JP2021528090A - Crisprエフェクター系に基づく増幅法、システム、及び診断法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図2
Description
本出願は、2018年6月26日出願の米国仮出願第62/690,257号、2018年11月14日出願の米国仮出願第62/767,052号、及び2019年3月14日出願の米国仮出願第62/818,650号の優先権を主張する。上記特定される出願の全内容は、本明細書により全体として本明細書中参照として援用される。
本発明は、認可番号MH100706、MH110049、及びHL141201の下、国立衛生研究所により付与された政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
電子配列表(BROD_2595WP_ST25.txt’’;ファイルサイズ11,011バイト、ファイル作成日2019年4月15日)の内容は、そのまま全体が本明細書中参照として援用される。
本明細書中開示される発明の対象は、概して、CRISPRエフェクター系の使用と関連した、核酸増幅の方法、システム、及び迅速な診断方法に関する。
特に定義されない限り、本明細書中使用される技術用語及び科学用語は、本開示が関係する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の一般的な用語と技術の定義は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989)(Sambrook, Fritsch, and Maniatis);Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition (2012)(Green and Sambrook);Current Protocols in Molecular Biology (1987)(F.M. Ausubel et al. eds.);the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (1995)(M.J. MacPherson, B.D. Hames, and G.R. Taylor eds.): Antibodies, A Laboratory Manual (1988)(Harlow and Lane, eds.): Antibodies A Laboratory Manual, 2nd edition 2013 (E.A. Greenfield ed.);Animal Cell Culture (1987)(R.I. Freshney, ed.);Benjamin Lewin, Genes IX, 出版元Jones and Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223);Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, 出版元Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829);Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 出版元VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471185710);Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992);及びMarten H. Hofker and Jan van Deursen, Transgenic Mouse Methods and Protocols, 2nd edition (2011)で見ることができる。
ヘリカーゼ依存増幅(HDA)では、二本鎖核酸を解きほぐしてプライマーハイブリダイゼーション及びその後のプライマー延長用のテンプレートを生成させるのに、ヘリカーゼ酵素が使用される。このプロセスは、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、それぞれが、標的配列を含むセンス鎖または逆相補的標的配列を含むアンチセンス鎖のどちらかの3’末端とハイブリダイズする。HDA反応は、ヘリカーゼ依存性核酸増幅の一般的方法である。
ある特定の実施形態において、本発明は、標的二本鎖核酸を増幅及び/または検出する方法を含み、本方法は、標的二本鎖核酸を含む試料を、増幅反応混合物と混合することを含み、増幅反応混合物は、以下:(i)増幅CRISPR系、増幅CRISPR系は第一CRISPR/Cas複合体及び第二CRISPR/Cas複合体を含み、第一CRISPR/Cas複合体は第一CRISPR/Cas酵素と第一CRISPR/Cas複合体を標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含み、第二CRISPR/Cas複合体は第二CRISPR/Cas酵素と第二CRISPR/Cas複合体を標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む;(ii)ヘリカーゼ;(iii)第一プライマー及び第二プライマーを含むプライマー対、ただし、第一プライマーは標的核酸の第一鎖と相補的な部分を含み、第二プライマーは標的核酸の第二鎖と相補的な部分を含む;ならびに(iv)ポリメラーゼ、を含む。本方法は、さらに、第一CRISPR/Cas複合体及び第二CRISPR/Cas複合体を用いて標的核酸のRループを開口し、ヘリカーゼを用いて標的核酸の第一鎖と第二鎖を解きほぐし、プライマー対を用いて鎖をアニールし、及びポリメラーゼを用いて鎖を延長することにより、標的核酸を増幅することを含む場合がある。本方法は、さらに、等温条件下で開口、解きほぐし、アニーリング、及び延長を繰り返すことにより、さらに標的核酸を増幅すること;及び任意選択で、増幅された標的核酸を検出することを含む場合がある。
特定の実施形態において、本明細書中想定される増幅反応混合物には、増幅CRISPR系が含まれる。増幅CRISPR系は、第一CRISPR/Cas複合体及び第二CRISPR/Cas複合体を含む場合がある。CRISPR/Cas複合体は、活性または失活CRISPR/Cas酵素と、CRISPR/Cas複合体を標的核酸の鎖に誘導するガイド分子とを含む場合がある。標的核酸が実際に長い、例えば、ゲノムDNAなどの場合、活性Cas酵素が有用である可能性がある。活性Cas酵素は、ゲノムDNAを切断して、二本鎖DNAの分断により生成した平滑末端にヘリカーゼ酵素が入ることを可能にする場合がある。
特定の実施形態において、本明細書中定義されるとおりの改変Casタンパク質、例えばCas9を利用することが目的となるが、ただしこのタンパク質は、RNAを含む核酸分子と複合体形成して、CRISPR複合体を形成し、ただし、CRISPR複合体において、核酸分子が1つまたは複数の標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的とする場合、タンパク質は、非修飾Casタンパク質と比較して少なくとも1つの修飾を有し、及び修飾タンパク質を含むCRISPR複合体は、非修飾Casタンパク質を含む複合体と比較した場合に活性が変化している。当然のことながら、本明細書中CRISPR「タンパク質」と示す場合、Casタンパク質は、好ましくは、修飾CRISPR−Casタンパク質である(例えば、酵素活性が上昇または低下している(あるいはない)、例えば、限定するものではないが、Cas9が挙げられる)。「CRISPRタンパク質」という用語は、「CRISPR−Casタンパク質」と同義で使用することができ、野生型CRISPRタンパク質に比べて、CRISPRタンパク質が改変されているかどうか、例えば酵素活性が上昇または低下している(あるいはない)などとは無関係である。本明細書中使用される場合、CRISPR−Casタンパク質に関して「修飾された」という用語は、概して、派生元となる野生型Casタンパク質と比較して、1つまたは複数の修飾または変異(点変異、トランケーション、挿入、削除、キメラ、融合タンパク質などを含む)を有するCRISPR−Casタンパク質を示す。由来するは、由来する酵素が、高度の配列相同性を有するという意味において、野生型酵素に多大に基づいているが、当該分野で既知のある種の方法でまたは本明細書中記載されるとおりに変異している(修飾されている)ことを意味する。あるいは、そのような修飾タンパク質で酵素活性を持たないものを、失活タンパク質、または失活CRISPR/Cas酵素と称する場合がある。
本明細書中使用される場合、「ガイド配列」、「crRNA」、「ガイドRNA」、または「単一ガイドRNA」、または「gRNA」という用語は、標的核酸配列とハイブリダイズし、ガイド配列及びCRISPRエフェクタータンパク質を含むRNA標的指向性複合体の標的核酸配列に対する配列特異的結合を指示するのに十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを示す。いくつかの例示の実施形態において、相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適に配列比較される場合、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%以上である。最適な配列比較は、配列の整列に適した任意のアルゴリズムを使用して決定される場合があり、その限定ではなく例として、Smith−Watermanアルゴリズム、Needleman−Wunschアルゴリズム、Burrows−Wheeler変換に基づくアルゴリズム(例えば、Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、ClustalX、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies;www.novocraft.comで入手可能)、ELAND(Illumina、San Diego、CA)、SOAP(soap.genomics.org.cnで入手可能)、及びMaq(maq.sourceforge.netで入手可能)が挙げられる。核酸標的指向性複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を指示するガイド配列(核酸標的指向性ガイドRNA内)の能力は、任意の適切なアッセイにより評価可能である。例えば、試験されるガイド配列を含む核酸標的指向性複合体を形成するのに十分な核酸標的指向性CRISPR系の構成要素は、核酸標的指向性複合体の構成要素をコードするベクターを用いるトランスフェクションなどにより、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供することができ、続いて、本明細書に記載されるとおりのSurveyorアッセイなどにより、標的核酸配列内の優先的標的指向性(例えば、切断)を評価することができる。同様に、標的核酸配列の切断は、試験管内で、標的核酸配列と、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含む核酸標的指向性複合体の構成要素とを提供すること、ならびに試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応の間で、標的配列での結合または切断速度を比較することにより評価可能である。他のアッセイも可能であり、当業者に思い浮かぶであろう。任意の標的核酸配列を標的とするように、ガイド配列、したがって核酸標的指向性ガイドを選択することができる。標的配列はDNAである場合がある。標的配列は、任意のRNA配列が可能である。実施形態によっては、標的配列は、メッセンジャーRNA(mRNA)、プレmRNA、リボソームRNA(rRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、核内低分子RNA(snRNA)、低分子核小体RNA(snoRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、非コードRNA(ncRNA)、長非コードRNA(lncRNA)、及び低分子細胞質RNA(scRNA)からなる群より選択されるRNA分子内の配列である場合がある。いくつかの好適な実施形態において、標的配列は、mRNA、プレmRNA、及びrRNAからなる群より選択されるRNA分子内の配列である場合がある。いくつかの好適な実施形態において、標的配列は、ncRNA及びlncRNAからなる群より選択されるRNA分子内の配列である場合がある。いくつかのより好ましい実施形態において、標的配列は、mRNA分子またはプレmRNA分子内の配列である場合がある。
ある特定の実施形態において、本発明のガイドは、非天然の核酸、及び/または非天然のヌクレオチド、及び/またはヌクレオチドアナログ、及び/または化学修飾を含む。非天然の核酸として、例えば、天然のヌクレオチドと非天然のヌクレオチドの混合物が挙げられる。非天然のヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログは、リボース部分、リン酸部分、及び/または塩基部分で修飾されている場合がある。本発明のある実施形態において、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。そのような実施形態の1つにおいて、ガイドは、1つまたは複数のリボヌクレオチド及び1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明のある実施形態において、ガイドは、1つまたは複数の非天然のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、ホスホロチオアート結合を有するヌクレオチド、ボラノリン酸連結を有するヌクレオチド、リボース環の2’炭素と4’炭素との間にメチレン架橋を有するロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、または架橋型核酸(BNA)を含む。修飾ヌクレオチドの他の例として、2’−O−メチルアナログ、2’−デオキシアナログ、2−チオウリジンアナログ、N6−メチルアデノシンアナログ、または2’−フルオロアナログが挙げられる。修飾塩基のさらなる例として、2−アミノプリン、5−ブロモ−ウリジン、シュードウリジン(Ψ))、N1−メチルシュードウリジン(me1Ψ)、5−メトキシウリジン(5moU)、イノシン、7−メチルグアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。ガイドRNAの化学修飾の例として、限定するものではないが、2’−O−メチル(M)、2’−O−メチル−3’−ホスホロチオアート(MS)、ホスホロチオアート(PS)、S−拘束エチル(cEt)、または2’−O−メチル3’チオPACE(MSP)を1つまたは複数の末端ヌクレオチドに組み込むことが挙げられる。そのように化学修飾されたガイドは、非修飾ガイドと比較した場合に安定性の向上及び活性の増大を含む可能性があるが、標的外と比較しての標的的中特異性は予測不可能である(Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985−9, doi:10.1038/nbt.3290、2015年6月29日オンライン公開;Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110−E7111;Allerson et al., J. Med. Chem. 2005, 48:901−904;Bramsen et al., Front. Genet., 2012, 3:154;Deng et al., PNAS, 2015, 112:11870−11875;Sharma et al., MedChemComm., 2014, 5:1454−1471;Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9): 985−989;Li et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1, 0066 DOI:10.1038/s41551−017−0066を参照)。実施形態によっては、ガイドRNAの5’末端及び/または3’末端は、さまざまな機能性部分によって修飾され、そのような機能性部分として、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグが挙げられる。(Kelly et al., 2016, J. Biotech. 233:74−83を参照のこと)。ある特定の実施形態において、ガイドは、標的DNAに結合する領域にリボヌクレオチドを含み、Cas9、Cpf1、またはC2c1に結合する領域に1つまたは複数のデオキシリボヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログを含む。本発明のある実施形態において、デオキシリボヌクレオチド及び/またはヌクレオチドアナログは、改変ガイド構造、例えば、限定するものではないが、5’及び/または3’末端、ステムループ領域、及びシード領域などに組み込まれる。ある特定の実施形態において、こうした修飾は、ステムループ領域の5’ハンドルには存在しない。ガイドのステムループ領域の5’ハンドルを化学修飾するとガイドの機能が消失する場合がある(Li, et al., Nature Biomedical Engineering、2017, 1:0066を参照)。ある特定の実施形態において、ガイドのヌクレオチドのうちの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または75のヌクレオチドが化学的に修飾される。実施形態によっては、ガイドの3’末端または5’末端いずれかに位置する3〜5つのヌクレオチドが化学修飾される。実施形態によっては、シード領域にごく軽微な修飾、例えば2’−F修飾などが導入される。実施形態によっては、ガイドの3’末端に2’−F修飾が導入される。ある特定の実施形態において、ガイドの5’末端及び/または3’末端に位置する3〜5ヌクレオチドが、2’−O−メチル(M)、2’−O−メチル−3’−ホスホロチオアート(MS)、S−拘束エチル(cEt)、または2’−O−メチル−3’−チオPACE(MSP)で化学的に修飾される。そのような修飾によってゲノム編集効率が向上する可能性がある(Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9):985−989を参照)。ある特定の実施形態において、遺伝子破壊のレベルを向上させるために、ガイドのホスホジエステル結合の全てがホスホロチオアート(PS)で置き換えられる。ある特定の実施形態において、ガイドの5’末端及び/または3’末端に位置する5ヌクレオチド超が、2’−O−Me、2’−F、またはS−拘束エチル(cEt)で化学的に修飾される。そのように化学修飾されたガイドでは、介在する遺伝子破壊のレベルが向上する可能性がある(Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110−E7111を参照)。本発明のある実施形態において、ガイドは、その3’末端及び/または5’末端に化学部分を含むように修飾される。そのような部分として、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)、またはローダミンが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、化学部分は、リンカー、例えばアルキル鎖などによってガイドに結合される。ある特定の実施形態において、修飾ガイドの化学部分は、ガイドを別の分子、例えば、DNA、RNA、タンパク質、またはナノ粒子などに付加するために使用することができる。そのように化学修飾されたガイドは、CRISPR系によって一般に編集された細胞の同定または富化に使用することができる(Lee et al., eLife, 2017, 6:e25312, DOI:10.7554を参照)。
「ヘリカーゼ」という用語は、本明細書では、二本鎖核酸を酵素反応で解きほぐすことができる任意の酵素を示す。例えば、ヘリカーゼは、全ての生物において、核酸が関与する全ての過程、例えば、複製、組換え、修復、転写、翻訳、及びRNAスプライシングなどにおいて見つかる酵素である。(Kornberg and Baker, DNA Replication, W. H. Freeman and Company (2nd ed.(1992))、特に第11章)。DNAまたはRNAに沿って5’→3’方向でまたは逆の3’→5’方向で転座させる任意のヘリカーゼが、本発明の本実施形態で使用可能である。このようなヘリカーゼとして、原核生物、ウイルス、古細菌、及び真核生物から得られるヘリカーゼ、または天然の酵素の組換え型、ならびに指定される活性を有する類似体または誘導体が挙げられる。天然のDNAヘリカーゼの例として、Kornberg及びBakerが彼らの著書、DNA Replication, W. H. Freeman and Company (2nd ed.(1992))の第11章に記載したもの、E.coliヘリカーゼI、II、III、及びIV、Rep、DnaB、PriA、PcrA、T4 Gp41ヘリカーゼ、T4 Ddaヘリカーゼ、T7 Gp4ヘリカーゼ、SV40 Large T抗原、酵母菌RADが挙げられる。HDAで有用である可能性があるさらなるヘリカーゼとして、RecQヘリカーゼ(Harmon and Kowalczykowski, J. Biol. Chem. 276:232−243 (2001))、T.tengcongensis由来の耐熱性UvrDヘリカーゼ、(本発明、実施例XIIに開示される)及びT.thermophilus由来の耐熱性UvrDヘリカーゼ(Collins and McCarthy, Extremophiles. 7:35−41. (2003))、T.aquaticus由来の耐熱性DnaBヘリカーゼ(Kaplan and Steitz, J. Biol. Chem. 274:6889−6897(1999))、ならびに古細菌及び真核生物由来のMCMヘリカーゼ((Grainge et al., Nucleic Acids Res. 31:4888−4898(2003))が挙げられる。ヘリカーゼのさらなる例として、Thermoanaerobacter ethanolicus由来のDNAヘリカーゼPcrA(例えば、WP_003870487.1)、Bacillus種FJAT−27231由来のPcrA(例えば、WP_034654680.1)、Bacillus megaterium由来のPcrA(例えば、WP_034654680.1)、Bacillus simplex由来のPcrA(例えば、WP_095390358.1)、及びPaeniclostridium sordellii由来のPcrA(例えば、WP_055343022.1)が挙げられる。
ある特定の例示の実施形態において、標的一本鎖または二本鎖核酸は、等温増幅技法を用いて増幅される場合がある。ある特定の例示の実施形態において、等温増幅は、核酸配列に基づく増幅法(NASBA)、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法(RPA)、ループ介在等温増幅法(LAMP)、鎖置換増幅法(SDA)、ヘリカーゼ依存増幅法(HDA)、またはニック酵素増幅反応(NEAR)である場合がある。
実施形態によっては、本方法は、さらに、増幅された核酸をある方法により検出することを含み、方法として、ゲル電気泳動、挿入色素検出、PCR、リアルタイムPCR、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、質量分析、ラテラルフローアッセイ、比色アッセイ、及びCRISPRに基づく検出システムが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。比色アッセイとして、当該分野で既知である任意のものを挙げることができ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)アッセイ、アルカリホスファターゼ(ALP)アッセイ、または金ナノ粒子に基づくアッセイなどがあるが、必ずしもこれらに限定されない。
本明細書中使用される場合、「マスキング構築物」は、本明細書中記載される活性化CRISPR系エフェクタータンパク質により切断される、またはいずれにしろ不活性化される可能性がある分子を示す。「マスキング構築物」という用語は、別の方法では、「検出構築物」とも称する場合がある。ある特定の例示の実施形態において、マスキング構築物は、RNA系マスキング構築物である。RNA系マスキング構築物は、CRISPRエフェクタータンパク質により切断可能なRNA配列要素を含む。RNA配列要素の切断は、作用剤を放出、または構造変化をもたらし、これにより検出可能なシグナルが生成される。RNA配列要素を使用してどのように検出可能なシグナルの生成を防ぐまたはマスクすることができるかを実証する構築物の例を、以下に記載するが、本発明の実施形態は、その変異形態を含む。切断の前、またはマスキング構築物が「活性」状態にある場合、マスキング構築物は、陽性の検出可能なシグナルの生成または検出を遮断する。当然のことながら、ある特定の例示の実施形態において、活性RNAマスキング構築物の存在下、最小限のバックグラウンドシグナルが生成する場合がある。陽性の検出可能なシグナルは、光学的方法、蛍光法、化学発光法、電気化学的方法、または当該分野で既知である他の検出法を用いて検出可能な任意のシグナルが可能である。「陽性の検出可能なシグナル」という用語は、マスキング構築物の存在下で検出可能である可能性がある他の検出可能なシグナルと区別するために使用される。例えば、ある特定の実施形態において、第一のシグナルは、マスキング剤が存在する場合に検出される可能性があり(すなわち、陰性の検出可能なシグナル)、このシグナルは、次いで、活性化CRISPRエフェクタータンパク質による標的分子の検出及びマスキング剤の切断または不活性化に際して、第二のシグナルへと変換される(例えば陽性の検出可能なシグナル)。
増幅及び検出用システム
実施形態によっては、本発明は、試料中の標的二本鎖核酸を増幅及び/または検出するシステムを提供する。本システムは、本明細書中記載されるとおりの増幅CRISPR系を含む場合がある。増幅CRISPR系は本明細書中記載されるとおりの第一CRIPR/Cas複合体及び第二CRIPR/Cas複合体を含む場合がある。第一CRISPR/Cas複合体は、第一CRISPR/Cas酵素と、第一CRISPR/Cas複合体を標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含む場合がある。第二CRISPR/Cas複合体は、第二CRISPR/Cas酵素と、第二CRISPR/Cas複合体を標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む場合がある。第一CRISPR/Cas酵素及び第二CRISPR/Cas酵素は、活性酵素の場合も失活酵素の場合もある。標的核酸が実際に長い、例えばゲノムDNAなどの場合、本明細書中記載されるとおり、例えば、活性Cas酵素が有用である場合がある。
同じく本明細書中提供されるのは、試料中の標的二本鎖核酸を増幅及び/または検出するためのキットである。そのようなキットは、本明細書中記載されるとおりの増幅CRISPR系を含む場合があるが、必ずしもこれに限定されない。増幅CRISPR系は、本明細書中記載されるとおりの第一CRIPR/Cas複合体及び第二CRIPR/Cas複合体を含む場合がある。第一CRISPR/Cas複合体は、第一失活CRISPR/Cas酵素と、第一CRISPR/Cas複合体を標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含む場合がある。第二CRISPR/Cas複合体は、第二失活CRISPR/Cas酵素と、第二CRISPR/Cas複合体を標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む場合がある。
好熱性HDA(tHDA)は、NEBが販売する市販のシステムを利用して、反応温度に65℃を用いる。tHDAと併用したCRISPR系のワークフローの例を、図2に示す。2工程プロセスでSHERLOCK検出と併せてCRISPR−tDAを利用することにより、単一分子検出において増幅システムにCRISPRを加えることで結果の改善を得ることが可能になる(図3A〜図3G)。図5は、改善がdAsCpf1:crRNA複合体によりもたらされ、Cas12a及びCas12bの両方もまた、2工程tHDA−SHERLOCKを改善することを示す。しかしながら、HDA−SHERLOCK反応をより低い温度での反応で完了させることも、改善といえる。
市販のステムとして、現在NEBが販売するtHDAがあるものの、37℃での中温性HDAに利用可能な市販のシステムは存在しない。2工程プロセスは、90分より長い時間を要し、tHDA−SHERLOCKシステムは、高感度検出のためにCas12aまたはCas12bなどの触媒不活性かつプログラム可能なCRISPR酵素を必要とすることで、感度を失う恐れがある。
特に有利な増幅法は、以下の変数のうち1つまたは複数を含むと思われる:37℃での操作、迅速(約10分間)、高感度(約2aM)、安価、多重化可能、ワンポットプロセスで行うことが容易、及び試料マトリクスに対して堅固。
Claims (86)
- 標的二本鎖核酸の増幅及び/または検出法であって、以下:
(a)前記標的二本鎖核酸を含む試料を、増幅反応混合物と混合すること、前記増幅反応混合物は、以下:
(i)増幅CRISPR系、前記増幅CRISPR系は、第一CRISPR/Cas複合体及び第二CRISPR/Cas複合体を含み、前記第一CRISPR/Cas複合体は、第一CRISPR/Cas酵素と、前記第一CRISPR/Cas複合体を前記標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含み、及び前記第二CRISPR/Cas複合体は、第二CRISPR/Cas酵素と、前記第二CRISPR/Cas複合体を前記標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含む;
(ii)ヘリカーゼ;
(iii)第一プライマー及び第二プライマーを含むプライマー対、ただし、前記第一プライマーは、前記標的核酸の前記第一鎖と相補的な部分を含み、及び前記第二プライマーは、前記標的核酸の前記第二鎖と相補的な部分を含む;ならびに
(iv)ポリメラーゼ;を含み、
(b)前記第一CRISPR/Cas複合体及び前記第二CRISPR/Cas複合体を用いて前記標的核酸のRループを開口することにより前記標的核酸を増幅し、前記ヘリカーゼを用いて前記標的核酸の前記第一鎖と前記第二鎖を解きほぐし、前記プライマー対を用いて前記鎖をアニーリングし、及び前記ポリメラーゼを用いて前記鎖を延長すること;ならびに
(c)等温条件下で開口、解きほぐし、アニーリング、及び延長を繰り返すことにより、さらに前記標的核酸を増幅すること;ならびに
(d)任意選択で、前記増幅された標的核酸を検出すること、
を含む、前記方法。 - 前記CRISPR/Cas酵素は、失活Cas9、失活Cas12a、失活Cas12b、及び失活Cas12cからなる群より選択される失活CRISPR/Cas酵素である、請求項1に記載の方法。
- 前記失活CRISPR/Cas酵素は、HNH及びRuvCドメインに変異を有する失活Cas9タンパク質である、請求項2に記載の方法。
- 前記失活CRISPR/Cas酵素は、SpCas9のD10A及びN863AまたはSpCas9のD10A及びH840Aに相当する変異を有する失活Cas9タンパク質である、請求項2に記載の方法。
- 前記失活CRISPR/Cas酵素は、Streptococcus pyogenes、Staphylococcus aureus、Streptococcus thermophilus、S. mutans、S. agalactiae、S. equisimilis、S. sanguinis、S. pneumonia;C. jejuni、C. coli;N. salsuginis、N. tergarcus;S. auricularis、S. carnosus;N. meningitides、N. gonorrhoeae;L. monocytogenes、L. ivanovii;C. botulinum、C. difficile、C. tetani、C. sordellii、Francisella tularensis 1、Prevotella albensis、Lachnospiraceae科菌MC2017 1、Butyrivibrio proteoclasticus、Peregrinibacteria属菌GW2011_GWA2_33_10、Parcubacteria属菌GW2011_GWC2_44_17、Smithella種SCADC、Acidaminococcus種BV3L6、Lachnospiraceae科菌MA2020、Candidatus Methanoplasma termitum、Eubacterium eligens、Moraxella bovoculi 237、Leptospira inadai、Lachnospiraceae科菌ND2006、Porphyromonas crevioricanis 3、Prevotella disiens、及びPorphyromonas macacaeからなる群より選択される細菌種由来の失活Cas9タンパク質である、請求項3または4に記載の方法。
- 前記失活CRISPR/Cas酵素は、失活Cas12タンパク質である、請求項2に記載の方法。
- 前記失活Cas12タンパク質は、RuvCドメインに変異を有する、請求項6に記載の方法。
- 前記失活Cas12酵素は、失活Cas12a、Cas12b、Cas12cである、請求項6に記載の方法。
- 前記失活Cas12aは、AsCpf1のD908AまたはE993Aに相当する変異を有する、請求項8に記載の方法。
- 前記失活Cas12タンパク質は、Francisella tularensis、Prevotella albensis、Lachnospiraceae科菌、Butyrivibrio proteoclasticus、Peregrinibacteria属菌、Parcubacteria属菌、Smithella種、Acidaminococcus種、Lachnospiraceae科菌、Candidatus Methanoplasma termitum、Eubacterium eligens、Moraxella bovoculi、Leptospira inadai、Porphyromonas crevioricanis、Prevotella disiens及びPorphyromonas macacae、Succinivibrio dextrinosolvens、Prevotella disiens、Flavobacterium branchiophilum、Helcococcus kunzii、Eubacterium種、Microgenomates(Roizmanbacteria)群菌、Flavobacterium種、Prevotella brevis、Moraxella caprae、Bacteroidetes oral、Porphyromonas cansulci、Synergistes jonesii、Prevotella bryantii、Anaerovibrio種、Butyrivibrio fibrisolvens、Candidatus Methanomethylophilus、Butyrivibrio種、Oribacterium種、Pseudobutyrivibrio ruminis、ならびにProteocatella sphenisciからなる群より選択される細菌種に由来する、請求項6または7に記載の方法。
- 前記失活Cas12は、Nucドメインに変異を有する失活Cas12bタンパク質である、請求項6に記載の方法。
- 前記失活Cas12bは、AacC2c1のD570A、E848A、またはD977Aに相当する変異を有する、請求項11に記載の方法。
- 前記失活Cas12bタンパク質は、Alicyclobacillus acidoterrestris、Alicyclobacillus contaminans、Alicyclobacillus macrosporangiidus、Bacillus hisashii、Candidatus Lindowbacteria、Desulfovibrio inopinatus、Desulfonatronum thiodismutans、Elusimicrobia門菌RIFOXYA12、Omnitrophica WOR_2細菌RIFCSPHIGHO2、Opitutaceae科菌TAV5、Phycisphaerae綱菌ST−NAGAB−D1、Planctomycetes門菌RBG_13_46_10、Spirochaetes門菌GWB1_27_13、Verrucomicrobiaceae科菌UBA2429、Tuberibacillus calidus、Bacillus thermoamylovorans、Brevibacillus種CF112、Bacillus種NSP2.1、Desulfatirhabdium butyrativorans、Alicyclobacillus herbarius、Citrobacter freundii、Brevibacillus agri(例えば、BAB−2500)、及びMethylobacterium nodulansからなる群より選択される細菌種に由来する、請求項11または12に記載の方法。
- 前記第一失活CRISPR/Cas酵素と前記第二失活CRISPR/Cas酵素は、同じである、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第一失活CRISPR/Cas酵素と前記第二失活CRISPR/Cas酵素は、異なる、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記失活CRISPR/Cas酵素は、dCas9、dCas12a、dCas12b、dCas12c、またはdCas14である、請求項15に記載の方法
- 前記ポリメラーゼは、Bst 2.0 DNAポリメラーゼ、Bst 2.0 WarmStart DNAポリメラーゼ、Bst 3.0 DNAポリメラーゼ、全長Bst DNAポリメラーゼ、巨大断片Bst DNAポリメラーゼ、巨大断片Bsu DNAポリメラーゼ、phi29 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、Gstポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼIのクレノー断片、KlenTaq DNAポリメラーゼ、Pol III DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラーゼ、及びシーケナーゼDNAポリメラーゼからなる群より選択される、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヘリカーゼは、UvrDヘリカーゼ、CRISPR−Cas3ヘリカーゼ、E.coliヘリカーゼI、E.coliヘリカーゼII、E.coliヘリカーゼIII、E.coliヘリカーゼIV、Repヘリカーゼ、DnaBヘリカーゼ、PriAヘリカーゼ、PcrAヘリカーゼ、T4 Gp41ヘリカーゼ、T4 Ddaヘリカーゼ、SV40LargeT抗原、酵母菌RADヘリカーゼ、RecDヘリカーゼ、RecQヘリカーゼ、耐熱性T.tengcongensis UvrDヘリカーゼ、耐熱性T.thermophilus UvrDヘリカーゼ、耐熱性T.aquaticus DnaBヘリカーゼ、Ddaヘリカーゼ、パピローマウイルスE1ヘリカーゼ、古細菌MCMヘリカーゼ、真核生物MCMヘリカーゼ、及びT7 Gp4ヘリカーゼからなる群より選択される、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸の増幅は、約37℃〜65℃で行われる、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸の増幅は、約50℃〜59℃で行われる、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸の増幅は、約60℃〜72℃で行われる、請求項1から18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸の増幅は、室温で行われる、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 中温性等温条件下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼは、中温性ポリメラーゼである、請求項23に記載の方法。
- 前記中温性ポリメラーゼは、Sau LFポリメラーゼである、請求項24に記載の方法。
- 前記標的核酸の増幅は、約37℃で行われる、請求項25に記載の方法。
- 前記ヘリカーゼは、E.coli UvrDヘリカーゼであり、任意選択で、DからAへの置換、例えば、D403及びD404などでの置換を2つ以上有する、請求項23に記載の方法。
- 前記ヘリカーゼは、D409A及びD410Aに相当する1つまたは複数の変異を有するpcrA(UvrD)型ヘリカーゼである、請求項23に記載の方法。
- 前記ヘリカーゼは、Tte−UvrD D409A/D410Aである、請求項23に記載の方法。
- 前記標的核酸配列は、長さが約20〜30、約30〜40、約40〜50、または約50〜100ヌクレオチドである、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸配列は、長さが約100〜200、約100〜500、または約100〜1000ヌクレオチドである、請求項1から23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸配列は、長さが約1000〜2000、約2000〜3000、約3000〜4000、または約4000〜5000ヌクレオチドである、請求項1から23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第一プライマーまたは前記第二プライマーは、RNAポリメラーゼプロモーターを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- クラウディング剤、補因子、一本鎖結合タンパク質、及び/またはアシストタンパク質から選択される1種または複数の添加剤を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クラウディング剤は、ポリエチレングリコールである、請求項34に記載の方法。
- 前記補因子は、ATPである、請求項34に記載の方法。
- 前記一本鎖結合タンパク質は、T4 gp32または好熱性SSB(ET−SSB)から選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記アシストタンパク質は、dCpf1及び/またはUvsXリコンビナーゼである、請求項34に記載の方法。
- さらに、ゲル電気泳動、挿入色素検出、PCR、リアルタイムPCR、蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、質量分析、ラテラルフローアッセイ、比色アッセイ、及びCRISPRに基づく検出システムからなる群より選択される方法により、前記増幅された核酸を検出することを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増幅された標的核酸は、CRISPR Cas13に基づくシステム、CRISPR Cas12に基づくシステム、またはそれらの組み合わせにより検出される、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増幅された標的核酸は、LwaCas13酵素を含むCRISPR Cas−13に基づくシステムにより検出される、請求項40に記載の方法。
- 前記標的核酸は、アトモル感度で検出される、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸は、フェムトモル感度で検出される、請求項1から29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸は、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、ウイルスDNA、プラスミドDNA、循環無細胞DNA、環境DNA、合成二本鎖DNA、及びRNAからなる群より選択される、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的核酸はRNAであり、かつ前記RNAは、増幅の前にcDNAへと逆転写される、請求項44に記載の方法。
- 前記増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)である、請求項45に記載の方法。
- 前記反応は、約2時間未満、約90分間未満、約60分間未満、約30分間未満、または約15分間未満で行われる、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料は、生体試料または環境試料である、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生体試料は、血液、血漿、血清、尿、糞便、痰、粘液、リンパ液、滑液、胆汁、腹水、胸水、漿液腫、唾液、脳脊髄液、眼房水もしくは硝子体液、または任意の体分泌、漏出液、滲出液、または関節から得られる液体、あるいは皮膚または粘膜表面のスワブである、請求項48に記載の方法。
- 前記試料は、ヒト患者から得られた血液、血漿、または血清である、請求項49に記載の方法。
- 前記試料は、植物試料である、請求項48に記載の方法。
- 前記試料は、未精製試料である、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料は、精製試料である、請求項1から52のいずれか1項に記載の方法。
- 標的一本鎖核酸の増幅及び/または検出法であって、以下:
(a)試料中の前記一本鎖核酸を標的二本鎖核酸に変換すること;及び
(b)請求項1に記載の工程を行うこと、
を含む、前記方法。 - 前記標的一本鎖核酸は、RNA分子である、請求項54に記載の方法。
- 前記RNA分子は、逆転写及び増幅工程により、前記二本鎖核酸に変換される、請求項55に記載の方法。
- 前記標的一本鎖核酸は、一本鎖ウイルスDNA、ウイルスRNA、メッセンジャーRNA、リボソームRNA、転移RNA、マイクロRNA、低分子干渉RNA、核内低分子RNA、合成RNA、合成一本鎖DNA、長鎖非翻訳RNA、プレマイクロRNA、ウイルスdsRNA、及び非ウイルスdsRNAからなる群より選択される、請求項54から56のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記プライマー対の前記第一プライマーに含まれる部分を含む増幅器プライマーを含み;ならびに、前記プライマー対の前記第一プライマーは、増幅の第一工程に介在し、及び前記増幅器プライマーは、前記プライマー対の前記第二プライマーと一緒に、増幅のその後の工程に介在する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅器プライマー及び前記プライマー対の前記第一プライマーはそれぞれ、T7プロモーター配列を含む、請求項58に記載の方法。
- 前記増幅器プライマーは、約23〜約35ヌクレオチドの長さを有する、請求項58に記載の方法。
- 試料中の標的二本鎖核酸を増幅及び/または検出するシステムであって、以下:
a)増幅CRISPR系、前記増幅CRISPR系は、第一CRISPR/Cas複合体及び第二CRISPR/Cas複合体を含み、前記第一CRISPR/Cas複合体は、第一CRISPR/Cas酵素と、前記第一CRISPR/Cas複合体を前記標的核酸の第一鎖に誘導する第一ガイド分子とを含み、及び前記第二CRISPR/Cas複合体は、第二CRISPR/Cas酵素と、前記第二CRISPR/Cas複合体を前記標的核酸の第二鎖に誘導する第二ガイド分子とを含み;
b)ヘリカーゼ;
c)第一プライマー及び第二プライマーを含むプライマー対、ただし、前記第一プライマーは、前記標的核酸の前記第一鎖と相補的な部分を含み、及び前記第二プライマーは、前記標的核酸の前記第二鎖と相補的な部分を含み;
d)ポリメラーゼ;ならびに、任意選択で
e)前記標的核酸の増幅を検出する検出システム
を含む、前記システム。 - 前記CRISPR/Cas酵素は、失活Cas9酵素または失活Cas12酵素から選択される失活CRISPR/Cas酵素である、請求項61に記載のシステム。
- 前記失活Cas12酵素は、失活Cas12a、Cas12b、またはCas12c酵素である、請求項62に記載のシステム。
- 前記CRISPR/Cas酵素は、Cas9またはCas12酵素である、請求項61に記載のシステム。
- 前記Cas12酵素は、Cas12a、Cas12b、またはCas12c酵素である、請求項64に記載のシステム。
- 前記ポリメラーゼは、Bst 2.0 DNAポリメラーゼ、Bst 2.0 WarmStart DNAポリメラーゼ、Bst 3.0 DNAポリメラーゼ、全長Bst DNAポリメラーゼ、巨大断片Bst DNAポリメラーゼ、巨大断片Bsu DNAポリメラーゼ、phi29 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、Gstポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼIのクレノー断片、KlenTaq DNAポリメラーゼ、Pol III DNAポリメラーゼ、T5 DNAポリメラーゼ、及びシーケナーゼDNAポリメラーゼ、及びSau LF DNAポリメラーゼからなる群より選択される、請求項61から65のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記ヘリカーゼは、UvrDヘリカーゼ、CRISPR−Cas3ヘリカーゼ、Repヘリカーゼ、PcrAヘリカーゼ、E.coliヘリカーゼI、E.coliヘリカーゼII、E.coliヘリカーゼIII、E.coliヘリカーゼIV、Repヘリカーゼ、DnaBヘリカーゼ、PriAヘリカーゼ、PcrAヘリカーゼ、T4 Gp41ヘリカーゼ、T4 Ddaヘリカーゼ、SV40LargeT抗原、酵母菌RADヘリカーゼ、RecDヘリカーゼ、RecQヘリカーゼ、耐熱性T.tengcongensis UvrDヘリカーゼ、耐熱性T.thermophilus UvrDヘリカーゼ、耐熱性T.aquaticus DnaBヘリカーゼ、Ddaヘリカーゼ、パピローマウイルスE1ヘリカーゼ、古細菌MCMヘリカーゼ、真核生物MCMヘリカーゼ、及びT7 Gp4ヘリカーゼからなる群より選択される、請求項61から66のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記ヘリカーゼは、Tte−UvrD D409A/D410Aである、請求項67に記載のシステム。
- 前記CRISPR/Cas酵素、前記ヘリカーゼ、及び前記ポリメラーゼは、同一温度で、場合によっては、約37℃で機能する、請求項61から68のいずれか1項に記載のシステム。
- 試料中の標的一本鎖核酸を増幅及び/または検出するシステムであって、以下:
a)前記標的一本鎖核酸を二本鎖核酸に変換する試薬:
b)請求項61に記載の構成要素
を含む、前記システム。 - 前記検出システムは、Cas12またはCas13エフェクタータンパク質と、相当する標的分子に結合するように設計されたガイドRNAとを含むCRISPR系;及びマスキング構築物を含む、請求項61から70のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記検出システムは、Cas13酵素LwaCas13を含む、請求項71に記載のシステム。
- さらに、前記プライマー対の前記第一プライマーとプロモーター配列同一性を有する追加の増幅器プライマーを含む、請求項61に記載のシステム。
- 試料中の標的二本鎖核酸を増幅及び/または検出するためのキットであって、請求項61から69のいずれか1項に記載の構成要素、及び使用説明書のセットを含む、前記キット。
- さらに、前記試料中の前記二本鎖核酸を精製するための試薬を含む、請求項74に記載のキット。
- 試料中の標的一本鎖核酸を増幅及び/または検出するためのキットであって、請求項72に記載の構成要素、及び使用説明書のセットを含む、前記キット。
- さらに、前記試料中の前記一本鎖核酸を精製するための試薬を含む、請求項76に記載のキット。
- 前記ヘリカーゼは、Tte−UvrD D409A/D410Aである、請求項66に記載のシステム。
- 前記ヘリカーゼは、酵素中に、DからAへの置換を1つまたは複数有する、請求項66に記載のシステム。
- さらに、クラウディング剤、補因子、一本鎖結合タンパク質、及び/またはアシストタンパク質から選択される1種または複数の添加剤を含む、請求項66に記載のシステム。
- 前記クラウディング剤は、分子量20Kのポリエチレングリコールであり、任意選択で、約2.5%〜約6.5%で提供される、請求項80に記載のシステム。
- 前記補因子は、ATPであり、任意選択で、0.75〜約5mMで提供される、請求項80に記載のシステム。
- 前記一本鎖結合タンパク質は、T4 gp32または好熱性SSB(ET−SSB)から選択される、請求項80に記載のシステム。
- 前記アシストタンパク質は、dCpf1及び/またはUvsXリコンビナーゼである、請求項80に記載のシステム。
- 中温性DNAポリメラーゼ、詳細にはSau LFポリメラーゼを含む、請求項76に記載のシステム。
- 前記ヘリカーゼは、変異D403A/D404Aを持つThermoanaerobacter ethanolicus由来のPcrAヘリカーゼ、D407A/D408A変異を持つBacillus種FJAT−27231由来のPcrAヘリカーゼ、D415A/D416A変異を持つBacillus megaterium由来のPcrAヘリカーゼ、D407A/D408A変異を持つBacillus simplex由来のPcrAヘリカーゼ、またはD402A/D403A変異を持つPaeniclostridium sordellii由来のPcrAヘリカーゼである、請求項1に記載の方法または請求項61に記載のシステム。
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