで推測した。図３８は、Ｃａｓ１２ａ．１（５’ａａａｕｕｕｃｕａｃｕｇｕａｇｕａｇａｕ３’）（配列番号１１６、パネルＡ）及びＣａｓ１２ｐ（５’ａｇａｕｕｕｃｕａｃｕｕｕｕｇｕａｇａｕ３’）（配列番号１１７、パネルＢ）のための成熟ガイド足場の二次構造を示す。これらを以下で検証した。
成熟ガイドの足場配列を、対応するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からｉｎ ｓｉｌｉｃｏで推測した。図３８は、Ｃａｓ１２ａ．１（５’ａａａｕｕｕｃｕａｃｕｇｕａｇｕａｇａｕ３’）（配列番号１１６、パネルＡ）及びＣａｓ１２ｐ（５’ａｇａｕｕｕｃｕａｃｕｕｕｕｇｕａｇａｕ３’）（配列番号１１７、パネルＢ）のための成熟ガイド足場の二次構造を示す。これらを以下で検証した。
Ｃａｓ１２ａ．１及びＣａｓ１２ｐのための成熟ガイド足場を試験管内で評価した。これらの成熟足場配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスからのＮ遺伝子を標的とするスペーサーと一緒にこの実施例に使用された。４０μｌの反応物質の中に１×の結合用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１００ｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．９）及び６００ｎＭのｓｓＤＮＡ ＦＡＭＱレポーター基質（ｓｓＤＮＡ ５’６－ＦＡＭ ＴＴＡＴＴＡＴＴ－３ＩＡＢｋＦＱ３（配列番号１２１））を含有する溶液においてＣａｓ１２ｐまたはＣａｓ１２ａ．１複合体を３７．５ｎＭのＣａｓ１２ｐ：３７．５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤、または７５ｎＭのＣａｓ１２ａ．１：７５ｎＭのｓｇＲＮＡ：１０ｎＭの活性化剤の終濃度に希釈することによって反応を開始した。反応物質を蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２）内で、１分ごとに蛍光測定を行いつつ最大２０分間にわたってインキュベートした（λｅｘ：５３５ｎｍ、λｅｍ：５９５ｎｍ）。標的プラスミドの非存在下で行われた反応から得られた蛍光値を差し引くことによってバックグラウンド補正蛍光値を算出した。エラーバーは平均±標準偏差を表し、ｎ＝３反復である（図３９）。この図の中のデータは、これらの成熟足場配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＣＲＩＳＰＲ媒介検出を可能にすることを示している。
Claims (122)
- ａ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４タンパク質、または前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、もしくは前記Ｃａｓ９．４タンパク質をコードする核酸と、
ｂ．Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、もしくはＣａｓ９．４ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、もしくは前記Ｃａｓ９．４ ｇＲＮＡをコードする核酸と、
を含むエンジニアリングされたシステムであって、
前記ｇＲＮＡ及び前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、または前記Ｃａｓ９．４タンパク質が、天然には一緒に存在しないものであり、前記ｇＲＮＡが、標的ＤＮＡ中の標的配列にハイブリダイズすることができ、前記ｇＲＮＡが、前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、または前記Ｃａｓ９．４５タンパク質と複合体を形成することができる、
前記エンジニアリングされたシステム。 - ａ．前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、前記Ｃａｓ９．４タンパク質と、
ｂ．前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、または前記Ｃａｓ９．４ ｇＲＮＡと、
を含む、請求項１に記載のシステム。 - ａ．前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、または前記Ｃａｓ９．４タンパク質をコードする核酸と、
ｂ．前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、または前記Ｃａｓ９．４ ｇＲＮＡをコードする核酸と、
を含む、請求項１に記載のシステム。 - 前記ｇＲＮＡが一分子ｇＲＮＡである、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＲＮＡが二分子ｇＲＮＡである、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ９．１タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ９．２タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ９．３タンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ９．４タンパク質が、配列番号１１のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的配列が、表６ａ～６ｆのいずれかに提供される標的の配列である、請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的配列が、ヒトの配列である、請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的配列が、非ヒト霊長類の配列である、請求項１～７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、または前記Ｃａｓ９．４タンパク質が、触媒活性を持ったタンパク質である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、または前記Ｃａｓ９．４タンパク質が、前記標的配列から遠位にある部位で切断する、請求項１３に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、または前記Ｃａｓ９．４タンパク質が、触媒活性を伴わないタンパク質である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、または前記Ｃａｓ９．４タンパク質が、ニッカーゼ活性を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のシステム。
- ａ．クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質と、
ｂ．単一のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、
を含むエンジニアリングされたシステムであって、
前記ｇＲＮＡ及び前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質が、天然には一緒に存在しないものであり、前記ｇＲＮＡが、標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズすることができ、前記ｇＲＮＡが、前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質と複合体を形成することができ、前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質がコラテラル活性を有し、ｔｒａｃｒＲＮＡなしでＲＮＡを含む一本鎖ポリヌクレオチドをコラテラル切断することができる、前記エンジニアリングされたシステム。 - 前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項１７に記載のシステム。
- 前記標的配列が、表６ａ～６ｆのいずれかに提供される標的の配列である、請求項１７～１８のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的配列が、ヒトの配列である、請求項１７～１８のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的配列が、非ヒト霊長類の配列である、請求項１７～１８のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的配列が、細菌またはウイルスの配列である、請求項１７～１８のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質が、一本鎖ＲＮＡをコラテラル切断することができる、請求項１７～２２のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質が、一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをコラテラル切断することができる、請求項１７～２２のいずれか一項に記載のシステム。
- ａ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑタンパク質、または前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、もしくは前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質をコードする核酸と、
ｂ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、もしくはＣａｓ１２ｑ ｇＲＮＡ、または前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、もしくは前記Ｃａｓ１２ｑ ｇＲＮＡをコードする核酸と、
を含むエンジニアリングされたシステムであって、
前記ｇＲＮＡ及び前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質が、天然には一緒に存在しないものであり、前記ｇＲＮＡが、標的ＤＮＡ中の標的配列にハイブリダイズすることができ、前記ｇＲＮＡが、前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質と複合体を形成することができる、前記エンジニアリングされたシステム。 - ａ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質と、
ｂ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑ ｇＲＮＡと、
を含む請求項２５に記載のシステム。 - ａ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質をコードする核酸と、
ｂ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑ ｇＲＮＡをコードする核酸と、
を含む請求項２５に記載のシステム。 - 前記Ｃａｓ１２ａ．１タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ１２ｐタンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質が、配列番号２２２のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質が、配列番号５のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的配列が、表６ａ～６ｆのいずれかに提供される標的の配列である、請求項２５～３１のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的配列が、ヒトの配列である、請求項２５～３１のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的配列が、非ヒト霊長類の配列である、請求項２５～３１のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的配列が、細菌またはウイルスの配列である、請求項２５～３１のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質が、触媒活性を持ったＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質である、請求項２５～３４のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質が、前記標的配列から遠位にある部位で切断する、請求項３６に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質が、触媒活性を伴わないＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質である、請求項２５～３４のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質が、ニッカーゼ活性を含む、請求項２５～３４のいずれか一項に記載のシステム。
- ａ．標的ＤＮＡ中の標的配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列を含むターゲッターＲＮＡと、
ｂ．前記ターゲッターＲＮＡとハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖を形成することができるアクチベーターＲＮＡであって、アクチベーターＲＮＡを含む、前記アクチベーターＲＮＡと、
を含むエンジニアリングされた一分子ｇＲＮＡであって、
前記ターゲッターＲＮＡと前記アクチベーターＲＮＡとが互いに共有結合しており、前記一分子ｇＲＮＡが、Ｃａｓ９．１、Ｃａｓ９．２、Ｃａｓ９．３、またはＣａｓ９．４タンパク質と複合体を形成することができ、前記標的配列への前記スペーサー配列のハイブリダイゼーションが、前記Ｃａｓ９．１、前記Ｃａｓ９．２、前記Ｃａｓ９．３、または前記Ｃａｓ９．４タンパク質を前記標的ＤＮＡに標的化することができる、前記エンジニアリングされた一分子ｇＲＮＡ。 - 前記ターゲッターＲＮＡ及び前記アクチベーターＲＮＡが５’から３’の向きに配置されている、請求項４０に記載のｇＲＮＡ。
- 前記アクチベーターＲＮＡ及び前記ターゲッターＲＮＡが５’から３’の向きに配置されている、請求項４０に記載のｇＲＮＡ。
- 前記ターゲッターＲＮＡ及び前記アクチベーターＲＮＡがリンカーを介して互いに共有結合している、請求項４０～４２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
- 前記一分子ｇＲＮＡが、対応する野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ及び／またはｃｒＲＮＡの配列と比較して、１以上の配列改変を含む、請求項４０～４３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
- 前記ターゲッターＲＮＡが前記標的ＤＮＡの配列に対して１００％の相補性を有する約１０～５０ヌクレオチドのスペーサー配列を含む、請求項４０～４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
- 前記ターゲッターＲＮＡが、前記標的ＤＮＡの配列に対して１００％未満の相補性を有する約１０～５０ヌクレオチドのスペーサー配列を含む、請求項４０～４４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
- 前記標的配列が、表６ａ～６ｆのいずれかに提供される標的の配列である、請求項４０～４６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
- 前記Ｃａｓ９．１タンパク質が、配列番号１の配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項４０～４７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
- 前記Ｃａｓ９．２タンパク質が、配列番号２の配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項４０～４７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
- 前記Ｃａｓ９．３タンパク質が、配列番号１０の配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項４０～４７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
- 前記Ｃａｓ９．４タンパク質が、配列番号１１の配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含む、請求項４０～４７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
- 配列番号１１６または配列番号１１７のスキャフォールド配列と、標的ＤＮＡ中の標的配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列とを含む、エンジニアリングされた一分子ｇＲＮＡ。
- 前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡ、植物ＤＮＡ、菌類ＤＮＡ、または細菌ＤＮＡを含む、請求項５２に記載のｇＲＮＡ。
- 前記標的配列が、表６ａ～６ｆのいずれかに提供される標的の配列である、請求項５２に記載のｇＲＮＡ。
- 前記標的が、コロナウイルスである、請求項５２に記載のｇＲＮＡ。
- 前記標的が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、請求項５２に記載のｇＲＮＡ。
- 前記標的ＤＮＡがｃＤＮＡであり、逆転写により得られる、請求項５２に記載のｇＲＮＡ。
- 標的ＤＮＡを改変する方法であって、前記標的ＤＮＡを、請求項１～３９のいずれか一項に記載のシステムと接触させることを含み、前記ｇＲＮＡが前記標的配列とハイブリダイズし、それにより前記標的ＤＮＡの改変が起こる、前記方法。
- 前記標的ＤＮＡが染色体外ＤＮＡである、請求項５８に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡが染色体の一部である、請求項５８に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏで染色体の一部である、請求項５８に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで染色体の一部である、請求項５８に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡが細胞の外にある、請求項５８に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡが細胞の内部にある、請求項５８に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡが遺伝子及び／またはその制御領域を含む、請求項６４に記載の方法。
- 前記細胞が、古細菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核生物単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻類細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚類細胞、カエル細胞、鳥類細胞、哺乳類細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞からなる群から選択される、請求項６４または６５に記載の方法。
- 前記改変が、前記標的ＤＮＡに二本鎖切断を導入することを含む、請求項５８～６６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触が、非相同末端結合または相同組換え修復を許容する条件下で発生する、請求項５８～６７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触が、前記標的ＤＮＡとドナーポリヌクレオチドであり、前記ドナーポリヌクレオチド、前記ドナーポリヌクレオチドの一部、前記ドナーポリヌクレオチドのコピー、または前記ドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が、前記標的ＤＮＡに組み込まれる、請求項５８～６７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることを含まない、または
前記標的ＤＮＡが、前記標的ＤＮＡ内のヌクレオチドが欠失されるように改変される、請求項５８～６７のいずれか一項に記載の方法。 - 試料中の標的ＤＮＡを検出する方法であって、前記方法が、
ａ．前記試料を、
ｉ．Ｃａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑタンパク質；
ｉｉ．標的ＤＮＡ中の標的配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列を含むＣａｓ１２ａ．１、Ｃａｓ１２ｐ、またはＣａｓ１２ｑ ｇＲＮＡ；及び
ｉｉｉ．前記ｇＲＮＡの前記スペーサー配列とハイブリダイズしない標識されたディテクター
と接触させることと、
ｂ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質による前記標識されたディテクターの切断によって生じる検出可能なシグナルを測定し、それにより前記標的ＤＮＡを検出することと、
を含む、前記方法。 - 前記標識されたディテクターが、標識された一本鎖ＤＮＡを含む、請求項７１に記載の方法。
- 前記標識されたディテクターが、標識されたＲＮＡを含む、請求項７１に記載の方法。
- 前記標識されたＲＮＡが、一本鎖ＲＮＡを含む、請求項７２に記載の方法。
- 前記標識されたディテクターが、標識された一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む、請求項７１に記載の方法。
- 前記標識されたディテクターが、１以上の改変されたヌクレオチドを含む、請求項７１～７５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料を前駆体ｇＲＮＡアレイと接触させることを含み、前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質が前記前駆体ｇＲＮＡアレイを切断して前記ｇＲＮＡを生成する、請求項７１～７６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡが一本鎖である、請求項７１～７７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡが二本鎖である、請求項７１～７８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡ、植物ＤＮＡ、菌類ＤＮＡ、または細菌ＤＮＡである、請求項７１～７９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的配列が、表６ａ～６ｆのいずれかに提供される標的の配列である、請求項８０に記載の方法。
- 前記標的が、コロナウイルスである、請求項８１に記載の方法。
- 前記標的が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである、請求項８２に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡがｃＤＮＡであり、逆転写により得られる、請求項７１～８３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡがヒト細胞由来である、請求項７１～７９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的ＤＮＡがヒト胎児またはがん細胞ＤＮＡである、請求項８５に記載の方法。
- 前記タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含むＣａｓ１２ａ．１である、請求項７１～８６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含むＣａｓ１２ｐである、請求項７１～８６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、配列番号２２２のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含むＣａｓ１２ｐである、請求項７１～８６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、配列番号５のアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％の配列同一性を含むＣａｓ１２ｑである、請求項７１～８６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が細胞溶解物からのＤＮＡを含む、請求項７１～８７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が細胞を含む、請求項７１～８７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、尿、血液、血清、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、鼻咽頭由来、口腔咽頭由来、鼻咽頭／口腔咽頭由来、吸引物、または生検試料である、請求項７１～８７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料中に存在する前記標的ＤＮＡの量を決定することを含む、請求項７１～９３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能なシグナルの測定が、視覚に基づく検出、センサーに基づく検出、色検出、金ナノ粒子に基づく検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学検出、及び半導体ベースセンシングのうちの１つ以上を含む、請求項９４に記載の方法。
- 前記標識されたディテクターが、改変された核酸塩基、改変された糖部分、及び／または改変された核酸結合を含む、請求項７１～９５のいずれか一項に記載の方法。
- 陽性対照試料中の陽性対照標的ＤＮＡを検出することをさらに含み、前記検出が、
ａ．前記陽性対照試料を、
ｉ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質；
ｉｉ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質に結合する領域と、前記陽性対照標的ＤＮＡとハイブリダイズする陽性対照スペーサー配列とを含む陽性対照ｇＲＮＡ；及び
ｉｉｉ．前記陽性対照ｇＲＮＡの前記陽性対照スペーサー配列とハイブリダイズしない標識されたディテクター
と接触させることと、
ｂ．前記Ｃａｓ１２ａ．１、前記Ｃａｓ１２ｐ、または前記Ｃａｓ１２ｑタンパク質による前記標識されたディテクターの切断によって生じる検出可能なシグナルを測定し、それにより前記陽性対照標的ＤＮＡを検出することと、
を含む、請求項７１～９６のいずれか一項に記載の方法。 - 前記検出可能なシグナルが、１５分、３０分、４５分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分、または２４０分未満で検出可能である、請求項７１～９７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料中の前記標的ＤＮＡを、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、分岐（ＲＡＭ）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）、シングルプライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅（ＳＭＡＲＴ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、ゲノム指数関数的増幅（ＧＥＡＲ）、または等温多重置換増幅（ＩＭＤＡ）により増幅することをさらに含む、請求項７１～９８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料中の標的ＤＮＡが１００μＭ未満の濃度で存在する、請求項７１～９９のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号１、２、３、４、５、１０、１１、または２２２に対して７０％～９９．５％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
- 前記タンパク質の前記配列がバイオインフォマティクスにより推定される、請求項１０１に記載のタンパク質。
- 請求項１０１に記載のタンパク質のいずれか、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 請求項１０１に記載のタンパク質のいずれかを含み、任意選択で薬物的に許容される担体、核酸安定化緩衝液、及び／またはタンパク質安定化緩衝液を含む組成物。
- 前記タンパク質が凍結乾燥されており、任意選択で、標識されたディテクター、逆転写酵素、及びループ媒介等温増幅のための試薬のうちの任意の１つ以上をさらに含む、請求項１０１に記載のタンパク質のいずれかを含む組成物。
- 請求項１０１に記載のタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリヌクレオチド。
- 請求項１０６に記載のＤＮＡポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
- 単一の前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１０７に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項１０６～１０８のいずれか一項に記載のＤＮＡポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 請求項１～３９に記載のエンジニアリングされたシステムのいずれか、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 請求項１～３９に記載のエンジニアリングされたシステムのいずれかを含み、任意選択で、核酸安定化緩衝液及び／またはタンパク質安定化緩衝液を含む、組成物。
- 請求項４０～５７に記載の一分子ｇＲＮＡのいずれか、及び任意選択で薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 請求項４０～５１に記載の一分子ｇＲＮＡのいずれか、及び任意選択で、核酸安定化緩衝液及び／またはタンパク質安定化緩衝液を含む、組成物。
- 請求項３，２７に記載の核酸、または請求項４０～５１に記載のｇＲＮＡのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリヌクレオチド。
- 請求項１１４に記載のＤＮＡポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
- 単一の前記ｇＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１１５に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項１１４～１１６のいずれか一項に記載のＤＮＡポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 請求項１～３９に記載のエンジニアリングされたシステムのいずれかの１つ以上の要素を含むキット。
- １つ以上の要素が凍結乾燥されている、請求項１１８に記載のキット。
- 前記１つ以上の要素が、前記Ｃａｓ１２ｐ、標識されたＲＮＡレポーター、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２指向性のｇＲＮＡを含む、請求項１１８～１１９のいずれか一項に記載のキット。
- バイオインフォマティクスベースの方法の使用を含む、メタゲノミクス試料からクラス２のＩＩ型及びクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を単離する方法。
- 前記クラス２のＩＩ型またはクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が、配列番号１、２、３、４、５、１０、１１、及び２２２からなる群から選択される、請求項１２１に記載の方法。
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