DE69730145T2 - VERFAHREN ZUM AUFFINDEN, NACHWEISEN, ANREICHERN UND/ODER ISOLIEREN VON ZIEL-NUcLEINSÄURESEQUENZEN UNTER VERWENDUNG VON VON RECA ÄHNLICHER REKOMBINASE - Google Patents

VERFAHREN ZUM AUFFINDEN, NACHWEISEN, ANREICHERN UND/ODER ISOLIEREN VON ZIEL-NUcLEINSÄURESEQUENZEN UNTER VERWENDUNG VON VON RECA ÄHNLICHER REKOMBINASE Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Fachgebiet
  • Die Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren zum zielgerichteten Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und/oder Isolieren einer Nucleinsäurezielsequenz unter Verwendung einer RecA-ähnlichen Rekombinase und im Speziellen Verfahren zum zielgerichteten Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und/oder Isolieren einer doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz unter Verwendung einer RecA-ähnlichen Rekombinase in Gegenwart sowohl einer homologen Sonde als auch einer heterologen Sonde.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • Eine Vielfalt von Rekombinasen, die in vitro die homologe Paarung und/oder den Austausch von DNA-Strängen katalysieren, wurden von verschiedenen Prokaryonten und Eukaryonten isoliert. Unter diesen Rekombinasen wurde das Rec-A-Protein, eine Rekombinase, die von Escherichia coli abgeleitet ist, intensiv untersucht. (Shibata T, Cell Technology 9, Nr. 4, 281–291 (1990)). Es ist bekannt, dass das RecA-Protein in vitro die homologe Paarung von einzelsträngiger DNA mit doppelsträngiger DNA katalysiert und somit homolog die Paarung einer dreisträngigen DNA oder eines dreisträngigen DNA-Verbindungsmoleküls erzeugt. (Rigas B, et al., Proc Natl Acad Sci USA 83: 9591–9505 (1986); Hsieh P et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 6492–6496 (1992); Ferrin LJ et al., Science 254: 1494–1497 (1991), etc.). Es wurde ebenfalls berichtet, dass das RecA-Protein die Erzeugung einer viersträngigen DNA-Struktur katalysiert, die als eine doppelte D-Schleife bekannt ist. In dieser Reaktion werden zwei Typen einer komplementären einzelsträngigen DNA als homologe Sonden verwendet, um eine doppelsträngige DNA zielgerichtet anzusteuern, die eine homologe Stelle für die einzelsträngige DNA-Sonde enthält. (Sena EP, Nature Genetics 3: 365–372 (1993); Jayasena VK et al., J Mol Biol 230: 1015 (1993)). Zusätzlich zur DNA-DNA-Hybridisierung kann das RecA-Protein auch die RNA-DNA-Hybridisierung fördern. Zum Beispiel kann einzelsträngige DNA, die mit dem RecA-Protein beschichtet ist, nackte RNA komplementär erkennen. (Kirkpatrick und Radding, 1992, Kirkpatrick et al., 1992).
  • Unter Verwendung der Eigenschaften des RecA-Proteins wurden Verfahren zum Isolieren spezifischer doppelsträngiger Ziel-DNA entwickelt, die in einer Lösung in einer sehr geringen Menge vorhanden ist (mit einem molaren Verhältnis von 1 : 50 Molekülen zu 1 : mehreren Hundert Molekülen) (Rigas B et al., Proc Natl Acad Sci USA 83: 9591–9595 (1986); Teintze M et al., Biochem Biophys Res Commun 211: 804–811 (1995); U.S.-Patent Nr. 4,888,274). Verfahren der in-situ-Hybridisierung wurden ebenfalls für den Nachweis von doppelsträngiger Ziel-DNA in einer fixierten Zelle entwickelt (WO 93/05177). Diese Verfahren verwenden RecA, um eine homologe Paarung zwischen der Ziel-DNA und einer homologen Sonde zu vermitteln, die eine Sequenz enthält, die ausreichend komplementär zu der Ziel-DNA ist, um einen homologen Sonden/Ziel-DNA-Komplex zu erzeugen. Die Verwendung des RecA-Proteins und eines RecA-Proteins, das einen Marker oder einen Liganden aufweist, für ein Verfahren zur in-situ-Hybridisierung sind in EP 0 687 738 beschrieben.
  • Die homologe Paarung, die durch eine Rekombinase wie z. B. das RecA-Protein katalysiert wird, führt zu der Erzeugung von Netzwerken (Koaggregate), die RecA-Proteine, Gesamt-DNA (Ziel-DNA + heterologe DNA) und homologe Sonden in dem System enthalten (Tsang SS et al., Biochemistry 24: 3226–3232 (1985); Gonda DK et al., J Biol Chem 261: 13087–13096; Chow SA et al., Proc Natl Acad Sci USA 82: 5646–5650 (1985)). Die Effizienz der homologen Paarung, die zwischen der doppelsträngigen Ziel-DNA und der einzelsträngigen Nucleinsäure (homologe Sonde) erfolgt, die komplementär zur doppelsträngigen Ziel-DNA ist und an der das RecA-Protein gebunden ist, ist deutlich verringert, wenn eine heterologe DNA im Überschuss in der vorliegenden Probe vorhanden ist. Um diese Abnahme in der Reaktionseffizienz zu verhindern, muss die Menge an RecA-Protein sowie die der RecA-Protein beschichteten homologen Sonde im Verhältnis zur Menge an Gesamt-DNA in der Probe erhöht werden (Rigas B et al., Proc Natl Acad Sci USA 83: 9591–9595 (1986)).
  • Eine Zunahme der Menge der mit RecA-Protein beschichteten homologen Sonde im Verhältnis zur Gesamtmenge an DNA in einer vorliegenden Probe erhöht jedoch die Menge des aus RecA-Protein/homologe Sonde/Ziel-DNA/heterologe DNA bestehenden Komplexes, was die endgültige Menge der heterologen DNA entsprechend erhöht, welche die doppelsträngige Ziel-DNA kontaminiert, die aus der Probe gewonnen wird. Eine solche Kontamination verringert die Spezifität der Reaktion. Daher scheint ein Problem darin zu liegen, dass bei der Isolierung doppelsträngiger Ziel-DNA die Menge der kontaminierenden, heterologen DNA, die zusammen mit der doppelsträngigen Ziel-DNA gewonnen wird, abhängig von der Menge der homologen Sonde ist, die in der Reaktion verwendet wird. Dieses Problem wird besonders deutlich, wenn das Verhältnis von Ziel-DNA zu heterologer DNA weniger als 1 : 1000 beträgt.
  • Die heterologe DNA kann aus dem Komplex unter Verwendung der Unterschiede bezüglich der Natriumchlorid- oder Mg2+-Sensitivität zwischen den aus Sonde/Ziel-DNA und den aus Sonde/heterologe DNA bestehenden Komplexen entfernt werden (Honigberg SM et al., Proc Natl Acad Sci USA 83: 9586–9590 (1986); Rigas B et al., Proc Natl Acad Sci USA 83: 9591–9595 (1986); U.S.-Patent Nr. 4,888,274). Es wurde berichtet, dass, wenn eine lange, zirkuläre homologe Sonde von mehr als 5000 Nucleotiden oder eine langgestreckte, lineare homologe Sonde von mehr als 3000 Nucleotiden verwendet wird, es möglich erscheint, die doppelsträngige Ziel-DNA, die in einer vorliegenden Probe in einem Verhältnis von einem Molekül der Ziel-DNA zu etwa 200 bis 1000 Molekülen der heterologen DNA enthalten ist, mit einer gewissen Spezifität zu isolieren. Die heterologe DNA kann aus dem Komplex der homologen Sonde/Ziel-DNA unter Verwendung des Unterschiedes der beiden Komplexe bezüglich der Sensitivität gegenüber Natriumchlorid oder Mg2+ entfernt werden. Die Stabilität des aus homologer Sonde/heterologer DNA bestehenden Komplexes unterscheidet sich deutlich von der des aus homologer Sonde/Ziel-DNA bestehenden Komplexes.
  • Wenn eine zirkuläre homologe Sonde verwendet wird, die eine vergleichsweise kurze Sequenz enthält, z. B. eine 700-Nucleotid-Sequenz, die komplementär zu einem Teil der Ziel-DNA ist, dann ist die endgültige Ausbeute der doppelsträngigen Ziel-DNA jedoch deutlich herabgesetzt. Dies ist sogar auch der Fall, wenn die Konzentration der doppelsträngigen Ziel-DNA relativ hoch ist, wie z. B. ein Molekül pro 50 Moleküle in einer vorliegenden Probe. (Teintze M et al., Biochem Biophys Res Comm 211: 804–811 (1995). Daher ist es unklar, ob eine homologe Sonde zum Isolieren doppelsträngiger Ziel-DNA verwendet werden kann oder nicht, wenn die Menge der in der DNA-Probe vorliegenden, doppelsträngigen Ziel-DNA sehr klein ist (zum Beispiel mit einem molaren Verhältnis von weniger als 1 Molekül/1000 Moleküle).
  • Es ist daher sehr schwierig, die heterologe DNA aus dem Komplex von RecA-Protein/homologe Sonde/Ziel-DNA/heterologe DNA selektiv zu entfernen, in dem die Menge an heterologer DNA die der Ziel-DNA um mehr als 1000fach in einer vorliegenden Probe übersteigt. Besonders wenn die Länge der komplementären Sequenz, die sowohl der doppelsträngigen Ziel-DNA als auch der homologen Sonde gemeinsam ist, (die Länge der homologen Sonde) kurz ist, das heißt kürzer als eine 700-Nucleotid-Sequenz, wird die Verwendung solcher kurzen Sonden eine selektive Eliminierung der heterologen DNA erschweren. Dies liegt daran, dass die Bindung innerhalb des aus homologer Sonde/Ziel-DNA bestehenden Komplexes, die durch eine kurze RecA-gebundene homologe Sonde vermittelt wird, deutlich instabil ist im Vergleich zu der Bindung innerhalb des gleichen Komplexes, die durch eine lange homologe Sonde vermittelt wird, die aus einer Sequenz von mehr als 3000 komplementären Nucleotiden besteht, an die gesamte Region der doppelsträngigen Ziel-DNA. Das Waschen unter stringenten Bedingungen wird den aus homologer Sonde/Ziel-DNA bestehenden Komplex aufbrechen, wenn eine kurze Sonde verwendet wird.
  • Wenn ATPγS als ein Co-Faktor verwendet wird, ist es schwierig, selektiv nur die heterologe DNA aus dem Komplex zu entfernen, da die Bindung innerhalb des aus RecA-Protein/homologer Sonde/heterologer DNA/Ziel-DNA bestehenden Komplexes sehr stabil ist. In einer anderen Ausführungsform ist es möglich RecA-Proteine aus dem Komplex vor dem Verfahren zur Entfernung der heterologen DNA davon zu eliminieren. Die Stabilität des aus homologer Sonde/Ziel-DNA bestehenden Komplexes ohne RecA-Protein ist jedoch deutlich herabgesetzt im Vergleich zu der des aus RecA-Protein/homologer Sonde/Ziel-DNA bestehenden Komplexes. Diese Alternative wird daher nicht bevorzugt (Teintze M et al., Biochem Biophys Res Commun 211: 804–811 (1995)).
  • Durch die Tatsache, dass die Menge der kontaminierenden, heterologen DNA, die zusammen mit der doppelsträngigen Ziel-DNA gewonnen wird, von der Menge der homologen Sonde abhängig ist, die in der Reaktion verwendet wird, wie vorstehend beschrieben wurde, kann die Verringerung der Menge der homologen Sonde in der Reaktion die Effizienz der selektiven Eliminierung der heterologen DNA erleichtern. Die ausschließliche Verringerung der Menge der homologen Sonde wird jedoch auch die Effizienz der homologen Paarung zwischen einer homologen Sonde und einer Ziel-DNA herabsetzen.
  • Es wurde gezeigt, dass die Effizienz der Reaktion, die von der Länge der komplementären Sequenz abhängig ist, die sowohl der doppelsträngigen Ziel-DNA als auch der homologen Sonde gemeinsam ist (die Länge der homologen Sonde) sinkt, wenn die Länge der homologen Sonde abnimmt. (Hsieh P et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 6492 (1992); Sena EP, Nature Genetics 3: 365–372 (1993); Jayasena VK et al., J Mol Biol 230: 1015 (1993), etc.). Besonders deutlich wird die Effizienz der homologen Paarung herabgesetzt, wenn eine homologe Sonde mit einer Sequenz von weniger als mehreren Hundert Nucleotiden in der Reaktion verwendet wird. Dementsprechend ist es sehr schwierig eine doppelsträngige Ziel-DNA unter Verwendung einer kurzen homologen Sonde allein effizient nachzuweisen und/oder zu isolieren, besonders wenn die Menge der heterologen DNA, die einer vorliegenden Probe vorhanden ist, mehr als die 1000fache Menge der Ziel-DNA beträgt.
  • Es wurde berichtet, dass die Reaktionseffizienz herabgesetzt wird, wenn eine lange, zirkuläre homologe Sonde von mehr als 5000 Nucleotiden für die homologe Paarung zwischen der homologen Sonde und einer Ziel-DNA verwendet wird, die in einem Verhältnis von einem Molekül der Ziel-DNA zu 1000 Molekülen der heterologen DNA in einer Probe enthalten ist, und wenn die Menge der RecA beschichteten homologen Sonde verringert ist. Die Verringerung der Reaktionseffizienz der homologen Paarung wurde jedoch durch die Zugabe einer langen, zirkulären heterologen Sonde mit mehr als 6000 Nucleotiden zu der Paarungsreaktion mit einem Verhältnis von weniger als siebenfach (molares Verhältnis) der Menge der homologen Sonde unterdrückt (Honigberg SM et al., Proc Natl Acad Sci USA 83: 9586–9590 (1986).
  • Daher besteht ein Bedarf, die Effizienz und die Spezifität der Reaktion der herkömmlichen Verfahren zu verbessern, wobei eine Rekombinase wie z. B. das RecA-Protein für das zielgerichtete Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und/oder Isolieren einer sehr kleinen Menge an doppelsträngiger Ziel-DNA verwendet wird, die in einer vorliegenden DNA-Probe vorhanden ist (zum Beispiel in einem molaren Verhältnis von weniger als ein Molekül zu 1000 Molekülen) (Teintze M et al., Biochem Biophys Res Comm 211: 804–811 (1995)). Es besteht außerdem ein Bedarf für die Verwendung einer kurzsträngigen homologen Sonde für die verschiedenen Anwendungen, die vorstehend diskutiert wurden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zustellen, das eine RecA-ähnliche Rekombinase zum zielgerichteten Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und/oder Isolieren einer Nucleinsäurezielsequenz mit hoher Effizienz und Spezifität verwendet. Es ist ebenfalls eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das durch eine RecA-ähnliche Rekombinase vermittelt wird, wobei eine kurzsträngige Sonde zum zielgerichteten Ansteuern, Anreichern Nachweis und/oder Isolieren einer Nucleinsäurezielsequenz verwendet wird, die in einer geringen Menge in einer vorliegenden Probe vorhanden ist.
  • Diese und andere Aufgaben und Vorteile sind durch die Verwendung eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung erreicht worden, wobei eine RecA-ähnliche Rekombinase zum zielgerichteten Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und/oder Isolieren einer doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz in einer Probe verwendet wird. Das Verfahren umfasst die Schritte der Bereitstellung einer RecA-ähnlichen Rekombinase, einer homologen Nucleinsäuresonde, einer heterologen Nucleinsäuresonde sowie das Vermischen der RecA-ähnlichen Rekombinase, der homologen Nucleinsäuresonde, der heterologen Nucleinsäuresonde mit der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz in der Probe, wobei die Spezifität der homologen Paarung und/oder des Strangaustausches zwischen der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz und der homologen Nucleinsäuresonde durch die Zugabe der heterologen Nucleinsäuresonde erhöht wird.
  • Es stellte sich heraus, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung zahlreiche Vorteile zur Verfügung stellen. Wie nachstehend im größeren Detail erklärt wird, stellte sich heraus, dass die vorliegende Erfindung ein zielgerichtetes Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und/oder Isolieren einer Nucleinsäurezielsequenz, die in einer geringen Konzentration in einer vorliegenden Probe enthalten ist, mit hoher Effizienz und Spezifität ermöglicht. Die vorliegende Erfindung ermöglicht außerdem die Verwendung einer kurzen, homologen Sonde zum Nachweisen einer Zielsequenz, von der nur eine Teilsequenz bekannt ist.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind gut geeignet für die Verwendung bei der Isolation und der nachfolgenden Klonierung eines Zielgens aus einem Gemisch von cDNAs oder genomischen DNAs. Sie sind ebenfalls gut geeignet für die Verwendung beim Suchen des Zielgens in verschiedenen Genbanken, besonders zum Isolieren und Suchen des Zielgens, von dem die Nucleotidsequenz oder die Aminosäuresequenz nur teilweise bekannt ist.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können ebenfalls bei der Amplifikation der DNA-Zielsequenz verwendet werden, wobei eine RecA-ähnliche Rekombinase verwendet wird; bei der Kartierung verschiedener Gene wie z. B. bei der auf RARE basierenden Kartierung unter Verwendung einer Oligonucleotidsonde; bei der Nucleotidsequenz spezifischen Modifizierung oder Spaltung der Ziel-DNA unter Verwendung eines Oligonucleotids.
  • Des weiteren können die Verfahren der vorliegenden Erfindung bei Verfahren der in-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer RecA-ähnlichen Rekombinase verwendet werden, um die Spezifität oder die Effizienz der Hybridisierung zu erhöhen. Sie können ebenfalls als Gentherapie-Technik mittels Genalternierung oder Inhibition der Transkription unter Verwendung des Gentargetings in vivo in lebenden Zellen verwendet werden.
  • Bei dieser Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung erfolgt die homologe Paarung und/oder der Strangaustausch zwischen einer homologen Sonde und einer Zielsequenz, die durch eine RecA-ähnliche Rekombinase vermittelt wird, in Anwesenheit einer mit einer RecA-ähnlichen Rekombinase beschichteten heterologen Sonde. In der vorliegenden Erfindung beträgt das Gewichtsverhältnis der Menge der homologen Sonde zur Menge der heterologen Sonde zwischen etwa 1 : 3 bis 1 : 500.
  • Die Erfindung ist in ihrem vollsten Umfang in den beigefügten Ansprüchen definiert und wird nachfolgend in ihren bevorzugten Ausführungsformen beschrieben.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Entdeckung, dass die Zugabe einer heterologen Sonde zu einem durch RecA-ähnliche Rekombinase vermittelten Reaktionssystem, die Spezifität der homologen Paarung und/oder des Strangaustausches zwischen einer Ziel-DNA und einer homologen Sonde erhöht, die komplementär zur Ziel-DNA ist, besonders wenn eine kurze, homologe Sonde verwendet wird.
  • Zusätzlich ist es eine überraschende Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass die Verringerung der Menge der homologen Sonde und stattdessen die Zugabe einer heterologen Sonde zum durch RecA-ähnliche Rekombinase vermittelten Reaktionssystem eine höhere Spezifität zur Verfügung stellt als die, die erzielt wird, wenn ausschließlich die homologe Sonde verwendet wird. Dies trifft sogar zu, wenn eine kurze, lineare homologe Sonde von weniger als mehreren Hundert Nucleotiden in der Länge in Gegenwart von mindestens einem 1000fachen Überschuss der heterologen DNA gegenüber der Ziel-DNA in einer vorliegenden Probe verwendet wird.
  • Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum zielgerichteten Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und/oder Isolieren einer doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz in einer Probe durch die Verwendung einer RecA-ähnlichen Rekombinase zur Verfügung. Das Verfahren umfasst die Schritte des Bereitstellens einer RecA-ähnlichen Rekombinase, einer homologen Nucleinsäuresonde, einer heterologen Nucleinsäuresonde; und das Mischen der RecA-ähnlichen Rekombinase, der homologen Nucleinsäuresonde, der heterologen Nucleinsäuresonde mit der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz in der Probe, wobei die Spezifität der homologen Paarung und/oder des Strangaustausches zwischen der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz und der homologen Nucleinsäuresonde durch die Zugabe der heterologen Nucleinsäuresonde erhöht wird.
  • Für den Zweck der vorliegenden Erfindung wird die „Effizienz" basierend auf der Menge der Nucleinsäurezielsequenz bestimmt, die zielgerichtet angesteuert, angereichert, nachgewiesen oder isoliert wird. Die „Spezifität" wird basierend auf dem Verhältnis der Menge der Nucleinsäurezielsequenz bestimmt, die zielgerichtet angesteuert, angereichert, nachgewiesen oder isoliert wird, und der Gesamtmenge der Nucleinsäurezielsequenz plus der heterologen Nucleinsäuresequenz, die zielgerichtet angesteuert, angereichert, nachgewiesen oder isoliert wird.
  • RecA-ähnliche Rekombinasen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, schließen Rekombinasen ein, die eine katalytische Aktivität haben, die der des von Escherichia coli abgeleiteten RecA-Proteins ähnlich ist. Das RecA-Protein kann sowohl die homologe Paarung und/oder den Strangaustausch zwischen geeigneten DNA-Molekülen bei in-vitro-Untersuchungen der homologen Rekombination vermitteln (Kowalczykowski S, Ann Rev Biophys Biohysical Chem 20: 539–575 (1991); Radding CM, Biochem Biophys Acta 1008: 131–139 (1989); Radding CM, J Biol Chem 266: 5355–5358 (1991), vgl. ebenfalls Golub E et al., Nucleic Acids Res 20: 3121–3125 (1992)). Zusätzlich zur DNA-DNA-Hybridisierung kann das RecA-Protein die RNA-DNA-Hybridiserung fördern. Zum Beispiel kann mit RecA-Protein beschichtete einzelsträngige DNA komplementäre, nackte RNA erkennen (Kirkpatrick S et al., Nucleic Acid Res 20: 4339–4346 (1992). Daher kann jede Rekombinase in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die sowohl die homologe Paarung und/oder den Strangaustausch zwischen geeigneten DNA-Molekülen oder zwischen DNA- und RNA-Molekülen fördern kann.
  • RecA-ähnliche Rekombinasen wurden aus vielen Prokaryonten und Eukaryonten isoliert und gereinigt. Die Beispiele von solchen Rekombinasen schließen das Wildtyp-RecA-Protein, das von Escherichia coli abgeleitet wurde (Shibata T et al., Method in Enzymology 100: 197 (1983), und mutierte Typen des RecA-Proteins (z. B. RecA 803 (Madiraju M et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 6592 (1988); RecA 441 (Kawashima H et al., Mol Gen Genet 193: 288 (1984), etc.); das uvsX-Protein, ein von T4-Phagen abgeleitetes Analog des Proteins (Yonesaki T et al., Eur J Biochem 148: 127 (1985)); das von Bacillus subtilis abgeleitete RecA-Protein (Lovett CM et al., J Biol Chem 260: 3305 (1985)); das von Ustilago abgeleitete RecI-Protein (Kmiec EB et al., Cell 29: 367 (1982)); das von hitzeresistenten Bakterien (wie z. B. Thermus aquaticus oder Thermus thermophilus) abgeleitete RecA-ähnliche Protein (Angov E et al., J Bacteriol 176: 1405 (1994); Kato R et al., J Biochem 114: 926 (1993)); und das von Hefe, Maus und Mensch abgeleitete RecA-ähnliche Protein (Shinohara A et al., Nature Genetics 4: 239 (1993)) ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann RecA-Protein verwendet werden, das aus einer Kultur von Escherichia coli isoliert und gereinigt wurde (z. B. Kuramitsu S et al., J Biochem 90: 103 (1981); Shibata T et al., Methods in Enzymology 100: 197 (1983)). Im Handel erhältliches RecA-Protein kann ebenfalls verwendet werden (Boehringer-Mannheim, Pharmacia).
  • Der Ausdruck „Nucleinsäure", wie er hierin verwendet wird, umfasst sowohl RNA als auch DNA und cDNA. In der vorliegenden Erfindung gibt es keine spezifische Beschränkung an eine doppelsträngige Nucleinsäurezielsequenz bezüglich ihrer Länge, ihres Typs oder ihrer Form. Die doppelsträngige Nucleinsäurezielsequenz kann zum Beispiel in einer zirkulären Form oder einer linearen Form vorliegen.
  • Vorzugsweise ist die doppelsträngige Nucleinsäurezielsequenz eine doppelsträngige Ziel-DNA. Die doppelsträngige Ziel-DNA kann genomische DNA, cDNA, die von Prokaryonten und Eukaryonten abgeleitet ist, DNA, die von Viren oder Bakteriophagen abgeleitet ist, Fragmente einer solchen genomischen DNA oder cDNA und verschiedene Arten einer solchen DNA, die in verschiedenen Arten von DNA-Genbanken enthalten ist, sein, ist aber nicht auf diese beschränkt.
  • Eine doppelsträngige Nucleinsäurezielsequenz der vorliegenden Erfindung kann eine Nucleinsäuresequenz sein, die in einer Lösung; in fixierten Zellen, in zellulären Strukturen und interzellulären Strukturen; oder in lebenden Zellen oder zellulären Strukturen, die nicht fixiert sind, enthalten ist. Beispiele von Zellen, zellulären Strukturen und interzellulären Strukturen schließen Bakterien, Viren, zelluläre Organellen wie z. B. Nucleus, Mitochondrien oder Chromosomen und Parasiten wie z. B. Viren oder Bakterien ein, die in biologischen Proben wie z. B. Blut vorkommen, sind aber nicht auf diese beschränkt. Zellen oder zelluläre Strukturen können mittels konventioneller Verfahren unter Verwendung organischer Lösungsmittel (z. B. Methanol, Ethanol, etc.), Säuren (z. B. Essigsäure) oder kreuzvernetzenden Wirkstoffen (z. B. Formalin, Paraformaldehyd) fixiert werden. Diese Verfahren der Fixierung sind auf dem Fachgebiet angesichts der unmittelbaren Offenbarung gut bekannt.
  • Eine doppelsträngige Nucleinsäurezielsequenz der vorliegenden Erfindung kann, falls gewünscht, mittels konventioneller Verfahren markiert werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Die Zielsequenz kann durch Radioisotope (z. B. 32P 35S, etc.), fluoreszierende Pigmente (z. B. FITC, Rhodamin, etc.), Enzymmarker (z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase, etc.), chemilumineszierende Wirkstoffe (z. B. Acridiniumester, etc.) und verschiede Arten von Marker und Liganden wie z. B. Biotin oder Digoxigenin markiert werden, ist aber nicht auf diese beschränkt. Diese Verfahren zur Markierung sind dem Fachmann angesichts der unmittelbaren Offenbarung gut bekannt.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass, obwohl die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hauptsächlich auf das zielgerichtete Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und/oder Isolieren von doppelsträngiger Ziel-DNA gerichtet sind, sie auch für andere doppelsträngige Nucleinsäurezielsequenzen verwendet werden können. Beispiele solcher doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenzen schließen DNA/RNA-Sequenzen oder möglicherweise doppelsträngige RNA-Elemente, doppelsträngige oder einzelsträngige Nucleinsäuresequenzen ein, die mit viralen, bakteriellen oder parasitären Pathogenen assoziiert sind, sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • Der Ausdruck „einzelsträngige Nucleinsäuresonde", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine einzelsträngige Nucleinsäure. Der Ausdruck „Nucleinsäure" schließt sowohl RNA als auch DNA und cDNA ein. Vorzugsweise wird einzelsträngige DNA verwendet. Es gibt keine Beschränkung in Bezug auf die Form einer Sonde und daher kann entweder eine zirkuläre Form oder eine lineare Form verwendet werden.
  • Kommerziell erhältliche Produkte von einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nucleinsäuresequenzen können als Sonden für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Die Sonden können auch unter Verwendung der auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können Sonden direkt von Viren, Bakteriophagen, Plasmiden, Cosmiden oder anderen Vektoren, die eine Zielsequenz haben, z. B. mittels eines Nick-Translationsverfahrens und eines Zufallsprimerverfahrens oder dergleichen hergestellt werden. Falls es erwünscht ist, kann eine Sonde auch durch Restriktionsspaltung des Segments, das der Sonde entspricht, aus dem Vektor und der nachfolgenden elektrophoretischen Isolation des spezifischen Restriktionsfragments oder durch die Amplifikation der Sondensequenz unter Verwendung des PCR-Verfahrens hergestellt werden. Obwohl die so erhaltene Sonde normalerweise doppelsträngig ist, kann, falls erwünscht, eine einzelsträngige Sonde durch Denaturierung oder durch die Subclonierung der doppelsträngigen Sequenz in einen einzelsträngigen Vektor wie z. B. den M13-Phagen erhalten werden. In einer anderen Ausführungsform kann eine einzelsträngige Sonde durch Verfahren der Oligonucleotid-Synthese hergestellt werden. Eine lange Sonde kann durch die Verbindung von Subfragmenten der Sonde nach der Synthese dieser Subfragmente hergestellt werden.
  • Eine homologe Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Nucleinsäuresonde, die eine Region besitzt, die homolog zu der ausgewählten Basensequenz in einer doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz ist. Vorzugsweise ist die homologe Sonde eine einzelsträngige DNA-Sonde. Der Ausdruck „Homologie" der Sonde mit dem Ziel, wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass die einzelsträngige Sonde und das doppelsträngige Ziel eine Region besitzen, die eine ähnliche oder genau die gleiche Basenpaarsequenz besitzt, was der Sonde ermöglicht, die entsprechende Basenpaarregion des doppelsträngigen Ziels zu erkennen und damit zu hybridisieren. Das Ausmaß der Basenpaarfehlpaarungen, das möglich ist, ohne die Homologie zu verlieren, kann so hoch sein wie 20% bis 30% und ist abhängig von der Verteilung und der Länge der fehlgepaarten Basenpaare. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die homologe Sonde eine einzelsträngige Nucleinsäure, welche die Sequenz enthält, die mindestens eine mehr als 70%ige Homologie zum partiellen oder zum gesamten Nucleinsäureziel besitzt. Um eine sequenzspezifische homologe Paarung (Hybridisierungsreaktion) zwischen der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz und der homologen Sonde sicherzustellen, wird bevorzugt, dass die homologe Sonde im Allgemeinen eine Sequenz enthält, die mindestens eine 90–95%ige Homologie zu der partiellen oder zu der gesamten Sequenz der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz besitzt.
  • Eine homologe Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch die Denaturierung einer doppelsträngigen Nucleinsäuresonde hergestellt werden, die entweder komplementär zu einem oder zu beiden Strängen einer Zielsequenz ist. Die homologe Sonde kann ebenfalls einen erweiterten, endständigen Anteil enthalten, der nicht komplementär zu einem der Nucleinsäurestränge in der Probe ist. Wenn beide Stränge einer doppelsträngigen, homologen Sonde solche erweiterten Sequenzen an ihren Enden haben, können diese erweiterten Sequenzen komplementär zueinander sein.
  • Eine homologe Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt eine Länge von mindestens 15 Nucleinsäureresten und besitzt eine Länge von vorzugsweise 15–2000 Nucleinsäureresten. Eine längere Polynucleotidsonde (mehr als 2000 Nucleinsäurereste in der Länge) kann ebenfalls verwendet werden (Hsieh P et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 6492 (1992)). Vorzugsweise beträgt die Länge für die notwendige Homologie zwischen einer Sonde und einem Ziel mindestens etwa 15 Basenpaare.
  • Falls es erwünscht ist, kann eine homologe Sonde für den Nachweis und/oder die Isolation markiert werden, wobei konventionelle Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Beispiele für die Marker, die verwendet werden können, um eine homologe Sonde zu markieren, schließen radioaktive Isotope (z. B. 32P 35S, etc.), fluoreszierende Pigmente (z. B. FITC, Rhodamin, etc.), Enzymmarker (z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase, etc.), chemilumineszierende Mittel (z. B. Acridiniumester, etc.) und verschiede Arten von Markern und Liganden wie z. B. Biotin oder Digoxigenin ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • In der vorliegenden Erfindung wird mindestens eine Art der homologen Sonden in Kombination mit mindestens einer Art von RecA-ähnlicher Rekombinase verwendet. Zum Beispiel kann eine homologe Sonde mit einer RecA-ähnlichen Rekombinase beschichtet sein, um einen Komplex aus homologer Sonde/RecA-ähnlicher Rekombinase zu erzeugen, wobei ein Verfahren verwendet wird, das auf dem Fachgebiet gut bekannt ist. Die Menge der homologen Sonde, die in einer Probe verwendet werden soll, beträgt normalerweise 0,1–200 ng, vorzugsweise 0,5–150 ng, wenn die Probe etwa 1 μg DNA (Ziel-DNA und heterologe DNA) enthält.
  • Die heterologe Sonde, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist eine Nucleinsäuresonde, die nicht ausreichend komplementär zur Zielsequenz ist. Eine heterologe Sonde ist nicht ausreichend komplementär zu einer Zielsequenz, wenn sie weder mit der Zielsequenz hybridisieren kann noch einen stabilen Komplex aus heterologer Sonde/Zielsequenz erzeugen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Sequenz der heterologen Sonde eine geringe Komplementarität zu einer anderen Sequenz als die Zielsequenz in einem Zielmolekül zeigen, das die Zielsequenz und die Vektorsequenz umfasst. Zum Beispiel kann sie eine geringe Komplementarität zu einer Vektorsequenz zeigen, in der die Zielsequenz integriert ist oder die zur Konstruktion der Genbank verwendet wurde. Es wird jedoch bevorzugt, dass eine solche Komplementarität ausreichend gering ist, so dass ein Komplex aus heterologer Sonde/Zielmolekül oder ein Komplex aus heterologer Sonde/Vektorsequenz nicht erzeugt wird.
  • Die heterologe Sonde kann sowohl eine DNA-Sonde als auch eine RNA-Sonde sein. Vorzugsweise ist die heterologe Sonde eine einzelsträngige DNA. Die Form einer Sonde ist nicht eingeschränkt und daher kann entweder eine zirkuläre Form oder eine lineare Form verwendet werden. Die Sonde kann durch Denaturierung der doppelsträngigen, heterologen Sonde hergestellt werden.
  • Wenn zum Beispiel die DNA-Probe von einem Menschen abgeleitet ist, kann die in diesem System verwendete, heterologe Sonde eine einzelsträngige Nucleinsäuresonde, die von einem Virus oder einem Bakteriophagen abgeleitet ist, vorzugsweise eine einzelsträngige Phagen-DNA wie z. B. M13 oder ⌀ X174, oder eine einzelsträngige DNA, die von dem Fragment einer Lambda-Phagen-DNA hergestellt wurde; eine einzelsträngige Nucleinsäuresonde, die von einem Mikroorganismus abgeleitet wurde, wie z. B. RNA, die von Escherichia coli oder Hefe abgeleitet wurde; eine einzelsträngige Nucleinsäuresonde, die von Eukaryonten mit Ausnahme des Menschen abgeleitet wurde, wie z. B. einzelsträngige DNA, die von DNA-Fragmenten von Lachssperma hergestellt wurde, sein, ist aber nicht auf diese beschränkt.
  • Vorzugsweise enthält die in der vorliegenden Erfindung verwendete heterologe Sonde keine Marker oder Liganden.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendete heterologe Sonde besitzt eine Länge von mindestens 15 Nucleinsäureresten. Vorzugsweise besitzt sie eine Länge von etwa 15–20000 Nucleinsäureresten und stärker bevorzugt besitzt sie eine Länge von 60–10000 Nucleinsäuren. Eine längere Polynucleotidsonde wie z. B. eine Sonde mit einer Länge von mehr als 20000 Nucleinsäureresten kann ebenfalls verwendet werden.
  • In der vorliegenden Erfindung wird mindestens eine Art der heterologen Sonden in Kombination mit mindestens einer Art Rekombinase verwendet. Zum Beispiel kann eine heterologe Sonde der vorliegenden Erfindung mit RecA-ähnlicher Rekombinase, um einen Komplex aus heterologer Sonde/RecA-ähnlicher Rekombinase zu erzeugen, unter Reaktionsbedingungen beschichtet werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Die Menge der heterologen Sonde, die in einer Probe verwendet werden soll, beträgt normalerweise 0,1–500 ng, vorzugsweise 20–250 ng, wenn die Probe etwa 1 μg der DNA (Ziel-DNA und heterologe DNA) enthält.
  • In der vorliegenden Erfindung können Co-Faktoren zu dem Reaktionssystem zusammen mit der verwendeten Rekombinase zugefügt werden. Wenn zum Beispiel ein RecA-Protein als eine Rekombinase verwendet wird, das von Escherichia coli abgeleitet wurde, kann das RecA-Protein an die homologe Sonde und die heterologe Sonde gemäß konventioneller Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, in der Gegenwart von Co-Faktoren gebunden werden. Beispiele für solche Co-Faktoren schließen rATP, einzeln oder in Gegenwart eines rATP-Regenerationssystems (zum Beispiel des von Boehringer-Mannheim GmbH hergestellte rATP-Regenerationssystems), ATPγS, GTPγS, dATP, ein Gemisch von ATPγS und ADP, ein Gemisch von ADP und AIF4 – (Aluminiumnitrat und Natriumfluorid), ein Gemisch von dADP und AIF4 –, ein Gemisch von ATP und AIF4 – und ein Gemisch von dATP und AIF4 – ein, sind aber nicht auf diese beschränkt (Rigas B et al., Proc Natl Acad Sci USA 83: 9591–9595 (1986); Hsieh P et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 6492–6496 (1992); Ferrin LJ et al., Science 254: 1494–1497 (1991); Sena EP, Nature Genetics 3: 365–372 (1993); Teintze M et al. Biochem Biophys Res Commun 211: 804–811 (1995); Jayasena VK et al., J Mol Biol 230: 1015 (1993); Kowalczykowski SC et al. Proc Natl Acad Sci USA 92: 3478–3482 (1995); Moreus PL et al., J Biol Chem 264: 2302–2306 (1989); US Patent Nr. 4,888,274, WO93/05177, WO93/05178, WO95/18236, WO93/22443, etc.).
  • Vorzugsweise handelt es sich bei Co-Faktoren um ATP (vorzugsweise 1–5 mM) GTPγS (vorzugsweise 0,05–5 mM), ATPγS (vorzugsweise 0,01–3 mM), ein Gemisch von ATPγS und ADP (0,3–3 ATPγS + 0,3–1,1 mM ADP) oder ein Gemisch von ADP und AIF4 – [0,02–5 mM ADP + 0,01–0,5 mM Al(NO3)3 + 5–50 mM NaF].
  • Die homologe Sonde und die heterologe Sonde können gemäß der vorliegenden Erfindung entweder als einzelsträngige oder als doppelsträngige Form verwendet werden. Im Allgemeinen wird die Sonde einer Denaturierung mittels Erhitzen für etwa 5 Minuten bei 95–100°C vor der Reaktion unterzogen und nach dem Abkühlen der Sonde auf Eis für etwa 20 Sekunden bis 1 Minute wird die Sonde für die Bindungsreaktion mit der RecA-ähnlichen Rekombinase verwendet. Falls es erwünscht ist, wird die Sonde für etwa 1–10 Sekunden bei 0–4°C vor der Bindungsreaktion mit der Rekombinase zentrifugiert. Obwohl die denaturierte, einzelsträngige Sonde in einem Gefrierschrank bei –20°C aufgehoben werden kann, wird sie vorzugsweise sofort in einem Eiswasserbad mit der Standardreaktionslösung gemischt, die einen Co-Faktor und eine RecA-ähnliche Rekombinase enthält. Die einzelsträngige Sonde wird an die RecA-ähnliche Rekombinase durch Inkubation der gemischten Lösung bei 37°C für 0–20 Minuten gebunden (eine Vorinkubation ist nicht immer notwendig, wenn ATP, GTPγS, ATPγS oder ein Gemisch von ATPγS und ADP als Co-Faktor verwendet wird). In dieser Reaktion bindet die RecA-ähnliche Rekombinase im Allgemeinen an eine einzelsträngige Sonde in einem Verhältnis von einem Molekül zu etwa 3 Nucleotiden einer einzelsträngigen Sonde. Die Bindungsreaktion kann mit einem Mischungsverhältnis der Menge des RecA-Proteins (Monomer) zu Nucleotiden der Sonde durchgeführt werden, dass von 5 : 1 bis zu 1 : 8 variiert, vorzugsweise von 3 : 1 bis 1 : 6. Falls es erwünscht ist, wird die Reaktion in Gegenwart des Einzelstrang-DNA bindenden Proteins (SSB) Topoisomerase I oder Topoisomerase II durchgeführt.
  • Die homologe Sonde der vorliegenden Erfindung kann als eine markierte, homologe Sonde verwendet werden, wenn sie an eine RecA-ähnliche Rekombinase gebunden ist, die verschiedene Marker oder Liganden besitzt, wie im Dokument WO95/18236 beschrieben ist.
  • Andererseits wird die Verwendung der heterologen Sonde mit einer RecA-ähnlichen Rekombinase nicht bevorzugt, die verschiedene Marker oder Liganden besitzt.
  • Der Komplex aus homologer Sonde/RecA-ähnlicher Rekombinase und der Komplex aus heterologer Sonde/RecA-ähnlicher Rekombinase werden zu der DNA-Probe unter Bedingungen zugegeben, welche die Denaturierung doppelsträngiger Ziel-DNA vermeiden, zum Beispiel mit einer Temperatur, die niedriger ist als die zum Schmelzen doppelsträngiger DNA. Das Gemisch wird bei 37°C im Allgemeinen für 10 Minuten–24 Stunden inkubiert, vorzugsweise 15 Minuten–2 Stunden, um die homologe Paarung (Hybridisierung) durchzuführen.
  • Das Verhältnis der Menge der homologen Sonde zur heterologen Sonde, das in die Reaktion zugegeben wird, beträgt 1 : 3–1 : 500, vorzugsweise 1 : 3–1 : 250. Es ist eine überraschende Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass die Verwendung der heterologen Sonde zusammen mit der homologen Sonde in einem Verhältnis, wie vorstehend beschrieben wurde, die Spezifität zum zielgerichteten Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und Isolieren einer Nucleinsäurezielsequenz erhöht. Wie in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Beispiel angewendet, um doppelsträngige Ziel-DNA von einer Probe zu isolieren, die etwa 1 μg Gesamt-DNA enthält, die in einem molaren Verhältnis von Ziel-DNA zu Nichtziel-DNA von 1 : 10000 vorliegt. Wenn ausschließlich 200 ng einer RecA-Protein beschichteten, homologen Sonde mit einer Länge von 60–275 Nucleotiden verwendet wird, ist die Spezifität der Reaktion extrem niedrig. Eine große Menge anderer heterologer DNA als die Ziel-DNA wird als Kontamination der doppelsträngigen Ziel-DNA gewonnen, obwohl eine bestimmte Menge der doppelsträngigen Ziel-DNA ebenfalls gewonnen wird. Wenn die Menge der RecA-Protein beschichteten, homologen Sonde auf 50 ng reduziert und ausschließlich verwendet wird, sinkt die Effizienz der Reaktion im Vergleich mit der Effizienz der Reaktion, in der ausschließlich 200 ng der homologen Sonde verwendet wird, und dementsprechend sinkt die Ausbeute der doppelsträngigen Ziel-DNA. Wenn jedoch 50 ng der RecA-Protein beschichteten homologen Sonde mit der Proben-DNA in der Gegenwart von 150 ng der RecA-Protein beschichteten heterologen Sonde umgesetzt wird, steigt nicht nur die Reaktionseffizienz und es wird eine größere Menge der doppelsträngigen Ziel-DNA gewonnen im Vergleich zu der Reaktion, in der 200 ng der homologen Sonde alleine verwendet wird, sondern auch die Spezifität der Reaktion steigt deutlich wegen der starken Hemmung der Gewinnung der heterologen DNA. Wenn die Menge der homologen Sonde noch weiter gesenkt wird (25 ng oder 10 ng) und daher das Verhältnis der homologen Sonde zur heterologen Sonde weiter gesenkt wird (homologe Sonde : heterologe Sonde = 10 : 190 oder homologe Sonde : heterologe Sonde = 25 : 175), wird die Spezifität der Reaktion weiter deutlich verbessert.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass das Verhältnis der Menge an homologer Sonde zu der heterologen Sonde, also das Verhältnis der RecA-ähnlichen Rekombinase, die an den Sonden gebunden ist, verändert werden kann, in dem die Eigenschaften der Probe und dergleichen berücksichtigt werden. Im Hinblick auf die Lehren dieser Enthüllung kann ein Fachmann das Verhältnis mit Bezug auf Veränderungen in der Eigenschaft der Probe ohne übermäßige Experimente ändern.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Reaktionslösung für die homologe Paarung (Hybridisierung) so hergestellt werden, dass die Endkonzentration jeder Komponente innerhalb des folgenden Bereichs liegt: 1–100 mM Tris-HCl-Puffer oder Tris-Acetat-Puffer, 1–30 mM Magnesiumacetat oder Magnesiumchlorid, 0–50 mM Natriumacetat oder Natriumchlorid, 0–3 mM Dithiothreit, 0–100 mM EGTA, 0–50 mM Spermidin, 0–10% Glycerin, 1–5 mM ATP oder 0,05–5 mM GTPγS oder 0,01–3 mM ATPγS oder 0,3–3 mM ATPγS + 0,3–1,1 mM ADP, 0,002–0,025 mM RecA-Protein, 0,5–150 ng der homologen Sonde und 20–200 ng der heterologen Sonde pro Reaktion und etwa 1 μg der DNA-Probe (Ziel-DNA + heterologe DNA).
  • Die Verfahren der vorliegenden Verbindung können zum Nachweis oder zur Isolation eines Komplexes, der zwischen der doppelsträngigen Ziel-DNA und der RecA-Protein beschichteten, homologen Sonde erzeugt wurde, in Verbindung mit Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (U.S.-Patent Nr. 4,888,274, WO093/05177, WO093/5178, WO095/18236, Teintze M et al., Biochem Biophys Res Commun 211: 804–811 (1995)), wobei entweder die doppelsträngige Ziel-DNA oder das RecA-Protein oder die homologe Sonde mit Markern oder Liganden markiert sein können. Zum Beispiel kann der Komplex ein Komplex sein aus homologer Sonde, die verschiedene Marker oder Liganden trägt, RecA-Protein und doppelsträngiger Ziel-DNA oder ein Komplex aus homologer Sonde und RecA-Protein, das verschiedene Marker oder Liganden trägt, und doppelsträngiger Ziel-DNA, oder ein Komplex aus homologer Sonde, RecA-Protein und doppelsträngiger Ziel-DNA, die verschiedene Marker oder Liganden trägt. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden diese Komplexe durch homologe Paarung (Hybridisierungsreaktion) erzeugt, wobei eine RecA-ähnliche Rekombinase in Gegenwart sowohl einer homologen Sonde als auch einer heterologen Sonde verwendet wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Verfahren zum Isolieren doppelsträngiger Ziel-DNA die Schritte: die Markierung der homologen Sonde mit Biotin; das Beschichten der homologen Sonde und einer unmarkierten, heterologen Sonde mit RecA-Protein in Gegenwart eines geeigneten Co-Faktors (zum Beispiel GTPγS oder ein Gemisch aus ATPγS und ADP); die Reaktion der RecA beschichteten homologen und heterologen Sonden mit einer DNA-Probe, die doppelsträngige Ziel-DNA enthält, um einen Komplex aus homologer Sonde/Ziel-DNA zu erzeugen; und das Einfangen des Komplexes an magnetische Kügelchen (BioMag, Dynal), die mit Streptavidin konjugiert sind. Nachdem die DNA und die Sonden herausgewaschen wurden, die nicht an den Kügelchen gebunden sind, wird der Komplex aus Biotin markierter, homologer Sonde/doppelsträngiger Ziel-DNA, der an den Kügelchen gebunden ist, in einer NaCl enthaltenen Lösung für etwa 5–15 Minuten bei einer Temperatur inkubiert, die zwischen Raumtemperatur und 85°C liegt, um die Fraktion der doppelsträngigen Ziel-DNA von den Kügelchen zu trennen (eluieren). Vorzugsweise wird die gewonnene Fraktion der Ziel-DNA anschließend verwendet, um geeignete Wirtszellen zu transformieren, gefolgt von der Selektion der transformierten Zellen, welche die Ziel-DNA enthalten, und die Gewinnung der Ziel-DNA von den transformierten Zellen.
  • Um die vorstehend beschriebenen Verfahren durchzuführen, stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls einen Kit zum zielgerichteten Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und/oder Isolieren einer doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz in einer Probe zur Verfügung. Ein Kit kann ein Trägermittel umfassen, das in Kompartimente eingeteilt ist, um ein oder mehrere Behältervorrichtungen wie z. B. Glasfläschchen, Röhrchen und dergleichen in enger Begrenzung aufzunehmen, wobei jede Behältervorrichtung eine der separaten Elemente umfasst, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Zum Beispiel kann eine der Behältervorrichtungen RecA-ähnliche Rekombinase enthalten. Ein zweiter Behälter kann eine feste Phase enthalten, die entwickelt wurde, um den Komplex der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz und der homologen Sonde, die mit Markern oder Liganden markiert ist, einzufangen. Es werden ebenfalls Behälter zur Verfügung gestellt, welche die Co-Faktoren, die heterologe Sonde und die Waschlösung separat enthalten.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung die nachfolgenden Elemente in separaten Kompartimenten umfassen: RecA-ähnliche Rekombinase, geeignete Co-Faktoren, eine heterologe Sonde, eine feste Phase, die dazu entwickelt wurde, den Komplex der doppelsträngigen Ziel-DNA und der homologen Sonde, die mit Markern oder Liganden markiert ist, zu isolieren, und Waschlösung.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um Nucleinsäurezielmoleküle, die in einer vorliegenden Probe in sehr geringer Menge vorhanden sind, mit hoher Spezifität zielgerichtet anzusteuern, anzureichern, nachzuweisen und/oder zu isolieren. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das molare Verhältnis der Nucleinsäurezielmoleküle zu Nucleinsäurenichtzielmoleküle weniger als 1 : 1000 betragen. Vorzugsweise kann das Verhältnis mehr als 1 : 1,000,000 betragen und stärker bevorzugt kann es mehr als 1 : 500,000 betragen.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind für die Verwendung bei der Isolation und der nachfolgenden Clonierung des Zielgens aus einem Gemisch von cDNAs oder genomischen DNAs sowie bei dem Absuchen nach dem Zielgen in verschiedenen Genbanken gut geeignet. Beispiele solcher Genbanken schließen cDNA-Genbanken, Cosmid-Genbanken, YAC-Genbanken und dergleichen ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Da eine kurzsträngige Sonde in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wird die Isolation des Zielgens oder das Absuchen nach einem Zielgen möglich, dessen Nucleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz nur teilweise bekannt ist.
  • Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls in Verbindung mit Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, für die nachfolgenden Ziele verwendet werden: die Amplifikation der DNA-Zielsequenz unter Verwendung einer RecA-ähnlichen Rekombinase (US-Patent Nr. 5,223,414, WO91/17267), die Kartierung verschiedener Gene wie z. B. eine auf RARE (RecA unterstützte Spaltung mit Restriktionsendonucleasen; „RecA-Assisted Restriction Endonuclease cleavage") basierende Kartierung unter Verwendung einer Oligonucleotidsonde (Ferrin LJ et al., Nature Genetics 6: 379 (1994); Revet BM et al., J Mol Biol 232: 779 (1993)); Nucleotidsequenz spezifische Modifikationen (Methylierung oder Alkylierung) oder die Spaltung der Ziel-DNA unter Verwendung von Oligonucleotiden (Koob M et al., Nucleic Acids Res 20: 5831 (1992); Golub EI et al., Nucleic Acids Res 20: 3121 (1992); Mikhail A et al., Biochemistry 34: 13098 (1995)). Anwendungen der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit den vorstehenden, bekannten Verfahren sind im Hinblick auf diese Offenbarung auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • Des weiteren kann die vorliegende Erfindung für die Isolation und/oder zum Nachweis der spezifischen Ziel-DNA des Interesses von klinischen Proben verwendet werden, die ein Gemisch von cDNA oder genomischer DNA enthalten. Daher erlaubt die vorliegende Erfindung die Diagnose von verschiedenen genetischen Veränderungen oder Mutationen oder infektiösen Erkrankungen, die von verschiedenen pathogenen Mikroorganismen oder Viren verursacht werden.
  • Weiterhin kann die vorliegende Erfindung auch in Verbindung mit einem in-situ-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, das durch eine RecA-ähnliche Rekombinase vermittelt wird (WO93/05177, WO095/18236), um die Spezifität oder die Effizienz der Hybridisierung zu erhöhen. Sie kann ebenfalls als eine Gentherapietechnik und als ein transgenes Verfahren angewendet werden, um transgene Tiere oder Pflanzen mittels Genveränderung oder Hemmung der Transkription herzustellen, wobei in vivo ein Gentargetingverfahren in den lebenden Zellen verwendet wird (US-Patent Nr. 5,468,629, WO093/2244: Golub EI et al., Nucleic Acids Res 20: 3121 (1992); Golub EI et al., Proc Natl Acad Sci USA 90: 7186 (1993), etc.). Anwendungen der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit den vorstehend beschriebenen Verfahren sind dem Fachmann im Hinblick auf die vorliegende Offenbarung gut bekannt.
  • Wenn zum Beispiel die vorliegende Erfindung in vivo für Gentargeting in lebenden Zellen verwendet wird, werden sowohl die mit RecA-ähnlicher Rekombinase beschichtete homologe Sonde als auch die heterologe Sonde bei der durch die Rekombinase vermittelten Erzeugung des Komplexes aus homologer Sonde und doppelsträngiger Ziel-DNA verwendet. Dementsprechend kann ein Verfahren zum zielgerichteten Ansteuern einer doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz in einer Probe lebender Zellen durch ein in-vivo-Gentargetingverfahren unter Verwendung einer RecA-ähnlichen Rekombinase die nachfolgenden Schritte umfassen: (a) das Bereitstellen einer Rekombinase beschichteten homologen Sonde und einer Rekombinase beschichteten heterologen Sonde; (b) das Einbringen der homologen Sonde und der heterologen Sonde in lebende Zellen; und (c) die Inkubation der lebenden Zellen für einen ausreichenden Zeitraum, um der homologen Sonde zu ermöglichen, in das Genom der Zellen transformiert zu werden.
  • Das konventionelle Verfahren zum in-vivo-Gentargeting in lebenden Zellen, das in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist im U.S.-Patent Nr. 5,468,629 und in WO093/2244 beschrieben.
  • Die nachfolgenden Bespiele werden zur Verfügung gestellt, um die vorliegende Erfindung zu beschreiben. Sie beabsichtigen ausschließlich die Erläuterung der vorliegenden Erfindung und sollen den Bereich der vorliegenden Erfindung nicht einschränken.
  • BEISPIEL 1
  • Herstellung der Ziel-DNA der heterologen DNA, der homologen Sonde und der heterologen Sonde
  • 1. Herstellung der doppelsträngigen Ziel-DNA und der heterologen DNA
  • Php53B, ein 6,6 kb großes Plasmid, das eine vollständige cDNA-Sequenz enthält, die der Sequenz des menschlichen Tumor-Suppressor-Gens p53 entspricht (Zakut-Houri R et al., EMBO J 4: 1251 (1985), wurde als doppelsträngige Ziel-DNA in einer zirkulären Form verwendet und der Plasmidvektor pUC18 (2,7 kb) wurde als heterologe doppelsträngige DNA in zirkulärer Form verwendet. Diese Plasmide wurden aus Zellen von Escherichia coli, die jedes Plasmid enthielten, unter Verwendung des QIAGEN-Plasmid Maxi-Kits (hergestellt von QIAGEN GmbH) gereinigt.
  • 2. Herstellung der homologen Sonde
  • Die doppelsträngigen DNA-Fragmente von 275 bp (SEQ ID NO: 1) und 60 bp (SEQ ID NO: 2), welche die Teilsequenz der p53-cDNA enthielten, wurden unter Standardbedingungen für Amplifikation (PCR-Verfahren) hergestellt, wobei die Taq-Polymerase und die nachfolgenden Primer verwendet wurden: 5'-CCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA-3' (SEQ ID NO: 11, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 1 von Nucleotid 1–25), 5'-CGTGCAAGTCACAGACTTGGCTGTC-3' (SEQ ID NO: 12, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 1 von Nucleotid 251–275), 5'-AGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCT-3' (SEQ ID NO: 13, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 2 von Nucleotid 1–25), 5'-CGTGCAAGTCACAGACTTGGCTGTC-3' (SEQ ID NO: 12, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 2 von Nucleotid 36–60). Die vorstehenden Primer sind an ihren 5'-Enden biotinyliert. Die doppelsträngigen Fragmente wurden als homologe Sonden verwendet, nachdem sie in einzelsträngige DNA durch Erhitzen unmittelbar vor ihrer Verwendung denaturiert wurden. Die Nucleotidsequenzen, die diesen Regionen der p53-cDNA entsprechen, werden als SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigt.
  • Die doppelsträngigen DNA-Fragmente von 410 bp (SEQ ID NO: 9), 779 bp (SEQ ID NO: 10) und 1317 bp (SEQ ID NO: 8), welche die Teilsequenz von der p53-cDNA enthalten, werden ebenfalls unter Standardbedingungen für Amplifikation (PCR-Verfahren) hergestellt, wobei die Taq-Polymerase und die nachfolgenden Primer (hergestellt von GENOSYS) verwendet werden: 5'-CCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA-3' (SEQ ID NO: 11, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 8 von Nucleotid 236–260), 5'-CGTCATGTGCTGTGACTGCTTGTAG-3' (SEQ ID NO: 14, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 8 von Nucleotid 621–645), 5'-CCTTGCCGTCCCAAGCAATTGGATGA-3' (SEQ ID NO: 11, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 8 von Nucleotid 236–260, 5'-CCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCC-3' (SEQ ID NO: 15, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 8 von Nucleotid 990–1,014), 5'-GTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCA-3' (SEQ ID NO: 16, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 8 von Nucleotid 1–25), 5'-TCAGTCTGAGTCAGGCCCTTCTGTC-3' (SEQ ID NO: 17, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 8 von Nucleotid 1,293–1,317). Die vorstehend genannten Primer wurden an ihrem 5'-Ende biotinyliert. Diese doppelsträngigen Fragmente wurden als homologe Sonde nach der Denaturierung in einzelsträngige DNA durch Erhitzen unmittelbar vor der Verwendung verwendet. Die Nucleotidsequenzen, die diesen Regionen der p53-cDNA entsprechen, sind als SEQ ID NO: 9, 10 bzw. 8 gezeigt.
  • 3. Herstellung der heterologen Sonde
  • Die doppelsträngigen DNA-Fragmente von 500 bp (SEQ ID NO: 3) und 1,393 bp (SEQ ID NO: 4), die eine Teilsequenz des Lambda-Phagen-Genoms enthalten, wurden unter Standardbedingungen für Amplifikation (PCR-Verfahren) unter Verwendung der Taq-Polymerase und den nachfolgenden Primern hergestellt: 5'-GATGAGTTCG TGTCCGTACAACTGG-3' (SEQ ID NO: 18, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 3 von Nucleotid 1–25), 5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3' (SEQ ID NO: 19, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 3 von Nucleotid 476–500), 5'-GCGGCACGGAGTGGAGCAAGCGTGA-3' (SEQ ID NO: 20, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 4 von Nucleotid 1–25), 5'-ATACGGCTGAGGTTTTCAACGGCCT-3' (SEQ ID NO: 21, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 4 von Nucleotid 1,369–1,393). Die doppelsträngigen Fragmente wurden als heterologe Sonden nach der Denaturierung in einzelsträngige DNA durch Erhitzen unmittelbar vor ihrer Verwendung verwendet. Die Nucleotidsequenzen, die diesen Regionen des Lambda-Phagen entsprechen, sind als SEQ ID NO: 3 und 4 gezeigt.
  • Auch wurde die gesamte Lambda-Phagen-DNA (hergestellt von Nippon Gene) unter der Nick-Translationsreaktion in Gegenwart von dNTPs fragmentiert, wobei ein kommerziell erhältlicher Nick-Translations-Kit (hergestellt von BRL) verwendet wurde. Die Fragmente wurden als heterologe Sonden nach der Denaturierung in einzelsträngige DNA durch Erhitzen unmittelbar vor ihrer Verwendung verwendet (die „Lambda-DNA-Fragmente" wurden von Fragmenten mit einer Länge von 100–1,500 Nucleinsäureresten erzeugt).
  • Lachssperma-DNA (Type III, Sigma) wurde als eine heterologe Sonde verwendet, nachdem sie fragmentiert wurde und gemäß konventioneller Verfahren (Maniatis T. et al., „Molecular Cloning") hitzedenaturiert wurde und anschließend wieder in einzelsträngige DNA unmittelbar vor der Verwendung denaturiert wurde. Fragmente der Lachssperma-DNA haben eine Länge von etwa 100 bis 1,500 Nucleotiden.
  • Kommerziell erhältliche, einzelsträngige DNA von M13mp18 (hergestellt von New England Biolabs Inc.) wurde erworben und ebenfalls als heterologe Sonde verwendet.
  • BEISPIEL 2
  • Isolation doppelsträngiger Ziel-DNA unter Verwendung des RecA-Proteins
  • 1. Ziel-DNA : heterologe DNA = 1 : 10,000 (wenn GTPγS als ein Co-Faktor verwendet wurde)
  • A Homologe Paarung (Hybridisierungsreaktion)
  • (a) Herstellung verschiedener Sonden/RecA-Protein-Komplexe
  • Die doppelsträngigen, homologen Sonden, die in BEISPIEL 1.2 hergestellt wurden, wie z. B. die 275 bp-, die 60 bp-, die 410 bp-, die 779 bp- oder die 1,317 bp-Sequenz oder das Gemisch der homologen Sonden und der verschiedenen heterologen Sonden, die in BEISPIEL 1.3 hergestellt wurden, wurden entweder in destilliertem Wasser oder in TE-Puffer (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, pH 7,5) verdünnt. Das Aliquot wurde in ein 0,6 ml-Mikrozentrifugengefäß transferiert und in kochendem Wasser für 5 Minuten erhitzt, um die doppelsträngige Sonde zu denaturieren. Das Gefäß wurde anschließend schnell in Eiswasser abgekühlt. Es wurden 0,9 μl des 10 × Reaktionspuffers [300 mM Tris-HCl (pH 7,5 bei 37°C), 20 mM MgCl2, 4 mM DTT, 30% Glycerin], 0,9 μl einer 3 mM GTPγS-Lösung und das RecA-Protein (hergestellt von Boehringer Mannheim GmbH) in das Gefäß zugegeben, um ein Gemisch zu erzeugen. Das Gemisch wurde mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 9 μl verdünnt und man lies die Umsetzung für 12 Minuten bei 37°C erfolgen, um die Erzeugung des Sonde/RecA-Komplexes zu ermöglichen.
  • (b) Herstellung des Sonde/Ziel-DNA-Komplexes
  • Anschließend wurden 0,9 μl des 10 × Reaktionspufers, 0,9 μl der 3 mM GTPγS-Lösung, 0,9 μl einer 0,2 M MgCl2-Lösung, 245 pg php53B, welches die doppelsträngige Ziel-DNA in zirkulärer Form war, die in BEISPIEL 1.1 hergestellt wurde, und 1 μg pUC18, welches die zirkuläre heterologe DNA war (molares Verhältnis der Ziel-DNA zur heterologen DNA beträgt 1 : 10000), gemischt und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 9 μl verdünnt. Das Gemisch wurde entweder mit dem Komplex der homologen Sonde/RecA-Protein oder mit dem Gemisch aus homologer Sonde/RecA-Protein-Komplex und heterologer Sonde/RecA-Protein-Komplex gemischt, die von den vorstehend beschriebenen Reaktionen erhalten wurden. Das so erhaltene Gemisch wurde für 60 Minuten der Reaktion bei 37°C unterzogen, um die Hybridisierung und die Erzeugung des Komplexes der Sonde/Ziel-DNA zu ermöglichen. Die Art und die Menge der homologen Sonde, die der heterologen Sonde und die Menge des RecA-Proteins, die in jeder Reaktion verwendet wurden, sind in Tabelle 1 gezeigt. In allen Reaktionen betrug das Endvolumen des Reaktionsgemisches 18 μl.
  • B Einfangen/Isolation durch magnetische Kügelchen
  • Es wurden 20 μl der mit Strepdavidin beschichteten magnetische Kügelchen, hergestellt von DYNAL®, in ein 0,6 ml-Mikrozentrifugengefäß transferiert und zweimal in 100 μl 33 mM Tris-HCl und 50 mM NaCl (pH 7,5) gewaschen, wobei ein Magnetic Beads Separation Rack (MAGNA-SEPTM) verwendet wurde. Nach dem Verwerfen der Waschlösung wurden die magnetischen Kügelchen mit dem gesamten Volumen der Hybridisierungsreaktionslösung gemischt, die vorstehend in dem 0,6 ml-Mikrozentrifugengefäß erhalten wurde, und das Gemisch wurde gut gemischt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, wobei es alle 2–3 Minuten aufgeschüttelt wurde. Die magnetischen Kügelchen wurden anschließend vom Überstand unter Verwendung des Magnetic Beads Separation Rack getrennt. Nach dem Verwerfen des Überstandes wurden die magnetischen Kügelchen zweimal in einer Lösung aus 100 μl 33 mM Tris-HCl und 50 mM NaCl (pH 7,5) für 5 Minuten bei 37°C gewaschen, um alle ungebundenen Moleküle wie Sonden-, RecA-Protein-, Ziel-DNA- und heterologe DNA-Moleküle und dergleichen zu entfernen. Nach dem Verwerfen der Waschlösung wurden die Kügelchen suspendiert und mit 10 μl 33 mM Tri-HCl und 200 mM NaCl-Lösung (pH 7,5) gemischt und anschließend wurde das Gemisch auf 85°C für 8 Minuten erhitzt. Der die Ziel-DNA enthaltene Überstand wurde unter Verwendung des Magnetic Beads Separation Rack gewonnen.
  • C Transformation
  • Es wurden 100 μl kompetente Zellen, die von dem Escherichia coli-Stamm JM109 gemäß dem Verfahren von Nojima et al., (Inoue H et al., Gene 96: 23 (1990)) hergestellt wurden, in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugengefäß transferiert und mit 2 μl des Überstandes gemischt, der von den 10 μl des in B gewonnen Überstandes entfernt wurde. Das Gemisch wurde anschließend für 30 Minuten auf Eis gelagert. Das Gemisch wurde anschließend für 30 Sekunden bei 42°C inkubiert und anschließend erneut auf Eis für 1–2 Minuten abgekühlt. Anschließend wurden 0,5 ml SOC-Medium (2% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glucose) in das Gefäß zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden auf einer LB-Platte verteilt, die 50–100 μg/ml Ampicillin, 1 mg/Platte X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid), 0,5–1,0 mg/Platte IPTG (Isopropyl-β-D(–)-thiogalactopyranosid) enthielt, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen zeigen Escherichia coli, die mit php53B, der doppelsträngigen Ziel-DNA, transformiert waren, weiße Kolonien, und Escherichia coli, die mit pUC18, der heterologen DNA, transformiert waren, zeigen blaue Kolonien.
  • Die verschiedenen Bedingungen und die Ergebnisse der Transformation, die unter diesen Bedingungen erhalten wurden, sind in Tabelle 1 und 2 gezeigt.
  • Tabelle 1 Reaktionsbedingungen
    Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Wie hierin verwendet wird, bedeutet „homo. S." eine homologe Sonde; „hetero. S." bedeutet eine heterologe Sonde.
  • Alle „Lambda-DNA-Fragmente", die in Tabelle 1 verwendet wurden, wurden durch eine Nick-Translation der gesamten Lambda-Phagen-DNA in Gegenwart von d'NTPs hergestellt, wobei ein On-The-Shelf-Nick-Translation Kit (hergestellt von BRL Co., Lt) verwendet wurde.
  • Tabelle 2 Ergebnis der Transformation1)
    Figure 00310002
  • Figure 00320001
  • Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass, wenn eine große Menge (200 ng) einer homologen Sonde verwendet wird, die Spezifität der Reaktion sehr gering ist, obwohl die Effizienz der Reaktion relativ hoch ist. Wie hierin verwendet, wird die Spezifität der Reaktion basierend auf der Anzahl der weißen Kolonien gegen die Gesamtzahl der weißen und blauen Kolonien bestimmt. Die Effizienz der Reaktion wird basierend auf der Anzahl der weißen Kolonien und der Menge der gewonnenen Ziel-DNA bestimmt.
  • Wenn zum Beispiel eine große Menge (200 ng) einer einzelnen Art einer homologen Sonde verwendet wurde, die länger als 275 Nucleotide war (vgl. Nr. 1, 3, 7, 11), dann wurde die Effizienz der Reaktion als relativ hoch eingestuft, da eine große Anzahl Kolonien von Escherichia coli beobachtet wurde, welche die Ziel-DNA enthielten (Anzahl der weißen Kolonien), und die Ausbeute der Ziel-DNA ebenfalls hoch war. Gleichzeitig überstieg jedoch die Anzahl der Kolonien von Escherichia coli, welche die heterologe DNA enthielten (Anzahl der blauen Kolonien), deutlich die Anzahl der weißen Kolonien, was bedeutete, dass die Spezifität der Reaktion als sehr gering eingestuft wurde.
  • Wenn andererseits eine große Menge (200 ng) einer einzelnen Art einer homologen Sonde mit 60 Nucleotiden verwendet wurde (Nr. 24), dann war nicht nur die Spezifität der Reaktion sehr gering, sondern die Effizienz der Reaktion war ebenfalls deutlich geringer. Die Spezifität der Reaktion ist aufgrund großen Menge an Kontamination bei der heterologen DNA gering. Die Effizienz der Reaktion ist geringer, da die Ausbeute der Ziel-DNA im Vergleich zu der Ausbeute der Ziel-DNA deutlich geringer war, wenn die homologe Sonde mit 275 Nucleotiden verwendet wurde. Wenn die Menge der homologen Sonde oder des RecA-Proteins reduziert wurde (Nr. 12, 13, 25, 26), war die Kontamination bei der heterologen Sonde leicht vermindert und die Ausbeute der Ziel-DNA wurde ebenfalls reduziert. Dementsprechend waren sowohl die Effizienz der Reaktion als auch die Spezifität deutlich reduziert.
  • Wenn jedoch eine geringe Menge der homologen Sonde (50 ng) zusammen mit einer großen Menge (150 ng) der heterologen Sonde in der Reaktion verwendet wurde (Nr. 17, 30), war die Spezifität der Reaktion erhöht. Dies liegt an der Hemmung der Kontamination bei der heterologen DNA. Wenn die Menge der homologen Sonde weiter reduziert wurde (10 ng der homologen Sonde mit einer Länge von 275 Nucleotiden, 25 oder 10 ng der homologen Sonde mit einer Länge von 60 Nucleotiden) und die Menge der heterologen Sonde weiter erhöht wurde (175 ng oder 190 ng) (Nr. 18–21, 31–35), war die Menge der Kontamination bei der heterologen DNA im Vergleich zu Nr. 17 und 30 drastisch reduziert und daher war die Spezifität der Reaktion deutlich erhöht.
  • Wenn eine reduzierte Menge der homologen Sonde (10–133 ng) mit einer großen Menge der heterologen Sonde (67–190 ng) in der Reaktion verwendet wurde (Nr. 8, 9, 14–21, 27–35), dann war die Menge der Ziel-DNA drastisch erhöht und aus diesem Grund wurde die Effizienz der Reaktion selbst als verbessert eingestuft. Wenn eine kurze homologe Sonde wie z. B. eine Sonde mit einer Länge von 60–410 Nucleotiden (die Länge der komplementären Region zwischen Ziel-DNA und Sonde ist kurz) in Kombination mit verschiedenen Arten von heterologen Sonden verwendet wurde, wurde gezeigt, dass nicht nur die Reduktion der Effizienz der Reaktion verhindert wurde, die von ausschließlich der reduzierten Menge der homologen Sonde hervorgerufen wurde, sondern auch die Effizienz der Reaktion verbessert wurde, wenn sie mit der Effizienz verglichen wurde, die erreicht wurde, wenn ausschließlich eine nicht reduzierte Menge der homologen Sonde verwendet wurde.
  • Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass, wenn die heterologe Sonde in einem 1–500fachen Überschuss zu der Menge der homologen Sonde verwendet wird (Nr. 2, 4–6, 8–10, 15–23, 28–35), die Spezifität der Reaktion deutlich verbessert wird. Die Spezifität ist mehr als viermal erhöht im Vergleich zu der, die erzielt wird, wenn eine einzelne Art der homologen Sonde ohne die Zugabe der heterologen Sonde verwendet wird.
  • 2. Ziel-DNA : heterologe DNA = 1 : 100,000 (wenn GTPγS als ein Co-Faktor verwendet wurde)
  • A Herstellung der heterologen Sonde
  • Zusätzlich zu den 500 bp-Fragmenten der doppelsträngigen DNA, die in BEISPIEL 1.3 hergestellt wurde und welche die Teilsequenz des Genoms des Lambda-Phagens und der Lachssperma-DNA enthielt, wurden 308 bp der doppelsträngigen Fragmente (SEQ ID NO: 5), welche die Teilsequenz des Lamda-Phagen enthielten, unter Standardbedingungen der Amplifikation (PCR-Verfahren) erneut hergestellt, wobei ein Primer 5'-AGGTGCGGTGATACGTGGTGTTTTT-3' (SEQ ID NO: 22, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 5 von Nucleotid 1–25), ein weiterer Primer, 5'-ATACGGCTGAGGTTTTCAACGGCCT-3' (SEQ ID NO: 21, entsprechend der Sequenz von SEQ ID NO: 5 von Nucleotid 284–308) und Taq-Polymerase verwendet wurden. Dieses Fragment wurde als eine heterologe Sonde nach der Denaturierung in einzelsträngige DNA durch Erhitzen unmittelbar vor der Verwendung eingesetzt. Die DNA-Sequenz des Fragments ist in SEQ ID NO: 5 dargelegt.
  • B Homologe Paarung (Hybridisierungsreaktion)
  • (a) Die Herstellung verschiedener Sonden/RecA-Protein-Komplexe
  • Die doppelsträngige homologe Sonde, die aus einer 275 bp- oder einer 60 bp-Sequenz bestand und die in BEISPIEL 1.2 hergestellt wurde und die eine Teilsequenz der p53-cDNA enthielt und an ihrem 5'-Ende biotinyliert war, oder das Gemisch dieser homologen Sonde und den verschiedenen heterologen Sonden, die in BEISPIEL 2.2A beschrieben wurden, wurde entweder in destilliertem Wasser oder in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 7,5) verdünnt. Das Aliquot wurde in ein 0,6 ml-Mikrozentrifugengefäß überführt und wurde in einem kochenden Wasserbad für 5 Minuten erhitzt, um die doppelsträngige Sonde zu denaturieren. Das Gefäß wurde schnell in Eiswasser abgekühlt, anschließend wurden 0,9 μl eines 10 × Reaktionspuffers [300 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5 bei 37°C), 20 mM MgCl2, 4 mM DTT, 30% Glycerin], 0,9 μl einer 5 mM GTPγS-Lösung und RecA-Protein (hergestellt von Boehringer-Mannheim GmbH) in das Gefäß zugegeben. Man lies das Gemisch nach der Verdünnung mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 9 μl 12 Minuten bei 37°C reagieren.
  • (b) Die Herstellung des Sonde/Ziel-DNA-Komplexes
  • Anschließend wurden 0,9 μl des 10 × Reaktionspuffers, 0,9 μl der 5 mM GTPγS-Lösung, 0,9 μl der 0,2 M MgCl2-Lösung, 24,5 pg von php53B, das eine doppelsträngige Ziel-DNA in zirkulärer Form war, die wie in BEISPIEL 1.1 hergestellt wurde, und 1 μg pUC18, das eine zirkuläre heterologe DNA war, wurden gemischt (molares Verhältnis der Ziel-DNA zur heterologen DNA beträgt 1 : 100,000) und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 9 μl verdünnt. Das Gemisch wurde entweder mit dem Komplex, der aus der homologen Sonde und dem RecA-Protein bestand, oder mit einem Gemisch aus dem Komplex der homologen Sonde/RecA-Protein und dem Komplex der heterologen Sonde/RecA-Protein, das von der vorstehend beschriebenen Reaktion erhalten wurde, gemischt und das so erhaltene Gemisch wurde der Reaktion für 60 Minuten bei 37°C unterzogen. Die Art und die Menge der homologen Sonde, die der heterologen Sonde und die Menge des RecA-Proteins, die in der jeweiligen Reaktion verwendet wurden, sind in Tabelle 3 gezeigt. In allen Reaktionen betrug das Endvolumen der Reaktion 18 μl.
  • C Einfangen/Isolation durch magnetische Kügelchen
  • 20 μl der mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen, hergestellt von DYNAL®, wurden in ein 0,6 ml-Mikrozentrifugengefäß überführt und wurden zweimal in 100 μl 33 mM Tris-HCl und 50 mM NaCl (pH-Wert 7,5) gewaschen, wobei ein Magnetic Beads Separation Rack (MAGNA-SEPTM) verwendet wurde. Nach dem Verwerfen der Waschlösung wurden die magnetischen Kügelchen mit dem gesamten Volumen der Hybridisierungsreaktionslösung gemischt, die vorstehend in dem 0,6 μl-Mikrozentrifugengefäß erhalten wurde, und dieses Gemisch wurde gut gemischt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur gelagert, wobei es alle 2–3 Minuten aufgeschüttelt wurde. Die magnetischen Kügelchen wurden anschließend vom Überstand unter Verwendung des Magnetic Beads Separation Rack getrennt. Nach dem Verwerfen des Überstandes wurden die Kügelchen zweimal in 100 μl einer 33 mM Tris-HCl und 50 mM NaCl-Lösung (pH-Wert 7,5) für 5 Minuten bei 37°C gewaschen, um ungebundene Moleküle wie z. B. Sonden, RecA-Protein, Ziel-DNA, heterologe DNA, etc. zu entfernen. Nach dem Verwerfen der Waschlösung wurden die Kügelchen suspendiert und mit 10 μl 33 mM Tris-HCl und 200 mM NaCl (pH-Wert 7,5) gemischt und anschließend wurde das Gemisch für 8 Minuten bei 85°C erhitzt. Der die Ziel-DNA enthaltene Überstand wurde unter Verwendung des Magnetic Beads Separation Rack gewonnen.
  • D Transformation
  • Es wurden 100 μl kompetente Zellen, die von dem Escherichia coli-Stamm JM109 gemäß dem Verfahren von Nojima et al., (Inoue H et al., Gene 96: 23 (1990)) hergestellt wurden, in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugengefäß transferiert und mit 10 μl des Überstandes gemischt, der in BEISPIEL 2.2C gewonnen wurde. Das Gemisch wurde anschließend für 30 Minuten auf Eis gelagert. Das Gemisch wurde anschließend für 30 Sekunden bei 42°C inkubiert und anschließend erneut auf Eis für 1–2 Minuten abgekühlt. Anschließend wurden 0,5 ml SOC-Medium (2% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glucose) in das Gefäß zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden auf einer LB-Platte verteilt, die 50–100 μg/ml Ampicillin, 1 mg/Platte X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid), 0,5–1,0 mg/Platte IPTG (Isopropyl-β-D(–)-thiogalactopyranosid) enthielt, und wurde über Nacht bei 37°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen zeigen Escherichia coli, die mit php53B, der doppelsträngigen Ziel-DNA, transformiert waren, weiße Kolonien, und Zellen von Escherichia coli, die mit pUC18, der heterologen DNA, transformiert waren, zeigen blaue Kolonien.
  • Die verschiedenen Bedingungen und die Ergebnisse der Transformation, die unter diesen Bedingungen erhalten wurden, sind in Tabelle 3 und Tabelle 4 gezeigt.
  • Tabelle 3 Reaktionsbedingungen
    Figure 00380001
  • Tabelle 4 Ergebnis der Transformation1)
    Figure 00380002
  • Die Ergebnisse, die vorstehend zusammengefasst sind, zeigen, dass bei einer Reaktion, welche die zirkuläre Ziel-DNA in einem Verhältnis von 1 : 100,000 enthält, keine Reduktion der Reaktivität beobachtet wird, obwohl die Reaktion nur eine sehr kleine Menge der homologen Sonde (1 ng) und die 150fache Menge der heterologen Sonde (150 ng) enthält. Im Gegenteil, die Ergebnisse zeigen eine erstaunliche Verbesserung der Spezifität und der Reaktivität durch die Zugabe der heterologen Sonde (besonders, wenn die Sonde mit den 60 Nucleotiden verwendet wurde). Die hier erzielten Ergebnisse sind die gleichen, wie die in BEISPIEL 2.1 erzielten Ergebnisse, wenn die Ziel-DNA in einem Verhältnis von 1 : 10,000 vorliegt. Die vorstehenden Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass die 308-Nucleotidsonde, die eine Teilsequenz des Lambda-Phagengenoms enthält, als heterologe Sonde verwendet werden kann.
  • 3. Ziel-DNA : heterologen DNA = 1 : 10,000 (eine Sonde mit einer Länge von 30 Nucleotiden wurde verwendet und GTPγS wurde als ein Co-Faktor verwendet)
  • A Die Herstellung der homologen Sonde
  • Die 30 Nucleotide lange einzelsträngige Sonde (SEQ ID NO: 6), welche die Teilsequenz der p53-cDNA enthält, wurde unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts synthetisiert. Die Nucleotidsonde wurde an ihrem 5'-Ende biotinyliert. Die Nucleotidsequenz, die dieser Region der p53-cDNA entspricht, ist in SEQ ID NO: 6 gezeigt.
  • B Die Herstellung der heterologen Sonde
  • Zusätzlich zu der in BEISPIEL 2.2 verwendeten heterologen Sonde wurden ebenfalls eine einzelsträngige Sonde mit einer Länge von 60 Nucleotiden (SEQ ID NO: 7), die eine Teilsequenz des Lambda-Phagengenoms enthielt und die gemäß konventioneller Verfahren unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts synthetisiert wurde (die Nucleotidsequenz dieser Region ist als SEQ ID NO: 7 gezeigt), und rRNA von E. coli (ein Gemisch von 16S und 23S, hergestellt von Boehringer-Mannheim GmbH) als heterologe Sonden verwendet.
  • C Homologe Paarung (Hybridisierungsreaktion)
  • (a) Die Herstellung verschiedener Sonde/RecA-Protein-Komplexe
  • Eine einzelsträngige Sonde mit einer Länge von 30 Nucleotiden, die eine Teilsequenz der p53-cDNA enthielt und an ihrem 5'-Ende biotinyliert war und die wie in BEISPIEL 2.3A hergestellt wurde, oder ein Gemisch aus dieser homologen Sonde und verschiedenen heterologen Sonden, die in BEISPIEL 2.3.B beschrieben wurden, wurden entweder in destilliertem Wasser oder in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 7,5) verdünnt. Das Aliquot wurde in ein 0,6 ml-Mikrozentrifugengefäß überführt und wurde im kochenden Wasser für 5 Minuten erhitzt, um die doppelsträngige Sonde zu denaturieren. Das Gefäß wurde schnell in Eiswasser abgekühlt, anschließend wurden 0,9 μl eines 10 × Reaktionspuffers [300 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5 bei 37°C), 20 mM MgCl2, 4 mM DTT, 30% Glycerin], 0,9 μl einer 5 mM GTPγS-Lösung und RecA-Protein (hergestellt von Boehringer-Mannheim GmbH) in das Gefäß zugegeben und man lies das Gemisch nach der Verdünnung mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 9 μl 12 Minuten bei 37°C reagieren.
  • (c) Die Herstellung des Sonde/Ziel-DNA-Komplexes
  • Anschließend wurden 0,9 μl des 10 × Reaktionspuffers, 0,9 μl der 5 mM GTPγS-Lösung, 0,9 μl der 0,2 M MgCl2-Lösung, 245 pg von php53B, das eine doppelsträngige Ziel-DNA in zirkulärer Form war und die wie BEISPIEL 1.1 hergestellt wurde, und 1 μg pUC18, das eine zirkuläre heterologe DNA war, gemischt (molares Verhältnis der Ziel-DNA zur heterologen DNA beträgt 1 : 10,000) und mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 9 μl verdünnt. Das Gemisch wurde entweder mit dem Komplex gemischt, der aus der homologen Sonde und dem RecA-Protein bestand oder mit einem Gemisch aus dem Komplex der homologen Sonde/RecA-Protein und dem Komplex der heterologen Sonde/RecA-Protein, das von der vorstehend beschriebenen Reaktion erhalten wurde. Das so erhaltene Gemisch wurde der Reaktion für 60 Minuten bei 37°C unterzogen. Die Menge der homologen Sonde, die Art und die Menge der heterologen Sonde und die Menge des RecA-Proteins, die in der jeweiligen Reaktion verwendet wurden, sind in Tabelle 5 gezeigt. In allen Reaktionen betrug das Endvolumen der Reaktion 18 μl.
  • D Einfangen/Isolation durch magnetische Kügelchen
  • 20 μl der mit Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen, hergestellt von DYNAL®, wurden in ein 0,6 ml-Mikrozentrifugengefäß überführt und wurden zweimal in 100 μl 33 mM Tris-HCl und 50 mM NaCl (pH-Wert 7,5) gewaschen, wobei ein Magnetic Beads Separation Rack (MAGNA-SEPTM) verwendet wurde. Nach dem Verwerfen der Waschlösung wurde das gesamte Volumen der Hybridisierungsreaktionslösung zu dem Mikrozentrifugengefäß zugegeben und gut mit den gewaschenen magnetischen Kügelchen gemischt. Das Gemisch wurde für 15 Minuten bei Raumtemperatur gelagert, wobei es alle 2–3 Minuten aufgeschüttelt wurde. Die magnetischen Kügelchen wurden anschließend von den nicht gebundenen Molekülen unter Verwendung des Magnetic Beads Separation Rack getrennt. Nach dem Verwerfen des Überstandes wurden die magnetischen Kügelchen zweimal in 100 μl einer 33 mM Tris-HCl und 50 mM NaCl-Lösung (pH- Wert 7,5) für 5 Minuten bei 37°C gewaschen. Nach dem Verwerfen der Waschlösung wurden die Kügelchen suspendiert und mit 10 μl 33 mM Tris-HCl und 200 mM NaCl (pH-Wert 7,5) gemischt und anschließend wurde das Gemisch für 8 Minuten bei 85°C erhitzt. Der die Ziel-DNA enthaltende Überstand wurde unter Verwendung des Magnetic Beads Separation Rack gewonnen.
  • E Transformation
  • Es wurden 100 μl kompetente Zellen, die von dem Escherichia coli-Stamm JM109 gemäß dem Verfahren von Nojima et al., (Inoue H et al., Gene 96: 23 (1990)) hergestellt wurden, in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugengefäß transferiert und mit 2 μl des Überstandes gemischt, der in D wiedergewonnen wurde. Das Gemisch wurde anschließend für 30 Minuten auf Eis gelagert. Das Gemisch wurde anschließend für 30 Sekunden bei 42°C inkubiert und anschließend erneut auf Eis für 1–2 Minuten abgekühlt. Anschließend wurden 0,5 ml SOC-Medium (2% Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glucose) in das Gefäß zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden auf einer LB-Platte verteilt [die 50–100 μg/ml Ampicillin, 1 mg/Platte X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid), 0,5–1,0 mg/Platte IPTG (Isopropyl-β-D(–)-thiogalactopyranosid) enthielt] und über Nacht bei 37°C inkubiert. Unter diesen Bedingungen zeigen Escherichia coli, die mit php53B, der doppelsträngigen Ziel-DNA, transformiert waren, weiße Kolonien, und Escherichia coli, die mit pUC18, der heterologen DNA, transformiert waren, zeigen blaue Kolonien. Die verschiedenen Bedingungen und die Ergebnisse der Transformation, die unter diesen Bedingungen erhalten wurden, sind in Tabelle 5 und 6 gezeigt.
  • Tabelle 5 Reaktionsbedingung
    Figure 00430001
  • Tabelle 6 Ergebnis der Transformation1)
    Figure 00430002
  • Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass die Spezifität und die Reaktivität durch die Zugabe der heterologen Sonde zu der Reaktion deutlich erhöht war, wenn die 30 Nucleotide lange Sonde sowie die 60 Nucleotide lange Sonde und die 275 Nucleotide lange Sonde verwendet wurden. Die Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass die 60 Nucleotide lange einzelsträngige DNA-Sonde, welche die Teilsequenz des Lambda-Phagengenoms enthielt, und rRNA, die von Escherichia coli abgeleitet wurde (ein Gemisch von 16S und 23S), als heterologe Sonde verwendet werden können.
  • BEISPIEL 3
  • ABSUCHEN EINER cDNA-GENBANK NACH ZIEL-cDNA
  • Plasmide, die eine p53-cDNA-Zielsequenz enthielten, wurden von 5 μg einer cDNA-Genbank erhalten, die von einer kommerziell erhältlichen, menschlichen Gehirn-cDNA-Genbank (SUPER SCRIPT Human Brain cDNA Library, hergestellt von BRL) hergestellt wurde. Das Verhältnis von p53-cDNA zu der Genbank-DNA wurde durch das Verfahren der Kolonie-Hybridisierungsreaktion bestimmt und betrug etwa 1 : 100,000–1 : 200,000.
  • Die doppelsträngige homologe Sonde mit der 275 bp- und der 60 bp-Sequenz und die einzelsträngige, homologe Sonde mit 30 bp, die wie in BEISPIEL 1 und BEISPIEL 2 hergestellt wurden, wurden verwendet. Die Lambda-DNA-Fragmente, die wie in BEISPIEL 1 hergestellt wurden, wurden als heterologe Sonde verwendet.
  • Die homologe Paarung, das Einfangen/die Isolation durch magnetische Kügelchen und die Transformation wurden gemäß der Verfahren durchgeführt, die in BEISPIEL 2.2 und BEISPIEL 2.3 beschrieben wurden. Die so erhaltenen Transformanten wurden auf LB-Platten verteilt, die 50–100 μg/ml Ampicillin enthielten, und wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. 30 Kolonien wurden von den Ampicillin resistenten Kolonien zufällig ausgewählt, die durch jede dieser Reaktionen erhalten wurden, und die Plasmid-DNA wurde von jeder dieser Kolonien durch das Minprep-Verfahren extrahiert (Quantum Prep® Plasmid Miniprep Kit, hergestellt von BioRad, wurde verwendet).
  • Nach dem Durchführen der PCR-Reaktion, wobei ein Primer verwendet wurde, der die selbe Sequenz besaß wie der, der in der Herstellung der 275 bp langen homologen Sonde verwendet wurde, und der nicht biotinyliert war, wurde eine elektrophoretische Analyse im Agarosegel durchgeführt, um basierend auf dem Vorhandensein des 275 Nucleotide langen Fragments zu bestimmen, ob die Plasmid-DNA von jeder der Kolonien p53-cDNA enthielt oder nicht. Die Spezifität wurde basierend auf der nachfolgenden Formel berechnet: Spezifität (%) = Anzahl der PCR-positiven Klone ÷ 30 × 100
  • Die verschiedenen Reaktionsbedingungen und die Ergebnisse des Absuchens der cDNA-Genbank unter diesen Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 7 und 8 gezeigt.
  • Tabelle 7
    Figure 00450001
  • Tabelle 8
    Figure 00450002
  • Aufgrund der vorstehenden Ergebnisse aus dem Absuchen nach Ziel-cDNA aus einer gegebenen cDNA-Genbank wurde bestätigt, dass die Spezifität durch das Zugeben einer heterologen Sonde deutlich verbessert wurde.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht das zielgerichtete Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und/oder Isolieren des doppelsträngigen Ziel-DNA-Moleküls, das in der DNA-Probe in einer extrem kleinen Menge vorhanden ist, mit einer hohen Effizienz und Spezifität durch die Verwendung einer kurzsträngigen homologen Sonde und einer heterologen Sonde. Von der vorliegenden Erfindung wird erwartet, dass sie zum Isolieren oder zum Clonieren eines Zielgens aus einem cDNA- oder einem genomischen DNA-Gemisch, zum Absuchen nach einem Zielgen in verschiedenen Genbanken, zum Amplifizieren einer Ziel-DNA-Sequenz oder zum Kartieren von Genen unter Verwendung RecA-ähnlicher Rekombinasen; zum Durchführen einer sequenzspezifischen Modifikation oder Spaltung einer Ziel-DNA unter Verwendung von Oligonucleotiden und zum in-situ-Hybridisieren und zum in-vivo-Gentargeting in lebenden Zellen unter Verwendung einer RecA-ähnlichen Rekombinase verwendet wird.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER SEQUENZEN
  • SEQ ID NO: 1 ist ein doppelsträngiges DNA-Fragment einer p53-cDNA.
  • SEQ ID NO: 2 ist ein doppelsträngiges DNA-Fragment einer p53-cDNA.
  • SEQ ID NO: 3 ist ein doppelsträngiges DNA-Fragment einer genomischen Lambda-Phagen-DNA-Sequenz.
  • SEQ ID NO: 4 ist ein doppelsträngiges DNA-Fragment einer genomischen Lambda-Phagen-DNA-Sequenz.
  • SEQ ID NO: 5 ist ein doppelsträngiges DNA-Fragment einer genomischen Lambda-Phagen-DNA-Sequenz.
  • SEQ ID NO: 6 ist eine einzelsträngige DNA-Sonde, die einer Region der p53-cDNA entspricht.
  • SEQ ID NO: 7 ist eine einzelsträngige DNA-Sonde, die einer Region der genomischen Lambda-Phagen-DNA entspricht.
  • SEQ ID NO: 8 ist ein doppelsträngiges DNA-Fragment einer p53-cDNA.
  • SEQ ID NO: 9 ist ein doppelsträngiges DNA-Fragment einer p53-cDNA.
  • SEQ ID NO: 10 ist ein doppelsträngiges DNA-Fragment einer p53-cDNA.
  • SEQ ID NO: 11 ist ein Oligonucleotid-Primer für die p53-cDNA.
  • SEQ ID NO: 12 ist ein Oligonucleotid-Primer für die p53-cDNA.
  • SEQ ID NO: 13 ist ein Oligonucleotid-Primer für die p53-cDNA.
  • SEQ ID NO: 14 ist ein Oligonucleotid-Primer für die p53-cDNA.
  • SEQ ID NO: 15 ist ein Oligonucleotid-Primer für die p53-cDNA.
  • SEQ ID NO: 16 ist ein Oligonucleotid-Primer für die p53-cDNA.
  • SEQ ID NO: 17 ist ein Oligonucleotid-Primer für die p53-cDNA.
  • SEQ ID NO: 18 ist ein Oligonucleotid-Primer für die genomische Lambda-Phagen-DNA.
  • SEQ ID NO: 19 ist ein Oligonucleotid-Primer für die genomische Lambda-Phagen-DNA.
  • SEQ ID NO: 20 ist ein Oligonucleotid-Primer für die genomische Lambda-Phagen-DNA.
  • SEQ ID NO: 21 ist ein Oligonucleotid-Primer für die genomische Lambda-Phagen-DNA.
  • SEQ ID NO: 22 ist ein Oligonucleotid-Primer für die genomische Lambda-Phagen-DNA.
  • Die vorhergehenden Beschreibungen beabsichtigen, die Erfindung darzustellen, nicht aber den Bereich der Erfindung zu beschränken. In der Tat kann der Fachmann mühelos weitere Ausführungsformen, die auf den Lehren hierin basieren, sich vorstellen und ohne ungebührende Versuche herstellen.
  • Die vorliegende Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ausgeführt werden, ohne dass ein Abweichen von den wesentlichen Kennzeichen erfolgt. Die beschriebenen Ausführungsformen sollen in jeder Hinsicht nur als Darstellung und nicht als Beschränkung betrachtet werden. Der Bereich der Erfindung ist daher eher durch die Ansprüche im Anhang als durch die vorherige Beschreibung angezeigt.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001

Claims (42)

  1. Verfahren zum zielgerichteten Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und/oder Isolieren einer doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz in einer Probe unter Verwendung einer RecA-ähnlichen Rekombinase, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen von mindestens einem Typ einer Rekombinase, mindestens einem Typ einer homologen Sonde und mindestens einem Typ einer heterologen Sonde; und (b) Mischen der Rekombinase, der homologen Sonde und der heterologen Sonde mit der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz in der Probe, wobei die Spezifität der homologen Paarung und/oder des Strangaustausches zwischen der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz und der homologen Nucleinsäuresonde durch die Zugabe der heterologen Nucleinsäuresonde erhöht ist und das Gewichtsverhältnis der homologen Sonde zur heterologen Sonde etwa 1 : 3 bis etwa 1 : 500 beträgt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (b) weiterhin die Schritte umfasst: (a) Umsetzen der homologen Sonde und der heterologen Sonde mit der Rekombinase, um die Sonden mit der Rekombinase zu beschichten; und (b) Anwenden der Rekombinase-beschichteten homologen Sonde und der heterologen Sonde auf die doppelsträngige Nucleinsäurezielsequenz in der Probe.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die doppelsträngige Nucleinsäurezielsequenz doppelsträngige Ziel-DNA ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei in Schritt (a) mindestens zwei Typen von homologen Sonden bereitgestellt werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die homologen Sonden zwei Typen von homologen Sonden sind, die zueinander ausreichend komplementär sind.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüchen 1 bis 5, wobei die homologe Sonde eine Länge von mindestens 15 Nucleinsäureresten aufweist.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die homologe Sonde eine Länge von etwa 15 bis 2000 Nucleinsäureresten aufweist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die homologe Sonde eine Markierung oder einen Liganden umfasst.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die homologe Sonde eine doppelsträngige DNA-Sonde ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die homologe Sonde eine einzelsträngige DNA-Sonde ist.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die heterologe Sonde etwa 15 Basen oder mehr aufweist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die heterologe Sonde eine einzelsträngige DNA-Sonde ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die heterologe Sonde eine RNA-Sonde ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Gewichtsverhältnis der homologen Sonde zu der heterologen Sonde etwa 1 : 3 bis etwa 1 : 250 beträgt.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die RecA-ähnliche Rekombinase von einem Prokaryont stammt.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die RecA-ähnliche Rekombinase von Escherichia coli stammt.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die RecA-ähnliche Rekombinase RecA ist.
  18. Verfahren zum zielgerichteten Ansteuern, Anreichern, Nachweisen und/oder Isolieren einer doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz in einer Probe unter Verwendung einer RecA-ähnlichen Rekombinase, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer homologen Sonde, die eine Markierung oder einen Liganden aufweist und die an mindestens einen Typ einer Rekombinase gebunden ist, und einer heterologen Sonde, die an mindestens einen Typ einer Rekombinase gebunden ist; (b) Umsetzen der Rekombinase-beschichteten homologen Sonde und der Rekombinase-beschichteten heterologen Sonde mit der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz unter Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes aus der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz und der homologen Sonde im Reaktionsansatz fördern; (c) Inkontaktbringen des Reaktionsansatzes mit einem festen Träger, der so ausgelegt ist, dass er selektiv den Komplex aus der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz und der homologen Sonde bindet; (d) Entfernen von nicht gebundenen Molekülen vom festen Träger; und (e) Behandeln des festen Trägers, um die doppelsträngige Nucleinsäurezielsequenz, die über den Komplex selektiv an den festen Träger gebunden ist, freizusetzen; wobei das Gewichtsverhältnis der homologen Sonde zur heterologen Sonde etwa 1 : 3 bis etwa 1 : 500 beträgt.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die doppelsträngige Nucleinsäurezielsequenz doppelsträngige Ziel-DNA ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Probe eine cDNA oder eine genomische DNA-Bibliothek ist, und die doppelsträngige Ziel-DNA in einen Vektor inseriert ist, der in der Lage ist, einen geeigneten bakteriellen Wirt zu transformieren oder transfizieren.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, weiterhin umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen geeigneter Wirtszellen, die in der Lage sind, mit der doppelsträngigen Ziel-DNA, die in einen Vektor inseriert ist, transformiert oder transfiziert zu werden; (b) Transformieren oder Transfizieren der Wirtszellen mit der Ziel-DNA-Fraktion, die von der festen Phase freigesetzt wurde; und (c) Selektieren transformierter oder transfizierter Zellen, die die Ziel-DNA enthalten.
  22. Verfahren nach Anspruch 19 oder 21, wobei die Probe eine klinische Probe ist, die eine Mischung aus cDNA oder genomischer DNA enthält.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei die Markierung oder der Ligand Biotin oder Digoxigenin ist.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei die feste Phase magnetische oder paramagnetische Kügelchen umfasst, an deren Oberfläche Avidin, Streptavidin oder ein Anti-Digoxigenin-Antikörper gebunden ist.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei mindestens zwei Typen von homologen Sonden bereitgestellt werden.
  26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei zwei Typen von homologen Sonden bereitgestellt werden, die zueinander ausreichend komplementär sind.
  27. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 26, wobei die RecA-ähnliche Rekombinase von einem Prokaryont stammt.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die RecA-ähnliche Rekombinase von Escherichia coli stammt.
  29. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 28, wobei die heterologe Sonde eine Länge von mindestens 15 Nucleinsäureresten aufweist.
  30. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 29, wobei die homologe Sonde eine Länge von mindestens 15 Nucleinsäureresten aufweist.
  31. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 30, wobei das Gewichtsverhältnis der homologen Sonde zu der heterologen Sonde etwa 1 : 3 bis 1 : 250 beträgt.
  32. Verfahren zum Nachweis einer doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz in einer Probe von Zellen durch ein in-situ-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer RecA-ähnlichen Rekombinase, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer homologen Sonde und einer heterologen Sonde, wobei die Sonden an die Rekombinase gebunden sind; (b) Hinzufügen der Rekombinase-beschichteten homologen Sonde und heterologen Sonde zu der Zellprobe unter Bedingungen, die das Reagieren der homologen Sonde mit der doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz fördern; und (c) Entfernen der Sonden, die nicht mit der doppelstängigen Nucleinsäurezielsequenz reagiert haben; wobei das Gewichtsverhältnis der homologen Sonde zu der heterologen Sonde etwa 1 : 3 bis etwa 1 : 500 beträgt.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Gewichtsverhältnis der homologen Sonde zur heterologen Sonde etwa 1 : 3 bis etwa 1 : 250 beträgt.
  34. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, wobei mindestens zwei Typen von homologen Sonden bereitgestellt werden.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei zwei Typen homologer Sonden verwendet werden, die zueinander ausreichend komplementär sind.
  36. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 35, wobei die heterologe Sonde eine Länge von 15 Basen oder mehr aufweist.
  37. Verfahren nach Anspruch 2, 18 oder 32, wobei die homologen und heterologen Sonden in Anwesenheit eines Co-Faktors an die Rekombinase gebunden sind.
  38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die RecA-ähnliche Rekombinase aus Escherichia coli stammt.
  39. Verfahren nach Anspruch 37, wobei der Co-Faktor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GTP S, einer Mischung aus ATP S und ADP, einer Mischung aus ADP und AIF4 – (Aluminiumnitrat und Natriumfluorid), einer Mischung aus ATP und und AIF4 – (Aluminiumnitrat und Natriumfluorid), einer Mischung aus dADP und AIF4 – (Aluminiumnitrat und Natriumfluorid) oder einer Mischung aus dATP und AIF4 – (Aluminiumnitrat und Natriumfluorid).
  40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei der Co-Faktor GTP S ist.
  41. Verfahren zum zielgerechten Ansteuern einer doppelsträngigen Nucleinsäurezielsequenz in einer Probe lebender Zellen durch ein Gentargetingverfahren unter Verwendung einer RecA-ähnlichen Rekombinase, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer mit einer Rekombinase beschichteten homologen Sonde und einer mit einer Rekombinase beschichteten heterologen Sonde; (b) Einbringen der homologen Sonde und der heterologen Sonde in die lebenden Zellen; (c) Inkubieren der lebenden Zellen, die die homologe und die heterologe Sonde enthalten, für eine ausreichende Zeit, die es erlaubt, dass die homologe Sonde in das Genom der Zellen transformiert wird, wobei das Gewichtsverhältnis der homologen Sonde zur heterologen Sonde etwa 1 : 3 bis etwa 1 : 500 beträgt.
  42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei das Gewichtsverhältnis der homologen Sonde zur heterologen Sonde etwa 1 : 3 bis etwa 1 : 250 beträgt.
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