KR20230131701A - miR-31-3p를 포함하는 전립선암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

miR-31-3p를 포함하는 전립선암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 miR-31-3p 또는 miR-31-3p를 포함하는 발현벡터를 포함하는, 전립선암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다. 일 양상에 따른 miR-31-3p 또는 miR-31-3p를 포함하는 발현벡터의 처리시, 전립선암 세포주를 사멸시키거나 전이 및 침윤을 억제할 수 있다. 또한 피검 시료에서 miR-31-3p의 발현 수준을 측정하거나 후보물질을 miR-31-3p 발현 세포에 처리함으로써, 전립선암 진단을 위한 정보를 제공하거나 전립선암의 예방 또는 치료를 위한 물질의 스크리닝이 가능하다.

Description

miR-31-3p를 포함하는 전립선암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Pharmaceutical composition for preventing or treating prostate cancer comprising miR-31-3p}
본 발명은 miR-31-3p 또는 miR-31-3p를 포함하는 발현벡터를 포함하는, 전립선암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 전립선암의 전이 또는 침윤 억제용 약학적 조성물 및 전립선암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법 등에 관한 것이다.
전립선암은 전립선에서 발생하는 악성 종양으로, 서양의 경우 남성암 중 가장 흔한 암으로 높은 발생 빈도를 보이며, 우리나라의 경우도 최근 전립선암의 발생 빈도가 급격히 증가하고 있다. 전립선암의 원인 중 가장 중요한 원인은 연령, 인종, 가족력 등이고, 그 외에도 호르몬, 식이습관, 제초제와 같은 화학약품 등도 발병에 중요한 요인으로 작용한다고 알려져 있다. 전립선암이 진행되면 방광 출구가 막혀 소변을 배설하지 못하게 되는 급성요폐, 혈뇨, 요실금 등이 발생하게 되며, 전이암으로 진행되면 골 전이에 의한 뼈의 통증, 척수 압박에 의한 신경증상 및 골절 등이 발생한다.
microRNA(miRNA)는 생체 내 존재하는 단백질을 합성하지 않는 비번역 RNA로서, 유전자 발현을 조절하는 역할을 한다. 특히, miRNA는 세포주기, 분화, 발달, 대사, 발암, 노화와 같은 생물학적 기능을 조절하여 생체의 항상성 유지를 매개하는 중요한 유전적 요소로 알려져 있다. 특히, 최근에는 인간 종양에서 암 발생 또는 억제 기능과 관련된 miRNA의 발현이 비정상적으로 증가하거나 감소한다는 증거가 다수 발견되고 있어, 발암 유전자를 억제할 수 있는 기능을 갖는 miRNA의 발굴은 암 치료제 개발 및 스크리닝에 있어 중요한 의미를 갖는다고 볼 수 있다. 다만, 생물정보학 도구를 이용하여 수많은 타겟 유전자들 중에서 생리 기능적으로 의미 있는 miRNA를 발굴하고 그 실제 타겟을 밝혀내는 것은 여전히 쉽지 않은 도전 과제로 남아있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 전립선암 환자에서 miRNA의 발현량을 분석하여 암의 억제 효능을 갖는 miRNA 후보군을 발굴하고 그 기능을 연구함으로써, miR-31-3p를 포함하는 전립선암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등을 완성하였으며, 이를 통해 전립선암 세포주를 사멸시키거나 전이 및 침윤을 억제할 수 있고, 나아가 전립선암 진단을 위한 정보를 제공하거나 전립선암을 예방 또는 치료하기 위한 물질의 스크리닝이 가능할 것으로 기대한다.
일 양상은 miR-31-3p 또는 miR-31-3p를 포함하는 발현벡터를 포함하는, 전립선암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 miR-31-3p 또는 miR-31-3p를 포함하는 발현벡터를 포함하는, 전립선암의 전이 또는 침윤 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 miR-31-3p의 검출을 위한 프라이머쌍 또는 프로브를 포함하는, 전립선암 진단용 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 피검 개체에서 분리된 시료에서 miR-31-3p의 수준을 측정하는 단계; 측정된 miR-31-3p의 수준이 정상 대조군에 비해 감소한 개체를 선별하는 단계; 및 선별된 개체를 전립선암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 전립선암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 후보물질을 miR-31-3p 발현 세포에 처리하는 단계; miR-31-3p의 수준을 측정하는 단계; 및 측정된 miR-31-3p 수준이 무처리 대조군에 비해 증가하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 전립선암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
일 양상은 miR-31-3p 또는 miR-31-3p를 포함하는 발현벡터를 포함하는, 전립선암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 miR-31-3p를 전립선암 세포주에 처리시, 전립선암 세포주를 사멸시키거나 전이 및 침윤을 억제할 수 있음을 확인하였고, 피검 시료에서 miR-31-3p의 발현 수준을 측정하거나 후보물질을 miR-31-3p 발현 세포에 처리함으로써, 전립선암 진단을 위한 정보를 제공하거나 전립선암의 예방 또는 치료를 위한 물질의 스크리닝이 가능함을 확인하였다.
본 명세서에서의 용어 "miRNA" 및 "miR"은 마이크로 RNA를 나타내는 것으로, "miRNA", "miR" 및 "마이크로 RNA"는 서로 혼용될 수 있다. miRNA는 21 내지 25개의 뉴클레오티드로 이루어진 길이의 짧은 비코딩 RNA로서, miRNA는 mRNA의 3'-비번역 부위(3'-UTR)에 직접 결합하여 분해하거나 단백질로의 번역을 억제한다.
본 명세서에서의 용어 "miR-31-3p"는 pre-miRNA인 miR-31의 헤어핀(hairpin) 구조의 3' arm으로부터 유래한 성숙한(mature) miRNA를 의미한다. 상기 miR-31-3p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 그 서열은 5'-ugcuaugccaacauauugccau-3'와 같다. 보다 구체적으로, 상기 miR-31-3p는 인간으로부터 유래된 hsa-miR-31-3p일 수 있고, GABBR2 유전자를 타겟으로 하며, 타겟하는 부위는 GABBR2 3' UTR로 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 공공 오믹스 데이터 중 GEO(Gene Expression Omnibus) 데이터를 이용하여 정상인 대비 전립선암 환자에게서 유의하게 감소한 miRNA를 선정하여 세포 수준에서 그 발현 정도를 확인한 결과, miR-31-3p 등을 확인하였다(도 1). 나아가 DU 145, PC-3, LNCap 각각의 전립선암 세포주에 miR-646, miR-4456 및 miR-31-3p를 처리한 결과, miR-646, miR-4456으로 처리한 세포는 거의 사멸하지 않았고, miR-31-3p로 처리한 세포주의 경우 대조군 대비 세포의 사멸을 확인하였다(도 3).
본 명세서에서의 용어 "예방"은 본 발명의 약학적 조성물을 투여함으로써 전립선암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서의 용어 "치료"는 본 발명의 약학적 조성물을 투여함으로써 전립선암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
일 실시예에 따르면, DU 145, PC-3, LNCap 전립선암 세포주에 negative control miRNA, MIR-31-3p를 각각 처리하여 각 군집의 개수를 측정한 결과, 각 전립선암 세포주에 miR-31-3p을 처리한 세포군의 경우 대조군 대비 세포의 증식이 크게 억제된 것을 확인하였다(도 4). 또한, DU 145, PC-3, LNCap 전립선암 세포주에 negative control miRNA, MIR-31-3p를 각각 처리한 후, CCK-8 분석을 통해 세포의 생존율을 확인한 결과, 각 전립선암 세포주에 miR-31-3p을 처리한 세포군의 경우 대조군 대비 세포의 증식이 크게 억제된 것을 확인하였다(도 5).
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적인 담체가 될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 명세서에서의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
다른 양상은 miR-31-3p 또는 miR-31-3p를 포함하는 발현벡터를 포함하는, 전립선암의 전이 또는 침윤 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 조성물에도 공히 적용된다.
본 명세서에서의 용어 "발현벡터"는 상기 miR-31-3p가 삽입된 재조합 발현벡터를 의미하는 것으로, 보다 구체적으로는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미할 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서의 용어 "전이"는 암세포가 암이 처음 발생한 원발부위를 떠나 다른 장기로 이동하여 성장하는 것을 의미한다.
또한, 본 명세서에서의 용어 "침윤"은 암세포 등의 유주세포가 조직에 침입하여 일반적으로 경계가 고정되어 있지 않은 병소를 나타내는 병리적인 현상을 의미한다.
일 실시예에 따르면, DU 145, PC-3, LNCap 전립선암 세포주에 negative control miRNA, MIR-31-3p를 각각 처리하여 48시간 배양한 후 8㎛의 세공 필터를 갖는 트랜스웰을 이용하여 세포 전이 및 침윤 억제 효능을 확인한 결과, miR-31-3p을 처리한 세포군의 경우 대조군 대비 전이 및 침윤 정도가 크게 억제된 것을 확인하였다(도 6, 도 7).
또 다른 양상은 miR-31-3p의 검출을 위한 프라이머쌍 또는 프로브를 포함하는, 전립선암 진단용 키트를 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 키트에도 공히 적용된다.
상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트 등일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 키트는 개체의 전립선암 진단에 사용하기 위한 시약으로서 버퍼, 지시약 또는 그 조합을 추가로 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 RT-PCR 키트는 상기 miR-31-3p를 특이적으로 검출하기 위하여 RT-PCR을 수행하는데 요구되는 필수요소를 포함할 수 있다. RT-PCR 키트는 상기 miR-31-3p의 특정 부위에 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 마이크로어레이 칩은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 마이크로어레이는 기판 표면의 구분된 영역에 상기 프로브가 높은 밀도로 고정화되어 있는 것을 의미한다. 상기 마이크로어레이는 상기 miR-31-3p의 특정 부위에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고 통상적인 마이크로어레이의 구성을 포함할 수 있다.
또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
본 명세서에서의 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 개체에서 miR-31-3p의 발현 수준을 통해 전립선암의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 이는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "프로브"는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 구체적으로, 이는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 더욱 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 따라서, miR-31-3p의 염기서열에 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 개체의 전립선암 발병 여부 또는 발병 가능성 등을 예측할 수 있다.
또 다른 양상은 피검 개체에서 분리된 시료에서 miR-31-3p의 수준을 측정하는 단계; 상기 단계에서 측정된 miR-31-3p의 수준이 정상 대조군에 비해 감소된 개체를 선별하는 단계; 및 상기 단계에서 선별된 개체를 전립선암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 전립선암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 방법에도 공히 적용된다. 상기 miR-31-3p의 수준이라 함은 miRNA의 발현량 또는 활성 수준을 모두 포함하는 개념이다.
상기 miR-31-3p의 수준을 측정하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 측정방법을 모두 사용할 수 있으며, 이에 특별히 제한되지는 않으나, 예를 들어 실시간 정량 중합효소연쇄반응, 역전사효소 중합효소연쇄반응 등을 사용할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 정상인 대비 전립선암 환자에서 miR-31-3p 수준이 유의하게 감소된 것을 확인하였는바(도 1), 피검 개체에서 분리된 시료에서 miR-31-3p 수준이 정상 대조군에 비해 유의하게 감소된 경우, 이를 기초로 전립선암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정할 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "개체"는 전립선암이 발병되거나 발병될 가능성이 있는 모든 생물체를 의미하며, 구체적으로, 전립선암 발병에 의해 miR-31-3p의 발현 수준이 변화하는 생물체를 의미한다. 구체적으로, 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있고, 보다 구체적으로는 인간일 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서의 용어 "시료"는 전립선암이 발병된 환자로부터 분리되어 상기 miR-31-3p의 발현 수준을 측정할 수 있는 직접적인 대상을 의미한다. 보다 구체적으로, 상기 시료는 세포, 기관, 세포 용해물, 전혈, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 세포외액, 체액, 소변, 분변, 조직, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 방법은 분리된 시료로부터 miR-31-3p의 발현량을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 miR-31-3p의 발현량을 측정하는 방법은 공지의 공정으로 수행될 수 있으며, 일 실시예에 따르면 상기 miR-31-3p의 발현량의 측정은 miR-31-3p cDNA의 수준을 측정하는 것이다. 예를 들어, cDNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, 대용량 중합효소반응, 서던 블랏팅(southern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있다.
또 다른 양상은 후보물질을 miR-31-3p 발현 세포에 처리하는 단계; 상기 단계의 miR-31-3p의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 단계에서 측정된 miR-31-3p 수준이 무처리 대조군에 비해 증가하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 전립선암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 상기에서 설명한 내용과 동일한 부분은 상기 스크리닝 방법에도 공히 적용된다.
본 명세서에서의 용어 "후보물질"은 miR-31-3p의 발현 수준을 향상시키는 효과를 가질 수 있을 것으로 예상되는 모든 물질을 의미하며, 상기 후보물질은 천연 물질뿐만 아니라 합성 물질을 포함할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
일 실시예에 따르면, 정상인 대비 전립선암 환자에서 miR-31-3p 수준이 유의하게 감소된 것을 확인하였고(도 1), DU 145, PC-3, LNCap 각각의 전립선암 세포주에 miR-31-3p를 처리한 세포주의 경우 대조군 대비 암세포의 사멸을 확인하였는바(도 3), 특정 후보물질을 miR-31-3p 발현 세포에 처리하였을 때 miR-31-3p의 수준이 증가되는 것이 확인될 경우, 해당 후보물질을 전립선암 예방 또는 치료제로서 결정할 수 있다.
일 양상에 따른 miR-31-3p 또는 miR-31-3p를 포함하는 발현벡터 처리시, 전립선암 세포주를 사멸시키거나 전이 및 침윤을 억제할 수 있다. 또한, 피검 시료에서 miR-31-3p의 발현 수준을 측정하거나 후보물질을 miR-31-3p 발현 세포에 처리함으로써, 전립선암 진단을 위한 정보를 제공하거나 전립선암의 예방 또는 치료를 위한 물질의 스크리닝이 가능하다.
도 1은 공공 오믹스 데이터 중 GEO(Gene Expression Omnibus) 데이터를 이용하여 정상인(대조군) 대비 전립선암 환자에서 유의하게 감소된 miRNA를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 전립선암 세포주(Du145)에 miR-646, miR-4456 및 miR-31-3p를 각각 처리한 후, 세포주의 사멸 여부를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 각각의 전립선암 세포주에 miR-31-3p를 트랜스팩션(transfection)시킨 후, qPCR 분석을 통해 miRNA 발현 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 각각의 전립선암 세포주에 negative control miRNA, miR-31-3p를 처리한 후, 세포 군집 형성 여부로부터 전립선암 세포의 증식 억제 효능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 각각의 전립선암 세포주에 negative control miRNA, miR-31-3p를 처리한 후, CCK-8 실험을 통해 전립선암 세포의 증식 억제 효능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 6 및 도 7은 각각의 전립선암 세포주에 negative control miRNA, miR-31-3p를 처리한 후, 전립선암 세포주의 전이 및 침윤 억제 정도를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 각각의 전립선암 세포주에 negative control miRNA, miR-31-3p를 처리한 후, 전립선암 줄기세포의 특징적인 구체(sphere) 형태의 형성 수준을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 miRNA prediction program을 활용하여 선별된 miR-31-3p가 타겟으로 하는 유전자 및 염기서열 부위를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 공공 오믹스 데이터를 이용한 miRNA 후보 선정
공공 오믹스 데이터 중 GEO (Gene Expression Omnibus) 데이터를 이용하여 전립선암 환자와 정상인(대조군)의 miRNA를 분석하고 선별하였다. 구체적으로, 정상인 대비 전립선암 환자에게서 유의하게 감소한 miRNA를 선정하여 세포 수준에서 그 발현 정도를 확인하였으며, 해당 miRNA로 miR-941, miR-4456, miR-31-3p, miR-646, miR-3181 및 miR-516a-5p 등을 확인하였다(도 1).
실시예 2: 전립선암 세포주 사멸 효능 평가 및 qPCR 분석을 통하여 전립선암 세포주에서 miRNA 발현량 측정
실시예 1을 통해 선별된 miR-646, miR-4456 및 miR-31-3p miR-646를 G-fectin을 사용하여 DU 145 전립선암 세포주에 트랜스팩션(transfection)시켜 48시간 후에 세포의 density를 육안으로 확인한 결과, miR-646, miR-4456으로 처리한 세포는 거의 사멸하지 않았고, miR-31-3p로 처리한 세포주의 경우 대조군 대비 세포의 사멸을 확인하였다(도 2).
이후 DU 145, PC-3, LNCap 전립선암 세포주에 miR-31-3p를 트랜스팩션 시킨 후 miRNA 발현 정도를 측정하기 위해 qPCR 분석을 진행하였다. 구체적으로, 각각의 전립선암 세포주에 negative control miRNA, miR-31-3p를 각각 처리하여 48시간 배양한 후, 트리졸(Trizol)을 이용하여 세포로부터 total RNA를 추출하였고, HB miR Multi Assay kitTM(system I)를 사용하여 microRNA, cDNA 합성 및 qPCR을 진행하였다. 그 결과, 각각의 전립선암 세포주에 miR-31-3p가 트랜스팩션 되어 대조군 대비 발현량이 증가한 것을 확인하였다(도 3)
실시예 3: miRNA에 의한 전립선암 세포의 증식 억제 효능 평가
선별된 miRNA의 전립선암 세포 증식 억제 효능을 평가하기 위해 세포 군집 형성 실험, CCK-8 실험을 진행하였다. DU 145, PC-3, LNCap 전립선암 세포주에 negative control miRNA, MIR-31-3p를 각각 처리하여 48시간 배양한 후, 이를 60mm cell dish 당 세포 100개씩 시딩(seeding)하여 2주간 배양하였다. 이후 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염료로 염색하여 각 군집의 개수를 측정하였다(도 4). 또한, DU 145, PC-3, LNCap 전립선암 세포주에 negative control miRNA, MIR-31-3p를 각각 처리하여 48시간 배양한 후, CCK-8을 처리하고 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다(도 5). 그 결과, 각 전립선암 세포주에 miR-31-3p을 처리한 세포군의 경우 대조군 대비 세포의 증식이 크게 억제된 것을 확인하였다.
실시예 4: miRNA에 의한 유방암 세포주의 전이 및 침윤 억제 효능 평가
선별된 miRNA의 전립선암의 전이 및 침윤 억제 효능을 평가하기 위해, 8㎛의 세공 필터를 갖는 트랜스웰을 이용하여 실험을 진행하였다. DU 145, PC-3, LNCap 전립선암 세포주에 negative control miRNA, MIR-31-3p를 각각 처리하여 48시간 배양한 후, 104 세포들을 트랜스웰 상부 웰에 접종하고, 10-20% FBS 배지를 하부 웰에 첨가하여 세포 전이 효능을 확인하였으며, 상부 웰의 세공 필터를 마트리겔(Matrigel)로 코팅하여 침윤 억제 효능을 확인하였다. 필터를 침투한 세포들을 고정화시키고, 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 광학 현미경 하에서 세포를 계수하였다. 그 결과, miR-31-3p을 처리한 세포군의 경우 대조군 대비 전이 및 침윤 정도가 크게 억제된 것을 확인하였다(도 6, 도 7).
실시예 5: miRNA에 의한 전립선암 세포주의 줄기세포 특징 억제 효능 평가
선별된 miRNA의 줄기세포 특징 억제 효능을 평가하기 위해, 암 줄기세포의 특징인 구체 형성 수준을 확인하였다. 구체(sphere)는 암 줄기세포의 특징적인 형태로서, 구체의 성장은 암 줄기세포의 성장을 의미한다. 구체적으로, DU 145, PC-3, LNCap 전립선암 세포주를 Ultra-Low Attachment 6-웰 플레이트에 각 웰당 3000개의 세포로 도말하고, 암 줄기세포를 배지에서 배양하였다. 암 줄기세포 배지는 bFGF 20ng/ml, EGF 20ng/ml 및 2% B-27이 보충된 DMEM/F-12로 구성되었으며, 구체의 크기가 50㎛에 이르면 negative control miRNA, miR-31-3p를 각각 처리하였다. 처리 7일 후 구체의 크기 및 개수를 확인하기 위해 현미경을 이용하여 사진을 찍어 Image J software를 사용하여 분석하였다. 그 결과, 전립선암 세포주에 miR-31-3p을 처리한 세포군의 경우 대조군 대비 구체의 크기 및 개수가 크게 억제된 것을 확인하였다(도 8).
실시예 6: miR-31-3p의 타겟 유전자 및 타겟 부위 확인
miRNA prediction program을 활용하여 선별된 miR-31-3p가 타겟으로 하는 유전자를 조사하였다. 프로그램 중 miRDB, TargetScan, Diana를 이용하여 miR-31-3p가 타겟으로 하는 후보군을 발굴하였고, qPCR 분석을 통해 GABBR2임을 확인하였다. 또한, GABBR2 3' UTR 서열 내에서 miR-31-3p가 타겟하는 염기서열 부위를 확인하였다(도 9).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating prostate cancer comprising miR-31-3p <130> PN143296KR <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 ugcuaugcca acauauugcc au 22 <210> 2 <211> 7 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 gcauagc 7 <210> 3 <211> 8 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 gcauagca 8

Claims (7)

  1. miR-31-3p 또는 miR-31-3p를 포함하는 발현벡터를 포함하는, 전립선암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. miR-31-3p 또는 miR-31-3p를 포함하는 발현벡터를 포함하는, 전립선암의 전이 또는 침윤 억제용 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 miR-31-3p는 GABBR2 3'UTR의 1777 번째부터 1783 번째의 핵산서열 또는 2069 번째부터 2076 번째의 핵산서열을 타겟으로 하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 발현벡터는 비-바이러스성 벡터 또는 바이러스성 벡터인 것인, 약학적 조성물.
  5. miR-31-3p의 검출을 위한 프라이머쌍 또는 프로브를 포함하는, 전립선암 진단용 키트.
  6. (a) 피검 개체에서 분리된 시료에서 miR-31-3p의 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 측정된 miR-31-3p의 수준이 정상 대조군에 비해 감소된 개체를 선별하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 선별된 개체를 전립선암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 전립선암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
  7. (a) 후보물질을 miR-31-3p 발현 세포에 처리하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 miR-31-3p의 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 측정된 miR-31-3p 수준이 무처리 대조군에 비해 증가하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 전립선암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.
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