CN104372076B - 用于核酸指数式扩增的切口和延长扩增反应 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种扩增核苷酸序列的方法，其包含：合并具有靶核苷酸序列的靶核酸与(i)聚合酶、(ii)与所述靶核苷酸序列的第一链杂交的第一模板核酸、和(iii)与所述靶核苷酸序列第一链的互补链杂交的第二模板核酸，在所述聚合酶可延长所述模板核酸的条件下使其发生扩增反应，由此生成经延长模板核酸扩增子；其中：所述靶核苷酸序列的长度介于20与40个核苷酸之间；所述靶核苷酸序列在约10分钟内扩增1E+6倍或以上；并且上述步骤是在实质上等温的条件下实施。

Description

用于核酸指数式扩增的切口和延长扩增反应
相关申请案交叉参考
本发明主张优先于2007年7月14日申请并且标题为“用于核酸指数式扩增 的切口和延长扩增反应(Nicking and Extension Amplification Reaction for theExponentialAmplification of Nucleic Acids)”的美国专利申请案第11/778,018号，其是全文以引用方式而提及并纳入本文中。
技术领域
本发明一般来说涉及短DNA或RNA序列在恒温下的快速指数式扩增。
背景技术
随着人们对可快速检测有害物种的存在或确定目标区域遗传序列的系统的需要指数式增大，体外诊断学领域快速扩展。现有分子诊断学主要检测生物标记物并且包括小分子检测、基于免疫的分析和核酸测试。两个互补或实质上互补的核酸链之间的固有特异性使得可使用单一DNA或RNA序列进行快速特异性识别，其简单性使得核酸测试具有诱人前景。用于疾病管控的对细菌和病毒威胁剂、遗传修饰食品、和单核苷酸多态性的鉴定只是这些分子诊断工具的进展极为有利的少数领域。为满足这些不断增长的需求，人们已针对这些特异性和灵敏性需求研发并调整核酸扩增技术。
历史上，最常用的扩增技术是聚合酶链反应(PCR)，所述技术因其可靠性和特异性已在许多情况下成为检测方法的黄金标准。此技术需要使各种温度循环以进行以下步骤：dsDNA变性，短寡核苷酸引物复性，以及通过热稳定聚合酶沿模板来延长引物。尽管工程中的许多新进展已成功地将这些反应的时间缩短至20-30分钟，但仍然需要极高功率才能满足这些热循环单元的需求。
人们已研发出各种等温扩增技术来避免温度循环的需求。出于此需求，出现了DNA和RNA等温扩增两种技术。
转录介导扩增(TMA)采用具有RNA酶活性的逆转录酶、RNA聚合酶、和在5’末端 具有启动子序列的引物。逆转录酶自引物合成cDNA，降解RNA靶，并在反向引物结合后合成 第二链。随后RNA聚合酶结合至dsDNA的启动子区域并转录新RNA转录物，所述转录物可 用作进一步逆转录的模板。反应可在20-30分钟内产生十亿倍扩增。此系统不如其它DNA 扩增技术稳定，并且因此不是现场可部署测试，因为在无菌实验室外普遍存在RNA酶。此扩 增技术非常类似于自我持续序列复制(3SR)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，但其所用酶 不同。
单引物等温扩增(SPIA)也涉及多种聚合酶和RNA酶H。首先，逆转录酶沿RNA靶 延长嵌合引物。RNA酶H降解RNA靶并且使得DNA聚合酶可合成cDNA的第二链。随后RNA 酶H降解一部分嵌合引物以释放一部分cDNA并开放结合位点以供下一嵌合引物结合，并且 扩增过程再次进行所述循环。线性扩增系统可在约3.5hr内扩增极低水平的RNA靶。
Q-β复制酶系统是探针扩增方法。将与所选靶互补或实质上互补的探针区域插入MDV-1RNA中，所述RNA是Q-β复制酶的天然存在的模板。Q-β复制MDV-1质粒以使得合成 产物是Q-β复制酶模板自身，从而导致指数式扩增，只要针对模板的复制酶过量即可。因 为Q-β复制工艺如此灵敏并且不论是否存在靶都可扩增，因此需要多个洗涤步骤来清洗 非特异性结合复制质粒的样品。指数式扩增耗时约30分钟；然而，包括所有洗涤步骤在内 的总时间为约4小时。
也已研发出多种等温DNA扩增技术。滚环扩增(RCA)是基于质粒和病毒的自然复制来研发。引物沿环形模板延长，从而导致合成单链串联重复。捕获、洗涤和连接步骤对在靶存在下优先环化模板和减少背景扩增是必需的。分枝扩增(RAM)添加级联引物以供额外几何扩增。此技术涉及非特异性尺寸链的扩增，所述链为双链或单链。
解旋酶依赖性扩增(HDA)利用热稳定解旋酶(Tte-UvrD)来解开dsDNA以产生单链，所述单链随后可用于引物通过聚合酶进行的杂交和延长。热稳定HAD方法不需要非热稳定HAD所需要的辅助蛋白。所述反应可在单一温度下实施，但结合引物的初始热变性可生成更多产物。据报告，扩增长70-120个碱基对的产物的反应时间超过1小时。
环介导扩增(LAMP)是灵敏特异性等温扩增方法，其采用具有链置换能力的热稳定聚合酶和四种或以上种引物。所述引物设计为沿靶在正向和反向上连续复性。外引物的延长置换已延长内引物以释放单链。各引物设计为具有发夹末端，其在置换后立即咬合成发夹以促进自身引发和进一步聚合酶延长。其它环状引物可减少扩增时间，但会使反应混合物变复杂。总之，LAMP是较难多重化(也就是说同时扩增不止一个靶序列)的扩增方法，但据报导其由于具有多个必须与靶复性的引物而具有极高特异性，从而可促进扩增过程。尽管反应是在等温条件下进行，但双链靶需要初始热变性步骤。扩增在25至50分钟内进 行并且产生不同长度的梯形产物。
链置换扩增(SDA)是由沃克(Walker)等人在1992年所研发。此扩增方法使用两 组引物、链置换聚合酶、和限制性内切核酸酶。使用缓冲引物来置换首先延长的引物以产生供下一引物结合的单链。限制位点存于引物的5’区域。将经硫醇修饰的核苷酸纳入合成 产物中以抑制合成链的裂解。此修饰在链中聚合酶可延长的引物侧产生切口位点。对于双 链靶来说，此方法需要初始热变性步骤。则在低于双链靶区域解链温度的温度下进行反应。使用此方法通常在30-45分钟内扩增长60至100个碱基的产物。
这些和其它扩增方法论述于(例如)以下文献中：范尼斯，J(VanNess，J)等 人，PNAS2003，第100卷，第8册，第4504-4509页；陈，E.(Tan，E.)等人，分析化学 (Anal.Chem.)2005，77，7984-7992；利兹德，P.(Lizard，P.)等人，自然生物技术(Nature Biotech.)，1998，6，1197-1202；纳富，T.(Notomi，T.)等人，NAR 2000，28，12，e63；和科恩， N.(Kurn，N.)等人，临床化学(Clin.Chem.)2005，51：10，1973-1981。关于这些一般扩增技 术的其它参考文献包括(例如)美国专利第7112423号；第5455166号；第5712124号；第 5744311号；第5916779号；第5556751号；第5733733号；第5834202号；第5354668号； 第5591609号；第5614389号；第5942391号；和美国专利公开案第US20030082590号；第 US20030138800号；第US20040058378号；和第US20060154286号。
发明内容
本文提供扩增核酸靶序列的方法，所述方法依赖于切口和延长反应以在短于传统扩增反应(例如链置换扩增反应)的时间范围内扩增较短序列。本发明实施例包括(例 如)仅使用两个用来扩增靶序列的模板、一种或两种切口酶和聚合酶的在等温条件下进行 的反应。在实例性实施例中，聚合酶和切口酶具有耐热性，并且反应温度显著低于杂交靶区域的解链温度。切口酶仅在双链二倍体中的一个链上切口，从而使得不需要像在习用链置换扩增情形中那样纳入经修饰核苷酸。本发明方法不需要初始热变性步骤。在实例性实 施例中，由于反应简单，反应极易进行，不需要特殊设备(例如温度循环器)，并且可仅在约2.5至约10分钟内自基因组DNA将20-30聚体产物扩增108至1010倍。此外，在其它实例 性实施例中，所述方法能不实施单独逆转录步骤即扩增RNA。
因此，本发明第一实施例中提供扩增双链核酸靶序列的方法，所述方法包含使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与靶序列反义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列有义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；提供能在所述正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；提供能在所述反向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口酶；以及提供DNA聚合酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施：所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处切口，从而产生扩增产物。
在本发明某些实施例中，DNA聚合酶是耐热性聚合酶。在本发明其它实例中，聚合酶和所述切口酶在最高37℃、42℃2、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、或85℃的温度下稳定。在某些实施例中，聚合酶在最高60℃下稳定。聚合酶可选自(例如)由以下组成的群组： Bst(大片段)、9°N、温特(外)DNA聚合酶、热启动酶(Therminator)、和热启动 酶II。
切口酶可在(例如)切口酶结合位点上游切口，或在实例性实施例中，切口酶可 在切口酶结合位点下游切口。在某些实施例中，正向和反向模板包含可通过相同切口酶识 别的切口位点，并且所述第一与所述第二切口酶相同。切口酶可选自(例如)由以下组成 的群组：Nt.BspQI、Nb.BbvCi、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、NtAlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.Bpu10I、和Nt.Bpu10I。
在本发明某些方面中，靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板识别区域和所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。
DNA分子可为(例如)基因组DNA。DNA分子可选自(例如)由以下组成的群组： 质粒、线粒体和病毒DNA。在某些实施例中，以与反向模板相同的浓度提供正向模板。在其 它实例中，所提供正向模板与反向模板的比率在1∶100至100∶1比率范围内。
在本发明其它实例中，所述方法另外包含使用第二聚合酶。扩增可在(例如)恒 温下实施。此温度可为(例如)54℃至60℃。对于进行反应的时间长度，在某些实例中，可 将扩增反应物在恒温下保持1至10分钟。
本发明另外包含通过(例如)选自由以下组成的群组的方法来检测扩增产物：凝胶电泳、质谱、SYBR I荧光法、SYBR II荧光法、SYBR金、Pico绿、TOTO-3、嵌入染料检测、FRET、分子信标检测、表面捕获、毛细管电泳、纳入经标记核苷酸以容许通过捕获来检测、荧光偏振、和侧向流动捕获。可使用(例如)固体表面方法来检测扩增产物，例如其中至少一个捕获探针固定在结合所扩增序列之固体表面上。
本发明可用于多重扩增。因此，例如，在本发明某些实施例中，能扩增至少两个靶序列。“能扩增”意指扩增反应包含可扩增至少两个靶序列的适宜模板和酶。因此，例如，可预备能检测至少两个靶序列的扩增反应，但可能实际上仅一个靶序列存于所测试样品中，从而使得即使可能实际上仅一个序列进行了扩增，但两个序列都能扩增。或者，倘若存在两个靶序列，则扩增反应可导致两个靶序列都扩增。多重扩增反应可导致其所包含适宜模板和酶所针对的一个、某些、或所有靶序列发生扩增。
例如，至少一个模板可包含间隔子、阻断基团或经修饰核苷酸。
也提供扩增单链核酸靶序列的方法来作为本发明一实施例，其包含使包含单链靶序列的靶核酸与反向模板接触，其中所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；提供能在所述反向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；提供DNA聚合酶，其中所述聚合酶在一定条件下沿所述靶序列延长所述反向模板；使所述经延长反向模板与正向模板接触，其中所述正向模板包含位于3’末端且与靶序列5’末端相同的识别区域，所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；提供能在所述正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施：所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处切口，从而产生扩增产物。
所属领域技术人员应理解，本文所述涉及双链核酸靶序列扩增和扩增产物检测的实例也适用于单链核酸靶序列的扩增和扩增产物的检测。此外，在本发明各实例中，靶序列可为(例如)RNA，例如(但不限于)信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、病毒RNA、微小 RNA、微小RNA前体、或siRNA。在(例如)靶序列为RNA的本发明实例性实施例中，聚合酶 具有逆转录活性。在本发明另一实例中，靶序列为DNA，例如基因组DNA，或例如靶序列选自 由以下组成的群组：质粒、线粒体、和病毒DNA、或甚至PCR产物。
倘若在实例性实施例中本发明方法涉及不止一种聚合酶的使用，则所述聚合酶中至少一种可具有逆转录酶活性。
在本发明其它实施例中，提供一组寡核苷酸模板，其包含核酸扩增用第一模板，所述第一模板包含位于3’末端且与靶序列反义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；和核酸扩增用第二模板，所述第二模板包含位于3’末端且与所述靶序列反义链5’末端相同的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；其中所述靶序列在所述反义链的所述3’末端与所述反义链的所述5’末端之间包含1至5个不结合任一模板的间隔子碱基。
在其它实施例中，提供用于实施本发明核酸扩增方法的试剂盒，其包含DNA聚合酶；核酸扩增用第一模板，其包含位于3’末端且与靶序列反义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；核酸扩增用第二模板，其包含位于3’末端且与靶序列有义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；一种或两种热稳定切口酶，其中任一种酶都能在所述第一和所述第二模板的切口位点处切口，或第一酶能在所述第一引物的切口位点处切口并且第二酶能在所述第二引物的酶位点处切口。
试剂盒可在一个容器中提供(例如)所述聚合酶、切口酶、和模板。试剂盒可在两个容器中提供(例如)所述聚合酶、切口酶、和模板。在某些实例中，聚合酶和切口酶都在第一容器中，并且所述模板位于第二容器中。在某些实例中，聚合酶和切口酶经冻干。试剂盒可另外包含(例如)实施本发明扩增方法的说明书。试剂盒可另外包含(例如)试管。试 剂盒可另外包含(例如)侧向流动装置或试条。侧向流动装置或试条可另外包含(例如) 捕获探针，其中所述捕获探针结合扩增产物。试剂盒可另外包含(例如)检测部分，例如选 自由以下组成的群组者：荧光染料、胶体金颗粒、胶乳颗粒、分子信标、聚苯乙烯珠粒和诸如 此类。在其它实例中，试剂盒中至少一个模板可包含间隔子、阻断基团或经修饰核苷酸。
在扩增反应中包括三磷酸脱氧核苷(dNTP)。如本文所述，一或多个dNTP可经修饰或经标记，然而，在本发明方法中不需要使用经修饰NTP。如下所述命名核苷酸。三磷酸核糖核苷称作NTP或rNTP；其中N可为A、G、C、U或m5U来表示特定核糖核苷酸。三磷酸脱氧 核苷底物表示为dNTP，其中N可为A、G、C、T或U。在整篇文章中，在不特别提及DNA或RNA 的情况下单体核苷酸亚单元可表示为A、G、C或T。
在另一实施例中，提供核酸扩增方法，其包含形成以下物质的混合物：包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶核酸；正向模板，其所包含核酸序列包含位于3’末端且与靶序列反义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；反向模板，其所包含核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列有义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；能在所述正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；能在所述反向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口酶；和耐热性聚合酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施：所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处切口，从而产生扩增产物。在某些实施例中，正向和反向模板上的切口酶结合位点可由相同切口酶来识别，并且反应中仅使用一种切口酶。
在另一实施例中，提供核酸扩增方法，其包含形成以下物质的混合物：包含单链靶序列的靶核酸；反向模板，其中所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列3’末端互补或实质上互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口酶结合位点和所述切口位点上游的稳定区域；能在所述反向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；耐热性聚合酶，其中所述聚合酶在一定条件下沿所述靶序列延长所述反向模板；正向模板，其中所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与靶序列5’末端相同或实质上相同的识别区域；以及能在所述正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施：所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处切口，从而产生扩增产物。在某些实施例中，正向和反向模板上的切口酶结合位点可由相同切口酶来识别，并且反应中仅使用一种切口酶。
在本发明其它实施例中提供通过本发明扩增方法获得的扩增核酸的分离方法。在本发明其它实施例中提供检测和/或分析通过本发明扩增方法获得的扩增核酸的方法，包括(例如)使用SYBR I、II、SYBR金、Pico绿、TOTO-3、和大多数嵌入染料的方法、分子信标、FRET、使用具有荧光的固定探针的表面捕获、电化学或比色检测、质谱、毛细管电泳、纳入经标记核苷酸以容许通过捕获或荧光偏振来检测、侧向流动、和其它涉及捕获探针的方法。
使用捕获探针的检测方法包括(例如)使用核酸分子(捕获探针)，其包含与扩 增产物链互补或实质上互补的序列从而使得捕获探针可结合扩增核酸。在某些实施例中， 可使探针连接可检测标记并且可根据探针中与扩增产物特异性杂交的可检测标记来检测 扩增产物。反应可另外包含(例如)针对纳入或附接至捕获探针的分子的抗体。或者，例 如，捕获探针或与捕获探针结合的分子可纳入(例如)酶标记，例如过氧化物酶、碱性磷酸 酶、或β-半乳糖苷酶；荧光标记，例如荧光素或罗丹明(rhodamine)，或例如具有化学发光 或生物发光活性的其它分子。在某些实施例中，在所属领域技术人员已知并选择的条件下 使探针连接至固体载体上，并且可使扩增产物链特异性固定至与所述固体载体连接的捕获 探针上。在后一情况的实施例中，可对固体载体固定的扩增产物实施处理步骤，例如洗涤、 离子交换、自固体载体释放、或其它处理步骤。在某些实施例中，可在扩增产物固定至固体 载体上时对其进行检测。本发明实施例也包含这些检测和分析方法的组合。
附图说明
图1A-D是绘示本发明反应机制的草图。图1D是图1的图例。
图2.来自DNA NEARTM分析的反应产物的20％聚丙烯酰胺凝胶。
根据本发明方法在56℃下使反应进行2.5分钟，然后在94℃下经4分钟热变性。 在20％聚丙烯酰胺凝胶上以160V使6微升反应物运行约2.5hr。用SYBR II凝胶染色剂 对凝胶实施染色。泳道1：25聚体分析的无靶对照。泳道2：27聚体分析的无靶对照。泳道 3：用3.5E+5拷贝枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组DNA进行25聚体分析。泳道 4：用1.1E+6拷贝枯草芽孢杆菌基因组DNA进行27聚体分析。
图3.来自使用本发明方法的RNA分析的反应产物的20％聚丙烯酰胺凝胶。
在56℃下使反应进行12分钟，然后在94℃下经4分钟热变性。在20％聚丙烯酰 胺凝胶上以160V使6微升反应物运行约2.5hr。用SYBR II凝胶染色剂对凝胶实施染色。 泳道1和2：用1E+6拷贝埃博拉(Fbola)披甲RNA(安宾(Ambion))进行25聚体分析的反 应。泳道3和4：25聚体分析的无靶对照反应。25聚体反应产物划在白框中。
图4.炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)DNA分析产物的质谱。
将A)0拷贝靶或B)5E+5拷贝基因组DNA添加至反应中。使反应进行10分钟，然 后在94℃下经4分钟热变性。将10微升样品注入LC/ESI-MS中。(-4)电荷态的26聚体 产物和其互补序列划在黑框中。较小相邻峰是主产物的钠加合物。
图5.MS2基因组RNA分析产物的质谱。
将A)0拷贝靶、B)1E+6拷贝MS2基因组RNA、或C)1E+6拷贝合成靶DNA添加至反 应中。使反应进行10分钟，然后在94℃下经4分钟热变性。将10微升样品注入LC/ESI-MS 中。(-4)电荷态的27聚体产物和其互补链序列划在黑框中。较小相邻峰是主产物的钠加 合物。
图6.使用嵌入式荧光染料对扩增实施实时检测。
比较500拷贝鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)基因组DNA(正方形)与无靶对 照(NTC，空心三角形)的实时扩增。在58℃下使反应进行10分钟并用SYBR II通过实时 荧光进行监测(n＝5)。
图7.使用荧光共振能量转移(FRET)对扩增进行实时检测。
比较10,000拷贝鼠疫耶尔森菌合成DNA(正方形)与无靶对照(NTC，空心三角形)的实时扩增。在57℃下使反应进行10分钟，n＝3。
图8.使用分子信标实时检测土拉热弗朗西斯菌(Francisella tularensis)DNA扩增。
将0拷贝(空心三角形)或1E+5拷贝(正方形)添加至反应混合物中并在57.5℃ 下反应10分钟。
图9.比较假阳性率测试结果的平均AUC值。
误差棒表示一倍标准误差。在55℃下于存在和不存在枯草芽孢杆菌基因组DNA的情况下使枯草芽孢杆菌分析进行10min。在94℃下经4min使酶热变性。将10μL样品注 入LC/ESI-MS中并分析产物峰的曲线下面积(AUC)。真阳性物含有10,000拷贝枯草芽孢杆 菌DNA以及990,000拷贝近邻苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)DNA。真阴性物 含有10,000拷贝大肠杆菌(E.coli)DNA和990,000拷贝近邻DNA，并且水阴性物作为对照 不含DNA。
图10.重复实施使用分子信标检测的研究，其中由不同的操作者在不同的两天实施实验。
在57.5℃下(在存在和不存在500拷贝土拉热弗朗西斯菌基因组DNA的情况下) 使反应进行10分钟，并且在94℃下实施4min的热杀灭。添加300nM分子信标并在45、50 和57℃下进行监测(n＝24)。
图11.使用分子信标检测的反应的灵敏性。
在57.5℃下使分析进行10分钟。在94℃下通过4min的热失活步骤终止反应。添 加300nM分子信标并在57.5℃下监测荧光(n＝3)。监测在用1E+6、5E+5、5E+4、5E+2、50、 和0(NTC)输入拷贝的土拉热弗朗西斯菌基因组DNA扩增的反应物存在下开放的信标的荧 光，并将其与信标(MB)单独存在时的荧光作比较。
图12.扩增产物在NEAR反应中的终浓度。
在55℃下用不同拷贝的枯草芽孢杆菌基因组DNA使NEARTM反应物进行10min。在 94℃下经4分钟的热失活步骤来终止反应。将10微升样品注入LC/ESI-MS中，并分析1944 道尔顿处产物峰的AUC且将其与标准曲线相比较。
图13.输入RNA靶拷贝数与扩增产物终浓度的关联。
在55℃下用不同拷贝的对应于埃博拉基因组DNA的合成RNA使埃博拉NEARTM分析进行12min。在94℃下经4分钟的热失活步骤来终止反应。将10微升样品注入LC/ESI-MS 中，并且分析1936道尔顿处产物峰的AUC并且与AUC值的标准曲线相比较。(n＝3)
图14.证实NEAR反应特异性的质谱产物分析。
在多拷贝苏云金芽孢杆菌稀释物存在下于56℃下使炭疽芽孢杆菌NEARTM反应进行10min(n＝3)，然后在94℃下经4分钟热变性。将10μL样品注入LC/ESI-MS中并分析 产物峰的AUC值。
图15.干扰物组对扩增的效应。
在55℃下使枯草芽孢杆菌DNA反应进行10min，并将其加热至94℃并且保持4分 钟以终止反应。在1E+5拷贝枯草芽孢杆菌基因组DNA(“1E+5”)存在下或无靶DNA存在 下(″0″)使反应重复进行三次。样品x是未添加干扰物的对照分析。以50％反应体积 将干扰物A至F添加至枯草芽孢杆菌分析中。使用二因子ANOVA和邦弗朗尼(Bonferroni) t-测试来分析质谱产物峰的AUC。(图例：A＝无；B＝室尘、脱脂乳；C＝AZ测试用粉尘、 腐殖酸；D＝柴油烟粒；E＝脱脂乳；F＝霉菌孢子)
图16.枯草芽孢杆菌/炭疽芽孢杆菌DNA双重反应的凝胶电泳结果。
NEARTM反应包括对枯草芽孢杆菌(Bs)和炭疽芽孢杆菌(Ba)DNA二者具有特异性 的模板，在不存在靶DNA的情况下(阴性)、在枯草芽孢杆菌单独存在下(27聚体产物为 阳性)、以及在枯草芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌二者存在下(27聚体和25聚体产物分别为阳 性)进行反应。此分析中所用靶拷贝数为500,000拷贝。在57℃下使分析进行10min。改 变各分析中的模板浓度以控制扩增(对于炭疽芽孢杆菌为100nM并且对于枯草芽孢杆菌为 50nM)。在20％聚丙烯酰胺凝胶上以160V使样品运行约2小时。用SYBR II荧光染料对凝 胶实施染色并使其成像。以积分光密度(IOD)对荧光带实施量化和分析(n＝8)。
图17.通过凝胶电泳显示枯草芽孢杆菌/炭疽芽孢杆菌DNA双重反应的特异性结果。
NEARTM反应包括针对枯草芽孢杆菌(Bs)和炭疽芽孢杆菌(Ba)DNA二者的模板，在无靶DNA存在下(阴性)、在枯草芽孢杆菌DNA单独存在下(27聚体产物)、以及在枯草芽 孢杆菌和炭疽芽孢杆菌DNA二者存在下(各自为27聚体和25聚体产物)进行反应。此分 析中所存在各基因组的靶拷贝数为500,000拷贝。所有反应物都含有500,000拷贝苏云 金芽孢杆菌作为外源核酸。改变各分析中的模板浓度以控制扩增。在57℃下使分析进行 10min，在94℃下经4min热变性，并且将6微升分析物装载至20％凝胶上以160V运行约2 小时。用SYBR II荧光染料对凝胶实施染色并使其成像。以积分光密度(IOD)对荧光带实 施量化和分析。
图18.MS2/埃博拉RNA双重反应的凝胶电泳结果。
NEARTM反应包括针对MS2和埃博拉分析物二者的模板，在无靶RNA存在下(阴性， 泳道2-5)、在MS2单独存在下(27聚体产物，泳道6和7)、以及在MS2和埃博拉RNA二者存 在下(各自为27聚体和25聚体产物，泳道8和9)进行反应。此分析中所用靶拷贝数为 1E+6拷贝。在57℃下使分析进行10min。改变各分析中的模板浓度以控制扩增。在20％ 聚丙烯酰胺凝胶上以160V使样品运行约2.5小时。用SYBRII荧光染料对凝胶实施染色并 使其成像。以积分光密度(IOD)对荧光带实施量化和分析。
图19.经溶解孢子的DNA扩增的质谱分析。
比较经溶解与未溶解样品的扩增产物质量的平均AUC值。然后将经溶解孢子样品添加至母混合物(master mix)中并在55℃下反应10分钟，在94℃下经4分钟热变性，并 在质谱上运行以供分析。取产物峰AUC值的平均值并加以比较(n＝3)。
图20.展示用于表面检测的捕获和延长方法。
比较A.)一般结合(未添加聚合酶的阳性反应产物)、B.)500,000靶(添加有聚 合酶的阳性反应产物)，与C.)无靶(添加有聚合酶的阴性反应物)。在55℃下使NEARTM分 析进行10分钟，在94℃下经4分钟热变性，然后将其添加至具有以5’末端与表面结合的 捕获探针的板中。将聚合酶添加至阳性反应物的一孔中。在55℃下将板培养30min，洗涤， 添加SYBR II，洗涤3次，并在帝肯(Tecan)板读取器(495nm激发/530nm发射)上进行读 取。
图21.在存在(正方形)和不存在(空心三角形)1E+6拷贝基因组DNA的情况下 对单一模板固定在表面上的NEARTM FRET分析实施伪实时荧光检测。
在覆盖有中性链亲和素(neutravidin)的平底96孔板中实施反应。在缓慢搅拌 和37℃下将1微摩尔FRET标记反向模板溶液培养1hr。用PBS-吐温(Tween)溶液将各孔 洗涤3次以释放未结合模板。将本发明方法的NEARTM反应混合物添加至各孔中(所取每个 时间点添加一孔)并在58℃下于设定为135RPM的震荡培养器的加热模块上培养。在所取 各时间点处通过将1微升EDTA添加至孔中以终止反应。自底部使用帝肯100板读取器来 读取荧光。
图22.沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)分析的检测限。使用衣原体靶的2 倍稀释物实施一系列分析。A)以3次分析的平均值显示检测限的荧光检测的条形图。B) 显示单次分析结果的条形图。
图23.单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)与无害利斯特菌(L.innocua)的区分。展示一系列分析的结果的条形图，实施所述系列分析来确定所述分析区分两种不同细菌的能力。
图24.用病毒RNA实施的分析。展示以不同稀释度病毒RNA靶实施本发明方法的 一系列分析的结果的条形图。
图25.展示bar基因靶序列检测分析结果的条形图。
图26.展示检测miRNA靶序列的本发明方法的分析结果的条形图。
图27.Gc分析：LOD。A)展示检测基因组靶序列的一系列分析的平均值的条形图。B)单次分析的结果，每次分析包括50个基因组拷贝。
图28.枯草芽孢杆菌NEARTM分析。A)确定添加至样品中的参照寡核苷酸的量与 曲线下面积(AUC)之间关联的标准曲线。B)展示测定所生成特定产物量的本发明方法的分 析结果的条形图。C)展示分析结果的表。
图29.间隔子长度研究。A)展示确定不同间隔子长度的效应的本发明方法分析结果的条形图。B)用于获得不同间隔子长度的模板序列。
图30.用于图29中所示分析的模板设计。
图31.稳定区域的效应。A)使用包括或不包括稳定区域的寡核苷酸模板实施的本发明方法的分析结果图。B)A)图中一部分的扩展。
图32.Mg+2浓度的滴定。A)展示使用不同Mg+2量实施的一系列NEAR分析结果的 条形图。B)展示分析中各组份的图表。
图33.绘示本发明方法反应机制的草图。
图34.靶序列和寡核苷酸模板序列的实例列表。
具体实施方式
本文提供指数式扩增短DNA或RNA序列的方法。
本发明靶核酸包括双链和单链核酸分子。核酸可为(例如)DNA或RNA。倘若靶 核酸为RNA分子，则所述分子可为(例如)双链、单链，或RNA分子可包含单链靶序列。倘 若靶核酸为RNA分子，则所述分子可为双链或单链，或可包含单链靶序列。靶核酸包括(例 如)基因组、质粒、线粒体、细胞、和病毒核酸。靶核酸可为(例如)基因组、染色体、质粒 DNA、基因、任一类型的细胞RNA、或合成寡核苷酸。“基因组核酸”意指来自任一基因组的任 一核酸，包括(例如)动物、植物、昆虫、和细菌基因组，包括(例如)存于孢子中的基因组。 双链DNA靶核酸包括(例如)基因组DNA、质粒DNA、线粒体DNA、病毒DNA、和合成双链DNA 或本文所述或业内已知的其它类型的DNA。单链DNA靶核酸包括(例如)病毒DNA、cDNA、 和合成单链DNA、或本文所述或业内已知的其它类型的DNA。RNA靶核酸包括(例如)信使 RNA、病毒RNA、核糖体RNA、转移RNA、微小RNA和微小RNA前体、以及siRNA或本文所述或业 内已知的其它RNA。
微小RNA、miRNA、或小短暂RNA(stRNA)是单链短RNA序列，其长约21-23个核 苷酸并且与基因调节有关。微小RNA被认为可干扰信使RNA的转译，因为其与信使RNA 部分互补。(例如，参见鲁昆，G1(Ruvkun，G1)，科学(Science)，294：797-99(2001)；拉 各斯-金塔纳，M.(Lagos-Quintana，M.)等人，科学，294：854-58(2001)；刘，N.C.(Lau， N.C.)等人，科学，294：858-62(2001)；李，R.C.(Lee，R.C.)和安布罗斯，V.(Ambros，V.)， 科学，294：862-64(2001)；鲍尔库姆，D.(Baulcombe，D.)等人，科学，297：2002-03(2002)； 莱伍，C(Llave，C)，科学，297：2053-56(2002)；哈特瓦格纳，G.(Hutvagner，G.)和萨莫勒， P.D.(Zamore，P.D.)，科学，297：2056-60(2002))。根据近期所报导在基因剔除小鼠中的研 究，微小RNA可能在免疫系统中也具有一定作用。(例如，参见韦德，N.(Wade，N.)，“研究 启示和免疫系统调节剂(Studies Reveal andImmune System Regulator)”，纽约时报(New York Times)，2007年4月27日)。也可使用本发明方法检测的微小RNA前体包括(例如) 初级转录物(初级miRNA)和前体miRNA(经进一步处理后变为miRNA的茎-环结构RNA)。
短干扰RNA(或siRNA)为具有至少部分双链并且长约20-25个核苷酸的RNA分子，人们发现其与RNA干扰有关，例如与病毒复制或基因表达的减量调节有关(例如，参见萨 莫勒等人，2000，细胞(Cell)，101，25-33；巴斯(Bass)，2001，自然(Nature)，411，428-429；Elbashir等人，2001，自然，411，494-498；和克拉萨(Kreutzer)等人，国际PCT公开案第WO00/44895；泽内卡-戈茨(Zernicka-Goetz)等人，国际PCT公开案第WO 01/36646；法尔(Fire)，国际PCT公开案第WO 99/32619号；普雷汀科(Plaetinck)等人，国际PCT公开案第WO 00/01846号；米洛(Mello)和法尔，国际PCT公开案第WO 01/29058号；迪甘斯-德帕里(Deschamps-Depaillette)，国际PCT公开案第WO99/07409号；和李(Li)等人，国际PCT公 开案第WO 00/44914号；奥舍尔(Allshire)，2002，科学，297，1818-1819；沃尔皮(Volpe) 等人，2002，科学，297，1833-1837；基纽文(Jenuwein)，2002，科学，297，2215-2218；和霍尔(Hall)等人，2002，科学，297，2232-2237；哈特瓦格纳和萨莫勒，2002，科学，297，2056-60；麦克曼纽斯(McManus)等人，2002，RNA，8，842-850；雷哈特(Reinhart)等人，2002，基因 与发育(Gene&Dev.)，16，1616-1626；以及雷哈特和巴特尔(Bartel)，2002，科学，297， 1831)。
术语“靶序列”的使用可意指序列的有义或反义链，并且也可意指初始靶序列的靶核酸、扩增拷贝、或扩增产物上存在的序列。扩增产物可为较大分子，其包含靶序列以及至少一个其它序列或其它核苷酸。靶序列的长度以及鸟苷：胞嘧啶(GC)浓度(百分比)取决 于进行反应的温度；此温度取决于反应中所用聚合酶和切口酶的稳定性。所属领域技术人 员可实施样品分析来确定适合于反应条件的长度和GC浓度。例如，倘若聚合酶和切口酶在 最高60℃下稳定，则靶序列长度可为(例如)19至50个核苷酸，或长度可为(例如)20至 45、20至40、22至35、或23至32个核苷酸。在这些条件下GC浓度可(例如)小于60％、 小于55％、小于50％、或小于45％。所选靶序列和切口酶应使得靶序列不含反应混合物中 将包括的任一切口酶的切口位点。
靶序列可自多种类型的样品来扩增，包括(但不限于)含有来自原核生物或真核生物的孢子、病毒、细胞、核酸或任何游离核酸的样品。例如，所述分析不需溶解即可检测位于孢子外的DNA。可自怀疑含有靶序列的任何材料分离样品。例如，对于动物(例如哺乳动物，例如人类)来说，样品可包含血液、骨髓、粘液、淋巴液、硬组织(例如肝、脾、肾、肺、或卵巢)、活检样品、痰、唾液、泪液、粪便、或尿液。或者，靶序列可存于怀疑含有生物有机体的空气、植物、土壤、或其它材料中。
靶序列也可存于也含有环境污染物(例如粉尘、花粉和烟粒(例如来自柴油排放)或临床相关基质(例如尿液、粘液或唾液)的样品中。靶序列也可存于废水、饮用水、空气、乳汁、或其它食物中。根据这些污染物的浓度，可能需要所属领域技术人员已知的样品纯化方法来移除成功扩增的抑制剂。纯化可涉及(例如)洗涤剂溶解产物、超声处理、玻璃珠涡旋或法氏压机(French press)的使用。此纯化也可导致样品靶的浓缩。也可通过(例如) 过滤、酚提取、色谱法、离子交换、凝胶电泳、或密度依赖性离心对样品实施进一步纯化。在 具体实施例中，可直接将样品添加至反应混合物中或在预稀释后将样品添加至反应混合物中而不事先纯化靶核酸。
寡核苷酸是包含两个或以上个(例如三个以上)脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。寡核苷酸的长度可取决于其使用方式。寡核苷酸可以合成方式或通过克隆来获得。
术语“互补”在描述两个核酸序列时一般是指两个序列在两个核酸之间形成足够氢键以稳定通过两个核酸杂交形成的双链核苷酸序列的能力。在两个序列中，一个序列中的所有核苷酸可都与另一序列中的对应核苷酸互补。在某些实施例中，两个序列中的对应核苷酸之间可能存在一些失配(即非互补核苷酸)，例如10个核苷酸中存在1处失配、20 个核苷酸中存在1处失配、或30个核苷酸中存在1处失配，所述序列在本文中称作“实质上 互补”。如图1A-1D中所示，各模板核酸经常包括与模板核酸所杂交的靶核酸链(或其互补 链)互补或实质上互补的识别区域。同样如图1A-1D中所示，各模板核酸经常包括位于识 别区域5’端的稳定区域和不与靶核酸序列或其互补链互补或实质上互补的切口剂识别区 域。
本文所用“杂交”和“结合”可互换使用并且是指互补核酸序列相互之间的非共价结合或“碱基成对”。特定探针是否与多核苷酸序列保持碱基成对取决于互补度、探针长度、以及结合条件的严苛性。严苛性越高，互补度必须越高，和/或欲保持稳定结合或碱基成对的探针越长。
本文所用“严苛性”是指对核酸所施加的可导致双链核酸离解为组成单链的条件组合，例如极端pH、高温和盐浓度。词组“高严苛性”是指杂交条件的严苛性或限制性高至足以使得仅可进行特异性碱基成对。特异性应高至足以使得可根据标准南方(Southern)杂交方案(如分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，98：503(1975)中所述)使用寡核苷酸探针 或密切相关序列来检测单一序列。
模板定义为与靶序列识别区域结合并且也含有位于识别区域上游的切口酶结合区域和位于切口酶结合区域上游的稳定区域的寡核苷酸。
“识别区域”意指模板上与靶序列上的核酸序列互补或实质上互补的核酸序列。“靶序列上的识别区域”意指靶序列上与模板互补或实质上互补或与模板结合的核苷酸序列。
“稳定区域”意指具有(例如)约50％GC含量的核酸序列，其设计为可稳定用于 (例如)切口和/或延长反应的分子。
在描述某些序列在核酸分子、例如在靶序列或模板中的定位时，所属领域技术人员应理解，术语“3’”和“5’”是指特定序列或区域相对于另一序列或区域的位置。因此，在一序列或区域位于或为另一序列或区域的3’时，所述位置介于所述序列或区域与所述核酸链3’羟基之间。在核酸中的位置位于或为另一序列或区域的5’时，此意指所述位置介于 所述序列或区域与所述核酸链的5’磷酸根之间。
聚合酶是能催化根据核酸靶序列纳入特定核苷酸来延长引物分子(例如模板寡核苷酸)3’羟基末端的蛋白质。聚合酶可为(例如)耐热酶从而使得其在升高反应温度下 也具有活性。例如，其也可具有链置换能力。然而，其不需要极高持续性(单次合成30-40 个核苷酸已足够)。所用聚合酶通常不具有5’-3’外切核酸酶活性。若聚合酶也具有逆转 录酶活性(例如Bst(大片段)、9°N、热启动酶、热启动酶II等)，则反应不使用单独的逆 转录酶也可在单一步骤中扩增RNA靶。反应中可包括不止一种聚合酶，在一实例中一种聚 合酶可具有逆转录酶活性并且另一种聚合酶可缺少逆转录酶活性。在实例性实施例中，聚 合酶是BST(大片段)。聚合酶可选自(例如)由表1中所列一或多种聚合酶组成的群组。
表1
在本发明方法的反应中可使用以下逆转录酶(RT)的非限制性实例来改良检测RNA序列时的表现：OmniScript(凯杰(Qiagen))、SensiScript(凯杰)、MonsterScript(艾比森(Epicentre))、Transcriptor(罗氏(Roche))、HIV RT(安宾)、Superscript III(英 杰(Invitrogen))、ThermoScript(英杰)、Thermo-X(英杰)、ImProm II(普洛麦格(Promega))。
这些不同的RT在标准反应缓冲液中以不同水平进行反应，并且此效能评定列述如下。“+”指示扩增反应产生特定产物。更多“+”指示反应效果更佳，并且“+++++”指示结 果极佳。“-”指示反应没有产生特定产物，或没有产生超过背景的特定产物。
表2
OmniScript**(凯杰) +++++
SensiScript(凯杰) +++
MonsterScript(艾比森) +++
Transcriptor(罗氏) ++
HIV RT*(安宾) +
SuperscriptIII(英杰) -
ThermoScript(英杰) -
Thermo-X(英杰) -
ImProm II(普洛麦格) -
“切口”是指全双链或部分双链核酸中的双链部分仅一条链发生裂解。核酸发生切口的位置称作切口位点或切口位点。切口酶所识别的识别序列称作切口酶结合位点。“能切口”是指切口酶的酶促能力。
切口酶是结合双链DNA并裂解双链二倍体中的一条链的蛋白质。切口酶可在结合位点或切口酶识别位点的上游或下游进行裂解。在实例性实施例中，反应包含使用在结合位点下游裂解或切口的切口酶(顶端链切口酶)从而使得产物序列不含切口位点。使用在结合位点下游进行裂解的酶使得聚合酶可更容易地进行延长而不需要置换切口酶。切口酶必须可在与聚合酶相同的反应条件下发挥作用，因此需要在两种酶的两种理想条件之间进行优化。切口酶可得自(例如)新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)(NEB)和富美 泰斯(Fermentas)。切口酶可选自(例如)由表3中所列一或多种切口酶组成的群组。
表3
切口酶 又名
Nb.BbvCI
Nb.Bpu10I
Nb.BsaI
Nb.BsmI
Nb.BsrDI
Nb.BstNBIP
Nb.BstSEIP
Nb.BtsI
Nb.SapI
Nt.AlwI
Nt.BbvCI
Nt.BhaIIIP
Nt.Bpu10I
Nt.Bpu10IB
Nt.BsaI
Nt.BsmAI
Nt.BsmBI
Nt.BspD6I
Nt.BspQI
Nt.Bst9I
Nt.BstNBI N.BstNB I
Nt.BstSEI
Nt.CviARORFMP
Nt.CviFRORFAP
Nt.CviPII Nt.CviPIIm
Nt.CviQII
Nt.CviQXI
Nt.EsaSS1198P
Nt.MlyI
Nt.SapI
切口酶可选自(例如)由以下组成的群组：Nt.BspQI(NEB)、Nb.BbvCI(NEB)、Nb.BsmI(NEB)、Nb.BsrDI(NEB)、Nb.BtsI(NEB)、Nt.AlwI(NEB)、Nt.BbvCI(NEB)、 Nt.BstNBI(NEB)、Nt.CviPII(NEB)、Nb.Bpu101(富美泰斯)、和Nt.Bpu101(富美泰斯)。在某 些实施例中，切口酶选自由以下组成的群组：Nt.NBst.NBI、Nb.BsmI、和Nb.BsrDI。所属领 域技术人员应了解，在本发明方法中可使用除本文中特别提及的切口酶外的各种切口酶。
本发明方法中的切口酶和聚合酶可在(例如)室温下保持稳定，所述酶也可在(例如)最高37℃、42℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或85℃的温度下保持稳定。在某些实 施例中，所述酶可在最高60℃下保持稳定。
当酶在最高37℃、42℃、50-60℃、54-60℃、56-58℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、或85℃的温度下保持稳定时，所述酶具有“耐热性”。
产物或扩增产物定义为沿经切口和释放的靶延长模板的最终产物。然后可将此产物反馈回扩增循环中，或可使其与其互补链或分子信标复性。
“天然核苷酸”是指腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸、胸苷酸、或尿苷酸。“衍生核苷酸”是除天然核苷酸以外的核苷酸。
反应可在天然核苷酸存在下实施，例如双脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。反应也 可在经标记dNTP存在下实施，例如放射性标记(例如32P、33P、125I、或35S)、酶标记(例如 碱性磷酸酶)、荧光标记(例如异硫氰酸荧光素(FITC))、生物素、抗生物素蛋白、地高辛(digoxigenin)、抗原、半抗原、或荧光染料。这些衍生核苷酸可任选地存于模板中。
“恒温”、“等温条件”、“基本等温”或“等温地”意指一组反应条件，其中在扩增反应过程期间反应温度保持基本上或实质上恒定。本发明方法的扩增方法的优势在于，温度不需要在较高温度与较低温度之间循环。切口和延长反应可在相同温度下或在相同狭窄温度范围内进行。然而，不需要将温度精确维持在一种温度下。若用来维持升高温度的设备使得反应混合物的温度可在几度或十分之几度(例如小于1度、0.8度、0.6度、0.4度、或0.2度)范围内变化，此对扩增反应无害，并且仍可视为等温反应。
术语“多重扩增”是指不止一种目标核酸的扩增。例如，其可意指来自同一样品的多个序列的扩增样品中若干个序列中的一个序列的扩增，如美国专利第5,422,252号和第5,470,723号所论述，所述专利提供多重链置换扩增的实例。所述术语也意指同时或以逐步方式对存于多个样品中的一或多个序列实施的扩增。
模板设计
正向和反向模板、以及第一和第二模板设计为在5’末端具有稳定区域，在稳定区域下游具有切口酶结合位点和切口位点，并且在寡核苷酸3’末端切口酶结合位点和切口位点的下游具有识别区域。根据每个单独区域的长度、温度、靶序列的长度、以及GC浓度，总寡核苷酸长度可为19至40、例如19-40、23-40、20-30、20-24、23-24、23-32、25-40、27-40、或27-35个核苷酸。所属领域技术人员应了解如何平衡模板的这些特征。模板的设计应 使得其可一起结合少于或等于100％的靶序列，一种模板结合有义链，并且另一种结合反义链。每种模板的长度不需要与另一种模板相同。例如，倘若正向模板结合约60％的靶反义链，则反向模板可结合(例如)约40％的靶有义链。模板的设计容许在靶序列上存在不与 任一模板结合的间隔子碱基。因此可将模板设计为可结合约30％、约40％、约50％、或约 60％的靶序列。
正向模板的识别区域设计为与靶有义链的5’区域实质上相同或相同并且与靶位点反义链的3’末端互补或实质上互补。正向模板的识别区域具有任何适宜长度，例如长 约8、9、10、11、12、13、14、15或16个碱基，并且有时长8-16、9-16、10-16、8-12、8-15、9-15、 10-15、或11-14个核苷酸。在实例性实施例中，长度为11-13、11-12、12、或12-13个核苷 酸。反向模板的识别区域设计为与靶位点有义链的3’末端实质上互补或互补。反向模板 的识别区域具有任何适宜长度，例如长约8、9、10、11、12、13、14、15或16个碱基，并且有时 长8-16、9-16、10-16、8-12、8-15、9-15、10-15、或11-14个核苷酸。在实例性实施例中，长度 为11-13、11-12、12、或12-13个核苷酸。第一模板的识别区域的长度可与第二模板的识别 区域相同或不同。
模板的识别序列经常与有机体中的单一序列、或实质上单一的序列互补或实质上互补。本文所用术语“单一序列”是指有机体中不为任何其它已知有机体所共有的核苷酸序列。本文所用“实质上单一的序列”是指存于特定有机体家族中或最多仅存于约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种其它有机体中的核苷酸序列。在某些实施例中，单一序列或实质上单一的序列存于核糖体RNA中或编码核糖体RNA的DNA的有义或反义链中。
所属领域技术人员能确定用于最佳有效扩增的适宜识别区域长度。在某些实施例中，为提供适宜特异性，模板识别区域的长度下限是8个碱基。反应的分析特异性与两个模板(正向和反向模板)中的识别区域总长度有关。例如，若每个模板具有8个核苷酸的识 别区域，则可使分析能检测8+8＝16个核苷酸的单一序列组合，此称作“靶尺寸”。对于给 定DNA链来说，16个核苷酸的靶尺寸具有4.29x109个可能组合。人类基因组长3.3x109个 核苷酸。因此，在统计学上，预计16个核苷酸的特定序列在人类基因组中大约出现一次。 若靶尺寸降低至(例如)15个核苷酸，则预计其在人类基因组中平均出现3次(在3.3x109个核苷酸中有1.07x109次出现可能性)，并且因此其特异性可能不如16个核苷酸的靶尺寸 高。对于具有7个核苷酸的识别区域(使分析靶尺寸为14个碱基)的分析来说，预计其在 人类基因组中出现12次(在3.3x109个核苷酸中有2.68x108次出现可能性)。此可使分 析的特异性降低，从而使得其在诊断领域中价值降低。因此，每个模板具有8个碱基的识别 区域经常被视为某些分析的下限。
表4
实施本发明扩增分析来确定最佳识别区域长度。在10分钟的分析中，在使用0或100,000拷贝靶DNA时，20聚体识别区域模板组不产生可检测特定产物，而在使用12聚体 识别区域模板组时检测到特定产物。使用16聚体识别区域模板组产生特定可检测产物，但 所检测到的特定产物比使用12聚体识别区域模板组的分析少四分之三。在某些实施例中， 使用15聚体识别区域模板组生成的特定产物多于16聚体识别区域模板组。
因此，在某些实例性实施例中，提供扩增双链核酸靶序列的方法，其包含使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与靶序列反义链3’末端互补或实质上互补的识别区域(其中所述识别区域长8至15个核苷酸)、位于所述识别区域上游的切口酶结合位 点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；所述反向模板 所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列有义链3’末端互补或实质上互补的识别 区域(其中所述识别区域长8至15个核苷酸)、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点 和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；提供能在正向模 板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第一切口酶；提供能在反向模板的切口位点 处切口但不能在靶序列内切口的第二切口酶；以及提供DNA聚合酶；其中扩增在一定条件 下通过多次如下循环来实施：聚合酶沿靶序列延长正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且切口酶在切口位点处切口，从而产生扩增产物。因此，在某些实施例中，正向或反向模板的识别区域或正向和反向模板中每一者的识别区域长8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在某些实施例中，靶序列所包含的核苷酸比正向模板识别区域和反向模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。
在另一实例性实施例中，提供扩增单链核酸靶序列的方法，其包含使包含单链靶序列的靶核酸与反向模板接触，其中所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列3’末端互补或实质上互补的识别区域(其中所述识别区域长8至15个核苷酸)、 位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；提供能在反向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第一切口酶；提供DNA聚合酶，其中所述聚合酶在一定条件下沿靶序列延长反向模板；使所延长反向模板与正向模板接触，其中正向模板包含位于3’末端且与靶序列5’末端相同的识别区域(其中所述识别区域长8至15个核苷酸)、位于所述识别区域上游的切口酶结合位 点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；提供能在正向 模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第二切口酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施：聚合酶沿靶序列延长正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且切口酶在切口位点处切口，从而产生扩增产物。因此，在某些实施例中，正向或反向模板的识别区域或正向和反向模板中每一者的识别区域长8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在某些实施例中，靶序列所包含的核苷酸比正向模板识别区域和反向模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。
在某些实施例中，实施扩增反应的温度低于模板和靶的解链温度(Tm)。在某些 实施例中，反应温度比模板和靶的Tm低(例如)1℃-10℃、1℃-8℃、1℃-6℃、1℃-4℃、 1℃-2℃、2℃-10℃、2℃-8℃、2℃-6℃、2℃-4℃、2℃-2℃、2℃-4℃或2℃、3℃、4℃、5℃、 6℃、7℃、或8℃。反应温度通常也低于反应产物(例如图1B和图1C中所示步骤9A后扩 增二倍体的切口产物和聚合酶延长产物)的Tm。反应温度可高于初始模板/靶序列复合体(绘示于图1A的步骤(1)上方)的Tm。一旦模板延长而形成稳定复合体，稳定复合体的Tm即高于反应温度。
因此，模板/靶核酸靶的Tm经常高于反应温度，并且有时Tm比反应温度高5℃ 或更高，或例如比反应温度高约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、或8℃或更高。在切口 后经切口链中每一部分的Tm通常都高于反应温度，并且有时每一经切口部分的Tm比反应 温度高5℃或更高，或例如比反应温度高约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、或8℃或更 高。可使用(例如)万维网(World Wide Web)URLidtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/中所提供用于IDT寡核苷酸分析软件(Oligo Analyzer)(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies))的程序来计算模板和靶的Tm，所述程序考虑反应条件中的盐浓度。如IDT网站中所述，使用所述分析软件实施的Tm计算是如下所述来进行：
解链温度(TM)是寡核苷酸双倍体中50％呈单链形式并且50％呈双链形式时的温度。所述寡核苷酸分析软件根据适用于短DNA二倍体的最近邻两态模型估算TM，
其中ΔH°(焓)和AS°(熵)是根据序列和所公开最近邻热力学参数计算的 解链参数，R是理想气体常数(1.987卡K-1摩尔-1)，[寡核苷酸]是寡核苷酸的摩尔浓 度，并且-273.15的常数将温度自开尔文温度(Kelvin)转换为摄氏度。最准确的最近邻 参数得自以下出版物：关于DNA/DNA碱基对(阿拉维，H.(Allawi，H.)，桑塔露琪亚，J.， Jr.(SantaLucia，J.，Jr.)，生物化学(Biochemistry)，36，10581)、关于RNA/DNA碱基对(衫 本，N.(Sugimoto，N.)等人，生物化学，34，11211)、关于RNA/RNA碱基对(夏，T.(Xia，T.)等 人，生物化学，37，14719)、和关于LNA/DNA碱基对(麦克蒂格，P.M.(McTigue，P.M.)等人， 生物化学，43，5388)。
TM取决于溶剂的单价盐浓度([Na+])。线性TM校正是业内已知方法。如IDT网站 中所述，IDT的科学家在各种钠缓冲液中对约100个短DNA双倍体实施了大量UV解链实验 (约3000次测量)，并且确定此线性函数不准确。寡核苷酸分析软件采用经改良的二次TM盐校正函数(欧扎泽，R.(Owczarzy，R.)等人，生物化学，43，3537)，
其中f(GC)是GC碱基对的分数。
在某些实施例中，调节识别区域的长度以使得靶序列中有至少一个核苷酸不在正向模板的识别区域中并且在反向模板的识别区域中也不具有互补链。这些间隔子碱基(其形成“间隔子区域”)是靶序列内所含位于正向和反向模板的3’末端之间的核苷酸。间隔 子碱基展示于(例如)图30中，其中其显示为介于正向和反向模板3’末端之间的靶有义 和反义序列的区段，也显示在“间隔子区域”内。例如，当将图30中的模板T2和T1与靶一 起使用时，靶有义链具有1个间隔子碱基(1个核苷酸的间隙)-T，并且靶反义链具有1个间 隔子碱基(或1个核苷酸的间隙)-A。在某些实施例中，靶序列中存在5个或更少间隔子碱 基。在实例性实施例中，间隔子碱基数为2至3。在某些实施例中，间隔子碱基数为1、2或 3。在其它实施例中，存在1个间隔子碱基。在其它实施例中，存在2个间隔子碱基。在其 它实施例中，存在3个间隔子碱基。在其它实施例中，间隔子碱基数为1、2、3、4或5。
因此，在本发明方法的实例性实施例中，靶序列在与第一模板3’末端杂交的靶序列核苷酸以及第一链中与第二模板3’末端杂交的互补链核苷酸的对应核苷酸之间包含1至5个核苷酸。“对应核苷酸”意指在靶核苷酸序列中的一链与靶核苷酸序列的互补链对准时所述链上与互补链杂交的核苷酸。这1至5个核苷酸也称作间隔子碱基。
这些间隔子碱基使得可区分真实扩增产物与任何由于以与引物二聚体类似的方式重叠模板而通过延长扩增的背景产物。此考虑因素使得可改良对背景噪音与靶序列扩增的区分。然而，进行扩增时不需要这些间隔子碱基。
因此，在某些实例性实施例中，提供扩增双链核酸靶序列的方法，其包含使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与靶序列反义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列有义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；提供能在正向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第一切口酶；提供能在反向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第二切口酶；以及提供DNA聚合酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施：聚合酶沿靶序列延长正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且切口酶在切口位点处切口，从而产生扩增产物，其中所述靶序列所包含的核苷酸比正向模板识别区域和反向模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。因此，在某些 实施例中，靶序列所包含的核苷酸比正向模板识别区域和反向模板识别区域中的核苷酸总数多1、2、3、4或5个。
在另一实例性实施例中，提供扩增单链核酸靶序列的方法，其包含使包含单链靶序列的靶核酸与反向模板接触，其中所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列3’末端互补或实质上互补的识别区域、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；提供能在反向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第一切口酶；提供DNA聚合酶，其中所述聚合酶在一定条件下沿靶序列延长反向模板；使所延长反向模板与正向模板接触，其中所述正向模板包含位于3’末端且与靶序列5’末端相同的识别区域、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；提供能在正向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第二切口酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施：聚合酶沿靶序列延长正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且切口酶在切口位点处切口，从而产生扩增产物，其中所述靶序列所包含的核苷酸比正向模板识别区域和反向模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。因此，在某些 实施例中，靶序列所包含的核苷酸比正向模板识别区域和反向模板识别区域中的核苷酸总数多1、2、3、4或5个。
模板的切口酶结合位点序列取决于所选用于各模板的切口酶。在单一分析中可使用不同切口酶，但简单扩增中两种模板可采用(例如)单一切口酶。因此，本发明方法的实施例包括两种模板包含针对相同切口酶的识别位点的实施例，并且反应中仅使用一种切口酶。在这些实施例中，第一和第二切口酶二者相同。本发明也包括各模板包含针对不同切口酶的识别位点的实施例，并且在反应中使用两种切口酶。
例如，在Nt.BstNBI情况下，酶结合位点为5’-GAGTC-3’并且酶在此位点下游4个核苷酸处(即GAGTCNNNN^)对顶端链进行切口。扩增反应对这4个核苷酸(N)的序列几乎 不显示依赖性，但此区域的最佳序列是GC含量为25％或更低并且具有与结合区域5’核苷 酸相邻的胸腺嘧啶。后一约束使得通过聚合酶添加有额外腺嘌呤的产物具有引发能力。可 根据应用优化所述4个核苷酸的序列，以产生或消除发夹、自身二聚体或异二聚体的存在。
位于模板寡核苷酸5’末端的稳定区域设计为具有大约50％GC。因此，GC含量可 为(例如)约40％-60％、约42％-58％、约44％-56％、约46％-54％、约48％-52％、或约 49％-51％。这些参数使针对Nt.BstNBI酶的稳定区域长度为8-11个核苷酸，但人们已测 试短至6个核苷酸并且长至15个核苷酸的长度并且显示此长度在此扩增方法中可用。较长 稳定区域或使GC％升高至大于50％可在较高反应温度下进一步稳定切口和延长反应。正 向和反向模板5’稳定区域的序列通常相同，但若目标是独立捕获各产物链则所述序列可不 同。此区域的序列应不干扰切口位点或识别区域，但模板序列内的较短内部发夹已显示可 具有经改良的实时结果。
在某些实施例中，扩增工艺中包括一或多种使核酸交互作用(例如链间或链内交互作用)去稳定的试剂；并且在替代性实施例中，扩增方法中不包括一或多种所述试剂。 使核酸交互作用去稳定的试剂的实例是那些可使双链结构(例如双链DNA)和/或链内结 构(例如RNA中的二级或三级结构)去稳定的试剂，并且其包括(但不限于)甜菜碱和其 它四铵化合物、甲酰胺、甘油、山梨醇、高氯酸钠、二甲亚砜(DMSO)、低碳烷基醇(例如乙醇、 1-4碳醇)、尿素、三烷基铵盐(例如三乙基氯化铵)、单链结合(ssb)蛋白(例如大肠杆菌 ssb)、解旋酶(例如大肠杆菌DNA解旋酶I、II、或IV)、低碳烷基(1-4C)醇和诸如此类。不 期望受限于理论，所述试剂降低核酸交互作用的解链温度(Tm)(例如降低二倍体Tm)。所属 领域技术人员可根据(例如)去稳定程度以及维持酶促活性的需要来确定反应的适宜去稳 定剂和适宜去稳定剂浓度。浓度的实例包括约10％甘油、约10％高氯酸钠、约10％DMSO、 约10％山梨醇、约2.4摩尔三乙基氯化铵、和大约大于1、2、3、4、或5摩尔的甜菜碱(例如 约5-6摩尔甜菜碱)。甜菜碱或N，N，N-三甲基甘氨酸可购自(例如)西格玛-奥德里奇 (Sigma-Aldrich)，例如目录号为B2629或B0300。其可与(例如)低浓度的DMSO组合使 用，例如约1-2、或约1.3％DMSO与约1M甜菜碱组合。
本发明方法的模板可包括(例如)间隔子、阻断基团、和经修饰核苷酸。经修饰核苷酸是组成和/或结构与天然核苷酸和核苷酸三磷酸不同的核苷酸或核苷酸三磷酸。本文所用经修饰核苷酸或核苷酸三磷酸的修饰方式可使得当修饰位于双链核酸中存在限制性内切核酸酶识别位点的一链上时，经修饰核苷酸或核苷酸三磷酸可保护经修饰链免受限制性酶裂解。因此，经修饰核苷酸或核苷酸三磷酸的存在促进双链核酸发生切口而非裂解。阻断基团可添加至模板以抑制聚合酶实施靶序列依赖性核酸聚合的化学部分。阻断基团通常位于模板的3’末端。阻断基团的实例包括(例如)烷基、非核苷酸连接子、硫代磷酸酯、烷二醇残基、肽核酸、和缺少3’-OH的核苷酸衍生物(包括(例如)蛹虫草菌素(cordycepin))。 间隔子的实例包括(例如)C3间隔子。间隔子可用于(例如)模板内，并且也可用于(例 如)5’末端以连接其它基团，例如标记。
经常提供未修饰核苷酸用于模板延长。经常不提供未修饰核苷酸和核苷酸衍生物用于纳入经延长模板中。然而，在某些实施例中，可提供一或多个经修饰核苷酸或核苷酸衍生物并将其纳入经延长模板中。
扩增反应也可包括辅助寡核苷酸。辅助寡核苷酸是长(例如)5-10、5-15、5-20个核苷酸的寡核苷酸。辅助寡核苷酸的存在可提高扩增反应的速率、数量或灵敏性。辅助寡核苷酸并不纳入终产物中。所属领域技术人员能确定添加至反应中的适宜辅助寡核苷酸以及应添加的数量。确定适宜辅助寡核苷酸的方式的一个实例是合成与靶核酸或其互补链中的各区域互补的寡核苷酸，并以不同数量将其添加至分析中，比较使用辅助寡核苷酸的分析与作为对照的不使用辅助寡核苷酸的分析。可合成与识别区域或其互补链的上游或下游区域互补的辅助寡核苷酸。例如，可合成长约10个碱基的辅助寡核苷酸组，其与识别区域上游或下游相互间隔5-10个碱基的多个区域互补，然后成对测试其增强扩增反应的能力。
扩增的具体机制
本发明方法的扩增反应需要核酸靶、至少两个模板寡核苷酸、切口酶(例如耐热性切口酶)、耐热性聚合酶、和缓冲组份的存在，其皆保持在反应温度下。模板的识别区域与互补或实质上互补的靶序列交互作用。由于靶与模板中互补或实质上互补区域的解链温度显著低于反应温度，因此两条核酸链之间的交互作用较短暂，但却容许耐热性聚合酶有足够的时间自模板的3’末端沿靶链延长。实验已显示，某些聚合酶与单链寡核苷酸结合。此复合体的预形成可促进扩增过程的速率。
对于双链靶来说，在双链DNA的正常呼吸期间两个模板都可同时与对应靶链交互作用(正向模板与反义链交互作用并且反向模板与有义链交互作用)。也可通过基因组序列内的单或双切口位点来生成靶。对于单链靶(RNA或DNA)来说，反向模板结合并延长第 一(图1，步骤1和2)。所延长序列含有正向模板的互补链。然后正向模板置换靶区域并结 合与正向模板的识别区域互补或实质上互补的3’合成区域(步骤3)。或者，另一反向模板 也可在识别区域置换最初延长的反向模板以产生单链延长的反向模板以供结合正向模板。 可通过延长较短DNA链的非持续性聚合酶来促进模板的初始结合和延长，从而使得合成产 物的解链温度高于反应温度。然后单链产物可用于与下一模板识别位点结合并通过聚合酶来延长。
将正向模板延长至反向模板的5’末端，从而产生用于反向模板的双链切口酶结合位点(步骤5)。然后切口酶结合二倍体并直接在反向模板链的识别序列上游进行切口(在顶端链切口酶情况下)(步骤6)。切口下游的核酸序列被释放(若解链温度接近反应温度)和/或通过聚合酶自3’-OH切口位点合成来置换。聚合酶沿正向模板延长至正向模板的 5’末端(步骤8)。通过两个模板的延长形成的双链在二倍体的任一末端上产生切口酶结 合位点。此双链称为NEARTM扩增二倍体。当切口酶结合并进行切口时，释放位于两个切口 位点之间的靶产物(具有5’-磷酸酯和3’-OH)，其长度通常介于(但不限于)23至29个 碱基之间(步骤9-11A)；或释放单一切口产物，其含有靶产物和切口位点的反向互补链以 及模板的稳定区域(通常长36至48个碱基)(步骤9-11B)。关于反应机制的另一绘示展 示于图33中。
可通过改变模板浓度来调节产物1与2的比率。正向：反向模板比率可自(例 如)100∶1、75∶1；50∶1、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1、1∶1、1∶2.5、 1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶75或1∶100的摩尔比变化。产物比 率(A∶B)取决于切口酶与聚合酶的比率，即较高聚合酶浓度可产生更多长度较长的产物 (B)，这是因为存在相对较少切口酶在聚合酶延长之前对两条链同时进行切口。由于将反 向模板的置换/释放产物进给至正向模板中并且反之亦然，因此可达成指数式扩增。切口 酶：聚合酶比率可自(例如)20∶1、15∶1；10∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1.5∶1、 1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20的酶单位比变化。在某 些实施例中，切口酶与聚合酶的比率可为(例如)1∶3、1∶2、1∶1.5、或1∶0.8。所属 领域技术人员应了解，这些比率可代表舍入值。此切口和聚合酶延长过程继续进行直至一 种资源(通常为dNTP或酶)耗尽。
如各实例中所述，反应进行时间可在(例如)约1分钟内、或在约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分钟内变化。较长反应时间可产生可接受的结果，其中速率并不重要。在某些实施例中，反应时间介于1-20分钟、1-15分钟之间，或在某些实施例中介于1-10、1-8、1-5、1-2.5、2.5-5、2.5-8、2.5-10或2.5-20分钟之间。本文所述扩增工艺是有效的，并且在某些实施例中(如例如各实例中所述)，在反应时间范围内(例如在5或10分钟内)扩增约1x106倍或以上，扩增约1x107倍或以上，扩增约1x108倍或以 上，扩增约1x109倍或以上，或扩增约1x1010倍或以上。所述反应具有高灵敏性，并且能检 测(例如)样品中的低至约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100或 以上拷贝、样品中的多至200、500、1,000、5,000、或10,000或以上拷贝，或可检测(例如) 以诸如以下等浓度存在的靶：约3.32E-13微摩尔至约3.32E-8微摩尔、约1.66E-12微摩尔 至约3.32E-8微摩尔、约3.32E-13微摩尔至约3.32E-7微摩尔、或约3.32E-13微摩尔至约 3.32E-6微摩尔。
在某些实例性实施例中，提供扩增双链核酸靶序列的方法，其包含使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与靶序列反义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列有义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；提供能在正向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第一切口酶；提供能在反向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第二切口酶；以及提供DNA聚合酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施：聚合酶沿靶序列延长正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且切口酶在切口位点处切口，从而产生扩增产物，其中在10分钟内于等温条件下产生约106(IE+06)拷贝的靶序列。在其它实施例中，在10分钟内产生约107(IE+07)拷 贝。对于多重分析来说，产生等量拷贝的时间可延长至(例如)约12、14、15、18、或20分 钟。出于计算效率的目的，这些分析中的靶序列的尺寸可为(例如)约20至约40个核苷 酸、20至30个核苷酸、或(例如)约20至约33个核苷酸。自所有反应产物出现在同一器 皿、容器或类似物中从而使得扩增反应可以开始的时间至加热或添加化学试剂以终止反应 的时间来计算反应时间。
在另一实例性实施例中，提供扩增单链核酸靶序列的方法，其包含使包含单链靶序列的靶核酸与反向模板接触，其中所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列3’末端互补或实质上互补的识别区域、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；提供能在反向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第一切口酶；提供DNA聚合酶，其中所述聚合酶在一定条件下沿靶序列延长反向模板；使所延长反向模板与正向模板接触，其中所述正向模板包含位于3’末端且与靶序列5’末端相同的识别区域、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；提供能在正向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第二切口酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施：聚合酶沿靶序列延长正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且切口酶在切口位点处切口，从而产生扩增产物，其中在10分钟内于等温条件下产生约106(IE+06)拷贝的靶序列。在其它实施例中，在10分钟内产生约107(IE+07) 拷贝。对于多重分析来说，产生等量拷贝的时间可延长至(例如)约12、14、15、18、或20分 钟。出于计算效率的目的，这些分析中的靶序列尺寸可为(例如)约20至约40个核苷酸、 或(例如)约20至约33个核苷酸。自所有反应产物出现在同一器皿、容器或类似物中从 而使得扩增反应可以开始的时间来计算反应时间。
本发明方法不需要使用温度循环，而在多种扩增方法中通常需要温度循环来离解自扩增核酸靶序列。反应温度可根据序列长度和GC浓度来改变，但根据所属领域技术人员所理解，温度应高至足以使非特异性结合最小化。温度也应适合于反应中的酶，即切口酶和聚合酶。例如，反应可在约52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、或60℃下进行。在某些实施例中，反应是在约37℃-85℃、37℃-60℃、54℃-60℃、55℃-60℃、58℃-60℃ 下进行，并且在实例性实施例中，是在56℃-58℃下进行。在某些实施例中，所述工艺中没 有变性步骤。在本发明方法的某些实施例中，整个扩增过程(包括使模板与靶核酸交互作 用在内)是在实质上等温的条件下实施，并且不具有变性步骤(例如无显著温度升高(例 如温度未上升至90-110℃))。
因此，在某些实例性实施例中，提供扩增双链核酸靶序列的方法，其包含使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与靶序列反义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列有义链3’末端互补或实质上互补的识别区域、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；提供能在正向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第一切口酶；提供能在反向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第二切口酶；以及提供DNA聚合酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施：聚合酶沿靶序列延长正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且切口酶在切口位点处切口，从而产生扩增产物，其中以上各步骤是在等温条件下实施。
在另一实例性实施例中，提供扩增单链核酸靶序列的方法，其包含使包含单链靶序列的靶核酸与反向模板接触，其中所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶序列3’末端互补或实质上互补的识别区域、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；提供能在反向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第一切口酶；提供DNA聚合酶，其中所述聚合酶在一定条件下沿靶序列延长反向模板；使所延长反向模板与正向模板接触，其中所述正向模板包含位于3’末端且与靶序列5’末端相同的识别区域、位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及位于所述切口酶结合位点和切口位点上游的稳定区域；提供能在正向模板的切口位点处切口但不能在靶序列内切口的第二切口酶；其中扩增在一定条件下通过多次如下循环来实施：聚合酶沿靶序列延长正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且切口酶在切口位点处切口，从而产生扩增产物，其中以上各步骤是在等温条件下实施。
可在切口酶与靶核酸分子混合之前、之后或同时将聚合酶与靶核酸分子混合。在实例性实施例中，将反应缓冲液优化至适用于切口酶和聚合酶二者。
当一种资源耗尽时，可使反应完成。或者，可使用所属领域技术人员已知的方法来终止反应，例如热失活、或添加EDTA、大量盐或洗涤剂。在实例性实施例中，倘若在扩增后使用质谱，则可使用EDTA来终止反应。
反应组份
在1.5mL埃彭道夫(Eppendorf)管中按照自上到下的顺序合并以下试剂：
所添加试剂： 微升/反应
H<sub>2</sub>O 31.4
10X Thermopol缓冲液(NEB) 5
10X NEB缓冲液3 2.5
100mM MgSO<sub>4</sub> 4.5
10mM dNTP 1.5
8U/微升BstPol 0.6
10U/微升N.BstNBI 1.5
20微摩尔正向模板 0.25
20微摩尔反向模板 0.25
总反应混合物 47.5
靶样品 2.5
总反应体积 50微升
在此实例中用于反应条件中的各组份的浓度如下所述：
浓度组份
45.7mM Tris-HCl
13.9mM KCl
10mM (NH4)2SO4
50mM NaCl
0.5mM DTT
15mM MgCl2
0.10％ 曲拉通(Triton)X-100
0.008mM EDTA
6μg/mL BSA
3.90％ 甘油(若使用更浓的酶原液则可能更低)
0.3U/微升 Nt.BstNBI
0.1-0.4U/微升 Bst聚合酶(大片段)
0.1微摩尔 正向模板
0.1微摩尔 反向模板
缓冲条件、MgSO4浓度、聚合酶浓度、和模板浓度的改变都可根据分析序列和期望检测方法来优化。若使用更浓的酶原液，则可(例如)降低甘油数量。在某些实施例中，作 为反应物添加的Mg2+离子的浓度为(例如)约9mM至约25mM、约9mM至21mM、约9至21mM、 约9至20mM、约9至15mM，并且在实例性实施例中，为约10mM至约18mM、约10mM至约25mM、 约10mM至21mM、约12至21mM、约10至20mM、约10至15mM、约10.3mM至约20mM、约10.3mM 至约14.9mM、或约15mM。同样，所属领域技术人员应了解，可在无EDTA或BSA的情况下进 行反应；这些组份可作为酶的储存缓冲液的一部分存于反应中。可成比例改变各体积以获 得较大或较小总反应体积。所述体积通常介于5μL与100μL之间。
模板浓度通常超过靶浓度。正向和反向模板的浓度可相同或不同以使一种产物的扩增超过另一产物。各自的浓度通常介于10nM与1μM之间。
可包括诸如BSA、非离子型洗涤剂(例如曲拉通X-100或吐温-20)、DMSO、DTT、和RNA酶抑制剂等添加剂以达成优化目的并且对扩增反应无不利影响。
制备/添加靶
可在1x Thermopol缓冲液II、1x TE(pH 7.5)或H2O中稀释靶。热启动条件使得 可实施更快、特异性更高的扩增。在此情况下，将反应混合物(不含酶或模板和靶)加热至 反应温度并保持2分钟，之后将反应混合物添加至另一组份(酶或模板/靶)中。可以任 何体积添加靶，最多等于反应中所需要的水的总量。在此情况下，可在水中稀释靶。在上述 50微升总反应体积的实例中，每次反应应添加2.5微升制备靶以使总反应体积达到50微 升。根据使用者的需要，可增加或减少本发明方法的反应体积。在本发明方法中可使用(例 如)5、10、15、20、25、30、35、40、45、50微升或更大的反应体积、或使用(例如)75、100、150、 200、300、400、500微升的较大反应体积。
进行反应
反应是在恒温下进行，对于Bst聚合酶(大片段)与Nt.Bst.NB1切口酶的酶组合 来说通常介于54℃与60℃之间。可使用其它酶组合，并且最适反应温度可取决于切口酶和 聚合酶二者可同时生效的最适温度以及反应产物的解链温度。例如，将反应物在一定温度 下保持2.5至10分钟，直至达成期望量的扩增。可通过任一热失活步骤使酶失活(在使用 可热失活的酶时)来终止反应。或者，可通过将EDTA添加至反应物中来终止反应。
读数
可通过所属领域技术人员已知的任何方法来检测所扩增靶序列。本文藉助非限制性实例来阐述这些已知方法中的若干种。在一种方法中，可通过凝胶电泳来检测扩增产物，由此检测具有特定长度的反应产物。例如，可用(例如)生物素对核苷酸实施标记。可使 用与信号生成酶(例如过氧化物酶)结合的抗生物素蛋白来捕获生物素标记扩增序列。
核酸检测方法可采用对双链DNA特异性染色的染料。在与DNA或RNA结合后表现 增强荧光的嵌入染料是分子和细胞生物学中的基础工具。染料可为(例如)DNA或RNA嵌 入荧光团并且可包括(但不限于)以下实例：吖啶橙、溴乙啶、赫斯特(Hoechst)染料、Pico 绿、碘化丙啶、SYBR I(非对称花青染料)、SYBR II、TOTO(噻唑橙二聚体)和YOYO(噁唑黄 二聚体)和诸如此类。在结合各种检测方法使用时染料提供提高核酸检测灵敏性的机会并 且可具有不同的最适使用参数。例如，溴乙啶常用于在凝胶电泳后和PCR期间在琼脂糖凝 胶中对DNA染色(希古奇(Hiquchi)等人，自然生物技术，10；413-417，1992年4月)，碘 化丙啶和赫斯特33258在流式细胞术中用于确定细胞的DNA倍数，SYBR绿1一直用于通过 毛细管电泳以激光诱导荧光检测来分析双链DNA，并且Pico绿一直用于在实施匹配离子对 多核苷酸色谱法后促进双链DNA的检测(辛格(Singer)等人，分析生物化学(Analytical Biochemistry)，249，229-238，1997)。
核酸检测方法也可采用经标记核苷酸，将其直接纳入靶序列中或纳入含有与目标靶互补或实质上互补的序列的探针中。所述标记的性质可为放射性和/或荧光性并且可以本文所述任一方式来分解。应区分可检测并且可用作天然核苷酸的经标记核苷酸与不能用作天然核苷酸的经修饰核苷酸。
检测和/或连续监测核酸产物扩增的方法也为所属领域技术人员所熟知并且下文阐述其若干实例。
可通过分子信标来检测并监测靶核酸和核酸序列的产生或存在。分子信标是发夹形寡核苷酸，其在一末端上含有荧光团并且在相对末端上含有猝灭染料。发夹中的环含有与靶序列互补或实质上互补的探针序列，并且茎部是通过使位于探针序列两侧的互补或实质上互补的臂序列复性来形成。荧光团和猝灭分子在每一臂中的相对末端处共价连接。在防止寡核苷酸与其互补或实质上互补的靶杂交的条件下或在分子信标游离于溶液中时，荧光和猝灭分子位于彼此的近端，从而防止荧光共振能量转移(FRET)。在分子信标遇到靶分子时发生杂交；环结构转化为稳定的更牢固的构象，从而导致荧光团与猝灭剂分子分离，并产生荧光(泰亚吉(Tyagi)等人，自然生物技术，14：1996年3月，303-308)。由于探针具 有特异性，荧光的生成只能是由于合成了既定扩增产物所致。
分子信标的特异性极高并且可辨别单核苷酸多态性。分子信标也可用不同颜色的荧光团和不同的靶序列来合成，从而使得可同时量化同一反应中的若干种产物。对于定量扩增工艺，分子信标可在每一扩增循环后特异性结合至经扩增靶上，并且由于未杂交分子信标较暗，因此不需要分离探针-靶杂合体才能定量地测定扩增产物的数量。所得信号与扩增产物的数量成正比。此可实时进行。对于其它实时模式，必须优化每一引物/探针组 的特定反应条件以确保准确性和精确性。
也可通过荧光共振能量转移(FRET)来检测并监测靶核酸和核酸序列的产生或存在。FRET是两种生色团(供体和受体分子)之间的能量转移机制。简单来说，供体荧光团分子在特定激发波长下激发。随后在供体分子返回其基态时来自供体分子的发射可通过远程偶极-偶极交互作用将激发能转移至受体分子。可监测受体分子的发射强度并且其随供体与受体之间的距离、供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠、以及供体发射偶极矩和受体吸收偶极矩的取向而变化。FRET是量化分子动力学的有用工具，例如用分子信标所观察到的DNA-DNA交互作用。对于监测特定产物的产生来说，可在探针的一末端用供体分子标记并且在另一末端用受体分子标记。探针-靶杂交使得供体与受体的距离或取向改变并且观察到FRET变化。(约瑟夫R.拉科维兹(Joseph R.Lakowicz)，“荧光光谱学原理(Principles ofFluorescence Spectroscopy)”，普莱南出版公司(Plenum Publishing Corporation)， 第2版(1999年7月1日))。
也可通过质谱来检测并监测靶核酸和核酸序列的产生或存在。质谱是分析性 技术，其可用于测定靶核酸物质的结构和数量并且可用于提供复合体混合物的快速分 析。在实施所述方法后，将样品离子化，在电场和/或磁场中根据所得离子的质荷比将 其分离，并且用检测器测量离子的质荷比。(克雷恩，P.F.(Crain，P.F.)和麦克洛斯 基，J.A.(McCloskey，J.A.)，生物技术新见(Current Opinion in Biotechnology)，9： 25-34(1998))。质谱法包括(例如)MALDI、MALDI/TOF或电喷雾。这些方法可与气相色谱 法(GC/MS)以及液相色谱法(LC/MS)组合。MS一直用于DNA和RNA寡核苷酸的序列测定 (林伯赫P.(Limbach P.)，质谱综述(MassSpectrom.Rev.)，15：297-336(1996)；默里K.， J.(MurrayK.，J.)，质谱(Mass Spectrom.)，31：1203-1215(1996))。MS(并且更具体来 说基质辅助激光脱附/离子化MS(MALDI MS))由于高速信号采集和脱离固体表面的自动 化分析而具有极高处理量潜力。人们已指出，MS除节省时间外也可测量分子的内在特性， 并且由此产生信息量显著较大的信号(克斯特H.(Koster H.)等人，自然生物技术，14： 1123-1128(1996))。
也可通过各种凝胶电泳方法来检测并监测靶核酸和核酸序列的产生或存在。凝胶电泳涉及通过基质(一般为交联聚合物)使用推动分子通过基质的电动势来分离核酸。分子以不同速率移动通过基质，从而导致各种产物分离，此可通过多种方法中的任一种来可 视化和说明，所述方法包括(但不限于)：放射自显影、磷光成像、和用核酸螯合染料实施染 色。
也可通过毛细管凝胶电泳来检测并监测靶核酸和核酸序列的产生或存在。毛细管凝胶电泳(CGE)是传统凝胶电泳与液相色谱法的组合，其在狭窄内径毛细管中采用诸如聚丙烯酰胺等介质来达成核酸分子的快速高效分离，其分辨率可高至单个碱基。CGE通常与激光诱导荧光(LIF)检测组合，其中可检测少至六个经染色DNA分子。CGE/LIF检测一般涉 及荧光DNA嵌入染料的使用，所述染料包括溴乙啶、YOYO和SYBR绿1，但也可涉及荧光DNA 衍生物的使用，其中荧光染料与DNA共价键结。使用此方法可达成若干个不同靶序列的同 时鉴定。
也可通过各种表面捕获方法来检测并监测靶核酸和核酸序列的产生或存在。此是通过将特定寡核苷酸固定在表面上从而产生兼具高灵敏性和高选择性的生物传感器来达成。此方法中所用表面可包括(但不限于)金和碳并且可使用多种共价或非共价偶联方法来将探针连接至表面上。随后对靶DNA的检测可通过多种方法来监测。
电化学方法一般涉及测量DNA探针电极上的嵌入剂(例如亚甲蓝)的阴极峰并且用方波伏安图将其可视化。可通过在亚甲蓝以不同方式与dsDNA和ssDNA交互作用时反映杂合体形成程度的亚甲蓝伏安还原信号量值的降低来观察靶序列的结合。
也可使用表面等离子共振(SPR)来监测探针连接的动力学以及靶捕获过程。SPR不需要使用荧光探针或其它标记。SPR依赖于光在两种具有不同折射率的透明介质的界面上发生反射和折射的原理。在使用单色光和p-偏振光以及界面包含金薄层的两种透明介质时，观察到光的总反射超出临界角，然而光的电磁场分量穿入具有较低折射率的介质中，从而产生消散波和清晰阴影(表面等离子共振)。这是由于共振能在波与表面等离子之间转移所致。共振条件受薄金属膜上所吸附材料的影响，并且能根据共振单位与质量浓度之间的关联来测量核酸分子、蛋白质和糖的浓度。
也可通过侧向流动装置来检测并监测靶核酸和核酸序列的产生或存在。侧向流动装置为人所熟知。这些装置一般包括固相流体可渗透流动路径，流体通过毛细管力流经所述路径。实例包括(但不限于)试条分析和具有各种适宜涂层的薄层色谱板。将各种用于 样品的结合试剂、用于样品的结合配偶体或包括结合配偶体的偶联物以及信号产生系统固定在流动路径上。可以若干种方式达成样品检测：例如酶促检测、纳米颗粒检测、比色检测、和荧光检测。酶促检测可涉及酶标记探针，其与互补或实质上互补的核酸靶在侧向流动装置表面上杂交。可用适宜标记物处理所得复合体以产生可读信号。纳米颗粒检测涉及珠粒技术，其可使用胶体金、胶乳和顺磁纳米颗粒。在一实例中，可使珠粒与抗生物素抗体偶联。可直接使靶序列生物素化，或可使靶序列与序列特异性生物素化探针杂交。在磁场中激发时，金和胶乳产生肉眼可见的比色信号，并且顺磁颗粒产生不可见信号，并且可通过专门读取器来说明。
基于荧光的侧向流动检测方法也为人所知，例如荧光素和生物素双重标记寡核苷酸探针法、采用由包埋于晶体中的镧系元素组成的上转换磷光体报告分子的UPT-NALF(克斯特廷斯(Corstjens)等人，临床化学，47：10，1885-1893，2001)、以及量子点的使用。
也可在侧向流动装置上捕获核酸。捕获方式可包括抗体依赖性和非抗体依赖性方法。抗体依赖性捕获一般包含抗体捕获线和经标记探针，所述探针是与靶互补或实质上互补的序列。非抗体依赖性捕获一般利用两种结合配偶体之间的非共价交互作用，例如生物素化探针与抗生蛋白链菌素类之间的高亲力和不可逆连接。可将捕获探针直接固定在侧向流动膜上。抗体依赖性和非抗体依赖性方法二者都可用于多重分析中。
也可通过多重DNA测序来检测并监测靶核酸和核酸序列的产生或存在。多重DNA测序是自DNA库鉴定靶DNA序列的方式。所述技术使得可同时处理多个测序模板。在处理 完成时可将所汇集的多个模板分解成单个序列。简单来说，汇集DNA分子，将其扩增并以化 学方式使其破碎。在测序凝胶上根据尺寸将产物分级并将其转移至尼龙膜上。使用与标准DNA测序技术中所用类似的方法用探针检测所述膜并实施放射自显影(丘奇(Church)等人，科学，1998年4月8日；240(4849)：185-188)。可评估放射自显影照片并量化靶核酸序 列的存在。
试剂盒
如本文所述，用于本发明方法中的试剂盒可包含(例如)一或多种聚合酶、正向和反向模板、和一或多种切口酶。倘若欲扩增一个靶，则在试剂盒中可包括一种或两种切口酶。倘若欲扩增多个靶序列，并且所设计用于那些靶序列的模板包含相同切口酶的多个切口酶结合位点，则可包括一种或两种切口酶。或者，倘若可通过不同切口酶识别所述模板，则试剂盒中可包括更多切口酶，例如3种或以上种。
用于本发明方法中的试剂盒也可在任一数量的单独容器、封包、小管、小瓶、微量滴定板和类似物中包含一或多种组份，或在所述容器中可以各种组合合并所述组份。
试剂盒中的各组份可存于(例如)一或多个容器中，例如所有组份可都存于一个容器中，或者例如酶可存于与模板不同的单独容器中。例如，所述组份可冻干、冷冻干燥、或存于稳定缓冲液中。在一实例中，聚合酶和切口酶以冻干形式存于单一容器中，并且模板以冻干、冷冻干燥、或存于缓冲液中的形式存于不同容器中。或者，在另一实例中，聚合酶、切口酶、和模板以冻干形式存于单一容器中。或者，可将聚合酶和切口酶分离至不同容器中。
试剂盒可另外包含(例如)反应中所用dNTP、或经修饰核苷酸、试管或用于反应的其它容器、或含有用于使冻干组份再水合的水或缓冲液的小瓶。所用缓冲液可(例如)既 适合于聚合酶活性也适合于切口酶活性。
用于本发明方法的试剂盒也可包含实施本文所述一或多种方法的说明书和/或本文所述一或多种组合物或试剂的说明。说明书和/或说明可呈印刷品形式并且可包括于试剂盒插入物中。试剂盒也可包括对提供所述说明书或说明的网址的书面描述。
试剂盒可另外包含用于检测方法的试剂，例如用于以下方法的试剂：FRET、侧向流动装置、试条、荧光染料、胶体金颗粒、胶乳颗粒、分子信标、或聚苯乙烯珠粒。
本发明方法和本发明试剂盒的优势在于其可用于可提供恒温的任一装置中，包括温度循环器、培养箱、水浴、和加热模块。
因此，本发明方法中提供扩增核苷酸序列的方法，其包含：合并具有靶核苷酸序列的靶核酸与(i)聚合酶、(ii)与靶核苷酸序列第一链杂交的第一模板核酸、和(iii)与靶 核苷酸序列的第一链的互补链杂交的第二模板核酸；在所述聚合酶可延长所述模板核酸的条件下使其发生扩增反应，由此生成经延长模板核酸扩增子；其中：靶核苷酸序列长度介于20与40个核苷酸之间；靶核苷酸序列在约10分钟内扩增1E+6倍或以上；并且上述步骤 是在实质上等温的条件下实施。
也提供扩增核苷酸序列的方法，其包含：合并具有靶核苷酸序列的靶核酸与(i)聚合酶、(ii)与靶核苷酸序列第一链杂交的第一模板核酸、和(iii)与靶核苷酸序列的第一链的互补链杂交的第二模板核酸；在所述聚合酶可延长所述模板核酸的条件下使其发生扩增反应，由此生成经延长模板核酸扩增子；其中：靶核苷酸序列的长度介于20与40个核苷酸之间；第一模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与靶核苷酸序列的第一链的3’末端互补或实质上互补的第一模板识别区域；第二模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶核苷酸序列的第一链的互补链的3’末端互补或实质上互补的第二模板识别区域；靶核苷酸序列所包含的核苷酸比第一模板识别区域与第二模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个；靶核苷酸序列在约10分钟内扩增1E+6倍或以上；并且上述步骤是在实质上 等温的条件下实施。
也提供扩增核苷酸序列的方法，其包含：合并具有靶核苷酸序列的靶核酸与(i)聚合酶、(ii)与靶核苷酸序列第一链杂交的第一模板核酸、和(iii)与靶核苷酸序列的第一链的互补链杂交的第二模板核酸；在所述聚合酶可延长模板核酸的条件下使其发生扩增反应，由此生成经延长模板核酸扩增子；其中：第一模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与靶核苷酸序列的第一链的3’末端互补或实质上互补的第一模板识别区域，其中识别区域长8-15个核苷酸；第二模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶核苷酸序列的第一链的互补链的3’末端互补或实质上互补的第二模板识别区域，其中识别区域长8-15个核苷酸；靶核苷酸序列在约10分钟内扩增1E+6倍或以上；并且上述步骤是在实质 上等温的条件下实施。
在本发明方法的某些方面中，第一模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与靶核苷酸序列的第一链的3’末端互补或实质上互补的第一模板识别区域；并且第二模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与靶核苷酸序列的第一链的互补链的3’末端互补或实质上互补的第二模板识别区域。在某些方面中，靶核苷酸序列所包含的核苷酸比第一模板识别区域与第二模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。在其它方面中，第一模板和 第二模板包含位于识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点，并且扩增反应另外包含一或多种能在所述正向和所述反向模板的切口位点处切口的切口酶，其中任一种切口酶都能对所述两种模板进行切口，或每个模板都能通过至少一种切口酶进行切口，并且其中所述一或多种切口酶不能在所述靶序列内切口。
在某些实施例中，靶核苷酸序列所包含的核苷酸比第一模板识别区域与第二模板识别区域中的核苷酸总数多1个。在其它实施例中，靶核苷酸序列所包含的核苷酸比第一模板识别区域与第二模板识别区域中的核苷酸总数多2个。在其它实施例中，靶核苷酸序列所包含的核苷酸比第一模板识别区域与第二模板识别区域中的核苷酸总数多3个。
在本发明方法的某些方面中，靶核酸是双链或单链核酸。在某些方面中，靶核酸是双链DNA。在其它方面中，靶核酸是单链DNA。在其它方面中，靶核酸是RNA。靶核酸可选自(例如)由以下组成的群组：基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA、线粒体DNA、和合成双链DNA。 靶核酸可选自(例如)由以下组成的群组：病毒DNA、cDNA和合成单链DNA。靶核酸可选自 (例如)由以下组成的群组：信使RNA、病毒RNA、核糖体RNA、转移RNA、微小RNA、微小RNA 前体和合成RNA。
在本发明方法中，DNA聚合酶可为(例如)耐热性聚合酶。聚合酶可选自例如由 以下组成的群组：Bst(大片段)、9°N、温特(外)DNA聚合酶、热启动酶和热启动酶II。 在某些方面中，聚合酶为Bst(大片段)。
在某些实施例中，第一和第二模板包含可通过相同切口酶识别的多个切口酶结合位点，并且所述第一与所述第二切口酶相同。切口酶可选自(例如)由以下组成的群 组：Nt.BspQI、Nb.BbvCi、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.Bpu10I、和Nt.Bpu10I。
在本发明方法的某些方面中，第一链核酸序列中与靶核苷酸序列第一链互补或实质上互补的部分长8-15个核苷酸，并且其中第二链中与靶核苷酸序列互补或实质上互补的部分长8-15个核苷酸。在某些方面中，所提供第一模板的浓度与第二模板相同。在其它方面中，所提供第一或第二模板中的一者与另一模板的比率在1∶100至100∶1的比率 范围内。本发明方法的反应可另外包含第二聚合酶。在某些方面中，第一或第二聚合酶中 至少一种包含逆转录酶活性。
在本发明方法的某些实施例中，扩增是在54℃与60℃之间实施。在其它实施例中，扩增是在56℃与58℃之间实施。在某些实施例中，其中将扩增反应物在恒温下保持1 至10分钟。在其它实施例中，将扩增反应物在恒温下保持1至20分钟。
本发明方法可另外包含检测扩增产物。因此，在某些方面中，扩增产物是通过选自由以下组成的群组的检测方法来检测：凝胶电泳、质谱、SYBR I荧光法、SYBR II荧光法、SYBR金、Pico绿、TOTO-3、嵌入染料检测、荧光共振能量转移(FRET)、分子信标检测、表面捕获、毛细管电泳、纳入经标记核苷酸以容许通过捕获来检测、荧光偏振、和侧向流动捕获。
在某些方面中，能扩增至少两个靶序列。在某些方面中，在固体表面上检测扩增产物。在某些方面中，将至少一种捕获探针固定在固体表面上。在某些实施例中，所述模板中的至少一种包含间隔子、阻断基团、或经修饰核苷酸。
在本发明方法的某些实施例中，靶核苷酸序列在约5分钟内扩增1E+6倍或以上。在其它实施例中，靶核苷酸序列在约2.5分钟内扩增1E+6倍或以上。在其它实施例中，靶 核苷酸序列在约5分钟内扩增1E+7倍或以上。在其它实施例中，靶核苷酸序列在约5分钟 内扩增1E+8倍或以上。在其它实施例中，其中靶核苷酸序列在约5分钟内扩增1E+9倍或 以上。
本发明方法也包括扩增双链核酸靶序列的方法，其包含在基本等温条件下使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列反义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶反义链3’末端互补的部分长8-15个核苷酸；所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列有义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶反义链3’末端互补的部分长8-15个核苷酸；提供能在所述正向模板的切口位点上游、下游或切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；提供能在所述反向模板的切口位点上游、下游或切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口酶；以及提供DNA聚合酶；其中扩增是通过多次如下循环来实施：所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处或所述位点的扩增拷贝处切口，从而产生扩增产物。
也提供扩增单链核酸靶序列的方法，其包含使包含单链靶序列的靶核酸与反向模板接触，其中所述反向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶序列3’末端互补的部分长8-15个核苷酸；提供能在所述反向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；提供DNA聚合酶，其中所述聚合酶在一定条件下沿所述靶序列延长所述反向模板；使所述经延长反向模板与正向模板接触，其中所述正向模板包含位于3’末端且与所述经延长反向模板3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶反义链3’末端互补的部分长8-15个核苷酸；提供能在所述正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内或在所述靶序列互补链内切口的第二切口酶；其中扩增是在基本等温条件下实施，其中扩增是通过多次如下循环来实施：所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处切口，从而产生扩增产物。在本发明方法的某些方面中，DNA聚合酶是耐热性聚合酶。例如，聚合酶可选自由以下组成的群组：Bst(大片段)、9°N、 温特(外)DNA聚合酶、热启动酶、和热启动酶II。在某些方面中，聚合酶为Bst(大片 段)。
在某些方面中，切口酶在切口酶结合位点下游切口。在其它方面中，正向和反向模板包含可通过相同切口酶识别的切口酶结合位点，并且所述第一与所述第二切口酶相同。在某些方面中，切口酶选自由以下组成的群组：Nt.BspQI、Nb.BbvCi、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.Bpu10I、和Nt.Bpu10I。
在本发明方法的某些实施例中，靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板识别区域和所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。在某些实施例中，靶序列所包含的 核苷酸比所述正向模板识别区域与所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多1个。在其它 实施例中，靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板识别区域与所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多2个。
在某些方面中，靶DNA分子选自由以下组成的群组：基因组DNA、质粒、线粒体和病毒DNA。在其它方面中，靶核酸选自由以下组成的群组：病毒DNA、信使RNA、微小RNA、和微 小RNA前体。在其它方面中，所提供正向模板的浓度与反向模板相同。在其它方面中，所提 供正向或反向模板中的一个模板与另一模板的比率在1∶100至100∶1的比率范围内。
在某些实施例中，本发明方法另外包含第二聚合酶。例如，聚合酶中的至少一种可包含逆转录酶活性。在某些方面中，扩增是在54℃与60℃之间实施。在其它方面中，将扩 增反应物在恒温下保持1至10分钟。
本发明方法可另外包含检测扩增产物。例如，扩增产物可通过选自由以下组成的群组的方法来检测：凝胶电泳、质谱、SYBR I荧光法、SYBR II荧光法、SYBR金、Pico绿、TOTO-3、嵌入染料检测、FRET、分子信标检测、表面捕获、毛细管电泳、纳入经标记核苷酸以容许通过捕获来检测、荧光偏振、和侧向流动捕获。
在某些方面中，能扩增至少两个靶序列。在其它方面中，在固体表面上检测扩增产物。在某些方面中，将至少一种捕获探针固定在固体表面上。在其它方面中，所述模板中的至少一种包含间隔子、阻断基团、或经修饰核苷酸。
本发明方法也包括扩增双链核酸靶序列的方法，其包含在基本等温条件下使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列反义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域；所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列有义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域；并且所述靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板识别区域和所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个；提供能在所述正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；提供能在所述反向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口酶；以及提供DNA聚合酶；其中扩增是通过多次如下循环来实施：所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处或所述位点的扩增拷贝处切口，从而产生扩增产物。
也提供扩增单链核酸靶序列的方法，其包含使包含单链靶序列的靶核酸与反向模板接触，其中所述反向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶序列3’末端互补的部分长8-15个核苷酸；提供能在所述反向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；提供DNA聚合酶，其中所述聚合酶在一定条件下沿所述靶序列延长所述反向模板；使所述经延长反向模板与正向模板接触，其中所述正向模板包含位于3’末端且与所述经延长反向模板3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板识别区域和所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个；提供能在所述正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内或在所述靶序列互补链内切口的第二切口酶；其中扩增是在基本等温条件下实施，其中扩增是通过多次如下循环来实施：所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处切口，从而产生扩增产物。
在某些实施例中，靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板识别区域与所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多1个。在其它实施例中，靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板识别区域与所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多2个。在其它实施例中，靶序列所包含的核苷酸比所述正向模板识别区域与所述反向模板识别区域中的核苷酸总数多3 个。
也提供扩增双链核酸靶序列的方法，其包含在基本等温条件下使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列反义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域；所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列有义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域；提供能在所述正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；提供能在所述反向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口酶；以及提供DNA聚合酶；其中扩增是通过多次如下循环来实施：所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处或所述位点的扩增拷贝处切口，从而产生扩增产物。
也提供扩增双链核酸靶序列的方法，其包含在基本等温条件下使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列反义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域；所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列有义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域；提供能在所述正向模板的切口位点上游、下游或切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；提供能在所述反向模板的切口位点上游、下游或切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口酶；以及提供DNA聚合酶；其中扩增是通过多次如下循环来实施：所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处或所述位点的扩增拷贝处切口，从而产生扩增产物。
也提供扩增双链核酸靶序列的方法，其包含在基本等温条件下使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列反义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域；所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列有义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域；提供能在所述正向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；提供能在所述反向模板的切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口酶；以及提供DNA聚合酶；其中扩增是通过多次如下循环来实施：所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处或所述位点的扩增拷贝处切口，从而产生扩增产物，其中当使扩增反应进行12分钟时，长22-35个核苷酸的靶序列获得至少1E+7倍的扩增。
本发明也提供扩增双链核酸靶序列的方法，其包含在基本等温条件下使包含具有有义链和反义链的双链靶序列的靶DNA分子与正向模板和反向模板接触，其中所述正向模板所包含的核酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列反义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶反义链3’末端互补的部分长8-15个核苷酸；所述反向模板所包含的核苷酸序列包含位于3’末端且与所述靶序列有义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶反义链3’末端互补的部分长8-15个核苷酸；提供能在所述正向模板的切口位点上游、下游或切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第一切口酶；提供能在所述反向模板的切口位点上游、下游或切口位点处切口但不能在所述靶序列内切口的第二切口酶；以及提供DNA聚合酶；其中扩增是通过多次如下循环来实施：所述聚合酶沿所述靶序列延长所述正向和反向模板，从而产生双链切口位点，并且所述切口酶在所述切口位点处或所述位点的扩增拷贝处切口，从而产生扩增产物，其中当使扩增反应进行12分钟时，长22-35个核苷酸的靶序列获得至少1E+7倍的扩增。
也提供扩增核酸靶序列的试剂盒，其包含DNA聚合酶；核酸扩增用第一模板，其包含位于3’末端且与所述靶序列有义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶序列有义链3’末端互补的部分长8-15个核苷酸；核酸扩增用第二模板，其包含位于3’ 末端且与所述靶序列有义链互补链的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述核酸序列中与所述靶序列有义链互补链3’末端互补的部分长8-15个核苷酸；和一种或两种热稳定切口酶，其中任一种酶都能在所述第一和所述第二模板的切口位点处切口，或第一酶能在所述第一引物的切口位点处切口并且第二酶能在所述第二引物的酶位点处切口。
在某些实施例中，靶序列所包含的核苷酸比所述第一模板识别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。在某些实施例中，聚合酶、切口酶和模板存于一个容器中。在某些实施例中，聚合酶、切口酶和模板存于两个容器中。在其它实施例中，聚合酶和切口酶存于第一容器中，并且所述模板存于第二容器中。在某些方面中，聚合酶、切口酶和模板经冻干。在某些方面中，试剂盒另外包含实施扩增方法的说明书。试剂盒可另外包含试管。或者，例如，试剂盒可另外包含侧向流动装置或试条。在某些方面中，侧向流动装置或试条另外包含捕获探针。在某些方面中，试剂盒另外包含选自由以下组成的群组的检测部分：荧光染料、胶体金颗粒、胶乳颗粒、分子信标和聚苯乙烯珠粒。在试剂盒的某些方面中，所述模板中的至少一种包含间隔子、阻断基团、或经修饰核苷酸。
也提供扩增核酸靶序列的试剂盒，其包含DNA聚合酶；核酸扩增用第一模板，其包含位于3’末端且与所述靶序列有义链3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域；核酸扩增用第二模板，其包含位于3’末端且与所述靶序列有义链互补链的3’末端互补的识别区域、所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点、以及所述切口位点上游的稳定区域，其中所述靶序列所包含的核苷酸比所述第一模板识别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个；和一种或两种热稳定切口酶，其中任一种酶都能在所述第一和所述第二模板的切口位点处切口，或第一酶能在所述第一引物的切口位点处切口并且第二酶能在所述第二引物的酶位点处切口。在试剂盒的某些方面中，所述第一模板核酸序列中与所述靶序列有义链3’末端互补的部分长8-15个核苷酸，并且所述第二模板核酸序列中与所述靶序列有义链互补链3’末端互补的部分长8-15个核苷酸。
在某些实施例中，聚合酶、切口酶和模板存于两个容器中。在其它实施例中，聚合酶和切口酶存于第一容器中，并且所述模板存于第二容器中。在某些方面中，聚合酶、切口酶和模板经冻干。在某些方面中，试剂盒另外包含实施扩增方法的说明书。所述试剂盒可另外包含试管。或者，例如，试剂盒可另外包含侧向流动装置或试条。在某些方面中，侧向流动装置或试条另外包含捕获探针。在某些方面中，试剂盒另外包含选自由以下组成的群组的检测部分：荧光染料、胶体金颗粒、胶乳颗粒、分子信标和聚苯乙烯珠粒。在试剂盒的某些方面中，所述模板中的至少一种包含间隔子、阻断基团、或经修饰核苷酸。
实例
实例1：样品NEARTM扩增分析
此实例提供本发明方法中典型DNA湿法分析的实例。所属领域技术人员应理解，可对反应体积和模式、实施分析的时间长度、以及各反应物的数量进行多种改变。
使用两个96孔微量滴定板来建立“湿法”分析，所述两个板为模板/靶板和主混 合物板。将5微升模板等分至模板/靶板上的适宜孔中以开始分析。对于“-靶”孔(无靶 对照孔)，添加5微升dH2O。通过在单一管中将缓冲液、盐、dNTP、酶和dH2O合并在一起来产 生试剂主混合物，其中根据所测试样品数来使用各自的适宜体积(参见此实例内的表)。将 40微升试剂主混合物等分至主混合物板的“-靶”和“+靶”(有靶对照孔)孔中，并且用热 密封剂将板密封。上述所有步骤都是在扩增前室中完成，并且随后的所有步骤都是在扩增 后室中完成。自模板/靶板移除热密封剂，其中仅自将添加靶的孔中移除，使“-孔”保持密 封以避免可能的污染。将5微升靶等分至适宜“+靶”孔中。用热密封剂再次将模板/靶板 密封。将模板/靶板和主混合物板二者在分析温度下(例如在56℃、57C或58℃下，使用热 循环)培养2-3分钟。自两个板移除热密封剂。将40微升试剂主混合物自主混合物板孔 转移至模板/靶板上的适宜孔中，并且用热密封剂再次将模板/靶板密封。将样品在分析 温度下培养5-10分钟。根据开始培养的时间来计算反应时间，在将试剂主混合物转移至模 板/靶板上的孔中后立即将板密封，并将其置于温度循环器中。通过添加0.1％或以上SDS 来终止反应，或通过将样品在80℃下培养2分钟来终止反应。
为检测扩增产物，例如将3-5微升、5微摩尔分子信标添加至各孔中并通过上下抽吸若干次来混合。在分析温度下培养1分钟后，根据存于分子信标上的荧光团在适宜波长下实施荧光读取。
单一50微升DNA反应的典型试剂明细(所有体积都以微升来表示)
试剂 靶 +靶 终浓度
5X IB2缓冲液 10.0 10.0 1X
100mM MgSO<sub>4</sub> 2.5 2.5 10+5mM
10mM dNTP 1.5 1.5 0.3mM
8U/微升Bst Pol 2.4 2.4 19.2单位
10U/微升N.BstNBl 1.50 1.50 15单位
模板1 2.5 2.5 10-1000nM
模板2 2.5 2.5 10-1000nM
靶 0 5.0
H<sub>2</sub>O 27.1 22.1
总量 50.0 50.0
5X IB2缓冲液由以下组成：
250mM Tris-HCl(pH8.0)
75mM(NH4)2SO4
75mMNa2SO4
50mM MgSO4
5mM DTT
0.5％曲拉通X-100。
典型反应不具有标准靶浓度，但每次反应中的靶拷贝可介于(例如)10-50的下限与(例如)1E+6拷贝或以上的上限之间。对于摩尔浓度来说，具有10拷贝靶的50微升分 析物为3.32e-13微摩尔，而具有50拷贝靶的50微升分析物为1.66e-12微摩尔，并且具有 1e6拷贝靶的50微升分析物为3.32e-8微摩尔。
靶样品可由(例如)已再悬浮于dH2O或TE中的纯化DNA或RNA或 尚未纯化的样品组成。例如，收集子宫颈内拭子临床样品，并且使用皮尔斯溶 解-N-Go(Pierce′sLyse-N-Go)PCR试剂(目录号78882)自拭子洗脱并溶解样品。溶 解-N-Go是基于非离子型洗涤剂的专卖调配物。然后将经洗脱/溶解样品的各等份直接添 加至分析物中，并且结果表明未损失分析活性。也已使用在病毒运输介质(VTM)(M4或M5) 中收集的临床样品来实施分析。将在VTM中收集的样品与皮尔斯溶解-N-Go PCR试剂混合 以溶解靶细胞，并且随后将这些样品的等份添加至分析物中而不损失活性。最后，已在各种 可能抑制剂的存在下实施分析，例如沙子、土壤、粘土、尿液和血清，并且这些抑制剂各自具 有良好耐受性。
实例2：通过凝胶电泳检测DNA NEARTM分析产物
可通过凝胶电泳使扩增反应产物可视化。在不存在靶时，模板(具有互补或实质上互补的3’碱基)重叠一或多个碱基，聚合酶在各方向上延长以生成NEARTM扩增二倍体 (图1B)；并且扩增继续以类似机制进行至NEARTM扩增，以扩增比靶扩增产物短两个碱基的 产物。在模板末端为A和T的25聚体分析情况下，所得背景产物为23个碱基。27聚体分 析也形成23聚体背景和27聚体产物。同样扩增较长反应产物。根据图1C中的步骤9B，假 定这一系列产物是在切口酶可在NEARTM扩增二倍体两侧切口之前通过聚合酶延长所形成 的。图2显示通过凝胶电泳可容易地区分NEARTM反应产物与背景产物。
实例3：通过凝胶电泳检测RNA分析产物
本发明方法的反应也可扩增RNA靶。在此情况下，靶为埃博拉披甲RNA，其为约600个碱基的RNA链，通过MS2噬菌体外壳蛋白将其封装以模拟病毒颗粒。反应设计为可扩增 封装RNA序列内所含埃博拉基因组中的25个碱基的区域。在20％聚丙烯酰胺凝胶上运行 反应产物(图3)，展示经扩增25聚体产物以及23聚体和20聚体背景产物。此实例证实反 应具有扩增自病毒样颗粒释放的RNA的能力。
实例4：通过质谱检测DNA和RNA分析产物
本发明方法的反应扩增产物也可使用具有前端LC的ESI/TOF系统通过质谱来检测。所观察到的反应产物是多电荷离子物质。通常，-3或-4电荷态是波谱中的主峰(在1000-3000AMU范围内)，根据寡核苷酸产物而定。波谱中通常存在钠加合物作为与主峰相邻的峰，其强度为约20-25％。在靶存在下阳性反应的独特峰可见于分别针对DNA和RNA反应的图4和图5二图中。在这些反应中形成的背景产物未显示于这些波谱的质量范围中。
实例5：分析扩增的实时检测
如图6中所示，也可用SYBR II荧光法实时监测本发明方法的扩增反应。荧光随SYBR II嵌入经扩增双链产物中而增强。背景产物也生成荧光，但速率慢于真实产物。需要 优化扩增序列、反应温度和反应缓冲条件以使阳性反应与阴性对照之间的特征性区别可视 化。
实例6：实时NEARTM分析扩增的FRET检测
NEARTM扩增也可通过荧光共振能量转移(FRET)来监测，如图7中所示。使用双 重标记模板来进行扩增，每个末端上有一个标记(5’-FAM，3’-BHQ)。在模板变成双链时，在 通过切口酶裂解模板后，自FAM标记寡核苷酸生成荧光。由于荧光是通过初始切口反应来 产生，因此此检测方法极为灵敏。由于猝灭标记阻断模板3’末端的延长，因此抑制了背景 荧光的产生。
实例7：实时NEARTM扩增的分子信标检测
第三种监测实时扩增的方法是使用分子信标，如图8中所示。在此情况下，扩增产物与分子信标中的环区域杂交，从而导致因位于发夹茎各个末端上的荧光团与猝灭剂的分离而产生的荧光增强。由于此交互作用在扩增后发生，因此将其视为伪实时并且其反应相对于FRET方法稍慢。
实例8：假阳性率测试
此实验设计为用探针检测本发明方法的扩增反应在阴性反应中产生真实产物或假阳性的可能性。在存在(n＝120)和不存在(n＝320)枯草芽孢杆菌基因组DNA的情况 下实施对枯草芽孢杆菌基因组具有特异性的25聚体区域的特异性扩增反应。终点反应是 在质谱仪上进行并且分析质谱中产物质量峰的曲线下面积(AUC)。如图9中所示，结果显示 320个阴性反应都不产生AUC值等于水对照的假阳性。真阳性AUC值与真阴性相差至少3 倍标准误差。总之，这些结果证实本发明方法的分析具有再现性。
实施枯草芽孢杆菌分析以靶向mobA-nprE基因区域中的25个核苷酸的区域，其具有序列5’-TTAACGTCTCTAATTTCAGCTTTTG-3’。用于扩增此区域的模板为T15’-ATGCATGCATGAGTCACATTTAACGTCTCTA-3’和T25’-ATGCATGCATGAGTCACATCAAAAGCTGAAA-3’。基本上如实例1中所述实施分析，并且在此处具有以下修改：在56℃下经4分钟用10,000拷贝枯草芽 孢杆菌基因组DNA加上100,000拷贝苏云金芽孢杆菌基因组DNA(真阳性)、10,000拷贝大 肠杆菌(Escherichia coli)基因组DNA加上100,000拷贝苏云金芽孢杆菌基因组DNA(真 阴性)、或无靶(水对照)来实施。然后通过电喷雾离子化质谱来分析各样品的各等份，以 使用曲线下面积(AUC)计算来确定各反应中产生的特定产物量。
实例9：信标检测：使用信标检测的分析的再现性
本发明方法的反应产物的分子信标检测也可用作终点读取。如图10中所示，可通过改变正向与反向模板的输入比来操纵各反应产物的比率。改变各种模板的比率以偏向一种反应产物的产生，从而使得单链产物可用于与分子信标杂交。开放的信标生成荧光信号。此检测方法再现性极高。在此研究中，两个操作者在不同的两天重复实施相同分析。此研究的结果证实分析在相邻两天之间具有再现性，并且在各操作者之间也具有再现性。
实例10：使用信标检测的分析的灵敏性
使用土拉热弗朗西斯菌基因组DNA的稀释物来测试使用信标读数的分析的灵敏性。如图11中所示，所检测拷贝数仅高出无靶对照50拷贝。
实例11：DNA扩增的扩增产物浓度
也可使用反应产物的质谱检测来研究分析的灵敏性。图12显示高出无靶对照的信号低达100拷贝。使用此研究的数据来关联输入拷贝数与最终扩增产物量。在此研究中，将质谱产物峰的AUC值拟合至标准曲线以获得分析中扩增产物的终浓度估算值。1E+2和 1E+5拷贝的扩增产物数量分别介于约250nM至接近1μM之间。此产物数量产生1E+8至 7E+10倍的扩增。这些反应是在非热启动条件下实施，事实上已显示热启动条件可显著提高 扩增产物量，从而达成扩增的进一步增强。零拷贝扩增反应由于标准曲线方程中的y-截距 值而具有阳性终浓度。
实例12：RNA分析的扩增产物浓度
对使用本发明方法的RNA扩增实施类似研究。通过本发明方法的分析来扩增RNA靶的稀释物。在质谱上运行产物并且根据标准曲线分析产物峰的AUC值以确定终产物的浓度，如图13中所示。始于30和30,000拷贝初始靶的12分钟的扩增分别产生3E+9至1E+7 倍扩增。与DNA扩增相比较低的扩增程度可归因于聚合酶的逆转录酶能力与其复制能力相 比效率较低。同样，在延长反向模板后形成的RNA∶DNA杂合体与正常DNA∶DNA杂合体相比 具有较强交互作用并且可具有较弱呼吸作用，从而使得正向模板或另一反向模板可置换一 链。然而，据检测RNA反应的扩增产物低至＜100拷贝。
实例13：NEARTM反应对DNA的特异性
由于反应产物长度通常介于20与30个碱基之间，因此产生了关于这些短扩增分析物的特异性是否足以将单一序列区域靶向所存在的其它近邻基因组的问题。通过在存在和不存在不同数量的近邻基因组DNA的情况下进行扩增反应来测试反应的特异性(图14)。在此情况下，分析检测炭疽芽孢杆菌pXO2质粒中的特定序列，并且近邻基因组为苏云金芽孢杆菌(库斯塔克亚种(kurstaki))。通过产物峰的AUC值来分析反应。下图证实，在不存 在正确靶(炭疽芽孢杆菌)时，不扩增真实产物(含量低至在照片比例下不可见)。阳性反 应的扩增量恒定，但由于三次重复反应中有一次反应具有单一较低值，因此对于0和5E+5 拷贝苏云金芽孢杆菌(5E+4拷贝炭疽芽孢杆菌)具有较大误差棒。总之，实验证实当所设 计分析物在基因组的独特区域内时，反应对靶序列的特异性极高。
实例14：干扰物测试
测试一组干扰物以监测其各自对扩增的效应。图15证实，本发明方法的分析在干扰物存在下具有稳定性。某些已知可抑制PCR的干扰物(例如腐殖酸)似乎不抑制分析， 但各干扰物的数量是未知的。根据统计分析，仅干扰物B、C和E在统计上与对照分析物x 不同。在B、C、和E情况下，所述差异导致产物扩增增强。
实例15：利用DNA分析对两个序列的多重化
设计DNA二倍体用于毛细管电泳(CE)检测。扩增产物长度为25个碱基(炭疽芽 孢杆菌分析，Ba)和27个碱基(枯草芽孢杆菌分析，Bs)，并且背景产物为23聚体。在存在 或不存在5E+5拷贝的各基因组DNA靶的情况下使反应进行10分钟。在20％聚丙烯酰胺凝 胶上运行样品以使反应产物可视化。图16表明，当仅存在枯草芽孢杆菌时以及存在枯草芽 孢杆菌和炭疽芽孢杆菌二者时，存在阳性产物扩增。
实例16：DNA分析的双重特异性
显示使用枯草芽孢杆菌(Bs)和炭疽芽孢杆菌(Ba)的DNA双重反应对各基因组具有特异性。在近邻苏云金芽孢杆菌存在下进行分析，如图17中所示。在存在两个模板组以及苏云金芽孢杆菌基因组DNA的阴性反应中，在25或27聚体区域无产物区带。仅在存在 特定基因组靶时出现产物区带，此证实所述双重反应具有特异性。
实例17：利用RNA分析的多重化
实施并多重化扩增27聚体产物的MS2分析和扩增25聚体产物的埃博拉分析，从 而使得各分析中存在所有模板并且产物的扩增依赖于所存在的靶。此模板组合形成长23 个碱基和20个碱基的背景产物。图18中所示凝胶证实，本发明方法的反应具有在单一反 应中扩增多个RNA靶的能力。
实例18：自经溶解孢子扩增
对半处理样品实施扩增以确定是否可扩增通过溶解自孢子释放的DNA。阴性对照反应含有经DNA酶处理的未溶解孢子，因此应不存在可扩增DNA。阳性对照反应含有纯化基因组DNA，其浓度与可通过溶解释放的DNA数量估算值大致相等。图19中的结果显示，如人们所预期，用经DNA酶处理的未溶解孢子实施扩增不产生产物扩增，而在扩增前溶解的三种样品产生在理论数量范围内的产物数量。
实例19：捕获和延长
也可在固体表面上检测本发明方法的反应产物。5’末端通过生物素/抗生蛋白链菌素连接而连接至表面的捕获探针可与反应产物结合，聚合酶自此延长以形成SYBR和任何嵌入染料可检测的稳定二倍体。捕获探针设计为偏向通过结合真实产物而非背景产物来延长，因为捕获探针的3’碱基与产物中的中间间隔子碱基互补，所述中间间隔子碱基在模板或背景产物中不存在。图20证实，在捕获探针和聚合酶存在下产物的荧光相对于一般结合(在不存在聚合酶时进行相同反应以排除捕获探针的延长)和无靶对照(其中仅扩增背景产物，但不能与聚合酶欲延长的捕获探针形成稳定二倍体)有所增强。
实例20：表面NEARTMFRET DNA分析
也可使用固定在表面上的模板实施本发明方法的反应。用于表面扩增FRET检测的模板通常具有三个修饰：一个具有TEG间隔子的5’生物素、一个位于所述生物素内侧的FAM荧光团、和3’末端上用于阻断背景扩增以及猝灭FAM荧光团的猝灭剂。通过生物素/ 抗生蛋白链菌素连接将模板固定在表面上。图21显示，在使用两种固定模板以及额外混合时，反应进行速率显著慢于溶液扩增速率(对1E+6拷贝基因组DNA扩增16分钟)。当单一 模板固定在表面上并且另一模板游离于溶液中时，扩增反应加快到10分钟检测1E+6拷贝 的基因组DNA。在产物信号后约3.5分钟观察到来自背景产物的荧光，此与溶液相动力学观 察结果相似，但显著减慢。
实例21：健康实例
沙眼衣原体(Ct)分析
实施本发明方法的分析来检测沙眼衣原体(Ct)靶序列的存在。使用用于Ct P2_2分析的含有靶序列的合成DNA的2倍系列稀释物来确定分析检测限。基本上如实例1中 所述来实施反应，但如此实例中所述进行某些修改。系列稀释物始于10,000拷贝靶DNA， 并且稀释至每次反应小于1拷贝。在此实验中也包括‘无靶’对照样品。在96孔微量 滴定板上以50微升体积于如下缓冲液中实施反应：50mM Tris-HCl，pH 8.0，30mM NaCl， 15mM(NH4)2(SO2)，15mM Mg2SO4，1mM DTT，0.1％曲拉通X-100，其含有0.3mM dNTP、19.2单位 Bst DNA聚合酶和15单位Nt.BstNBI切口酶。以200nM∶100nM(模板1∶模板2)的比 率添加模板。如下所述实施反应：在板1上，于扩增前室中将5微升模板混合物添加至各孔 中，并将其密封。在板2上，于扩增前室中将40微升主混合物添加至各孔中，并将其密封。 主混合物由dH2O以及上文所列除模板外的所有分析组份组成。然后将两个板转移至扩增 后室中，其中将5微升靶添加至板1的各孔中(‘无靶’对照孔除外)。然后将两个板转移 至预加热至56℃的热循环器上以在56℃下实施2-3分钟的预培养。然后将板2的内容物 转移至板1中，然后在56℃下将其培养5分钟(扩增步骤)。在此培养后，通过在80℃下 保持2分钟使酶失活来终止反应。随后，将对扩增Ct P2_2产物具有特异性的分子信标添 加至300nM的终浓度并在56℃下检测荧光。所有样品都重复分析三次，并且用误差棒来显 示标准误差。使用两个模板、即模板1(5’-ATGCATGCATGAGTCACATAGGCTTATGGAG-3’)和模 板2(5’-ATGCATGCATGAGTCACATTTATACCGCTTA-3’)以200nM∶100nM的最终模板浓度来实 施Ct P2_2分析。用于荧光检测的分子信标MB 5.18含有5’-FAM荧光团和3’-BHQ1猝灭 剂，其具有以下序列：5’-ctggcTACCGCTTAACTCCATAAgccag-3’。
结果展示于图22中，并且表明所述分析可有效检测样品中少于10拷贝的靶。图22B表明，甚至可检测约1-2拷贝，但由于稀释实验，某些孔可能在统计学上不含任何靶 DNA(比较图22B中的条棒1.2a、b与c)。
Ct P2_2分析的靶序列为5’AGGCTTATGGAGTTAAGCGGTATAA-3’。可制备临床样品 用于如下分析中，所述样品为(例如)在子宫颈内拭子或阴道拭子上收集的样品、或在拭子 上收集并且随后转移至诸如M4或M5等病毒运输介质中的样品。将各拭子置于含有300微 升至1毫升皮尔斯溶解-N-Go PCR试剂(目录号78882)的1.5毫升或2.0毫升埃彭道夫 管中。在室温下将混合物培养5-10分钟，并且不时加以搅拌。然后将一等份经洗脱和溶解 的样品直接添加至分析中。对于存于病毒运输介质中的样品来说，可将一等份样品转移至 含有相等或较大体积的皮尔斯溶解-N-Go PCR试剂的埃彭道夫管中(样品：溶解-N-Go比 率为1∶1、1∶2、1∶10、1∶20等)并且将其在室温下培养5-10分钟，并且不时加以搅 拌。然后将一等份经洗脱和溶解的样品直接添加至分析中。
实例22：食物安全应用
单核细胞增生利斯特菌分析
为证实本发明方法的分析可有效地特异性检测食物病原体，对单核细胞增生利斯特菌实施分析，所述细菌是对即食食品的食物安全最大的威胁之一。基本上如实例1中所述实施分析，但如此实例中所述进行某些修改。将单核细胞增生利斯特菌EGD-e株基因组DNA与递增量的紧密相关非病原性物种无害利斯特菌Clip11262株的基因组DNA一起分析。如图23中所示，不存在DNA的阴性对照反应仅显示背景水平的荧光，并且最高每50微升反应物一百万基因组当量的递增量的无害利斯特菌DNA显示不使背景荧光显著增强。然而，可通过荧光的显著增强容易地检测到1,000基因组当量的单核细胞增生利斯特菌的添加，并且此荧光增强不受无害利斯特菌的存在的影响，甚至当非病原性无害利斯特菌以1000倍过量(即每50微升反应物一百万基因组当量)存在时也是如此。各反应物由以下组成：46mM Tris缓冲液，pH 8.5；50mM NaCl；10mM KCl；10mM(NH4)2SO4；5mM MgCl2；10mM MgSO4；0.5mM二硫苏糖醇；0.1％曲拉通X-100；0.01mM EDTA；0.3mM的各种dATP、dCTP、dGTP、和dTTP；得自新英格兰生物实验室公司的19.2单位Bst DNA聚合酶；得自新英格兰生物实验室公司的15单位Nt.BstNBI切口内切核酸酶；200nM第一寡核苷酸；和2微摩尔的第二寡 核苷酸。在56℃下将寡核苷酸和利斯特菌属(Listeria)基因组DNA与酶缓冲液混合物分 开培养，然后将5微升的此混合物添加至45微升酶缓冲液混合物中。在56℃下将反应物 培养10分钟，然后在80℃下培养2分钟。此后，将3.2微升分子信标的5μM溶液添加至 各反应物中。分子信标的序列对扩增单核细胞增生利斯特菌序列具有特异性，所述分子信 标在5’和3’末端上分别具有荧光团和猝灭剂。在添加分子信标后，在56℃下将反应物培 养1分钟，然后实施荧光测量。将各分析条件重复测试两次，并展示平均荧光值。单核细胞 增生利斯特菌分析的靶序列为5’-AAAGCAAGAGAAAGTTATCGTGTAT-3’。模板序列如下所述： T15’-ATGCATGCATGAGTCACATAAAGCAAGAGAA-3’和T25’-ATGCATGCATGAGTCACATATACACGATAA C-3’。
实例23：病毒RNA实例
使用来自病毒阳性临床样品的纯化病毒RNA的10倍系列稀释物来确定分析的 检测限。使用市售病毒RNA纯化试剂盒来纯化病毒RNA。包括‘无靶’阴性对照样品。在 96孔微量滴定板上以50微升体积于以下缓冲液中实施反应：50mM Tris-HCl，pH8.0，30mM NaCl，15mM(NH4)2(SO2)，10mM Mg2SO4，1mM DTT，0.1％曲拉通X-100，其含有0.1mM dNTP、 19.2单位Bst DNA聚合酶、7.5单位Nt.BstNBI切口酶和4单位OmniScript逆转录酶。以 400nM∶20nM(模板1∶模板2)的比率添加模板。如下所述实施反应：在板1上，于扩增 前室中将5微升模板混合物添加至各孔中，并将其密封。在板2上，于扩增前室中将40微 升主混合物添加至各孔中，并将其密封。主混合物由水以及上文所列除模板外的所有分析 组份组成。然后将两个板转移至扩增后室中，其中将5微升靶添加至板1的各孔中(‘无 靶’对照孔除外)。然后将两个板转移至预加热至56℃的热循环器上以在56℃下实施2-3 分钟的预培养。然后将板2的内容物转移至板1中，然后在56℃下将其培养5分钟(扩增 步骤)。在此培养后，通过在80℃下保持2分钟使酶失活来终止反应。随后，将对扩增产物 具有特异性的分子信标添加至300nM的终浓度并在56℃下检测荧光。所有样品都重复分析 三次，并且用误差棒来显示标准误差。结果展示于图24中。
使用两个模板(模板1：长31个核苷酸；和模板2：长31个核苷酸)以 400nM∶20nM的最终模板浓度来实施病毒RNA分析。用于荧光检测的分子信标(MB)含有 5’-FAM荧光团和3’-BHQ1猝灭剂，其序列长29个核苷酸。靶序列的长度为26个核苷酸。
实例24：农业应用：遗传修饰(GMO)和普通(非GMO)玉米的作物分析样品制剂中遗 传修饰性征的检测：
在农业应用中可使用本发明方法的分析来检测遗传修饰有机体(GMO)。使用所述分析来检测在未经修饰玉米DNA背景下插入玉米基因组中的bar基因的存在。bar基因可 赋予针对广谱除草剂草丁膦的抗性。基本上如实例1中所述来实施分析，但如此处所述进 行某些修改。将遗传修饰和普通(未经修饰)玉米种子研磨至适宜粗糙水平，并使用标准 缓冲液来提取核酸。根据制造商说明书使用尺寸排除管柱来纯化所提取材料。合并经纯化 核酸以在普通背景下产生5％终浓度的bar经修饰玉米(例如，合并5微升bar玉米DNA提 取物与95微升普通玉米DNA提取物)，或在100％普通玉米情况下使用未混合形式的纯化 核酸。用于检测bar基因的寡核苷酸序列列述如下。
模板1：ATGCATGCATGAGTCACATCATCGTCAACCA
模板2：ATGCATGCATGAGTCACATTGTCTCGATGTA
模板设计为可产生以下产物：
产物1：CATCGTCAACCACTACATCGAGACA
产物2：TGTCTCGATGTAGTGGTTGACGATG
所用分析试剂为：9.6单位Bst.聚合酶(NEB)、15单位N.BstNBI切口酶(NEB)、 5微升Thermopol I缓冲液(NEB)、2.5微升NEB缓冲液3、12mM MgSO4、0.3mM dNTP、2.5％ DMSO(二甲亚砜)、5微升样品、模板和水。寡核苷酸以10nM(模板1)和100nM(模板2)的 初始浓度存在。使用水将终体积调节至50微升，并且在56℃下实施10分钟的分析，随后在 94℃下培养2分钟以使酶失活，之后在56℃下用特异性分子信标以300nM的终浓度检测。 此分子信标的序列为：
5’FAM-CCTCGCCGTCAACCACTACATCGAGCGAGG-BHQ 1-3’。
结果展示于图25中。
实例25：微小RNA(miRNA)的检测
来自MDA-MB-231人乳癌细胞的微小RNA的分析样品制剂：
已知MDA-MB-231人乳癌细胞(ATCC号HTB-26)可表达升高水平的微小RNA-21(约瑞欧，M.V.(Iorio，M.V.)等人，2005，人类乳癌中的微小RNA基因表达脱调节(MicroRNAgene expression deregulation in human breast cancer)，癌症研究(CancerRes.)，65：7065-7070)。实施对miR-21的分析，其检测成熟微小RNA-21序列：
5’UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 3’
所用模板序列为(切口酶序列加下划线)：
模板1：ATGCATGCATGAGTCACATTAGCTTATCA
模板2：ATGCATGCATGAGTCACATTCAACATCAG
模板设计为可产生以下产物：
产物1：TAGCTTATCAGACTGATGTTGA
产物2：TCAACATCAGTCTGATAAGCTA
基本上如实例1中所述来实施分析，但如此处所述进行某些修改。为获得RNA，使用所属领域技术人员熟知的标准方法在补加有10％胎牛血清、葡萄糖和抗生素的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)(英杰)中对MDA-MB-231 细胞实施繁殖和继代培养，。在达到铺满前，通过用胰蛋白酶处理自板中移出细胞，并且随 后在磷酸盐缓冲盐水中洗涤，之后在-80℃下冷冻。随后使细胞解冻，并且一部分用于根据 制造商说明书用TRI试剂(分子研究中心(Molecular ResearchCenter)公司)来分离RNA。 使用在260nm下的UV吸光度来量化纯化RNA。
根据分子研究中心TRI试剂手册，1ng纯化RNA对应于约100个细胞的起始材料。 在包括以下试剂的分析中使用不同量的纯化RNA：50mM Tris-HCl(pH 8.0)、30mM(NH4)2SO4、30mM Na2SO4、1mM DTT、0.1％曲拉通X-100、10mM MgSO4、0.1mMdNTP、19.2单位Bst.聚合 酶(新英格兰生物实验室)、7.5单位N.BstNBI切口酶(新英格兰生物实验室)、7.4单位Omniscript逆转录酶(凯杰)、各自为100nM的两种寡核苷酸、样品和水。使用水将终体积 调节至50微升，并且在56℃下实施20分钟分钟的分析，之后在94℃下培养2分钟以使酶 失活。使用电喷雾离子化质谱来测量产物，并且通过计算曲线下面积来量化产物数量。所 述分析的结果展示于图26中。
实例26：基因组DNA靶的检测
基本上如实例1中所述使用设计为可结合基因组靶的寡核苷酸模板来实施本发 明方法的分析。实施稀释实验来确定检测下限。如图27中所示，在50个基因组拷贝下检 测值恒定。在所稀释样品含有10个基因组拷贝时可以检测到，然而，在统计学上所述检测 值不恒定。
实例26(图27)绘示淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)分析。所述分析靶 向pilQ基因，特别是序列5’-ACTCTACCAACACGGAACTCAAAAA-3’。用于扩增此靶的模板序列 为：T15’-ATGCATGCATGAGTCACATTTTTTGAGTTCC-3’、和T25’-ATGCATGCATGAGTCACATACTCTACCAACA-3’。基本上如实例1中所述来实施分析，但在此处进行某些修改。简单来说，在56℃下实施5分钟的分析，随后在80℃下实施2分钟的热失活步骤以终止反应。在56℃下培养 1分钟后，使用300纳摩尔含有5’-荧光团和3’-猝灭剂并且对扩增特定产物具有特异性 的分子信标来实施经扩增特定产物的终点检测。分子信标序列为：5’-CGCATGGAGTTCCGTGTTGGTAGACATGCG-3’。
实例27：枯草芽孢杆菌分析中生成的特定产物的计算
基本上如实例1中所述使用设计为可结合枯草芽孢杆菌靶序列的寡核苷酸模板来实施本发明方法的分析，所述靶为ppsA基因：
靶序列(25聚体)5’-CCAAGCTCAAAAAAGGAATCGTGAA-3’
T15’-ATGCATGCATGAGTCACATCCAAGCTCAAAA-3’
T25’-ATGCATGCATGAGTCACATTTCACGATTCCT-3’
如图28中所示，线性回归显示添加至样品中的参照寡核苷酸的数量与曲线下面积(AUC)之间具有极佳关联。使用此方程来确定在将50或500拷贝基因组DNA靶添加至 反应中时生成的特定产物量。使反应进行5分钟。计算扩增倍数并将其展示于下表中。
表5
特定产物1944的产率(x＝y-b/m)
根据以下来计算：枯草芽孢杆菌基因组＝4214814个核苷酸，分子量(g/摩尔)为2781777240。阿伏伽德罗数(Avogadro′s number)(分子/摩尔)＝6.02E+23。对于50 基因组拷贝来说(以摩尔计)，此产生8.30E-23；对于500基因组拷贝来说(以摩尔计)， 此产生8.30E-22。
实例28：不同间隔子长度的效应
基本上如实例1和21中所述使用图29和30中所示的各种模板来实施一系列沙 眼衣原体(Ct)分析。图29展示反应结果，图30提供关于模板设计的更多细节。使用0或 100拷贝靶使反应进行10分钟。制备一系列寡核苷酸目标，其中间隔子区域长度(若结合 模板，则是指靶序列上介于寡核苷酸模板结合位点之间的核苷酸数)介于1至11之间。此 实验的最适间隔子长度为1、2、3或4。
基本上遵循与实例23中所述相同的方法使用2、5、6、7和8的间隔子长度对病毒RNA靶实施类似的一组实验。如通过质谱所测定，发现最适特定产物检测使用2和5的间隔子长度，并且在间隔子长度为6或更大并且使反应进行20分钟时在此分析中未检测到特定产物。
也使用其它靶进行类似实验。对于某些靶(例如miR-21)来说，当模板设计中不 包括间隔子核苷酸时，不论反应中是否存在靶序列都可检测到产物。不论分析中是否存在 靶DNA都可检测到产物，此表明模板组不需要靶存在也可产生特定产物。在其它实验中，0 个核苷酸的间隔子区域确实产生特定产物。因此，在设计本文所述分析的模板时，应制备不止一组模板，以确定最适于自特定靶产生特定产物的间隔子区域长度。
实例29：稳定区域的效应
基本上如实例1和21中所述来实施一组沙眼衣原体(Ct)分析。制备包括或不包 括稳定区域(5’ATGCATGCAT)的模板。用0或100拷贝靶DNA使反应进行10分钟。使用实 时Sybr绿荧光检测来实施分析。如图31中所示，含有不具有稳定区域的模板的样品不显 示扩增。在另一组分析中，使用病毒RNA，分析中包括0或1000拷贝靶。含有不具有稳定区 域的模板的样品不显示扩增，而具有稳定区域的样品显示快速扩增。
实例30：Mg+2浓度的效应
基本上如实例1和21中所述来实施一组沙眼衣原体(Ct)分析。所述分析是使用 不同浓度的Mg+2来实施。如图32中所示，对于此组分析来说，当存在6mM Mg+2时发现活性 完全丧失，并且当存在9mM Mg+2时活性显著下降。在12mM至21mM的Mg+2浓度下，所实施分 析最佳。
实例31：其它模板/靶组合的实例
本发明方法并不限于本发明实施例和实例中所提供的特定模板和靶。可使用其它靶和模板来实施本文所述的等温扩增方法。其它靶和模板的实例包括(但不限于)图34 中所示者。所属领域技术人员应了解，可设计图中所示靶的其它模板，反应中可使用图中所示靶的相关靶序列，并且图中未包括的靶序列也在本发明方法的范围内。
每个专利、专利申请案、出版物和本文所提及的文献都是全文以引用方式并入本文中。上述专利、专利申请案、出版物和文献的引用并不代表认可上述任一文献是相关的先前技术，也不代表对这些出版物或文献中的内容或日期的认可。
除非上下文另外明确说明，否则单数形式“一(a、an)”和“所述”包括复数含义。 因此，例如，在提及“一亚组”时包括复数个所述亚组，在提及“一核酸”时包括一或多种核 酸和所属领域技术人员已知的核酸等效物，等等。术语“或”对其所指代的一或多个术语并 无排他性。例如，在具有结构“A或B”的词组中使用时，可表示单独的A、单独的B、或A和 B二者。
除非另有说明，否则本文所用所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本发明实践或测试中可使用与本文所述类似或等效的任何方法和系统，但现在阐述所述方法、装置和材料。本文所提及的所有出版物都是以引用方式并入本文中，以达成阐述和揭示可结合本发明使用的出版物中所报导的工艺、系统和方法的目的。绝不能由于此揭示内容为先前发明而理解为承认本发明无权先于所述揭示内容。
可在不背离本发明基本方面的情况下对上文加以修改。尽管已参照一或多个具体实施例十分详细地阐述了本发明，但所属领域技术人员应了解，可对本申请案中具体揭示的实施例进行改变，并且这些修改和改良都在本发明范围和精神内。可在不存在本文未特别揭示的任何要素的情况下以适宜方式实践本文说明性阐述的本发明。因此，例如，在本文中每一情形中，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一者都可用其它两个术语中的任一者来替代。因此，使用已采用的术语和表达作为说明而非限制的术语，不排除所展示和阐述的特征的等效内容或其各部分，并且应了解可在本发明范围内作出各种修改。在以下权利要求书中阐述本发明各实施例。

Claims (52)

1.一种非以疾病诊断为目的的扩增核苷酸序列的方法，其包含:
具有靶核苷酸序列的靶核酸与反应混合物混合合并，其中，所述的反应混合物包括：(i)聚合酶，(ii)与所述靶核苷酸序列的第一链杂交的第一模板核酸，所述第一模板所包含的核酸序列包含位于3'末端且与所述靶核苷酸序列第一链的3'末端互补的第一模板识别区域；切口酶结合位点和位于所述识别区域上游的切口位点，和位于切口位点上游的稳定区域，所述的稳定区域包括40-60％的GC；
(iii)与所述靶核苷酸序列第一链的互补链杂交的第二模板核酸，所述第二模板所包含的核苷酸序列包含位于3'末端且与所述靶核苷酸序列第一链的互补链的3'末端互补的第二模板识别区域；切口酶结合位点和位于所述识别区域上游的切口位点，和位于切口位点上游的稳定区域，所述的稳定区域包括40-60％的GC；
和(iv)一种或多种切口酶；
在所述聚合酶可延长所述模板核酸的条件下使其发生扩增反应，由此生成经延长模板核酸扩增子；其中:
所述靶核苷酸序列的长度介于20与40个核苷酸之间；
所述靶核苷酸序列在10分钟内扩增1E+6倍或以上；并且
上述步骤是在等温的条件下实施；其中，不需要在扩增前进行靶核酸的变性步骤；
其中，所述被扩增的靶核苷酸序列来自样品，所述的样品是直接被添加到所述的反应混合物中，或者所述的样品被直接稀释 后再被直接添加到所述的反应混合物中，所述的样品不经过提前纯化获得靶核苷酸序列，所述的样品包括孢子、病毒，或者所述的样品来自于哺乳动物的血液、骨髓、粘液、淋巴液、硬组织、活检样品、唾液、泪液、粪便、或尿液；或者样品为废水、饮用水、牛奶，或者空气、植物、土壤。
2.如权利要求1所述的方法，所述的样品来自于哺乳动物的痰。
3.一种非以疾病诊断为目的的扩增核苷酸序列的方法，其包含:
具有靶核苷酸序列的靶核酸与反应混合物混合合并，其中，所述的反应混合物包括：(i)聚合酶，(ii)与所述靶核苷酸序列的第一链杂交的第一模板核酸，(iii)与所述靶核苷酸序列第一链的互补链杂交的第二模板核酸，和(iv)一种或多种切口酶；
在所述聚合酶可延长所述模板核酸的条件下使其发生扩增反应，由此生成经延长模板核酸扩增子；其中:
所述靶核苷酸序列的长度介于20与40个核苷酸之间；
所述第一模板所包含的核酸序列包含位于3'末端且与所述靶核苷酸序列第一链的3'末端互补的第一模板识别区域，切口酶结合位点和位于所述识别区域上游的切口位点，和位于切口位点上游的稳定区域，所述的稳定区域包括40-60％的GC；
所述第二模板所包含的核苷酸序列包含位于3'末端且与所述靶核苷酸序列第一链的互补链的3'末端互补的第二模板识别区域，切口酶结合位点和位于所述识别区域上游的切口位点，和位于切口位点上游的稳定区域，所述的稳定区域包括40-60％的GC；所述靶核苷酸序列所包含的核苷酸比所述第一模板识别区域与所述 第二模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个；
所述靶核苷酸序列在10分钟内扩增1E+6倍或以上；并且上述步骤是在等温的条件下实施；其中，不需要在扩增前进行靶核酸的变性步骤：
其中，所述被扩增的靶核苷酸序列来自样品，所述的样品是直接被添加到所述的反应混合物中，或者所述的样品被直接稀释后再被直接添加到所述的反应混合物中，所述的样品不经过提前纯化获得靶核苷酸序列，所述的样品包括孢子、病毒，或者所述的样品来自于哺乳动物的血液、骨髓、粘液、淋巴液、硬组织、活检样品、唾液、泪液、粪便、或尿液；或者样品为废水、饮用水、牛奶，或者空气、植物、土壤。
4.如权利要求3所述的方法，所述的样品来自于哺乳动物的痰。
5.一种非以疾病诊断为目的的扩增核苷酸序列的方法，其包含:
具有靶核苷酸序列的靶核酸与反应混合物混合合并，其中，所述的反应混合物包括：(i)聚合酶，(ii)与所述靶核苷酸序列的第一链杂交的第一模板核酸，所述第一模板所包含的核酸序列包含位于3'末端且与所述靶核苷酸序列第一链的3'末端互补的第一模板识别区域；切口酶结合位点和位于所述识别区域上游的切口位点，和位于切口位点上游的稳定区域，所述的稳定区域包括40-60％的GC；(iii)与所述靶核苷酸序列第一链的互补链杂交的第二模板核酸，所述第二模板所包含的核酸序列包含位于3'末端且与所述靶核苷酸序列第一链的3'末端互补的第二模板识别区域；切口酶结合位点和位于所述识别区域上游的切口位点，和位于切口位点上 游的稳定区域，所述的稳定区域包括40-60％的GC；和(iv)一种或多种切口酶；
在所述聚合酶可延长所述模板核酸的条件下使其发生扩增反应，由此生成经延长模板核酸扩增子；其中:
所述第一模板的识别区域长8至15个核苷酸；
所述第二模板的识别区域长8至15个核苷酸；
所述靶核苷酸序列在10分钟内扩增1E+6倍或以上；并且上述步骤是在等温的条件下实施；其中，不需要在扩增前进行靶核酸的变性步骤：
其中，所述被扩增的靶核苷酸序列来自样品，所述的样品是直接被添加到所述的反应混合物中，或者所述的样品被直接稀释后再被直接添加到所述的反应混合物中，所述的样品不经过提前纯化获得靶核苷酸序列，所述的样品包括孢子、病毒，或者所述的样品来自于哺乳动物的血液、骨髓、粘液、淋巴液、硬组织、活检样品、唾液、泪液、粪便、或尿液；或者样品为废水、饮用水、牛奶，或者空气、植物、土壤。
6.如权利要求5所述的方法，所述的样品来自于哺乳动物的痰。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述靶核苷酸序列所包含的核苷酸比所述第一模板别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多1至5个。
8.如权利要求3至7中任一权利要求所述的方法，其中所述第一模板和第二模板包含位于所述识别区域上游的切口酶结合位点和切口位点，并且所述一或多种切口酶能在所述正向和所述反向模板的 所述切口位点处切口，其中任一种切口酶都能对所述两个模板进行切口，或每个模板都能通过至少一种所述切口酶进行切口，并且
其中，所述一或多种切口酶不能在所述靶序列内切口。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述靶核苷酸序列所包含的核苷酸比所述第一模板识别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多1个。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述靶核苷酸序列所包含的核苷酸比所述第一模板识别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多2个。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述靶核苷酸序列所包含的核苷酸比所述第一模板识别区域与所述第二模板识别区域中的核苷酸总数多3个。
12.如权利要求1至11中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核酸是双链或单链核酸。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述靶核酸是双链DNA。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述靶核酸是单链DNA。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述靶核酸是RNA。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述靶核酸选自由以下组成的群组:基因组DNA、质粒DNA、病毒DNA、线粒体DNA和合成双链DNA。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述靶核酸选自由以下组成的群组:病毒DNA、cDNA和合成单链DNA。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述靶核酸选自由以下组成的群组:信使RNA、病毒RNA、核糖体RNA、转移RNA、微小RNA、微小RNA前体、和合成RNA。
19.如权利要求1至18中任一权利要求所述的方法，其中所述DNA聚合酶是耐热性聚合酶。
20.如权利要求1至18中任一权利要求所述的方法，其中所述聚合酶选自由以下组成的群组:Bst1、9°N、热启动酶。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述热启动酶为热启动酶II。
22.如权利要求1至20中任一权利要求所述的方法，其中所述聚合酶是Bst。
23.如权利要求9至14中任一权利要求所述的方法，其中所述第一和第二模板包含可通过相同切口酶识别的多个切口酶结合位点，并且所述第一与所述第二切口酶相同。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述切口酶选自由以下组成的群组:Nt.BspQI、Nb.BbvCi、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.CviP II、Nb.Bpu 10I、和Nt.Bpu 10I。
25.如权利要求1至24中任一权利要求所述的方法，其中所述第一链核酸序列中与所述靶核苷酸序列第一链互补的部分长8至15个核苷酸。
26.如权利要求1至25中任一权利要求所述的方法，其中所提供的所述第一模板的浓度与所述第二模板相同。
27.如权利要求1至25中任一权利要求所述的方法，其中所提供的所 述第一或第二模板中的一者与另一模板的比率在1:100至100:1的比率范围内。
28.如权利要求1至27中任一权利要求所述的方法，其另外包含第二聚合酶。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述第一或第二聚合酶中至少一者具有逆转录酶活性。
30.如权利要求1至18中任一权利要求所述的方法，其中所述扩增是在54℃与60℃之间实施。
31.如权利要求1至30中任一权利要求所述的方法，其中所述扩增是在56℃与58℃之间实施。
32.如权利要求1至31中任一权利要求所述的方法，其中将所述扩增反应物在恒温下保持1至10分钟。
33.如权利要求1至32中任一权利要求所述的方法，其中将所述扩增反应物在恒温下保持1至20分钟。
34.如权利要求1至23中任一权利要求所述的方法，其另外包含检测扩增产物。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述扩增产物是通过选自由以下组成的群组的检测方法来检测:凝胶电泳、质谱、SYBRI荧光法、SYBR II荧光法、SYBR金、Pico绿、ToTo-3、荧光共振能量转移(FRET)、分子信标检测、毛细管电泳、纳入经标记核苷酸以容许通过捕获来检测、荧光偏振、和侧向流动捕获。
36.如权利要求1至35中任一权利要求所述的方法，其中能扩增至少两个靶序列。
37.如权利要求1至36中任一权利要求所述的方法，其中在固体表面上检测所述扩增产物。
38.如权利要求1至37中任一权利要求所述的方法，其中将至少一种捕获探针固定在固体表面上。
39.如权利要求1至38中任一权利要求所述的方法，其中所述模板中的至少一者包含间隔子、阻断基团、或经修饰核苷酸。
40.如权利要求1至39中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核苷酸序列在5分钟内扩增1E+6倍或以上。
41.如权利要求1至39中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核苷酸序列在2.5分钟内扩增1E+6倍或以上。
42.如权利要求1至39中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核苷酸序列在5分钟内扩增1E+7倍或以上。
43.如权利要求1至39中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核苷酸序列在5分钟内扩增1E+8倍或以上。
44.如权利要求1至39中任一权利要求所述的方法，其中所述靶核苷酸序列在5分钟内扩增1E+9倍或以上。
45.如权利要求1至39中任一权利要求所述的方法，其中，当靶核苷酸为双链的时候，不需要在扩增前进行靶核酸的变性步骤。
46.如权利要求1-45中任一权利要求所述的方法，其中，模板与靶核酸的初始解链温度低于扩增反应的温度。
47.如权利要求1-46中任一权利要求所述的方法，其中所述第一和第二模板包含 可通过相同切口酶识别的切口酶结合位点，并且所述第一与所述第二切口酶相同。
48.如权利要求27-46中任一权利要求所述的方法，其中所提供的所述第一模板的浓度与所述第二模板相同。
49.如权利要求28-46中任一权利要求所述的方法，其中所提供的所述第一或第二模板中的一者与另一模板的比率在1:100至100:1的比率范围内。
50.如权利要求29-46中任一权利要求所述的方法，其另外包含第二聚合酶。
51.如权利要求46所述的方法，其中所述聚合酶中至少一者具有逆转录酶活性。
52.如权利要求32-46中任一权利要求所述的方法，其中所述扩增是在54℃与60℃之间实施。
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