WO2005028647A1

WO2005028647A1 - 核酸プローブ、核酸チップ、標的核酸検出方法、薬剤スクリーニング方法、標的核酸検出装置及び遺伝子診断方法

Info

Publication number: WO2005028647A1
Application number: PCT/JP2004/013740
Authority: WO
Inventors: Yasuhiro Aoyama; Shinsuke Sando; Toshinori Sasaki; Atsushi Narita
Original assignee: Kyoto University
Priority date: 2003-09-22
Filing date: 2004-09-21
Publication date: 2005-03-31
Also published as: US20080124706A1; EP1717313A4; JPWO2005028647A1; EP1717313A1

Abstract

　本発明の核酸プローブは、微量な標的核酸を高感度、高精度かつ高速に検出するための核酸プローブであって、前記標的核酸にハイブリダイゼーションした後に構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブはハイブリダイズの結合力が減少し、前記標的核酸から解離するように設計されている。また、標的核酸にハイブリダイゼーション可能であり、該標的核酸にハイブリダイゼーションした際に、切断されて、少なくともいずれか一方が前記標的核酸から解離可能な第一プローブ断片及び第二プローブ断片を生成する切断部と、シグナルを発生させるシグナル発生部と、を有してなる。また、該標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに切断される切断部を有し、標的核酸にハイブリダイゼーションするまでは、分子内で一部が互いにハイブリダイゼーションしてロック構造を形成している。

Description

明細書

核酸プローブ、核酸チップ、標的核酸検出方法、薬剤スクリーニング方法、標的核酸検出装置及び遺伝子診断方法

技術分野

[0001] 本発明は、標的核酸にハイブリダィズした核酸プローブ力生ずるシグナルを増幅させることにより、標的核酸に対する選択性が極めて高ぐ微量な標的核酸を高感度でかつ正確に検出可能な核酸プローブ、該核酸プローブを固定した核酸チップ、並びに、該核酸プローブを用いた、標的核酸検出方法、薬剤スクリーニング方法、標的核酸検出装置及び遺伝子診断方法に関する。

背景技術

[0002] 近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発され、特に医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。また、遺伝子診断により患者個人ごとに対応したテーラーメード医療も可能となってきており、例えば製薬分野においては、遺伝子情報に基づいて抗体やホルモンなどのタンパク質を特定し、薬剤として利用している。更に、農業や食品関連分野などにおいても多くの遺伝子情報を利用した製品が創り出されている。また、核酸プローブ、 D NAチップなどを用いて得た患者の遺伝子情報を、コンピューターを用いてデータべースと比較乃至対比して診断を行う遺伝子診断の発想が生まれてきて!、る。この遺伝子診断をベースにして、病気の予後判定、先天的因子による疾病の危険度の判定、テーラーメード医薬の投与など、従来では想定し得な力つた事業が行われようとしている。

[0003] 前記遺伝子診断にお!、て用いる前記核酸プローブや前記 DNAチップでは、微量な標的核酸を分析するのは困難であるため、前記遺伝子診断を行うには、前記標的核酸を PCR法によって増幅しなければならない。ところが、微量な前記標的核酸の増幅に前記 PCR法を用いる場合には熟練を要するため、従来は、該標的核酸の増幅が不十分で、該標的核酸を検出できないケースが多く発生してしまうという問題があった。この問題を克服し、微量な標的核酸を高感度でかつ高速に分析可能な技術の開発が、前記遺伝子診断の発展に必須である。このような、微量な標的核酸を高感度でかつ高速に分析可能な技術は、前記遺伝子診断のみならず輸血についても必要となる。輸血を行う際には、血液が HIV、 HBV、 HCVなどのウィルスに感染していないかどうかの検査が必要である力従来より採用されている、抗体ビーズ法、ゥェスタンプロット法などの免疫学的検査の場合、前記ウィルスに対する抗体を検出することになり、該抗体は前記ウィルスに感染後 1一 2ヶ月間は生成されないため、ウィルス感染の初期においては前記免疫学的検査が擬陰性になる、いわゆるウィンドウピリォドの発生を防ぐことができないという問題がある。このため、ウィルス感染の初期など、微量にしか存在しな、ウィルス (標的核酸)を高感度でかつ高速に分析可能な技術は、前記輸血における前記ウィンドウピリオドの発生を防ぐために必要であり、更に、あらゆる感染症、精神病、癌等の早期発見、早期治療に役立ち極めて重要である

[0004] このような状況において、前記 PCR法によることなぐシグナルを増幅させることにより、微量な標的核酸を検出可能な核酸プローブが開示されている（特表 2003— 525 631参照）。この核酸プローブの場合、標的核酸とハイブリダィゼーシヨンするセンサ一分子と、該センサー分子が有する DNAザィム活性により、酵素反応的に切断され、標識がシグナルを発生可能なリポーター分子とを併用し、前記リポーター分子が前記センサー分子より連続的に切断されることにより、前記レポーター分子のシグナルが増幅され、増幅された該シグナルを検出することにより、微量な前記標的核酸の存在を検出することができる。しかし、該核酸プローブの場合、前記標的核酸とハイプリダイゼーシヨンする前に前記リポーター分子が、前記センサー分子により切断されてしまうという、擬陽性反応が生じてしまう。また、前記センサー分子が、標的核酸の塩基配列に近、核酸を標的核酸であると誤認してハイブリダィゼーシヨンしてしま、、標的核酸の選択性が十分でないという問題がある。即ち、この方法の場合、操作が煩雑な上に、感度及び精度が十分ではなぐ誤検出等があり、信頼性が低いという問題がある。

[0005] 一方、前記テーラーメード医薬の実現等のためには、投与した薬剤が生細胞に及ぼす影響 (遺伝子の発現及び抑制）を定量的かつ高速に診断可能な技術の開発が必須であるが、本発明者らは、標的核酸に対する選択性が非常に高ぐ酵素や試薬などを必要とせず、生細胞への導入が可能であり、細胞内の铸型となる DNA又は R NA上で化学反応を起こし、反応の進行に付随してシグナルを発することができ、細胞内で発現される DNAや RNAの細胞内での検出乃至配列解析を可能とした核酸プローブ「QUALプローブ」を開発した (非特許文献 1参照）。しかし、この「QUALプローブ」を用ヽる場合、前記 RNA又は DNA 1分子カゝら前記シグナルを 1つしカゝ発生させることができないため、細胞中に多数存在する rRNA等の検出は容易である力極微量しか存在しない mRNAなどは検出が非常に困難であるという問題がある。

[0006] 非特許文献 1 : Imaging of RNA in Bacteria with Self- Ligating Quenched

Probes sando S et al. J. AM. CHEM Soc. 2002,124,9686

発明の開示

[0007] 本発明は、従来における問題を解決し、ウィルス感染の初期など、微量にしか存在しな!/、ウィルス (標的核酸)を高感度でかつ高速に分析可能な技術、生細胞に及ぼす影響 (遺伝子の発現及び抑制)を定量的かつ高速に診断可能な技術、前記核酸プローブ「QUALプローブ」では達成できなかったシグナルの増幅を可能にする技術などを開発し、以下の目的を達成することを課題とする。

即ち、本発明は、標的核酸にハイブリダィズした核酸プローブ力生ずるシグナルを増幅させることにより、標的核酸に対する選択性が極めて高ぐ微量な標的核酸を高感度、高精度かつ高速にしかも簡便に検出乃至分析可能であり、該標的核酸が極微量で短寿命等であったとしてもその存在乃至挙動を測定可能であり、遺伝子診断、食中毒菌の存在検査、虫歯乃至歯周病の診断、血液検査等に好適な核酸プローブを提供することを目的とする。

また、本発明は、該核酸プローブを担体に固定することにより、微量な標的核酸を高感度、が可能であり、遺伝子診断、食中毒菌の存在検査、虫歯乃至歯周病の診断、血液検査等に好適な核酸チップを提供することを目的とする。

また、本発明は、前記核酸プローブを用いることにより、微量な標的核酸を高感度、高精度かつ高速検出乃至分析が可能であり、遺伝子診断、食中毒菌の存在検査、虫歯乃至歯周病の診断、血液検査等に好適な標的核酸検出方法及び標的核酸検出装置を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記核酸プローブを用いることにより、薬剤の投与効果を分析可能であり、所望の薬剤を効率良くスクリーニング可能な薬剤スクリーニング方法を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記核酸プローブを用いることにより、特定疾患に関連する遺伝子の存在を高効率かつ高精度で診断可能な遺伝子診断方法を提供することを目的とする。

核酸プローブ

本発明の核酸プローブとしては、以下の第一一第六までの核酸プローブが挙げられる。

前記第一の核酸プローブは、標的核酸を検出するための核酸プローブであって、該核酸プローブは前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブはハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少し、前記標的核酸から解離するよう設計されて!、ることを特徴とする。該第一の核酸プローブは、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際には、構造変化を生ずる。すると、前記標的核酸から解離して、発光等のシグナルが生ずる。

前記第二の核酸プローブは、標的核酸を検出するための核酸プローブであって、前記標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位と、自己核酸酵素を形成可能な核酸酵素形成部位と、を有することを特徴とする。該第二の核酸プローブは、前記相補部位が前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンすると、構造変化を起こし、前記核酸酵素形成部位が自己核酸酵素を形成可能である。すると、該核酸プローブは前記自己核酸酵素により切断等され、前記標的核酸から解離して、例えば、発光等のシグナルが生ずる。

前記第三の核酸プローブは、標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能であり、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に構造が変化可能な構造可変部を有してなり、該構造可変部の構造が変化したときに該標的核酸力解離可能であることを特徴とする。該第三の核酸プローブは、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際には、構造可変部の構造が変化する。すると、該核酸プローブが切断等されて、前記標的核酸から解離して、例えば、発光等のシグナルが生ずる。

前記第四の核酸プローブは、標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能であり、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンしたときに切断される切断部を有してなり、標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記切断部に対する切断活性を有する切断活性領域を形成可能であることを特徴とする。該第四の核酸プローブは、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際には、前記切断活性領域が形成され、前記切断部が切断される。すると、該核酸プローブが切断等されて、前記標的核酸から解離して、例えば、発光等のシグナルが生ずる。

前記第五の核酸プローブは、標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能であり、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に、切断されて前記標的核酸力解離可能な第一プローブ断片及び第二プローブ断片を生成する切断部と、シグナルを発生させるシグナル発生部と、を有してなることを特徴とする。該第五の核酸プローブは、標的核酸にハイブリダィゼーシヨンする前にお、ては、前記シグナル発生部力シグナル (発光等）が発生せず、前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンした際には、前記シグナル発生部力シグナル (発光等）が発生する結果、該シグナル (発光等)を検出することにより、前記標的核酸の存在が検出される。なお、前記第五の核酸プローブも、次々に標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンしては、前記シグナル (発光等）を生じ、該シグナルが短時間で増幅されるため（一つの標的核酸力多数のシグナル (発光等）が生ずるため）、前記標的核酸の量が極微量であったとしてもその存在が高感度、高精度かつ高速で検出される。

前記第六の核酸プローブは、標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能であり、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンしたときに切断される切断部を有し、標的核酸にノ、ィブリダィゼーシヨンするまでは、分子内で一部が互いにハイブリダィゼーシヨンして口ック構造を形成していることを特徴とする。該第六の核酸プローブは、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンする前においては、分子内で一部が互いにノ、イブリダィゼーシヨンしてロック構造を形成して、るが、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際には、前記ロック構造における、互いにハイブリダィゼーシヨンしている部分の相補的結合が解離する。すると、前記切断部が切断され易くなり、該切断部が切断されて、発光等のシグナルが生ずる。

前記第一力第六の核酸プローブは、前記標的核酸に次々にハイブリダィゼーシヨンしては、その度に構造が変化し、切断等されて発光等のシグナルを生じ、該シグナルが短時間で増幅されるため（一つの標的核酸力多数のシグナルが生ずるため )、前記標的核酸の量が極微量であったとしてもその存在が高感度、高精度かつ高速で検出される。

[0009] 核酸チップ

本発明の核酸チップは、本発明の前記核酸プローブを担体に固定してなることを特徴とする。該核酸チップに固定された前記核酸プローブは、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンする前においては、前記シグナルが生じないが、前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンした際には、前記シグナル発生部からシグナル (発光等）が生ずる結果、例えば、該シグナル (発光等)の有無を検出することにより、前記標的核酸の存在の有無が検出される。本発明の核酸チップにおいては、前記標的核酸の量が極微量であったとしてもその存在が高感度、高精度かつ高速で検出される。

[0010] 標的核酸検出方法

本発明の標的核酸検出方法としては、以下の第一一第三までの標的核酸検出方法が挙げられる。

前記第一の標的核酸検出方法は、核酸プローブを用いて標的核酸を検出する核酸検出方法であって、前記核酸プローブは前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブはハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少し前記標的核酸から解離するよう設計されていることを特徴とする。前記第二の標的核酸検出方法は、標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位と、自己核酸酵素を形成可能な核酸酵素形成部位と、を有する核酸プローブを用いる標的核酸の検出方法であって、標的核酸に前記核酸プローブを相補的に結合させるハイブリダィゼーシヨン工程と、ハイブリダィゼーシヨン形成の後、前記自己核酸酵素が形成され前記核酸プローブの構造が変化し、その結果ハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少して該核酸プローブが前記標的核酸から解離する解離工程と、前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部を検出する検出工程と、を有することを特徴とする。該標的核酸検出方法では、前記ノ、イブリダィゼーシヨン形成工程にぉ、て、前記標的核酸に前記核酸プローブが相補的に結合させられる。前記解離工程において、ハイブリダィゼーシヨン形成後、前記自己核酸酵素が形成され、該核酸プローブの構造が変化し、その結果ハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少し、該核酸プローブが前記標的核酸力解離する。前記検出工程において、前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部が検出される。その結果、前記標的核酸の存在の有無が検出される。

前記第三の標的核酸検出方法は、本発明の前記核酸プローブを標的核酸にハイブリダィゼーシヨンさせるノ、イブリダィゼーシヨン工程と、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブ力発生したシグナルを検出することにより該標的核酸の存在を検出する標的核酸検出工程と、を含むことを特徴とする。該標的核酸検出方法では、前記ハイブリダィゼーシヨン工程において、標的核酸に本発明の前記核酸プローブがハイブリダィゼーシヨンする。前記標的核酸検出工程にお！ヽて、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブ力発生したシグナルの有無を検出することにより該標的核酸の存在の有無が検出される。

なお、該標的核酸検出工程が、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブが切断されて生じた、第一プローブ断片及び第二プローブ断片の内、該第一プローブ断片に存在する発光部の発光の有無を検出することにより前記標的核酸の存在の有無を検出する標的核酸検出工程である場合には、該標的核酸検出工程において、ハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブにおける前記切断部が切断されて、前記第一プローブ断片及び前記第二プローブ断片に分割され、該第一プローブ断片及び第二プローブ断片が前記標的核酸から離れる結果、前記消光部と前記発光部とが互いに離れ、前記第一プローブ断片に存在し、前記消光部の作用を受けなくなった前記発光部が生ずる発光を検出することにより、前記標的核酸の存在の有無が検出される。

薬剤スクリーニング方法

本発明の薬剤スクリーニング方法は、本発明の前記核酸プローブを、薬剤投与により発現した標的核酸にハイブリダィゼーシヨンさせるハイブリダィゼーシヨン工程と、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブ力発生したシグナルの有無を検出することにより該標的核酸の存在の有無を検出する標的核酸検出ェ程と、を含み、前記標的核酸の存在の有無により薬剤をスクリーニングすることを特徴とする。

前記薬剤スクリーニング方法では、前記ハイブリダィゼーシヨン工程において、薬剤投与により標的核酸が発現した場合には該標的核酸に本発明の前記核酸プローブ力 Sハイブリダィゼーシヨンするが、薬剤投与により標的核酸が発現しな力た場合には該標的核酸に本発明の前記核酸プローブはハイブリダィゼーシヨンしな、。前記標的核酸が発現した場合には、前記標的核酸検出工程において、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンしたことに起因して前記核酸プローブ力も発生したシグナルを検出することにより該標的核酸の存在が検出される。この標的核酸の発現の有無に基づき所望の薬剤がスクリーニングされる。

なお、前記標的核酸検出工程が、該標的核酸にハイブリダィズした後に前記核酸プローブが切断されて生じた、第一プローブ断片及び第二プローブ断片の内、該第一プローブ断片に存在する発光物質の発光を検出することにより前記標的核酸の存在を検出する標的核酸検出工程である場合には、該標的核酸検出工程において、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした後、前記核酸プローブにおける前記切断部が切断されて、前記第一プローブ断片及び前記第二プローブ断片に分割され、該第一プローブ断片及び第二プローブ断片の少なくともいずれかが前記標的核酸から離れる結果、前記消光部と前記発光部とが互いに離れ、前記第一プローブ断片に存在し、前記消光部の作用を受けなくなった前記発光部が生ずる発光を検出することにより、前記標的核酸の存在が検出される。その結果、前記薬剤投与による前記標的核酸の発現の有無が検出され、この標的核酸の発現の有無に基づき所望の薬剤がスクリーニングされる。

標的核酸検出装置

本発明の標的核酸検出装置としては、以下の第一一第二までの標的核酸検出装置が挙げられる。

前記第一の標的核酸検出装置は、試料中の標的核酸を検出するための核酸プローブが担体に固定された核酸分析用デバイスであって、前記核酸プローブは標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブはハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少し前記標的核酸力解離するよう設計されていることを特徴とする。

前記第二の標的核酸検出装置は、本発明の前記核酸プローブを標的核酸にハイブリダィゼーシヨンさせるノ、イブリダィゼーシヨン手段と、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブ力発生したシグナルを検出することにより該標的核酸の存在を検出する標的核酸検出手段と、を含むことを特徴とする。なお、該第二の標的核酸検出装置は、遺伝子情報データベースを格納するデータベース部と、標的核酸検出手段の検出結果データと、前記データベース部に格納された遺伝子情報データとを比較し分析するデータ分析部と、を有する第一の形態、及び、インタ一ネットに通信可能であり、該インターネット上の遺伝子情報データベースにアクセス可能な通信部と、標的核酸検出手段の検出結果データと、前記インターネット上の遺伝子情報データベースの遺伝子情報データとを比較し分析するデータ分析部と、を有する第二の形態の、ずれかであるのが好ましぐ前記遺伝子情報データベース力特定の疾患に関する、健常人の遺伝子情報と患者の遺伝子情報とを含むのがより好ましい。

前記標的核酸検出装置では、前記ハイブリダィゼーシヨン手段により、標的核酸に本発明の前記核酸プローブを前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンさせる。前記標的核酸検出手段により、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブ力発生したシグナルが検出され、該標的核酸の存在が検出される。

なお、前記標的核酸検出手段が、該標的核酸にハイブリダィズした際に前記核酸プローブが切断されて生じた、第一プローブ断片及び第二プローブ断片の内、該第一プローブ断片に存在する発光物質の発光を検出することにより前記標的核酸の存在を検出する標的核酸検出手段である場合には、該標的検出手段が、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした後に前記核酸プローブにおける前記切断部が切断されて、前記第一プローブ断片及び前記第二プローブ断片に分割され、該第一プローブ断片及び第二プローブ断片が前記標的核酸から離れる結果、前記消光部と前記発光部とが互いに離れ、前記第一プローブ断片に存在し、前記消光部の作用を受けなくなった前記発光部が生ずる発光を検出する。その結果、前記標的核酸の存在が検出される。

[0013] 遺伝子診断方法

本発明の遺伝子診断方法は、本発明の前記標的遺伝子検出装置を用い、被検者における、特定疾患に関する標的核酸の発現量を定量する標的核酸発現量定量ステツプと、該被検者における前記特定疾患に関する標的核酸の発現量と、遺伝子情報データベースに含まれる、該特定疾患に関する標的核酸の健常人の発現量及び患者の発現量とをデータ分析部により比較し、該被検者が前記特定疾患の患者であるか否かを診断する診断ステップと、を含むことを特徴とする。

前記遺伝子診断方法では、前記標的核酸発現量定量ステップにおいて、本発明の前記標的遺伝子検出装置を用いて、被検者における、特定疾患に関する標的核酸の発現量が定量される。前記診断ステップにおいて、前記被検者における前記特定疾患に関する標的核酸の発現量と、遺伝子情報データベースに含まれる、該特定疾患に関する標的核酸の健常人の発現量及び患者の発現量とがデータ分析部により比較され、該被検者が前記特定疾患の患者であるか否かが診断される。

図面の簡単な説明

[0014] [図 1]図 1は、本発明の核酸プローブを用いた本発明の標的核酸検出方法のプロセスの一例を示す概念図である。

[図 2]図 2は、本発明の核酸プローブ (実施例 1)の一例を示す概略説明図である。

[図 3]図 3は、本発明の核酸プローブ（実施例 1)が標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンした状態を示す模式図である。 [図 4]図 4は、本発明の核酸プローブを用いた本発明の標的核酸方法を実施した実施例 1における結果を示すグラフである。

[図 5A]図 5Aは、標的核酸にハイブリダィゼーシヨンするまではステムループ構造をとる本発明の核酸プローブの一例 (右図）と、該核酸プローブが標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした状態 (左図）とを示す概念図である。

[図 5B]図 5Bは、図 5Aの核酸プローブの一次元構造を示す模式図である。

[図 6]図 6は、ステムループ構造をとる本発明の核酸プローブを用いた本発明の標的核酸検出方法のプロセス (発光増幅)の一例を示す概念図である。

[図 7]図 7は、本発明の核酸プローブを用いた本発明の薬剤スクリーニング方法の一例を示す概念図である。

[図 8]図 8は、本発明の核酸プローブを用いた本発明の薬剤スクリーニング方法の他の例を示す概念図である。

[図 9]図 9は、本発明の核酸プローブを用いた本発明の標的核酸検出装置の一例を示すのブロック図である。

[図 10]図 10は、本発明の核酸プローブを用いた本発明の標的核酸検出方法を実施した実施例 3の結果 (発光の検出結果)を表す写真データである。

[図 11]図 11は、本発明の核酸プローブを用いた本発明の標的核酸検出方法を実施した実施例 5の結果を示す写真データである。

[図 12]図 12は、本発明の核酸プローブを用いた本発明の標的核酸検出方法を実施した実施例 6におけるハイブリダィゼーシヨンの形態を示す概念図である。

[図 13]図 13は、本発明の核酸プローブを用いた本発明の標的核酸検出方法を実施した実施例 6の結果を示す写真データである。

発明を実施するための最良の形態

(核酸プローブ）

本発明の核酸プローブは、標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能であり、該核酸プローブとしては、上記第一一第六の核酸プローブが好ましぐ該第一一第六の核酸プローブの特徴を 2つ有するものがより好ましぐ 3つ有するものが特に好ましい。なお、本発明の核酸プローブは、該第一一第六の核酸プローブの特徴を有すること以外には、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択したその他の部などを有していてもよい。

[0016] 以下、本発明の核酸プローブについて図面を参照しながら説明する。図 1は、本発明の核酸検出方法における反応サイクルの一例を示す概念図であり、図 2は、本発明の核酸プローブの一例を示す模式図であり、図 3は、本発明の核酸プローブが標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした状態を示す模式図であり、図 4は、本発明の一実施例による標的核酸の検出反応の結果を示すグラフである。

[0017] 前記第一の核酸プローブは、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブはハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少し、前記標的核酸力解離するよう設計されている。

このような構成とすることにより、標的核酸の存在を示すシグナルが増幅され検出感度が向上する。

例えば、図 1に示すように、標的核酸 1の分子上で、核酸プローブの結合乃至解離を含むサイクルが形成される。図 1において、核酸プローブ 2と標的核酸 1とが接触すると、相互にハイブリダィズし複合体を形成する (A)。ノ、イブリダィゼーシヨンした核酸プローブ 2は自己核酸酵素 7を形成し、自己核酸酵素 7は、特定配列を有する切断部位 12で切断する (B)。切断された核酸プローブは、標的核酸 1との結合状態を維持できず自発的に解離する (C)。このとき蛍光物質 Fは、消光物質 Qとの相互作用を喪失し蛍光を発する。フリーになった標的核酸 1には、再び新たな核酸プローブ 2がハイブリダィゼーシヨンし、プロセス (A)— (C)を繰返すことにより蛍光シグナルが増幅される。このように、 1分子の標的核酸上で、検出シグナルの増幅が行われるため、標的核酸 1が、極微量あるいは短寿命の場合であっても高感度で検出することができる。

[0018] また、この反応サイクルにおいて、制限酵素やィ匕学物質等を使用しないため、本発明の核酸プローブを直接生きた細胞に導入し、プロセス (A)— (C)を進行させることも可能である。したがって、本発明によれば、細胞内で遺伝子等の標的核酸の「認識」、「シグナル増幅」、「診断」ができ、例えば投与された薬剤とそれによる遺伝子の発現乃至抑制との関係を直接的に観察するスクリーニングが可能となる。更に、 PCR等による遺伝子増幅や反応温度の制御等の必要がないため、実験室や分析機器等の特殊な機器や設備が不要となり、家庭内や学校、職場等、医療乃至研究施設外においても遺伝子診断を行なうことができる。

[0019] ここで、本発明でいう「標的核酸」とは、定量的、定性的検出、又は単なる検出を目的とする核酸又は遺伝子を意味し、精製、未精製のいずれの状態のものをも含む。また標的核酸は、その種類はいかなるものでもよぐ RNA、 DNA、 PNA及び人工的に修飾された核酸等を挙げることができる。標的核酸の塩基配列は、例えば、マキサム.ギルバート法、ジデォキシ法等により決定することができる。本発明の核酸プローブの構造変化は、自己核酸酵素の形成を含むことが好ましい

。これにより、標的核酸 1分子上で、核酸プローブの結合乃至解離からなるサイクルを容易に形成することができ、標的核酸の検出感度が向上する。また、核酸プローブを切断等するために制限酵素等を使用しないため、本発明の核酸プローブを細胞内に導入するだけで特異的酵素反応を利用して、細胞内の標的核酸を容易に検出することがでさる。

また、本発明の核酸プローブは標識物質を有するものであることが好ましい。これによって、標的核酸の存在をより容易に確認することができる。更に、力かる標識物質は、前記核酸プローブが前記標的核酸から解離する前後で異なるシグナルを発するものであることがより好ましい。標識物質に関する詳細は後述する。

[0020] 前記第二の核酸プローブは、図 2及び図 3に示すように、標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位 3a、 3bと、自己核酸酵素を形成可能な核酸酵素形成部位 6と、を備えている。

[0021] 前記第三の核酸プローブは、図 2及び図 3に示すように、前記標的核酸にハイプリダイゼーシヨンした際に構造が変化可能な構造可変部としての切断部 12を有してなり、該構造可変部の構造が変化したときに、即ち切断部 12が切断されたときに、該標的核酸力解離可能である。

[0022] 前記第四の核酸プローブは、図 2及び図 3に示すように、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンしたときに切断される切断部 12を有してなり、標的核酸にノ、イブリダィゼた際に切断部 12に対する切断活性を有する切断活性領域 7を形成可能である。

[0023] 前記第五の核酸プローブは、図 2及び図 3に示すように、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に、切断されて前記標的核酸力解離可能な第一プローブ断片及び第二プローブ断片を生成する切断部 12と、シグナルを発生させるシグナル発生部 8と、を有してなる。

[0024] なお、図 2がー本鎖に伸ばした状態の図である、図 3が標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンした状態の図である。図 2及び図 3に示すように、核酸プローブ 2は、標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能であり、塩基配列 3a及び 3bと、核酸酵素形成部位 6 と、シグナル発生部 8である前記発光部としての発光物質 Fと、切断部 12と、前記シグナル発生部である前記消光部としての消光物質 Qとを有してなる。

塩基配列 3a及び 3bは、標的核酸 1に対してハイブリダィゼーシヨン可能な領域であり、核酸プローブ 2の両端に位置している。

[0025] 図 2に示す核酸酵素形成部位 6は、図 3に示すように、標的核酸 1に核酸プローブ 2 力 Sハイブリダィゼーシヨンした際に切断活性領域 7を形成し、切断部 12に対する切断活性を発現する。なお、このとき、核酸プローブ 2内では、分子内で一部が、具体的には切断部 12を中心（間）にしてその両側の一部が、それぞれハイブリダィゼーションしている（図 3中の Y及び Z)。

切断部 12は、リボ核酸 (ヌクレオチドにおける糖がリボース)で形成されており、切断活性領域 7が発現するリボザィム活性により切断可能である。

発光物質 Fと消光物質 Qとは、図 2及び図 3に示すように、切断部 12を中心（間）にして互、に隣接して位置して、る。

[0026] これにより、前記第二一第五の各核酸プローブは、標的核酸をァロステリツタエフェクタ一とする、例えば自己切断型遺伝子診断プローブとして機能することができる。自己切断したヌクレオチドの各断片は、等温下ではそれぞれ標的核酸との相補的結合 (ハイブリダィズ)を維持することができず自発的に解離する。その後、新たな核酸プローブが標的核酸にハイブリダィズし、自己核酸酵素を形成した後解離する。こうして図 1に示すような触媒サイクルが順次繰り返されることにより、蛍光シグナル等に代表される検出シグナルが増幅されるため、 PCR等の核酸増幅等を行うことなぐ従来の核酸測定法では非常に困難であった微量の核酸や遺伝子等も容易に検出可能となった。また、前記第二一第五の各核酸プローブは、自己核酸酵素を形成するため特別の酵素や試薬の添加を必要とせず、生きた細胞への導入を可能にするものである。したがって、前記第二一第五の各核酸プローブを用いれば、細胞内における 1分子レベルの核酸や遺伝子の挙動をも観察することができる。

換言すれば、核酸プローブ 2は、図 1に示すように、標的核酸 1が存在すると、標的核酸 1に対してハイブリダィゼーシヨン可能である相補的な塩基配列 3a及び 3bをその両端に有しているため（図 2及び図 3参照）、塩基配列 3a及び 3bが核酸配列 1にハイブリダィゼーシヨンすると（図 1中の A)、核酸酵素形成部位 6が三次元のコンファーメーシヨンをとることにより切断活性領域 7が形成されて、切断部 12に対する切断活性 (リボザィム活性)が生じ、切断部 12 (リボース部分)が切断（自己切断)され、発光物質 Fを有する第一プローブ断片と、消光物質 Qを有する第二プローブ断片とに分割され (図 1中の B)、それぞれが標的核酸 1から解離される結果、互いに隣接して位置していた発光物質 Fと消光物質 Qとが互いに離れて位置するようになる（図 1中の C )。発光物質 Fと消光物質 Qとは、互いに隣接して位置していたときには、両者の間における光共¹] ェ不ノレ³ Γ ~~ (fluorescence resource energy transfer： FREl 移動により、発光物質 Fの発光が消光物質 Qの作用により消光状態 8にあったのが、該蛍光共鳴エネルギー移動がなくなり、消光物質 Qの消光作用が働かなくなり、発光物質 Fが発光を生ずるようになる（図 1中の C)。この発光は、前記核酸プローブが標的核酸 1にハイブリダィゼーシヨンする度に生じ、この反応が繰り返されて (catalytic process,図 1中の A— Cのサイクル）、増幅される。即ち、核酸プローブ 2が切断されると、前記第一プローブ断片及び前記第二プローブ断片は、ハイブリダィゼーションを維持することができず、標的核酸 1から解離すると、標的核酸 1はフリーの状態となるため、新たな核酸プローブ 2がハイブリダィゼーシヨンし、図 1中の A— Cのサイクルが繰り返される。核酸プローブ 2は、標的核酸 1をァロステリックエフェクターとすることができる。このため、標的核酸 1が極微量（く lOngZ w l)あるいは短寿命であつても、前記核酸プローブによって生ずる発光を増幅させることにより、目視等にて容易にその存在を検出することができる。 [0028] この場合、従来のような PCR法などを用いて核酸増幅を行う必要がなぐ従来では測定不可能であった極微量な標的核酸を高感度、高精度かつ高速で検出することができる。また、制限酵素や化学物質などを使用しないため、核酸プローブ 2を直接、生細胞に導入しノヽイブリダィゼーシヨンさせることができ、ウィルスに対してハイブリダイゼーシヨンさせることができる。したがって、核酸プローブ 2によれば、細胞内に存在する極微量の標的核酸を検出することができる。

[0029] 図 5A及び図 5B並びに図 6は、前記第六の核酸プローブの一例を示す概略説明図である。前記第六の核酸プローブは、図 5A及び図 5B並びに図 6に示すように、標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能であり、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンしたときに切断される切断部 (rA)を有し、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンするまでは、分子内で一部が互いにハイブリダィゼーシヨンしてロック構造 (ステムループ構造)を形成している。

[0030] この核酸プローブは、より詳しくは、前記標的核酸とハイブリダィゼーシヨン可能な 2 つの塩基配列（5，末端の 5， XGTAGGAGT3，及び 3，末端の 3， YGTGCCAGG5 ' )と、切断活性領域と、前記シグナル発生部である前記発光部としての発光物質 Fと、切断部 (rA)と、前記シグナル発生部である前記消光部としての消光物質 Qと、ァデニン (A)オリゴマー及びチミン (T)オリゴマーが互いにハイブリダィゼーシヨンしてなるロック構造 (ステムループ構造）と、を有してなる。

[0031] この核酸プローブは、図 5A及び図 5B並びに図 6に示すように、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンする前までは、前記ロック構造 (ステムループ構造)を形成して!/ヽる。なお、前記アデニン (A)オリゴマーは、前記核酸プローブの 5'末端側の最末端に存在し、前記チミン (T)オリゴマーは、前記核酸プローブの 3'末端側ではあるが最末端には存在していないため、図 5A及び図 5B並びに図 6に示すように、前記ロック構造はステムループ構造をとる。そして、前記ステムループ構造を有している間の前記核酸プローブは、前記 3'末端側が該ステムループ構造カゝら突出した状態となっている。そして、このステムループ構造を有している間（前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンするまでの間）の該核酸プローブは、前記切断活性領域を形成しておらず、前記切断部 (rA:塩基がアデニンで、糖がリボースの構造）における切断は起こらない。このため、該核酸プローブは、前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンする前に、切断活性領域が形成されて前記切断部を切断してしまうことがなぐ誤検出等のおそれがない。

[0032] 本発明にお、ては、このようなロック構造 (ステムループ構造)を有し、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンする前に前記切断部の切断活性を発現しない本発明の核酸プローブのことを、「Locked TASC」プローブと称することがある。一方、上述したような、前記ステムループ構造を有していない本発明の核酸プローブのことを、「 TASCJプローブと称することがある。

[0033] なお、この核酸プローブ、即ち前記「Locked TASC」プローブの場合には、図 5B 及び図 6に示すように、前記ロック構造 (ステムループ構造)をとるとき、自己核酸酵素を形成し得ないので前記切断活性領域を形成することはなぐ逆に、前記切断活性領域を形成している間は、前記ロック構造 (ステムループ構造)をとることはない。前記ロック構造 (ステムループ構造)をとつて!/ヽる形状乃至構造と、前記切断活性領域を形成する形状乃至構造との間では、前記核酸プローブが大きな形状乃至構造変化を起こすことが必要となる。前記「Locked TASC」プローブの場合、この形状乃至構造変化は、該核酸プローブの前記標的核酸へのハイブリダィゼーシヨンにより、容易に起こる。つまり、前記第六の核酸プローブにおいては、前記標的核酸とハイブリダィゼーシヨン可能な 2つの塩基配列の該標的核酸に対する親和性 (結合力、ハイブリダィゼーシヨン力）の方が、前記ロック構造 (ステムループ構造）における親和性（結合力、ハイブリダィゼーシヨン力）よりも大き強く）なるように設計されている。このため、該核酸プローブは、前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンする前には、前記ロック構造 (ステムループ構造)をとつているが、前記標的核酸が存在すると、前記標的核酸とハイブリダィゼーシヨン可能な 2つの塩基配列が前記標的核酸におけるその相補部位に相互作用し、このとき、該 2つの塩基配列の前記標的核酸に対する親和性 (結合力、ハイブリダィゼーシヨン力）が大きい（強い)ため、前記ロック構造 (ステムループ構造）は容易に解かれ、その結果、該核酸プローブは、大きな形状乃至構造変化を伴って前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨン可能となる。

[0034] 前記核酸プローブにおける、前記標的核酸とハイブリダィゼーシヨン可能な 2つの塩基配列の該標的核酸に対する親和性 (結合力、ハイブリダィゼーシヨン力）（以下「

A2」と称する）や、前記ロック構造 (ステムループ構造）における親和性 (結合力、ハイブリダィゼーシヨン力）（以下「A1」と称する）は、前記標的核酸とハイブリダィゼーション可能な塩基配列数又は前記ロック構造における相補鎖の塩基配列数、ハイブリダィゼーシヨン時における各塩基間の水素結合数（2又は 3)、などにより適宜調整することができる。

[0035] 前記 A1と前記 A2との関係力 A2>A1、となるようにするには、例えば、前記標的核酸とハイブリダィゼーシヨン可能な 2つの塩基配列の数を、前記ロック構造における相補鎖の塩基配列数よりも多くする等すればよい。図 5Aに示す例では、前記 A2の数が「9塩基 X 2箇所 = 18」であるのに対し、前記 A1の数は「5」であり、前記 A2の数が前記 A1の数の 3倍強、 4倍弱となっている。

[0036] そして、前記核酸プローブにおいて、図 5Bに示すような一次元の切断活性領域は、図 5A及び図 6に示すように、前記標的核酸に前記核酸プローブがハイブリダィゼーシヨンした際に前記切断活性領域を形成し、前記切断部（図 5Aでは rA、図 6では Qで表された部位）に対する切断活性を発現する。なお、このとき、前記核酸プロ一ブ内では、分子内で一部が、具体的には前記切断部を中心（間）にしてその両側の一部が、それぞれハイブリダィゼーシヨンしている（図 5A中の rAの両側、図 6の B及び図 6の C中の Qで表された部位の両側）。

[0037] 前記切断部は、リボ核酸 (ヌクレオチドにおける糖がリボース)で形成されており、前記切断活性領域が発現するリボザィム活性により切断可能である。

前記発光物質 Fと前記消光物質 Qとは、図 6の Aに示すように、前記ロック構造 (ステムループ構造)をとっている間は互いに隣接して位置しており、この間は前記発光物質 Fの発光は前記消光物質 Qの作用により消光されている。

[0038] 前記核酸プローブは、図 5A左図及び図 6の Bに示すように、前記標的核酸 (targe t)が存在すると、該標的核酸に対してハイブリダィゼーシヨン可能である相補的な 2 つの塩基配列をその両端側に有しているため（図 5A及び図 6の B参照）、該 2つの塩基配列が前記核酸配列にハイブリダィゼーシヨンすると（図 5A及び図 6の B)、前記切断活性領域が形成されて、前記切断部に対する切断活性 (リボザィム活性)が生じ (図 6の Cでは、マグネシウムイオンが該切断活性領域の中心に位置することにより切断活性が発現乃至向上された状態となる）、該切断部 (リボース部分)が切断（自己切断)され、前記発光物質 Fを有する第一プローブ断片と、消光物質 Qを有する第二プローブ断片とに分割され (図 6の D)、それぞれが前記標的核酸力解離される。なお、互いに隣接して位置していた発光物質 F及び消光物質 Qは、該核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に、互いに離れて位置するようになるため（図 6中の B)、このときには、前記消光物質 Qの消光作用が働かなくなり、前記発光物質 Fが発光を生ずるようになる。前記発光物質 Fによる発光は、前記核酸プロ一ブが前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンする度に生じ、この反応が繰り返されて ( 図 6中の A— Dのサイクル）、増幅される。即ち、前記核酸プローブが切断されると、前記第一プローブ断片及び前記第二プローブ断片は、ノ、イブリダィゼーシヨンを維持することができず、前記標的核酸から解離すると、該標的核酸はフリーの状態となるため、新たな核酸プローブがハイブリダィゼーシヨンし、図 6中の A— Dのサイクルが繰り返される。前記核酸プローブは、前記標的核酸をァロステリックエフェクターとすることができる。このため、前記標的核酸が極微量（< 10ngZ /n)あるいは短寿命であっても、前記核酸プローブによって生ずる発光を増幅させることにより、目視等にて容易にその存在を検出することができる。

[0039] 本発明の核酸プローブは、その全部がヌクレオチド鎖で形成されていてもよいし、その一部がヌクレオチド鎖で形成されていてもよぐ後者の場合には、前記ヌクレオチドで形成された部分以外の部分は、例えば、アミノ酸鎖、糖鎖、合成ポリマー鎖などで形成されていてもよい。これらの中でも、製造効率等の点で、その全部がヌクレオチド鎖で形成されて、るのが好ま U、。

なお、前記核酸プローブにおける前記ヌクレオチド鎖の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成法、プラスミドべクタ一、ファージベクターなどを使用する微生物法、核酸合成機を使用する機械的合成法、などが挙げられ、この中でも、量産性に優れる点で、機械的合成法が好ましい

[0040] 前記核酸プローブにおける前記ヌクレオチド鎖の塩基配列数 (全長）としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、 5— 100が好ましぐ 10 一 70がより好ましい。

前記ヌクレオチド鎖の塩基配列数 (全長）が、 100を超えると、非特異的ハイブリダィズが起こって検出精度が低下するおそれがあり、また、細胞膜に対する透過性が低下し、効率よく生細胞内で前記標的核酸を検出することができないことがあり、 5未満であると、ハイブリダィゼーシヨンの結合力が不十分になり、前記標的核酸の検出精度が低下することがある。

[0041] 本発明の核酸プローブは、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能であり、該標的核酸と相補鎖を形成可能な領域 (部位)を有している。これにより、該核酸プロ一ブは、サンプル中の検出すべき前記標的核酸を捕捉することができる。

前記標的核酸と相補鎖を形成可能な領域 (部位)の数としては、少なくとも 1つ必要であり、 2以上であってもよいが、 2つであるのが好ましい。該相補鎖を形成可能な領域 (部位)の数が、複数である場合には、前記標的核酸の捕捉性に優れ、検出感度を向上させることができ、また、前記標的核酸との結合力を容易に制御することができ、更に、前記核酸プローブが前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンした際に、該核酸プローブが後述の切断活性領域を安定にかつ効率良く形成し易い等の点で有利である。

[0042] 前記標的核酸と相補鎖を形成可能な領域 (部位)の位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記核酸プローブのどの部分に存在してもよいが、例えば、該標的核酸と相補鎖を形成可能な領域 (部位)の数が 2つである場合、図 3に示すように、前記核酸プローブの両末端であってもよいし（図 3中の相補部 3a及び相補部 3b)、図 5A及び図 5Bに示すように、前記核酸プローブの一端と中央部とであってもよい。これらの中でも、後者の場合（図 5A及び図 5Bに示すような場合 )には、前記核酸プローブが、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンする前後で大きな形状乃至構造変化を生ずるので、該ハイブリダィゼーシヨンしたことにより、後述の切断活性領域を形成することができ、後述の切断部に対する切断活性を発現させることができるため、誤切断がなぐ誤検出等の問題がない点で有利である。

[0043] 前記相補鎖 (前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能な領域)の長さ、即ち該相補鎖における一方の塩基配列数としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、 1一 13が好ましぐ前記標的核酸に対する選択性が高い点で、 2 一 10がより好ましぐ 6— 9が特に好ましい。なお、前記標的核酸への結合力は、該相補鎖における塩基配列数に概ね比例し、例えば、図 1中の Aの例では、核酸プローブ 2の標的核酸 1に対する結合力は、相補部位 3aと相補部位 3bとの結合力の和となる。核酸プローブ 1に切断等が生じた場合（図 1中の B)、各核酸プローブ断片における結合力は、前記標的核酸に相補結合して、る部分湘補部位 3a又は相補部位 3 b)単独の結合力しかないことになる。即ち、切断によって標的核酸 1への結合力は略半分に減少することになる。この結合力の減少を利用することにより、標的核酸 1へのハイブリダィゼーシヨンと解離のプロセスを含む反応サイクルを確立させることができる。

前記塩基配列数が、 1一 13である場合には、生物体内温度付近 (37°C付近）にお V、て、各相補部位単独では標的核酸とのノ、イブリダィゼーシヨンを維持できな、ものとし、より容易に自発的に解離させることができ、直接生体内や細胞内に導入して核酸プローブと標的核酸との反応サイクルを成立させることが容易に可能となる点で有利であり、 2— 10、更には 6— 9である場合には、その効果が顕著である点でより好ましい。なお、各相補鎖における塩基配列数は、互いに同数であってもよいし、異なつていてもよい。

[0044] —切断活性領域—

本発明の核酸プローブは、例えば、前記切断部に対する自己核酸酵素等の切断活性を有する部位を形成可能な切断活性領域 (核酸酵素形成部位など) 6を有するのが好ましい。これにより、核酸プローブ 2は、標的核酸 1にハイブリダィゼーシヨンした後、自己核酸酵素の形成等を形成する構造変化を生じ、その後、前記標的核酸から解離可能となる。前記切断活性領域は、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に形成可能であるのが好ま、。

[0045] 前記切断活性領域としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、一定条件下で切断活性を発現するものなどが好適に挙げられ、例えば、特定の形状乃至構造をとつたときに、切断活性 (酵素活性)、例えば DNAザィム活性、 RN Aザィム活性、リボザィム活性等を発現可能な DNA鎖又は RNA鎖、などが挙げられる。

切断活性領域 (核酸酵素形成部位)は、前記核酸プローブが前記標的核酸に結合したとき、酵素活性を発現するための金属イオンを捕捉する空洞を形成するようコンホメーシヨン変化し得る領域を含む。前記切断活性領域は、前記核酸プローブ分子内で、例えばヌクレオチドの特異的切断等の酵素活性等の切断活性を有する。該核酸プローブは、制限酵素等を必要としないため、該核酸プローブを細胞内に導入するだけで特異的酵素反応を利用して、細胞内の標的核酸を検出することができる。また、通常、特異的切断をさせたい場合、切断しょうとする特定配列部位を認識する酵素を選択して使用しなければならないが、任意の配列で核酸を切断しょうとすると、あらゆる場合において特定配列部位を認識し切断する制限酵素が存在するとは限らない。しかし、本発明の核酸プローブは、同一分子内に核酸酵素形成部位とともに自己核酸酵素により認識乃至切断等される特定配列を有するため、酵素活性の発現について所望の特性を備えるよう設計が自由であり、制限酵素を用いる場合のような上記制限がない。

[0046] なお、切断部位 12は、核酸プローブがハイブリダィゼーシヨンした後自己核酸酵素 7が形成されたとき、切断活性が最も効率よく発揮される位置に配置されることが好ましい。

核酸酵素形成部位 6は、例えば、相補部位が 2以上ある場合には、一の相補部位 3 aと他の相補部位 3bとの間の領域にあることが好ましい。このような構成にすることにより、核酸プローブが標的核酸に確実に固定され、自己核酸酵素 7はより安定化するそして、自己核酸酵素の作用の結果、ヌクレオチドが切断等されたとき、核酸プローブと標的核酸との結合力を減少させるよう設計することがより容易になる。

[0047] 本発明では、核酸酵素形成部位から形成される自己核酸酵素は、切断活性、結合活性、その他いずれの活性を有するものであってもよいが、切断活性を有するものが好ましい。例えば、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした後、自己核酸酵素の作用により 2つの相補部位の間で切断された場合、各相補部位の結合力の総和力でもって標的核酸と結合状態を維持していたものが、切断後、短くなつた各断片は標的核酸とのハイブリダィズを維持できず標的核酸力解離する。フリーとなった標的核酸は新たな核酸プローブと結合し、自己核酸酵素の形成、切断、解離、新たなハイブリダィズ形成を順次繰り返す反応サイクルを繰り返すことができる。したがって、遊離した切断片がシグナルを発するように設計された核酸プロ一ブを使用した場合、 1分子の標的核酸上でシグナルが増幅されるため、検出感度の向上を図ることができる。

核酸酵素形成部位 6から形成される自己核酸酵素としては、 DNA酵素、 RNA酵素等が挙げられるがそのいずれであってもよぐこれらの核酸酵素は、ハンマーヘッド型、ヘアピン型、 HDV型及びその他のいずれのタイプを含むものでもよい。

[0048] 前記切断活性領域を形成するには、前記核酸プローブが、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に分子内でハイブリダィゼーシヨン可能な領域を有しているのが好ましい。この場合、前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブが前記切断活性領域を形成する三次元コンファーメーシヨンをとることが容易となり、また、該三次元コンファーメーシヨンの安定性に優れ、形成される前記切断活性領域の切断活性等に優れる等の点で有利である。

[0049] 前記核酸プローブにおいて、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に分子内でノ、イブリダィゼーシヨン可能な領域の数としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができる力例えば、 2以上であるのが好ましい。該領域の数が 2以上であると、前記切断活性領域の形成が容易である等の点で有利である。

[0050] 前記核酸プローブにおいて、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に分子内でノ、イブリダィゼーシヨン可能な領域の位置としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができる力例えば、後述する切断部を中心（間）にして互いに隣接した位置であるのが好ましぐこの位置に加えて、これらの位置の中心（間）であつて後述する切断部と対向する側 (後述する切断活性領域内乃至付近)の位置などもよい。前記位置が、前記切断部を中心（間）にして互いに隣接した位置である場合には、前記切断活性領域と切断部とを該切断活性領域が前記切断部を切断可能に対向させることができる点で有利であり、また更に、これらの位置の中心（間）であって後述する切断部と対向する側 (後述する切断活性領域内乃至付近)の位置にも存在する場合には、前記切断活性領域に複雑な三次元コンファーメーシヨンを付与可能であり、その切断活性を増強可能である等の点で有利である。

[0051] 前記核酸プローブにおいて、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に分子内でノ、イブリダィゼーシヨン可能な領域の塩基配列数としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができる。

[0052] 前記 Y及び Zの少なくともいずれかの塩基配列数が、 2未満であると、前記切断活性領域の形成乃至構造維持が困難になることがある。

また、前記 Yと前記 Zとの合計の塩基配列数としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができる力 2— 12が好ましい。

前記合計の塩基配列数が、 2未満であると、前記切断活性領域の安定化及び切断効率の向上に十分寄与しないことがあり、 12を超えると、前記核酸プローブが前記標的核酸とハイブリダィゼーシヨンする前においても前記切断活性領域を形成可能な構造を有して、る場合にぉ、ては、前記標的核酸とハイブリダィゼーシヨンして、な V、フリーの前記核酸プローブが、前記核酸配列とハイブリダィゼーシヨンする前に前記切断活性領域を形成し易くなり、前記核酸プローブどうしが互いにクロスノ、イブリダィゼーシヨンを生じてしまうことがあり、検出精度、感度等が低下してしまうことがある。なお、前記 Zの部分の塩基配列としては、その一部に 1個乃至数個の互いにハイブリダィゼーシヨンしな、塩基 (互いにノ、イブリダィゼーシヨンしな、塩基）が存在してヽてもよヽ (その一部に欠失、置換等が存在して!/、てもよ!/、)。

[0053] また、前記 Zの部分の塩基配列により、通常、前記核酸プローブにおいては前記切断部とは反対側にループ (ループ部）が形成される。

前記ループ部の塩基配列数としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができるが、前記核酸プローブの反応速度は、通常、該ループ部に依存しているため、該ループ部が短!、ほど安定であるので好まし！/、。

前記ループ部の塩基配列数力 2未満であると、エントロピー的に不利となり、後述するステムループ構造部分が不安定となり、前記切断活性領域の形成効率が低下してしまうことがある。 [0054] なお、前記切断活性領域により前記切断部が切断されると、前記核酸プローブは、前記第一プローブ断片と、前記第二プローブ断片とに分割される。

前記第一プローブ断片及び前記第二プローブ断片の大きさとしては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、互いに同程度の大きさであってもよいし、互いに異なる大きさであってもよぐこれらが前記標的核酸力解離し易い大きさであるのが好ましい。この場合、前記切断活性領域による前記切断部の切断により生ずるシグナル (発光等）を短時間で発生させることができ、高速検出が可能となる点で有利である。

[0055] 前記切断活性領域が前記切断部に対して DNAザィム活性、 RNAザィム活性、リボザィム活性等を有する場合には、該切断活性領域は、通常、活性中心サイトを有しており、該活性中心サイトに前記金属イオンが存在すると、前記 DNAザィム活性、 RNAザィム活性、リボザィム活性等を生じ得る。

前記金属イオンとしては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マグネシウムイオン、コバルトイオン、などが挙げられるが、これらの中でも、マグネシウムイオンが好適に挙げられる。

なお、前記活性中心サイトに前記金属イオンが存在するようにするには、例えば、前記核酸プローブを前記金属イオンが含まれる溶液中に存在させる方法などが挙げられる。この場合、前記金属イオンの前記溶液中の濃度としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、 10— 50mMが好ましい。

[0056] 前記切断活性領域の設計方法としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することできるが、例えば、前記切断活性領域が DNA等の核酸鎖により形成する場合には、上述した SELEX法などが好適に挙げられる。

前記 SELEX法においては、複数の核酸を、標的（ここでは前記切断部）に作用させ、該複数の核酸の中から結合力の強い核酸を選択分離し、これを増幅し、更に複数の核酸と共に前記標的 (前記切断部）に作用させることを繰り返すことにより、前記標的 (前記切断部）に対する親和性の高!、核酸配列が選抜される。

[0057] —切断部—

前記切断部は、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に特異的に切断可能 (前記切断活性領域により切断可能)であればよぐその形状、構造、大きさ、材質等については特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができる。

前記切断部は、前記切断活性領域の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、前記切断活性領域が前記 DNAザィム活性を有する場合には、 DNAであるのが好ましぐ前記切断活性領域が前記 RNAザィム活性を有する場合には、 RNAであるのが好ましぐ前記切断活性領域が RNA切断活性を有する場合には、リボースであるのが好ましい。

なお、前記切断部は、前記切断活性領域により切断されるが、前記切断活性領域力前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に形成されるように設計されて、る場合には、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンしたときだけ切断されるため、該標的核酸の誤検出等を防ぐことができる点で有利である。

ロック構造

本発明の核酸プローブは、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンするまでは、分子内で一部が互いにハイブリダィゼーシヨンしてロック構造を形成しているのが好ましい。

この場合、前記核酸プローブが前記ロック構造を有している間、即ち、該核酸プローブが前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンするまでの間は、前記切断活性領域を形成せず、前記核酸プローブが前記分子内ハイブリダィゼーシヨン構造を有さなくなるとき、即ち、該核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に初めて、前記切断活性領域を形成するため、前記標的核酸への該核酸プローブのハイブリダィゼーシヨンと、前記切断部の切断等に代表される構造変化と、を完全にリンクさせることができ、誤検出等を効果的に防ぐことができる点で有利である。

前記ロック構造としては、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ステムループ構造、ヘアピン構造、などが挙げられる。これらは、 1種単独で前記核酸プロ一ブ内に形成されてヽてもよヽし、 2以上組み合わされて前記核酸プローブ内に形成されていてもよい。これらの中でも、ステムループ構造が好ましぐ該ステムループ構造は、一般に核酸が形成する三次元のヘアピン構造のことを意味し、通常、相補的結合により茎のような形状を有するステム部と、ループのような形状を有するループ部とを有する。

[0059] 前記ロック構造における、前記ハイブリダィゼーシヨンを形成して、る相補鎖 (互ヽにハイブリダィゼーシヨンした部分、例えば前記ステム部）の内、一方における塩基配列数としては、 4一 8ntが好ましい。

前記塩基配列数が、 4nt未満であると、該ハイブリダィゼーシヨン領域 (例えば前記ステム部）における相補鎖の結合力が弱く十分でないことがあり、誤検出等の原因となるおそれがあり、一方、 8ntを超えると、前記ハイブリダィゼーシヨン領域 (例えば前記ステム部）における相補鎖の結合力が強すぎてしまい、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンすることができなくなる、あるいはハイブリダィゼーシヨンし難くなるおそれがある。

[0060] シグナル発生部

本発明の核酸プローブにおける前記シグナル発生部としては、該核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に、シグナルを発生すさせることができれば特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記核酸プローブが前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンすること等により発光可能な発光部や、発光を生ずる発光部と、該発光部に隣接して位置しているときは該発光部の発光を消光させる消光部との組合せ、などが好適に挙げられる。なお、前記シグナル発生部は、シグナルの発生の有無の検出のみならず、細胞内での前記標的核酸の挙動を追跡する動的パラメータとしても使用することができる。

これらは、前記核酸プローブ内に、 1種単独で設けられていてもよいし、 2以上組合せて設けられていてもよい。これらの中でも、前記発光部と前記消光部との組合せ、などが好適に挙げられる。。

前記シグナルとしては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、発光、消光、タンパク発現、放射線の放射、温度変化 (発熱等）、磁力変化 (磁気発生等)、切断片発生、物質生産、物質消費、変形、粘度変化、色変化、 UV吸収、 pH変化、旋光、異性化、などが挙げられる。これらは、 1種単独で使用してもよいし、 2種以上を併用してもよい。

[0061] なお、前記シグナルの検出方法乃至手段としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記シグナルが、発光、消光等の場合には受光装置、カメラ等などが挙げられ、放射線の放射の場合には感光フィルムなどが挙げられ、温度変化の場合には熱電対、温度センサーなどが挙げられ、磁力変化の場合には磁力センサーなどが挙げられ、切断片発生の場合には電気泳動、 SDS— PAGE、ウェスタン .ブロッテイングなどが挙げられ、物質生産の場合には抗体、 HPLC、ァフィ-ティークロマトグラフィーなどが挙げられ、物質消費の場合には IRスペクトル、 MS スペクトルなどが挙げられ、変形の場合には電子顕微鏡などが挙げられ、粘度変化の場合には粘度センサーなどが挙げられる。

[0062] なお、前記発光部と前記消光部との糸且合せとしては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛍光共鳴エネルギー（fluorescence resourc e energy transfer:FRET)等の技術として知られているものなどが好適に採用することがでさる。

[0063] 前記発光部としては、発光を生ずることができれば特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、蛍光物質、化学発光物質、電気化学発光物質、などを含むもの、あるいはこれらで形成されているもの、などが挙げられる。

これらは、 1種単独で使用してもよいし、 2種以上を併用してもよい。これらの中でも前記消光部が該発光部に隣接して存在する場合に該消光部の作用により、その発光が消光されるものが好ましぐ視認性に優れ、検出が容易な点で、前記蛍光物質力り好ましい。

前記蛍光物質としては、特に制限はなぐ目的応じて適宜選択することができ、例えば、アントラセン、フルォロセイン、フルォロセインイソチオシァネート（FITC)、テトラメチルローダミン、スルホローダミン等のローダミン類、ダンシルク口ライド、テキサスレッド、 AL350、インドカルボシァニン（CY)、などが挙げられる。

前記核酸プローブが前記発光部を有していると、検出を目視等で行うことが可能になる点で有利である。 [0064] 前記消光部としては、前記発光部に隣接して位置している場合に該発光部の発光を消光させることができれば特に制限はなぐ前記発光部の種類等に応じて適宜選択することができ、例えば、消光物質を含むもの、あるいは該消光物質で形成されているもの、などが挙げられる。

前記消光物質としては、特に制限はなぐ目的応じて適宜選択することができ、例えば、前記発光部が前記蛍光物質で形成されている場合には、該蛍光物質が発光する際に放出するエネルギーを吸収可能な物質、などが挙げられ、前記発光物質との間で光共鳴ェ不ル ~~ (fluorescence resource energy transfer： FRET )移動が可能な物質、など好適に挙げられ、具体的には、テトラメチルローダミンイソチオシァネート (TRITC)、ジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)、金ナノパーティクル、ブラックホールクェンチヤ一、などが挙げられる。

[0065] 前記核酸プローブが前記消光部を有すると、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンする前においては、即ち、該消光部が前記発光部に隣接して存在する場合には、該発光部の発光を消光することができ、一方、前記核酸プロ一ブが前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンした後においては、前記切断部が切断され、前記第一プローブ断片と前記第二プローブ断片とに分割され、これらが前記標的核酸から解離する結果、即ち、前記消光部が前記発光部から離れて存在するようになるため、前記消光部の作用がなくなり、前記発光部に発光を生じさせることができるので、前記標的核酸の存在を該発光部の発光により、目視等で容易に検出することができる点で有利である。

[0066] 前記消光部の前記核酸プローブにおける存在位置としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができるが、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンする前においては、前記発光部と隣接して位置し、前記核酸プローブが前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンした際には、即ち前記切断部が切断されて前記核酸プローブが前記第一プローブ断片と前記第二プローブ断片とに分割された後においては、前記発光部と離れて位置するのが好ましぐ具体的には、前記第一プローブ断片に前記発光部が存在する場合には前記第二プローブ断片に存在しているのがより好ましぐまた、これとは逆に、前記第二プローブ断片に前記発光部が存在する場合には前記第一プローブ断片に存在しているの力換言すれば、前記切断部を間にして前記消光部と前記発光部とが位置しているのがより好ましい。この場合、前記切断部が切断された際に、前記消光部を前記発光部とは異なる別のプローブ断片に存在させることができる点で有利である。

前記切断部が切断されるまでの間における、前記消光部の前記発光部からの距離としては、該消光部の消光作用が働く範囲内であればよぐ目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記消光部における前記発光部側の末端塩基と、前記発光部における前記消光部側の末端塩基との間に存在する塩基数で、 5— 30ntが好ましい。

前記塩基数が、 5未満であると、前記消光部と前記発光部との距離が近すぎ、分子設計、合成等が容易でないことがあり、 30を超えると、前記消光部の消光作用が十分でないことがある。

[0067] なお、前記発光物質と前記消去物質との具体的な糸且合せとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる力例えば、フルォロセインイソチォシァネート（FITC)とテトラメチルローダミンイソチオシァネート（TRITC)との組合せ、ジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)とフルォロセインとの組合せ、などが好適に挙げられる。

[0068] 以上は、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に、前記発光部の発光が生ずるように設計した場合にっ、て主に説明したが、本発明においては、これらの場合に限られず、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンする前に、前記発光部の発光が生じており、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に、前記発光部の発光が消光するように設計してもよい。なお、本発明の核酸プローブとしては、前記標識物質 (前記発光部及び前記消光部など)を有しない形態に設計してもよぐ該核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンしたことの検出は、例えば、該ノ、イブリダィゼーシヨンにより切断されて生じたプローブ断片を、例えば、電気泳動等することなどにより検出することができる。

[0069] 図 3の例では、蛍光物質 Fと消光物質 Qとは、自己核酸酵素による切断部位 12を介した位置にそれぞれ設けられていることが好ましい。その原理は、蛍光共鳴エネルキ ~~移動 (fluorescence resource energy transfer： FRET)【こつく。 FRET 成するためには、特に蛍光物質 (F)と消光物質 (Q)との物質間の距離が重要となるが、本発明の核酸プローブ 2が標的核酸 1にハイブリダィズして、る状態では、 Fと Qとの物質間距離は FRETが成立していて消光するような距離に設計されている。その後、自己核酸酵素が作用し、オリゴヌクレオチドが所定の切断部位で切断されると、各切断片は標的核酸との結合を維持できず解離する。その結果、 FRETから解放された蛍光物質は蛍光発光する。このように蛍光強度の増力 tlから標的核酸を検出乃至定量することができる。

また、このような FRET法によれば、ハイブリダィズした核酸プローブと、ハイブリダィズしない核酸プローブとを分離することなく目的の標的核酸の検出が可能となり、手順が簡略化され好ましい。

前記蛍光物質と前記消光物質とは、標的核酸にハイブリダィズした状態で切断部位を挟んで、約 5— 30塩基配列の距離で隔てられていることが好ましいが、必ずしもこの場合に限られるものではな、。

[0070] なお、核酸プローブに導入する標識物質としては、エネルギー供与物質とエネルギ一受容物質 (FITCZTRITC)力もなる組合せを採用することもできる。

本発明の核酸プローブは、ガラス製基板等の担体表面に固定された形態、いわゆる「DNAチップ」として使用することが可能であり、 Lab-on-Chipとして使用することちでさる。

[0071] その他の部

前記その他の部としては、特に制限はなぐ本発明の効果を害しない限り、適宜選択することができ、例えば、各種マーカー、水溶性リンカ一、などが挙げられる。

前記各種マーカーとしては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、放射線ラベル、量子ドットラベル、タンパク質ラベル、などが挙げられる。

[0072] 前記核酸プローブを担体に固定して使用する場合には、前記核酸プローブと前記担体との間に前記水溶性リンカ一を導入することが好ましい。

前記担体としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、榭脂粒子やプレート、容器の底面や側面、などが挙げられる。前記核酸プローブを検出キット等に予め固定しておくことによって、手軽に前記標的核酸の検出作業が行える。

前記水溶性リンカ一としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エチレングリコールリンカ一などが使用できる。水溶性リンカ一の長さは、担体の構造や種類などに応じて、適当な長さを決めればよい。

[0073] 前記核酸プローブを細胞内に導入して使用する場合には、前記核酸プローブ中の核酸の一部又は全部について、 2'— OMe化処理 (糖の 2'位のヒドロキシル基をメトキシ基に置換する処理)を行うことが好ましい。これによつて、細胞内在性酵素による前記核酸プローブの非特異的切断を抑制することができ、前記標的核酸の検出精度を向上させることができる。

[0074] 用途及び有用性

本発明の核酸プローブは、ウィルス、細菌、動物細胞、植物細胞などの前記標的核酸が極微量であっても検出可能であり、遺伝子治療、食中毒菌の存在検査、虫歯乃至歯周病の診断、血液検査等に好適に応用可能であり、後述する本発明の核酸チップ、標的核酸検出方法、薬剤スクリーニング方法、遺伝子検出装置、及び遺伝子診断方法に好適である。

また、本発明の核酸プローブは、例えば、血液検査 (輸血時のウィルス感染予防）、全血、アルブミン製剤、血液凝固製剤などの血液製剤の衛生管理、人口受精時などのウィルス検査、性病検査、神経疾患の病態分析、などに好適に適用乃至応用可能である。より詳しくは、唾液中には微量のウィルスや細菌などが含まれているので、例えば、 HIV感染検査、虫歯乃至歯周病の診断などとして、採取した唾液中に本発明の核酸プローブを添加するだけで、陽性、陰性の検査を簡便にかつ容易に目視等にて行うことができる。

また、本発明の核酸プローブは、犯罪搜查、法医学、考古学などの領域においても好適に応用可能である。

[0075] なお、本発明の核酸プローブを用いて前記標的核酸を検出する場合、該核酸プローブは、単独で使用してもよいし、ヘルパーオリゴヌクレオチドの存在下で（ヘルパーオリゴヌクレオチドと共に)使用してもょ、。

前記ヘルパーオリゴヌクレオチドは、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイプリダイゼーシヨンするのを補助する機能を有するものであれば特に制限はなぐ目的に応じて公知のものの中力適宜選択することができる力前記ステムループ構造を直鎖構造に変化させるのを補助する機能を有するものなどが好まし、。該ヘルパーオリゴヌクレオチドは、前記核酸プローブが前記ロック構造を有する場合に特に好適に該核酸プローブと併用することができる。

前記ヘルパーオリゴヌクレオチドの長さ、即ち塩基配列数としては、特に制限はなく

、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、 15— 20が好ましい。

[0076] 標的核酸

ここで、本発明の核酸プローブによる検出対象である前記標的核酸としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、精製、未精製のいずれであってもよぐ RNA、 DNA、 PNA、人工的に装飾された核酸などのいずれであってもよい。なお、前記標的核酸の塩基配列の決定法としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マキサム'ギルバート法、ジデォキシ法などが挙げられる。

前記標的核酸が存在する試料としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、血液、血清、血漿、糞便、尿、喀痰、骨髄液、汗、涙、唾液、精液、水道水等の水、これらを前処理したもの、などの採取乃至調製したものであつてもよ、し、細胞（生細胞を含む）やウィルスなどであってもよ、。

[0077] 前記細胞としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、植物細胞、菌類、酵母などが好適に挙げられる。

[0078] 前記動物細胞としては、特に制限はなぐ目的応じて適宜選択することができ、例えば、受精卵、 ES細胞、 EG細胞、 EC細胞などの胚性幹細胞、胚性癌細胞、造血幹細胞、癌化し、不死化した癌細胞株、各臓器の細胞株、赤血球、リンパ球、白血球などが挙げられる。なお、前記動物細胞には、発生時から形質転換されたトランスジエニック動物の細胞も含まれる。

なお、前記動物細胞が由来する生体としては、例えば、哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、昆虫類、などのいずれでもよい。

[0079] 前記哺乳類としては、例えば、肉食獣、霊長類、草食獣、げつし目、などが挙げられ、具体的には、マウス、ラット、ノ、ムスター、ゥシ、ゥマ、ブタ、ャギ、イノシシ、ゾゥ、キリン、パンダ、ィヌ、ネコ、クマ、ゥサギ、クジラ、ィルカ、サル、ヒトなどが挙げられる。前記爬虫類としては、例えば、カメ目、へビ目、ヮ二目、ムカシトカゲ目、有鱗目、などが挙げられ、具体的には、リクガメ、ゥミガメ、ミドリガメ、ゼ-ガメ、トカゲ、イグアナ、カメレオン、ャモリ、 -シキへビ、ナミへビ、コブラなどが挙げられる。

前記鳥類としては、例えば、ァヒル、ガチョウ、ァホウドリ、 -ヮトリ、トキ、力モメ、ダチヨウ、シギダチョウ、スズメ、カラス、キジ、カヮセミ、九官鳥、ヤンバルタイナ、コウノトリ、ツル、ホトトギス、キツッキ、フクロウ、ホウカンチョウ、ミフゥズラ、ォゥムなどが挙げられる。

前記両生類としては、例えば、力エル、ィモリ、サンショウゥォ、サラマンダーなどが挙げられる。

前記魚類としては、淡水魚、海水魚などが挙げられ、前記淡水魚としては、具体的には、ァロワナ、グッピー、ナマズ、タナゴ、コィ、メダカ、ャマメ、イワナ、ピラニア、ノヽィギヨ、シクリツド、ナマズなどが挙げられ、前記海水魚としては、具体的には、エイ、サメ、クマノミ、キス、ハゼ、マグロ、ヒラメ、マンボウ、マンタ、クマノミ、エンゼルフイツシュ、デイスカスなどが挙げられる。

前記昆虫類としては、例えば、力ブトムシ、クヮガタ、トンボ、ハチ、コゥロギ、スズムシ、力ミキリムシ、ァリ、ゴキブリ、力マキリ、セミ、タガメ、ハエ、ノッタ、ホタル、チョウなどが挙げられる。

[0080] 前記植物細胞としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、花、茎、根、葉などの部分由来の細胞が挙げられ、それらのプロトプラストであってもよい。前記植物の種類としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、種子植物、シダ類、蘚苔類、藻類などの由来の細胞が挙げられ、発生の時点で該ポリヌクレオチドを導入されたトランスジエニック植物も含まれる。

[0081] 前記種子植物としては、例えば、裸子植物、被子植物などが挙げられ、具体的には、イネ、小麦、大麦、サクラ、タンポポ、マツ、チューリップ、ヒマヮリ、スギ、ブナ、ナス、ハス、アブラナ、ナデシコ、ソラマメ、ツバキ、セリ、トウモロコシ、ネギ、クロモ、サトイモ、ツユクサ、イチヨウ、ソテツ、ヒノキ、カャ、カラマツ、イブキ、キク、シソ、リンドウ、サクラソゥ、ラン、ユリ、アヤメなどが挙げられる。

前記シダ植物としては、例えば、ィヌワラビ、ヮラビ、スギナ、ゼンマイ、へゴ、ミズ二ラ、ヒカゲノカズラ、トクサなどが挙げられる。

前記蘚苔類としては、例えば、スギゴケ、ミズゴケ、クロゴケ、ヒカリゴケ、チョウチンゴケ、タチゴケ、ゼニゴケ、ジャゴケ、ゥロコゴケ、ノヽタケゴケ、コマチゴケ、ゥキゴケなどが挙げられる。

前記藻類としては、例えば、クラミドモナス、ァォノリ、クロレラ、ァォミドロ、ミル、ァォサ、マリモなどが挙げられる。

[0082] 前記菌類としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば

、きのこ類、真菌類、細菌などが挙げられる。

[0083] 前記きのこ類としては、例えば、シィタケ、マツタケ、ァガリタスダケ、エリンギ、マイタケ、ャマブシタケ、ブナシメジ、タモギタケ、ナメコ、ヒラタケ、ホシシメジ、エノキダケなどが挙げられる。

前記真菌類としては、大きく酵母と糸状菌に分類することができる。

[0084] 前記酵母としては、例えば、 Candida albicans. C. glabrada. C. tropicalis 、 parapsilosis. C. stellatoidea. Crvptococcus neoformans. Saccha romvces cerevisiaeなどが举げられ、前記糸状菌としては、例えば、 Trichophvti n ruprum, Microsporum canis, Alternaria alternata, Alternaria pana x、 Bipolaris brizae.などが挙げられる

[0085] 前記細菌としては、例えば、グラム陽性菌、グラム陰性菌などが挙げられ、また、嫌気性菌、通性嫌気性菌、微好気性菌、好気性菌などのいずれであってもよい。該細菌の具体的な種としては、例えば、 Staphylococcus aureus. Streptococcus β vogenes. Rnterococcus faecalis. Bucillus anthracis. Batcillus sub tills、 Clostridium tetania Listeria monocytogene s、 Pseudomonas aeruginosa ゝ Eschericnia coli、 Heamophiiis influenzae. Neisseria gonorrhoeae. My cobacterium tuberculosis、 Corvnebacterium glutamicum^ StreDtomyces antibioticus. Salmonella typhi、 Edwardsiella tarda、 Citrobacter freun dii、 Vibrio parahaemolvticus. Morganella morganii. Seratia marcescens ゝ Klebsiella pneumoniae. Shigella dvsenteriae. Yersinia 。estis、 Trepon ema pallidum、 Leptospira interroganse. Campylobactor jejuni. Lactoba cillus latis、 Actinobacillus actinomvcetemcomitance. Purphyromonas g ingivalis. Prevotella intermedia. Bacteroides forsvthus、 Treponema de nticolaなどが举げられ、更にクラミジァ科、リケッチア科、マイコプラズマ科などのものも挙げられる。

なお、前記細菌としては、例えば、歯周病原因細菌、う蝕性細菌、食中毒原因菌、なども好適に挙げられる。

[0086] また、その他の微生物類として、原生生物、プランクトンなどが挙げられる。

前記原生動物としては、例えば、赤痢アメーバ、大腸アメーバ、膣トリコモナス、トリノ Vソーマ、マラリア、ニューモシスチスカリ-、クリプトモナス、ミドリムシ、糸状虫、鞭虫などが挙げられる。

前記プランクトンとしては、例えば、ミジンコ、ケンミジンコ、ヮムシなどが挙げられる。

[0087] 前記ウィルスとしては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルぺスウィルス、センダイウィルス、バタテリオファージなどが挙げられる。

前記レトロウイルスとしては、例えば、マウス白血病ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、ヒト Tリンパ球向性ウィルスなどが挙げられる。

前記アデノウイルスとしては、例えば、ィヌアデノウイルス 1型、ィヌアデノウイルス 2 型、ヒトアデノウイルス 1型、ヒトアデノウイルス 2型などが挙げられる。

前記センダイウィルスとしては、例えば、主にマウス由来のものが挙げられ、ヒトには感染しな、ことが知られて、る。

前記バタテリオファージとしては、例えば、 T4ファージ、 T5ファージ、 T7ファージ、 λファージ、 M13などが挙げられる。

また、大腸菌内のプラスミド、コスミドなども挙げられ、該プラスミドとしては、例えば、 pBR322、 pBR325、 pAT153、 pUC8、 pUC18、 pUC19、 pSP— RLUCなど力挙げられる。

[0088] (核酸チップ）

本発明の核酸チップは、本発明の前記核酸プローブを担体に固定してなること以外には特に制限はなぐ目的に応じて適宜公知の構成を採用することができる。中でも、前記水溶性リンカ一を介して前記核酸プローブを前記担体に固定する構成が好ましい。

前記核酸プローブを固定する対象としては、公知の担体などが好適に挙げられる。該核酸プローブを前記担体に固定してなる前記核酸チップは、 DNAチップとして好適に使用することができる。

[0089] 前記担体としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば

、無機材料で形成されていてもよいし、有機材料で形成されていてもよい。

[0090] 前記無機材料としては、例えば、無機高分子、金属、セラミック、半導体、磁石、パラマグネット、アパタイトなどが挙げられる。

前記無機高分子としては、例えば、カーボン、熱硬化性榭脂を炭化焼成して得られたアモルファスカーボン、グラフアイト、などが好適に挙げられる。

前記金属としては、例えば、金、白金、銀、銅、鉄、アルミニウム、などが好適に挙げられる。

前記セラミックとしては、例えば、アルミナ、シリカ、窒化ケィ素、炭化ケィ素、ガラス、水晶、シリカゲル、などが好適に挙げられる。

前記半導体としては、シリコン、などが好適に挙げられる。

これらの無機材料は、 1種単独で用いてもよいし、 2種以上併用してもよい。

[0091] 前記有機材料としては、例えば、プラスチック、天然高分子、などが挙げられる。

前記プラスチックとしては、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネイト、ポリプロピレン、ポリアミド、フエノール榭脂、エポキシ榭脂、ポリカルポジイミド榭脂、ポリ塩化ビ -ル、ポリフッ化ビ-リデン、ポリフッ化工チレン、ポリイミド、アクリル榭脂、セラミックなどが挙げられる。

前記天然高分子としては、例えば、ポリアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、ァルギン酸、これらの誘導体、などが挙げられる。 [0092] 前記担体の形状は、通常、前記核酸チップの形状にそのままなることから、該核酸チップをどのように設計するかという観点から選択することができ、特に制限はなぐ例えば、フィルム状、板状、粒子状 (ビーズなど）、各種成形品などが好適に挙げられる。前記形状が粒子状である場合には、例えば、流動的なビーズ表面に固定された DNAマイクロビーズアレイなどとして設計することができる。なお、前記各種成型品としては、例えば、ストリップ、マルチウエルプレートのゥエル又はストリップ、チューブ、メッシュ、連続発泡フォーム、膜、紙、針、ファイバー、プレート、中空糸、スライド、細胞容器などが挙げられる。

前記核酸チップの大きさとしては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができる。

[0093] 前記核酸チップ上における前記核酸プローブの配置としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記担体の全表面又は一部の表面であってもょ、し、前記担体表面にアレイ状に配置させてもょ、。

また、前記核酸チップ上に配置する前記核酸プローブの種類としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、 1種単独であってもよいし、 2種以上であってもよい。後者の場合には、各核酸プローブをアレイ状に配置させておくことにより、同時に多種、多量の遺伝子を定性、定量等することができ、遺伝子診断等に好適に応用可能である。このとき、前記核酸プローブの種類毎に、生ずる発光の色を異なるように設計しておくと (マルチカラープローブとして設計しておくと）、発光色を目視等するだけで、どの標的核酸の存在の有無を瞬時に判断することができる点で有利である。

[0094] 本発明の核酸チップは、前記標的核酸の検出乃至分析に好適に使用することができ、後述す本発明の標的核酸検出方法、薬剤スクリーニング方法、遺伝子診断方法などに好適に使用することができる。

本発明の核酸チップは、ウィルス、細菌、動物細胞、植物細胞などの前記標的核酸が極微量であっても検出可能であり、遺伝子治療等に好適に応用可能であり、後述する本発明の標的核酸検出方法、薬剤スクリーニング方法、遺伝子検出装置、及び遺伝子診断方法に好適である。 [0095] また、本発明の核酸チップは、例えば、血液検査（輸血時のウィルス感染予防）、全血、 MAP、 FFP、アルブミン製剤、血液凝固製剤などの血液製剤の衛生管理、人口受精時などのウィルス検査、性病検査、神経疾患の病態分析、などに好適に適用乃至応用可能である。より詳しくは、唾液中には微量のウィルスや細菌などが含まれているので、例えば、 HIV感染検査などとして、採取した唾液中に本発明の核酸チップを用いただけで、陽性、陰性の検査を簡便にかつ容易に目視等にて行うことができるまた、本発明の核酸チップは、犯罪搜查、法医学、考古学などの領域においても好適に応用可能である。

[0096] (標的核酸検出方法）

本発明の標的検出方法としては、以下の第一一第三の標的検出方法が挙げられる。

前記第一の標的核酸検出方法は、核酸プローブを用いて標的核酸を検出する核酸検出方法であって、前記核酸プローブは前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブはハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少し前記標的核酸力解離するよう設計されている。

前記第二の標的核酸検出方法は、標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位と、自己核酸酵素を形成可能な核酸酵素形成部位と、を有する核酸プローブを用いる標的核酸の検出方法であって、標的核酸に前記核酸プローブを相補的に結合させるハイブリダィゼーシヨン工程と、ハイブリダィゼーシヨン形成の後、前記自己核酸酵素が形成され前記核酸プローブの構造が変化し、その結果ハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少して該核酸プローブが前記標的核酸から解離する解離工程と、前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部を検出する検出工程と、を含む。

前記第三の標的核酸検出方法は、本発明の前記核酸プローブを標的核酸にハイブリダィゼーシヨンさせるノ、イブリダィゼーシヨン工程と、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブ力発生したシグナルを検出することにより該標的核酸の存在を検出する標的核酸検出工程とを含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の工程を含む。

[0097] 本発明の標的検出方法においては、基本的には核酸プローブを試料中に存在する標的核酸にノ、イブリダィズさせる操作のみであり、この後、自発的に核酸プローブの構造変化、ハイブリダィズ結合力の減少、核酸プローブの解離、シグナルの蓄積、が起こって標的核酸の測定が可能となる。このように操作が非常に簡単なため、複雑乃至特殊な装置や特別の試薬等が不要であり、必要時に必要なところ、例えば診療所、家庭、学校、職場等において速かに遺伝子診断を行うことができる。

標的核酸の検出を細胞内で行う場合には、前記核酸プローブを細胞内に導入することが必要である。前記核酸プローブの細胞内への導入方法としては、特に制限はなぐ細胞の種類等により適宜選択することができ、例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、エレクト口ポレーシヨン法、ソノポレーシヨン法、などの既知の遺伝子導入方法が挙げられる。

本発明の核酸検出方法は、核酸プローブが前記標的核酸力解離する前後にお V、て、異なるシグナルを発する標識物質を有する核酸プローブを用いることが好ましい。

このように構成することにより、核酸プローブと標的核酸とのハイブリダィゼーシヨン乃至解離などの現象が、シグナルの変化として視認容易となり、標的核酸の検出がより容易になる。

[0098] また、本発明の核酸検出方法は、標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位と、自己核酸酵素を形成可能な核酸酵素形成部位と、を有する核酸プローブを用いる標的核酸の検出方法であって、標的核酸に前記核酸プローブを相補的に結合させるハイブリダィゼーシヨン形成工程と、ハイブリダィゼーション形成の後、前記自己核酸酵素が形成され前記核酸プローブの構造が変化し、その結果ノ、イブリダィゼーシヨンの結合力が減少して該核酸プローブが前記標的核酸から解離する解離工程と、前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部を検出する検出工程と、を有することを特徴とする。

このような方法によれば、標的核酸と一度ハイブリダィゼーシヨンした核酸プローブ上にある標識物質をポジティブに検出できるため、操作性に優れ、容易かつ高精度で標的核酸の検出を行うことができる。

[0099] 更に、核酸プローブの相補部位でのみ標的核酸とハイブリダィゼーシヨンさせるため、ハイブリダィゼーシヨンを完了するのに要する時間を短縮することができ、検査の迅速ィ匕を図ることができる。

本発明の標的核酸検出方法によれば、核酸プローブ自身が標的核酸の認識、シグナルの増幅の両者を行うため、 PCR等によってサンプル DNA(RNA)を増幅する必要がなぐ従来のように制限酵素等を必要せず、核酸プローブ内に制限酵素部位を設ける必要がなぐ更に化学物質等の添加を必要とせず、一定温度下で反応が進行するため、細胞内における標的核酸の検出方法としても使用することができる。

[0100] ーノヽイブリダィゼーシヨン工程

前記ノ、イブリダィゼーシヨン工程は、本発明の前記核酸プローブを上述した標的核酸にハイブリダィゼーシヨンさせる工程である。

前記ノ、イブリダィゼーシヨンの条件等としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、 V、わゆる「ストリンジェント」なハイブリダィゼーシヨン条件下で行われることが好ましぐ pHとしては、 7. 0-8. 5力子ましく、温度としては 30°C— 60 °Cが好ましぐ 0. 01-0. 1M未満のナトリウムイオン塩濃度の溶液中で行うのが好ましい。

なお、前記ハイブリダィゼーシヨン工程においては、上述したヘルパーオリゴヌタレォチドを併用してもよい。

[0101] 前記ヘルパーオリゴヌクレオチドは、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイプリダイゼーシヨンするのを補助する機能を有するものであれば特に制限はなぐ目的に応じて公知のものの中力も適宜選択することができる力前記ロック構造 (ステムループ構造)を直鎖構造に変化させるのを補助する機能を有するものなどが好ま、。該ヘルパーオリゴヌクレオチドは、前記核酸プローブが前記ロック構造を有する場合に特に好適に該核酸プローブと併用することができる。

[0102] 標的核酸検出工程

前記標的核酸検出工程は、本発明の前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に生じた前記シグナルを検出することにより前記標的核酸を検出する工程である。

前記シグナルとしては、上述した通りであり、例えば、発光、消光、放射線の放射、温度変化 (発熱等)、磁力変化 (磁気発生等)、切断片発生、物質生産、物質消費、変形、粘度変化、などが挙げられる。これらは、 1種単独で使用してもよいし、 2種以上を併用してもよい。

[0103] 前記シグナルの検出方法乃至手段としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記シグナルが、発光、消光等の場合には受光装置、カメラ等などが挙げられ、放射線の放射の場合には感光フィルムなどが挙げられ、温度変化の場合には熱電対、温度センサーなどが挙げられ、磁力変化の場合には磁力センサーなどが挙げられ、切断片発生の場合には電気泳動、 SDS— PAGE、ゥェスタン .ブロッテイングなどが挙げられ、物質生産の場合には抗体、 HPLC、了フィニティークロマトグラフィーなどが挙げられ、物質消費の場合には IRスペクトル、 MSスベクトルなどが挙げられ、変形の場合には電子顕微鏡などが挙げられ、粘度変化の場合には粘度センサーなどが挙げられる。

[0104] 前記シグナルが、前記核酸プローブが切断されて生じた、第一プローブ断片及び第二プローブ断片の内、該第一プローブ断片に存在する前記発光部の発光である場合には、該標的核酸検出工程においては、前記発光を検出することにより前記標的核酸の存在が検出される。なお、このとき、前記発光部の発光を検出する方法としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、前記発光部が前記発光物質で形成されており、該発光物質が蛍光物質である場合には、その発光 (蛍光）を目視等乃至蛍光顕微鏡で容易に検出することができ、前記発光物質が前記化学発光物質で形成されて、る場合には、感光フィルム等を用いて容易に検出することができ、また、本発明においては、 CCDカメラを用いて検出してもよぐこの場合はデジタル解析をすることがができ、データの処理乃至力卩ェが容易であり、前記標的核酸の定性、定量を高精度に行うことができる点で有利である。

[0105] 本発明の標的核酸検出方法は、ウィルス、細菌、動物細胞、植物細胞などの前記標的核酸が極微量であっても検出可能であり、遺伝子治療、食中毒菌の存在検査、虫歯乃至歯周病の診断、血液検査等に好適に応用可能である。また、本発明の標的核酸検出方法は、例えば、血液検査 (輸血時のウィルス感染予防）、全血、 MAP, FFP、アルブミン製剤、血液凝固製剤などの血液製剤の衛生管理、人口受精時などのウィルス検査、性病検査、神経疾患の病態分析、などに好適に適用乃至応用可能である。また、本発明の標的核酸検出方法は、犯罪搜查、法医学、考古学などの領域においても好適に応用可能である。

[0106] ここで、本発明の標的核酸検出方法の一例について図面を参照しながら説明するまず、標的核酸 1と本発明の核酸プローブ 2とをノヽイブリダィズさせる（図 1中の A)。ハイブリダィズ形成工程において、反応条件は適宜設定可能であり、公知の方法によって行うことができ、 V、わゆる「ストリンジェント」なハイブリダィゼーシヨン条件下で行われる。例えば、 ρΗ7. 0—8. 5、温度 30— 60°Cの約 0. 01—0. 1M未満のマグネシゥムイオン塩濃度の溶液を用いて行われる。なお、標的核酸は、通常、高温処理等によって予め一本鎖に変性されて、ることが好ま、。

次に、ハイブリダィゼーシヨンした核酸プローブは一定条件の下、自己核酸酵素 7 を形成する（図 1中の A)。この自己核酸酵素 7よって特定配列の認識と酵素活性の発現が核酸プローブ 1内で起こる。自己核酸酵素 7が切断活性を有する場合、特定配列を有する切断部位 12でヌクレオチドが切断される（図 1中の B)。このように切断された核酸プローブ 2は、標的核酸 1との結合状態を維持することができず解離する（図 1中の C)。これにより、核酸プローブ断片上の蛍光物質 Fは消光物質 Qの影響を受けることがなくなって蛍光シグナルを発する。このシグナルを次の検出工程において検出乃至解析する。

[0107] 即ち、前記ハイブリダィゼーシヨン工程において、図 1に示すように、核酸プローブ 2 は、標的核酸 1が存在すると、標的核酸 1に対してハイブリダィゼーシヨン可能である相補的な塩基配列 3a及び 3bをその両端に有しているため（図 2及び図 3参照）、塩基配列 3a及び 3bが核酸配列 1にハイブリダィゼーシヨンすると（図 1中の A)、核酸酵素形成部位 6が三次元のコンファーメーシヨンをとることにより切断活性領域 7が形成されて、切断部 12に対する切断活性 (リボザィム活性）が生じ、切断部 12 (リボース部分)が切断（自己切断)され、発光物質 Fを有する第一プローブ断片と、消光物質 Qを有する第二プローブ断片とに分割され (図 1中の B)、それぞれが標的核酸 1から解離される結果、互いに隣接して位置していた発光物質 Fと消光物質 Qとが互いに離れて位置するようになる（図 1中の C)。発光物質 Fと消光物質 Qとは、互いに隣接して位置していたときには、両者の間における蛍光共鳴エネルギー（fluorescence resou rce energy transfer : FRET)移動により、発光物質 Fの発光が消光物質 Qの作用により消光状態 8にあったのが、該蛍光共鳴エネルギー移動がなくなり、消光物質 Qの消光作用が働力なくなり、発光物質 Fが発光を生ずるようになる（図 1中の C)。この発光は、前記核酸プローブが標的核酸 1にハイブリダィゼーシヨンする度に生じ、この反応が繰り返されて（catalytic process,図 1中の A— Cのサイクル）、増幅される。即ち、核酸プローブ 2が切断されると、前記第一プローブ断片及び前記第二プローブ断片は、ハイブリダィゼーシヨンを維持することができず、標的核酸 1から解離すると、標的核酸 1はフリーの状態となるため、新たな核酸プローブ 2がハイブリダィゼーシヨンし、図 1中の A— Cのサイクルが繰り返される。核酸プローブ 2は、標的核酸 1 をァロステリックエフェクターとすることができる。このため、標的核酸 1が極微量（< 1 あるいは短寿命であっても、前記核酸プローブによって生ずる発光を増幅させることができる。

[0108] 前記標的核酸検出工程において、発光物質 Fによる発光を検出する。この検出は、前記核酸プローブの性状や標識物質に応じて適宜選択することにより行うことができ、例えば、核酸プローブが蛍光物質で標識されている場合は、蛍光顕微鏡等を用 V、て行うことができ、放射性同位元素で標識されて!ヽる場合はオートラジオグラフィーにより行うことができ、化学発光物質で標識されている場合には、感光フィルムを用いた解析や CCDカメラを用いたデジタル解析により行うことができ、その結果、前記標的核酸の定性、定量分析を行うことが可能である。

なお、標識物質を有しない核酸プローブを用いた場合には、例えば切断された核酸プローブ断片をゲル電気泳動などで確認することにより標的核酸の検出を行うことができる。

[0109] 本発明の核酸検出方法において、核酸酵素反応工程では前記核酸プローブが切断されることが好ましい。上述のとおり、自己核酸酵素の活性は特に限定されないが、切断活性の発現により核酸プローブが切断されることが好ましい。核酸プローブが切断されることによりできた各断片は、標的核酸とのハイブリダィズを維持できず標的核酸力解離し、その後、新たな核酸プローブが標的核酸に結合する。その結果、このようなシグナルの増幅を可能にする反応サイクルを容易に形成することができる。

また、本発明の核酸検出方法において、核酸プローブは担体に固定されていることが好ましい。このよう〖こすること〖こよって、 DNAチップ、 DNAマイクロアレイ等の核酸分析用デバイスを構成することができ、高感度で多量の遺伝子データを得ることが可能となる。

[0110] 更に、本発明の核酸プローブを使用した核酸分析用デバイスによれば、例えば、薬剤投与後の経過時間ごとに細胞あるいは臓器力も mRNAを取り出し、本発明の核酸プローブを固定ィ匕した DNAチップ等で測定することで、遺伝子ごとの mRNA量の経時変化を見ることができる。 mRNA量が増加することは、 DNA分子からの遺伝情報が活発に転写されることを意味し、遺伝子の働きが増加することに対応する。この遺伝子の働きの時間変化をコンピュータ解析することで、遺伝子パスウェイの情報等が得られる。

また、塩基配列の異なる 2以上の本発明の核酸プローブを同一担体に固定させた核酸検出用デバイスを構成することにより、一度に多種類の標的核酸を検出乃至測定することができる。

[0111] また、本発明の標的核酸検出方法の他の例について図面を参照しながら説明する前記ハイブリダィゼーシヨン工程においては、図 5A左図及び図 6の Bに示すように、前記標的核酸 (target)が存在すると、前記核酸プローブが、該標的核酸に対してノ、イブリダィゼーシヨン可能である相補的な 2つの塩基配列をその両端側に有しているため（図 5A及び図 6の B参照）、該 2つの塩基配列が前記核酸配列にハイブリダィゼーシヨンすると（図 5A及び図 6の B)、前記切断活性領域が形成されて、前記切断部に対する切断活性 (リボザィム活性）が生じ（図 6の Cでは、マグネシウムイオンが該切断活性領域の中心に位置することにより更に切断活性が向上された状態となつている）、該切断部 (リボース部分)が切断（自己切断)され、前記発光物質 Fを有する第一プローブ断片と、消光物質 Qを有する第二プローブ断片とに分割され (図 6の D)、それぞれが前記標的核酸力解離される。なお、互いに隣接して位置していた発光物質 F及び消光物質 Qは、該核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーションした際に、互いに離れて位置するようになるため（図 6中の B)、このときには、前記消光物質 Qの消光作用が働力なくなり、前記発光物質 Fが発光を生ずるようになる。ただし、該発光物質 Fが発光を生ずるのと、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンして前記切断部が切断されるのとは、略同時に行われる。前記発光物質 Fによる発光は、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーションする度に生じ、この反応が繰り返されて（図 6中の A— Dのサイクル）、増幅される。即ち、前記核酸プローブが切断されると、前記第一プローブ断片及び前記第二プローブ断片は、ハイブリダィゼーシヨンを維持することができず、前記標的核酸から解離すると、該標的核酸はフリーの状態となるため、新たな核酸プローブがハイブリダィゼーシヨンし、図 6中の A— Dのサイクルが繰り返される。前記核酸プローブは、前記標的核酸をァロステリックエフェクターとすることができる。このため、前記標的核酸が極微量（く lOngZ 1)あるいは短寿命であっても、前記核酸プローブによって生ずる発光を増幅させることにより、目視等にて容易にその存在を検出することができる。前記標的核酸検出工程において、発光物質 Fによる発光を検出する。この検出は、目視で行ってもよいし、蛍光顕微鏡、 CCDカメラ等を使用してもよい。

[0112] 本発明の標的核酸検出方法は、微量な各種標的核酸の高感度、高精度かつ高速での検出に好適であり、後述する本発明の薬剤スクリ一ユング方法にも好適に応用可能である。

[0113] (薬剤スクリーニング方法）

本発明の薬剤スクリーニング方法は、ハイブリダィゼーシヨン工程と、標的核酸検出工程とを含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の工程とを含む。

前記ノ、イブリダィゼーシヨン工程は、本発明の前記核酸プローブを、薬剤投与により発現した又は発現しな力つた前記標的核酸に上述したのと同様にハイブリダィゼーシヨンさせる工程である。 [0114] 標的核酸検出工程

前記標的核酸検出工程は、本発明の前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に生じた前記シグナルを検出することにより前記標的核酸を検出する工程である。なお、該標的核酸検出工程は、前記標的核酸検出方法における前記標的核酸検出工程と同様である。

[0115] 本発明の薬剤スクリーニング方法においては、前記標的核酸検出工程において検出した前記標的核酸の存在の有無により薬剤をスクリーニングする。即ち、増幅された前記発光を検出し、薬剤投与後の遺伝子の発現量の変化を観ることにより、しカゝもこのスクリーニングを細胞、組織、臓器などの生細胞内で行うこともできるため、該薬剤の作用乃至副作用を効率良くスクリーニングすることができる。従来のスクリーニング法では、図 7に示すように、前記薬剤によって発現した mRNAを単離し、逆転写反応により cDNAを調製し、 PCRで増幅させ、増幅された cDNAにラベリングをし、ラベルの発光を検出するという非常に煩雑かつ熟練した技能が必要であつたが、本発明における薬剤スクリーニング方法では、生細胞に直接、前記核酸プローブを導入することもできるので、迅速かつ簡易にスクリーニングを行うことができる。

また、本発明の薬剤スクリーニング方法は、図 7に示すように、生細胞を用いることにより、今まで細胞を固定し、生物的な活動をさせていな力つたことで発見できなかつた mRNAなどの挙動を検出乃至分析することができ、更に微量な mRNAなどを検出乃至分析等することができる点で有利であり、また、図 8で示すように、所望の阻害剤をスクリーニングすることもでき、既存薬の新たな作用、副作用を微量な遺伝子 (標的核酸の発現の有無）を検出することにより知ることができ、また、スポーツ選手などに対するドーピング検査、麻薬常習犯に対する麻薬検出検査などにも応用することができる。

[0116] 本発明の薬剤スクリーニング方法によりスクリーニングする薬剤としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、末梢神経作用薬、中枢神経作用薬、ホルモン剤、ォータコイド、循環器系作用薬、呼吸器系作用薬、消化器系作用薬、泌尿生殖器系作用薬、皮膚作用薬、ビタミン剤、化学療法剤、消毒薬、防腐剤、生物学的製剤、漢方薬などが挙げられ、既存薬、新薬のいずれであってもよい。

[0117] 前記末梢神経作用薬としては、例えば、局所麻酔薬、筋弛緩薬、自律神経系作用薬などが挙げられる。

前記局所麻酔薬としては、例えば、コカイン、トロパコカイン、プロ力イン、リドカイン、ブピノ力イン、メピノ力イン、テトラカイン、ジブ力インなどが挙げられる。

前記筋弛緩薬としては、例えば、 d-ッボクラ—レ、ガラミン、パンクロ-ゥム、ベクロ- ゥム、デカメトニゥム、スクサメトニゥム、ダントロリンなどが挙げられる。

前記自律神経作用薬としては、例えば、ェピネフイリン、ノルェピネフイリン、イソプロテレノール、ドノミン、フエ二レフリン、メトキサミン、クロ二ジン、メタラミノール、ナファゾリン、ドブタミン、メトキシフエナミン、オルシプレナリン、テルブタリン、クロルプレナリン、トリメトキノ一ノレ、サノレブタモーノレ、ッロブテノーノレ、プロ力テロ一ノレ、ピノレブテロ一ノレ、フエノテローノレ、ホノレモテノーノレ、クレンブテローノレ、マブテロ一ノレ、チラミン、エフエドリン、メチルエフェドリン、アンフェタミン、エルゴタミン、ェルゴトキシン、エルゴメトリン、ジヒドロエノレゴトキシン、ジヒドロエノレゴトキシン、フエノキシベンザミン、トラゾリン、フェントラミン、プラゾシン、テラゾシン、ドキサゾシン、ブナゾシン、ゥラピジル、ョヒンビン、プロプラノロ一ノレ、ブプラノロ一ノレ、ブフヱトローノレ、ブクモローノレ、ナドローノレ、チモローノレ、チリソローノレ、プラクトローノレ、メトプロローノレ、ァテノロ一ノレ、ビソプロ口ール、ベタキソロール、ピンドロール、オクスプレノール、アルプレノロール、力ノレテオローノレ、インデノローノレ、ペンブトローノレ、ブニトロ一ノレ、ボピンドローノレァセブトロール、セリプロロール、ラベタノール、グァネチジン、メチルドーノ、クロ-ジン、グアンファシン、グアナべンズ、アセチルコリン、べナテコール、メタコリン、ムスカリン、ピロカルピン、フィゾスチグミン、ネオスチグミン、エドロホ-ゥム、アンべノ-ゥム、ジスチグミン、パラチオン、アト口ピン、スコポラミン、ロートエキス、ホマトロピン、シクロペントレート、ニコチン、 DMPP、 TMA、 DFP、 TEPP、テトラエチルアンモ-ゥム、へキサメトニゥム、メカミラミン、トリメタファンなどが挙げられる。

[0118] 前記中枢神経作用薬としては、例えば、亜酸化窒素、シクロプロパン、エチレン、ェ一テル、クロロフオルム、ハロセン、メトキシフルレン、ェンフルラン、イソフルラン、セボフルラン、チォペンタール、チアミラール、へキソバルピタール、ペントバルピタール、プロパ-シド、ケタミン、フエノバルビタール、ブロムヮレリル尿素、ブロムジェチルァセチル尿素、抱水クロラール、ダルテシミド、メタクワロン、ニトラゼパム、フルラゼパム、エスタゾラム、トリァゾラム、ェチルパラフィノール、エトクロルビノール、ェチノレアルコール、メチルアルコール、ジスルフィラム、フエ-トイン、メフエ-トイン、ェソトイン、フエノバルピタール、ネタルビタール、プリミドン、カルバマゼピン、ゾ-サミド、トリメタジォン、パラメタジオン、バルプロ酸ナトリウム、フェンスクシミド、メトスクシミド、エトスクミシド、ジァゼパム、クロナゼパム、モルヒネ、コディン、デバイン、パパべリン、ノス力ピン、ァヘンチンキ、リン酸コディン、ヘロイン、ペチジン、フェンタニル、メサドン、レボルファノール、デキストロメトルファン、ペンタゾシン、フエナゾシン、ブプレノルファン、ブトルファノール、ナロルフイン、レバロルフアン、ナロキソン、エンドルフィン、メフエネシン、ェポリゾン、ノクロフェン、チザ-ジン、レボドパ、カルビドノく、ベンゼラシド、トリへキシフエ二ジル、ビペリデン、ベンズトロピン、ァマンタジン、ブロモクリプチン、ぺルゴリド、ドロキシドパ、ストリキニーネ、ピクロトキシン、ペンテトラゾール、 -ケタミド、ジモルホラミン、カフェイン、テオフィリン、テオブロミン、アミノフィリン、クロルブロマジン、チオリダジン、フェルフエナジン、レセルピン、レシナミン、デセルビジン、ハロペリドール、クロルプロチキセン、チォチキセン、ィプロ-アジド、ナイァラミド、イソカルボキサジド、サフラジン、トラ-ルシプロミン、パージリン、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、クロミプラミン、ミアンセリン、リチウム、ジァゼパム、ォキサゼパム、ニトラゼパム

、ェチゾラム、ロラゼパム、ヒドロキシジン、 LSD— 25、メスカリン、大麻、ジメチルトリプタミン、ジェチルトリプタミン、プシロシン、プシロシビン、ブホテニン、ハーミンなどが挙げられる。

前記ホルモン剤としては、ホルモン作用を有するもの又は阻害するものであれば特に制限はなぐ例えば、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、乳汁分泌ホルモン、ォキシトシン、バソブレツシン、甲状腺ホルモン、リオチロニンナトリウム、レボチロキシンナトリウム、メチルチォゥラシノレ、プロピルチオゥラシル、チアマゾーノレ、カノレシト-ン、上皮小体ホノレモン、インスリン、グルカゴン、カルプタミド、クロルプロパミド、ァセトへキサミド、トラザミド、へタへキサミド、 1ーブチルー 3—-トロウレア、トルプタミド、ダリベンダラミド、ダリミジン、グリブゾール、フェンフオルミン、プフォルミン、メトフオルミン、ェパルレスタツト、ボグリボーズ、ァカルノーズ、トログリタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、デスォキシコルトン、プレドニゾロン、ェチルプレドニゾロン、パラメタゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、アルドステロン、エストラジオール、エストロン、ェチュルエストラジオール、スチノレベン、プロゲストロン、クロノレマジノン、ノノレエチステロン、テストステロン、アンドロステロン、ェチォコラノロン、ェピアンドロステロン、メチルテストステロン、テストステロン水性懸濁注射剤、テスットステロンエステル注射剤、ォキシメトロン、メテノロン、混合ホルモン剤などが挙げられる。

[0120] 前記ォータコイドとしては、例えば、ヒスタミン、ジフェンヒドラミン、ジフエ-ルビラリン、クレマスチン、ピリラミン、プロメタジン、クロルフエ二ラミン、クロルサイキリジン、シプ口ヘプラジン、メキタジン、テルフエナジン、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン、ジフェンヒドラミン、ジメンヒドリナート、サイタリジン、メタリジン、プロメタジン、チェチノレぺラジン、セロトニン、メチセルギド、プロへプタジン、レニン、アンギオテンシン、カプトプリノレ、プロスタグランジン E2、プロスタグランジン F2 a、プロスタグランジン A2、トロンボキサン A2、ロイトコリエン、ブラジキュン、血漿カリクレイン、腺性カリクレイン、サリチル酸ナトリウム、アスピリン、サリチル酸アミド、インドメタシン、メッフヱナム酸、フルフエナム酸、ジクロフエナック、ベンジダミン、ェピリゾール、チアラミド、フエナセチン、ァセトァミノフェン、アンチピリン、ァミノピリン、スルピリン、コルヒチン、プロベネシフド、ァロプリノール、フエ二ルブタゾン、ォキシフェンブタゾン、スルフィンブタゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、ぺ-シラミン、ァザチォプリン、ブシラミン、サラゾスルフアビリジン、ァクタリットなどが挙げられる。

[0121] 前記循環器系作用薬としては、例えば、ジキタリス、ケジキタリス、スト口ファンッス、力やノウ、ジギトキシン、ジゴキシン、メチルジゴキシン、 G—スト口ファンチン、ラナトシド C、ポロスシラリジ、ゥァバイン、 j8受容体作用薬、アムリノン、ピモベンダン、ベスナリノン、キ-ジン、プロ力インアミド、ジソビラミド、メキシレチン、アプリジン、プロパフエノン、フレカイ-ド、ピルジカイ-ド、アドレナリン作動性 j8遮断薬、アミオダロン、ベラパミル、ヒドララジン、ジァゾキシド、プラゾシン、レセルピン、グァネチジン、中枢作用薬、サイァザイド系利尿薬、カプトプリル、ェナラプリル、ァラセプリル、デラプリル、シラザプリル、リシノプリル、べナゼプリル、イミダプリル、デモ力プリル、キナプリル、トランドラプリル、亜硝酸ァミル、ニトログリセリン、一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリトール、モロシドミン、ニコランジル、ジピリダモール、ジセラプ、プレニルァミン、クロモナール、トリメタジジン、ォキシフエドナリン、エタフエノン二フエジピン、二カノレジピン、ニソノレジピン、ニトレンジピン、ベニジピン、マニジピン、バノレニジピン、エフォ-ジピン、アムロジピン、フエロジピン、ジノレチアゼム、ベラパミノレ、イノシトールへキサニコチレート、シクランデレート、シンナリジン、インクスプリン、アルプロスタジル、メクロフエノキサート、ビンポセチン、 -セノレゴリン、イブシラスト、フノレナリジン、ィフェンプロジノレ、ペントキシフィリン、インデべノン、インデロキサジン、ビフェラミン、プロペントフィリン、ニコチン酸、コレスチラミン、プロブコール、プラバスタチン、シンパスタチン、へパリン、ジカマロ一ノレ、トルメキサン、ヮーフアイリン、ゥロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、糸且織プラスミノーゲンァクチベータ、チクロビジン、シロスタゾール、ィコサンペント酸ェチル、ベラプロスト、トロンビン、トラネキサム酸、カルバゾクロム

、硫酸鉄、フマール酸第一鉄、クェン酸第一鉄ナトリウム、含糖酸化鉄、エリスロポェチン、ェポェチンアルファ、ェポェチンベータ、フィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、ミリモスチム、クェン酸シルデナフィルなどが挙げられる。

[0122] 前記呼吸器系作用薬としては、例えば、二酸化炭素、ジモルホラミン、ジメフリン、ドキサプラム、サポニン類、非サポニン性配糖体、ヨウ化カリウム、ブロムへキシン、メチルシスティン、ェチルシスティン、ァセチルシスティン、カルボシスティン、アンブロキノール、キサンチン誘導体、クロモグリク酸ナトリウム、ケトチフェン、トラ-ラスト、ァゼラスチン、ォキサトミド、ォザダレル、トシル酸スプラタスト、テルフヱナジン、ァステミゾール、セラトロダスト、プランルカスト水和物などが挙げられる。

[0123] 前記消ィ匕器系作用薬としては、例えば、炭酸水素ナトリウム、酸化マグネシウム、天然ケィ酸アルミニウム、乾燥水酸ィ匕アルミニウムゲル、副交感神経遮断薬、ピレンゼピン、チキジゥム、シメチジン、ファモチジン、ラニチジン、オメブラゾーノレ、ランソプラゾール、メチルメチォニンスルホ -ゥムクロリド、ァズレンスルフォン酸、スクラルファート、アルジォキサ、ゲファルナート、テプレノン、トロキシピド、ィルソグラジン、スルピルド、ソファルコン、プラウノトール、レバミピド、ベネキサートベータデタス、オルノプロスチル、ミソプロストール、ェンプロスチル、クラリスロマイシン、ァモキシシリン、メトロ二ダゾール、次硝酸ビスマス、ひまし油、アントラキノン誘導体。フエノールフタレイン、ピコスルフアート、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、硫酸ナトリウム、グリセリン、ビサコジル、タンニン酸アルブミン、沈降炭酸カルシウム、薬用炭、ァヘンアルカロイド、ベルべリン、ラクトミン、メトクロプラミド、ドンペリドン、シサプリド、トリメブチンなどが挙げられる。

[0124] 前記被尿生殖器系作用薬としては、例えば、 D-マン-トール、濃グリセリン、塩ィ匕アンモ-ゥム、硝酸アンモ-ゥム、塩化カルシウム、水銀利尿薬、ァセタゾールアミド、ジクロノレフエナミド、トリクロノレメチアジド、ヒドロクロ口チアジド、ベンジノレヒドロクロロチアジド、ペンフルチジド、メチクロチアジド、メトラゾン、クロールタリドン、フロセミド、ェタクリン酸、ピレタ -ド、ブメタミド、ァゾセミド、メフルシド、スピトノラタトン、トリアムテレン、カンレノ酸カリウム、へキサミン、マンデル酸、ニトロフラントイン、ェルゴトキシン、エノレゴタミン、エノレゴメトリ、メチノレエノレゴメトリン、ォキシトシン、ジノプロスト、ジノプロストン、ゲメプロスト、スパルティン、酢酸フエ-ル水銀、硫酸ォキシヒノリン、経口避妊薬などが挙げられる。

[0125] 前記皮膚、粘膜作用薬としては、例えば、力ラシ、カンタリス、トウガラシ、タンニン酸、没食子酸、酸化亜鉛、一酸化鉛、四三酸化鉛、硫酸亜鉛、酢酸鉛、硫酸アルミニゥム、硫酸アルミ-ゥムカリウム、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、氷酢酸、トリクロル酢酸、塩酸、乳酸、硝酸銀、塩化第二鉄、塩化亜鉛、硫酸銅、クェン酸銅、サリチル酸、ィォゥ、アラビアゴム、トラ力ガントゴム、でんぷん、ァガー、メチルセルロース、グリセリン、プロピレングリコール、ォリーブ油、ツバキ油、ゴマ油、ナタネ油、ダイズ油、ラッカセィ油、トウモロコシ油、ヤシ油、カカオ S旨、ステアリン酸、牛脂、豚脂、ラノリン、ノラフィン、ペトロラタム、蜜ろう、タルク、カオリン、石松子、薬用炭、フイブリノ一ゲン、トロンボプラスチン、吸収性ゼラチンスポンジ、酸ィ匕セルロース、メトキサレン、モノべンゾンなどが挙げられる。

[0126] 前記ビタミン剤としては、ビタミン A、ビタミン。，ビタミン E,ビタミン F、ビタミン、ュビキノン、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ノントテン酸、 α—リポ酸、ビチオン、葉酸、メゾイノチトール、 Ρ-アミノ酸安息香酸、シァノコバラミン、プロスルチアミン、フルスルチアミン、ォクトチアミン、ビスベンチアミン、ベンフォチアミン、シコチアミン、ジセチアミン、ァスコルビン酸、ビタミン Pなどが挙げられる。

[0127] 前記化学療法剤としては、ペニシリン系、セフエム系、ォキサセフエム系、モノパクタム系、カルパぺネム系、 13ラクタマーゼ阻害剤、ホスホマイシン、アミノ配糖体系、クロラムフエ-コール、テトラサイクリン系、マクロライド系、リンコマイシン系、リファマイシン、抗ミコバタテリゥム系、ポリエンマクロライド系、合成抗菌薬などの抗生物質、サルファ剤、キノロン剤、ピタラビン、イドクスゥリジン、ァシクロビル、ガンシクロビル、ジドブシン、ジダノジン、インターフェロン、ァマンタジン、ェメチン、ピリメタミン、クロ口キン、プリマキン、キナクリン、メトロ-ダゾール、イセチオン酸ペンタミジン、サントニン、カイニン酸、ピぺラジン塩、パモ酸ピランテル、プラジカンテル、カマラ、酒石酸アンチモンナトリウム、ジェチルカルバマジン、へキシルレゾルシン、アンチモン化合物、二クロサミド、ビォチノール、ベフエ-ゥムヒドロキシナフトエート、ピルビ-ゥムパモエート、ィソチアニド、ストレプトマイシン、リファンピシン、エタンプトール、パラアミノサリチル酸、塩酸メクロルエタミン、シクロフォスフアミド、メルファラン、チォテパ、ブスルファン、二ムスチン、メトトレキサート、 6—メルカォゥトプリン、 5—フルォロウラシル、シタラビン、ジェチノレスチノレべストローノレ、ェチ-ノレエストラジオ一ノレ、テストステロンプロピオネート、フルォキシメステロン、クラウステロン、ハイド口コルチゾン、プレド-ゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、タエン酸タモキシフェン、タエン酸トレミフェン、ァクチノマイシン D、アントラサイクリン、ドキソルビシン、ダウノビシン、アクラルビシン、ェピルビシン、ピラノレビシン、ブレオマイシン、ぺプロマイシン、マイトマイシン C、ビンブラスチン、ビンデシン、エトポシド、イリノテカン、 Lーァスパラキナーゼ、ペントスタチン、シスプラチン、トレチノイン、ビシバニール、クレスチン、リン酸ォセルタミビルなどが挙げられる。

[0128] 前記生物学的製剤としては、例えば、ジフテリア、破傷風混合ワクチン、経口生ポリォワクチン、乾燥弱毒風疹ワクチン、乾燥弱毒麻疹ワクチン、インフルエンザ HAワクチン、日本脳炎ワクチン、乾燥 BCGワクチン、痘瘡ワクチン、コレラワクチン、ワイル病秋疫混合ワクチン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ガス壊疽抗毒素、ジフテリァ抗毒素、蛇抗毒素、破傷風抗毒素、精製ッベルクリン、 BCGなどが挙げられる。前記漢方薬しては、例えば、安中散、釣藤散、黄連解毒湯、桂枝茯苓丸、小紫胡湯、抑肝散、八味地黄丸、葛根湯などが挙げられる。

[0129] (標的核酸検出装置）

本発明の標的核酸検出装置としては、以下の第一から第二の標的核酸検出装置が好適に挙げられる。

前記第一の標的核酸検出装置は、試料中の標的核酸を検出するための核酸プローブが担体に固定された核酸分析用デバイスであって、前記核酸プローブは標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブはハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少し前記標的核酸力解離するよう設計されている。

前記第二の標的核酸検出装置は、本発明の前記核酸プローブを標的核酸にハイブリダィゼーシヨンさせるノ、イブリダィゼーシヨン手段と、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブ力発生したシグナルを検出することにより該標的核酸の存在を検出する標的核酸検出手段と、を含む。

前記ハイブリダィゼーシヨン手段としては、本発明の前記核酸プローブを前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンさせることができれば特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、本発明の前記核酸チップなどが好適に挙げられる。

[0130] 前記標的核酸検出手段は、本発明の前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に生じた前記シグナルを検出することにより前記標的核酸を検出する手段であり、例えば、上述したシグナルが、発光、消光等の場合には受光装置、カメラ等などが挙げられ、放射線の放射の場合には感光フィルムなどが挙げられ、温度変化の場合には熱電対、温度センサーなどが挙げられ、磁力変化の場合には磁力センサーなどが挙げられ、切断片発生の場合には電気泳動、 SDS— PAGE、ウェスタン .ブロッテイングなどが挙げられ、物質生産の場合には抗体、 HPLC、ァフィ-ティークロマトグラフィーなどが挙げられ、物質消費の場合には IRスペクトル、 MS スペクトルなどが挙げられ、変形の場合には電子顕微鏡などが挙げられ、粘度変化の場合には粘度センサーなどが挙げられる。これらは、 1種単独で使用してもよいし、 2以上を併用してもよい。

前記シグナルが、前記核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィズした際に該核酸プローブが切断されて生じた、前記第一プローブ断片及び前記第二プローブ断片の内、該第一プローブ断片に存在する前記発光部の発光である場合には、前記標的検出手段としては、蛍光顕微鏡、感光フィルム、 CCDカメラなどが好適に挙げられる。

本発明においては、前記標的核酸検出手段が、前記標的核酸の存在のみならずその量までも定量することができるのが好ましい。

[0131] 前記その他の手段としては、例えば、遺伝子情報データベースを格納するデータベース部、標的核酸検出手段の検出結果データと、前記データベース部に格納された遺伝子情報データとを比較し分析するデータ分析部、インターネットに通信可能であり、該インターネット上の遺伝子情報データベースにアクセス可能な通信部、前記標的核酸検出手段の検出結果データと、前記インターネット上の遺伝子情報データベースの遺伝子情報データとを比較し分析するデータ分析部、などが好適に挙げられる。

前記遺伝子情報データベースとしては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができるが、特定の疾患に関する、健常人の遺伝子情報と患者の遺伝子情報とを含むものが好ましい。

[0132] 本発明の前記標的核酸検出装置の好ましい具体例としては、前記ハイブリダィゼーシヨン手段としての本発明の前記核酸チップと、前記標的検出手段としての前記蛍光顕微鏡とを含む本発明の前記標的検出装置が、図 9に示すように、更に、 CPU 31、入力装置 32、メモリ 33、通信装置 34、データベース装置 36、及びこれらを双方向通信可能に接続するメインバス 37を備えているものが挙げられる。

[0133] CPU31は、前記標的核酸検出装置の全体を制御し、メモリ 33に格納されたプログラム、各種データ等に基づいて動作し、各種機能を実現する。ここで該各種機能とは、他の標的核酸検出装置力受け取ったデータを診断する遠隔診断機能、他のプロノイダ及びその他サーバーとの情報の受け渡しを制御するため、異なる信号を統一化する照合処理機能、前記標的核酸に関する各種情報を提供するデータベース処理機能などが挙げられる。前記各種データとしては、遺伝子診断のために作られる各種リストのデータなどが挙げられる。 [0134] 入力装置 32は、プロバイダの管理者が、遺伝子診断の条件などの入力を行うための装置である。メモリ 33は、 CPU31によってアクセスされるためのプログラムや前記遺伝子情報データベース、前記標的核酸検出装置が受信した情報、必要に応じて記憶装置 35、データベース装置 36等から読み出した情報、などを格納する機能を有する。

通信装置 34は、インターネット、通信回線 15等を介した外部との通信を制御する装置である。通信装置 34は、例えば、モデムを変換装置として備えていてもよいし、 IS DN回線との接続に介在するターミナルアダプタ (TA)及びデジタルサービスユニット (DSU)を備えていてもよい。

[0135] 記憶装置 35は、各種プログラムや各種データを格納し、記憶する機能を有し、例えば、記憶手段としての ROM38、 ROM38に記憶された記憶媒体を読み込むレコーダー 39などを有している。記憶装置 35としては、 ROM等の電子メモリ回路 (電子記憶媒体)のほかに、フロッピーディスク等の磁気記憶媒体を前記記憶媒体とする磁気記憶装置、 CD - ROM等の光学的記録媒体を前記記憶媒体とする光学記憶装置などが挙げられる。前記記憶媒体としては、記憶装置 35に固定的に設けたものであつてもよいし、着脱自在に設けたものであってもよい。記憶装置 35に記憶されるプログラム、データ等は、前記標的核酸検出装置外にある記憶装置から通信手段を介して受信するようにしてもよヽ。

データベース装置 36は、過去の前記標的核酸のデータリストなどを内部に格納している。

[0136] (遺伝子診断方法）

本発明の遺伝子診断方法は、本発明の前記標的遺伝子検出装置を用い、標的核酸発現量定量ステップと、診断ステップとを含み、更に必要に応じて適宜選択したその他のステップを含む。

[0137] 前記標的核酸発現量定量ステップは、被検者における、特定疾患に関する標的核酸の発現量を定量するステップである。

該ステップは、上述した本発明の標的核酸検出装置を用いた本発明の標的核酸検出方法により好適に行うことができ、例えば、本発明の前記核酸プローブを用い、前記標的核酸の発現量と発光量との関係を表す検量線を予め作成しておき、該検量線を用いて定量することにより、行うことができる。

[0138] 前記診断ステップは、該被検者における前記特定疾患に関する標的核酸の発現量と、遺伝子情報データベースに含まれる、該特定疾患に関する標的核酸の健常人の発現量及び患者の発現量とをデータ分析部により比較し、該被検者が前記特定疾患の患者である力否かを診断するステップである。

該診断ステップは、本発明の前記標的検出装置における、前記データベース部、前記データ分析部、前記通信部、前記データ分析部などにより好適に行うことができる。例えば、上述した記憶装置 35に、該遺伝子診断方法のプログラムを記憶させておき、データベース装置 36に過去の検出データ力も平均化された後述の (Xi— SZ M-S)における S値と M値とを記憶させておき、前記被検者の前記疾患遺伝子 (前記 Xi)を前記標的核酸検出装置で定量し、前記 CPUが前記 (Xi - SZM - S)を計算し、前記被検者の健康状態を CPUが診断する。本発明の遺伝子診断方法によると、僻地等であっても診断が可能となる点で有利である。

[0139] 前記診断ステップにお!/、ては、例えば、特定疾患に関する標的遺伝子の、患者の発現量を Mとし、健常人の発現量を Sとし、被検者の発現量を Xiとしたとき、 (Xi-S/ M-S)≥0. 9、を満たすとき、該被検者を前記特定疾患の患者であると診断するようにしてもよい。このような計算は、前記標的核酸検出装置における前記 CPU等により瞬時に行うことができ、この場合、高速なコンピューター診断が可能となる。

なお、前記 (Xi— SZM— S)の値が、 0. 1以下であると、一般に、疾病の因子がない、予後がよいことなどを意味し、 0. 9近づくにつれて、ある被検者の標的核酸 (疾患遺伝子）の発現が特定の疾患の状態に近づいていることを意味し、 0. 9を超えると、前記標的核酸 (疾患遺伝子)の発現量が 90%疾患遺伝子をもつ患者及び因子を持つ健常人に近いこととを意味する。

[0140] 前記その他のステップとしては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、疾患遺伝子をいくつかの候補を力選択する選択ステップ、などが挙げられる。

[0141] 本発明の遺伝子診断方法により診断することができる病気乃至疾患としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、癌、アルカプトン尿症、全身性エリトマト一デス、皮膚筋炎、慢性関節リュウマチ、強皮症、精神病、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、花粉症、ループス腎炎、クロイトフェルツヤコブ病、ァルツハイマー病、パーキンソン病、マルファン症候群、ウイリアムス症候群、再生不良性貧血、赤血球増多症、ファンコ-症候群、血友病 A、血友病 B、ホン'ウィルブランド病、血小板無力症、突発性血小板減少性紫斑病、チアダック ·東症候群、尋常性天疱瘡、フレリー症候群、脆弱 X症候群、エドワード症候群、ミラー ·デッガー症候群、プラダーヴイリ一症候群、クブロッホ'サルツバーガー症候群、ローン症候群、クラインフェルター症候群、アンジェルマン症候群、網膜色素変性症、爪膝蓋骨症候群、ベーチェット病、マジャトジヨセフ病、ゾリンガー ·エリソン症候群、猫鳴き症候群、ターナー症候群、ストレンジプール病、メルゲルソン'ローゼンタール症候群、アルドステロン症、橋本病、クレチン病、クッシング症候群、 ADH分泌異常症候群、末端肥大症、鎌形赤血球症、潰瘍性大腸炎、クローン病、家族性大腸性ポリポーシス、ダウン症、糖尿病、メープルシロップ尿症、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、痛風、多発性筋炎、シヱグレン症候群、混合性結合織病、ピルェ.ロビン症候群、プルーマー 'ビンソン症候群、ランセィ 'ハント症候群、顔面半側萎縮症、外胚葉性異型性症、骨形成不全症、オスラー病、ライター症候群、サルコイドーシス，若年性関節リュウマチ、ギルバート症候群、ローター症候群、へモクトマト一シス、フエ-ルケトン尿症、グリシン尿症、チロシノーシス、シスチン尿症、ホモシスチン尿症、ホルナー症候群、プラダーゥイリ症候群、ゴージヱ病、ヒスチジン血症、ウィルソン病、骨軟化症、嚢胞性繊維症、ポルフィリン代謝異常、ピリルビン代謝異常、 ADA欠損症、自己免疫性溶血性貧血、サラセミア、ヘモグロビン C症、ピルビン酸キナーゼ欠損症、 G6PD欠損症、遺伝性球状赤血球症、家族性周期性四肢麻痺、重症筋無力症、ギランバレー症候群、多発性硬化症、副甲状腺機能低下症、副甲状腺機能亢進症、クローゾン病、インスリノーマ、バセドウ病、高脂血症、舞踏病、高血圧、緑内障、白内障などが挙げられる。本発明の遺伝子診断方法は、これらの診断のみならず、これらの予後の推定、疾病にか力るリスク推定などを行うこともでき、また、投与する薬剤に対する生体の適応性などを標的核酸 (遺伝子)の発現量により分析等することもできる。 [0142] 以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

(実施例 1)

-核酸プローブの設計 - 本発明の核酸プローブとして、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能な領域となる塩基配列 3a及び 3bを両末端に有し、公知のリボザィム（8— 17DNAzyme)を一部に有してなる塩基配列を用いた。該塩基配列は、下記配列 1に示す塩基配列を有しており、前記切断部としての rAは、 5'末端側カゝら数えて 15番目に位置していた。また、前記切断部としての rAを切断する活性を有する前記切断活性領域 (リボザィム活性を示す）は、 5'末端側力も数えて 32番目に位置する Tと、 5'末端側から数えて 46番目に位置する Aとの間に存在していた。この選抜した塩基配列における、 5，末端側から 14番目の塩基 (T(dT) )として、前記発光部としての蛍光物質 (F)：フルォロセインが結合したチミン (dT)、即ちフルォロセイン dT ( (ダレンリサーチ（Glen Reserch)社製)を用い、 5'末端側から 18番目の塩基 (T)として、前記消光部としての消光物質（Q)：ジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)が結合したチミン (dT)、即ちジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)— dT (グレンリサーチ（G len Reserch)社製)を用いた。以上により、実施例 1の核酸プローブを作製した。また、 5'末端から 1番目の Aから 5'末端から 10番目の Cまでを 3bとし、 3'末端から 1番目の Cから 3'末端から 10番目の Cまでを 3aとした。

[0143] (配列 1)

GACGAAGTTCTAGTTGGTC-3 '

[0144] 図 2は、実施例 1の核酸プローブの一次元構造を模式ィ匕した図であり、塩基配列 3a 側が 3'末端側であり、塩基配列 3b側が 5'末端側である（上記 (配列 1)と左右が逆になっている）。図 2に示すように、前記切断部としての rAは、前記発光部及び前記消光部の間に存在するため、該切断部が切断されて、実施例 1の核酸プローブが第一プローブ断片と、第二プローブ断片とに分割されると、前記発光部は前記第一プローブ断片上に存在することになり、前記消光部は前記第二プローブ断片上に存在することになる。

図 3は、実施例 1の核酸プローブが標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンした際の三次元構造を模式ィ匕した図である。図 3に示すように、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に分子内でハイブリダィゼーシヨン可能な領域が前記切断部を中心（間）にして互いに隣接して位置する 2つである場合、その内の塩基配列 3a及び 3b側に近い方を Yとし、他方を Zとしたとき、前記 Yの塩基配列数力であり、前記 Zの塩基配列数力であり、前記 Y及び Zの合計の塩基配列数が 8であった。

[0145] 核酸プローブの合成

以上のように設計した実施例 1の核酸プローブを、 DNA合成機を使用した固相合成法により、固相合成し、脱保護を行い、ゲル電気泳動法により目的鎖長の前記核酸プローブのみを分離精製した。

まず、 A— TOM— CE (Phosphoramidites) (グレンリサーチ（Glen Reserch)社製)を保護基として用い、発光物質 F及び消光物質 Qを保護し、前記 DNA合成機（ダレンリサーチ（Glen Reserch)社製）を用いた固相法により、： L molの濃度の前記標識物質を導入した本発明における核酸プローブを合成した。

[0146] 合成後、生成物をチューブに移し、ここにメチルァミン (40%メチルァミン水溶液と、 33%メチオアミン'エタノール溶液の等量混合液）を 1. 5ml添カロし、 35°Cで 6時間のインキュベートをし、前記核酸プローブを、前記固相から取り出し、前記標識物質の保護基を除去した。

[0147] 次に、前記チューブを氷上で冷やした後、前記チューブを注意深く開け、滅菌状態下で上清を回収し、凍結乾燥した。該凍結乾燥後、 1Mのテトラプチルアンモニゥムのテトラヒドロフラン (THF)溶液 lmlを、前記チューブに添加し、 50°Cで、 10分間の浸盪をし、前記核酸プローブについた前記保護基と、前記標識物質の部位にある基とを除去し、 35°Cに冷却した後、再び 6時間の浸盪をした。

次に、 1Mのトリス緩衝液 (pH7. 4) lmlをチューブに添カ卩した後、よく浸盪し、遠心濃縮法により、前記 THFを除去した。更に、 1Mのトリス緩衝液 (pH7. 4) lmlを、前記チューブに添カ卩し、前記チューブ内の核酸プローブ溶液の全量を 2mlとした。

[0148] 核酸プローブの精製 NAP— 25カラム（フアルマシア社製）を、水 15mlで平衡化した後、前記核酸プロ一ブ溶液 2mlを前記 NAP— 25カラムにカ卩えた。前記核酸プローブ溶液を完全に前記カラムに浸透させた後、蒸留水 0. 5mlをカ卩え、いわゆるゲルろ過を行い、不純物を除去した。更に蒸留水 3mlを用いて、脱塩した前記核酸プローブを溶出した。

前記ゲルろ過した核酸プローブを凍結乾燥した後、 7Mの尿素を含有した 20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。前記電気泳動後、 UV照射することにより、核酸プローブのバンドを確認し、前記バンドの分画を切り出した。前記分画を遠心管に入れ、ガラス棒を用いてゲルを粉砕し、水を 10ml加え、 37°Cで 6時間の浸盪をした。透析後、凍結乾燥処理を行い固化物を得た。該固化物を蒸留水 0. 4mlに溶解した後、 20°Cに冷凍保存した。

[0149] —ハイブリダィゼーシヨン及び切断活性反応—

前記標的核酸として、下記配列 2に示す塩基配列を有する 22ntのオリゴヌクレオチドを用意した。

[0150] (配列 2)

5 ' -GACCAACTAGAAGATGAGAAGT-3 '

[0151] 前記標的核酸 500pmolと、前記核酸プローブ lOOpmolとを、 50mMトリスー 25m M塩化マグネシウム水溶液 (pH7. 2) 100 1中、37でで1. 5時間、インキュベートをした。更にエタノール 800 1を加え、 4°Cで 12, OOOgの遠心分離を行い、エタノール沈殿を行った。上清を除き、残存している前記エタノールを真空乾燥により完全に除去した。

[0152] 標的核酸の検出

前記真空乾燥により、前記エタノールが完全に除去された沈殿物を、ホルムアルデヒド 5 1で溶解し、 7Mの尿素を含有した 20%ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を行った。 UVランプを照射し、バンドの存在を確認したところ、前記核酸プローブよりも長さが短い前記核酸プローブ断片が観られた。この結果、前記核酸プローブは、前記標的核酸とハイブリダィゼーシヨンし、前記切断活性領域による前記切断部の自己切断が生じたことが確認された。

[0153] 前記標的核酸 lOpmolと、前記核酸プローブ lOOpmolとを、 50mMトリスー 25mM 塩化マグネシウム水溶液 (pH7. 2) 100 1中で、 37°Cで、 6時間のインキュベートをした（マグネシウムイオンの濃度は 25mMであった)。この反応溶液に波長 495nmの励起光を照射し、測定蛍光波長 520nmの蛍光スペクトル変化を蛍光測定機（島津製作所製、 RF - 5300PC)を用いて測定した。前記蛍光の強度の増加から、前記核酸プローブが前記標的核酸とハイブリダィゼーシヨンし、前記切断活性領域による前記切断部の自己切断が生じたことが確認された。

[0154] 前記発光の強度変化力前記核酸プローブの切断量を割り出したグラフを図 4に示した。図 4中、実線は、前記発光の強度から割り出した前記核酸プローブの切断量を示し、点線は、発光の増幅ができない従来の核酸プローブを用いた場合の理論値を示す。

この結果から、従来の核酸プローブでは、 1当量の前記標的核酸に対して、 1当量のプローブしか反応しないが、本発明の核酸プローブでは、時間と共に切断量が増加し、 1当量の前記標的核酸に対し、 1当量以上の反応を示し、発光が増幅されることが半 ljつた。

[0155] (実施例 2)

-核酸プローブの設計 - 本発明の核酸プローブとして、下記配列 3— 5の塩基配列を有する核酸プローブを選抜した。具体的には、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能な領域となる、 5 ，末端側に位置する X配列の 3'末端側に続く X側配列（5'末端側力 GTAGGAGT )及び 3，末端側に位置する Y配列の 5，末端側に続く Y側配列（3 '末端側カゝら GTG CCAGG)を両末端に有する一本鎖の DN Aランダム配列プールを作製した。該 DN Aランダム配列プールには、前記 X側配列 (塩基配列数： 8)及び前記 Y側配列 (塩基配列数: 8)の間のランダム配列の長さや配列種が異なる多数の塩基配列が含まれている。該 DNAランダム配列プールは、 DNA合成装置を用いて、 3'末端側に位置する前記 Y配列及び Y側配列の内、該 Y側配列の 5，末端側に位置するシトシン (C)から一塩基づつ伸長させて、前記 Y側配列に続くランダム配列を合成し、該ランダム配列の 5'末端に、前記 X配列の 3'末端と前記 X側配列の 5'末端とが結合した配列における 3'側のグァニン (G)を結合させることにより、合成した。なお、このランダム配列中には、前記切断部としての rA (塩基がアデニンで、糖がリボース）が 1つ含まれている。

次に、前記 DNAランダム配列プールに含まれる多数の塩基配列の中力前記切断部の切断活性の高いものを選抜した。この選抜した塩基配列は、下記配列 3— 5 に示す塩基配列を有して!/、た。

配列 3では、前記切断部としての rAは、 5'末端側力も数えて 14番目に位置していた。また、前記切断部としての rAを切断する活性を有する前記切断活性領域 (リボザィム活性を示す）は、 5'末端側力も数えて 29番目に位置する Tと、 5'末端側から数えて 43番目に位置する Aとの間に存在していた。配列 3における、 5'末端側から 22 番目の塩基 (T(dT) )として、前記消光部としての消光物質 (Q)：ジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)が結合したチミン（dT)、即ちジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)— dT (グレンリサーチ（Glen Reserch)社製）を用い、 5，末端に、前記発光部としての蛍光物質 (F)：フルォロセインを結合させた、即ちフルォロセイン（（ダレンリサーチ (Glen Reserch)社製)を結合させた。以上により、実施例 2 における配列 3の核酸プローブを作製した。

配列 4では、前記切断部としての rAは、 5'末端側力も数えて 20番目に位置していた。また、前記切断部としての rAを切断する活性を有する前記切断活性領域 (リボザィム活性を示す）は、 5'末端側力も数えて 35番目に位置する Tと、 5'末端側から数えて 49番目に位置する Aとの間に存在していた。配列 4における、 5'末端側から 28 番目の塩基 (T(dT) )として、前記消光部としての消光物質 (Q)：ジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)が結合したチミン（dT)、即ちジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)— dT (グレンリサーチ（Glen Reserch)社製）を用い、 5，末端に、前記蛍光部としての蛍光物質 (F)：フルォロセインを結合させた、即ちフルォロセイン（（ダレンリサーチ (Glen Reserch)社製)を結合させた。以上により、実施例 2 における配列 4の核酸プローブを作製した。

配列 5では、前記切断部としての rAは、 5'末端側力も数えて 18番目に位置していた。また、前記切断部としての rAを切断する活性を有する前記切断活性領域 (リボザィム活性を示す）は、 5'末端側力も数えて 33番目に位置する Tと、 5'末端側から数えて 47番目に位置する Aとの間に存在していた。配列 5における、 5'末端側から 26 番目の塩基 (T(dT) )として、前記消光部としての消光物質 (Q)：ジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)が結合したチミン（dT)、即ちジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)— dT (グレンリサーチ（Glen Reserch)社製）を用い、 5，末端に、前記蛍光部としての蛍光物質 (F)：フルォロセインを結合させた、即ちフルォロセイン（（ダレンリサーチ (Glen Reserch)社製)を結合させた。以上により、実施例 2 における配列 5の核酸プローブを作製した。

[0157] (配列 3)

5'

GAAGCGGACCGTGTC-3 '

(配列 4)

5'

CCGGACGAAGCGGACCGTGTC-3 '

(配列 5)

5'

GGACGAAGCGGACCGTG-3 '

[0158] 図 5Bは、実施例 2の核酸プローブの一次元構造を模式ィ匕した図である。

前記配列 3の核酸プローブは、図 5Aに示すように、 5'末端側の前記 X配列が 5 '末端側から CCの 2塩基であり、 3'末端側の前記 Y配列が 3'末端側カゝら CTの 2塩基であり、 *印に位置する塩基 (T)として、消光物質 Qであるジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル (DABSYL)が結合したチミン (T (dT) )、即ちジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)—dT (グレンリサーチ（Glen Reserch)社製）を用い、 5'末端（最末端）に位置する塩基として、発光物質 Fであるフルォレセインが結合したリン酸基、即ちフルォレセインホスホロアミダイト（ダレンリサーチ（Glen Reserch)社製）を用いた。前記配列 3の核酸プローブにおいては、前記標的核酸とハイブリダィゼーションする領域の塩基配列数は、 3'末端側が 10であり、 5'末端側が 10であった。

[0159] 前記配列 4の核酸プローブは、図 5Aに示すように、 5'末端側の前記 X配列が 5'末端側から AAAAAGCCの 8塩基であり、 3 '末端側の前記 Y配列が 3 '末端側から CT の 2塩基であり、 *印に位置する塩基 (T)として、消光物質 Qであるジメチルァミノべンゼンスルフォ-ル（DABSYL)が結合したチミン（T (dT) )、即ちジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL) -dT (グレンリサーチ（Glen Reserch)社製）を用い、 5^末端 (最末端）に、発光物質 Fであるフルォレセインが結合したリン酸基、即ちフルォレセインホスホロアミダイト（（ダレンリサーチ（Glen Reserch)社製）を結合させた。前記配列 3の核酸プローブにおいては、前記標的核酸とハイブリダィゼーシヨンする領域の塩基配列数は、 3'末端側が 10であり、 5'末端側が 10であった。

[0160] 前記配列 5の核酸プローブは、図 5Aに示すように、 5'末端側の前記 X配列が 5'末端側から AAAAAGの 6塩基であり、 3，末端側の前記 Y配列が 0塩基であり、 *印に位置する塩基 (T)として、消光物質 Qであるジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DA BSYL)が結合したチミン (T (dT) )、即ちジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DAB SYL)— dT (ダレンリサーチ (Glen Reserch)社製)を用い、 5'末端 (最末端）に、発光物質 Fであるフルォレセインが結合したリン酸基、即ちフルォレセインホスホロアミダイト（（ダレンリサーチ（Glen Reserch)社製)を結合させた。前記配列 5の核酸プローブにお 1、ては、前記標的核酸とハイブリダィゼーシヨンする領域の塩基配列数は、 5'末端側が 8であり、 3'末端側が 8であった。

なお、実施例 2における、前記配列 3の核酸プローブを「TASC1プローブ」、前記配列 4の核酸プローブを「Locked TASC2プローブ」、前記配列 5の核酸プローブを「Locked TASC3プローブ」と、それぞれ称することがある。

[0161] 前記配列 3— 5の各核酸プローブにおいては、図 5Aに示すように、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に分子内でノ、イブリダィゼーシヨン可能な領域が前記切断部 (rA)を中心（間）にして互いに隣接して位置する 2つである場合、その内の前記 X配列及び前記 Y配列に近い方を Yとし、他方を Zとしたとき、前記 Yの塩基配列数が 3であり、前記 Zの塩基配列数が 3であり、前記 Y及び Zの合計の塩基配列数が 6であった。また、前記配列 3— 5の各核酸プローブは、前記標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンした際には、前記切断部 (rA)と対向する側に前記切断活性領域 (リボザィム活性を示す)が形成されており、該切断活性領域には 3塩基対の相補鎖部位が存在していた。 [0162] なお、前記配列 3— 5の各核酸プローブは、前記標的核酸にハイブリダィゼーションする前においては、 5'末端（5'最末端）に位置する前記 X配列と、 3'末端側であつて最末端ではなく 5'末端側にずれた箇所に位置し、該 X配列に対する相補配列と力分子内ハイブリダィゼーシヨンを生じているため、図 5A右に示すような、ステムループ構造を有していた。このステムループ構造は、該核酸プローブが前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に解かれた。実施例 2の核酸プローブは、前記 Lock ed TASCプローブであり、標的核酸にハイブリダィゼーシヨンする前においては、前記ステムループ構造を維持し、前記切断活性領域を形成せず、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記ステムループ構造が解かれて初めて前記切断活性領域が形成された。

[0163] 核酸プローブの合成

以上のように設計した前記核酸プローブを、 DNA合成機を使用した固相合成法により、固相合成し、脱保護を行い、ゲル電気泳動法により目的鎖長の前記核酸プローブのみを以下のように分離精製した。

まず、ホスホロアミダイト（Phosphoramidites) (グレンリサーチ (Glen Reserch) 社製）の Bz- dAと、 Bu- dGと、 Ac- dCと、 fluoresceinと、 Ac- A- Tomと、ダブシル— dTとを用い、 DNAZRNA合成機（ABI 392、パーキンエルマ一社製）を用いて前記核酸プローブをそれぞれ合成した。

[0164] 前記合成後、合成物をチューブに移し、メチルァミン溶液 (40%メチルアミン水溶液（フル力社製 75590)と、 33%メチルアミン'エタノール溶液（フル力社製 75580 )との等量混合液を 1. 5ml添カ卩し、 35°Cで 6時間のインキュベートをし、前記核酸プ

、た不純物を除去した。

前記チューブを氷上で冷やした後、前記チューブを注意深く開け、上清を回収し、凍結乾燥した。該凍結乾燥後、 1Mのテトラプチルアンモ -ゥム 'テトラヒドロフラン (T HF)溶液 lmlを、前記チューブに添加し、 50°Cで 10分間の浸盪をし、 35°Cに冷却後、再び 6時間浸盪し、前記核酸プローブについた前記保護基を除去した。

[0165] 核酸プローブの精製

NAP— 25カラム（フアルマシア社製)を蒸留水 15mlで平衡ィ匕した後、前記核酸プローブ溶液 2mlを前記 NAP— 25カラムに加えた。前記核酸プローブ溶液を完全に前記 NAP— 25カラムに浸透させた後、蒸留水 0. 5mlをカ卩え、いわゆるゲルろ過を行い、不純物を除去した。更に蒸留水 3mlを用いて、脱塩した前記核酸プローブを溶出し 7こ。

[0166] 前記ゲルろ過した核酸プローブを凍結乾燥した後、 7Mの尿素を含有した 8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。前記電気泳動後、 UV照射することにより、前記核酸プローブのバンドを確認し、この分画を切り出した。該分画を遠心管に入れ、ガラス棒を用いてゲルを粉砕し、水を 10mlカ卩え、 37°Cで 6時間の浸盪をした。透析後、凍結乾燥処理を行い固化物を得た。該固化物を蒸留水 0. 4mlに溶解した後、 -20°Cで冷凍保存した。

[0167] —ハイブリダィゼーシヨン及び切断活性反応—

前記標的核酸として、下記配列 6に示す 22ntのオリゴヌクレオチドと、下記配列 7に示す 22ntのオリゴヌクレオチドとを用意した。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ大腸菌 K12— MG1655の 16Sリボソーム RNA326— 347領域の RNA配列と、それを DNAに置き換えた DNA配列である。

[0168] (配列 6)

5， -GACACGGTCCAGACTCCTACGG-3 '

(配列 7)

5，— GACACGGUCCAGACUCCUACGG - 3 '

[0169] 前記標的核酸 500pmol水溶液、又は添加しなヽ水溶液（2種）と、前記配列 3の核酸プローブ水溶液と、前記配列 4の核酸プローブ水溶液との 2種を、それぞれ ΙΟΟρ molずつ下記組合せで混合し、 25mM塩化マグネシウム 50mMトリスー HC1緩衝溶液 (pH7. 2) 100 1中に添カロし、 3時間インキュベートした（マグネシウムイオン濃度は 25mMである）。この反応液をアクリルアミド電気泳動にて解析し、切断されているバンドをデンシトグラフ (ATTO社製)を用いて測定した。

[0170] 前記配列 3の核酸プローブ (TASC1プローブ）の水溶液のみが添加された反応液では、 Kobs—は、 1. 9 X 10— ³min— ¹であった。また、前記配列 3の核酸プローブと、前記配列 6の標的核酸とを添カ卩した場合では、 Kobs+は、 5. 3 X 10— ³min^_1であった。ァロステリックエフェクターとしてのパラメータ： Kobs+/Kobs—は、 3であり、前記切断活性領域による前記切断部の自己切断が、前記標的核酸のみでも生じてしまうことが判った。

前記配列 4の核酸プローブ（Locked TASC2プローブ： 5 '末端の配列が 3 ' GAA AAA5'である）の水溶液のみ添加された反応液では、前記 Kobs—は、 1. 0 X 10— ⁵ min— ¹以下であり、前記配列 4の核酸プローブと、前記配列 6の標的核酸とを添加した場合では、 Kobs+は、 4. 4 X 10— ³min— ¹であった。ァロステリックエフェクターとしてのパラメータ: Kobs+ZKobs—は 440以上であった。また、反応時間を 24時間とした場合、前記配列 4の核酸プローブのみ添加された反応液における自己切断は 3%以下であった。この結果から、前記ステムループ構造を有すると、前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンする前にお 1ヽては、前記切断活性領域による前記切断部の切断が生じてしまう擬陽性反応が改善されることが判った。

[0171] (実施例 3)

実施例 2にお、て、前記配列 3の核酸プローブ及び前記配列 6の標的核酸を用いず、前記配列 4の核酸プローブ (Locked TASC2プローブ）、前記配列 5の核酸プローブ (Locked TASC3プローブ）、下記配列 8の核酸配列（前記配列 5の核酸プローブとの相補鎖にぉ、て 2塩基相違)及び下記配列 9の標的核酸 (前記配列 5の核酸プローブとの相補鎖において 1塩基相違)を用いた以外は、実施例 2と同様にして

、前記標的核酸を検出した。

[0172] (配列 8)

5， -GACACTGTCCAGACACCTACGG-3 '

[0173] (配列 9)

5， -GACACTGTCCAGACTCCTACGG-3 '

[0174] 前記配列 8の標的核酸は、前記核酸プローブの相補鎖部分と 2つ塩基配列が異なつており、前記配列 9の標的核酸は、前記核酸プローブの相補鎖部分と 1つ塩基配列が異なっている。

[0175] 前記配列 4の核酸プローブ（Locked TASC2プローブ）の溶液と、前記配列 6の標的核酸溶液とが添加された反応液では、 Kobs (full+)力 4. 4 X 10— ³min— ¹であり、前記配列 4の核酸プローブ (Locked TASC2プローブ）の溶液と、前記配列 8の標的核酸溶液とが添加された反応液では、 Kobs (l-mis+) 1S 4. O X 10一³ min一¹であり、前記配列 4の核酸プローブ (Locked TASC2プローブ）の溶液と、前記配列 9 の標的核酸を添カ卩した反応液では、 Kobs(2— mis+)が、 1. 0 X 10— ⁵未満であった。

[0176] 前記配列 5の核酸プローブ (Locked TASC3プローブ)溶液と、前記配列 6の標的核酸溶液とが添加された反応液では、 Kobs (full) 1S 4. 3 X 10— ³min— ¹であり、前記配列 5の核酸プローブ（Locked TASC3プローブ)溶液と、前記配列 8の標的核酸とが添加された反応液では、 Kobs (l-mis⁺)が、 1 X 10— ⁵min— ¹以下であり、前記配列 5の核酸プローブ（Locked TASC3プローブ)溶液と、前記配列 9の標的核酸とが添加された反応液では、 Kobs (2-mis + )が、 1. 0 X 10— ⁵以下であった。ァロステリックエフェクターとしてのパラメータ： Kobs (full) /Kobs" ( 1一 mis+)は 440以上であった。

以上の結果から、前記配列 5の核酸プローブ (Locked TASC3プローブ）は、前記標的核酸が 1塩基でも異なれば反応せず、前記標的核酸に対する選択性が極めて高ぐ該標的核酸とハイブリダィゼーシヨンする領域の塩基配列数としては、 8 + 8 ( 2ケ所） = 16 (合計)が特に好ま、ことが判った。

[0177] (実施例 4)

実施例 3において、前記配列 5の核酸プローブ (Locked TASC3プローブ）溶液を用い、前記配列 4の核酸プローブ（Locked TASC2プローブ）を用いず、 25mM 塩化マグネシウム 50mMトリスー HCL緩衝溶液（pH7. 2) 100 1の代わりに、 900m Mの NaC150mMトリスー HCL緩衝溶液（pH7. 2) 100 1を等量用いた以外は、実施例 2と同様にして、前記配列 5の核酸プローブ（Locked TASC3プローブ）溶液と、前記配列 6の標的核酸溶液とを反応させ、反応液をフルォロセイン 96ゥエルミクロプレート（コ一-ング社製）にスポットし、蛍光イメージヤー（バルサドク 3000 フルォロセインイメージヤー、バイオラドネ土製)で、観察した。結果を図 10に示した。

この結果から、前記核酸プローブは、マグネシウムイオンが存在する場合には、前記切断活性領域の切断活性が生じたが（図 10のレーン 1参照）、ナトリウムイオンが存在する場合には、前記切断活性領域の切断活性が生じない（図 10のレーン 2参照 )ことが判った。

[0178] (実施例 5)

E. coliを、菌懸濁液の OD の値が 0. 5になるまで培養し、 167 μ 1の前記菌懸濁

600

液を 4000rpm、 10分間で遠心分離した後、上清を除去し、沈殿した菌体を 4%のパラホルムアルデヒドで 1時間固定し、 PBSで洗浄し、 1 μ Μの前記配列 5の核酸プローブ（Locked TASC3プローブ）のトリス— HC1緩衝液（50mM、 pH7. 2、 0. 1%S DS) (25mM MgCl又は 0. 9Mの NaCl、前記 10 Mのヘルパーオリゴヌクレオチド又は何も含有しなヽを含む）を調整した。この混合液（3種：前記 25mMの MgClが存在し、前記ヘルパーオリゴヌクレオチド水溶液力添加されない混合液、前記 0. 9 Mの NaClが存在し、前記ヘルパーオリゴヌクレオチド水溶液とを添カ卩した混合液、前記 25mMの MgClが存在し、前記ヘルパーオリゴヌクレオチド水溶液とを添カ卩した混合液)を、 37°Cでインキュベートした。 3 1の前記混合液を数回遠心し、蛍光顕微鏡 (KSォリンパス社製)を用いて観察した。

前記ヘルパーオリゴヌクレオチドの塩基配列を下記配列 10及び 11に示す。

[0179] (配列 10)

3， -GTCGGTGTGACCTTGACTCT-5 '

[0180] (配列 11)

3， -CCCTCCGTCGTCACCCCTTA-5 '

[0181] この結果を図 11に示した。図 11の a (左写真）は、前記ヘルパーオリゴヌクレオチド水溶液が添加されず、前記 MgCl水溶液を添加した混合液の画像であり、全く発光が観られな力つた。図 11の b (中央写真）は、前記ヘルパーオリゴヌクレオチド水溶液と、前記 NaCl水溶液とを添加した混合液の画像であり、弱い蛍光のみが観測された。図 11の c (右写真）は、前記ヘルパーオリゴヌクレオチド水溶液と、前記 MgCl水溶液とを添加した混合液の画像であり、強、発光が確認された。

この結果から、前記核酸プローブは、細菌類の細胞に導入することができ、前記へルパーオリゴヌクレオチドと、前記 MgClとを添加（マグネシウムイオンが存在）することにより、発光が増幅されることが確認された。

[0182] (実施例 6) 実施例 2にお、て、下記配列 12— 15の塩基配列を持つ核酸プローブを設計した以外は、実施例 2と同様にして実施例 6の核酸プローブを合成した。

[0183] (配列 12)

5， -AAAAAGCCGTAGGAGTGCTAGTCTTTTT-3 '

[0184] (配列 13)

5， -CCGTAGGAGTGCTTTTTAGCGGACCGTGTC-3 '

[0185] (配列 14)

5， -AAAAAGCCGTAGGAGTGCTA-3 '

[0186] (配列 15)

5， -GAAGCGGACCGTGTC-3 '

[0187] 前記配列 12— 15の核酸プローブは、前記配列 4及び前記配列 5の核酸プローブ（ステムループ構造を有する）のモデルとなる核酸プローブである。

[0188] 前記標的核酸として、以下の配列を持つオリゴヌクレオチドを用意した。

[0189] (配列 16)

5， -GGCATCCTCAGACCTGGCACAG-3 '

[0190] (配列 17)

5， -CATCCTCAGACCTGGCAC-3 '

[0191] 前記配列 13の核酸プローブは、前記配列 16の標的核酸とハイブリダィゼーシヨンする塩基配列数は、 10 + 10 (2ケ所） = 20 (合計)であり、また、前記配列 17の標的核酸とハイブリダィゼーシヨンする塩基配列数は、 8 + 8 (2ケ所） = 16 (合計)であつた。

実施例 2において、前記配列 3— 5との核酸プローブを前記配列 12— 15の核酸プローブに、前記配列 6— 7の標的核酸を前記配列 16— 17の標的核酸に代え、温度条件を変化させ、以下に示す前記核酸プローブと前記標的核酸との組合せで反応液を組成した以外は、実施例 2と同様にして、前記反応液を 260nmの吸光度を測定した。吸光度と温度との関係を図 13に示した。

[0192] 前記配列 12の核酸プローブは、標的核酸にハイブリダィゼーシヨンする前においては、完全なステムループ構造を有し（図 12A)、図 13に示す線 1のカーブにおける中心の Tm値は、 43°Cであった。この結果から、前記配列 4の核酸プローブと前記配列 5の核酸プローブとにおけるステムループ構造は、温度耐久性があることが判った前記配列 13の核酸プローブと、前記配列 16の標的核酸とをノ、イブリダィゼーシヨンさせた結果を図 13の線 2で表し、前記配列 13の核酸プローブと、前記配列 17の標的核酸とをハイブリダィゼーシヨンさせた結果を線 3で表した（図 12Bの形態である）。前記線 2のカーブにおける中心の Tm値は、 62°Cであり、前記線 3のカーブにおける中心の Tm値は、 53°Cであった。

[0193] 前記配列 14及び 15の核酸プローブと、前記配列 16の標的核酸とをノ、イブリダィゼーシヨンさせた結果を図 13の線 4で示し、前記配列 14及び 15の核酸プローブと前記配列 17の標的核酸とをノヽイブリダィゼーシヨンさせた結果を図 13の線 5で示した（図 12Cの形態である）。前記線 4のカーブにおける中心の Tm値は、 50°Cであり、前記線 5のカーブにおける中心の Tm値は、 43°Cであった。

この結果から、全て Tm値は 37°C以上となり、室温ではハイブリダィゼーシヨンに問題が生じないことが判った。

[0194] (実施例 7)

実施例 2において、下記配列 18の塩基配列を設計した以外は、実施例 2と同様にして、実施例 7の核酸プローブを合成した。

配列 18では、前記切断部としての rAは、 5'末端側力も数えて 20番目に位置していた。また、配列 18における、 5 '末端側から 28番目の塩基 (T(dT) )として、前記消光部としての消光物質（Q)：ジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)が結合したチミン（dT)、即ちジメチルァミノベンゼンスルフォ-ル（DABSYL)— dT (グレンリサーチ (Glen Reserch)社製)を用い、 5'末端に、前記蛍光部としての蛍光物質 (F )：フルォロセインを結合させた、即ちフルォロセイン（（グレンリサーチ（Glen Reser ch)社製)を結合させた。以上により、実施例 7における配列 18の核酸プローブを作製した。

[0195] (配列 18)

5' CCGGACGAAGCCTAGTTGGTC-3 '

[0196] Dulbecco's培地で、 Hela細胞（子宮癌細胞）を 1日間培養し、増殖して!/、ることを顕微鏡で確認した。それぞれ 1 X 10⁵個/ mlの濃度であることを確認し、 100マイクロリットルづっ 96穴プレートに分注した。 100マイクロリットルの PBSバッファーで洗浄後、 c fos遺伝子を標的とする実施例 7の核酸プローブ（1マイクロリットル)をリポフエクチン (インビトロゲン社製）とともに添加し、 37°Cで 1時間培養させた。蛍光スぺタトルを蛍光顕微鏡 (KSオリンノス社製、 FV500)を用いて検出した。

[0197] コントロールとして用いた正常細胞からは発光が検出されな力つた力前記 Hela細胞からは顕著な蛍光増幅が観られらた。この結果から、前記核酸プローブは高等生物の生細胞でも用いることができ、前記癌細胞と、正常細胞とを診断する上で有用な情報を得ることができることが判った。

[0198] (実施例 8)

(実施例 8)

Dulbecco's培地で、 Hela細胞（子宮癌細胞）をそれぞれ 1日間培養し、増殖していることを顕微鏡で確認した。 1 X 10⁵個/ mlの濃度であることを確認し、 100マイク口リットルづっ 96穴プレートに分注した。培養液に増殖因子 EGFとチロシンキナーゼ阻害剤を添カ卩し、 37°Cで、 6時間培養した。 100マイクロリットルの PBSバッファーで洗浄後、 EGFRシグナルマーカー c fos遺伝子を標的とする実施例 8の核酸プロ一ブ（1マイクロリットル)をリポフエクチン (インビトロゲン社製）とともに添加し、 37°Cで 1 時間培養させた。蛍光スペクトルを確認を蛍光顕微鏡 (KSォリンパス社製、 FV500) を用いて検出した。コントロールとして用いたチロシンキナーゼ阻害剤を添カ卩していない細胞力は発光が検出されたったが、前記チロシンキナーゼ阻害剤添加細胞からは顕著な蛍光の増幅が観られらた。

この結果から、チロシンキナーゼ阻害剤導入後の前記 Hela細胞では、原癌遺伝子の発現が抑制されたことが判った。本発明の核酸プローブを用いると、医薬品のスクリー-ングに有用な情報を得られることが判った。

[0199] (実施例 9)

実施例 2にお!/、て、前記配列 5の核酸プローブ（Locked TASC3プローブ）を用い、最終濃度が ImMの MgCl水溶液、 5mMの MgCl水溶液、 10mMの MgCl水溶液、 15mMの MgCl水溶液、 20mMの MgCl水溶液、 30mMの MgCl水溶液中で反応させた以外は、実施例 2と同様にして、前記配列 5の核酸プローブと、前記配列 6の標的核酸を反応させ、反応液をフルォロセイン 96ゥエルミクロプレート（コーニング社製）にスポットし、パルサドク 3000フルォロセイン'イメージヤー（バイオラドネ土製）で観察した。

この結果から、添カ卩する MgClの好ましい濃度としては、 20mM— 30mMであることが半 ljつた。

産業上の利用可能性

[0200] 本発明によると、標的核酸にハイブリダィズした核酸プローブ力生ずる発光を増幅させることにより、標的核酸に対する選択性が極めて高ぐ微量な標的核酸を高感度、高精度かつ高速で検出可能であり、遺伝子診断、食中毒菌の存在検査、虫歯乃至歯周病の診断、血液検査等に好適な核酸プローブを提供することができる。

[0201] 本発明の核酸プローブは、ウィルス、細菌、動物細胞、植物細胞などの微量な標的核酸 (遺伝子）の検出などに特に好適であり、輸血の血液のウィルス感染を防止する検査、神経疾患の病態分析に特に好適であり、人類の寿命及び QOLを向上させることができる。該核酸プローブは、酵素や試薬が不要であり、加熱等が不要で生体温度でも機能し、前記シグナルを細胞死を与えるほど増幅させる必要がなぐ細胞を破壊せずとも標的核酸の検出が可能である等の点で有利である。

[0202] また、本発明によると、前記核酸プローブを固定することにより、微量な標的核酸を高感度、高精度かつ高速検出乃至分析が可能であり、遺伝子診断、食中毒菌の存在検査、虫歯乃至歯周病の診断、血液検査等に好適な核酸チップを提供することができる。該核酸チップは、本発明の前記核酸プローブを用いているので、該核酸プローブの効果をそのまま奏することができる。

[0203] また、本発明によると、前記核酸プローブを用いることにより、微量な標的核酸を高感度、高精度かつ高速検出乃至分析が可能な標的核酸検出方法及び標的核酸検出装置を提供することができる。本発明の標的核酸検出方法及び標的核酸検出装置は、通院の手間を省かせることで、僻地の患者、通院距離の長い地方及び国の患者の QOLを向上させることができる。該標的核酸検出方法及び標的核酸検出装置は、本発明の前記核酸プローブを用いているので、該核酸プローブによる効果をそのまま奏することができる。

[0204] また、本発明によると、前記核酸プローブを用いることにより、薬剤の投与効果を分析可能であり、所望の薬剤を効率良くスクリーニング可能な薬剤スクリーニング方法を提供することができる。本発明の薬剤スクリーニング方法は、今まで得ることのできな力つた遺伝子情報から、副作用及び作用機序を明確にさせ、ティラーメード医療を実現させる製薬業に革命を起こし得る画期的な技術である。該薬剤スクリーニング方法は、本発明の前記核酸プローブを用いているので、該核酸プローブによる効果をそのまま奏することができる。

[0205] また、本発明によると、前記核酸プローブを用いることにより、特定疾患の患者であるかどうかを高効率かつ高精度で診断可能な遺伝子診断方法を提供することができる。本発明の遺伝子診断方法は、通院の手間を省力ゝせることで、僻地の患者、通院距離の長い地方及び国の患者の QOLを向上させることができる。該遺伝子診断方法は、本発明の前記核酸プローブを用いているので、該核酸プローブによる効果をそのまま奏することができる。

Claims

請求の範囲

[I] 標的核酸を検出するための核酸プローブであって、

該核酸プローブは前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブはハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少し、前記標的核酸から解離するよう設計されていることを特徴とする核酸プローブ。

[2] 前記構造変化は自己核酸酵素の形成を含む請求の範囲第 1項に記載の核酸プローブ。

[3] 前記核酸プローブは標識物質を有する請求の範囲第 1項から第 2項のいずれかに記載の核酸プローブ。

[4] 標的核酸を検出するための核酸プローブであって、

前記標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位と、自己核酸酵素を形成可能な核酸酵素形成部位と、

を有することを特徴とする核酸プローブ。

[5] 前記自己核酸酵素は前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである請求の範囲第 4項に記載の核酸プローブ。

[6] 前記核酸プローブ分子内でノ、イブリダィゼーシヨン可能な配列を含む分子内ハイブリダィズ領域を有する請求の範囲第 4項力第 5項に記載の核酸プローブ。

[7] 前記標的核酸の存在を認識容易にする標識物質を有する請求の範囲第 4項から第

6項の!/、ずれかに記載の核酸プローブ。

[8] 前記標識物質は少なくとも一対の蛍光物質と消光物質とを有する請求の範囲第 7項に記載の核酸プローブ。

[9] 担体に固定ィ匕されている請求の範囲第 1項力第 8項のいずれかに記載の核酸プローブ。

[10] 標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能であり、前記標的核酸にハイブリダィゼーションした際に構造が変化可能な構造可変部を有してなり、該構造可変部の構造が変化したときに該標的核酸力解離可能であることを特徴とする核酸プローブ。

[II] 標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能であり、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンしたときに切断される切断部を有してなり、標的核酸にハイブリダィゼーに前記切断部に対する切断活性を有する切断活性領域を形成可能であることを特徴とする核酸プローブ。

[12] 標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際にシグナルを発生させるシグナル発生部を有する請求の範囲第 10項力も第 11項のいずれかに記載の核酸プローブ。

[13] 標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能であり、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に、

切断されて前記標的核酸から解離可能な第一プローブ断片及び第二プローブ断片を生成する切断部と、

シグナルを発生させるシグナル発生部と、

を有してなることを特徴とする核酸プローブ。

[14] シグナル発生部が、第一プローブ断片及び第二プローブ断片が標的核酸力解離した時、シグナルを発生させる請求の範囲第 12項力も第 13項のいずれかに記載の核酸プローブ。

[15] シグナル発生部力発光を生ずる発光部と、該発光部に隣接して位置しているときは該発光部の発光を消光させる消光部とを含む請求の範囲第 12項から第 14項のいずれかに記載の核酸プローブ。

[16] 発光部が第一プローブ断片に存在し、消光部が第二プローブ断片上に存在する請求の範囲第 15項に記載の核酸プローブ。

[17] 標的核酸にハイブリダィゼーシヨンするまでは、分子内で一部が互いにノ、イブリダイゼーシヨンしてロック構造を形成している請求の範囲第 1項力も第 16項のいずれかに記載の核酸プローブ。

[18] 標的核酸にハイブリダィゼーシヨン可能であり、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンしたときに切断される切断部を有し、標的核酸にハイブリダィゼーシヨンするまでは、分子内で一部が互いにハイブリダィゼーシヨンしてロック構造を形成して、ることを特徴とする核酸プローブ。

[19] ロック構造が、ステムループ構造、ヘアピン構造、及びインターナルループ構造から選択される少なくとも 1種である請求の範囲第 17項力も第 18項のいずれかに記載の核酸プローブ。

[20] ロック構造において分子内ハイブリダィゼーシヨンが生じている分子内ハイブリダィゼーシヨン領域の内、一方の相補鎖の塩基配列数力 3— 8ntである請求の範囲第 17 項力第 19項のいずれかに記載の核酸プローブ。

[21] 標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に、分子内で一部が互いにハイブリダィゼーシヨン可能な分子内ハイブリダィゼーシヨン領域を有する請求の範囲第 1項力第

20項の!/、ずれかに記載の核酸プローブ。

[22] 分子内ハイブリダィゼーシヨン領域が、 2以上存在し、該領域の内、切断部を間にして互いに隣接して位置する 2つの内の一方を Yとし、他方を Zとしたとき、 Y及び Zの合計の塩基配列数が、 2— 12ntである請求の範囲第 21項に記載の核酸プローブ。

[23] Yの塩基配列数が 1一 8であり、 Zの塩基配列数が 1一 8である請求の範囲第 22項に記載の核酸プローブ。

[24] 標的核酸と相補的な塩基配列を少なくとも 2つ有し、該少なくとも 2つの相補的な塩基配列における塩基数が 6— 10である請求の範囲第 1項力も第 23項のいずれかに記載の核酸プローブ。

[25] 切断部がヌクレオチドで形成されており、該ヌクレオチドにおける糖力 ^ボースである請求の範囲第 11項、第 13項及び第 18項のいずれかに記載の核酸プローブ。

[26] 標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に、切断部に対する切断活性を示す切断活性領域を形成可能な請求の範囲第 11項、第 13項及び第 18項のいずれかに記載の核酸プローブ。

[27] 切断活性領域が、 DNAザィム活性、 RNAザィム活性及びリボザィム活性の少なくともいずれか有する請求の範囲第 26項に記載の核酸プローブ。

[28] 切断活性領域が、金属イオンと相互作用することにより、切断部に対する切断活性を示す請求の範囲第 27項に記載の核酸プローブ。

[29] 金属イオンが、マグネシウムイオンである請求の範囲第 28項に記載の核酸プローブ

[30] 発光部が発光物質を有し、消光部が消光物質を有してなり、

該発光物質と該消去物質との組合せ力フルォロセインイソチオシァネート (FITC )とテトラメチルローダミンイソチオシァネート（TRITC)との組合せ、ジメチルァミノべンゼンスルフォ-ル（DABSYL)とフルォロセインとの組合せ、から選択される請求の範囲第 15項力も第 29項のいずれかに記載の核酸プローブ。

[31] 請求の範囲第 1項力第 30項のいずれかに記載の核酸プローブを担体に固定してなることを特徴とする核酸チップ。

[32] 核酸プローブを用いて標的核酸を検出する核酸検出方法であって、

前記核酸プローブは前記標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブはハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少し前記標的核酸から解離するよう設計されていることを特徴とする標的核酸検出方法。

[33] 前記構造変化は自己核酸酵素の形成を含む請求の範囲第 32項に記載の標的核酸検出方法。

[34] 前記核酸プローブは標識物質を有し、該標識物質力発せられるシグナルは前記核酸プローブが前記標的核酸力解離する前後で異なるものである請求の範囲第 32 項力も第 33項のいずれかに記載の標的核酸検出方法。

[35] 標的核酸の少なくとも一部の塩基配列と相補的な配列を有する相補部位と、自己核酸酵素を形成可能な核酸酵素形成部位と、を有する核酸プローブを用いる標的核酸の検出方法であって、

標的核酸に前記核酸プローブを相補的に結合させるハイブリダィゼーシヨン工程とハイブリダィゼーシヨン形成の後、前記自己核酸酵素が形成され前記核酸プローブの構造が変化し、その結果ハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少して該核酸プロ一ブが前記標的核酸力解離する解離工程と、

前記解離工程で解離した前記核酸プローブの少なくとも一部を検出する検出工程と、

を有することを特徴とする標的核酸検出方法。

[36] 前記自己核酸酵素により前記核酸プローブが切断される請求の範囲第 35項に記載の核酸検出方法。

[37] 前記核酸プローブが担体に固定されている請求の範囲第 35項力も第 36項のいずれかに記載の標的核酸検出方法。

[38] 請求の範囲第 1項力第 30項のいずれかに記載の核酸プローブを標的核酸にハイブリダィゼーシヨンさせるハイブリダィゼーシヨン工程と、

該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブ力発生したシグナルを検出することにより該標的核酸の存在を検出する標的核酸検出工程と、を含むことを特徴とする標的核酸検出方法。

[39] 標的核酸検出工程が、標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プロ一ブが切断されて生じた、第一プローブ断片及び第二プローブ断片の内、該第一プローブ断片に存在する発光部の発光を検出することにより前記標的核酸の存在を検出する請求の範囲第 38項に記載の標的核酸検出方法。

[40] 標的核酸が、細胞内に存在する核酸及びウィルスの核酸のいずれかである請求の範囲第 38項力も第 39項のいずれかに記載の標的核酸検出方法。

[41] 標的核酸とのハイブリダィゼーシヨン力ヘルパーオリゴヌクレオチドの存在下で行われる請求の範囲第 38項力も第 40項に記載の標的核酸検出方法。

[42] 請求の範囲第 1項力も第 23項のいずれかに記載の核酸プローブを、薬剤投与により発現した標的核酸にハイブリダィゼーシヨンさせるハイブリダィゼーシヨン工程と、該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブ力発生したシグナルの有無を検出することにより該標的核酸の存在の有無を検出する標的核酸検出工程と、

を含み、

前記標的核酸の存在の有無により薬剤をスクリーニングすることを特徴とする薬剤スクリーニング方法。

[43] 標的核酸検出工程が、標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プロ一ブが切断されて生じた、第一プローブ断片及び第二プローブ断片の内、該第一プローブ断片に存在する発光部の発光を検出することにより前記標的核酸の存在を検出する請求の範囲第 42項に記載の薬剤スクリーニング方法。

[44] 試料中の標的核酸を検出するための核酸プローブが担体に固定された核酸分析用デバイスであって、

前記核酸プローブは標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした後構造変化を生じ、構造変化した前記核酸プローブはハイブリダィゼーシヨンの結合力が減少し前記標的核酸から解離するよう設計されていることを特徴とする標的核酸検出装置。

[45] 前記構造変化は自己核酸酵素の形成を含む請求の範囲第 44項に記載の標的核酸検出装置。

[46] 前記核酸プローブは前記標的核酸を認識容易にする標識物質を有する請求の範囲第 44項力も第 45項のいずれかに記載の標的核酸検出装置。

[47] 試料中の標的核酸を検出するための核酸分析用デバイスであって、

を有する核酸プローブが担体上に固定されていることを特徴とする標的核酸検出装

[48] 前記自己核酸酵素は前記核酸プローブを特異的に切断する切断活性を有するものである請求の範囲第 47項に記載の標的核酸検出装置。

[49] 前記核酸プローブは分子内でノヽイブリダィゼーシヨン可能な配列を含む分子内ハイブリダィゼーシヨン領域を有する請求の範囲第 44項力も第 48項のいずれかに記載の標的核酸検出装置。

[50] 前記核酸プローブは前記標的核酸を認識容易にする標識物質を備える請求の範囲第 44項力も第 49項のいずれかに記載の標的核酸検出装置。

[51] 請求の範囲第 1項力第 30項のいずれかに記載の核酸プローブを標的核酸にハイブリダィゼーシヨンさせるハイブリダィゼーシヨン手段と、

該標的核酸にハイブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プローブ力発生したシグナルを検出することにより該標的核酸の存在を検出する標的核酸検出手段と、を含むことを特徴とする標的核酸検出装置。

[52] 標的核酸検出手段力標的核酸にノ、イブリダィゼーシヨンした際に前記核酸プロ一ブが切断されて生じた、第一プローブ断片及び第二プローブ断片の内、該第一プローブ断片に存在する発光部の発光を検出することにより前記標的核酸の存在を検出する請求の範囲第 51項に記載の標的核酸検出装置。

[53] 遺伝子情報データベースを格納するデータベース部と、標的核酸検出手段の検出結果データと、前記データベース部に格納された遺伝子情報データとを比較し分析するデータ分析部と、を有する請求の範囲第 51項力も第 52項のいずれかに記載の標的核酸検出装置。

[54] インターネットに通信可能であり、該インターネット上の遺伝子情報データベースにァクセス可能な通信部と、標的核酸検出手段の検出結果データと、前記インターネット上の遺伝子情報データベースの遺伝子情報データとを比較し分析するデータ分析部と、を有する請求の範囲第 51項力も第 53項のいずれかに記載の標的核酸検出装

[55] 遺伝子情報データベースが、特定の疾患に関する、健常人の遺伝子情報と患者の遺伝子情報とを含む請求の範囲第 51項力も第 54項のいずれかに記載の標的核酸検出装置。

[56] 標的核酸検出手段が、標的核酸の量を定量する請求の範囲第 55項に記載の標的核酸検出装置。

[57] 請求の範囲第 56項に記載の標的遺伝子検出装置を用い、

被検者における、特定疾患に関する標的核酸の発現量を定量する標的核酸発現量定量ステップと、

該被検者における前記特定疾患に関する標的核酸の発現量と、遺伝子情報データベースに含まれる、該特定疾患に関する標的核酸の健常人の発現量及び患者の発現量とをデータ分析部により比較し、該被検者が前記特定疾患の患者である力否かを診断する診断ステップと、

を含むことを特徴とする遺伝子診断方法。

[58] 診断ステップにおいて、特定疾患に関する標的遺伝子の、患者の発現量を Mとし、健常人の発現量を Sとし、被検者の発現量を XIとしたとき、 (Xi-S/M-S)≥0. 9、を満たすとき、該被検者を前記特定疾患の患者であると診断する請求の範囲第 57 項に記載の遺伝子診断方法。