KR20210040943A - Crispr 이펙터 시스템 기반 증폭 방법, 시스템, 및 진단 - Google Patents
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Abstract
본원에서 제공되는 것은 표적 이중-가닥 또는 단일-가닥 핵산을 증폭 및/또는 검출하기 위한 방법 및 시스템이다. 방법은 표적 핵산을 포함하는 샘플을 증폭 반응 혼합물과 조합하고, 표적 핵산을 증폭하고, 등온 조건 하에 반복된 열림, 풀림, 어닐링 및 연장에 의해 표적 핵산을 추가로 증폭하는 것을 포함한다. 증폭 반응 혼합물은 증폭 CRISPR 시스템, 헬리카제, 프라이머 쌍, 및 중합효소를 포함할 수 있다. 증폭 CRISPR 시스템은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 포함할 수 있으며, 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체는 제 1 CRISPR/Cas 효소 및 제 1 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 1 가닥으로 가이드하는 제 1 가이드 분자를 포함할 수 있고; 제 2 CRISPR/Cas 복합체는 제 2 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 2 가닥으로 가이드하는 제 2 가이드 분자를 포함할 수 있다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2018년 6월 26일에 출원된 미국 가출원 제 62/690,257 호; 2018년 11월 14일에 출원된 미국 가출원 제 62/767,052 호; 및 2019년 3월 14일에 출원된 미국 가출원 제 62/818,650 호의 우선권을 주장한다. 상기 확인된 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 그 전체가 포함된다.
연방정부 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health) 에 의해 부여되는 허가 번호 MH100706, MH110049 및 HL141201 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
전자 서열 목록에 관한 참조
전자 서열 목록의 내용 ("BROD_2595WP_ST25.txt"; 크기는 11,011 바이트이고 2019년 4월 15 일에 생성되었음) 은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
기술분야
본 명세서에 개시된 주제는 일반적으로 CRISPR 이펙터 시스템의 용도와 관련된 핵산 증폭 방법, 시스템 및 신속한 진단에 관한 것이다.
핵산은 생물학적 정보의 보편적인 특징이다. 휴대용 플랫폼 상에서 높은 감도와 단일-염기 특이도로 핵산을 신속하게 검출하는 능력은 수많은 질환에 대한 진단 및 모니터링을 혁신시키고, 소중한 역학 정보를 제공하며, 일반화할 수 있는 과학 도구로서 역할을 하게 될 잠재력을 갖는다. 많은 방법들이 핵산을 검출하기 위해 개발되었으나 (Du et al., 2017; Green et al., 2014; Kumar et al., 2014; Pardee et al., 2014; Pardee et al., 2016; Urdea et al., 2006), 이들은 부득이하게 감도, 특이도, 간소함, 및 속도 간에 상호 절충을 겪는다. 예를 들어, qPCR 접근법은 민감하지만 값비싸고 복잡한 장비에 의존하여, 실험실 상황에서 고도로 숙련된 작업자에게만 사용성이 제한된다. 핵산 진단이 다양한 의료 적용분야와 관련성이 점차로 증가되고 있으므로, 저비용에서 높은 특이도 및 감도를 제공하는 검출 기술은 임상 및 기초 연구 상황 둘 모두에서 상당한 유용성을 가지게 될 것이다.
다양한 검출 플랫폼으로 많은 핵산 증폭 접근법을 이용할 수 있다. 그 중에서, 급격한 온도 사이클링 및 복잡한 계기 장비 없이 증폭을 위한 등온 핵산 증폭 방법이 개발되었다. 이들 방법은 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), 리콤비나아제 폴리머라아제 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 전위 증폭 (SDA), 헬리카아제-의존적 증폭 (HDA), 또는 닉킹 효소 증폭 반응 (NEAR) 을 포함한다. 그러나, 이러한 등온 증폭 접근법은 초기 변성 단계 및 여러 세트의 프라이머를 여전히 필요로 할 수 있다. 또한, 휴대용 플랫폼과 등온 핵산 증폭을 조합하는 신규한 접근법 (Du et al., 2017; Pardee et al., 2016) 은 현장 진단 (POC) 상황에서 높은 검출 특이도를 제공하지만, 어느 정도 낮은 감도로 인해 제한된 적용성을 갖는다.
한 양태에서, 본 발명은 표적 이중 가닥 핵산 서열을 증폭 및/또는 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 표적 이중 가닥 핵산을 포함하는 샘플을 증폭 반응 혼합물과 조합하는 단계, (b) 표적 핵산을 증폭하는 단계, 및 (c) 등온 조건 하에 반복된 열림, 풀림, 어닐링 및 연장에 의해 표적 핵산을 추가로 증폭하는 단계를 포함한다. 방법은 선택적으로 표적 핵산을 검출하는 단계를 포함한다.
증폭 반응 혼합물은 (i) 증폭 CRISPR 시스템, (ii) 헬리카제, (iii) 제 1 및 제 2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍, 및 (iv) 중합 효소를 포함할 수 있다. 증폭 CRISPR 시스템은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 포함할 수 있다. 제 1 CRISPR/Cas 복합체는 제 1 CRISPR/Cas 효소 및 제 1 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 1 가닥으로 가이드하는 제 1 가이드 분자를 포함할 수 있다. 제 2 CRISPR/Cas 복합체는 제 2 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 2 가닥으로 가이드하는 제 2 가이드 분자를 포함할 수 있다. 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 효소는 활성 (active) 또는 데드 (dead) 일 수 있다. 제 1 프라이머는 표적 핵산의 제 1 가닥에 상보적인 부분을 포함할 수 있고, 제 2 프라이머는 표적 핵산의 제 2 가닥에 상보적인 부분을 포함할 수 있다. 표적 핵산은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 사용하여 표적 핵산의 R-루프를 열고, 헬리카제를 사용하여 표적 핵산의 제 1 및 제 2 가닥을 풀고, 프라이머 쌍 및 중합효소를 사용하여 가닥을 어닐링 및 연장하여 증폭될 수 있다.
일부 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 데드 Cas9, 데드 Cas12a, 데드 Cas12b, 및 데드 Cas12c 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 HNH 및 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함하는 데드 Cas9 단백질일 수 있다.
데드 CRISPR/Cas 효소는 SpCas9 에 D10A 및 N863A, 또는 SpCas9 에 D10A 및 H840A 에 해당하는 돌연변이를 포함하는 데드 Cas9 단백질일 수 있다. 데드 CRISPR/Cas 효소는 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 테르모필루스 (Streptococcus thermophilus), 에스. 뮤탄스 (S. mutans), 에스. 아갈락티아에 (S. agalactiae), 에스. 에퀴시밀리스 (S. equisimilis), 에스. 산귀니스 (S. sanguinis), 에스. 뉴모니아 (S. pneumonia); 씨. 제주니 (C. jejuni), 씨. 콜라이 (C. coli); 엔. 살수기니스 (N. salsuginis), 엔. 테르가르쿠스 (N. tergarcus); 에스. 아우리쿨라리스 (S. auricularis), 에스. 카르노서스 (S. carnosus); 엔. 메닌지티데스 (N. meningitides), 엔. 고노로에아에 (N. gonorrhoeae); 엘. 모노시토게네스 (L. monocytogenes), 엘. 이바노비이 (L. ivanovii); 씨. 보툴리넘 (C. botulinum), 씨. 디피실 (C. difficile), 씨. 테타니 (C. tetani), 씨. 소르델리이 (C. sordellii), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis) 1, 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MC2017 1, 부티리비브리오 프로테오클라스티커스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium) GW2011_GWC2_44_17, 스미텔라 종 (Smithella sp.) SCADC, 악시다미노코쿠스 종 (Acidaminococcus sp.) BV3L6, 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미텀 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 237, 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis) 3, 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카카에 (Porphyromonas macacae) 로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래된 데드 Cas9 단백질일 수 있다.
일부 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 데드 Cas12 단백질일 수 있다. 데드 Cas12 단백질은 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함할 수 있다. 데드 Cas12 효소는 데드 Cas12a, Cas12b, 또는 Cas12c 일 수 있다. 데드 Cas12a 단백질은 AsCpf1 에 D908A 또는 E993A 에 해당하는 돌연변이를 포함할 수 있다.
데드 Cas12a 단백질은 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium), 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium), 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium), 스미텔라 종 (Smithella sp.), 아시다미노코쿠스 종 (Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium), 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi), 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카카에 (Porphyromonas macacae), 숙시니비브리오 덱스트리노솔벤스 (Succinivibrio dextrinosolvens), 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens), 플라보박테리움 브란키오필룸 (Flavobacterium branchiophilum), 헬코코쿠스 쿤지이 (Helcococcus kunzii), 유박테리움 종 (Eubacterium sp.), 미크로게노마테스 (Microgenomates) (로이즈만박테리아 (Roizmanbacteria)) 박테리움, 플라보박테리움 종 (Flavobacterium sp.), 프레보텔라 브레비스 (Prevotella brevis), 모락셀라 카프라에 (Moraxella caprae), 박테로이데테스 오랄 (Bacteroidetes oral), 포르피로모나스 칸술치 (Porphyromonas cansulci), 시네르기스테스 조네시이 (Synergistes jonesii), 프레보텔라 브리안티이 (Prevotella bryantii), 아나에로비브리오 종 (Anaerovibrio sp.), 부티리비브리오 피브리솔벤스 (Butyrivibrio fibrisolvens), 칸디다투스 메타노메틸로필루스 (Candidatus Methanomethylophilus), 부티리비브리오 종 (Butyrivibrio sp.), 오리박테리움 종 (Oribacterium sp.), 슈도부티리비브리오 루미니스 (Pseudobutyrivibrio ruminis) 및 프로테오카텔라 스페니치 (Proteocatella sphenisci) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래될 수 있다.
데드 Cas12 효소는 Nuc 도메인에 돌연변이를 포함하는 데드 Cas12b 단백질일 수 있다. 데드 Cas12b 는 AacC2c1 에 D570A, E848A, 또는 D977A 에 해당하는 돌연변이를 포함할 수 있다.
데드 Cas12b 단백질은 알리시클로바실루스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris), 알리시클로바실루스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans), 알리시클로바실루스 마크로스포란지이두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus), 바실루스 히사시이 (Bacillus hisashii), 칸디다투스 린도우박테리아 (Candidatus Lindowbacteria), 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans), 엘루시미크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 (Omnitrophica) WOR_2 박테리움 RIFCSPHIGHO2, 오피투타세아에 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스파에라에 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코미크로비아세아에 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실루스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus), 바실루스 테르모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans), 브레비바실루스 종 (Brevibacillus sp.) CF112, 바실루스 종 (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티라브디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans), 알리시클로바실루스 헤르바리우스 (Alicyclobacillus herbarius), 시트로박테르 프레운디이 (Citrobacter freundii), 브레비바실루스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 및 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 제 1 데드 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 데드 CRISPR/Cas 효소는 동일할 수 있다. 대안적 구현예에서, 제 1 데드 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 데드 CRISPR/Cas 효소는 상이할 수 있다.
일부 구현예에서, 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 효소는 촉매 활성 효소이다. 일부 경우에, CRISPR/Case 효소는 Cas9, Cas12, Cas 12b 또는 Cas 12c 효소이다.
일부 구현예에서, 중합효소는 Bst 2.0 DNA 중합효소, Bst 2.0 WarmStart DNA 중합효소, Bst 3.0 DNA 중합효소, 전체 길이 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bsu DNA 중합효소, phi29 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, Gst 중합효소, Taq 중합효소, 이. 콜라이 DNA 중합효소 I 의 클레노우 (Klenow) 단편, KlenTaq NDA 중합효소, Pol III DNA 중합효소, T5 DNA 중합효소, 및 시쿼나제 (Sequenase) DNA 중합효소로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 헬리카제는 UvrD 헬리카제, CRISPR-Cas3 헬리카제, 이. 콜라이 헬리카제 I, 이. 콜라이 헬리카제 II, 이. 콜라이 헬리카제 III, 이. 콜라이 헬리카제 IV, Rep 헬리카제, DnaB 헬리카제, PriA 헬리카제, PcrA 헬리카제, T4 Gp41 헬리카제, T4 Dda 헬리카제, SV40 대형 T 항원, 효소 RAD 헬리카제, RecD 헬리카제, RecQ 헬리카제, 열안정성 T. 텡콘겐시스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 테르모필루스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 아쿠아티쿠스 DnaB 헬리카제, Dda 헬리카제, 파필로마 바이러스 E1 헬리카제, 고세균 MCM 헬리카제, 진핵생물 MCM 헬리카제, 및 T7 Gp4 헬리카제로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 헬리카제는 헬리카제 가공성 및 또는 활성을 증가시키도록 치환된다.
표적 핵산의 증폭은 약 37℃-65℃ 에서 수행될 수 있다. 표적 핵산의 증폭은 약 50℃-59℃ 에서 수행될 수 있다. 표적 핵산의 증폭은 약 60℃-72℃ 에서 수행될 수 있다. 표적 핵산의 증폭은 약 37℃ 에서 수행될 수 있다. 표적 핵산의 증폭은 또한 실온에서 수행될 수 있다. 실온은 20℃-25℃ 에서 다를 수 있다. 표적 핵산의 증폭은 일정한 온도에서 수행될 수 있다. 증폭은 중온성 또는 호열성 등온 조건 하에 수행될 수 있다.
일부 경우에, 본원에서 개시된 방법은 중온성 등온 조건 하에 수행되고, 중온성 중합효소의 사용을 요구한다. 일부 경우에, 중온성 중합효소는 Sau LF 중합효소이다. 유사하게, 증폭이 중온성 등온 조건 하에 수행될 때, 이용되는 헬리카제는 중온성 조건 하에 충분한 활성으로 수행한다. 일부 경우에, 헬리카제는 UvrD-유사 헬리카제, 야생형, 또는 슈퍼 헬리카제 돌연변이가 있는 돌연변이체이다. 슈퍼 헬리카제 돌연변이는 전형적으로 헬리카제의 활성을 증가시키는 DD 에서 AA 로의 치환이다. 일부 경우에, 헬리카제는 D403A 및 D404A 에서 치환이 있는 이. 콜라이 UvrD 헬리카제이다. 일부 구현예에서, 헬리카제는 pcrA (UvrD)-유형 헬리카제, 예를 들어, D409/D410A 에 돌연변이가 있는 Tte-UvrD 헬리카제이다. 일부 경우에, 헬리카제는 ATP 의존적 헬리카제이고, ATP 보조인자는 헬리카제와 함께 사용될 수 있다. 일부 경우에, 헬리카제는 돌연변이 D403A/D404A 가 있는 테르모아나에로박테르 에타놀리쿠스 (Thermoanaerobacter ethanolicus) 로부터의 PcrA 헬리카제, 돌연변이 D407A/D408A 가 있는 바실루스 종 FJAT-27231 로부터의 PcrA 헬리카제, 돌연변이 D415A/D416A 가 있는 바실루스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 으로부터의 PcrA 헬리카제, 돌연변이 D407A/D408A 가 있는 바실루스 심플렉스 (Bacillus simplex) 로부터의 PcrA 헬리카제, 또는 돌연변이 D402A/D403A 가 있는 페니클로스트리디움 소르델리이 (Paeniclostridium sordellii) 로부터의 PcrA 헬리카제이다.
표적 핵산 서열은 약 20-30, 약 30-40, 약 40-50, 또는 약 50-100 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 표적 핵산 서열은 약 100-200, 약 100-500, 또는 약 100-1000 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 표적 핵산 서열은 약 1000-2000, 약 2000-3000, 약 3000-4000, 또는 약 4000-5000 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 경우에, 표적 핵산이 게놈 DNA 내에 포함될 때, 촉매 활성이고 추가 증폭을 위해 더 작은 표적 핵산 서열을 절단하는 CRISPR/Cas 효소가 사용될 수 있다.
증폭된 핵산의 검출은 겔 전기영동, 인터칼레이팅 염료 검출, PCR, 실시간 PCR, 형광, 형광 공명 에너지 전이 (FRET), 질량 분석법, 측류 어세이, 비색 어세이, 및 CRISPR-기반 검출 시스템으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행될 수 있다. 제 1 또는 제 2 프라이머는 RNA 중합효소 프로모터를 포함할 수 있다. 증폭된 핵산은 Cas13-기반 시스템, CRISPR Cas12-기반 시스템, 또는 그들의 조합에 의해 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, LwCas13 이 검출에 사용된다.
표적 핵산은 아토몰라 감도로 검출될 수 있다. 표적 핵산은 펨토몰라 감도로 검출될 수 있다.
표적 핵산은 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA, 플라스미드 DNA, 순환성 무세포 DNA, 환경 DNA, 합성 이중-가닥 DNA, 및 RNA 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
표적 핵산이 RNA 인 구현예에서, RNA 는 증폭 전에 cDNA 로 역전사될 수 있다. 예시적 증폭 방법은 레콤비나제 중합효소 증폭 (RPA) 을 포함한다. 일부 구현예에서, T7 RNA 중합효소는 시험관내 (in vitro) 전사에 사용된다.
일부 구현예에서, 증폭 및 검출 방법은 크라우딩제, 보조인자, 단일-가닥 결합 단백질, 및/또는 보조 단백질을 포함하는 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 첨가제는, 예를 들어, 신호 대 배경 비의 측정에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 경우에, ATP 는 보조인자로서 사용될 수 있다. 크라우딩제는 중합체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PEG 는 분자량이 20K 이지만, 분자량 및 분지화의 수준은 방법이 적용되는 시스템의 복잡성에 따라 선택될 수 있다.
단일-가닥 결합 단백질이 또한 본원에 공개된 일부 방법 및 시스템에서 사용되는 것이 고려된다. 예를 들어, T4 gp32 또는 호열성 SSB (ET-SSB) 가 사용될 수 있다. 복잡한 주형을 위한 보조 단백질이 또한, 특히 복잡한 주형에, 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, dCpf1 및/또는 UvsX 레콤비나제가 사용될 수 있다.
샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액, 림프액, 활액, 담즙, 복수, 흉막 삼출액, 혈청종, 타액, 뇌척수액, 수양액 또는 유리체액, 또는 임의의 신체 분비액, 여출액, 삼출액, 또는 관절로부터 수득된 체액, 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑 (swab) 일 수 있다. 샘플은 인간 환자로부터 수득된 혈액, 혈장, 또는 혈청일 수 있다. 샘플은 식물 샘플일 수 있다. 샘플은 미정제 샘플일 수 있다. 샘플은 정제된 샘플일 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 표적 단일-가닥 핵산을 증폭 및/또는 검출하는 방법을 제공한다. 방법은 지금까지 기재된 단계를 수행하기 전에 샘플의 단일-가닥 핵산을 표적 이중-가닥 핵산으로 전환하는 것을 포함한다. 표적 단일-가닥 핵산은 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 역전사 및 증폭 단계에 의해 이중-가닥 핵산으로 전환될 수 있다.
표적 단일-가닥 핵산은 단일-가닥 바이러스 DNA, 바이러스 RNA, 전령 RNA, 리보솜 RNA, 운반 RNA, 마이크로RNA, 짧은 간섭 RNA, 소형 핵 RNA, 합성 RNA, 및 합성 단일-가닥 DNA, 장형 비-코딩 RNA, 프리-마이크로RNA, 바이러스 dsRNA, 및 비-바이러스 dsRNA 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
표적 핵산이 RNA 인 경우에, RNA 는 증폭 전에 cDNA 로 역전사될 수 있다. 증폭은 그 때 당해 기술분야에 알려진 임의의 적합한 증폭 방법, 예컨대 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 하나의 예시적 증폭 방법은 레콤비나제 중합효소 증폭 (RPA) 을 포함할 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 이중-가닥 핵산을 증폭 및/또는 검출하기 위한 시스템을 제공한다. 시스템은 증폭 CRISPR 시스템, 헬리카제, 제 1 및 제 2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍, 중합효소, 및 임의로 표적 핵산의 증폭을 검출하기 위한 검출 시스템을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 프라이머 쌍으로 증폭하는 제 1 단계를 매개하는 것, 및 후속적으로 프라이머 쌍의 제 1 프라이머의 부분에 대한 서열 동일성을 포함하는 앰플리파이어 (amplifier) 프라이머로 증폭하는 단계를 매개하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 앰플리파이어 프라이머 및 프라이머의 제 1 프라이머는 각각 T7 프로모터 서열을 포함한다.
증폭 CRISPR 시스템은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 포함할 수 있다. 제 1 CRISPR/Cas 복합체는 제 1 CRISPR/Cas 효소 및 제 1 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 1 가닥으로 가이드하는 제 1 가이드 분자를 포함할 수 있다. 제 2 CRISPR/Cas 복합체는 제 2 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 2 가닥으로 가이드하는 제 2 가이드 분자를 포함할 수 있다. CRISPR/Cas 효소는 활성 또는 데드일 수 있다. 제 1 프라이머는 표적 핵산의 제 1 가닥에 상보적인 부분을 포함할 수 있고, 제 2 프라이머는 표적 핵산의 제 2 가닥에 상보적인 부분을 포함할 수 있다.
데드 CRISPR/Cas 효소는 데드 Cas9 효소 또는 데드 Cas12 효소일 수 있다. 데드 Cas12 효소는 데드 Cas12a, Cas12b, 또는 Cas12c 효소일 수 있다.
중합효소는 Bst 2.0 DNA 중합효소, Bst 2.0 WarmStart DNA 중합효소, Bst 3.0 DNA 중합효소, 전체 길이 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bsu DNA 중합효소, phi29 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, Gst 중합효소, Taq 중합효소, 이. 콜라이 DNA 중합효소 I 의 클레노우 단편, KlenTaq DNA 중합효소, Pol III DNA 중합효소, T5 DNA 중합효소 및 시쿼나제 DNA 중합효소로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
헬리카제는 UvrD 헬리카제, CRISPR-Cas3 헬리카제, 이. 콜라이 헬리카제 I, 이. 콜라이 헬리카제 II, 이. 콜라이 헬리카제 III, 이. 콜라이 헬리카제 IV, Rep 헬리카제, DnaB 헬리카제, PriA 헬리카제, PcrA 헬리카제, T4 Gp41 헬리카제, T4 Dda 헬리카제, SV40 대형 T 항원, 효소 RAD 헬리카제, RecD 헬리카제, RecQ 헬리카제, 열안정성 T. 텡콘겐시스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 테르모필루스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 아쿠아티쿠스 DnaB 헬리카제, Dda 헬리카제, 파필로마 바이러스 E1 헬리카제, 고세균 MCM 헬리카제, 진핵생물 MCM 헬리카제, 및 T7 Gp4 헬리카제로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 데드 CRISPR/CAS 효소, 헬리카제, 및 중합효소는 동일한 온도 하에 수행할 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 단일-가닥 핵산을 증폭 및/또는 검출하기 위한 시스템을 제공한다. 이전 구현예에서 기재된 구성요소에 더하여, 시스템은 표적 단일-가닥 핵산을 이중-가닥 핵산으로 전환시키기 위한 시약을 포함할 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 이중-가닥 핵산을 증폭 및/또는 검출하기 위한 키트를 제공한다. 이전 구현예에서 기재된 모든 구성요소에 더하여, 키트는 또한 사용 지침의 세트를 포함할 수 있다. 키트는 샘플 내의 이중-가닥 핵산을 정제하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 단일-가닥 핵산을 증폭 및/또는 검출하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 이전 구현예에 기재된 구성요소 및 사용 지침의 세트를 포함할 수 있다. 키트는 샘플 내의 단일-가닥 핵산을 정제하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다.
예시적 구현예의 이들 및 다른 양태, 목적, 특성 및 장점은 제시된 예시적 구현예의 하기 상세한 설명을 고려시에 당업자에게 명백해질 것이다.
본 발명의 특성 및 장점의 이해는 본 발명의 원리를 이용할 수 있는 실례적인 구현예를 제시하는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조로 하여 수득될 것이다:
도 1 은 HDA 작업흐름을 설명하는 도식이다.
도 2 는 CRISPR-HDA 작업흐름을 설명하는 도식이다.
도 3A-3G 는 단일 분자 검출을 위한 2-단계 호열성 CRISPR HDA SHERLOCK 등온 증폭 방법의 민감도를 설명하는 그래프이다. 개별 그래프는 (도 3A) 2 pM, (도 3B) 200fM, (도 3C) 20 fM, (도 3D) 2 fM, (도 3E) 200 aM, (도 3F) 2 aM, 및 (도 3G) 0 aM 농도에서의 검출을 보여준다.
도 4 는 dAsCpf1 이 2-단계 호열성 HDA (tHDA) SHERLOCK 민감도를 개선한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 5 는 dAsCpf1:crRNA 복합체에 의해 야기되는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6 은 Cas12a 및 Cas12b 둘 모두가 2-단계 tHDA-SHERLOCK 을 개선한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 7 은 온도 범위, 왼쪽, 및 크기 (aa), 오른쪽을 포함하는 중온성 헬리카제의 차트 선택이다.
도 8 은 예시적인 등온 헬리카제 리포터 어세이를 묘사한다.
도 9 는 이. 콜라이 UvrD 내의 D403 및 D404 에 대한 알라닌 치환이 헬리카제 진행성 및 활성을 증가시킨다는 것을 보여준다. 공통 동일성이 제공되며, 선별된 UvrD 헬리카제 사이에서 보존된 부위가 박스 안에 있다 (SEQ ID NO:1-14).
도 10 은 선별된 pcrA (UvrD)-유형 헬리카제는 광범위한 활성 스펙트럼을 가지며, '슈퍼 헬리카제' DD-> AA 치환은 활성을 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 11 은 헬리카제 리포터 어세이를 사용하여 헬리카제 기질 풀림의 동역학 및 보조인자 선호도를 추론할 수 있다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다. 번호 1 내지 8 은, 수치적으로 2 배 헬리카제 농도 희석을 나타내며, 1 은 최고이고, 8 은 헬리카제 부재이다.
도 12 는 프로토콜 최적화 연구의 도표이며, 반응 당 500 ng 의 T4 gp32 SSB 및 125 ng 의 헬리카제가 가장 잘 수행했다.
도 13 은 신호 대 배경 비의 최적화를 그래프로 보여주며, 크라우딩제 PEG 20K 및 ATP 를 보조인자로서 첨가하여 신호 대 배경 비를 증가시키는 것을 보여준다.
도 14 는 종래의 프라이머 전략 및 앵커링된 프라이밍 전략을 보여주는 개략도이다.
도 15 는 '앵커링된' 및 총 프라이머 효과 효율의 양의 그래프이며, '앵커링된' 프라이밍이 증폭 효율을 증가시키는 것을 보여준다.
도 16 은 최적화된 원-포트 mHDA-SHERLOCK 이 2fM (1000 카피), 오른쪽 2 시간 미만 내에, 왼쪽을 달성하는 것을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 17 은 플라스미드 DNA 에 대한 원-포트 mHDA-SHERLOCK 의 그래프이다.
본원에서의 도면은 단지 예시적인 목적을 위한 것이며 반드시 일정한 비율로 도시되는 것은 아니다.
도 1 은 HDA 작업흐름을 설명하는 도식이다.
도 2 는 CRISPR-HDA 작업흐름을 설명하는 도식이다.
도 3A-3G 는 단일 분자 검출을 위한 2-단계 호열성 CRISPR HDA SHERLOCK 등온 증폭 방법의 민감도를 설명하는 그래프이다. 개별 그래프는 (도 3A) 2 pM, (도 3B) 200fM, (도 3C) 20 fM, (도 3D) 2 fM, (도 3E) 200 aM, (도 3F) 2 aM, 및 (도 3G) 0 aM 농도에서의 검출을 보여준다.
도 4 는 dAsCpf1 이 2-단계 호열성 HDA (tHDA) SHERLOCK 민감도를 개선한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 5 는 dAsCpf1:crRNA 복합체에 의해 야기되는 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6 은 Cas12a 및 Cas12b 둘 모두가 2-단계 tHDA-SHERLOCK 을 개선한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 7 은 온도 범위, 왼쪽, 및 크기 (aa), 오른쪽을 포함하는 중온성 헬리카제의 차트 선택이다.
도 8 은 예시적인 등온 헬리카제 리포터 어세이를 묘사한다.
도 9 는 이. 콜라이 UvrD 내의 D403 및 D404 에 대한 알라닌 치환이 헬리카제 진행성 및 활성을 증가시킨다는 것을 보여준다. 공통 동일성이 제공되며, 선별된 UvrD 헬리카제 사이에서 보존된 부위가 박스 안에 있다 (SEQ ID NO:1-14).
도 10 은 선별된 pcrA (UvrD)-유형 헬리카제는 광범위한 활성 스펙트럼을 가지며, '슈퍼 헬리카제' DD-> AA 치환은 활성을 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 11 은 헬리카제 리포터 어세이를 사용하여 헬리카제 기질 풀림의 동역학 및 보조인자 선호도를 추론할 수 있다는 것을 보여주는 그래프를 포함한다. 번호 1 내지 8 은, 수치적으로 2 배 헬리카제 농도 희석을 나타내며, 1 은 최고이고, 8 은 헬리카제 부재이다.
도 12 는 프로토콜 최적화 연구의 도표이며, 반응 당 500 ng 의 T4 gp32 SSB 및 125 ng 의 헬리카제가 가장 잘 수행했다.
도 13 은 신호 대 배경 비의 최적화를 그래프로 보여주며, 크라우딩제 PEG 20K 및 ATP 를 보조인자로서 첨가하여 신호 대 배경 비를 증가시키는 것을 보여준다.
도 14 는 종래의 프라이머 전략 및 앵커링된 프라이밍 전략을 보여주는 개략도이다.
도 15 는 '앵커링된' 및 총 프라이머 효과 효율의 양의 그래프이며, '앵커링된' 프라이밍이 증폭 효율을 증가시키는 것을 보여준다.
도 16 은 최적화된 원-포트 mHDA-SHERLOCK 이 2fM (1000 카피), 오른쪽 2 시간 미만 내에, 왼쪽을 달성하는 것을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 17 은 플라스미드 DNA 에 대한 원-포트 mHDA-SHERLOCK 의 그래프이다.
본원에서의 도면은 단지 예시적인 목적을 위한 것이며 반드시 일정한 비율로 도시되는 것은 아니다.
예시적 구현예의 상세한 설명
일반 정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 개시물이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학의 공통 용어 및 기술의 정의는 다음의 문헌들에서 확인할 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) (Sambrook, Fritsch, and Maniatis); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition (2012) (Green and Sambrook); Current Protocols in Molecular Biology (1987) (F.M. Ausubel et al. eds.); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (1995) (M.J. MacPherson, B.D. Hames, and G.R. Taylor eds.): Antibodies, A Laboratory Manual (1988) (Harlow and Lane, eds.): Antibodies A Laboratory Manual, 2nd edition 2013 (E.A. Greenfield ed.); Animal Cell Culture (1987) (R.I. Freshney, ed.); Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones and Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992); and Marten H. Hofker and Jan van Deursen, Transgenic Mouse Methods and Protocols, 2nd edition (2011).
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수형 표현은 문맥에서 달리 명확하게 명시하지 않는 한, 단수형 및 복수형 대상 둘 모두를 포함한다.
용어 "임의의" 또는 "임의로는" 은 후술되는 사건, 상황 또는 치환기가 존재하지 않을 수도 있거나 또는 존재할 수도 있고, 그 설명은 사건 또는 상황이 일어나는 예 및 일어나지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다.
종료점에 의한 수치 범위의 설명은 언급된 종료점을 비롯하여, 각 범위 내에 포함된 모든 수 및 분수를 포함한다.
측정가능한 값 예컨대 매개변수, 양, 시간적 지속기간 등을 언급할 때 본원에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략" 은 명시된 값과 그로부터의 변동, 예컨대 그러한 변동이 개시된 발명에서 수행하기에 적절하다면, 명시된 값과 그로부터의 +/-10% 이하, +/-5% 이하, +/-1% 이하, 및 +/-0.1% 이하의 변동을 포괄한다는 것을 의미한다. 수식어 "약" 또는 "대략" 이 언급되는 값은 그 자체로 또한 특별히, 그리고 바람직하게 개시된다는 것이 이해될 것이다.
본 명세서 전반에서 "일부 구현예", "하나의 구현예", "예시적 구현예" 에 대한 언급은 구현예와 함께 기재된 특정한 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 구현예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반의 다양한 위치에서 어구 "일부 구현예에서", "하나의 구현예에서", 또는 "예시적 구현예에서" 의 출현은 반드시 모두 동일한 구현예를 언급하지 않지만, 그럴 수도 있다. 또한, 특정한 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 구현예에서, 본 개시물로부터 당업자에게 자명하게 되는 바와 같이, 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 일부 구현예가 다른 구현예에 포함된 다른 특성이 아닌 일부 특성을 포함하지만, 상이한 구현예의 특성의 조합은 본 발명의 범주 내에 두고자 한다. 예를 들어, 첨부된 청구항에서, 임의의 청구된 구현예들은 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "생물학적 샘플" 은 전체 세포 및/또는 살아있는 세포 및/또는 세포 파편을 함유할 수 있다. 생물학적 샘플은 "체액" 을 함유할 수 있다 (또는 그로부터 유래할 수 있다). 본 발명은, 체액이 양수, 안방수, 유리체액, 담즙, 혈청, 모유, 뇌척수액, 귀지 (cerumen) (이구 (earwax)), 유미, 유미즙, 내림프, 외림프, 삼출물, 대변, 여성 사정액, 위산, 위액, 림프, 점액 (비강 배액 및 가래 포함), 심장막액, 복막액, 흉막액, 고름, 점막 분비물, 타액, 피지 (피부 기름), 정액, 객담, 활액, 땀, 눈물, 소변, 질 분비물, 구토물 및 이의 하나 이상의 혼합물에서 선택되는 구현예를 포함한다. 생물학적 샘플은 세포 배양물, 체액, 체액으로부터의 세포 배양물을 포함한다. 체액은 예를 들어 천공, 또는 기타 수집 또는 샘플링 절차에 의해 포유동물 유기체로부터 수득할 수 있다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자" 는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 포유동물은 쥐과, 원숭이, 인간, 가축, 경기용 동물 및 애완동물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 다. 생체내에서 수득되거나 시험관내에서 배양된 생물학적 엔티티 (entity) 의 조직, 세포 및 그들의 자손도 또한 포함된다.
"C2c2" 는 이제 "Cas13a" 로 지칭되고, 이 용어는 달리 표시되지 않으면 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어 "군 29," "군 30," 및 Cas13b 는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어 "Cpf1" 및 "Cas12a" 는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어 "C2c1" 및 "Cas12b" 는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "융해", "풀림" 또는 "변성" 은 핵산 듀플렉스의 2 개의 상보적 가닥의 전부 또는 일부를 분리하는 것을 의미한다.
"뉴클레아제" 및 "엔도뉴클레아제" 는 DNA 절단을 위한 엔도뉴클레오리틱 촉매 활성을 갖는 효소를 의미하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "오솔로그 (orthologue)" (본원에서 "오솔로그 (ortholog)" 로도 나타냄) 및 "상동체 (homologue)" (본원에서 "상동체 (homolog)" 로도 나타냄) 는 당업계에 널리 공지되어 있다. 추가 지침에 의해서, 본원에서 사용되는 단백질의 "상동체" 는 이의 상동체인 단백질과 동일하거나 유사한 기능을 수행하는 동일한 종의 단백질이다. 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 단백질의 "오솔로그" 는 이의 오솔로그인 단백질과 동일하거나 유사한 기능을 수행하는 상이한 종의 단백질이다. 오솔로그성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 상동체 및 오솔로그는 상동성 모델링 (참고, 예를 들어, Greer, Science vol. 228 (1985) 1055, 및 Blundell et al. Eur J Biochem vol 172 (1988), 513) 또는 "구조적 BLAST" (Dey F, Cliff Zhang Q, Petrey D, Honig B. Toward a "structural BLAST": using structural relationships to infer function. Protein Sci. 2013 Apr;22(4):359-66. doi: 10.1002/pro.2225.) 에 의해 확인될 수 있다. CRISPR-Cas 좌위의 분야에서의 적용에 관해 Shmakov et al. (2015) 를 또한 참조한다. 그러나 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다.
이하 다양한 구현예를 기재한다. 특별한 구현예들이 배타적인 설명으로서 또는 본원에서 논의되는 더 넓은 양태에 대한 제한으로서 의도되지 않는다는 것에 주의해야 한다. 특정 구현예와 함께 기재되는 하나의 양태는 반드시 그 구현예로 제한되지 않으며 임의의 다른 구현예(들)로 실시될 수 있다. 본 명세서 전반에서 "하나의 구현예", "한 구현예", "예시적 구현예" 에 대한 언급은 구현예와 함께 기재된 특정한 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 구현예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반의 다양한 위치에서 어구 "하나의 구현예에서", "한 구현예에서", 또는 "예시적 구현예에서" 의 출현은 반드시 모두 동일한 구현예를 언급하지 않지만, 그럴 수도 있다. 더 나아가서, 특정한 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 구현예에서, 본 개시로부터 당업자에게 자명하게 되는 바와 같이, 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 일부 구현예가 다른 구현예에 포함된 다른 특성이 아닌 일부 특성을 포함하지만, 상이한 구현예의 특성의 조합은 본 발명의 범주 내에 두고자 한다. 예를 들어, 첨부된 청구항에서, 임의의 청구된 구현예들은 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
본원에서 인용되는 모든 출판물, 공개 특허 문서, 및 특허 출원은 각각의 개별 출판물, 공개 특허 문서, 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로서 특별히 개별적으로 표시한 바와 동일한 정도로 참조로 본원에 포함된다.
개관
헬리카제-의존적 증폭 (HDA) 에서, 헬리카제 효소를 사용하여 이중 가닥 핵산을 풀어서, 프라이머 하이브리드화 및 후속적 프라이머-연장을 위한 주형을 생성한다. 이 과정은 표적 서열을 함유하는 센스 가닥 또는 역상보적 표적 서열을 함유하는 안티센스 가닥의 3'-말단에 각각 하이브리드화하는 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한다. HDA 반응은 헬리카제-의존적 핵산 증폭을 위한 일반적 방법이다.
이 방법을 CRISPR-Cas 시스템과 조합하여, 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 사용하여 표적 핵산의 R-루프를 열어서 표적 핵산이 증폭될 수 있다. 표적 핵산의 제 1 및 제 2 가닥은 헬리카제를 사용하여 풀릴 수 있으며, 이는 등온 조건 하에 프라이머 및 중합효소가 DNA 에 결합하여 그것을 연장시키는 것을 허용한다. 표적 핵산의 검출은 HDA 기술에 후속하여 수행될 수 있으며, 일부 바람직한 구현예에서, SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing) 이 표적 핵산의 검출에 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본원에 개시된 구현예는 증폭 CRISPR 시스템, 헬리카제, 프라이머 쌍, 중합효소, 및 임의로 표적 핵산의 증폭을 검출하기 위한 검출 시스템을 포함하는, 샘플 내의 표적 핵산을 증폭 및/또는 검출하기 위한 시스템에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 시스템은 이중 가닥 핵산을 검출하며, 그러나, 표적 핵산이 단일 가닥인 경우에, 표적 단일-가닥 핵산을 이중-가닥 핵산으로 전환시키기 위한 시약이 또한 시스템에 제공될 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 증폭 CRISPR 시스템은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 포함하며, 제 1 복합체는 제 1 CRISPR/Cas 효소 및 제 1 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 1 가닥으로 가이드하는 제 1 가이드 분자를 포함하고, 제 2 복합체는 제 2 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 2 가닥으로 가이드하는 제 2 가이드 분자를 포함한다. 특정 예시적 구현예에서, 시스템은 프라이머 쌍의 제 1 프라이머에 또한 함유된 프로모터 서열을 포함하는 앰플리파이어 프라이머를 추가로 포함한다. 시스템은 크라우딩제, 보조인자, 단일-가닥 결합 단백질, 및/또는 보조 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 시스템은 SHERLOCK 검출 시스템일 수 있는 검출 시스템을 추가로 포함한다. 일부 경우에, HDA 에 후속하여, 이펙터 단백질 및 하나 이상의 증폭된 핵산 에 상응하는 하나 이상의 가이드 분자, 및 RNA 차폐성 구성체를 포함하는 검출 시스템이 제공된다.
표적 이중-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출 방법
특정 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 표적 이중-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출 방법을 포함한다: 표적 이중-가닥 핵산을 포함하는 샘플을 증폭 반응 혼합물과 조합하는 단계로서, 증폭 반응 혼합물은 하기를 포함하는 단계: (i) 증폭 CRISPR 시스템으로서, 증폭 CRISPR 시스템은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 포함하며, 제 1 CRISPR/Cas 복합체는 제 1 CRISPR/Cas 효소 및 제 1 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 1 가닥으로 가이드하는 제 1 가이드 분자를 포함하고, 제 2 CRISPR/Cas 복합체는 제 2 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 2 가닥으로 가이드하는 제 2 가이드 분자를 포함하는 증폭 CRISPR 시스템; (ii) 헬리카제; (iii) 제 1 및 제 2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍으로서, 제 1 프라이머는 표적 핵산의 제 1 가닥에 상보적인 부분을 포함하고, 제 2 프라이머는 표적 핵산의 제 2 가닥에 상보적인 부분을 포함하는 프라이머 쌍; 및 (iv) 중합효소. 방법은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 사용하여 표적 핵산의 R-루프를 열고, 헬리카제를 사용하여 표적 핵산의 제 1 및 제 2 가닥을 풀고, 프라이머 쌍 및 중합효소를 사용하여 가닥을 어닐링 및 연장하여 표적 핵산을 증폭시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 등온 조건 하에 반복된 열림, 풀림, 어닐링 및 연장에 의해 표적 핵산을 추가로 증폭하고; 증폭된 표적 핵산을 임의로 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
CRISPR 복합체 형성의 맥락에서, "표적 서열" 은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 사이의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시킨다. 표적 서열은 표적 이중-가닥 또는 표적 단일-가닥 핵산을 포함할 수 있다. 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 용어 "표적 DNA 또는 RNA" 또는 "표적 핵산" 은 표적 서열이거나 표적 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 달리 말해서, 표적 DNA 또는 RNA 는 gRNA 의 일부분, 즉 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계되고 CRISPR 이펙터 단백질 및 gRNA 를 포함하는 복합체에 의해 매개되는 이펙터 기능을 유도시키는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 또는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드의 일부분일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치된다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산은 이중-가닥이다.
증폭 CRISPR 시스템
특정 구현예에서, 본원에서 구상되는 증폭 반응 혼합물은 증폭 CRISPR 시스템을 포함한다. 증폭 CRISPR 시스템은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 포함할 수 있다. CRISPR/Cas 복합체는 활성 또는 데드 CRISPR/Cas 효소 및 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 가닥으로 가이드하는 가이드 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어 게놈 DNA 와 같이, 표적 핵산이 정말로 긴 경우에, 활성 Cas 효소가 유용할 수 있다. 활성 Cas 효소는 게놈 DNA 를 절단할 수 있으며, 이는 헬리카제 효소가 이중-가닥 DNA 브레이크 (break) 에 의해 생성된 블런트 말단 (blunt end) 에 진입하는 것을 허용한다.
일반적으로, 본 명세서, 및 문헌 예컨대 WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667) 에서 사용되는 CRISPR-Cas 또는 CRISPR 시스템은 Cas 유전자를 코딩하는 서열, tracr (trans-activating CRISPR) 서열 (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-mate 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우에 "직접 반복부" 및 tracrRNA-프로세싱된 부분 직접 반복부 포괄), 가이드 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우에 "스페이서" 라고도 함), 또는 그 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "RNA(들)" (예를 들어, Cas를 가이드하는 RNA(들), 예컨대 Cas9, 예를 들어 CRISPR RNA 및 트랜스활성화 (tracr) RNA 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA) (키메라 RNA)) 또는 CRISPR 유전자좌 유래 다른 서열 및 전사물을 포함하여, CRISPR-연관 ("Cas") 유전자의 발현 또는 활성 유도에 관여되는 전사물 및 다른 엘리먼트를 집합적으로 언급한다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우 프로토스페이서라고도 함) 의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 엘리먼트를 특징으로 한다. 예를 들어, Shmakov et al. (2015) "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems", Molecular Cell, DOI: dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008 을 참고한다.
특정 구현예에서, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 또는 PAM-유사 모티프는 관심 표적 유전자좌에 대한 본원에 개시된 바와 같은 이펙터 단백질 복합체의 결합을 유도한다. 일부 구현예에서, PAM 는 5' PAM (즉, 프로토스페이서의 5' 말단의 업스트림에 위치) 일 수 있다. 다른 구현예에서, PAM 는 3' PAM (즉, 프로토스페이서의 5' 말단의 다운스트림에 위치) 일 수 있다. 용어 "PAM" 은 용어 "PFS" 또는 "프로토스페이서 측접 위치" 또는 "프로토스페이서 측접 서열" 과 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 추가의 이펙터는 cas1 유전자에 대한 그들의 근접성, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, cas1 유전자의 출발점으로부터 20 kb 및 cas1 유전자의 종료점으로부터 20 kb 영역 이내에 의해 확인될 수 있다. 일정 구현예에서 이펙터 단백질은 적어도 하나의 HEPN 도메인 및 적어도 500 개 아미노산을 포함하고, C2c2 이펙터 단백질은 Cas 유전자 또는 CRISPR 어레이의 상류 또는 하류 20 kb 이내의 원핵생물 게놈에 천연적으로 존재한다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12 라고도 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 형태를 포함한다. 일정 예의 구현예에서, C2c2 이펙터 단백질은 Cas 1 유전자의 상류 또는 하류 20 kb 이내 원핵생물 게놈에 천연적으로 존재한다. 용어 "오솔로그 (orthologue)" (ortholog 라고도 함) 및 "상동체 (homologue)" (homolog 라고도 함) 는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 추가 지침에 의해서, 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "상동체" 는 상동성인 단백질과 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행하는 동일 종의 단백질이다. 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "오솔로그" 는 오솔로그인 단백질과 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행하는 상이한 종의 단백질이다. 오솔로그 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다.
일정 예의 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 어세이는 하나 이상의 Cas9 오솔로그와 조합하여 다수의 Cas12 오솔로그 또는 하나 이상의 오솔로그를 포함할 수 있다. 일정 예의 구현예에서, Cas12 오솔로그는 Cpf1 오솔로그, C2c1오솔로그, 또는 C2c3 오솔로그이다.
특정 구현예에서, Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 캄필로박터 (Campylobacter), 니트라티프락토르 (Nitratifractor), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 파르비바큘럼 (Parvibaculum), 로세부리아 (Roseburia), 네이세리아 (Neisseria), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 아조스피릴럼 (Azospirillum), 스파에로카에타 (Sphaerochaeta), 락토바실루스 (Lactobacillus), 유박테리움 (Eubacterium), 또는 코리네박터 (Corynebacte) 를 포함하는 속으로부터의 유기체에서 유래할 수 있다.
특정 구현예에서, Cas9 단백질은 카르노박테리움 (Carnobacterium), 로도박터 (Rhodobacter), 리스테리아 (Listeria), 팔루디박터 (Paludibacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae), 클로스트리디아리듐 (Clostridiaridium), 렙토트리키아 (Leptotrichia), 프란시셀라 (Francisella), 레지오넬라 (Legionella), 알리시클로바실루스 (Alicyclobacillus), 메타노메티오필러스 (Methanomethyophilus), 포르피로모나스 (Porphyromonas), 프레보텔라 (Prevotella), 박테로이데테스 (Bacteroidetes), 헬코코쿠스 (Helcococcus), 렙토스피라 (Leptospira), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세아에 (Opitutaceae), 투버리바실루스 (Tuberibacillus), 바실루스 (Bacillus), 브레비바실루스 (Brevibacilus), 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 또는 악시다미노코쿠스 (Acidaminococcus) 를 포함하는 속으로부터의 유기체에서 유래한다.
추가의 특정 구현예에서, Cas9 단백질은 에스. 뮤탄스 (S. mutans), 에스. 아갈락티아에 (S. agalactiae), 에스. 에퀴시밀리스 (S. equisimilis), 에스. 산귀니스 (S. sanguinis), 에스. 뉴모니아 (S. pneumonia); 씨. 제주니 (C. jejuni), 씨. 콜라이 (C. coli); 엔. 살수기니스 (N. salsuginis), 엔. 테르가르쿠스 (N. tergarcus); 에스. 아우리쿨라리스 (S. auricularis), 에스. 카르노서스 (S. carnosus); 엔. 메닌지티데스 (N. meningitides), 엔. 고노로에아에 (N. gonorrhoeae); 엘. 모노시토게네스 (L. monocytogenes), 엘. 이바노비이 (L. ivanovii); 씨. 보툴리넘 (C. botulinum), 씨. 디피실 (C. difficile), 씨. 테타니 (C. tetani), 씨. 소르델리이 (C. sordellii) 로부터 선택된 유기체로부터의 것이다. 특정 구현예에서, 닉카제는 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 또는 스트렙토코쿠스 테르모필루스 (Streptococcus thermophilus) 로부터 선택된 유기체로부터의 Cas9 유래의 Cas9 닉카제이다.
더욱 바람직한 구현예에서, Cas9 단백질은 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 테르모필루스 (Streptococcus thermophilus), 에스. 뮤탄스 (S. mutans), 에스. 아갈락티아에 (S. agalactiae), 에스. 에퀴시밀리스 (S. equisimilis), 에스. 산귀니스 (S. sanguinis), 에스. 뉴모니아 (S. pneumonia); 씨. 제주니 (C. jejuni), 씨. 콜라이 (C. coli); 엔. 살수기니스 (N. salsuginis), 엔. 테르가르쿠스 (N. tergarcus); 에스. 아우리쿨라리스 (S. auricularis), 에스. 카르노서스 (S. carnosus); 엔. 메닌지티데스 (N. meningitides), 엔. 고노로에아에 (N. gonorrhoeae); 엘. 모노시토게네스 (L. monocytogenes), 엘. 이바노비이 (L. ivanovii); 씨. 보툴리넘 (C. botulinum), 씨. 디피실 (C. difficile), 씨. 테타니 (C. tetani), 씨. 소르델리이 (C. sordellii), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis) 1, 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MC2017 1, 부티리비브리오 프로테오클라스티커스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium) GW2011_GWC2_44_17, 스미텔라 종 (Smithella sp.) SCADC, 악시다미노코쿠스 종 (Acidaminococcus sp.) BV3L6, 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미텀 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 237, 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis) 3, 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카카에 (Porphyromonas macacae) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래된다.
Cpf1 유전자는 여러 다양한 박테리아 게놈에서, 전형적으로 cas1, cas2 및 cas4 유전자 및 CRISPR 카세트를 갖는 동일한 유전자좌에서 발견된다 (예를 들어, 프란시셀라 cf. 노비시다 (Francisella cf. novicida) Fx1 의 FNFX1_1431-FNFX1_1428). 따라서, 이러한 추정 신규 CRISPR-Cas 시스템의 레이아웃은 II-B 유형의 경우와 유사해 보인다. 또한, Cas9 와 유사하게, Cpf1 단백질은, 트랜스포존 ORF-B 에 대해 상동성이며 활성 RuvC-유사 뉴클레아제, 아르기닌-풍부 영역, 및 Zn 핑거 (Cas9 에 부재함) 를 포함하는 용이하게 식별가능한 C-말단 영역을 함유한다. 그러나 Cas9 와 달리, Cpf1 은 또한 CRISPR-Cas 내용 없이 여러 게놈에 존재하며, ORF-B 와의 그의 상대적으로 높은 유사성은 그것이 트랜스포존 성분일 수 있다는 것을 시사한다. 이것이 진정한 CRISPR-Cas 시스템이고 Cpf1 이 Cas9 의 기능성 유사체라면, 이는 신규한 CRISPR-Cas 유형, 즉, 유형 V 라는 것이 시사되었다 (Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Makarova KS, Koonin EV. Methods Mol Biol. 2015;1311:47-75 참조). 그러나, 본원에서 기재한 바와 같이, Cpf1 은 하위유형 V-A 가 되는 것으로 나타나, 동일한 도메인 구조를 갖지 않으며 따라서 하위유형 V-B 가 되는 것으로 나타난 C2c1p 와 구별된다.
특정 구현예에서, Cpf1 이펙터 단백질은 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 캄필로박터 (Campylobacter), 니트라티프락토르 (Nitratifractor), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 파비바큘럼 (Parvibaculum), 로세부리아 (Roseburia), 네이세리아 (Neisseria), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 스파에로카에타 (Sphaerochaeta), 락토바실루스 (Lactobacillus), 유박테리움 (Eubacterium), 코리네박터 (Corynebacter), 카르노박테리움 (Carnobacterium), 로도박터 (Rhodobacter), 리스테리아 (Listeria), 팔루디박터 (Paludibacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 라크노스피라세아에 (Lachnospiraceae), 클로스트리디아리듐 (Clostridiaridium), 렙토트리키아 (Leptotrichia), 프란시셀라 (Francisella), 레지오넬라 (Legionella), 알리시클로바실루스 (Alicyclobacillus), 메타노메티오필러스 (Methanomethyophilus), 포르피로모나스 (Porphyromonas), 프레보텔라 (Prevotella), 박테로이데테스 (Bacteroidetes), 헬코코쿠스 (Helcococcus), 렙토스피라 (Leptospira), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세아에 (Opitutaceae), 투베리바실루스 (Tuberibacillus), 바실루스 (Bacillus), 브레비바실루스 (Brevibacilus), 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 또는 악시다미노코쿠스 (Acidaminococcus) 를 포함하는 속으로부터의 유기체에서 유래할 수 있다.
추가의 특정 구현예에서, Cpf1 이펙터 단백질은 에스. 뮤탄스 (S. mutans), 에스. 아갈락티아에 (S. agalactiae), 에스. 에퀴시밀리스 (S. equisimilis), 에스. 산귀니스 (S. sanguinis), 에스. 뉴모니아 (S. pneumonia); 씨. 제주니 (C. jejuni), 씨. 콜라이 (C. coli); 엔. 살수기니스 (N. salsuginis), 엔. 테르가르쿠스 (N. tergarcus); 에스. 아우리쿨라리스 (S. auricularis), 에스. 카르노서스 (S. carnosus); 엔. 메닌지티데스 (N. meningitides), 엔. 고노로에아에 (N. gonorrhoeae); 엘. 모노시토게네스 (L. monocytogenes), 엘. 이바노비이 (L. ivanovii); 씨. 보툴리넘 (C. botulinum), 씨. 디피실 (C. difficile), 씨. 테타니 (C. tetani), 씨. 소르델리이 (C. sordellii) 로부터 선택된 유기체로부터의 것이다.
더욱 바람직한 구현예에서, Cpf1 단백질은 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium), 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium), 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium), 스미텔라 종 (Smithella sp.), 아시다미노코쿠스 종 (Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium), 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi), 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카카에 (Porphyromonas macacae), 숙시니비브리오 덱스트리노솔벤스 (Succinivibrio dextrinosolvens), 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens), 플라보박테리움 브란키오필룸 (Flavobacterium branchiophilum), 헬코코쿠스 쿤지이 (Helcococcus kunzii), 유박테리움 종 (Eubacterium sp.), 미크로게노마테스 (Microgenomates) (로이즈만박테리아 (Roizmanbacteria)) 박테리움, 플라보박테리움 종 (Flavobacterium sp.), 프레보텔라 브레비스 (Prevotella brevis), 모락셀라 카프라에 (Moraxella caprae), 박테로이데테스 오랄 (Bacteroidetes oral), 포르피로모나스 칸술치 (Porphyromonas cansulci), 시네르기스테스 조네시이 (Synergistes jonesii), 프레보텔라 브리안티이 (Prevotella bryantii), 아나에로비브리오 종 (Anaerovibrio sp.), 부티리비브리오 피브리솔벤스 (Butyrivibrio fibrisolvens), 칸디다투스 메타노메틸로필루스 (Candidatus Methanomethylophilus), 부티리비브리오 종 (Butyrivibrio sp.), 오리박테리움 종 (Oribacterium sp.), 슈도부티리비브리오 루미니스 (Pseudobutyrivibrio ruminis) 및 프로테오카텔라 스페니치 (Proteocatella sphenisci) 로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래될 수 있다.
본 발명은 V-B 아형으로 표시되는 C2c1 유전자좌로부터 유래된, C2c1 기반 뉴클레아제의 사용을 포괄한다. 본 명세서에서 이러한 이펙터 단백질은 또한 "C2c1p", 예를 들어, C2c1 단백질이라고도 한다 (그리고 이러한 이펙터 단백질 또는 C2c1 단백질 또는 C2c1 유전자좌로부터 유래된 단백질은 또한 "CRISPR 효소" 라고도 한다). 현재, 하위유형 V-B 유전자좌는 cas1-Cas4 융합, cas2, C2c1 로 나타낸 별개의 유전자 및 CRISPR 어레이를 포함한다. C2c1 (CRISPR-연관 단백질 C2c1) 은 Cas9 의 특징적인 아르기닌-풍부 클러스터에 대응하는 부분과 함께 Cas9 의 해당하는 도메인 에 상응하는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 거대 단백질 (약 1100 - 1300 개 아미노산) 이다. 그러나, C2c1 은 모든 Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 결핍되어 있고, RuvC-유사 도메인은 HNH 도메인을 포함하는 긴 삽입물을 함유하는 Cas9 와 달리 C2c1 서열에서 연속적이다. 따라서, 특정 구현예에서, CRISPR-Cas 효소는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인만을 포함한다.
C2c1 (Cas12b 로도 공지됨) 단백질은 RNA 유도 뉴클레아제이다. 이의 절단은 tracr RNA 에 의존하여, 가이드 서열 및 직접 반복부를 포함하는 가이드 RNA 를 모집하는데, 여기서 가이드 서열은 표적 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화하여 DNA/RNA 헤테로듀플렉스를 형성한다. 현재 연구를 기반으로 하여, C2c1 뉴클레아제 활성은 또한 PAM 서열의 인식에 의존한다. C2c1 PAM 서열은 T-풍부 서열이다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, PAM 서열은 5' TTC 3' 이다. 특정 구현예에서, PAM 은 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum) 의 서열 내에 있다.
C2c1 은 표적 유전자좌에서, 5' 오버행과 함께, 엇갈림 절단 (staggered cut), 또는 표적 서열의 PAM 원위 측에서 "점착성 말단 (sticky end)" 을 생성한다. 일부 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. Lewis and Ke, Mol Cell. 2017 Feb 2;65(3):377-379 참고.
C2c1 유전자는 여러 다양한 박테리아 게놈에서, 전형적으로는 cas1, cas2 및 cas4 유전자 및 CRISPR 카세트를 갖는 동일한 유전자좌에서 발견된다. 따라서, 이러한 추정 신규 CRISPR-Cas 시스템의 레이아웃은 II-B 유형의 경우와 유사해 보인다. 또한, Cas9 와 유사하게, C2c1 단백질은 활성 RuvC-유사 뉴클레아제, 아르기닌-풍부 영역, 및 Zn 핑거 (Cas9 에 부재함) 를 함유한다.
특정 구현예에서, C2c1 단백질은 알리시클로바실루스 (Alicyclobacillus), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세아에 (Opitutaceae), 투베리바실루스 (Tuberibacillus), 바실루스 (Bacillus), 브레비바실루스 (Brevibacillus), 칸디다투스 (Candidatus), 데술파티랍디움 (Desulfatirhabdium), 시트로박테르 (Citrobacter), 엘루시미크로비아 (Elusimicrobia), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 옴니트로피카 (Omnitrophica), 피시스파에래 (Phycisphaerae), 플란크토마이세테스 (Planctomycetes), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 및 베루코미크로비아세아에 (Verrucomicrobiaceae) 를 포함하는 속으로부터의 유기체에서 유래할 수 있다.
추가의 특정 구현예에서, C2c1 단백질은 알리시클로바실루스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris), 알리시클로바실루스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans), 알리시클로바실루스 마크로스포란지이두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus), 바실루스 히사시이 (Bacillus hisashii), 칸디다투스 린도우박테리아 (Candidatus Lindowbacteria), 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans), 엘루시미크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 (Omnitrophica) WOR_2 박테리움 RIFCSPHIGHO2, 오피투타세아에 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스파에라에 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코미크로비아세아에 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실루스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus), 바실루스 테르모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans), 브레비바실루스 종 (Brevibacillus sp.) CF112, 바실루스 종 (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티라브디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans), 알리시클로바실루스 헤르바리우스 (Alicyclobacillus herbarius), 시트로박테르 프레운디이 (Citrobacter freundii), 브레비바실루스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 및 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 종에서 유래할 수 있다.
본 명세서에 제공된 방법 및 도구는 tracrRNA 를 이용하지 않는 유형 II 뉴클레아제인 Cas13 의 존재 또는 부재 하의 사용을 위해 디자인될 수 있다. Cas13 의 오솔로그는 본 명세서에 기재된 바와 같은 상이한 박테리아 종에서 동정되었다. 유사한 특성을 갖는 추가적인 유형 II 뉴클레아제는 당업계에 기재된 방법을 이용하여 동정될 수 있다 (Shmakov et al. 2015, 60:385-397; Abudayeh et al. 2016, Science, 5;353(6299)). 특정 구현예에서, 신규한 CRISPR 이펙터 단백질을 동정하기 위한 이러한 방법은 CRISPR Cas 유전자좌의 존재를 동정하는 씨드를 코딩하는 데이터베이스로부터 서열을 선택하는 단계, 선택된 서열에서 오픈 리딩 프레임 (ORF) 을 포함하는 10kb의 씨드 내에 위치된 유전자좌를 동정하는 단계, 이로부터, 단일 ORF만이 700 개 초과의 아미노산 및 공지된 CRISPR 이펙터에 대해 90% 이하의 상동성을 갖는 신규한 CRISPR 이펙터를 코딩하는 ORF를 포함하는 유전자좌를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 씨드는 Cas1 와 같은 CRISPR-Cas 시스템에 통상적인 단백질이다. 추가 구현예에서, CRISPR 어레이는 새로운 이펙터 단백질을 동정하기 위한 씨드로서 사용된다.
양 및 제제에 대한 것을 포함하여, 방법, 재료, 전달 비히클, 벡터, 입자, 및 이의 제조 및 사용을 포함한, CRISPR-Cas 시스템, 이의 성분, 및 이러한 성분의 전달에 대한 일반 정보, 뿐만 아니라 CRISPR-Cas-발현 진핵생물 세포, CRISPR-Cas 발현 진핵생물, 예컨대 마우스와 관련하여, 하기를 참조한다: 미국 특허 Nos. 8,999,641, 8,993,233, 8,697,359, 8,771,945, 8,795,965, 8,865,406, 8,871,445, 8,889,356, 8,889,418, 8,895,308, 8,906,616, 8,932,814, 및 8,945,839; 미국 특허 공보 US 2014-0310830 (미국 출원 Ser. No. 14/105,031), US 2014-0287938 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/213,991), US 2014-0273234 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/293,674), US2014-0273232 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/290,575), US 2014-0273231 (미국 출원 Ser. No. 14/259,420), US 2014-0256046 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/226,274), US 2014-0248702 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/258,458), US 2014-0242700 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/222,930), US 2014-0242699 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/183,512), US 2014-0242664 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/104,990), US 2014-0234972 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/183,471), US 2014-0227787 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/256,912), US 2014-0189896 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/105,035), US 2014-0186958 (미국 출원 Ser. No. 14/105,017), US 2014-0186919 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/104,977), US 2014-0186843 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/104,900), US 2014-0179770 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/104,837) 및 US 2014-0179006 A1 (미국 출원 Ser. No. 14/183,486), US 2014-0170753 (US App Ser No 14/183,429); US 2015-0184139 (미국 출원 Ser. No. 14/324,960); 14/054,414 유럽 특허 출원 EP 2 771 468 (EP13818570.7), EP 2 764 103 (EP13824232.6), 및 EP 2 784 162 (EP14170383.5); 및 PCT 특허 공보 WO2014/093661 (PCT/US2013/074743), WO2014/093694 (PCT/US2013/074790), WO2014/093595 (PCT/US2013/074611), WO2014/093718 (PCT/US2013/074825), WO2014/093709 (PCT/US2013/074812), WO2014/093622 (PCT/US2013/074667), WO2014/093635 (PCT/US2013/074691), WO2014/093655 (PCT/US2013/074736), WO2014/093712 (PCT/US2013/074819), WO2014/093701 (PCT/US2013/074800), WO2014/018423 (PCT/US2013/051418), WO2014/204723 (PCT/US2014/041790), WO2014/204724 (PCT/US2014/041800), WO2014/204725 (PCT/US2014/041803), WO2014/204726 (PCT/US2014/041804), WO2014/204727 (PCT/US2014/041806), WO2014/204728 (PCT/US2014/041808), WO2014/204729 (PCT/US2014/041809), WO2015/089351 (PCT/US2014/069897), WO2015/089354 (PCT/US2014/069902), WO2015/089364 (PCT/US2014/069925), WO2015/089427 (PCT/US2014/070068), WO2015/089462 (PCT/US2014/070127), WO2015/089419 (PCT/US2014/070057), WO2015/089465 (PCT/US2014/070135), WO2015/089486 (PCT/US2014/070175), WO2015/058052 (PCT/US2014/061077), WO2015/070083 (PCT/US2014/064663), WO2015/089354 (PCT/US2014/069902), WO2015/089351 (PCT/US2014/069897), WO2015/089364 (PCT/US2014/069925), WO2015/089427 (PCT/US2014/070068), WO2015/089473 (PCT/US2014/070152), WO2015/089486 (PCT/US2014/070175), WO2016/049258 (PCT/US2015/051830), WO2016/094867 (PCT/US2015/065385), WO2016/094872 (PCT/US2015/065393), WO2016/094874 (PCT/US2015/065396), WO2016/106244 (PCT/US2015/067177).
미국 출원 62/180,709, 17-Jun-15, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); 미국 출원 62/091,455, 출원일, 12-Dec-14, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); 미국 출원 62/096,708, 24-Dec-14, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); 미국 출원 62/091,462, 12-Dec-14, 62/096,324, 23-Dec-14, 62/180,681, 17-Jun-2015, 및 62/237,496, 5-Oct-2015, DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTION FACTORS; 미국 출원 62/091,456, 12-Dec-14 및 62/180,692, 17-Jun-2015, ESCORTED AND FUNCTIONALIZED GUIDES FOR CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/091,461, 12-Dec-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING AS TO HEMATOPOETIC STEM CELLS (HSCs); 미국 출원 62/094,903, 19-Dec-14, UNBIASED IDENTIFICATION OF DOUBLE-STRAND BREAKS AND GENOMIC REARRANGEMENT BY GENOME-WISE INSERT CAPTURE SEQUENCING; 미국 출원 62/096,761, 24-Dec-14, ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS FOR SEQUENCE MANIPULATION; 미국 출원 62/098,059, 30-Dec-14, 62/181,641, 18-Jun-2015, 및 62/181,667, 18-Jun-2015, RNA-TARGETING SYSTEM; 미국 출원 62/096,656, 24-Dec-14 및 62/181,151, 17-Jun-2015, CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH DESTABILIZATION DOMAINS; 미국 출원 62/096,697, 24-Dec-14, CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH AAV; 미국 출원 62/098,158, 30-Dec-14, ENGINEERED CRISPR COMPLEX INSERTIONAL TARGETING SYSTEMS; 미국 출원 62/151,052, 22-Apr-15, CELLULAR TARGETING FOR EXTRACELLULAR EXOSOMAL REPORTING; 미국 출원 62/054,490, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS; 미국 출원 61/939,154, 12-FEB-14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/055,484, 25-Sep-14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/087,537, 4-Dec-14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/054,651, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO; 미국 출원 62/067,886, 23-Oct-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO; 미국 출원 62/054,675, 24-Sep-14 및 62/181,002, 17-Jun-2015, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS IN NEURONAL CELLS/TISSUES; 미국 출원 62/054,528, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS IN IMMUNE DISEASES OR DISORDERS; 미국 출원 62/055,454, 25-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING CELL PENETRATION PEPTIDES (CPP); 미국 출원 62/055,460, 25-Sep-14, MULTIFUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; 미국 출원 62/087,475, 4-Dec-14 및 62/181,690, 18-Jun-2015, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/055,487, 25-Sep-14, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/087,546, 4-Dec-14 및 62/181,687, 18-Jun-2015, MULTIFUNCTIONAL CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; 및 미국 출원 62/098,285, 30-Dec-14, CRISPR MEDIATED IN VIVO MODELING AND GENETIC SCREENING OF TUMOR GROWTH AND METASTASIS 가 언급된다.
미국 출원 62/181,659, 18-Jun-2015 및 62/207,318, 19-Aug-2015, ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, METHODS, ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS OF CAS9 ORTHOLOGS AND VARIANTS FOR SEQUENCE MANIPULATION 이 언급된다. 미국 출원 62/181,663, 18-Jun-2015 및 62/245,264, 22-Oct-2015, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS, 미국 출원 62/181,675, 18-Jun-2015, 62/285,349, 22-Oct-2015, 62/296,522, 17-Feb-2016, 및 62/320,231, 8-Apr-2016, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS, 미국 출원 62/232,067, 24-Sep-2015, 미국 출원 14/975,085, 18-Dec-2015, 유럽 출원 No. 16150428.7, 미국 출원 62/205,733, 16-Aug-2015, 미국 출원 62/201,542, 5-Aug-2015, 미국 출원 62/193,507, 16-Jul-2015, 및 미국 출원 62/181,739, 18-Jun-2015, 각각의 발명의 명칭 NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS 및 미국 출원 62/245,270, 22-Oct-2015, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS 이 언급된다. 미국 출원 61/939,256, 12-Feb-2014, 및 WO 2015/089473 (PCT/US2014/070152), 12-Dec-2014 (발명의 명칭: ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED GUIDE COMPOSITIONS WITH NEW ARCHITECTURES FOR SEQUENCE MANIPULATION) 이 또한 언급된다. PCT/US2015/045504, 15-Aug-2015, 미국 출원 62/180,699, 17-Jun-2015, 및 미국 출원 62/038,358, 17-Aug-2014, 각각의 발명의 명칭 GENOME EDITING USING CAS9 NICKASES 가 또한 언급된다. 2017 년 12 월 22 일에 출원된 미국 출원 62/610,066; 2018 년 1 월 29 일에 출원된 미국 출원 62/623,546, 및 2018 년 2 월 14 일에 출원된 미국 출원 62/630,814, 각각의 발명의 명칭 CRISPR EFFECTOR SYSTEM BASED MULTIPLEX DIAGNOSTICS 에 공개된 검출 방법이 언급된다.
각각의 이들 특허, 특허 공보 및 출원, 및 그들 심사 동안 또는 그에 인용된 모든 문헌 ("출원 인용 문헌") 및 출원 인용 문헌에서 인용 또는 참조된 모든 문헌은 거기에서 또는 거기에 인용된 임의 문헌에서 언급되는 임의 제품에 대한 임의의 지시서, 설명서, 제품 사양서, 및 제품 시트와 함께, 참조로 본 명세서에 포함되며, 본 발명의 실시에서 이용될 수 있다. 모든 문헌 (예를 들어, 이들 특허, 특허 공보 및 출원 및 출원 인용 문헌) 은 각각의 개별 문헌이 특별히 개별적으로 참조로 포함된다고 표시된 바와 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
데드 CRISPR/Cas 효소
특정 구현예에서, 본 명세서에 정의한 바와 같은 조작된 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 를 사용하게 하는데 관심이 있고, 여기서 단백질은 RNA 를 포함하는 핵산 분자와 복합체를 형성하여 CRISPR 복합체를 형성하고, CRISPR 복합체에서, 핵산 분자가 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌를 표적화할 때, 단백질은 비변형 Cas9 단백질에 비해 적어도 하나의 변형을 포함하고, 변형된 단백질을 포함하는 CRISPR 복합체는 비변형 Cas 단백질을 포함하는 복합체에 비해 변경된 활성을 갖는다. 본 명세서에서 CRISPR "단백질" 을 언급할 때, Cas 단백질은 바람직하게는 예컨대 제한 없이 Cas9 를 포함하여, 변형된 CRISPR-Cas 단백질 (예를 들어, 증가된 또는 감소된 (또는 부재하는) 효소 활성을 가짐) 이라는 것이 이해된다. 용어 "CRISPR 단백질" 은 야생형 CRISPR 단백질에 비해서 CRISPR 단백질이 변경된, 예컨대, 증가된 또는 감소된 (또는 부재하는) 효소 활성을 갖는지 여부와 무관하게, "CRISPR-Cas 단백질" 과 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, CRISPR-Cas 단백질에 대한 용어 "변형된" 은 일반적으로 그것이 유래된 야생형 Cas 단백질과 비교하여 하나 이상의 변형 또는 돌연변이 (점 돌연변이, 절단, 삽입, 결실, 키메라, 융합 단백질 등 포함) 를 갖는 CRISPR-Cas 단백질을 의미한다. 유래된은 유래된 효소가 대체로 높은 서열 상동성 정도를 갖는다는 의미에서, 야생형 효소를 기반으로 하지만, 당분야에 공지되거나 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 일부 방식으로 돌연변이 (변형) 되었다는 것을 의미한다. 대안적으로, 효소 활성이 부재하는 그러한 변형된 단백질은 데드 단백질, 또는 데드 CRISPR/Cas 효소로 언급될 수 있다.
CRISPR-Cas 단백질의 추가 변형은 변경된 기능성을 야기할 수도 있거나 또는 그렇지 않을 수도 있다. 예로서, 특히 CRISPR-Cas 단백질을 참조하여, 변경된 기능성을 야기하지 않는 변형은 예를 들어 특정 숙주에서 발현을 위한 코돈 최적화, 또는 뉴클레아제에 특정 마커 (예를 들어, 가시화용) 를 제공하는 것을 포함한다. 변경된 기능성을 야기시킬 수 있는 변형은 또한 키메라 뉴클레아제 (예를 들어, 상이한 오솔로그 또는 상동체 유래 도메인 포함) 또는 융합 단백질을 비롯하여, 점 돌연변이, 삽입, 결실, 절두 (분할 뉴클레아제 포함) 등을 포함한, 돌연변이를 포함할 수 있다. 융합 단백질은 제한 없이 예를 들어 이종성 도메인 또는 기능성 도메인 (예를 들어, 국재화 신호, 촉매 도메인 등) 과의 융합을 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 다양한 상이한 변형은 조합될 수 있다 (예를 들어, 촉매적으로 불활성이고, 예컨대 예를 들어 DNA 메틸화, 또는 예컨대 제한 없이 파단 (예를 들어, 상이한 뉴클레아제 (도메인) 에 의함), 돌연변이, 결실, 삽입, 치환, 결찰, 분해, 파단 또는 재조합을 포함한, 다른 핵산 변형을 유도하기 위해 기능성 도메인에 추가로 융합된 돌연변이된 뉴클레아제). 본 명세서에서 사용되는 "변경된 기능성" 은 제한 없이 변경된 특이성 (예를 들어, 변경된 표적 인식, 증가 (예를 들어, "증강된" Cas 단백질) 또는 감소된 특이성, 또는 변경된 PAM 인식), 변경된 활성 (예를 들어, 촉매적으로 불활성인 뉴클레아제 또는 닉카제를 포함하는 증가 또는 감소된 촉매 활성), 및/또는 변경된 안정성 (예를 들어, 탈안정화 도메인과 융합) 을 포함한다. 적합한 이종성 도메인은 제한 없이 뉴클레아제, 리가제, 복구 단백질, 메틸트랜스퍼라제, (바이러스) 인테그라제, 리콤비나제, 트랜스포사제, 아르고노트, 시티딘 데아미나제, 레트론, 그룹 II 인트론, 포스파타제, 포스포릴라제, 술프퓨릴라제, 키나제, 중합효소, 엑소뉴클레아제 등을 포함한다. 모든 이들 변형의 예는 당해 기술분야에 알려져 있다. 본 명세서에 언급된 바와 같은 "변형된", 및 특히 "변형된" Cas 또는 "변형된" CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체는 바람직하게 여전히 (예를 들어, 가이드 분자와의 복합체로) 폴리핵산과 상호작용 또는 결합하는 능력을 갖는다는 것을 이해할 것이다. 이러한 변형된 Cas 단백질은 본 명세서에 기술된 바와 같은 데아미나제 단백질 또는 이의 활성 도메인과 조합될 수 있다.
일정 실시형태에서, CRISPR-Cas 단백질은 예컨대 표적화 또는 비표적화 가닥을 안정화시키는 돌연변이된 잔기를 포함하여, 증강된 활성 및/또는 특이성을 초래하는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다 (예를 들어, 그 전문이 참조로 본 명세서에 포함되는, eCas9; "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity", Slaymaker et al. (2016), Science, 351(6268):84-88 참조). 일정 구현예에서, 조작된 CRISPR 단백질의 변경된 또는 변형된 활성은 증가된 표적화 효율 또는 감소된 오프-표적 결합을 포함한다. 일정 구현예에서, 조작된 CRISPR 단백질의 변경된 활성은 변형된 절단 활성을 포함한다. 일정 구현예에서, 변경된 활성은 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해 증가된 절단 활성을 포함한다. 일정 구현예에서, 변경된 활성은 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해 감소된 절단 활성을 포함한다. 일정 구현예에서, 변경된 활성은 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해 감소된 절단 활성을 포함한다. 일정 구현예에서, 변형된 뉴클레아제의 변경된 또는 변형된 활성은 변경된 헬리카제 동역학을 포함한다. 일정 구현예에서, 변형된 뉴클레아제는 RNA 를 포함하는 핵산 분자 (Cas 단백질의 경우), 또는 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌의 가닥, 또는 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌의 가닥과 단백질의 회합을 변경하는 변형을 포함한다. 본 발명의 일 양상에서, 조작된 CRISPR 단백질은 CRISPR 복합체의 형성을 변경시키는 변형을 포함한다. 일정 구현예에서, 변경된 활성은 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해 증가된 절단 활성을 포함한다. 따라서, 일정 구현예에서, 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌와 비교하여 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대한 증가된 특이성이 존재한다. 다른 구현예에서, 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌와 비교하여 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해 감소된 특이성이 존재한다. 일정 구현예에서, 돌연변이는 감소된 오프-표적 효과 (예를 들어, 절단 또는 결합 특성, 활성, 또는 동역학) 를 초래하며, 예컨대 Cas 단백질의 경우에 예를 들어 표적과 가이드 RNA 간 미스매치에 대해 더 낮은 용인을 초래한다. 다른 돌연변이는 증가된 오프-표적 효과 (예를 들어, 절단 또는 결합 성질, 활성 또는 동역학) 를 야기시킬 수 있다. 다른 돌연변이는 증가되거나 또는 감소된 온-표적 효과 (예를 들어, 절단 또는 결합 성질, 활성 또는 동역학) 를 야기시킬 수 있다. 일정 구현예에서, 돌연변이는 변경된 (예를 들어, 증가 또는 감소된) 헬리카제 활성, 기능적 뉴클레아제 복합체 (예를 들어, CRISPR-Cas 복합체) 의 회합 또는 형성을 초래한다. 일정 구현예에서, 돌연변이는 비변형된 Cas 단백질과 비교하여 변경된 PAM 인지를 초래하며, 즉 상이한 PAM 가 (추가로 또는 대안으로) 인지될 수 있다 (예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는 "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities", Kleinstiver et al. (2015), Nature, 523(7561):481-485 를 참조한다). 특히 바람직한 돌연변이는 특이성을 증강시키기 위해서 양으로 하전된 잔기 및/또는 (진화적으로) 보존된 잔기, 에컨대 보존된 양으로 하전된 잔기를 포함한다. 일정 구현예에서, 이러한 잔기는 비하전된 잔기, 예컨대 알라닌으로 돌연변이될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 조작된 Cas9 단백질, 예컨대 Cas9 를 만드는 것에 관심이 있고, 이 단백질은 RNA 를 포함하는 핵산 분자와 복합체를 형성하여 CRISPR 복합체가 형성되고, CRISPR 복합체로 있을 때, 핵산 분자는 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드 유전자를 표적화하고, 단백질은 비변형된 Cas 단백질과 비교하여 적어도 하나의 변형을 포함하며, 변형된 단백질을 포함하는 CRISPR 복합체는 비변형된 Cas9 단백질을 포함하는 복합체와 비교하여 변경된 활성을 갖는다. 본 명세서에서 CRISPR "단백질" 을 언급할 때, Cas 단백질은 바람직하게는 예컨대 제한 없이 Cas9 를 포함하여, 변형된 CRISPR-Cas 단백질 (예를 들어, 증가된 또는 감소된 (또는 부재하는) 효소 활성을 가짐) 이라는 것이 이해된다. 용어 "CRISPR 단백질" 은 야생형 CRISPR 단백질에 비해서 CRISPR 단백질이 변경된, 예컨대, 증가된 또는 감소된 (또는 부재하는) 효소 활성을 갖는지 여부와 무관하게, "CRISPR-Cas 단백질" 과 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cas 의 상동체 또는 오솔로그는 Cas9 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cas 의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 Cas 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다. Cas 가 하나 이상의 돌연변이를 갖는 (돌연변이된) 경우에, 본 명세서에서 언급되는 상기 Cas 의 상동체 또는 오솔로그는 돌연변이된 Cas 와 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 예컨대 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다.
일정 구현예에서, Cas9 단백질의 하나 이상의 촉매 도메인 (예를 들어, Cas9 단백질의 RuvC I, RuvC II, 및 RuvC III 또는 HNH 도메인) 은 표적 서열의 오직 하나의 DNA 가닥을 절단하는 돌연변이된 Cas 단백질을 생성시키도록 돌연변이된다.
추가의 지침을 통해서, 제한 없이, 예를 들어, 에스. 피오게네스 (S. pyogenes) 유래 Cas9 의 RuvC I 촉매 도메인에서 아스파테이트에서 알라닌으로의 치환 (D10A) 은 Cas9 를 양쪽 가닥을 절단하는 뉴클레아제에서 (단일 가닥을 절단하는) 닉카제로 전환시킨다. Cas9 를 닉카제가 되게 하는 돌연변이의 다른 예는, 제한 없이, H840A, N854A, 및 N863A 를 포함한다. 추가 지침으로서, 효소가 SpCas9 가 아닌 경우에, 돌연변이는 (예를 들어 표준 서열 비교 도구를 통해서 확인할 수 있는) SpCas9 의 위치 10, 762, 840, 854, 863 및/또는 986 에 상응하는 임의의 또는 모든 잔기에서 만들어질 수 있다. 특히, SpCas9 에서 임의의 또는 모든 하기 돌연변이: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A 및/또는 D986A 가 바람직할 뿐만 아니라; 임의의 대체 아미노산에 대한 보존적 치환이 또한 고려된다.
하나의 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 촉매적 불활성 HNH 도메인을 갖는 SpCas9 닉카제 (예를 들어, N863A 돌연변이를 갖는 SpCas9 닉카제) 이다. 또다른 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 촉매적 불활성 HNH 도메인을 갖는 SaCas9 (예를 들어, N580A 돌연변이를 갖는 SaCas9 닉카제) 이다. 또다른 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 HNH 도메인이 부분적으로 또는 완전히 제거된 SpCas9 닉카제이다. 또다른 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 HNH 도메인이 부분적으로 또는 완전히 제거된 SaCas9 이다.
상기 기술된 일정 Cas9 효소에서, 효소는 FnCas9 단백질 또는 임의의 상응하는 오솔로그에 따라서, 제한 없이 위치 D917, E1006, E1028, D1227, D1255A, N1257을 포함하는 하나 이상의 잔기의 돌연변이에 의해 변형된다. 일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 조성물을 제공하고, 여기서 Cas9 효소는 FnCas9 단백질에 따라서 D917A, E1006A, E1028A, D1227A, D1255A 및 N1257A 또는 Cas9 오솔로그 중 상응하는 위치로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 불활성화된 효소이다. 일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 조성물을 제공하고, 여기서 CRISPR-Cas 단백질은 FnCas9 단백질에 따라서 D917, 또는 E1006 및 D917, 또는 D917 및 D1255, 또는 Cas9 오솔로그의 상응하는 위치를 포함한다.
일정 구현예에서, Cas9 의 변형 또는 돌연변이는 RuvCI, RuvCIII, RuvCIII 또는 HNH 도메인 내 돌연변이를 포함한다. 일정 구현예에서, 변형 또는 돌연변이는 SpCas9 의 아미노산 위치 넘버링에 관하여 위치 12, 13, 63, 415, 610, 775, 779, 780, 810, 832, 848, 855, 861, 862, 866, 961, 968, 974, 976, 982, 983, 1000, 1003, 1014, 1047, 1060, 1107, 1108, 1109, 1114, 1129, 1240, 1289, 1296, 1297, 1300, 1311, 및 1325 중 하나 이상; 바람직하게는 855; 810, 1003, 및 1060; 또는 848, 1003 에서 아미노산 치환을 포함한다. 일정 구현예에서, 위치 63, 415, 775, 779, 780, 810, 832, 848, 855, 861, 862, 866, 961, 968, 974, 976, 982, 983, 1000, 1003, 1014, 1047, 1060, 1107, 1108, 1109, 1114, 1129, 1240, 1289, 1296, 1297, 1300, 1311, 또는 1325; 바람직하게는 855; 810, 1003, 및 1060; 848, 1003, 및 1060; 또는 497, 661, 695, 및 926 에서의 변형 또는 돌연변이는 알라닌 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변형은 K855A; K810A, K1003A, 및 R1060A; 또는 K848A, K1003A (SpCas9 에 관하여), 및 R1060A 를 포함한다. 특정 구현예에서, 변형은 N497A, R661A, Q695A, 및 Q926A (SpCas9 에 관하여) 를 포함한다.
추가 예로서, Cas9 의 둘 이상의 촉매 도메인 (RuvC I, RuvC II, 및 RuvC III 또는 HNH 도메인) 은 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 돌연변이된 Cas9 를 생성시키도록 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, D10A 돌연변이는 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 Cas9 효소를 생성시키도록 H840A, N854A, 또는 N863A 돌연변이 중 하나 이상과 조합된다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 돌연변이된 효소의 DNA 절단 활성이 이의 비돌연변이된 형태에 비해서 약 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 미만이거나 또는 그보다 낮을 때 모든 DNA 절단 활성을 실질적으로 결여한 것으로 간주된다. 효소가 SpCas9 가 아닌 경우, 돌연변이는 (예를 들어 표준 서열 비교 도구에 의해 확인할 수 있는) SpCas9 의 위치 10, 762, 840, 854, 863 및/또는 986 에 상응하는 임의의 또는 모든 잔기에서 만들어질 수 있다. 특히, SpCas9 에서 임의의 또는 모든 하기 돌연변이: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A 및/또는 D986A 가 바람직할 뿐만 아니라; 임의의 대체 아미노산에 대한 보존적 치환이 또한 고려된다. 다른 Cas9 의 상응하는 위치에서 동일한 것 (또는 이들 돌연변이의 보존적 치환) 이 또한 바람직하다. 특히 바람직한 것은 SpCas9 의 D10 및 H840 이다. 그러나, 다른 Cas9 에서, SpCas9 D10 및 H840 에 상응하는 잔기가 또한 바람직하다.
일정 예의 구현예에서, 조성물, 시스템, 및 어세이는 하나 이상의 Cas9 오솔로그와 조합하여 하나 이상의 오솔로그 또는 다수의 Cas12 오솔로그를 포함할 수 있다. 일정 예의 구현예에서, Cas12 오솔로그는 Cpf1 오솔로그, C2c1오솔로그, 또는 C2c3 오솔로그이다.
본 발명은 아형 V-A로서 표시되는 Cpf1 유전자좌로부터 유래되는, 야생형 Cpf1 이펙터 단백질의 돌연변이된 형태를 기반으로 하는 닉카제의 사용을 포괄한다. 본 명세서에서 이러한 이펙터 단백질은 또한 "Cpf1p", 예를 들어, Cpf1 단백질이라고도 한다 (그리고 이러한 이펙터 단백질 또는 Cpf1 단백질 또는 Cpf1 유전자좌로부터 유래된 단백질은 또한 "CRISPR 효소" 라고도 한다). 현재, 아형 V-A 유전자좌는 cas1, cas2, cpf1 로 나타낸 별개의 유전자 및 CRISPR 어레이를 포함한다. Cpf1 (CRISPR-연관 단백질 Cpf1, 아형 PREFRAN) 은 Cas9 의 특징적인 아르기닌-풍부 클러스터의 대응부와 함께 Cas9 의 해당하는 도메인에 상동성인 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 거대 단백질 (약 1300 개 아미노산) 이다. 그러나, Cpf1 은 모든 Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 결여되어 있고, RuvC-유사 도메인은 HNH 도메인을 포함하는 긴 삽입물을 함유하는 Cas9 와 달리 Cpf1 서열에서 연속적이다. 따라서, 특정 구현예에서, CRISPR-Cas 효소는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인만을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf1 의 상동체 또는 오솔로그는 Cpf1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf1 의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 Cpf1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다. Cpf1 이 하나 이상의 돌연변이를 갖는 (돌연변이된) 경우, 본원에서 나타내는 바와 같은 상기 Cpf1 의 상동체 또는 오솔로그는 돌연변이된 Cpf1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, Cpf1 단백질은 제한 없이 악시다미노코쿠스 sp (Acidaminococcus sp), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) 또는 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 를 포함하는 속의 유기체의 오솔로그일 수 있고; 특정 구현예에서, 유형 V Cas 단백질은 제한 없이 악시다미노코쿠스 sp. BV3L6; 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006 (LbCpf1) 또는 모락셀라 보보쿨리 237 을 포함하는 종의 유기체의 오솔로그일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 언급되는 Cpf1 의 상동체 또는 오솔로그는 본 명세서에 개시된 Cpf1 서열 중 하나 이상 과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 예컨대 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본 명세서에서 언급되는 Cpf1 의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 FnCpf1, AsCpf1 또는 LbCpf1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 예컨대 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 Cpf1 단백질은 FnCpf1, AsCpf1 또는 LbCpf1 과 적어도 60%, 보다 특히 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf1 단백질은 야생형 AsCpf1 또는 LbCpf1 과 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 보다 특히 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 Cpf1 단백질은 FnCpf1 과 60% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 당업자는 이것이 Cpf1 단백질의 절두 형태를 포함하고, 이에 의해 절두 형태의 길이에 대해 서열 동일성이 결정된다는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, Cpf1 단백질은 Nuc 도메인에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cpf1 단백질은 표적화된 DNA 가닥과 가이드 분자 간의 헤테로듀플렉스의 형성으로 치환된 관심 유전자좌에서 비-표적화된 DNA 가닥을 닉킹시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, Cpf1 단백질은 AsCpf1 내 R1226A 에 해당하는 돌연변이를 포함한다.
추가 지침으로서, 제한 없이, 아시다미노코쿠스 sp. 유래 Cas13 의 Nuc 도메인에서 아르기닌-아르기닌 (arginine-to-alanine) 치환 (R1226A) 은 Cas13을 양쪽 가닥을 절단하는 뉴클레아제에서 (단일 가닥을 절단하는) 닉카제로 전환시킨다. 상기 효소가 AsCpf1 이 아닌 경우에, 돌연변이는 대응하는 위치에서의 잔기에서 만들어질 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 특정 구현예에서, Cpf1 은 FnCpf1 이고 돌연변이는 위치 R1218 의 아르기닌에 존재한다. 특정 실시형태에서, Cpf1 은 LbCpf1 이고, 돌연변이는 위치 R1138 에서의 알기닌에서이다. 특정 구현예에서, Cpf1 은 MbCpf1 이고 돌연변이는 위치 R1293 의 아르기닌에 존재한다.
특정 예시적 구현예에서 본 발명운 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함하는 촉매적 불활성 C2c1 을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적 불활성 C2c1 단백질은 알리시클로바실루스 악시도테레스트리스 C2c1 의 아미노산 위치 D570, E848, 또는 D977 에 해당하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적 불활성 C2c1 단백질은 알리시클로바실루스 악시도테레스트리스 C2c1 의 D570A, E848A, 또는 D977A 에 해당하는 돌연변이를 포함한다.
일정 구현예에서, Cas-기반 닉카제는 Nuc 도메인에 돌연변이를 포함하는 C2c1 닉카제이다. 일부 구현예에서, C2c1 닉카제는 알리시클로바실루스 악시도테레스트리스 C2c1 의 아미노산 위치 R911, R1000, 또는 R1015 에 해당하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, C2c1 닉카제는 알리시클로바실루스 악시도테레스트리스 C2c1 의 R911A, R1000A, 또는 R1015A 에 해당하는 돌연변이를 포함한다. 효소가 상기 열거된 CRISPR-Cas 효소가 아닌 경우에, 돌연변이는 상응하는 위치의 잔기에서 만들어질 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
돌연변이는 또한 이웃 잔기, 예를 들어 뉴클레아제 활성에 관여하는 상기 표시된 것 근처 아미노산에서 만들어질 수 있다. 일부 구현예에서, 오직 RuvC 도메인만이 불활성화되고, 다른 구현예에서는, 다른 추정의 뉴클레아제 도메인이 불활성화되며, 여기서 이펙터 단백질 복합체는 닉카제로 기능하고 오직 하나의 DNA 가닥만을 절단한다. 일부 구현예에서, 2종의 CRISPR-Cas 변이체 (각각 상이한 닉카제)는 특이성을 증가시키기 위해 사용되고, 2종의 닉카제 변이체는 표적에서 DNA 를 절단시키는데 사용된다 (여기서 양쪽 닉카제는, 오직 하나의 DNA 가닥이 절단되고 이후에 복구되는 오프-표적 변형을 최소화시키거나 또는 제거시키면서 DNA 가닥을 절단시킴).
일정 구현예에서 C2c1 이펙터 단백질은 2종의 C2c1 이펙터 단백질 분자를 포함하는 동종이량체로서 관심 유전자좌에서 또는 이와 연관된 서열을 절단시킨다. 바람직한 구현예에서, 동종이량체는 그들 개별 RuvC 도메인에 상이한 돌연변이를 포함하는 2종의 C2c1 이펙터 단백질 분자를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 C2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 C2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다. C2c1 이 하나 이상의 돌연변이를 갖는 (돌연변이된) 경우, 본원에서 나타내는 바와 같은 상기 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 돌연변이된 C2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다.
특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 데드 Cas9, 데드 Cpf1, 데드 C2c1, 또는 데드 C2c3 을 포함할 수 있으나, 반드시 그에 한정되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 HNH 및 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함하는 데드 Cas9 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 SpCas9 에 D10A 및 N863A, 또는 SpCas9 에 D10A 및 H840A 에 해당하는 돌연변이를 포함하는 데드 Cas9 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함하는 데드 Cpf1 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 AsCpf1 에 D908A 또는 E993A 에 해당하는 돌연변이를 포함하는 데드 Cpf1 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 Nuc 도메인에 돌연변이를 포함하는 데드 C2c1 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 AacC2c1 에 D570A, E848A, 또는 D977A 에 해당하는 돌연변이를 포함하는 데드 C2c1 단백질일 수 있다.
특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 테르모필루스 (Streptococcus thermophilus), 에스. 뮤탄스 (S. mutans), 에스. 아갈락티아에 (S. agalactiae), 에스. 에퀴시밀리스 (S. equisimilis), 에스. 산귀니스 (S. sanguinis), 에스. 뉴모니아 (S. pneumonia); 씨. 제주니 (C. jejuni), 씨. 콜라이 (C. coli); 엔. 살수기니스 (N. salsuginis), 엔. 테르가르쿠스 (N. tergarcus); 에스. 아우리쿨라리스 (S. auricularis), 에스. 카르노서스 (S. carnosus); 엔. 메닌지티데스 (N. meningitides), 엔. 고노로에아에 (N. gonorrhoeae); 엘. 모노시토게네스 (L. monocytogenes), 엘. 이바노비이 (L. ivanovii); 씨. 보툴리넘 (C. botulinum), 씨. 디피실 (C. difficile), 씨. 테타니 (C. tetani), 씨. 소르델리이 (C. sordellii), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis) 1, 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MC2017 1, 부티리비브리오 프로테오클라스티커스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium) GW2011_GWC2_44_17, 스미텔라 종 (Smithella sp.) SCADC, 악시다미노코쿠스 종 (Acidaminococcus sp.) BV3L6, 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미텀 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 237, 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis) 3, 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카카에 (Porphyromonas macacae) 로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래된 데드 Cas9 단백질일 수 있다.
특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium), 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium), 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium), 스미텔라 종 (Smithella sp.), 아시다미노코쿠스 종 (Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium), 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi), 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카카에 (Porphyromonas macacae), 숙시니비브리오 덱스트리노솔벤스 (Succinivibrio dextrinosolvens), 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens), 플라보박테리움 브란키오필룸 (Flavobacterium branchiophilum), 헬코코쿠스 쿤지이 (Helcococcus kunzii), 유박테리움 종 (Eubacterium sp.), 미크로게노마테스 (Microgenomates) (로이즈만박테리아 (Roizmanbacteria)) 박테리움, 플라보박테리움 종 (Flavobacterium sp.), 프레보텔라 브레비스 (Prevotella brevis), 모락셀라 카프라에 (Moraxella caprae), 박테로이데테스 오랄 (Bacteroidetes oral), 포르피로모나스 칸술치 (Porphyromonas cansulci), 시네르기스테스 조네시이 (Synergistes jonesii), 프레보텔라 브리안티이 (Prevotella bryantii), 아나에로비브리오 종 (Anaerovibrio sp.), 부티리비브리오 피브리솔벤스 (Butyrivibrio fibrisolvens), 칸디다투스 메타노메틸로필루스 (Candidatus Methanomethylophilus), 부티리비브리오 종 (Butyrivibrio sp.), 오리박테리움 종 (Oribacterium sp.), 슈도부티리비브리오 루미니스 (Pseudobutyrivibrio ruminis) 및 프로테오카텔라 스페니치 (Proteocatella sphenisci) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래된 Cpf1 단백질일 수 있다.
특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 알리시클로바실루스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris), 알리시클로바실루스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans), 알리시클로바실루스 마크로스포란지이두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus), 바실루스 히사시이 (Bacillus hisashii), 칸디다투스 린도우박테리아 (Candidatus Lindowbacteria), 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans), 엘루시미크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 (Omnitrophica) WOR_2 박테리움 RIFCSPHIGHO2, 오피투타세아에 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스파에라에 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코미크로비아세아에 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실루스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus), 바실루스 테르모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans), 브레비바실루스 종 (Brevibacillus sp.) CF112, 바실루스 종 (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티라브디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans), 알리시클로바실루스 헤르바리우스 (Alicyclobacillus herbarius), 시트로박테르 프레운디이 (Citrobacter freundii), 브레비바실루스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 및 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래된 C2c1 단백질일 수 있다.
특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 데드 Cas9, 데드 Cas12a, 데드 Cas12b, 또는 데드 Cas12c 이다.
특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 HNH 및 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함하는 데드 Cas9 단백질이다.
특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 SpCas9 에 D10A 및 N863A, 또는 SpCas9 에 D10A 및 H840A 에 해당하는 돌연변이를 포함하는 데드 Cas9 단백질이다.
특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 데드 Cas12 단백질이다. 특정 구현예에서, 데드 Cas12 단백질은 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 데드 Cas12 효소는 데드 Cas12a, Cas12b, Cas12c 이다. 특정 구현예에서, 데드 Cas12a 는 AsCpf1 에 D908A 또는 E993A 에 해당하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 데드 Cas12a 단백질은 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium), 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium), 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium), 스미텔라 종 (Smithella sp.), 아시다미노코쿠스 종 (Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium), 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi), 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카카에 (Porphyromonas macacae), 숙시니비브리오 덱스트리노솔벤스 (Succinivibrio dextrinosolvens), 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens), 플라보박테리움 브란키오필룸 (Flavobacterium branchiophilum), 헬코코쿠스 쿤지이 (Helcococcus kunzii), 유박테리움 종 (Eubacterium sp.), 미크로게노마테스 (Microgenomates) (로이즈만박테리아 (Roizmanbacteria)) 박테리움, 플라보박테리움 종 (Flavobacterium sp.), 프레보텔라 브레비스 (Prevotella brevis), 모락셀라 카프라에 (Moraxella caprae), 박테로이데테스 오랄 (Bacteroidetes oral), 포르피로모나스 칸술치 (Porphyromonas cansulci), 시네르기스테스 조네시이 (Synergistes jonesii), 프레보텔라 브리안티이 (Prevotella bryantii), 아나에로비브리오 종 (Anaerovibrio sp.), 부티리비브리오 피브리솔벤스 (Butyrivibrio fibrisolvens), 칸디다투스 메타노메틸로필루스 (Candidatus Methanomethylophilus), 부티리비브리오 종 (Butyrivibrio sp.), 오리박테리움 종 (Oribacterium sp.), 슈도부티리비브리오 루미니스 (Pseudobutyrivibrio ruminis) 및 프로테오카텔라 스페니치 (Proteocatella sphenisci) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 데드 Cas12 는 Nuc 도메인에 돌연변이를 포함하는 데드 Cas12b 단백질이다. 특정 구현예에서, 데드 Cas12b 는 AacC2c1 에 D570A, E848A, 또는 D977A 에 해당하는 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 데드 Cas12b 단백질은 알리시클로바실루스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris), 알리시클로바실루스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans), 알리시클로바실루스 마크로스포란지이두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus), 바실루스 히사시이 (Bacillus hisashii), 칸디다투스 린도우박테리아 (Candidatus Lindowbacteria), 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans), 엘루시미크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 (Omnitrophica) WOR_2 박테리움 RIFCSPHIGHO2, 오피투타세아에 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스파에라에 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코미크로비아세아에 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실루스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus), 바실루스 테르모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans), 브레비바실루스 종 (Brevibacillus sp.) CF112, 바실루스 종 (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티라브디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans), 알리시클로바실루스 헤르바리우스 (Alicyclobacillus herbarius), 시트로박테르 프레운디이 (Citrobacter freundii), 브레비바실루스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 및 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 제 1 데드 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 데드 CRISPR/Cas 효소는 동일하다. 특정 구현예에서, 제 1 데드 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 데드 CRISPR/Cas 효소는 상이하다. 특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 dCas9, dCas12a, dCas12b, dCas12c, 또는 dCas14 이다.
특정 구현예에서, 중합효소는 Bst 2.0 DNA 중합효소, Bst 2.0 WarmStart DNA 중합효소, Bst 3.0 DNA 중합효소, 전체 길이 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bsu DNA 중합효소, phi29 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, Gst 중합효소, Taq 중합효소, 이. 콜라이 DNA 중합효소 I 의 클레노우 단편, KlenTaq DNA 중합효소, Pol III DNA 중합효소, T5 DNA 중합효소 및 시쿼나제 DNA 중합효소로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 헬리카제는 UvrD 헬리카제, CRISPR-Cas3 헬리카제, 이. 콜라이 헬리카제 I, 이. 콜라이 헬리카제 II, 이. 콜라이 헬리카제 III, 이. 콜라이 헬리카제 IV, Rep 헬리카제, DnaB 헬리카제, PriA 헬리카제, PcrA 헬리카제, T4 Gp41 헬리카제, T4 Dda 헬리카제, SV40 대형 T 항원, 효소 RAD 헬리카제, RecD 헬리카제, RecQ 헬리카제, 열안정성 T. 텡콘겐시스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 테르모필루스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 아쿠아티쿠스 DnaB 헬리카제, Dda 헬리카제, 파필로마 바이러스 E1 헬리카제, 고세균 MCM 헬리카제, 진핵생물 MCM 헬리카제, 및 T7 Gp4 헬리카제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
가이드 서열
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가이드 서열", "crRNA", "가이드 RNA" 또는 "단일 가이드 RNA" 또는 "gRNA" 는 표적 핵산 서열과 하이브리드화하고 표적 핵산 서열에 대한 가이드 서열 및 CRISPR 이펙터 단백질을 포함하는 RNA-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 표적 핵산 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 예시적 구현예에서, 적합한 정렬 알고리즘을 이용하여 최적으로 정렬될 때 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적합한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬 (Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 트랜스폼 (Burrows-Wheeler Transform) 에 기초한 알고리즘 (예를 들어, 버로우즈 휠러 얼라이너 (Burrows Wheeler Aligner)), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies: www.novocraft.com 에서 이용가능함), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (soap.genomics.org.cn 에서 이용가능) 및 Maq (maq.sourceforge.net 에서 이용가능) 를 포함한다. 표적 핵산 서열에 대한 핵산-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 (핵산-표적화 가이드 RNA 내의) 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 어세이에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 가이드 서열을 비롯한 핵산-표적화 복합체를 형성하는데 충분한 핵산-표적화 CRISPR 시스템의 성분은 상응하는 표적 핵산 서열을 갖는 숙주 세포에, 예컨대, 핵산-표적화 복합체 성분을 인코딩하는 벡터에 의한 형질감염, 이후 표적 핵산 서열 내의 우선적인 표적화 (예를 들어, 절단) 평가에 의해, 예컨대, 본원에서 기재된 바와 같은 Surveyor 어세이에 의해 제공될 수 있다. 유사하게는, 표적 핵산 서열의 절단은 시험될 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 비롯한, 핵산-표적화 복합체 성분인 표적 핵산 서열을 제공함으로써, 그리고 시험 가이드 서열과 대조군 가이드 서열 반응 사이의 표적 서열에서의 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험 튜브에서 평가될 수 있다. 다른 어세이가 가능하며, 당업자에게 떠오를 것이다. 임의의 표적 핵산 서열을 표적화하기 위해 가이드 서열, 및 그에 따른 핵산-표적화 가이드가 선택될 수 있다. 표적 서열은 DNA 일 수 있다. 표적 서열은 임의의 RNA 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 메신저 RNA (mRNA), 프리-mRNA, 리보솜 RNA (rRNA), 전달 RNA (tRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 소형 핵소체 (small nucleolar RNA:snoRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 비-코딩 RNA (ncRNA), 장형 비-코딩 RNA (lncRNA) 및 소형 세포질 RNA (scRNA) 로 이루어지는 군으로부터 선택된 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA, 프리-mRNA 및 rRNA 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 ncRNA 및 lncRNA 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 보다 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA 분자 또는 프리-mRNA 분자 내의 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산-표적화 가이드는 핵산-표적화 가이드 내에서 2차 구조 정도를 감소시키도록 선택된다. 일부 구현예에서, 최적으로 폴딩될 때 핵산-표적화 가이드의 뉴클레오티드의 약 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이하가 자기-상보성 염기 짝짓기에 참여한다. 최적의 폴딩은 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 깁스 (Gibbs) 자유 에너지의 계산을 기반으로 한다. 한가지 이러한 알고리즘의 예는 Zuker 및 Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148)가 기술한 바와 같은 mFold이다. 또 다른 폴딩 알고리즘의 예는 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하여, 비엔나 대학의 이론 화학 연구소 (Institute for Theoretical Chemistry at the University of Vienna) 에서 개발한 온라인 웹서버 RNAfold 이다 (예를 들어, A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; 및 PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62 참조).
특정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 crRNA 는 직접 반복 (DR) 서열 및 가이드 서열 또는 스페이서 서열을 포함할 수 있거나, 그로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 그로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 crRNA 는 가이드 서열 또는 스페이서 서열에 융합되거나 연결된 직접 반복 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 그로 이루어질 수 있거나, 그로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 직접 반복 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열의 상류 (즉, 5') 에 위치될 수 있다. 다른 구현예에서, 직접 반복 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열의 하류 (즉, 3') 에 위치될 수 있다.
특정 구현예에서, crRNA 는 스템 루프, 바람직하게 단일 스템 루프를 포함한다. 특정 구현예에서, 직접 반복 서열은 스템 루프, 바람직하게 단일 스템 루프를 형성한다.
특정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 15 내지 35 nt 이다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 적어도 15 개 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 스페이서 길이는 15 내지 17 nt, 예를 들어, 15, 16 또는 17 nt, 17 내지 20 nt, 예를 들어, 17, 18, 19 또는 20 nt, 20 내지 24 nt, 예를 들어, 20, 21, 22, 23 또는 24 nt, 23 내지 25 nt, 예를 들어, 23, 24 또는 25 nt, 24 내지 27 nt, 예를 들어, 24, 25, 26 또는 27 nt, 27-30 nt, 예를 들어, 27, 28, 29 또는 30 nt, 30-35 nt, 예를 들어, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35 nt, 또는 35 nt 이상이다.
일반적으로, CRISPR-Cas, CRISPR-Cas9 또는 CRISPR 시스템은 전술한 문헌, 예컨대 WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667) 에서 사용된 대로 일 수 있고, Cas 유전자, 특히 CRISPR-Cas9 의 경우에 Cas9 유전자를 코딩하는 서열, tracr (trans-activating CRISPR) 서열 (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우에 "직접 반복부" 및 tracrRNA-프로세싱된 부분 직접 반복부 포함), 가이드 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우에 "스페이서" 라고도 함), 또는 이 용어가 본 명세서에서 사용되는 대로의 "RNA(들)" (예를 들어, 가이드 Cas9 에 대한 RNA(들), 예를 들어, CRISPR RNA 및 트랜스활성화 (tracr) RNA 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA) (키메라 RNA)) 또는 CRISPR 유전자좌 유래의 다른 서열 및 전사물을 포함하는, CRISPR-연관 ("Cas") 유전자의 발현 또는 그의 활성 유도에 관여하는 전사물 및 다른 엘리먼트를 집합적으로 의미한다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 엘리먼트 (내생의 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서 (protospacer) 로서도 지칭됨) 에 의해 특징지어진다. CRISPR 복합체 형성의 맥락에서, "표적 서열" 은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 사이의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시킨다. 표적 서열에 대한 상보성이 절단 활성에 중요한 가이드 서열의 섹션은 본원에서 종자 서열로서 지칭된다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치되고, 미토콘드리아, 세포기관, 소수포, 리포좀 또는 세포 내에 존재하는 입자에서의 또는 이들로부터의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 특히 비-핵 용도를 위해, NLS 는 바람직하지 않다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 하나 이상의 핵 유출 신호 (NES) 를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 하나 이상의 NLS 및 하나 이상의 NES 를 포함한다. 일부 구현예에서, 하기 기준 중 임의의 것 또는 모두를 충족시키는 반복 모티프를 탐색함으로써, 직접 반복부가 가상 환경에서 (in silico) 식별될 수 있다: 1. II형 CRISPR 유전자좌에 측접하는 게놈 서열의 2Kb 윈도우에서 발견됨; 2. 20 내지 50 bp 범위임; 및 3. 20 내지 50 bp 간격을 둠. 일부 구현예에서, 이들 기준 중 2 가지, 예를 들어 1 과 2, 2 와 3, 또는 1 과 3 이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 3 가지 기준 모두가 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 용어 가이드 서열 및 가이드 RNA, 즉, 표적 게놈 좌위에 Cas를 가이드할 수 있는 RNA 는 앞서 언급한 인용된 문헌, 예컨대 WO 2014/093622(PCT/US2013/074667) 에서와 같이 상호 호환 가능하게 사용된다. 일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과의 혼성화를 위해 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 충분한 상보성 및 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 직접 서열-특이적 결합을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 구현예에서, 적합한 배열 알고리즘을 이용하여 최적으로 정렬될 때 가이듣 서열과 그의 대응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있고, 이의 비제한적인 예는 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분취 (Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우스-윌러 (Burrows-Wheeler) 전환 기반 알고리즘 (예를 들어, 버로우 윌러 얼라이너), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; novocraft.com 에서 이용가능), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (soap.genomics.org.cn 에서 이용가능), 및 Maq (maq.sourceforge.net 에서 이용가능) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는, 가이드 서열은 10 내지 30 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 분석에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 가이드 서열을 비롯하여 CRISPR 복합체를 형성하는 데 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 대응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에, 예컨대 CRISPR 서열의 성분을 암호화하는 벡터로 형질감염에 의해, 그 다음에 표적 서열 내의 우선적인 절단의 평가, 예컨대 본 명세서에 기재된 바와 같은 서베이어(Surveyor) 분석에 의해 대응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에 제공될 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 절단은 시험될 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 비롯한 CRISPR 복합체 성분인 표적 서열을 제공함으로써, 그리고 시험 가이드 서열 반응과 대조군 가이드 서열 반응 사이에 표적 서열에서의 결합 또는 절단율을 비교함으로써, 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 어세이가 가능하며, 해당 분야의 숙련자에게 일어날 것이다.
CRISPR-Cas 시스템의 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이 에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 또는 100% 이상일 수 있고; 가이드 또는 RNA 또는 sgRNA 는 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있거나; 가이드 또는 RNA 또는 sgRNA 는 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 길이일 수 있고; 유리하게는 tracr RNA 는 30 또는 50 개 뉴클레오티드 길이이다. 그러나, 본 발명의 측면은 표적외 상호작용을 감소시키는 것이며, 예를 들어 낮은 상보성을 갖는 표적 서열과 가이드 상호작용을 감소시키는 것이다. 실제로, 예에서, 80% 내지 약 95% 상보성, 예를 들어, 83%-84% 또는 88-89% 또는 94-95% 초과의 상보성을 갖는 오프-표적 서열 및 표적 서열을 구별할 수 있는 CRISPR-Cas 시스템을 생성시키는 돌연변이를 포함한다는 것을 보여준다 (예를 들어, 18개 뉴클레오티드를 갖는 표적과 1, 2 또는 3개 미스매치를 갖는 18개 뉴클레오티드의 오프-표적을 구별함). 따라서, 본 발명의 맥락에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 94.5% 또는 95% 또는 95.5% 또는 96% 또는 96.5% 또는 97% 또는 97.5% 또는 98% 또는 98.5% 또는 99% 또는 99.5% 또는 99.9%, 또는 100% 초과이다. 오프 표적은 서열과 가이드 사이에, 100% 또는 99.9% 또는 99.5% 또는 99% 또는 99% 또는 98.5% 또는 98% 또는 97.5% 또는 97% 또는 96.5% 또는 96% 또는 95.5% 또는 95% 또는 94.5% 또는 94% 또는 93% 또는 92% 또는 91% 또는 90% 또는 89% 또는 88% 또는 87% 또는 86% 또는 85% 또는 84% 또는 83% 또는 82% 또는 81% 또는 80% 미만의 상보성이며, 오프 타겟이 서열과 가이드 사이에, 100% 또는 99.9% 또는 99.5% 또는 99% 또는 99% 또는 98.5% 또는 98% 또는 97.5% 또는 97% 또는 96.5% 또는 96% 또는 95.5% 또는 95% 또는 94.5% 의 상보성인 것이 유리하다.
가이드 변형
특정 구현예에서, 본 발명의 가이드는 비-자연 발생 핵산 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체, 및/또는 화학적 변형을 포함한다. 비-자연 발생 핵산은 예를 들어, 자연 발생 뉴클레오티드 및 비-자연 발생 뉴클레오티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 리보오스, 포스페이트, 및/또는 염기 모이어티에서 변형될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 가이드 핵산은 리보뉴클레오티드 및 비-리보뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서, 가이드는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 및 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 한 구현예에서, 가이드는 하나 이상의 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합이 있는 뉴클레오티드, 리보오스 고리의 2' 및 4' 탄소 사이에 메틸렌 브릿지를 포함하는 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드, 또는 브릿지연결된 핵산 (BNA) 을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드의 다른 예는 2'-O-메틸 유사체, 2'-데옥시 유사체, 2-티오우리딘 유사체, N6-메틸아데노신 유사체, 또는 2'-플루오로 유사체를 포함한다. 변형된 염기의 추가 예는 2-아미노푸린, 5-브로모-우리딘, 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸슈도우리딘 (me1Ψ), 5-메톡시우리딘 (5moU), 이노신, 7-메틸구아노신을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 가이드 RNA 화학적 변형의 예는 하나 이상의 말단 뉴클레오티드에서 2'-O-메틸 (M), 2'-O-메틸-3'-포스포로티오에이트 (MS), 포스포로티오에이트 (PS), S-구속형 (constrained) 에틸 (cEt), 또는 2'-O-메틸-3'-티오PACE (MSP) 의 혼입을 포함하지만 이것으로 제한되지 않는다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드는, 온 (on)-표적 대 오프 (off)-표적 특이성이 예측가능하지 않지만, 비변형 가이드에 비해 증가된 안정성 및 증가된 활성을 포함할 수 있다. (Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290, published online 29 June 2015; Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111; Allerson et al., J. Med. Chem. 2005, 48:901-904; Bramsen et al., Front. Genet., 2012, 3:154; Deng et al., PNAS, 2015, 112:11870-11875; Sharma et al., MedChemComm., 2014, 5:1454-1471; Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9): 985-989; Li et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1, 0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066 참조). 일부 구현예에서, 가이드 RNA 의 5' 및/또는 3' 말단은 형광 염료, 폴리에틸렌 글리콜, 콜레스테롤, 단백질 또는 검출 표지를 비롯한, 다양한 기능적 모이어티에 의해 변형된다. (Kelly et al., 2016, J. Biotech. 233:74-83 참조). 특정 구현예에서, 가이드는 표적 DNA 에 결합하는 부위 내에 리보뉴클레오티드, 및 Cas9, Cpf1, 또는 C2c1 에 결합하는 부위 내에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 조작된 가이드 구조, 예컨대, 제한 없이 5' 및/또는 3' 말단, 스템-루프 영역, 및 시드 영역에 혼입된다. 특정 구현예에서, 변형은 스템-루프 영역의 5'-핸들에 있지 않다. 가이드의 스템-루프 영역의 5'-핸들에서의 화학적 변형은 그 기능을 소멸시킬 수 있다 (Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066 참조). 특정 구현예에서, 가이드의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 또는 75 개 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 가이드의 3' 또는 5' 말단에서의 3-5 개 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 오직 소수의 변형, 예컨대 2'-F 변형이 시드 부위에 도입된다. 일부 구현예에서, 2'-F 변형은 가이드의 3 '말단에 도입된다. 특정 구현예에서, 가이드의 5' 및/또는 3' 말단에 3 내지 5 개의 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 (M), 2'-O-메틸-3'-포스포로티오에이트 (MS), S-구속형 에틸 (cEt), 또는 2'-O-메틸-3'-티오PACE (MSP) 로 화학적으로 변형된다. 이러한 변형은 게놈 편집 효율을 향상시킬 수 있다 (Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9): 985-989 참조). 특정 구현예에서, 가이드의 모든 포스포디에스테르 결합은 유전자 파괴 수준을 향상시키기 위해 포스포로티오에이트 (PS) 로 치환된다. 특정 구현예에서, 가이드의 5' 및/또는 3' 말단에서 5 개 초과의 뉴클레오티드가 2'-O-Me, 2'-F 또는 S-구속형 에틸 (cEt) 로 화학적으로 변형된다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드는 향상된 유전자 붕괴 수준을 매개할 수 있다 (Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111 참조). 본 발명의 한 구현예에서, 가이드는 그의 3' 및/또는 5' 말단에서 화학적 모이어티를 포함하도록 변형된다. 이러한 모이어티는 아민, 아지드, 알킨, 티오, 디벤조시클로옥틴 (DBCO), 또는 로다민을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 화학적 모이어티는 링커, 예컨대 알킬 사슬에 의해 가이드에 접합된다. 특정 구현예에서, 변형된 가이드의 화학적 모이어티는 다른 분자, 예컨대 DNA, RNA, 단백질, 또는 나노입자에 가이드를 부착시키는데 사용될 수 있다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드는 CRISPR 시스템에 의해 유전적으로 편집된 세포를 확인하거나 농축시키는데 사용될 수 있다 (Lee et al., eLife, 2017, 6:e25312, DOI:10.7554 참조).
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 바와 같은 CRISPR 시스템은 가이드 서열을 포함하는 crRNA 또는 유사한 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA 또는 RNA 및 DNA 의 혼합물이고/이거나, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 서열은 벌지 (bulge), 헤어핀 또는 스템 루프 구조와 같은 천연 crRNA 의 구조를 비제한적으로 포함하는 임의의 구조를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 가이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 서열일 수 있는 제 2 폴리 뉴클레오티드 서열과 듀플렉스를 형성한다.
특정 구현예에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA 가 사용된다. 가이드 RNA 화학 변형의 예로는, 이로 제한되지는 않지만, 하나 이상의 말단 뉴클레오티드에서 2'-O-메틸 (M), 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트 (MS), 또는 2'-O-메틸 3'티오PACE (MSP) 의 혼입을 포함한다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드 RNA 는, 표적상 특이성 대 표적외 특이성은 예측가능하지 않지만, 비변형된 가이드 RNA 에 비하여 증가된 안정성 및 증가된 활성을 포함할 수 있다. (참고, Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290, 2015 년 6 월 29 일에 온라인 공개됨). 화학적으로 변형된 가이드 RNA 는 포스포로티오에이트 연결 및 리보스 고리의 2 '및 4' 탄소 사이의 메틸렌 브릿지를 포함하는 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 갖는 RNA 를 제한 없이 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상의 뉴클레오티드 길이, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 미만의 뉴클레오티드 길이, 또는 그 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게, 가이드 서열은 10 내지 30 개 뉴클레오티드 길이이다. 표적 서열과 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 어세이를 통해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험하려는 가이드 서열을 포함하여, CRISPR 복합체를 형성하는데 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 예컨대 CRISPR 서열의 성분을 코딩하는 벡터로 형질감염시킨 후에, 표적 서열 내에서 우선적인 절단의 평가, 예컨대 서베이어 (Surveyor) 어세이에 의해서 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에 제공될 수 있다. 유사하게는, 표적 RNA 의 절단은 시험될 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 비롯한, CRISPR 복합체 성분인 표적 서열을 제공함으로써, 그리고 시험 가이드 서열과 대조군 가이드 서열 반응 사이에 표적 서열에서의 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험 튜브에서 평가될 수 있다. 다른 어세이가 가능하고, 당업자에게 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드에 대한 변형은 화학적 변형, 삽입, 결실 또는 분할이다. 일부 구현예에서, 화학적 변형은 2'-O-메틸 (M) 유사체, 2'-데옥시 유사체, 2-티오우리딘 유사체, N6-메틸아데노신 유사체, 2'-플루오로 유사체, 2-아미노푸린, 5-브로모-우리딘, 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸슈도우리딘 (me1Ψ), 5-메톡시우리딘 (5moU), 이노신, 7-메틸구아노신, 2'-O-메틸-3'-포스포로티오에이트 (MS), S-제약 에틸 (cEt), 포스포로티오에이트 (PS), 또는 2'-O-메틸-3'-티오PACE (MSP) 의 혼입을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 가이드는 포스포로티오에이트 변형 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, 가이드의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 25개의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 시드 영역 내의 하나 이상의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 3'-말단 내의 하나 이상의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 5'-핸들에서 어떠한 뉴클레오티드도 화학적으로 변형되지 않는다. 일부 구현예에서, 시드 부위에서의 화학적 변형은 사소한 변형, 예컨대, 2'-플루오로 유사체의 혼입이다. 특이적 구현예에서, 시드 부위의 하나의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 유사체로 대체된다. 일부 구현예에서, 3'-말단에서 5 또는 10 개 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. Cpf1 CrRNA 의 3'-말단에서의 이러한 화학적 변형은 유전자 절단 효율을 개선시킨다 (Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066 참조). 특정 구현예에서, 3'-말단 내의 5 개 뉴클레오티드는 2'-플루오로 유사체로 대체된다. 특정 구현예에서, 3'-말단 내의 10 개 뉴클레오티드는 2'-플루오로 유사체로 대체된다. 특이적 구현예에서, 3'-말단 내의 5 개 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 (M) 유사체로 대체된다.
일부 구현예에서, 가이드의 5'-핸들의 루프가 변형된다. 일부 구현예에서, 가이드의 5'-핸들의 루프는 결실, 삽입, 분할 또는 화학적 변형을 갖도록 변형된다. 특정 구현예에서, 루프는 3, 4 또는 5 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 루프는 UCUU, UUUU, UAUU 또는 UGUU 의 서열을 포함한다.
가이드 서열, 및 그로 인한 핵산-표적화 가이드 RNA 는 임의의 표적 핵산 서열을 표적화하기 위해 선택될 수 있다. CRISPR 복합체의 형성 상황에서, "표적 서열" 은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 디자인되는 서열을 의미하고, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 간 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 표적 서열은 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 용어 "표적 RNA" 는 표적 서열이거나 그를 포함하는 RNA 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 달리 말해서, 표적 RNA 는 gRNA, 즉 가이드 서열의 일부분이 상보성을 갖도록 설계되고 CRISPR 이펙터 단백질 및 gRNA 를 포함하는 복합체에 의해 매개되는 이펙터 기능이 유도되게 하는 RNA 폴리뉴클레오티드 또는 RNA 폴리뉴클레오티드의 일부분일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치된다. 표적 서열은 DNA일 수 있다. 표적 서열은 임의의 RNA 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 메신저 RNA (mRNA), 프리-mRNA, 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 소형 핵소체 RNA (snoRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 비-코딩 RNA (ncRNA), 긴 비-코딩 RNA (lncRNA), 및 소형 세포질 RNA (scRNA) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA, 프리-mRNA 및 rRNA 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 ncRNA 및 lncRNA 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 보다 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA 분자 또는 프리-mRNA 분자 내의 서열일 수 있다.
특정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 28 개 미만의 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 적어도 18 개 뉴클레오티드 및 28 개 미만의 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 19 내지 28 개 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 19 내지 25개 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 20 개 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 23개 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 25개 뉴클레오티드이다.
특정 구현예에서, 절단 효율의 조절은 스페이서/표적을 따라 미스매치의 위치를 포함하여, 스페이서 서열 및 표적 서열 간에 미스매치, 예를 들어 하나 이상의 미스매치, 예컨대 1 또는 2 개 미스매치의 도입에 의해 활용될 수 있다. 예를 들어 보다 중심 (즉, 3' 또는 5' 가 아님) 에 이중 미스매치가 존재할수록, 절단 효율이 보다 영향받는다. 따라서, 스페이서를 따라서 미스매치 위치를 선택함으로써, 절단 효율이 조절될 수 있다. 예로서, 표적의 100 % 미만의 절단이 바람직하면 (예를 들어, 세포 개체군에서), 스페이서 및 표적 서열 간에 하나 이상, 예컨대 바람직하게는 2 개 미스매치가 스페이서 서열에 도입될 수 있다. 미스매치 위치의 스페이서를 따라서 보다 중심일수록, 절단 백분율은 더 낮다.
특정 예시적 구현예에서, 절단 효율은 단일 뉴클레오티드, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 변이, 또는 (점) 돌연변이가 다른 둘 이상의 표적을 구별할 수 있는 단일 가이드를 설계하기 위해 활용될 수 있다. CRISPR 이펙터는 SNP (또는 다른 단일 뉴클레오티드 변이) 에 대한 감도를 감소시킬 수 있고, 일정한 수준의 효율로 SNP 표적을 계속 절달할 수 있다. 따라서, 2 개 표적, 또는 표적 세트의 경우에, 가이드 RNA 는 표적 중 하나와 상보적인 뉴클레오티드 서열, 즉, 온-표적 SNP 를 갖도록 설계될 수 있다. 가이드 RNA 는 합성 미스매치를 갖도록 더 설계된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "합성 미스매치" 는 자연 발생 SNP 의 상류 또는 하류에 도입되는 비-자연 발생 미스매치, 예컨대 상류 또는 하류에 도입되는 5 개 이하의 뉴클레오티드, 예를 들어 상류 또는 하류에 도입되는 4, 3, 2, 또는 1 개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 상류 또는 하류에 도입되는 3 개 이하의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 상류 또는 하류에 도입되는 2 개 이하의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 상류 또는 하류에 도입되는 1 개 뉴클레오티드 (즉, SNP 에 인접) 를 의미한다. CRISPR 이펙터가 온-표적 SNP 에 결합할 때, 오직 단일 미스매치가 합성 미스매치와 함께 형성될 것이고, CRISPR 이펙터는 계속 활성화될 것이며 검출가능한 신호가 생성될 것이다. 가이드 RNA 가 오프-표적 SNP 와 하이브리드화될 때, SNP 로부터의 미스매치 및 합성 미스매치의, 2 개 미스매치가 형성될 것이고, 검출가능한 신호는 발생되지 않을 것이다. 따라서, 본원에 개시된 시스템은 개체군 내의 SNP 를 구별하도록 설계될 것이다. 예를 들어, 시스템은 단일 SNP 가 상이한 병원성 균주를 구별하거나 특정한 질환 특이적 SNP, 예컨대 비제한적으로, 질환 연관된 SNP, 예컨대 비제한적으로, 암 연관된 SNP 를 검출하는데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 에 위치되도록 설계된다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 에 위치되도록 설계된다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 에 위치되도록 설계된다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 3, 4, 5 또는 6 에 위치되도록 설계된다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 3 에 위치되도록 설계된다.
특정 구현예에서, 가이드 RNA 는 미스매치 (예를 들어, 합성 미스매치, 즉 SNP 이외의 추가 돌연변이) 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 에 위치되도록 설계된다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 에 위치되도록 설계된다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 4, 5, 6 또는 7 에 위치되도록 설계된다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 5 에 위치하도록 설계된다.
특정 구현예에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 SNP 의 상류 2 개 뉴클레오티드 (즉, 하나의 개재 뉴클레오티드) 에 위치되도록 설계된다.
특정 구현예에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 SNP의 하류 2개 뉴클레오티드 (즉, 하나의 개재 뉴클레오티드) 에 위치되도록 디자인된다.
특정 구현예에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 5 에 위치되도록, 그리고 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 3 에 위치되도록 설계된다.
본원에 기재된 구현예는 본원에 토의된 바와 같이 세포를 벡터에 전달하는 것을 포함하는 본원에 토의된 바와 같은 진핵생물 세포 (시험관내, 즉 단리된 진핵생물 세포) 에서 하나 이상의 뉴클레오티드 변형을 유도하는 것을 이해한다. 돌연변이(들)는 가이드(들) RNA(들)를 통해서 세포(들)의 각 표적 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들)를 통해서 상기 세포(들)의 각 표적 서열에서 1-75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들)를 통해서 상기 세포(들)의 각 표적 서열에서 1, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 또는 75개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들)를 통해서 상기 세포(들)의 각 표적 서열에서 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 또는 75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들)를 통해서 상기 세포(들)의 각 표적 서열에 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함한다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들)를 통해서 상기 세포(들)의 각 표적 서열에 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들)를 통해서 상기 세포(들)의 각 표적 서열에 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400 또는 500 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
전형적으로, 내생성 CRISPR 시스템의 상황에서, CRISPR 복합체 (표적 서열과 하이브리드화하고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체를 형성하는 가이드 서열 포함) 의 형성은 그 결과로 표적 서열 내 또는 그 근처 (예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 개 이상의 염기쌍 이내) 에서 절단을 일으키지만, 특히 RNA 표적의 경우에, 예를 들어 2차 구조에 의존적일 수 있다.
특정 구현예에서, 표적 이중-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출 방법이 제공된다. 그러한 방법은 표적 이중-가닥 핵산을 포함하는 샘플을 증폭 반응 혼합물과 조합하는 단계를 포함할 수 있다. 그러한 증폭 반응 혼합물은 증폭 CRISPR 시스템을 포함할 수 있다. 증폭 CRISPR 시스템은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 포함하며, 제 1 CRISPR/Cas 복합체는 제 1 데드 CRISPR/Cas 효소 및 제 1 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 1 가닥으로 가이드하는 제 1 가이드 분자를 포함하고, 제 2 CRISPR/Cas 복합체는 제 2 데드 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 2 가닥으로 가이드하는 제 2 가이드 분자를 포함한다.
특정 구현예에서, 제 1 데드 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 데드 CRISPR/Cas 효소는 동일할 수 있다. 대안적 구현예에서, 제 1 데드 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 데드 CRISPR/Cas 효소는 상이할 수 있다.
특정 구현예에서, 증폭 반응 혼합물은 헬리카제를 추가로 포함할 수 있다. 본 구현예에서 사용하기 위한 헬리카제의 예는 또한 하기 웹 주소에서 찾을 수 있다: http://blocks.fhcrc.org (키워드: 헬리카제로 블록에 도달한다). 이 사이트는 49 Herpes 헬리카제, 224 DnaB 헬리카제, 250 UvrD-헬리카제 및 UvrD/Rep 헬리카제, 276 DEAH_ATP-의존적 헬리카제, 147 Papillom_E1 파필로마바이러스 헬리카제 E1 단백질, 608 바이러스 헬리카제 1 바이러스 (슈퍼패밀리 1) RNA 헬리카제 및 556 DEAD_ATP-의존적 헬리카제를 열거한다. 일반적으로 5' 에서 3' 방향으로 복제하는 헬리카제의 예는 T7 Gp4 헬리카제, DnaB 헬리카제 및 Rho 헬리카제이며, 한편 3' 에서 5' 방향으로 복제하는 헬리카제의 예는 UvrD 헬리카제, HCV 의 PcrA, Rep, NS3 RNA 헬리카제를 포함한다.
특정 구현예에서, 헬리카제는 UvrD 헬리카제, CRISPR-Cas3 헬리카제, Rep 헬리카제, PcrA 헬리카제, RecD 헬리카제, Dda 헬리카제, 파필로마 바이러스 E1 헬리카제, 및 gp4 헬리카제를 포함할 수 있으나, 반드시 그에 한정되는 것은 아니다.
특별한 구현예에서, 증폭 반응 혼합물은 표적 핵산 가닥과 하이브리드화할 수 있는 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "하이브리드화" 는 프라이머가 주형의 다른 영역이 아닌, 오직 주형 가닥 중 하나에서 이의 상보성 서열에만 특이적으로 결합하는 조건 하에서 단일-가닥 핵산 주형의 영역에 올리고뉴클레오티드 프라이머가 결합하는 것을 의미한다. 하이브리드화의 특이성은 올리고뉴클레오티드 프라이머의 길이, 하이브리드화 반응이 수행되는 온도, 이온 강도, 및 pH에 의해 영향받을 수 있다. 용어 "프라이머" 는 표적 핵산 가닥의 중합효소 의존적 복제를 촉진하기 위해서 표적 핵산 상의 단일 가닥 영역에 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산을 의미한다. "상보성" 또는 "상보체 (들)" 인 핵산(들)은 표준 왓슨-크릭 (Watson-Crick), 후그스틴 (Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 결합 상보성 규칙에 따라서 염기-쌍형성할 수 있는 것들이다.
특정 구현예에서, 증폭 반응 혼합물은 제 1 및 제 2 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 제 1 프라이머는 표적 핵산의 제 1 가닥에 상보적인 부분을 포함할 수 있고, 제 2 프라이머는 표적 핵산의 제 2 가닥에 상보적인 부분을 포함할 수 있다. 제 1 및 제 2 프라이머는 프라이머 쌍으로서 언급될 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 또는 제 2 프라이머는 RNA 중합효소 프로모터를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 증폭 반응 혼합물은 중합효소를 추가로 포함할 수 있다. HDA 를 위한 중합효소는 가공성 및 가닥 전위 활성에 기초하여 선별된다. 융해 및 프라이머와의 하이브리드화에 후속하여, 핵산은 중합 단계에 적용된다. 증폭시키고자 하는 핵산이 DNA 인 경우에 DNA 중합효소가 선택된다. 초기 표적이 RNA 인 경우에, 첫째로 역전사효소가 사용되어 RNA 표적이 cDNA 분자로 복사될 수 있고, cDNA 가 그 후 HDA 에서 선택된 DNA 중합효소에 의해 추가로 증폭된다. DNA 중합효소는 표적 핵산에 대해 작용하여 네 가지 dNTP 의 존재 하에 핵산 주형에 하이브리드화된 프라이머를 연장시켜 핵산 주형의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 프라이머 연장 산물을 형성한다.
DNA 중합효소는 5'에서 3'으로의 엑소뉴클레아제 활성이 결여되고 추가로 임의로 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여될 수 있는 중합효소의 군으로부터 선택될 수 있다. 적합한 DNA 중합효소의 예는 이. 콜라이 (E. coli) DNA 중합효소 I 의 엑소뉴클레아제-결핍 클레노우 (Klenow) 단편 (New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.)), 엑소뉴클레아제 결핍 T7 DNA 중합효소 (시쿼나제; USB, (Cleveland, Ohio)), 이. 콜라이 DNA 중합효소 I 의 클레노우 단편 (New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.)), Bst DNA 중합효소의 대형 단편 (New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.)), KlenTaq DNA 중합효소 (AB Peptides, (St Louis, Mo.)), T5 DNA 중합효소 (미국 특허 제5,716,819호), 및 Pol III DNA 중합효소 (미국 특허 제6,555,349호) 를 포함한다. 가닥-치환 활성을 보유하는 DNA 중합효소, 예컨대 이. 콜라이 DNA 중합효소 I 의 엑소뉴클레아제-결핍 클레노우 단편, Bst DNA 중합효소 대형 단편, 및 시쿼나제는 헬리카제-의존적 증폭에 바람직하다. T7 중합효소는 Taq 중합효소에 비해 유의하게 낮은 3.5×105 의 오차율을 갖는 고충실도 중합효소이다 (Keohavong and Thilly, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9253-9257 (1989)). 그러나 T7 중합효소는 열안정성이 아니므로 열순환을 요구하는 증폭 시스템에서 사용을 위해서는 최적이 아니다. 등온에서 수행될 수 있는 HDA 에서, T7 시쿼나제는 DNA의 증폭에 바람직한 중합효소 중 하나이다.
특정 구현예에서, 중합효소는 Bst 2.0 DNA 중합효소, Bst 2.0 WarmStart DNA 중합효소, Bst 3.0 DNA 중합효소, 전체 길이 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bsu DNA 중합효소, phi29 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, Gst 중합효소, Taq 중합효소, 이. 콜라이 DNA 중합효소 I 의 클레노우 (Klenow) 단편, KlenTaq NDA 중합효소, Pol III DNA 중합효소, T5 DNA 중합효소, Sau LF DNA 중합효소, 및 시쿼나제 (Sequenase) DNA 중합효소로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 표적 이중-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출 방법은 본원에 기재된 바와 같은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 사용하여 표적 핵산의 R-루프를 열어서 표적 핵산을 증폭시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. RNA 분자가 이중-가닥 핵산과 비공유적으로 연합될 때 R-루프가 형성되고 이는 이중 가닥 핵산 내에 국부화된 변성 ("버블" 형성) 을 야기한다 (Thomas et al., 1976 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 2294). 방법은 헬리카제를 사용하여 표적 핵산의 제 1 및 제 2 가닥을 푸는 것을 추가로 포함할 수 있다. 방법은 프라이머 쌍 및 중합효소를 사용하여 가닥을 어닐링 (결합) 및 연장하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 하이브리드화된 프라이머 쌍의 연장은 중합효소에 적합한 조건 하에 일어난다. 일부 경우에, 하이브리드화 및 연장은 동일한 온도에서 수행되며, 한편 다른 경우에는, 하이브리드화는 프라이머에 최적인 온도에서 일어나고 연장은 중합효소에 최적인 온도에서 일어난다. 그러나, 본원에서 개시된 바와 같이, 프라이머 및 중합효소는 호열성 및 중온성 응용에 최적화되었다. 연장 단계의 길이는 생산되는 산물의 크기에 따라 다를 수 있다. 연장 시간의 증가는 더 긴 단편의 생산을 초래할 것이다. 이와 대조적으로, 더 짧은 연장 시간을 이용하여 더 짧은 산물만을 선택할 수 있다. 당업자는 연장 시간의 변화를 이용하여 상이한 크기의 산물을 선택할 수 있다는 것과 이 변화를 사용하여 원하는 길이의 산물의 증폭을 개선할 수 있다는 것을 실감할 것이다.
일부 특정 구현예에서, 반응 마다 500 ng 의 SSB 및 약 125 ng 의 헬리카제를 사용하여 이상적인 성능 조건을 얻을 수 있다. 부가적으로, 반응 마다 약 2.5 내지 약 7% PEG 20K, 및 약 0.5 내지 약 5 mM ATP 를 사용할 수 있다.
특정 구현예에서, 표적 이중-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출 방법은 등온 조건 하에서의 반복된 열림, 풀림, 어닐링 및 연장에 의해 표적 핵산을 추가로 증폭시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. "등온 조건" 은 증폭이 단일 온도에서 일어나는 조건, 또는 증폭이 온도 변동이 최소인 온도에서 일어나는 조건을 지칭한다. 구현예들에서, 온도 변동은 약 1 ℃, 2 ℃, 3 ℃, 4 ℃, 5 ℃, 6 ℃, 7 ℃, 8 ℃, 9 ℃, 또는 10 ℃ 미만이다. 이는 증폭 절차와 동일한 온도에서 또는 더 높은 온도에서 수행될 수 있는 증폭의 개시에서의 단일 짧은 시간 (15 분 미만) 을 포함하지 않는다.
헬리카제
용어 "헬리카제" 는 본원에서 이중 가닥 핵산을 효소적으로 풀 수 있는 임의의 효소를 지칭한다. 예를 들어, 헬리카제는 모든 유기체에서 및 핵산을 수반하는 모든 과정 예컨대 복제, 재조합, 복구, 전사 및 RNA 스플라이싱에서 발견되는 효소이다. (Kornberg and Baker, DNA Replication, W. H. Freeman and Company (2nd ed. (1992)), 특히 챕터 11). DNA 또는 RNA 를 따라 5' 에서 3' 방향으로 또는 반대로 3' 에서 5' 방향으로 전위하는 임의의 헬리카제가 본 발명의 본구현예에서 사용될 수 있다. 이는 원핵생물, 바이러스, 고세균류, 및 진핵생물 또는 재조합 형태의 자연적으로 존재하는 효소 뿐만 아니라 명시된 활성을 갖는 유사체 또는 유도체로부터 수득된 헬리카제를 포함한다. Kornberg 및 Baker 에 의해 그들의 책, DNA Replication, W. H. Freeman and Company (2nd ed. (1992)) 의 챕터 11 에서 기재된, 자연적으로 존재하는 DNA 헬리카제의 예는 이. 콜라이 헬리카제 I, II, III, & IV, Rep, DnaB, PriA, PcrA, T4 Gp41 헬리카제, T4 Dda 헬리카제, T7 Gp4 헬리카제, SV40 대형 T 항원, 효소 RAD 를 포함한다. HDA 에서 유용할 수 있는 부가적 헬리카제는 RecQ 헬리카제 (Harmon and Kowalczykowski, J. Biol. Chem. 276:232-243 (2001)), T. 텡콘겐시스 (본 발명, 실시예 XII 에서 개시됨) 및 T. 테르모필루스 (Collins and McCarthy, Extremophiles. 7:35-41. (2003)) 로부터의 열안정성 UvrD 헬리카제, T. 아쿠아티쿠스 (Kaplan and Steitz, J. Biol. Chem. 274:6889-6897 (1999)) 로부터의 열안정성 DnaB 헬리카제, 및 고세균 및 진핵생물 유기체로부터의 MCM 헬리카제 (Grainge et al., Nucleic Acids Res. 31:4888-4898 (2003)) 를 포함한다. 헬리카제의 추가의 예는 테르모아나에로박테르 에타놀리쿠스로부터의 DNA 헬리카제 PcrA (예를 들어, WP_003870487.1), 바실루스 종 FJAT-27231 로부터의 PcrA (예를 들어, WP_034654680.1), 바실루스 메가테리움으로부터의 PcrA (예를 들어, WP_034654680.1), 바실루스 심플렉스로부터의 PcrA (예를 들어, WP_095390358.1), 및 페니클로스트리디움 소르델리이로부터의 PcrA (예를 들어, WP_055343022.1) 를 포함한다.
헬리카제의 전통적 정의는 에너지원으로 뉴클레오시드 트리포스페이트 (NTP) 가수분해 (예컨대 ATP) 를 사용하여 핵산 듀플렉스 (DNA, RNA 또는 하이브리드) 의 나선 구조를 단일-가닥 구성요소로의 분리/지퍼풀림/풀림 반응을 촉진하는 효소이다. 그러나, 모든 헬리카제가 더이상 이 정의에 부합하는 것은 아니라는 점에 유의해야 한다. 더욱 일반적인 정의로 그것은 만난 듀플렉스화된 핵산을 풀 수 있거나 또는 풀 수 없는 단일-가닥 또는 이중 가닥 핵산을 따라 (통상적으로 특정 방향, 3' 에서 5' 방향 또는 5' 에서 3' 방향, 또는 둘 모두의 방향으로) 이동하는, 즉 전위하는, 운동 단백질이다. 게다가, 일부 헬리카제는 명백한 전위효소 활성 없이 듀플렉스화된 핵산 구조에 단순히 결합하여 "융해" 시킨다.
헬리카제는 모든 살아 있는 유기체에 존재하고 모든 양태의 핵산 대사에서 기능한다. 헬리카제는 아미노산 서열, 방향성, 올리고머화 상태 및 핵산 유형 및 구조 선호도에 기초하여 분류된다. 가장 흔한 분류 방법은 모티프로 호칭되는, 특정 아미노산 서열의 존재에 기초하여 개발되었다. 이 분류에 따르면 헬리카제는 하기 6 가지 슈퍼패밀리로 분류된다: SF1, SF2, SF3, SF4, SF5 및 SF6. SF1 및 SF2 헬리카제는 핵산 주위에서 고리 구조를 형성하지 않지만, SF3 내지 SF6 은 그러하다. 슈퍼패밀리 분류는 전통적인 분류체계에 의존하지 않는다.
DNA 헬리카제는 이중-가닥 DNA (dsDNA) 분자를 그 각각의 단일-가닥 핵산 (ssDNA) 형태로 푸는 것을 촉진하는 것을 책임진다. 구조적 및 생화학적 연구는 어떻게 다양한 헬리카제가 뉴클레오티드 당 하나의 ATP 를 소모하면서 ssDNA 상에서 방향성 있에 전위할 수 있는지를 밝혔지만, 핵산 풀림의 메카니즘 및 어떻게 풀림 활성이 조절되는지는 여전히 분명하지 않고 논란이 많다 (T. M. Lohman, E. J. Tomko, C. G. Wu, "Non-hexameric DNA helicases and translocases: mechanisms and regulation," Nat Rev Mol Cell Biol 9:391-401 (2008)). 헬리카제는 잠재적으로 만나는 모든 핵산을 풀 수 있으므로, 어떻게 그것의 풀림 활성이 조절되는지에 대한 이해는 생명공학 응용에서 헬리카제 기능의 활용을 초래할 수 있다.
용어 "HDA" 는 헬리카제 의존적 증폭 (Helicase Dependent Amplification) 을 지칭하며, 이는 이중 가닥 핵산을 풀기 위해 헬리카제 제제를 사용하여 프라이머 하이브리드화 및 후속적 프라이머-연장을 위한 주형을 생성함으로써 핵산을 증폭시키는 시험관내 방법이다. 이 과정은 표적 서열을 함유하는 센스 가닥 또는 역상보적 표적 서열을 함유하는 안티센스 가닥의 3'-말단에 각각 하이브리드화하는 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한다. HDA 반응은 헬리카제-의존성 핵산 증폭을 위한 일반적 방법이다.
본 발명은 당해 기술분야에 알려진 임의의 적합한 헬리카제의 사용을 포함한다. 이들은 UvrD 헬리카제, CRISPR-Cas3 헬리카제, 이. 콜라이 헬리카제 I, 이. 콜라이 헬리카제 II, 이. 콜라이 헬리카제 III, 이. 콜라이 헬리카제 IV, Rep 헬리카제, DnaB 헬리카제, PriA 헬리카제, PcrA 헬리카제, T4 Gp41 헬리카제, T4 Dda 헬리카제, SV40 대형 T 항원, 효소 RAD 헬리카제, RecD 헬리카제, RecQ 헬리카제, 열안정성 T. 텡콘겐시스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 테르모필루스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 아쿠아티쿠스 DnaB 헬리카제, Dda 헬리카제, 파필로마 바이러스 E1 헬리카제, 고세균 MCM 헬리카제, 진핵생물 MCM 헬리카제, 및 T7 Gp4 헬리카제를 포함하나, 반드시 그에 한정되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 헬리카제 선택은 증폭 조건에 기초한다. 예를 들어, 중온성 등온 증폭 조건은 중온성 박테리아 종으로부터의 UvrD 유형의 헬리카제를 선호할 수 있다. 일부 예에서, 헬리카제는 활성을 증가시키는 치환을 포함한다. 하나의 특히 바람직한 구현예에서, 헬리카제는 두 개의 아스파르트산 대신 알라닌으로의 치환을 가질 수 있다. 헬리카제 Tte-UvrD 에서, 치환 D409A 및 D410A 는 헬리카제 가공성 및 활성을 증가시킨다.
일부 경우에, 헬리카제는 UvrD-유사 헬리카제, 야생형, 또는 슈퍼 헬리카제 돌연변이가 있는 돌연변이체이다. 슈퍼 헬리카제 돌연변이는 전형적으로 헬리카제의 활성을 증가시키는 DD 에서 AA 로의 치환이다. 일부 경우에, 헬리카제는 D403A 및 D404A 에서 치환이 있는 이. 콜라이 UvrD 헬리카제이다. 일부 구현예에서, 헬리카제는 pcrA (UvrD)-유형 헬리카제, 예를 들어, 돌연변이 D409A/D410A 가 있는 Tte-UvrD 헬리카제이다. 일부 경우에, 헬리카제는 ATP 의존적 헬리카제이고, ATP 보조인자는 헬리카제와 함께 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 헬리카제는 DNA 헬리카제 pcrA 헬리카제, 예를 들어, 돌연변이 D403A/D404A 가 있는 테르모아나에로박테르 에타놀리쿠스로부터의 pcrA 헬리카제 (예를 들어, WP_003870487.1), 돌연변이 D407A/D408A 가 있는 바실루스 종 FJAT-27231 로부터의 pcrA 헬리카제 (예를 들어, WP_034654680.1), 돌연변이 D415A/D416A 가 있는 바실루스 메가테리움으로부터의 pcrA 헬리카제 (예를 들어, WP_034654680.1), 돌연변이 D407A/D408A 가 있는 바실루스 심플렉스로부터의 pcrA 헬리카제 (예를 들어, WP_095390358.1), 또는 돌연변이 D402A/D403A 가 있는 페니클로스트리디움 소르델리이로부터의 pcrA 헬리카제 (예를 들어, WP_055343022.1) 이다.
일부 구현예에서, 헬리카제는 임의로 예를 들어 D403 및 D404 에서 둘 이상의 D 에서 A 로의 치환이 있는 이.콜라이 UvrD 헬리카제이다. 일부 구현예에서, 헬리카제는 D409A 및 D410A 에 해당하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 pcrA (UvrD)-유형 헬리카제이다. 일부 구현예에서, 헬리카제는 Tte-UvrD D409A/D410A 이다.
증폭
특정 예시적 구현예에서, 표적 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산은 등온 증폭 기술을 사용하여 증폭될 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 등온 증폭은 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), 리콤비나아제 중합효소 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 전위 증폭 (SDA), 헬리카아제-의존적 증폭 (HDA), 또는 닉킹 효소 증폭 반응 (NEAR) 일 수 있다.
"등온 증폭 (Isothermal amplification)" 은 단일 온도에서 일어나는 증폭을 지칭한다. 이는 증폭 절차와 동일한 온도에서 또는 더 높은 온도에서 수행될 수 있는 증폭의 개시에서의 단일 짧은 시간 (15 분 미만) 을 포함하지 않는다.
중온성 증폭 및 호열성 증폭은 두 개의 예시적 등온 응용이다. 중온성 증폭은 전형적으로 대략 20 내지 40 ℃, 또는 대략 35 ℃ +/- 5 ℃ 의 온도에서 수행되며, 호열성 증폭은 전형적으로 대략 50 내지 70 ℃, 또는 대략 55 ℃ 내지 60 ℃ 의 온도에서 수행된다.
HDA 는 하나 이상의 헬리카제에 의존하여 핵산 듀플렉스의 두 개의 가닥을 분리한다 (융해시키거나, 또는 푼다. 당해 기술분야에 알려진 임의의 헬리카제가 사용될 수 있다. HDA 는 추가로 DNA 또는 RNA 중합효소를 이용하여 프라이머를 연장시키며, 프라이머는 단일 가닥 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화되어 상보적 프라이머 연장 산물을 형성한다. 이 과정은 스스로 반복하여 단일 온도에서 기하급수적 증폭이 달성될 수 있다. 선행 기술의 증폭 절차에 비해 본 구현예의 일부 이점은 DNA 및 RNA 의 긴 표적 서열 (약 200 뉴클레오티드 초과, 더욱 특히 약 500 초과 뉴클레오티드, 더욱 특히 약 1000 뉴클레오티드 초과, 더욱 특히 2000 뉴클레오티드 초과, 더욱 특히 약 50,000 뉴클레오티드 이하, 더욱 특히 약 100,000 뉴클레오티드 정도) 을 등온에서 증폭시키는 능력 및 처음부터 끝까지 하나의 온도에서 표적 서열을 증폭시키는 능력을 포함한다.
따라서, 일정한 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템은 증폭 시약을 포함할 수 있다. 핵산의 증폭에 유용한 상이한 성분 또는 시약은 본 명세서에 기술되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 증폭 시약은 완충제, 예컨대 Tris 완충제를 포함할 수 있다. Tris 완충제는 예를 들어, 제한 없이, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 1 M 등의 농도를 포함하여, 바람직한 적용 또는 용도에 적절한 임의 농도로 사용될 수 있다. 당업자는 완충제 예컨대 본 발명에서 사용을 위한 Tris 의 적절한 농도를 결정할 수 있을 것이다.
염, 예컨대 마그네슘 클로라이드 (MgCl2), 포타슘 클로라이드 (KCl), 또는 소듐 클로라이드 (NaCl) 가 핵산 단편의 증폭을 개선시키기 위해서, 증폭 반응, 예컨대 PCR 에 포함될 수 있다. 염 농도가 특정한 반응 및 적용분야에 의존적일 것이지만, 일부 구현예에서, 특정한 크기의 핵산 단편은 특정한 염 농도에서 최적 결과를 초래할 수 있을 것이다. 바람직한 결과를 생성시키기 위해서, 더 큰 생성물은 변경된 염 농도, 전형적으로 더 낮은 염을 요구할 수 있는 한편, 더 작은 생성물의 증폭은 더 높은 염 농도에서 보다 양호한 결과를 생성시킬 수 있을 것이다. 당업자는 염 농도의 변경과 함께, 염의 존재 및/또는 농도가 생물학적 또는 화학적 반응의 엄격도를 변경시킬 수 있고, 그러므로 본원에서 기재된 바와 같이 본 발명의 반응을 위해 적절한 조건을 제공하는 임의의 염을 사용할 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다.
생물학적 또는 화학적 반응의 다른 성분은 세포 안의 물질의 분석을 위해 세포를 파쇄하거나 용해시키기 위해 세포 용해 성분을 포함할 수 있다. 세포 용해 성분은 세제, 상기 기재된 바와 같은 염, 예컨대 NaCl, KCl, 암모늄 술페이트 [(NH4)2SO4], 또는 다른 것들을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 적절할 수 있는 세제는 Triton X-100, 소듐 도데실 술페이트 (SDS), CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트), 에틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올 (NP-40) 을 포함할 수 있다. 세제의 농도는 특정 적용분야에 의존적일 수 있고, 일부 경우에서 반응에 특이적일 수 있다. 증폭 반응은 예컨대 제한 없이, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 950 nM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM 등의 농도를 포함하여, 본 발명에 적절한 임의 농도로 사용되는 dNTP 및 핵산 프라이머를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 따라서 유용한 폴리머라아제는 Taq 폴리머라아제, Q5 폴리머라아제 등을 포함하는, 당분야에 공지되어 있고 본 발명에서 유용한 임의의 특이적이거나 일반적인 폴리머라아제일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같은 증폭 시약은 핫-스타트 증폭에서 사용하기에 적절할 수 있다. 핫 스타트 증폭은 어댑터 분자 또는 올리고의 이량체화를 감소시키거나 제거시키기 위해서, 또는 달리 원치않는 증폭 생성물 또는 인공물을 방지하고 바람직한 생성물의 최적 증폭을 수득하기 위해서 일부 구현예에서 유리할 수 있다. 증폭에 사용하기 위한 본원에 기재된 많은 성분이 또한 핫-스타트 증폭에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 핫-스타트 증폭에서 사용하기에 적절한 시약 또는 성분은 적절하다면 조성물 성분 중 하나 이상 대신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 또는 다른 시약은 특정한 온도 또는 다른 반응 조건에서 바람직한 활성을 나타내는 것이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 핫-스타트 증폭에서 사용을 위해 디자인되거나 또는 최적화된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 중합효소는 전위 이후 또는 특정한 온도에 도달 이후에 활성화될 수 있다. 이러한 중합효소는 항체-기반 또는 압타머-기반일 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 중합효소는 당분야에 공지되어 있다. 이러한 시약의 예는 제한 없이, 핫-스타트 중합효소, 핫-스타트 dNTP, 및 광-케이징된 dNTP를 포함할 수 있다. 이러한 시약은 공지되어 있고 당분야에서 입수가능하다. 당업자는 개별 시약에 적절하게 최적 온도를 결정할 수 있을 것이다.
증폭은 등온성일 수 있고, 온도에 대해 선택될 수 있다. 한 구현예에서, 증폭은 37℃ 에서 신속하게 진행된다. 다른 구현예에서, 등온 증폭의 온도는 상이한 온도에서 작동가능한 중합효소 (예를 들어, Bsu, Bst, Phi29, 클레노우 단편 등) 를 선택하여 선택될 수 있다.
핵산의 증폭은 특별한 열 순환 기계 또는 장비를 사용해 수행될 수 있고, 단일 반응으로 또는 대량으로 수행될 수 있어, 임의의 바람직한 횟수의 반응이 동시에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭은 미세유체 또는 로봇식 장치를 사용해 수행될 수 있거나, 또는 바람직한 증폭을 달성하도록 온도의 수동 변경을 사용해 수행될 수도 있다. 일부 구현예에서, 특정한 적용분야 또는 물질에 대한 최적 반응 조건을 수득하기 위해 최적화가 수행될 수 있다. 당업자는 충분한 증폭을 수득하는 반응 조건을 이해하고 최적화시킬 수 있을 것이지만, 본원에 개시된 증폭은 등온 조건 하에 수행되는 이점을 갖고, 따라서 증폭을 달성하기 위해 열 사이클링을 요구하지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 사용하여 표적 핵산의 R-루프를 열고, 헬리카제를 사용하여 표적 핵산의 제 1 및 제 2 가닥을 풀고, 프라이머 쌍 및 중합효소를 사용하여 가닥을 어닐링 및 연장시킴으로써 표적 핵산을 증폭시키고; 추가로 표적 핵산을 등온 조건 하에 반복된 열림, 풀림, 어닐링 및 연장에 의해 증폭시키는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 표적 핵산의 증폭은 약 37℃-65℃ 에서 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 핵산의 증폭은 약 50℃-59℃ 에서 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 핵산의 증폭은 약 60℃-72℃ 에서 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 핵산의 증폭은 약 37℃ 에서 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 핵산의 증폭은 실온에서 수행된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 중온성 등온 조건 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 중합효소는 중온성 중합효소이다. 일부 구현예에서, 중온성 중합효소는 Sau LF 중합효소이다.
일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 약 20-30, 약 30-40, 약 40-50, 또는 약 50-100 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 약 100-200, 약 100-500, 또는 약 100-1000 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 약 1000-2000, 약 2000-3000, 약 3000-4000, 또는 약 4000-5000 뉴클레오티드 길이이다.
일부 구현예에서, 제 1 또는 제 2 프라이머는 RNA 중합효소 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 크라우딩제, 보조인자, 단일-가닥 결합 단백질, 및/또는 보조 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 크라우딩제는 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 은 약 500 내지 30,000 Da 크기이다. 일부 구현예에서, PEG 는 20,000 Da 크기이다.
일부 구현예에서, 보조인자는 ATP 이다.
일부 구현예에서, 단일-가닥 결합 단백질은 T4 gp32 또는 호열성 SSB (ET-SSB) 로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 보조 단백질은 dCpf1 및/또는 UvsX 레콤비나제이다.
일부 구현예에서, 증폭된 표적 핵산은 LwaCas13 효소를 포함하는 CRISPR Cas-13 기반 시스템에 의해 검출된다.
일부 구현예에서, 표적 핵산은 아토몰라 감도로 검출된다. 특별한 구현예에서, 표적 핵산은 펨토몰라 감도로 검출된다.
표적 핵산이 RNA 인 경우에, RNA 는 증폭 전에 cDNA 로 역전사될 수 있다. 증폭은 그 때 당해 기술분야에 알려진 임의의 적합한 증폭 방법, 예컨대 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 하나의 예시적 증폭 방법은 헬리카제 의존적 증폭 (HDA) 을 포함할 수 있다. 또다른 예시적 증폭 방법은 레콤비나제 중합효소 증폭 (RPA) 을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 반응은 약 2 시간 미만, 약 90 분 미만, 약 60 분 미만, 약 30 분 미만 또는 약 15 분 미만으로 수행된다.
일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 약 20-30, 약 30-40, 약 40-50, 또는 약 50-100 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 약 100-200 개, 약 100-500 개, 또는 약 100-1000 개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산 서열은 약 1000-2000, 약 2000-3000, 약 3000-4000, 또는 약 4000-5000 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
특정 구현예에서, 표적 핵산은 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA, 플라스미드 DNA, 또는 합성 이중-가닥 DNA 를 포함할 수 있으나, 반드시 그에 한정되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 표적 핵산은 단일-가닥 바이러스 DNA, 전령 RNA, 리보솜 RNA, 운반 RNA, 마이크로RNA, 짧은 간섭 RNA, 소형 핵 RNA, 합성 RNA, 합성 단일-가닥 DNA, 장형 비-코딩 RNA, 프리-마이크로RNA, 바이러스 dsRNA, 및 비-바이러스 dsRNA 를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 표적 이중-가닥 핵산을 포함하는 샘플을 증폭 반응 혼합물과 조합하는 단계를 수반한다.
본원에서 기재된 바와 같이, 본 발명에서 사용을 위한 샘플은 생물학적 또는 환경적 샘플, 예컨대 식품 샘플 (신선 과일 또는 채소, 육류), 음료 샘플, 종이 표면, 패브릭 표면, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 염수 샘플, 대기 공기 또는 다른 가스 샘플에의 노출, 또는 이의 조합일 수 있다. 예를 들어, 금속, 목재, 플라스틱, 고무 등을 비제한적으로 포함하는 임의의 재료로 만들어진 가정용/상업적/산업적 표면을 면봉으로 닦아서 오염을 시험할 수 있다. 토양 샘플은 환경적 목적 및/또는 인간, 동물 또는 식물 질환 검사를 위해, 병원성 박테리아 또는 기생충, 또는 다른 미생물의 존재에 대해 시험될 수 있다. 물 샘플 예컨대 담수 샘플, 폐수 샘플, 또는 염수 샘플은 예를 들어, 크립토스포리디움 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 지아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 또는 다른 미생물 오염의 존재를 검출하기 위해, 청정도 및 안정성, 및/또는 휴대성에 대해 평가될 수 있다. 추가 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 객담, 점액질, 림프, 활액, 뇌척수액, 복수, 흉수, 혈청종, 고름, 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑을 비제한적으로 포함하는 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 특정한 구현예에서, 환경적 샘플 또는 생물학적 샘플은 미가공 샘플일 수 있고/있거나 하나 이상의 표적 분자는 방법의 적용 이전에 샘플로부터 정제되지 않을 수 있거나 증폭되지 않을 수 있다. 미생물의 식별은 임의의 많은 적용분야에서 유용하고/하거나 필요할 수 있고, 따라서 당업자가 적절하다고 여기는 임의 출처 유래의 임의 유형의 샘플이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액, 림프액, 활액, 담즙, 복수, 흉막 삼출액, 혈청종, 타액, 뇌척수액, 수양액 또는 유리체액, 또는 임의의 신체 분비액, 여출액, 삼출액, 또는 관절로부터 수득된 유체, 또는 피부 또는 점막 표면의 면봉을 포함할 수 있지만, 반드시 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 샘플은 인간 환자로부터 수득한 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플은 식물 샘플일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 미정제 샘플일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 정제된 샘플일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 핵산의 증폭은 약 37℃-65℃ 에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산의 증폭은 약 50℃-59℃ 에서 수행될 수 있다. 더욱 구체적인 구현예에서, 표적 핵산의 증폭은 약 60℃-72℃ 에서 수행될 수 있다. 더욱 구체적인 구현예에서, 표적 핵산의 증폭은 약 37℃ 에서 수행될 수 있다. 표적 핵산의 증폭은 또한 실온에서 수행될 수 있다. 실온은 20℃-25℃ 에서 다를 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 핵산의 증폭 일정한 온도에서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 프라이머 쌍의 제 1 프라이머에 함유된 부분을 포함하는 앰플리파이어 프라이머를 추가로 포함하며, 프라이머 쌍의 제 1 프라이머는 제 1 증폭 단계를 매개하고, 앰플리파이어 프라이머는 프라이머 쌍의 제 2 프라이머와 함께 후속 증폭 단계를 매개한다.
앰플리파이어 프라이머 및 프라이머 쌍의 제 1 프라이머는 각각 T7 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
앰플리파이어 프라이머는 길이 약 23 내지 약 35 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명은 표적 단일-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출 방법으로서, 샘플 내의 단일-가닥 핵산을 표적 이중-가닥 핵산으로 전환하고; 표적 이중-가닥 핵산을 포함하는 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 증폭 반응 혼합물과 조합하는 단계, 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 사용하여 표적 핵산의 R-루프를 열고, 헬리카제를 사용하여 표적 핵산의 제 1 및 제 2 가닥을 풀고, 프라이머 쌍 및 중합효소를 사용하여 가닥을 어닐링 및 연장함으로써 표적 핵산을 증폭하는 단계를 수행하고; 추가로 등온 조건 하에 반복된 열림, 풀림, 어닐링 및 연장에 의해 표적 핵산을 증폭하고; 및 임의로 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 증폭된 표적 핵산을 검출하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 표적 단일-가닥 핵산은 RNA 분자이다.
일부 구현예에서, RNA 분자는 역전사 및 증폭 단계에 의해 이중-가닥 핵산으로 전환된다.
일부 구현예에서, 표적 단일-가닥 핵산은 단일-가닥 바이러스 DNA, 바이러스 RNA, 전령 RNA, 리보솜 RNA, 운반 RNA, 마이크로RNA, 짧은 간섭 RNA, 소형 핵 RNA, 합성 RNA, 합성 단일-가닥 DNA, 장형 비-코딩 RNA, 프리-마이크로RNA, 바이러스 dsRNA, 및 비-바이러스 dsRNA 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
검출
일부 구현예에서, 방법은 겔 전기영동, 인터칼레이팅 염료 검출, PCR, 실시간 PCR, 형광, 형광 공명 에너지 전이 (FRET), 질량 분석법, 측류 어세이, 비색 어세이, 및 CRISPR-기반 검출 시스템을 포함하나 그에 한정되지 않는 방법에 의해 증폭된 핵산을 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 비색 어세이는 당해 기술분야에 알려진 임의의 것, 예컨대, 반드시 이에 한정되는 것은 아니나, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase) (HRP) 어세이, 알칼리성 포스페이트 (ALP) 어세이, 또는 골드 나노입자 기반 어세이를 포함할 수 있다.
특별한 구현예에서, 증폭된 핵산은 CRISPR Cas13-기반 시스템에 의해 검출할 수 있다. 특정 구현예에서, 증폭된 핵산은 CRISPR Cas12-기반 시스템에 의해 검출될 수 있다 (Chen et al. Science 360:436-439 (2018) 및 Gootenberg et al. Science 360:439-444 (2018) 참조). 특별한 구현예에서, 증폭된 핵산은 CRISPR Cas13-기반 및 CRISPR Cas12-기반 시스템의 조합에 의해 검출할 수 있다.
단일 뉴클레오티드 변이체를 포함하는 핵산의 검출, rRNA 서열에 기반하는 검출, 약물 내성에 대한 스크리닝, 미생물 발생, 유전자 변동 모니터링, 및 환경 샘플의 스크리닝은, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 2018 년 10월 22일에 출원된 PCT/US18/054472 의 [0183] - [0327] 에 기재된 바와 같을 수 있다. WO 2017/219027, WO2018/107129, US20180298445, US 2018-0274017, US 2018-0305773, WO 2018/170340, 미국 출원 15/922,837, 출원일 2018년 3월 15 일, 발명의 명칭 "Devices for CRISPR Effector System Based Diagnostics", PCT/US18/50091, 출원일 2018년 9월 7일 "Multi-Effector CRISPR Based Diagnostic Systems", PCT/US18/66940, 출원일 2018 년 12월 20일, 발명의 명칭 "CRISPR Effector System Based Multiplex Diagnostics", PCT/US18/054472, 출원일 2018년 10월 4일, 발명의 명칭 "CRISPR Effector System Based Diagnostic", 미국 가출원 62/740,728, 출원일 2018년 10월 3일, 발명의 명칭 "CRISPR Effector System Based Diagnostics for Hemorrhagic Fever Detection", 미국 가출원 62/690,278, 출원일 2018년 6월 26일 및 미국 가출원 62/767,059, 출원일 2018년 11월 14일, 둘 모두의 발명의 명칭 "CRISPR Double Nickase Based Amplification, Compositions, Systems and Methods", 미국 가출원 62/690,160, 출원일 2018년 6월 26일 및 62,767,077, 출원일 2018년 11월 14일, 둘 모두의 발명의 명칭 "CRISPR/CAS and Transposase Based Amplification Compositions, Systems, And Methods", 미국 가출원 62/690,257, 출원일 2018년 6월 26일 및 62/767,052, 출원일 2018년 11월 14일, 둘 모두의 발명의 명칭 "CRISPR Effector System Based Amplification Methods, Systems, And Diagnostics", 미국 가출원 62/767,076, 출원일 2018년 11월 14일, 발명의 명칭 "Multiplexing Highly Evolving Viral Variants With SHERLOCK" 및 62/767,070, 출원일 2018년 11월 14일 발명의 명칭 "Droplet SHERLOCK" 을 참조한다. 또한 WO2017/127807, WO2017/184786, WO 2017/184768, WO 2017/189308, WO 2018/035388, WO 2018/170333, WO 2018/191388, WO 2018/213708, WO 2019/005866, PCT/US18/67328, 출원일 2018 년 12월 21일, 발명의 명칭 "Novel CRISPR Enzymes and Systems", PCT/US18/67225, 출원일 2018 년 12월 21일, 발명의 명칭 "Novel CRISPR Enzymes and Systems" 및 PCT/US18/67307, 출원일 2018 년 12월 21일, 발명의 명칭 "Novel CRISPR Enzymes and Systems", US 62/712,809, 출원일 2018년 7월 31일, 발명의 명칭 "Novel CRISPR Enzymes and Systems", U.S. 62/744,080, 출원일 2018년 10월 10일, 발명의 명칭 "Novel Cas12b Enzymes and Systems" and U.S. 62/751,196, 출원일 2018년 10월 26일, 발명의 명칭 "Novel Cas12b Enzymes and Systems", U.S. 715,640, 출원일 2018년 8월 7일, 발명의 명칭 "Novel CRISPR Enzymes and Systems", WO 2016/205711, U.S. 9,790,490, WO 2016/205749, WO 2016/205764, WO 2017/070605, WO 2017/106657, 및 WO 2016/149661, WO2018/035387, WO2018/194963, Cox DBT, et al., RNA editing with CRISPR-Cas13, Science. 2017 Nov 24;358(6366):1019-1027; Gootenberg JS, et al., Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6., Science. 2018 Apr 27;360(6387):439-444; Gootenberg JS, et al., Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2., Science. 2017 Apr 28;356(6336):438-442; Abudayyeh OO, et al., RNA targeting with CRISPR-Cas13, Nature. 2017 Oct 12;550(7675):280-284; Smargon AA, et al., Cas13b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNase Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28. Mol Cell. 2017 Feb 16;65(4):618-630.e7; Abudayyeh OO, et al., C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector, Science. 2016 Aug 5;353(6299):aaf5573; Yang L, et al., Engineering and optimising deaminase fusions for genome editing. Nat Commun. 2016 Nov 2;7:13330, Myrvhold et al., Field deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13, Science 2018 360, 444-448, Shmakov et al. "Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems," Nat Rev Microbiol. 2017 15(3):169-182 (각각 전문이 본원에 참조로 포함됨) 을 참조한다.
일부 특별한 구현에에서, RNA 표적화 이펙터는 강력한 CRISPR-기반 검출을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예는 비슷한 수준의 감도로 DNA 및 RNA 둘 모두를 검출할 수 있고, 개시된 HDA 방법 및 시스템과 함께 사용될 수 있다. 참조의 편이를 위해서, 본 명세서에 개시된 검출 구현예는 또한 SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing) 이라고 할 수 있고, 이것은 일부 구현예에서, 중온성 및 고온성 등온 조건을 포함하여, 본 명세서에 개시된 HDA 방법에 후속으로 수행된다.
일부 구현예에서, 핵산-표적화 검출 시스템의 하나 이상의 엘리먼트는 내생성 CRISPR RNA-표적화 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유래된다. 일정 예의 구현예에서, 이펙터 단백질 CRISPR RNA-표적화 검출 시스템은 제한 없이, 본 명세서에 기술된 HEPN 도메인, 당분야에 공지된 HEPN 도메인, 및 공통 서열 모티프와 비교하여 HEPN으로 인식되는 도메인을 포함하여, 적어도 하나의 HEPN 도메인을 포함한다. 몇몇 이러한 도메인이 본원에서 제공된다. 비제한적인 한 예에서, 공통 서열은 본원에서 제공되는 C2c2 또는 Cas13b 오솔로그의 서열로부터 유래될 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 이펙터 단백질은 단일 HEPN 도메인을 포함한다. 일정한 다른 예의 구현예에서, 이펙터 단백질은 2개의 HEPN 도메인을 포함한다.
예시적 구현예에서, 이펙터 단백질은 RxxxxH 모티프 서열을 포함하는 하나 이상의 HEPN 도메인을 포함한다. RxxxxH 모티프 서열은 비제한적으로, 본원에 기재된 HEPN 도메인 또는 당업계에 공지된 HEPN 도메인으로부터의 것일 수 있다. RxxxxH 모티프 서열은 둘 이상의 HEPN 도메인의 일부를 조합하여 생성된 모티프 서열을 더 포함한다. 언급된 바와 같이, 공통 서열은 PCT/US2017/038154, 발명의 명칭 "Novel Type VI CRISPR Orthologs and Systems", 예를 들어, 페이지 256-264 및 285-336, 미국 가특허출원 62/432,240, 발명의 명칭 "Novel CRISPR Enzymes and Systems," 미국 가특허출원 62/471,710, 발명의 명칭 "Novel Type VI CRISPR Orthologs and Systems", 출원일 2017년 3월 15 일, 및 미국 가특허출원 62/484,786, 발명의 명칭 "Novel Type VI CRISPR Orthologs and Systems", 출원일 2017년 4월 12일에 개시된 오솔로그의 서열로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, HEPN 도메인은 R{N/H/K}X1X2X3H (SEQ ID NO:15) 의 서열을 포함하는 적어도 하나의 RxxxxH 모티프를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, HEPN 도메인은 R{N/H}X1X2X3H (SEQ ID NO:16) 의 서열을 포함하는 RxxxxH 모티프를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, HEPN 도메인은 R{N/K}X1X2X3H (SEQ ID NO:17) 의 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, X1 은 R, S, D, E, Q, N, G, Y, 또는 H 이다. 일정 구현예에서, X2는 I, S, T, V, 또는 L 이다. 일정 구현예에서, X3 은 L, F, N, Y, V, I, S, D, E, 또는 A 이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 추가의 이펙터는 cas1 유전자에 대한 그들의 근접성, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, cas1 유전자의 출발점으로부터 20 kb 및 cas1 유전자의 종료점으로부터 20 kb 영역 이내에 의해 확인될 수 있다. 일정 구현예에서 이펙터 단백질은 적어도 하나의 HEPN 도메인 및 적어도 500 개 아미노산을 포함하고, C2c2 이펙터 단백질은 Cas 유전자 또는 CRISPR 어레이의 상류 또는 하류 20 kb 이내의 원핵생물 게놈에 천연적으로 존재한다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12라고도 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 형태를 포함한다. 일정 예의 구현예에서, C2c2 이펙터 단백질은 Cas 1 유전자의 상류 또는 하류 20 kb 이내 원핵생물 게놈에 천연적으로 존재한다. 용어 "오솔로그 (orthologue)" (ortholog 라고도 함) 및 "상동체 (homologue)" (homolog 라고도 함)는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 추가 지침에 의해서, 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "상동체" 는 상동성인 단백질과 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행하는 동일 종의 단백질이다. 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "오솔로그" 는 오솔로그인 단백질과 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행하는 상이한 종의 단백질이다. 오솔로그 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다.
특정 구현예에서, 유형 VI RNA-표적화 Cas 효소는 C2c2 이다. 다른 예시적인 구현예에서, 유형 VI RNA-표적화 Cas 효소는 Cas 13b 이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 언급되는 유형 VI 단백질 예컨대 C2c2의 상동체 또는 오솔로그는 유형 VI 단백질 예컨대 C2c2 (예를 들어, 임의의 렙토트리키아 샤히이 (Leptotrichia shahii) C2c2, 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020 C2c2, 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A179 C2c2, 클로스트리듐 아미노필럼 (Clostridium aminophilum) (DSM 10710) C2c2, 카르노박테리움 갈리나럼 (Carnobacterium gallinarum) (DSM 4847) C2c2, 팔루디박터 프로피오니시게네스 (Paludibacter propionicigenes) (WB4) C2c2, 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 (Listeria weihenstephanensis) (FSL R9-0317) C2c2, 리스테리아세아에 박테리움 (Listeriaceae bacterium) (FSL M6-0635) C2c2, 리스테리아 뉴요켄시스 (Listeria newyorkensis) (FSL M6-0635) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (Leptotrichia wadei) (F0279) C2c2, 로도박터 캅슐라터스 (Rhodobacter capsulatus) (SB 1003) C2c2, 로도박터 캅슐라터스 (R121) C2c2, 로도박터 캅슐라터스 (DE442) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2) C2c2, 또는 리스테리아 실리게리 (Listeria seeligeri) C2c2 중 임의의 야생형 서열 기반)와 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 예컨대 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 유형 VI 단백질 예컨대 C2c2의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 C2c2 (예를 들어, 렙토트리키아 샤히이 C2c2, 라크노스피라세아에 박테리움 MA2020 C2c2, 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A179 C2c2, 클로스트리듐 아미노필럼 (DSM 10710) C2c2, 카르노박테리움 갈리나럼 (DSM 4847) C2c2, 팔루디박터 프로피오니시게네스 (WB4) C2c2, 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 (FSL R9-0317) C2c2, 리스테리아세아에 박테리움 (FSL M6-0635) C2c2, 리스테리아 뉴요켄시스 (FSL M6-0635) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (F0279) C2c2, 로도박터 캅슐라터스 (SB 1003) C2c2, 로도박터 캅슐라터스 (R121) C2c2, 로도박터 캅슐라터스 (DE442) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2) C2c2, 또는 리스테리아 실리게리 C2c2 중 임의의 야생형 서열 기반)와 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 예컨대 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다.
특정한 다른 예시적 구현예에서, CRISPR 시스템 이펙터 단백질은 C2c2 뉴클레아제이다. C2c2 의 활성은 2 개 HEPN 도메인의 존재에 의존적일 수 있다. 이들은 RNase 도메인, 즉 RNA 를 절단하는 뉴클레아제 (특히 엔도뉴클레아제) 인 것으로 확인되었다. C2c2 HEPN 은 또한 DNA, 또는 잠재적으로 DNA 및/또는 RNA 를 표적화할 수 있다. C2c2 의 HEPN 도메인이 그들의 야생형 형태로, 적어도 RNA 에 결합하여 절단시킬 수 있다는 것을 기초로, C2c2 이펙터 단백질이 RNase 기능을 갖는 것이 바람직하다. C2c2 CRISPR 시스템과 관련하여, 2016년 6월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/351,662 및 2016년 8월 17일에 출원된 미국 가출원 번호62/376,377을 참조한다. 또한 2016년 6월 17일 출원된 미국 가출원 62/351,803을 참조한다. 또한, 브로드 연구소 번호 10035.PA4 및 대리인 서류 번호 47627.03.2133을 보유하는 2016년 12월 8일 출원된 발명의 명칭 "Novel Crispr Enzymes and Systems" 의 미국 가출원을 참조한다. East-Seletsky et al. "Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection" Nature doi:10/1038/nature19802 and Abudayyeh et al. "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA targeting CRISPR effector" bioRxiv doi:10.1101/054742 을 더 참조한다.
CRISPR 시스템에서 RNase 기능은 공지되어 있으며, 예를 들어 mRNA 표적화는 일정 유형 III CRISPR-Cas 시스템의 경우에 보고되었고 (Hale et al., 2014, Genes Dev, vol. 28, 2432-2443; Hale et al., 2009, Cell, vol. 139, 945-956; Peng et al., 2015, Nucleic Aids research, vol. 43, 406-417), 상당한 장점을 제공한다. 스타필로코쿠스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis) 유형 III-A 시스템에서, 표적 전역의 전사는 그 결과로 Cas10-Csm 리보뉴클레오단백질 이펙터 단백질 복합체 내의 독립적인 활성 부위에 의해 매개되는, 표적 DNA 및 이의 전사물의 절단을 야기시킨다 (Samai et al., 2015, Cell, vol. 151, 1164-1174). 본 발명의 이펙터 단백질을 통한 CRISPR-Cas 시스템, 조성물 또는 RNA 의 표적화 방법이 따라서 제공된다.
일 구현예에서, Cas 단백질은 제한 없이 렙토트리키아 (Leptotrichia), 리스테리아 (Listeria), 코리네박터 (Corynebacter), 수테렐라 (Sutterella), 레지오넬라 (Legionella), 트레포네마 (Treponema), 필리팍토르 (Filifactor), 유박테리움 (Eubacterium), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 락토바실루스 (Lactobacillus), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 박테로이데스 (Bacteroides), 플라비이볼라 (Flaviivola), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 스파에로카에타 (Sphaerochaeta), 아조스피릴럼 (Azospirillum), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 네이세리아 (Neisseria), 로세부리아 (Roseburia), 파르비바큘럼 (Parvibaculum), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 니트라티프락토르 (Nitratifractor), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 캄필로박터 (Campylobacter), 및 라크노스피라 (Lachnospira) 를 포함하는 속의 유기체의 C2c2 오솔로그일 수 있다. 이러한 속의 유기체 종은 달리 본원에서 논의될 수 있다.
특정 예시적 구현예에서, 본 발명의 C2c2 이펙터 단백질은 제한 없이, 하기의 21 개 오솔로그 종 (다수 CRISPR 유전자좌 포함): 렙토트리키아 샤히 (Leptotrichia shahii); 렙토트리키아 웨이데이 (Leptotrichia wadei) (Lw2); 리스테리아 실리게리 (Listeria seeligeri); 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020; 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) NK4A179; [클로스트리디움 (Clostridium)] 아미노필룸 (aminophilum) DSM 10710; 카르노박테리움 갈리나룸 (Carnobacterium gallinarum) DSM 4847; 카르노박테리움 갈리나룸 (Carnobacterium gallinarum) DSM 4847 (제 2 CRISPR 유전자좌); 팔루디박터 프로피오니시게네스 (Paludibacter propionicigenes) WB4; 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 (Listeria weihenstephanensis) FSL R9-0317; 리스테리아세아에 박테리움 (Listeriaceae bacterium) FSL M6-0635; 렙토트리키아 웨이데이 (Leptotrichia wadei) F0279; 로도박터 캡슐라투스 (Rhodobacter capsulatus) SB 1003; 로도박터 캡슐라투스 (Rhodobacter capsulatus) R121; 로도박터 캡슐라투스 (Rhodobacter capsulatus) DE442; 렙토트리키아 부칼리스 (Leptotrichia buccalis) C-1013-b; 허르비닉스 헤미셀룰로실리티카 (Herbinix hemicellulosilytica); [유박테리움 (Eubacterium)] 렉탈레 (rectale); 유박테리아세아에 박테리움 (Eubacteriaceae bacterium) CHKCI004; 블라우티아 종 마르세이유 (Blautia sp. Marseille)-P2398; 및 렙토트리키아 종 (Leptotrichia sp.) 경구 분류군 879 str. F0557 을 포함한다. 12 가지의 추가적인 비제한적 예는 하기의 것이다: 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) NK4A144; 클로로플렉수스 아그레간스 (Chloroflexus aggregans); 데메퀴나 아우란티아카 (Demequina aurantiaca); 탈라소스피라 종 (Thalassospira sp.) TSL5-1; 슈도부티리비브리오 종 (Pseudobutyrivibrio sp.) OR37; 부티리비브리오 종 (Butyrivibrio sp.) YAB3001; 블라우티아 종 마르세이유 (Blautia sp. Marseille)-P2398; 렙토트리키아 종 마르세이유 (Leptotrichia sp. Marseille)-P3007; 박테로이데스 이후아에 (Bacteroides ihuae); 포르피로모나다세아에 박테리움 (Porphyromonadaceae bacterium) KH3CP3RA; 리스테리아 리파리아 (Listeria riparia); 및 인솔리티스피릴룸 페레그리눔 (Insolitispirillum peregrinum).
CRISPR-Cas 시스템 효소의 오솔로그를 식별하는 일부 방법은 관심 게놈에서 tracr 서열을 식별하는 단계를 포함할 수 있다. tracr 서열의 식별은 하기의 단계들과 관련될 수 있다: CRISPR 효소를 포함하는 CRISPR 영역을 식별하기 위해 데이타베이스에서 직접 반복부 또는 tracr 메이트 서열에 대한 검색 단계. 센스 및 안티센스 양쪽 방향으로 CRISPR 효소에 측접하는 CRISPR 영역에서 상동성 서열의 검색 단계. 전사 종결인자 및 2차 구조의 조사. 직접 반복부 또는 tracr 메이트 서열은 아니지만 직접 반복부 또는 tracr 메이트 서열과 50% 초과의 동일성을 갖는 잠재적 tracr 서열로서 임의 서열을 식별하는 단계. 잠재적 tracr 서열을 선택하고 그와 회합되는 전사 종결인자 서열을 분석하는 단계.
본 명세서에 기술된 임의의 기능성이 다수의 오솔로그 유래 단편을 포함하는 키메라 효소를 포함하여, 다른 오솔로그 유래 CRISPR 효소로 조작될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 이러한 오솔로그의 예는 본 명세서의 다른 부분에 기술되어 있다. 따라서, 키메라 효소는 제한 없이 렙토트리키아, 리스테리아, 코리네박터, 수테렐라, 레지오넬라, 트레포네마, 필리팍토르, 유박테리움, 스트렙토코쿠스, 락토바실루스, 마이코플라스마, 박테로이데스, 플라비이볼라, 플라보박테리움, 스파에로차에타, 아조스피릴룸, 글루콘아세토박터, 네이세리아, 로세부리아, 파르비바큘럼, 스타필로코쿠스, 니트라티프락토, 마이코플라스마 및 캄필로박터를 포함하는 유기체의 CRISPR 효소 오솔로그의 단편을 포함할 수 있다. 키메라 효소는 제 1 단편 및 제 2 단편을 포함할 수 있고, 단편은 본 명세서에 언급된 속의 유기체 또는 본 명세서에 언급된 종의 유기체의 CRISPR 효소 오솔로그의 것일 수 있으며, 유리하게 단편은 상이한 종의 CRISPR 효소 오솔로그로부터 유래된다.
구현예에서, 본원에서 언급되는 바와 같은 C2c2 단백질은 또한 C2c2 의 기능성 변이체 또는 이의 상동체 또는 오솔로그를 포괄한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 단백질의 "기능적 변이체" 는 그 단백질의 활성을 적어도 부분적으로 보유하는 그러한 단백질의 변이체를 의미한다. 기능적 변이체는 다형체 등을 포함하는, 돌연변이체 (삽입, 결실, 또는 치환 돌연변이체일 수 있음) 를 포함할 수 있다. 기능적 변이체에는 또한 또 다른, 통상 미관련된, 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드와 이러한 단백질의 융합 생성물이 포함된다. 기능적 변이체는 천연적으로 발생할 수 있거나 인공적일 수 있다. 유리한 구현예는 조작 또는 비천연 발생 유형 VI RNA-표적화 이펙터 단백질을 포함할 수 있다.
한 구현예에서, C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체를 인코딩하는 핵산 분자(들)는 진핵생물 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 진핵생물은 본원에서 토의되는 바와 같을 수 있다. 핵산 분자(들)는 조작 또는 비천연 발생일 수 있다.
한 구현예에서, C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다 (그리고 그에 따라 이를 코딩하는 핵산 분자(들)는 돌연변이(들)를 가질 수 있음). 돌연변이는 인공적으로 도입된 돌연변이일 수 있고, 제한 없이 촉매성 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. Cas9 효소에 대한 촉매성 도메인의 예는 제한 없이 RuvC I, RuvC II, RuvC III 및 HNH 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 인공적으로 도입된 돌연변이일 수 있고, 제한 없이 촉매성 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. Cas 효소에 대한 촉매성 도메인의 예는 제한 없이 HEPN 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체는 기능성 도메인에 작동적으로 연결되거나 또는 융합된 일반 핵산 결합 단백질로서 사용될 수 있다. 예시적인 기능성 도메인은 제한 없이 번역 개시인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 뉴클레아제, 특히 리보뉴클레아제, 스플라이시오솜, 비드, 광 유도성/제어성 도메인 또는 화학 유도성/제어성 도메인을 포함할 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, C2c2 이펙터 단백질은 렙토트리키아, 리스테리아, 코리네박터, 수테렐라, 레지오넬라, 트레포네마, 필리팩토르, 유박테리움, 스트렙토코쿠스, 락토바실루스, 마이코플라스마, 박테로이데스, 플라비이볼라, 플라보박테리움, 스파에로차에타, 아조스피릴룸, 글루콘아세토박터, 네이세리아, 로세부리아, 파르비바큘럼, 스타필로코쿠스, 니트라티프락토, 마이코플라스마, 및 캄필로박터로 이루어지는 군으로부터 선택된 유기체로부터 유래될 수 있다.
일정 실시형태에서, 이펙터 단백질은 리스테리아 sp. C2c2p, 바람직하게 리스테리아 실리게리아 C2c2p, 보다 바람직하게 리스테리아 실리게리아 혈청형 1/2b str. SLCC3954 C2c2p일 수 있고, crRNA 서열은 5' 29-nt 직접 반복부 (DR) 및 15-nt 내지 18-nt 스페이서를 갖는 44 내지 47개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일정 구현예에서, 이펙터 단백질은 렙토트리키아 sp. C2c2p, 바람직하게 렙토트리키아 샤히 C2c2p, 보다 바람직하게 렙토트리키아 샤히 DSM 19757 C2c2p일 수 있고, crRNA 서열은 적어도 24 nt의 5' 직접 반복부, 예컨대 5' 24-28-nt 직접 반복부 (DR) 및 적어도 14 nt의 스페이서, 예컨대 14-nt 내지 28-nt 스페이서, 또는 적어도 18 nt의 스페이서, 예컨대 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 또는 그 이상의 nt, 예컨대 18-28 nt, 19-28 nt, 20-28 nt, 21-28 nt, 또는 22-28 nt의 스페이서를 갖는, 42 내지 58개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 이펙터 단백질은 렙토트리키아 sp., 렙토트리키아 웨이데이 F0279, 또는 리스테리아 sp., 바람직하게 리스테리아 뉴요켄시스 FSL M6-0635 일 수 있다.
일정한 예의 실시형태에서, 본 발명의 C2c2 이펙터 단백질은 제한 없이, 하기의 21개 오솔로그 종 (다수 CRISPR 유전자좌 포함): 렙토트리키아 샤히; 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2); 리스테리아 실리게리 라크노스피라과 박테리아 MA2020; 라크노스피라과 박테리아 NK4A179; [클로스트리듐] 아미노필럼 DSM 10710; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847 (제 2 CRISPR 유전자좌); 팔루디박터 프로피오니시게네스 WB4; 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 FSL R9-0317; 리스테리아과 박테리아 FSL M6-0635; 렙토트리키아 웨이데이 F0279; 로도박터 캡슐라터스 SB 1003; 로도박터 캡슐라터스 R121; 로도박터 캡슐라터스 DE442; 렙토트리키아 부칼리스 C-1013-b; 허르비닉스 헤미셀룰로실리티카; [유박테리움] 렉탈레; 유박테리아과 박테리아 CHKCI004; 블라우티아 종 마르세이유-P2398; 및 렙토트리키아 sp. 경구 분류군 879 str. F0557을 포함한다. 12종의 추가의 비제한적인 예는 라크노스피라과 박테리아 NK4A144; 클로로플렉서스 아그레간스; 데메퀴나 아우란티아카; 탈라소스피라 sp. TSL5-1; 슈도부티리비브리오 sp. OR37; 부티리비브리오 sp. YAB3001; 블라우티아 종 마르세이유-P2398; 렙토트리키아 sp. 마르세이유-P3007; 박테로이데스 이후아에; 포르피로모나다과 박테리아 KH3CP3RA; 리스테리아 리파리아; 및 인솔리티스피릴럼 페레그리넘이다.
일정 구현예에서, 본 발명에 따른 C2c2 단백질은 오솔로그 중 하나이거나 또는 그로부터 유래되거나 또는 본 출원에서 기술된 바와 같은 둘 이상의 오솔로그의 키메라 단백질이거나, 또는 이종성/기능성 도메인과 융합하거나 또는 융합하지 않고, 본 명세서의 다른 곳에서 정의된 바와 같이, 데드 C2c2, 분할 C2c2, 탈안정화 C2c2 등을 포함한, 오솔로그 중 하나의 돌연변이체 또는 변이체 (또는 키메라 돌연변이체 또는 변이체) 이다.
일정한 예의 구현예에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 유형 VI-B 이펙터 단백질, 예컨대 Cas13b 및 그룹 29 또는 그룹 30 단백질이다. 일정한 예의 구현예에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 하나 이상의 HEPN 도메인을 포함한다. 일정한 예의 구현예에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 C-말단 HEPN 도메인, N-말단 HEPN 도메인, 또는 둘 모두를 포함한다. 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있는 예로서 VI형-B 이펙터 단백질과 관련하여, 2016년 10월 21일에 출원된 발명의 명칭 "Novel CRISPR Enzymes and Systems"의 US 출원 번호 15/331,792, 및 2016년 10월 21일 출원된 발명의 명칭 "Novel CRISPR Enzymes and Systems"의 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/058302, 및 Smargon et al. "Cas13b is a Type VI-B CRISPR-associated RNA-Guided RNase differentially regulated by accessory proteins Csx27 and Csx28" Molecular Cell, 65, 1-13 (2017); dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023, 및 2017년 3월 15 일 출원된 발명의 명칭 "Cas13b Orthologues CRISPR Enzymes and Systems"로 양도된 미국 가출원 번호를 참조한다. 바람직한 일 구현예에서, Cas 13 단백질은 LwaCas13 이다.
차폐성 구성체
본 명세서에서 사용되는 "차폐성 구성체" 는 본 명세서에 기술된 활성화된 CRISPR 시스템 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있거나 또는 달리 탈활성화될 수 있는 분자를 의미한다. 용어 "차폐성 구성체" 는 또한 "검출 구성체"로서 대체하여 언급될 수도 있다. 일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 RNA-기반 차폐성 구성체이다. RNA-기반 차폐성 구성체는 CRISPR 이펙터 단백질에 의해 절단가능한 RNA 엘리먼트를 포함한다. RNA 엘리먼트의 절단은 작용제를 방출하거나 또는 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있게 하는 입체형태 변화를 일으킨다. RNA 엘리먼트가 어떻게 사용되어서 검츨가능한 신호의 발생을 방지 또는 차폐할 수 있는지를 입증하는 예로서의 구성체는 하기에 기술되고 본 발명의 구현예는 이의 변이체를 포함한다. 절단 이전에, 또는 차폐성 구성체가 '활성' 상태일 때, 차폐성 구성체는 양성의 검출가능한 신호의 발생 또는 검출을 차단한다. 일정 예의 구현예에서 최소 배경 신호가 활성 RNA 차폐성 구성체의 존재 하에서 생성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 양성 검출가능한 신호는 광학, 형광, 화학발광, 전기화학 또는 다른 당분야에 공지된 검출 방법을 사용해 검출될 수 있는 임의 신호일 수 있다. 용어 "양성의 검출가능한 신호" 는 차폐성 구성체의 존재 하에서 검출가능할 수 있는 다른 검출가능한 신호와 구별하기 위해 사용된다. 예를 들어, 일정 구현예에서 제 1 신호 (즉, 음성의 검출가능한 신호)는 차폐제가 존재할 때 검출될 수 있을 것이고, 이것은 이후 표적 분자의 검출 및 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질에 의한 차폐제의 절단 또는 탈활성화 시에 제 2 신호 (예를 들어, 양성의 검출가능한 신호) 로 전환된다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 유전자 생성물의 발생을 억제할 수 있다. 유전자 생성물은 샘플에 첨가되는 리포터 구성체에 의해 코딩될 수 있다. 차폐성 구성체는 RNA 간섭 경로에 관여되는 간섭 RNA, 예컨대 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 또는 소형 간섭 RNA (siRNA) 일 수 있다. 차폐성 구성체는 또한 마이크로RNA (miRNA) 를 포함할 수 있다. 존재하는 경우에, 차폐성 구성체는 유전자 생성물의 발현을 억제한다. 유전자 생성물은 형광 단백질 또는 다른 RNA 전사물일 수 있거나 또는 달리 표지된 프로브, 압타머, 또는 항체에 의해 검출가능하지만 차폐성 구성체의 존재를 위한 단백질일 수 있다. 이펙터 단백질의 활성화 시에 차폐성 구성체는 절단되거나 또는 달리 침묵화되어서 양성 검출가능한 신호로서 유전자 생성물의 발현 및 검출이 가능하게 된다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 차폐성 구성체로부터 하나 이상의 시약의 방출이 검출가능한 양성 신호의 발생을 일으키도록 검출가능한 양성 신호를 발생시키는데 필요한 하나 이상의 시약을 격리시킬 수 있다. 하나 이상의 시약은 비색 신호, 화학 발광 신호, 형광 신호, 또는 임의의 다른 검출가능한 신호를 생성시키도록 조합될 수 있고, 이러한 목적에 적합한 것으로 공지된 임의 시약을 포함할 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 하나 이상의 시약은 하나 이상의 시약에 결합하는 RNA 압타머에 의해 격리된다. 하나 이상의 시약은 표적 분자의 검출 시 이펙터 단백질이 활성화되고 RNA 압타머가 분해될 때 방출된다.
본 발명의 다른 구현예에서, RNA-기반 차폐성 구성체는 검출가능한 양성 신호의 발생을 저해하거나 또는 RNA-기반 차폐성 구성체는 검출가능한 양성 신호를 차폐하거나, 또는 대신에 검출가능한 음성 신호를 발생시켜 검출가능한 양성 신호의 발생을 저해하거나, 또는 RNA-기반 차폐성 구성체는 리포팅 구성체에 의해 코딩되는 유전자 생성물의 발생을 저해하는 침묵화 RNA 를 포함하고, 여기서 유전자 생성물은 발현될 때 검출가능한 양성 신호를 발생시킨다.
추가 구현예에서, RNA-기반 차폐성 구성체는 음성의 검출가능한 신호를 발생시키는 리보자임이고, 여기서 양성의 검출가능한 신호는 리보자임이 탈활성화될 때 발생되거나, 또는 리보자임은 기질을 제 1 색상으로 전환시키고, 여기서 기질은 리보자임이 탈활성화될 때 제 2 색상으로 전환된다.
다른 구현예에서, RNA-기반 차폐제는 RNA 압타머이거나, 또는 압타머는 효소를 격리시키고, 여기서 효소는 기질에 대해 작용하여 압타머로부터 방출 시 검출가능한 신호를 발생시키거나, 또는 압타머는 압타머로부터 방출될 때 검출가능한 신호를 발생시키도록 조합되는 작용제의 쌍을 격리시킨다.
다른 구현예에서, RNA-기반 차폐성 구성체는 검출가능한 리간드 및 차폐성 성분이 부착되는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 검출가능한 리간드는 형광단이고 차폐성 성분은 소광제 분자이거나, 또는 예컨대 표적 RNA 를 증폭시키기 위한 시약이다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 개별 이산 부피 (하기에 더욱 정의됨) 내에 고형 기재 상에 고정화될 수 있고, 단일 시약을 격리시킬 수 있다. 예를 들어, 시약은 염료를 포함하는 비드일 수 있다. 고정화 시약에 의해 격리될 때, 개별 비드는 너무 확산되어 검출가능한 신호를 발생시키지 못하지만, 차폐성 구성체로부터 방출 시에 예를 들어 응집에 의해서 또는 용액 농도의 단순 증가에 의해서 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 고정된 차폐제는 표적 분자의 검출 시에 활성화된 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있는 RNA-기반 압타머이다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 용액 중 고정화 시약에 결합하여서 용액 중에 유리된 별개의 표지된 결합 파트너에 결합하는 시약의 능력을 차단한다. 따라서, 샘플에 세척 단계의 적용 시, 표지된 결합 파트너는 표적 분자의 부재 하에서 샘플을 세척해 낼 수 있다. 그러나, 이펙터 단백질이 활성화되면, 차폐성 구성체는 시약에 결합하는 차폐성 구성체의 능력을 방해하도록 충분한 정도로 절단되어서 표지된 결합 파트너가 고정화 시약과 결합할 수 있게 한다. 따라서, 표지된 결합 파트너는 세척 단계 후에 남아서 샘플 내의 표적 분자의 존재를 의미한다. 일정한 양상에서, 고정화 시약에 결합하는 차폐성 구성체는 RNA 압타머이다. 고정화된 시약은 단백질일 수 있고, 표지된 결합 파트너는 표지된 항체일 수 있다. 대안적으로, 고정화된 시약은 스트렙타비딘일 수 있고, 표지된 결합 파트너는 표지된 바이오틴일 수 있다. 상기 구현예에서 사용되는 결합 파트너 상의 표지는 당해 기술분야에 공지된 임의의 검출가능한 표지일 수 있다. 또한, 다른 공지된 결합 파트너가 본 명세서에 기술된 전체 설계에 따라서 사용될 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 리보자임을 포함할 수 있다. 리보자임은 촉매적 특성을 갖는 RNA 분자이다. 천연 및 조작 리보자임은 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질에 의해 표적화될 수 있는, RNA 를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 리보자임은 음성 검출가능한 신호를 발생시키거나 또는 양성 대조군 신호의 발생을 방지하는 반응을 촉매하도록 선택될 수 있거나 또는 조작될 수 있다. 활성화된 이펙터 단백질에 의한 리보자임의 탈활성화 시 음성의 대조군 신호를 발생시키거나, 또는 양성의 검출가능한 신호의 발생을 방지하는 반응은 제거되고 그리하여 양성의 검출가능한 신호가 발생될 수 있게 한다. 일례의 구현예에서, 리보자임은 용액이 제 1 색상을 나타내게 하는 비색 반응을 촉매할 수 있다. 리보자임이 탈활성화될 때 용액은 제 2 색상으로 바뀌고, 제 2 색상은 검출가능한 양성 신호이다. 리보자임이 비색 반응을 촉매하는데 어떻게 사용될 수 있는가에 대한 예는 Zhao et al. "Signal amplification of glucosamine-6-phosphate based on ribozyme glmS," Biosens Bioelectron. 2014; 16:337-42 에 기술되어 있고, 본 명세서에 개시된 실시형태의 문맥에서 이러한 시스템이 작용하도록 어떻게 변형될 수 있는가에 대한 예를 제공한다. 대안적으로, 리보자임은 존재하는 경우에, 예를 들어 RNA 전사물의 절단 생성물을 발생시킬 수 있다. 따라서, 양성 검출가능한 신호의 검출은 오직 리보자임의 부재 하에서만 발생되는 비절단된 RNA 전사물의 검출을 포함할 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 하나 이상의 시약은 단백질이 단백질에 하나 이상의 RNA 압타머의 결합에 의해 검출가능한 신호를 발생시킬 수 없도록 억제되거나 또는 격리되는, 검출가능한 신호, 예컨대 비색, 화학발광 또는 형광발광 신호의 발생을 촉진할 수 있는, 단백질, 예컨대 효소이다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시, RNA 압타머는 그들이 더 이상 검출가능한 신호를 발생시키는 단백질의 능력을 억제하지 않는 정도까지 절단 또는 분해된다. 일정한 예의 구현예에서, 압타머는 트롬빈 억제제 압타머이다. 일정한 예의 구현예에서, 트롬빈 억제제 압타머는 GGGAACAAAGCUGAAGUACUUACCC (SEQ ID NO: 18) 의 서열을 갖는다. 이러한 압타머가 절단될 때, 트롬빈은 활성화될 것이고 펩티드 비색 또는 형광 기질을 절단할 것이다. 일정한 예의 구현예에서, 비색 기질은 트롬빈에 대한 펩티드 기질에 공유적으로 연결된 파라-니트로아닐리드 (pNA) 이다. 트롬빈에 의해 절단 시, pNA 가 방출되고 노란 색상이 되어 쉽게 육안으로 볼 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 형광 기질은 형광도 검출기를 사용하여 검출할 수 있는 7-아미노-4-메틸쿠마린이다. 억제성 압타머가 또한 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 베타-갈락토시다제, 또는 송아지 알칼리 포스파타제 (CAP) 에 대해 사용될 수 있고, 상기 제시된 일반 원리에 속한다.
일정한 구현예에서, RNAse 활성은 효소-억제성 압타머의 절단을 통해 비색적으로 검출된다. RNAse 활성을 비색 신호로 전환시키는 하나의 잠재적인 방식은 비색 출력을 생성시킬 수 있는 효소의 재활성화와 RNA 압타머의 절단을 커플링시키는 것이다. RNA 절단의 부재 하에서, 온전한 압타머는 효소 표적에 결합하여 이의 활성을 억제하게 될 것이다. 이러한 판독 시스템의 장점은 효소가 추가 증폭 단계를 제공한다는 것이다: 부차적 활성 (예를 들어, Cas13a 부차적 활성) 을 통해서 압타머로부터 유리되면, 비색 효소는 비색 생성물을 계속 생성시켜서, 신호의 배가를 일으키게 될 것이다.
일정한 구현예에서, 비색 판독의 효소를 억제하는 현존 압타머가 사용된다. 비색 판독되는 몇몇 압타머/효소 쌍에는 예컨대 트롬빈, 단백질 C, 호중구 엘라스타제 및 서브스틸리신이 존재한다. 이들 프로테아제는 pNA 를 기반으로 비색 기질을 가지며 상업적으로 입수가능하다. 일정한 구현예에서, 일반적인 비색 효소를 표적화하는 신규한 압타머가 사용된다. 일반적인 강건한 효소, 예컨대 베타-갈락토시다제, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 송아지 장 알칼리 포스파타제는 선택 전략 예컨대 SELEX 에 의해 디자인된 조작된 압타머에 의해 표적화될 수 있다. 이러한 전략은 나노몰 결합 효율로 압타머의 신속한 선택을 가능하게 하고 비색 판독을 위한 추가의 효소/압타머 쌍의 개발에 사용될 수 있다.
일정한 구현예에서, RNAse 활성은 RNA-테더드 억제제의 절단을 통해서 비색으로 검출된다. 많은 일반 비색 효소는 경쟁적, 가역적 억제제를 가지며, 예를 들어 베타-갈락토시다제는 갈락토스에 의해 억제될 수 있다. 많은 이들 억제제는 약하지만, 그들의 효과는 국소 농도를 증가시켜서 증가될 수 있다. 억제제의 국소 농도를 RNAse 활성과 연결시킴으로써, 비색 효소 및 억제제 쌍은 RNAse 센서에 조작될 수 있다. 소형-분자 억제제를 기반으로 하는 비색 RNAse 센서는 3종의 성분을 포함하는데, 비색 효소, 억제제, 및 억제제를 효소에 속박시키는, 억제제와 효소 둘 모두에 공유적으로 연결된 브릿징 RNA 이다. 미절단된 구성에서, 효소는 소형 분자의 증가된 국소 농도에 의해 억제되고, RNA 가 (예를 들어, Cas13a 부차적 절단에 의해) 절단될 때, 억제제가 방출될 것이고 비색 효소가 활성화될 것이다.
일정한 구현예에서, RNAse 활성은 G-사중체의 형성 및/또는 활성화를 통해 비색적으로 검출된다. DNA의 G 사중체는 헴 (철 (III)-프로토포르피린 IX) 과 복합체를 형성하여 퍼옥시다제 활성과 DNAzyme 을 형성할 수 있다. 퍼옥시다제 기질 (예를 들어, ABTS: (2,2'-아지노비스 [3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄 염)) 이 공급될 때, 과산화수소의 존재 하에서 G-사중체-헴 복합체는 기질의 산화를 야기시킨 후에, 용액 중에서 녹색 색상을 형성한다. 예로서 G-사중체 형성 DNA 서열은 GGGTAGGGCGGGTTGGGA (SEQ. I.D. No. 19) 이다. RNA 서열과 이러한 DNA 압타머의 하이브리드화에 의해서, G-사중체 구조의 형성은 제한될 것이다. RNAse 부차적 활성화 (예를 들어, C2c2-복합체 부차적 활성화) 시에, RNA 주요부는 절단되어 G 사중체를 형성할 수 있게 하고 헴이 결합할 수 있게 할 것이다. 이러한 전략은 RNAse 활성화 이후에 추가 증폭이 존재한다는 것을 의미하는, 색상 형성이 효소적이기 때문에 특히 매력적이다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 개별 이산 부피 (하기에 더욱 정의됨) 내에 고형 기재 상에 고정화될 수 있고, 단일 시약을 격리시킬 수 있다. 예를 들어, 시약은 염료를 포함하는 비드일 수 있다. 고정화 시약에 의해 격리될 때, 개별 비드는 너무 확산되어 검출가능한 신호를 발생시키지 못하지만, 차폐성 구성체로부터 방출 시에 예를 들어 응집에 의해서 또는 용액 농도의 단순 증가에 의해서 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 고정된 차폐제는 표적 분자의 검출 시에 활성화된 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있는 RNA-기반 압타머이다.
일례의 구현예에서, 차폐성 구성체는 검출제가 응집되는지 또는 용액에 분산되는지 여부에 따라서 생상을 변화시키는 검출제를 포함한다. 예를 들어, 일정한 나노입자, 예컨대 콜로이드 금은 그들이 응집물로부터 분산된 입자로 이동하면서 가시적인 보라색에서 붉은 색으로 색상 이동을 겪는다. 따라서, 일정한 예의 구현예에서, 이러한 검출제는 하나 이상의 브릿지 분자에 의해 응집물로 유지될 수 있다. 브릿지 분자의 적어도 일부분은 RNA 를 포함한다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시에, 브릿지 분자의 RNA 일부분은 절단되어서 검출제가 분산될 수 있게 하고 색상의 상응하는 변화를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 도 46 을 참조한다. 일정 예의 구현예에서, 가교 분자는 RNA 분자이다. 일정한 예의 구현예에서, 검출제는 콜로이드 금속이다. 콜로이드 금속 재료는 액체, 히드로졸 또는 금속 졸에 분산된 수불용성 금속 입자 또는 금속 화합물을 포함할 수 있다. 콜로이드 금속은 주기율표의 그룹 IA, IB, IIB 및 IIIB 의 금속을 비롯하여, 전이 금속, 특히 그룹 VIII 의 것으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 금속은 금, 은, 알루미늄, 루테늄, 아연, 철, 니켈 및 칼슘을 포함한다. 다른 적합한 금속은 또한 모든 그들의 다양한 산화 상태의 하기의 것들을 포함한다: 리튬, 소듐, 마그네슘, 포타슘, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 크롬, 망간, 코발트, 구리, 갈륨, 스트론튬, 니오븀, 몰리브데늄, 팔라듐, 인듐, 주석, 텅스텐, 레늄, 플래티늄, 및 가돌리늄. 금속은 바람직하게 적절한 금속 화합물로부터 유래된 이온 형태, 예를 들어 A13+, Ru3+, Zn2+, Fe3+, Ni2+ 및 Ca2+ 이온으로 제공된다.
RNA 가교가 활성화된 CRISPR 이펙터에 의해 절단될 때, 상기 언급된 색상 이동이 관찰된다. 일정 예의 구현예에서, 입자는 콜로이드 금속이다. 다른 일정 예의 구현예에서, 콜로이드 금속은 콜로이드 금이다. 일정 예의 구현예에서, 콜로이드 나노입자는 15 nm 금 나노입자 (AuNP) 이다. 콜로이드 금 나노입자의 고유한 표면 성질 덕분에, 용액에서 완전히 분산되고 육안으로 붉은 색상이 나타날 때 520 nm 에서 최대 흡광도가 관찰된다. AuNP 의 응집 시, 그들은 최대 흡광도에서 붉은색-이동을 나타내고 색상이 더 진하게 나타나며, 궁극적으로 용액으로부터 진한 보라색 응집체로 침전된다. 일정 예의 구현예에서, 나노입자는 나노입자의 표면으로부터 연장된 DNA 링커를 포함하도록 변형된다. 개별 입자는 RNA 의 각 말단 상에서 DNA 링커의 적어도 일부분에 하이브리드화하는 단일 가닥 RNA (ssRNA) 가교를 통해 함께 연결된다. 따라서, 나노입자는 연결된 입자의 망을 형성하게 되고 응집하게 되어, 진한 침전물로서 나타나게 될 것이다. 본 명세서에 개시된 CRISPR 이펙터의 활성화 시, ssRNA 가교가 절단될 것이고, 연결된 메시로부터 AU NPS 를 방출하여 가시적인 붉은 색상을 생성시키게 된다. 예시적인 DNA 링커 및 RNA 가교 서열은 하기에 열거된다. DNA 링커의 말단 상에 티올 링커는 AuNPS 와 표면 접합을 위해 사용될 수 있다. 다른 형태의 접합이 사용될 수도 있다. 일정 예의 구현예에서, 각 DNA 링커에 대해 하나씩, 2개 집단의 AuNP 가 발생될 수 있다. 이것은 적절한 배향으로 ssRNA 가교의 적절한 결합을 촉진하도록 돕게 될 것이다. 일정 예의 구현예에서, 제 1 DNA 링커는 3' 말단으로 접합되는 반면 제 2 DNA 링커는 5' 말단으로 접합된다.
표 1.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 검출가능한 표지 및 그 검출가능한 표지의 차폐제가 부착되는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 검출가능한 표지/차폐제 쌍의 예는 형광단 및 형광단의 소광제가 있다. 형광단의 소광은 형광단 및 다른 형광단 또는 비형광 분자 간 비형광성 복합체의 형성 결과로서 일어날 수 있다. 이러한 기전은 바닥-상태 복합체 형성, 정적 소광, 또는 접촉 소광으로서 알려져 있다. 따라서, RNA 올리고뉴클레오티드는 형광단 및 소광제가 접촉 소광이 일어나도록 충분히 근접하도록 디자인될 수 있다. 형광단 및 그들의 동족 소광제는 당분야에 공지되어 있고, 당업자에 의해서 이러한 목적을 위해 선택될 수 있다. 특정한 형광단/소광제 쌍은 본 발명의 상황에서 핵심적이지 않고, 오직 형광단/소광제 쌍의 선택이 형광단의 차폐를 보장한다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시에, RNA 올리고뉴클레오티드는 절단되고, 그리하여 접촉 소광 효과를 유지하는데 필요한 형광단 및 소광제 간 근접성을 잘라낸다. 따라서, 형광단의 검출은 샘플 내의 표적 분자의 존재를 확인하는데 사용될 수 있다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 하나 이상의 금속 나노입자, 예컨대 금 나노입자가 부착되는 하나 이상의 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 차폐성 구성체는 닫힌 루프를 형성하는 다수의 RNA 올리고뉴클레오티드에 의해 가교된 다수의 금속 나노입자를 포함한다. 일 구현예에서, 차폐성 구성체는 닫힌 루프를 형성하는 3개의 RNA 올리고뉴클레오티드에 의해 교차된 3개의 금 나노입자를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질에 의한 RNA 올리고뉴클레오티드의 절단은 금속 나노입자에 의해 생성되는 검출가능한 신호를 야기시킨다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 하나 이상의 퀀텀 도트가 부착되는 하나 이상의 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질에 의한 RNA 올리고뉴클레오티드의 절단은 퀀텀 도트에 의해 생성되는 검출가능한 신호를 야기시킨다.
일례의 구현예에서, 차폐성 구성체는 퀀텀 도트를 포함할 수 있다. 퀀텀 도트는 표면에 부착되는 다수의 링커 분자를 가질 수 있다. 링커 분자의 적어도 일부분은 RNA 를 포함한다. 링커 분자는 한쪽 말단에서 퀀텀 도트에 부착되고 링커의 길이를 따라서 또는 말단부에서 하나 이상의 소광제에 부착되어서 소광제가 퀀텀 도트의 소광이 일어나도록 충분히 근접하게 유지된다. 링커는 분지될 수 있다. 상기처럼, 퀀텀 도트/소광제 쌍은 핵심적이지 않고, 오직 퀀텀 도트/소광제 쌍의 선택이 형광단의 차폐를 보장한다. 퀀텀 도트 및 그들의 동족 소광제는 당분야에 공지되어 있고 당업자에 의해서 이러한 목적을 위해 선택될 수 있다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시, 링커 분자의 RNA 부분은 절단되어서 소광 효과를 유지하는데 필요한 하나 이상의 소광제 및 퀀텀 도트 간 근접성을 제거한다. 일정한 예의 구현예에서, 퀀텀 도트는 스트렙타비딘 접합된다. RNA 는 바이오틴 링커를 통해서 부착되고 서열 /5Biosg/UCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/ (SEQ ID NO: 23) 또는 /5Biosg/UCUCGUACGUUCUCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/ (SEQ ID NO: 24) 을 갖는 소광 분자를 동원하며, 여기서 /5Biosg/는 바이오틴 태그이고 /3lAbRQSp/는 아이오와 블랙 소광제이다. 절단 시, 본 명세서에 개시된 활성화된 이펙터에 의해서 퀀텀 도트는 가시적으로 형광발광하게 될 것이다.
유사한 방식으로, 형광 에너지 전달 (FRET) 은 검출가능한 양성 신호를 발생시키기 위해 사용될 수 있다. FRET는 에너지 여기된 형광단 (즉, "도너 형광단")으로부터의 광자가 다른 분자 (즉, "억셉터") 내 전자의 에너지 상태를 더 높은 진동 수준의 여기된 단일항 상태로 상승시키는 비복사 과정이다. 도너 형광단은 그 형광단의 특징적인 형광을 발광하지 않고 바닥 상태로 되돌아간다. 억셉터는 다른 형광단일 수 있거나 또는 비형광성 분자일 수 있다. 억셉터가 형광단이면, 전달된 에너지는 그 형광단의 특징적인 형광으로서 발광된다. 억셉터가 비형광성 분자이면 흡수된 에너지는 열로서 소실된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 구현예의 상황에서, 형광단/소광제 쌍은 올리고뉴클레오티드 분자에 부착된 도너 형광단/억셉터 쌍으로 교체된다. 온전할 때, 차폐성 구성체는 억셉터로부터 방출되는 열 또는 형광에 의해 검출되는 제 1 신호 (음성 검출가능한 신호) 를 발생시킨다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시 RNA 올리고뉴클레오티드는 절단되고 FRET은 파괴되어서 도너 형광단의 형광이 이제 검출된다 (양성 검출가능한 신호).
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 짧은 뉴클레오티드로 긴 RNA 의 절단에 대응하여 그들 흡광도를 변화시키는 인터컬레이팅 염료의 사용을 포함한다. 몇몇 이러한 염료가 존재한다. 예를 들어, 파이로닌-Y 는 RNA와 복합체를 형성하게 될 것이고, 572 nm 에서 흡광도를 갖는 복합체를 형성하게 될 것이다. RNA 의 절단은 그 결과로 흡광도의 소실 및 색상 변화를 일으킨다. 메틸렌 블루는 유사한 방식으로 사용될 수 있고, RNA 절단 시 688 nm 에서의 흡광도가 변화한다. 따라서, 일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질에 의한 RNA 의 절단 시에 흡광도를 변화시키는 RNA 및 인터컬레이트 염료 복합체를 포함한다.
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 HCR 반응을 위한 개시제를 포함할 수 있다. 예를 들어 Dirks and Pierce. PNAS 101, 15275-15728 (2004) 을 참조한다. HCR 반응은 2가지 헤어핀 종에서 위치 에너지를 이용한다. 헤어핀 중 하나의 상응하는 영역에 상보성인 부분을 갖는 단일 가닥 개시제가 이전에 안정된 혼합물로 방출될 때, 이것이 한 종의 헤어핀을 개방시킨다. 이어서 이 과정은 다른 종의 헤어핀을 개방시키는 단일 가닥 영역을 노출시킨다. 다음으로 이 과정은 본래 개시제와 동일한 단일 가닥 영역을 노출시킨다. 최종 연쇄 반응은 헤어핀 공급이 고갈될 때까지 성장하는 닉킹된 이중 나선의 형성을 일으킬 수 있다. 최종 생성물의 검출은 겔 상에서 또는 비색적으로 수행될 수 있다. 예시적 비색 검출 방법은, 예를 들어, Lu et al. "Ultra-sensitive colorimetric assay system based on the hybridization chain reaction-triggered enzyme cascade amplification" ACS Appl Mater Interfaces, 2017, 9(1):167-175, Wang et al. "An enzyme-free colorimetric assay using hybridization chain reaction amplification and split aptamers" Analyst 2015, 150, 7657-7662, 및 Song et al. "Non covalent fluorescent labeling of hairpin DNA probe coupled with hybridization chain reaction for sensitive DNA detection." Applied Spectroscopy, 70(4): 686-694 (2016) 에 개시된 방법을 포함한다.
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 HCR 개시제 서열 및 개시제가 HCR 반응을 개시시키는 것을 방지하는 절단가능한 구조적 엘리먼트, 예컨대 루프 또는 헤어핀을 포함할 수 있다. 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질에 의한 구조적 엘리먼트의 절단 시, 개시제는 방출되어 HCR 반응을 촉발시키고, 이의 검출은 샘플 내의 하나 이상의 표적의 존재를 의미한다. 일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 RNA 루프와 헤어핀을 포함한다. 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질이 RNA 루프를 절단할 때, 개시제는 방출되어 HCR 반응을 촉발시킬 수 있다.
특별한 구현예에서, 표적 핵산은 아토몰라 감도로 검출될 수 있다. 특별한 구현예에서, 표적 핵산은 펨토몰라 감도로 검출될 수 있다. 일부 특별한 구현예에서, 방법은 약 2 시간 미만, 약 90 분 미만, 약 60 분 미만, 약 30 분 미만 또는 약 15 분 미만으로 수행된다. 일부 바람직한 구현예에서, 증폭 및 검출은 약 2 시간 미만으로 2 fM 검출로 원-포트 방법에서 일어날 수 있다.
증폭 및 검출을 위한 시스템 및 키트
증폭 및 검출을 위한 시스템
일부 구현예에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 이중-가닥 핵산을 증폭 및/또는 검출하기 위한 시스템을 제공한다. 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 증폭 CRISPR 시스템을 포함할 수 있다. 증폭 CRISPR 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 제 1 및 제 2 CRIPR/Cas 복합체를 포함할 수 있다. 제 1 CRISPR/Cas 복합체는 제 1 CRISPR/Cas 효소 및 제 1 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 1 가닥으로 가이드하는 제 1 가이드 분자를 포함할 수 있다. 제 2 CRISPR/Cas 복합체는 제 2 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 2 가닥으로 가이드하는 제 2 가이드 분자를 포함할 수 있다. 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 효소는 활성 또는 데드일 수 있다. 예를 들어 게놈 DNA 와 같이, 표적 핵산이 정말로 긴 경우에, 활성 Cas 효소가 유용할 수 있으며, 본원에 기재된 바와 같다.
데드 CRISPR/Cas 효소는 데드 Cas9, 데드 Cas12 를 포함할 수 있으나, 반드시 그에 한정되는 것은 아니다. 데드 Cas12 는 데드 Cas12a, 데드 Cas12b, 또는 데드 Cas12c 일 수 있다.
시스템은 헬리카제, 프라이머 쌍, 중합효소, 및 임의로, 본원에 기재된 바와 같은, 표적 핵산의 증폭을 검출하기 위한 검출 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 프라이머 쌍은 제 1 및 제 2 프라이머를 포함할 수 있으며, 제 1 프라이머는 표적 핵산의 제 1 가닥에 상보적인 부분을 포함하고, 제 2 프라이머는 표적 핵산의 제 2 가닥에 상보적인 부분을 포함한다.
중합효소는 Bst 2.0 DNA 중합효소, Bst 2.0 WarmStart DNA 중합효소, Bst 3.0 DNA 중합효소, 전체 길이 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bsu DNA 중합효소, phi29 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, Gst 중합효소, Taq 중합효소, 이. 콜라이 DNA 중합효소 I 의 클레노우 (Klenow) 단편, KlenTaq NDA 중합효소, Pol III DNA 중합효소, T5 DNA 중합효소, 및 시쿼나제 (Sequenase) DNA 중합효소를 포함할 수 있으나, 반드시 그에 한정되는 것은 아니다.
헬리카제는 UvrD 헬리카제, CRISPR-Cas3 헬리카제, Rep 헬리카제, PcrA 헬리카제, 이. 콜라이 헬리카제 I, 이. 콜라이 헬리카제 II, 이. 콜라이 헬리카제 III, 이. 콜라이 헬리카제 IV, Rep 헬리카제, DnaB 헬리카제, PriA 헬리카제, PcrA 헬리카제, T4 Gp41 헬리카제, T4 Dda 헬리카제, SV40 대형 T 항원, 효소 RAD 헬리카제, RecD 헬리카제, RecQ 헬리카제, 열안정성 T. 텡콘겐시스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 테르모필루스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 아쿠아티쿠스 DnaB 헬리카제, Dda 헬리카제, 파필로마 바이러스 E1 헬리카제, 고세균 MCM 헬리카제, 진핵생물 MCM 헬리카제, 및 T7 Gp4 헬리카제일 수 있으나, 반드시 그에 한정되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 헬리카제는 Tte-UvrD D409A/D410A 이다.
특정 구현예에서, 데드 CRISPR/Cas 효소, 헬리카제, 및 중합효소는 동일한 온도 하에 수행할 수 있다. 특정 구현예에서, 온도는 37℃ 일 수 있으나, 반드시 그에 한정되는 것은 아니다.
대안적 구현예에서, 본 발명은 샘플 내의 표적 단일-가닥 핵산을 증폭 및/또는 검출하기 위한 시스템을 제공한다. 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 표적 단일-가닥 핵산을 이중-가닥 핵산으로 전환시키기 위한 시약을 포함할 수 있으나, 반드시 그에 한정되는 것은 아니다. 시스템은 또한 이전에 기재된 바와 같은 증폭 CRISPR 시스템, 헬리카제, 프라이머 쌍, 중합효소, 및 임의로, 본원에 기재된 바와 같은 검출 시스템을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 검출 시스템은 Cas12 또는 Cas13 이펙터 단백질 및 상응하는 표적 분자에 결합하도록 디자인된 가이드 RNA 를 포함하는 CRISPR 시스템; 및 차폐성 구성체를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 표적 단일-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출 방법을 포함한다. 그러한 단일-가닥 핵산은 단일-가닥 바이러스 DNA, 바이러스 RNA, 전령 RNA, 리보솜 RNA, 운반 RNA, 마이크로RNA, 짧은 간섭 RNA, 소형 핵 RNA, 합성 RNA, 또는 합성 단일-가닥 DNA 를 포함할 수 있으나, 반드시 그에 한정되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 표적 단일-가닥 핵산은 RNA 분자이다. 단일-가닥 핵산은 이전에 기재된 임의의 단계 및 방법을 수행하기 전에 표적 이중-가닥 핵산으로 전환될 수 있다. 그러한 전환은 임의의 알려진 방법에 의해, 예컨대 역전사 및 증폭에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 검출 시스템은 Cas 13 효소 LwaCas13 을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 검출 시스템은 프라이머 쌍의 제 1 프라이머와 프로모터 서열 동일성을 포함하는 부가적 앰플리파이어 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 검출 시스템 내의 헬리카제는 Tte-UvrD D409A/D410A 이다. 일부 구현예에서, 헬리카제는 효소의 D 에서 하나 이상의 A 치환을 포함한다.
일부 구현예에서 시스템은 크라우딩제, 보조인자, 단일-가닥 결합 단백질, 및/또는 보조 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
크라우딩제는 폴리에틸렌 글리콜 20K 분자량일 수 있으며, 임의로 약 2.5% to 약 6.5% 로 제공된다.
보조인자는 ATP 일 수 있으며, 임의로 0.75 내지 약 5 mM 로 제공된다.
단일-가닥 결합 단백질은 T4 gp32 또는 호열성 SSB (ET-SSB) 를 포함할 수 있으나, 반드시 그에 한정되는 것은 아니다.
보조 단백질은 dCpf1 및/또는 UvsX 레콤비나제일 수 있으나, 반드시 그에 한정되는 것은 아니다.
시스템은 중온성 DNA 중합효소, 특히 Sau LF 중합효소를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법 또는 시스템에서, 헬리카제는 돌연변이 D403A/D404A 가 있는 테르모아나에로박테르 에타놀리쿠스 (Thermoanaerobacter ethanolicus) 로부터의 PcrA 헬리카제, 돌연변이 D407A/D408A 가 있는 바실루스 종 FJAT-27231 로부터의 PcrA 헬리카제, 돌연변이 D415A/D416A 가 있는 바실루스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 으로부터의 PcrA 헬리카제, 돌연변이 D407A/D408A 가 있는 바실루스 심플렉스 (Bacillus simplex) 로부터의 PcrA 헬리카제, 또는 돌연변이 D402A/D403A 가 있는 페니클로스트리디움 소르델리이 (Paeniclostridium sordellii) 로부터의 PcrA 헬리카제일 수 있다.
증폭 및 검출을 위한 키트
본 명세서는 또한 샘플 내의 표적 이중-가닥 핵산을 증폭 및/또는 검출하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 증폭 CRISPR 시스템을 포함할 수 있지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 증폭 CRISPR 시스템은 본원에 기재된 바와 같은 제 1 및 제 2 CRIPR/Cas 복합체를 포함할 수 있다. 제 1 CRISPR/Cas 복합체는 제 1 데드 CRISPR/Cas 효소 및 제 1 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 1 가닥으로 가이드하는 제 1 가이드 분자를 포함할 수 있다. 제 2 CRISPR/Cas 복합체는 제 2 데드 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 2 가닥으로 가이드하는 제 2 가이드 분자를 포함할 수 있다.
키트는 헬리카제, 프라이머 쌍, 중합효소, 및 임의로, 본원에 기재된 바와 같은 표적 핵산의 증폭을 검출하기 위한 검출 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 프라이머 쌍은 제 1 및 제 2 프라이머를 포함할 수 있으며, 제 1 프라이머는 표적 핵산의 제 1 가닥에 상보적인 부분을 포함하고, 제 2 프라이머는 표적 핵산의 제 2 가닥에 상보적인 부분을 포함한다. 키트는 또한 사용 지침의 세트를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 샘플 내의 이중-가닥 핵산을 정제하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 샘플 내의 표적 단일-가닥 핵산을 증폭 및/또는 검출하기 위한 키트일 수 있고, 샘플 내의 단일-가닥 핵산을 정제하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 또한 사용 지침의 세트를 포함할 수 있다.
키트는 검출 시스템, 바람직한 구현예에서, CRISPR 검출 시스템을 더 포함할 수 있다. 검출 시스템은, 예를 들어, 미국 출원 62/432,553, 출원일 2016년 12월 9일; US 62/456,645, 출원일 2017년 2월 8일; 62/471,930, 출원일 2017년 3월 15 일; 62/484,869, 출원일 2017년 4월 12일; 62/568,268, 출원일 2017년 10월 4일 (모두 전문이 본원에 참조로 포함됨) 에서 기재된 바와 같을 수 있고; 또한 PCT/US2017/065477, 출원일 2017년 12월 8일, 발명의 명칭 "CRISPR Effector System Based Diagnostics" (본원에 참조로 포함됨), 특히 검출을 위한 CRISPR 시스템의 구성요소를 기술하는 [0142] - [0289] 에서 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 더욱 설명되지만, 청구항에 기술된 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다.
작업예
실시예 1: 2-단계 CRISPR tHDA-SHERLOCK
호열성 HDA (tHDA) 는 반응 온도 65 ℃ 와, NEB 에 의해 판매되는 상업적으로 입수가능한 시스템을 사용한다. CRISPR 시스템과 tHDA 의 예시적 작업흐름은 도 2 에 도시되어 있다. 2-단계 프로세스로 SHERLOCK 검출과 CRISPR-tDA 작업흐름을 이용하여 단일 분자 검출이 가능하며, 증폭 시스템에 CRISPR 을 부가하여 결과가 개선된다 (도 3A-3G). 도 5 는 dAsCpf1:crRNA 복합체에 의해 개선이 야기되는 것을 보여주며, Cas12a 및 Cas12b 둘 모두는 또한 2-단계 tHDA-SHERLOCK 을 개선한다. 그러나, 더 낮은 반응 온도에서의 HDA-SHERLOCK 반응의 달성이 또한 개선일 것이다.
실시예 2: 2-단계 CRISPR mHDA-SHERLOCK
tHDA 는 NEB 에 의해 현재 판매되는 상업적 시스템이지만, 37 ℃ 에서의 중온성 HDA 에 이용가능한 상업적 시스템은 존재하지 않는다. 2-단계 프로세스는 90 분보다 더 길게 진행되고, tHDA-SHERLOCK 시스템은 촉매적 불활성 프로그램가능한 CRISPR 효소 예컨대 Cas12a 또는 Cas12b 를 민감한 검출에 요구하고 민감도를 결여할 수 있다.
발명자들은 첫째로 중온성 온도에서의 조합된 CRISPR-HDA 및 SHERLOCK 의 작업흐름의 개발에 착수했다. 중온성 헬리카제, 바람직하게는 가닥 분리를 위해 부속 단백질을 요구하지 않는 것에 대한 스크리닝, 및 조합된 중온성 HDA 및 SHERLOCK 에 대한 파라미터의 최적화를 수행했다. 첫째로, 중온성 박테리아 종으로부터의 UvrD 유형의 헬리카제의 선별을 수행했다 (도 7). 다음으로, 리포터 어세이를 확립하여 활성을 시험했다 (도 8). 선별된 헬리카제를 돌연변이유발하여 활성을 증가시켰으며 (도 9), 선별된 pcrA (UvrD)-유형 헬리카제는 활성을 증가시키는 치환으로 넓은 활성 스펙트럼을 가졌다 (도 10). 마지막으로, 도 11 은 리포터 어세이를 사용하여 헬리카제 기질 풀림의 동역학 및 보조인자 선호도를 추론할 수 있다는 것을 보여준다.
다음으로, 최적 효소 및 부속 단백질 (Cas13, DNA 중합효소, SSB) 의 확인을 포함하여, 조합된 중온성 HDA 및 SHERLOCK 을 위해 프로토콜을 최적화했다. 효소에 관하여, 여섯 가지 상이한 야생형 UvrD-유사 헬리카제 및 평가된 슈퍼 헬리카제 돌연변이를 갖는 돌연변이체는 Tte-UvrD D409A/D410A 가 강력하다는 것을 시사한다. 중온성 DNA 중합효소는 Sau LF 중합효소이며, T7 RNA 중합효소는 시험관내 전사를 위한 것이다. LwaCas13 은 현재 단일-plex 검출을 위해 선택되는 Cas 13 이다. 폴리에틸렌 글리콜, 분자량 20K (PEG 20K) 및 ATP 보조인자의 첨가는 신호 대 노이즈 비를 증가시킨다 (도 13). 단일-가닥 결합 단백질 T4 gp32 또는 호열성 SSB (ET-SSB) 는 프로토콜을 최적화시키는데 있어서 현재 바람직한 첨가제이다. dCpf1, UvsX 레콤비나제는 복합체 주형을 위한 보조 단백질로서 사용될 수 있다. 다양한 농도의 T4 gp32 및 헬리카제를 시험하여 반응 당 각각의 어떤 양이 가장 잘 수행했는지를 확인했다. 도 12 에서 보여지는 바와 같이, 여러 농도가 잘 수행했지만, 반응 당 500 ng 의 T4 gp32 및 125 ng 의 헬리카제가 가장 잘 수행했다. 신호 대 배경 비를 최적화하기 위해 첨가제를 또한 탐구했다 (도 13). 크라우딩제로서의 PEG 20K 및 보조인자로서의 ATP 의 첨가는 신호 대 배경 비를 증가시켰으며, 2.5% 내지 6.25% PEG 20K 분자량은 형광 신호를 증강시켰고, 0.75 mM 내지 3 mM ATP 는 또한 형광을 증강시켰다.
실시예 3: 원-포트 (One-Pot) mHDA SHERLOCK
특히 유리한 증폭 방법은 하기 변수, 37C 작업, 신속 (~10 분), 민감 (~2 aM), 저비용, 다중화가능, 원-포트 프로세스 (one-pot process) 로 수행하기 용이함, 및 매트릭스를 샘플링하기에 강력함 중 하나 이상을 포함할 것이다.
중온성 HDA (mHDA) 방법의 최적화의 일부로서, 프라이머 전략이 또한 최적화되었다. 잠재적으로 24 - 33 nt 의 길이가 최적으로 여겨지지만, 본 출원에서는, 전사를 위한 T7 프로모터 서열로 인해 정방향 프라이머가 훨씬 더 길다. 현재 개시된 바와 같이, 더 긴 정방향 프라이머를 피하는 하나의 방법은 도 14 에서 보여지는, "앵커링된 프라이밍" 으로 명명되는 과정에서 더 긴 HDA 프라이머와 함께 더 작은 T7 프로모터 프라이밍의 부가이다. 제 1 사이클을 매개하는 유전자 특이적 자리와 더 긴 '개시제' 프라이머를 사용하고, 최적 증폭에 더 작은 '앰플리파이어' 프라이머를 사용함으로써, 역방향 프라이밍 자리로 연장될 때 멀티플렉스 DNA 증폭 동안 프라이머 경쟁이 방지될 수 있다. 그 접근법에 기초하여, '앵커링된 프라이밍' 은 증폭 효율을 증가시켰으며, 원-포트 mHDA-SHERLOCK 를 허용하여 2fM (1000 카피) 을 2 시간 미만 내에 달성했다 (도 16). 도 17 에서 보여지는 바와 같이, 이는 또한 플라스미드 DNA 에 대해 달성되었다.
***
본 발명의 기재된 방법, 약학 조성물 및 키트의 다양한 변형 및 이형은 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않고 당업자에게 분명해질 것이다. 본 발명이 특별한 구현예와 함께 기재되어 있지만, 더욱 변형될 수 있고, 청구되는 본 발명이 이러한 특별한 구현예에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해하게 될 것이다. 실제로, 당업자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식의 다양한 변형은 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따른 본 발명의 임의의 변형, 용도, 또는 개조를 포괄하는 것으로 의도되고 본 개시물로부터의 이러한 이탈의 포함은 본 발명이 속하는 분야 내에서 공지의 통상적인 관례 내이며 이전에 기재된 본원의 본질적인 특성에 적용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> The Broad Institute, Inc.
Massachusetts Institute of Technology
President and Fellows of Harvard College
Zhang, Feng
Kellner, Max
Gootenberg, Jonathan
Abudayyeh, Omar
<120> CRISPR Effector System Based Amplification Methods, Systems, and
Diagnostics
<130> BROD-2592
<150> 62/690,257
<151> 2018-06-26
<150> 62/767,052
<151> 2018-11-14
<150> 62/818,650
<151> 2019-03-14
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 1
Thr Lys Phe Tyr Asp Arg Lys Glu Ile Lys Asp Ile Leu Ala Tyr Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Val Pro Lys Arg Gly Ile Gly Ala Ala Thr Val Asp
35 40
<210> 2
<211> 44
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 2
Thr Lys Phe Tyr Asp Arg Lys Glu Ile Lys Asp Ile Leu Ala Tyr Leu
1 5 10 15
Arg Leu Val Ser Asn Pro Asp Asp Asp Ser Phe Ala Arg Ile Val Asn
20 25 30
Val Pro Lys Arg Gly Ile Gly Ala Thr Ser Val Asp
35 40
<210> 3
<211> 44
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 3
Thr Lys Phe Tyr Asp Arg Lys Glu Ile Lys Asp Leu Leu Ala Tyr Leu
1 5 10 15
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20 25 30
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<211> 45
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 4
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1 5 10 15
Arg Val Ile Gln Asp Pro Glu Gly Asp Leu Ser Ile Lys Arg Ile Ile
20 25 30
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<210> 5
<211> 45
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 5
Leu Arg Phe Tyr Glu Arg Lys Glu Ile Lys Asp Ile Val Ala Tyr Leu
1 5 10 15
Arg Phe Ile Ser Asn Pro Ala Asp Ala Val Ser Phe Arg Arg Val Val
20 25 30
Asn Val Pro Lys Arg Gly Ile Gly Asp Ala Thr Val Gln
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<210> 6
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 6
Leu Lys Phe Tyr Gln Arg Lys Glu Ile Lys Asp Ile Met Ala Tyr Leu
1 5 10 15
Arg Val Val Ala Asn Pro Ser Asp Asp Val Ser Leu Leu Arg Ile Ile
20 25 30
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Arg Ile Leu Val Asn Pro Tyr Asp Asp Ser Phe Lys Arg Ile Ile Asn
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<213> Escherichia coli
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1 5 10 15
Arg Leu Ile Ala Asn Gln Asp Asp Asp Ser Leu Ala Arg Ile Val Asn
20 25 30
Val Pro Lys Arg Gly Val Gly Ala Thr Ser Val Asp
35 40
<210> 10
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 10
His Lys Phe Tyr Asp Arg Lys Glu Ile Lys Asp Leu Leu Ala Tyr Leu
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20 25 30
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<400> 11
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20 25 30
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35 40
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 13
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1 5 10 15
Arg Leu Ile Val Asn Pro Tyr Asp Asp Ser Phe Lys Arg Ile Val Asn
20 25 30
Val Pro Arg Arg Gly Ile Gly Pro Ala Thr Ile Glu
35 40
<210> 14
<211> 45
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 14
Met Arg Phe Phe Glu Arg Gln Glu Ile Lys Asp Ala Leu Ser Tyr Leu
1 5 10 15
Arg Leu Ile Ala Asn Arg Asn Asp Asp Ala Ala Phe Glu Arg Val Val
20 25 30
Asn Thr Pro Thr Arg Gly Ile Gly Asp Arg Thr Leu Asp
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<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Peptide
<220>
<221> misc
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = asparagine, histidine, or lysine
<220>
<221> misc
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = arginine, serine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine,
asparagine, glycine, tyrosine, or histidine
<220>
<221> misc
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = isoleucine, serine, threonine, valine, or leucine
<220>
<221> misc
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = leucine, phenylalanine, asparagine, tyrosine, valine,
isoleucine, serine, aspartic acid, glutamic acid, or alanine
<400> 15
Arg Xaa Xaa Xaa Xaa His
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = asparagine or histidine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = arginine, serine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine,
asparagine, glycine, tyrosine, or histidine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = isoleucine, serine, threonine, valine, or leucine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = leucine, phenylalanine, asparagine, tyrosine, valine,
isoleucine, serine, aspartic acid, glutamic acid, or alanine
<400> 16
Arg Xaa Xaa Xaa Xaa His
1 5
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Peptide
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa = asparagine or lysine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = arginine, serine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine,
asparagine, glycine, tyrosine, or histidine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = isoleucine, serine, threonine, valine, or leucine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = leucine, phenylalanine, asparagine, tyrosine, valine,
isoleucine, serine, aspartic acid, glutamic acid, or alanine
<400> 17
Arg Xaa Xaa Xaa Xaa His
1 5
<210> 18
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 18
gggaacaaag cugaaguacu uaccc 25
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 19
gggtagggcg ggttggga 18
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 3' ThioMC3-D modification
<400> 20
ttataactat tcctaaaaaa aaaaa 25
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' ThioMC6-D modification
<400> 21
aaaaaaaaaa ctcccctaat aacaat 26
<210> 22
<211> 45
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 22
ggguaggaau aguuauaauu ucccuuuccc auuguuauua gggag 45
<210> 23
<211> 12
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' Biosg modification
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 3' IAbRQSp modification
<400> 23
ucucguacgu uc 12
<210> 24
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' Biosg modification
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> 3' IAbRQSp modification
<400> 24
ucucguacgu ucucucguac guuc 24
Claims (86)
- 표적 이중-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 표적 이중-가닥 핵산을 포함하는 샘플을 증폭 반응 혼합물과 조합하는 단계로서, 증폭 반응 혼합물은 하기를 포함하는 단계:
(i) 증폭 CRISPR 시스템으로서, 증폭 CRISPR 시스템은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 포함하고, 제 1 CRISPR/Cas 복합체는 제 1 CRISPR/Cas 효소 및 제 1 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 1 가닥으로 가이드하는 제 1 가이드 분자를 포함하고, 제 2 CRISPR/Cas 복합체는 제 2 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 2 가닥으로 가이드하는 제 2 가이드 분자를 포함하는 증폭 CRISPR 시스템;
(ii) 헬리카제;
(iii) 제 1 및 제 2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍으로서, 제 1 프라이머는 표적 핵산의 제 1 가닥에 상보적인 부분을 포함하고, 제 2 프라이머는 표적 핵산의 제 2 가닥에 상보적인 부분을 포함하는 프라이머 쌍; 및
(iv) 중합효소;
(b) 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 사용하여 표적 핵산의 R-루프를 열고, 헬리카제를 사용하여 표적 핵산의 제 1 및 제 2 가닥을 풀고, 프라이머 쌍 및 중합효소를 사용하여 가닥을 어닐링 및 연장함으로써 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및
(c) 등온 조건 하에 반복된 열림, 풀림, 어닐링 및 연장에 의해 표적 핵산을 추가로 증폭하는 단계; 및
(d) 임의로 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계. - 제 1 항에 있어서, CRISPR/Cas 효소는 데드 Cas9, 데드 Cas12a, 데드 Cas12b, 및 데드 Cas12c 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 데드 CRISPR/Cas 효소인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 2 항에 있어서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 HNH 및 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함하는 데드 Cas9 단백질인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 2 항에 있어서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 SpCas9 에 D10A 및 N863A, 또는 SpCas9 에 D10A 및 H840A 에 해당하는 돌연변이를 포함하는 데드 Cas9 단백질인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 테르모필루스 (Streptococcus thermophilus), 에스. 뮤탄스 (S. mutans), 에스. 아갈락티아에 (S. agalactiae), 에스. 에퀴시밀리스 (S. equisimilis), 에스. 산귀니스 (S. sanguinis), 에스. 뉴모니아 (S. pneumonia); 씨. 제주니 (C. jejuni), 씨. 콜라이 (C. coli); 엔. 살수기니스 (N. salsuginis), 엔. 테르가르쿠스 (N. tergarcus); 에스. 아우리쿨라리스 (S. auricularis), 에스. 카르노서스 (S. carnosus); 엔. 메닌지티데스 (N. meningitides), 엔. 고노로에아에 (N. gonorrhoeae); 엘. 모노시토게네스 (L. monocytogenes), 엘. 이바노비이 (L. ivanovii); 씨. 보툴리넘 (C. botulinum), 씨. 디피실 (C. difficile), 씨. 테타니 (C. tetani), 씨. 소르델리이 (C. sordellii), 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis) 1, 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MC2017 1, 부티리비브리오 프로테오클라스티커스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium) GW2011_GWC2_44_17, 스미텔라 종 (Smithella sp.) SCADC, 악시다미노코쿠스 종 (Acidaminococcus sp.) BV3L6, 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미텀 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 237, 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis) 3, 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카카에 (Porphyromonas macacae) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래된 데드 Cas9 단백질인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 2 항에 있어서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 데드 Cas12 단백질인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 6 항에 있어서, 데드 Cas12 단백질은 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함하는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 6 항에 있어서, 데드 Cas12 효소는 데드 Cas12a, Cas12b, Cas12c 인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 8 항에 있어서, 데드 Cas12a 는 AsCpf1 에 D908A 또는 E993A 에 해당하는 돌연변이를 포함하는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 데드 Cas12 단백질은 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium), 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium), 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium), 스미텔라 종 (Smithella sp.), 아시다미노코쿠스 종 (Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium), 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi), 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카카에 (Porphyromonas macacae), 숙시니비브리오 덱스트리노솔벤스 (Succinivibrio dextrinosolvens), 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens), 플라보박테리움 브란키오필룸 (Flavobacterium branchiophilum), 헬코코쿠스 쿤지이 (Helcococcus kunzii), 유박테리움 종 (Eubacterium sp.), 미크로게노마테스 (Microgenomates) (로이즈만박테리아 (Roizmanbacteria)) 박테리움, 플라보박테리움 종 (Flavobacterium sp.), 프레보텔라 브레비스 (Prevotella brevis), 모락셀라 카프라에 (Moraxella caprae), 박테로이데테스 오랄 (Bacteroidetes oral), 포르피로모나스 칸술치 (Porphyromonas cansulci), 시네르기스테스 조네시이 (Synergistes jonesii), 프레보텔라 브리안티이 (Prevotella bryantii), 아나에로비브리오 종 (Anaerovibrio sp.), 부티리비브리오 피브리솔벤스 (Butyrivibrio fibrisolvens), 칸디다투스 메타노메틸로필루스 (Candidatus Methanomethylophilus), 부티리비브리오 종 (Butyrivibrio sp.), 오리박테리움 종 (Oribacterium sp.), 슈도부티리비브리오 루미니스 (Pseudobutyrivibrio ruminis) 및 프로테오카텔라 스페니치 (Proteocatella sphenisci) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 6 항에 있어서, 데드 Cas12 는 Nuc 도메인에 돌연변이를 포함하는 데드 Cas12b 단백질인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 11 항에 있어서, 데드 Cas12b 는 AacC2c1 에 D570A, E848A, 또는 D977A 에 해당하는 돌연변이를 포함하는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 데드 Cas12b 단백질은 알리시클로바실루스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris), 알리시클로바실루스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans), 알리시클로바실루스 마크로스포란지이두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus), 바실루스 히사시이 (Bacillus hisashii), 칸디다투스 린도우박테리아 (Candidatus Lindowbacteria), 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans), 엘루시미크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 (Omnitrophica) WOR_2 박테리움 RIFCSPHIGHO2, 오피투타세아에 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스파에라에 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코미크로비아세아에 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실루스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus), 바실루스 테르모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans), 브레비바실루스 종 (Brevibacillus sp.) CF112, 바실루스 종 (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티라브디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans), 알리시클로바실루스 헤르바리우스 (Alicyclobacillus herbarius), 시트로박테르 프레운디이 (Citrobacter freundii), 브레비바실루스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 및 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 유래되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 데드 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 데드 CRISPR/Cas 효소는 동일한 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 데드 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 데드 CRISPR/Cas 효소는 상이한 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 15 항에 있어서, 데드 CRISPR/Cas 효소는 dCas9, dCas12a, dCas12b, dCas12c, 또는 dCas14 인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합효소는 Bst 2.0 DNA 중합효소, Bst 2.0 WarmStart DNA 중합효소, Bst 3.0 DNA 중합효소, 전체 길이 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bsu DNA 중합효소, phi29 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, Gst 중합효소, Taq 중합효소, 이. 콜라이 DNA 중합효소 I 의 클레노우 (Klenow) 단편, KlenTaq DNA 중합효소, Pol III DNA 중합효소, T5 DNA 중합효소, 및 시쿼나제 (Sequenase) DNA 중합효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 헬리카제는 UvrD 헬리카제, CRISPR-Cas3 헬리카제, 이. 콜라이 헬리카제 I, 이. 콜라이 헬리카제 II, 이. 콜라이 헬리카제 III, 이. 콜라이 헬리카제 IV, Rep 헬리카제, DnaB 헬리카제, PriA 헬리카제, PcrA 헬리카제, T4 Gp41 헬리카제, T4 Dda 헬리카제, SV40 대형 T 항원, 효소 RAD 헬리카제, RecD 헬리카제, RecQ 헬리카제, 열안정성 T. 텡콘겐시스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 테르모필루스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 아쿠아티쿠스 DnaB 헬리카제, Dda 헬리카제, 파필로마 바이러스 E1 헬리카제, 고세균 MCM 헬리카제, 진핵생물 MCM 헬리카제, 및 T7 Gp4 헬리카제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산의 증폭은 약 37℃-65℃ 에서 수행되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산의 증폭은 약 50℃-59℃ 에서 수행되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산의 증폭은 약 60℃-72℃ 에서 수행되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산의 증폭은 실온에서 수행되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항에 있어서, 중온성 등온 조건 하에 수행되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 23 항에 있어서, 중합효소는 중온성 중합효소인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 24 항에 있어서, 중온성 중합효소는 Sau LF 중합효소인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 25 항에 있어서, 표적 핵산의 증폭은 약 37℃ 에서 수행되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 23 항에 있어서, 헬리카제는, 임의로, 예를 들어 D403 및 D404 에서, D 에서 A 로의 치환이 둘 이상 있는, 이.콜라이 UvrD 헬리카제인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 23 항에 있어서, 헬리카제는 D409A 및 D410A 에 해당하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 pcrA (UvrD)-유형 헬리카제인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 23 항에 있어서, 헬리카제는 Tte-UvrD D409A/D410A 인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산 서열은 약 20-30 개, 약 30-40 개, 약 40-50 개, 또는 약 50-100 개 뉴클레오티드 길이인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산 서열은 약 100-200 개, 약 100-500 개, 또는 약 100-1000 개 뉴클레오티드 길이인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산 서열은 약 1000-2000 개, 약 2000-3000 개, 약 3000-4000 개, 또는 약 4000-5000 개 뉴클레오티드 길이인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 또는 제 2 프라이머는 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 크라우딩제, 보조인자, 단일-가닥 결합 단백질, 및/또는 보조 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 포함하는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 34 항에 있어서, 크라우딩제는 폴리에틸렌 글리콜인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 34 항에 있어서, 보조인자는 ATP 인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 34 항에 있어서, 단일-가닥 결합 단백질은 T4 gp32 또는 호열성 SSB (ET-SSB) 로부터 선택되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 34 항에 있어서, 보조 단백질은 dCpf1 및/또는 UvsX 레콤비나제인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 겔 전기영동, 인터칼레이팅 염료 검출, PCR, 실시간 PCR, 형광, 형광 공명 에너지 전이 (FRET), 질량 분석법, 측류 어세이, 비색 어세이, 및 CRISPR-기반 검출 시스템으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 증폭된 핵산을 검출하는 것을 추가로 포함하는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭된 표적 핵산은 CRISPR Cas13-기반 시스템, CRISPR Cas12-기반 시스템, 또는 그들의 조합에 의해 검출되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 40 항에 있어서, 증폭된 표적 핵산은 LwaCas13 효소를 포함하는 CRISPR Cas-13 기반 시스템에 의해 검출되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산은 아토몰라 감도로 검출되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산은 펨토몰라 감도로 검출되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 핵산은 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA, 플라스미드 DNA, 순환성 무세포 DNA, 환경 DNA, 합성 이중-가닥 DNA, 및 RNA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 44 항에 있어서, 표적 핵산은 RNA 이고, RNA 는 증폭 전에 cDNA 로 역전사되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 45 항에 있어서, 증폭은 레콤비나제 중합효소 증폭 (RPA) 인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 반응은 약 2 시간 미만, 약 90 분 미만, 약 60 분 미만, 약 30 분 미만 또는 약 15 분 미만으로 수행되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 48 항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액, 림프액, 활액, 담즙, 복수, 흉막 삼출액, 혈청종, 타액, 뇌척수액, 수양액 또는 유리체액 샘플, 또는 임의의 신체 분비액, 여출액, 삼출액, 또는 관절로부터 수득된 체액, 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑 (swab) 인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 49 항에 있어서, 샘플은 인간 환자로부터 수득된 혈액, 혈장 또는 혈청인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 48 항에 있어서, 샘플은 식물 샘플인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 미정제 샘플인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 정제된 샘플인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 표적 단일-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 샘플 내의 단일-가닥 핵산을 표적 이중-가닥 핵산으로 전환하는 단계; 및
(b) 제 1 항의 단계를 수행하는 단계. - 제 54 항에 있어서, 표적 단일-가닥 핵산은 RNA 분자인 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 55 항에 있어서, RNA 분자는 역전사 및 증폭 단계에 의해 이중-가닥 핵산으로 전환되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 54 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단일-가닥 핵산은 단일-가닥 바이러스 DNA, 바이러스 RNA, 전령 RNA, 리보솜 RNA, 운반 RNA, 마이크로RNA, 짧은 간섭 RNA, 소형 핵 RNA, 합성 RNA, 합성 단일-가닥 DNA, 장형 비-코딩 RNA, 프리-마이크로RNA, 바이러스 dsRNA, 및 비-바이러스 dsRNA 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 1 항에 있어서, 프라이머 쌍의 제 1 프라이머에 함유된 부분을 포함하는 앰플리파이어 프라이머를 추가로 포함하고; 프라이머 쌍의 제 1 프라이머는 제 1 증폭 단계를 매개하고, 앰플리파이어 프라이머는 프라이머 쌍의 제 2 프라이머와 함께 후속 증폭 단계를 매개하는 단계를 포함하는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 58 항에 있어서, 앰플리파이어 프라이머 및 프라이머 쌍의 제 1 프라이머는 각각 T7 프로모터 서열을 포함하는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 제 58 항에 있어서, 앰플리파이어 프라이머는 약 23 개 내지 약 35 개 뉴클레오티드 길이를 포함하는 증폭 및/또는 검출 방법.
- 샘플 내의 표적 이중-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출을 위한 시스템으로서, 하기를 포함하는 시스템:
a) 증폭 CRISPR 시스템으로서, 증폭 CRISPR 시스템은 제 1 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 포함하고, 제 1 CRISPR/Cas 복합체는 제 1 CRISPR/Cas 효소 및 제 1 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 1 가닥으로 가이드하는 제 1 가이드 분자를 포함하고, 제 2 CRISPR/Cas 복합체는 제 2 CRISPR/Cas 효소 및 제 2 CRISPR/Cas 복합체를 표적 핵산의 제 2 가닥으로 가이드하는 제 2 가이드 분자를 포함하는 증폭 CRISPR 시스템;
b) 헬리카제;
c) 제 1 및 제 2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍으로서, 제 1 프라이머는 표적 핵산의 제 1 가닥에 상보적인 부분을 포함하고, 제 2 프라이머는 표적 핵산의 제 2 가닥에 상보적인 부분을 포함하는 프라이머 쌍; 및
d) 중합효소; 및 임의로
e) 표적 핵산의 증폭을 검출하기 위한 검출 시스템. - 제 61 항에 있어서, CRISPR/Cas 효소는 데드 Cas9 효소 또는 데드 Cas12 효소로부터 선택되는 데드 CRISPR/Cas 효소인 시스템.
- 제 62 항에 있어서, 데드 Cas12 효소는 데드 Cas12a, Cas12b, 또는 Cas12c 효소인 시스템.
- 제 61 항에 있어서, CRISPR/Cas 효소는 Cas9 또는 Cas12 효소인 시스템.
- 제 64 항에 있어서, Cas12 효소는 Cas12a, Cas12b, 또는 Cas12c 효소인 시스템.
- 제 61 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서, 중합효소는 Bst 2.0 DNA 중합효소, Bst 2.0 WarmStart DNA 중합효소, Bst 3.0 DNA 중합효소, 전체 길이 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bst DNA 중합효소, 대형 단편 Bsu DNA 중합효소, phi29 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, Gst 중합효소, Taq 중합효소, 이. 콜라이 DNA 중합효소 I 의 클레노우 (Klenow) 단편, KlenTaq NDA 중합효소, Pol III DNA 중합효소, T5 DNA 중합효소, 및 시쿼나제 (Sequenase) DNA 중합효소, 및 Sau LF DNA 중합효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템.
- 제 61 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, 헬리카제는 UvrD 헬리카제, CRISPR-Cas3 헬리카제, Rep 헬리카제, PcrA 헬리카제, 이. 콜라이 헬리카제 I, 이. 콜라이 헬리카제 II, 이. 콜라이 헬리카제 III, 이. 콜라이 헬리카제 IV, Rep 헬리카제, DnaB 헬리카제, PriA 헬리카제, PcrA 헬리카제, T4 Gp41 헬리카제, T4 Dda 헬리카제, SV40 대형 T 항원, 효소 RAD 헬리카제, RecD 헬리카제, RecQ 헬리카제, 열안정성 T. 텡콘겐시스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 테르모필루스 UvrD 헬리카제, 열안정성 T. 아쿠아티쿠스 DnaB 헬리카제, Dda 헬리카제, 파필로마 바이러스 E1 헬리카제, 고세균 MCM 헬리카제, 진핵생물 MCM 헬리카제, 및 T7 Gp4 헬리카제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템.
- 제 67 항에 있어서, 헬리카제는 Tte-UvrD D409A/D410A 인 시스템.
- 제 61 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR/Cas 효소, 헬리카제, 및 중합효소는 동일한 온도 하에서, 일부 경우에, 약 37℃ 에서 수행되는 시스템.
- 샘플 내의 표적 단일-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출을 위한 시스템으로서, 하기를 포함하는 시스템:
a) 표적 단일-가닥 핵산을 이중-가닥 핵산으로 전환시키기 위한 시약;
b) 제 61 항의 구성요소. - 제 61 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 시스템은 Cas 12 또는 Cas 13 이펙터 단백질 및 상응하는 표적 분자에 결합하도록 디자인된 가이드 RNA 를 포함하는 CRISPR 시스템; 및 차폐성 구성체를 포함하는 시스템.
- 제 71 항에 있어서, 검출 시스템은 Cas 13 효소 LwaCas13 을 포함하는 시스템.
- 제 61 항에 있어서, 프라이머 쌍의 제 1 프라이머와 프로모터 서열 동일성을 포함하는 부가적 앰플리파이어 프라이머를 추가로 포함하는 시스템.
- 샘플 내의 표적 이중-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출을 위한 키트로서, 제 61 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항의 구성요소, 및 사용 지침의 세트를 포함하는 키트.
- 제 74 항에 있어서, 샘플 내의 이중-가닥 핵산을 정제하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.
- 샘플 내의 표적 단일-가닥 핵산의 증폭 및/또는 검출을 위한 키트로서, 제 72 항의 구성요소 및 사용 지침의 세트를 포함하는 키트.
- 제 76 항에 있어서, 샘플 내의 단일-가닥 핵산을 정제하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.
- 제 66 항에 있어서, 헬리카제는 Tte-UvrD D409A/D410A 인 시스템.
- 제 66 항에 있어서, 헬리카제는 효소 내의 D 에서 하나 이상의 A 치환을 포함하는 시스템.
- 제 66 항에 있어서, 크라우딩제, 보조인자, 단일-가닥 결합 단백질, 및/또는 보조 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 시스템.
- 제 80 항에 있어서, 크라우딩제는 폴리에틸렌 글리콜 20K 분자량이며, 임의로 약 2.5% 내지 약 6.5% 로 제공되는 시스템.
- 제 80 항에 있어서, 보조인자는 ATP 이며, 임의로 0.75 내지 약 5 mM 로 제공되는 시스템.
- 제 80 항에 있어서, 단일-가닥 결합 단백질은 T4 gp32 또는 호열성 SSB (ET-SSB) 로부터 선택되는 시스템.
- 제 80 항에 있어서, 보조 단백질은 dCpf1 및/또는 UvsX 레콤비나제인 시스템.
- 제 76 항에 있어서, 중온성 DNA 중합효소, 특히 Sau LF 중합효소를 포함하는 시스템.
- 제 1 항 또는 제 61 항에 있어서, 헬리카제는 돌연변이 D403A/D404A 가 있는 테르모아나에로박테르 에타놀리쿠스 (Thermoanaerobacter ethanolicus) 로부터의 PcrA 헬리카제, 돌연변이 D407A/D408A 가 있는 바실루스 종 (Bacillus sp.) FJAT-27231 로부터의 PcrA 헬리카제, 돌연변이 D415A/D416A 가 있는 바실루스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 으로부터의 PcrA 헬리카제, 돌연변이 D407A/D408A 가 있는 바실루스 심플렉스 (Bacillus simplex) 로부터의 PcrA 헬리카제, 또는 돌연변이 D402A/D403A 가 있는 페니클로스트리디움 소르델리이 (Paeniclostridium sordellii) 로부터의 PcrA 헬리카제인 증폭 및/또는 검출 방법 또는 시스템.
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