CN116670297A - 从环境样品中检测李斯特菌的方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了从环境样品中检测李斯特菌。特别地，所述检测可以在当天或同一工作班次，例如在约12小时或更短或约6至10小时内可得到结果的情况下完成。所述当天检测利用短的孵育时间和/或浓缩步骤，结合快速检测测定来产生当天的结果。

Description

从环境样品中检测李斯特菌的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年10月22日提交的美国临时专利申请号63/094,945的权益，将其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及从环境样品中检测李斯特菌(Listeria)。特别是，从环境样品的检测可以在单一天或单一工作班次内完成。

背景技术

李斯特菌属物种(Listeria species)非常常见并且可以在环境中的几乎任何地方找到。作为指示生物体，李斯特菌属物种(Listeria spp.)可用于评估食品加工厂环境中致病性单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的潜在存在。单核细胞增多性李斯特菌是一种有害病原体，所述有害病原体由于它与人类食源性李斯特菌病有关，因此在食品工业中尤其成问题。需要快速检测和鉴定环境样品(包括用于食品安全测试的环境样品)中李斯特菌的方法和诊断工具。本发明的装置、方法和试剂盒满足了这种需求和其他需求。

发明内容

本发明为用户提供了测定来自食品生产、食品加工或食品服务场所的环境样品中李斯特菌的存在的手段，其中在当天或同一工作班次，例如在约12小时或更短或约6至10小时内获得结果。用于测定来自环境样品的李斯特菌的常规方法需要16至24小时或更长的孵育时间，并且因此结果不可在当天得到或至少不可在同一个工作班次得到。如本文所述，当天结果为食品工业提供了优势，例如，通过允许在食品产品离开设施之前检测李斯特菌。

在一方面，本文提供了一种检测环境样品中李斯特菌的方法。在一些实施方案中，所述样品来自低浓度环境。所述方法包括以下步骤：使用收集装置收集包含细胞的环境样品；将所述样品转移到含有约50ml或更少富集培养基的孵育容器中；将所述孵育容器中的细胞孵育约12小时或更短；裂解所述细胞以从所述细胞中释放核酸；以及进行靶向核酸序列的检测测定，用于扩增和检测从所述细胞中释放的李斯特菌核酸。

此方面的实施方案可以包括以下任选特征中的一个或多个：在一些实施方案中，所述方法进一步包括在裂解细胞之前浓缩所述细胞；在一些实施方案中，所述孵育容器含有约1ml至约50ml富集培养基(例如，肉汤，诸如中和缓冲液)；在一些实施方案中，所述富集培养基对李斯特菌的生长是选择性的；在一些实施方案中，所述富集培养基对李斯特菌的生长是非选择性的；在一些实施方案中，所述方法包括将所述孵育容器中的细胞孵育约4至约12小时；在一些实施方案中，所述收集装置是拭子、棉签(q-tip)或海绵；在一些实施方案中，所述收集装置是海绵；在一些实施方案中，从收集所述样品到检测李斯特菌核酸的时间是12小时或更短；在一些实施方案中，从收集所述样品到检测李斯特菌核酸的时间是8小时或更短；在一些实施方案中，所述检测测定是等温切口酶扩增反应(NEAR)测定；在一些实施方案中，所述检测测定是热稳定解旋酶依赖性等温扩增(tHDA)测定；在一些实施方案中，所述检测测定是分子方法，诸如实时聚合酶链式反应(qPCR)；在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过离心或过滤浓缩所孵育的细胞；在一些实施方案中，所述检测测定靶向的核酸序列来自从所述细胞中释放的RNA；在一些实施方案中，所述环境样品是从包含约2至约50个李斯特菌细胞或约5至约50个李斯特菌细胞的低浓度环境中收集的；在一些实施方案中，在孵育之前，所述环境样品包含约2至约50个李斯特菌细胞或约5至约50个李斯特菌细胞；在一些实施方案中，所述方法具有足够的灵敏度来检测具有少至7个李斯特菌细胞或少至3个李斯特菌细胞的环境样品中李斯特菌的存在；在一些实施方案中，所述收集装置是海绵，并且所述孵育容器含有约5ml至约50ml富集培养基(例如，肉汤)；在一些实施方案中，所述收集装置是拭子，并且所述孵育容器含有约1ml至约10ml富集培养基(例如，肉汤)。

在另一方面，本文提供了一种用于检测环境样品中李斯特菌的存在的试剂盒。所述试剂盒包括用于收集包含细胞的环境样品的收集装置；含有约50ml或更少富集培养基的孵育容器；以及任选地用于扩增和检测所述样品中的李斯特菌核酸的测定。

此方面的实施方案可以包括以下任选特征中的一个或多个：在一些实施方案中，所述试剂盒能够在从收集所述样品到检测所扩增的核酸的12小时或更短的时间内检测来自低浓度环境的李斯特菌；在一些实施方案中，所述孵育容器含有约1ml至约50ml富集培养基；在一些实施方案中，所述富集培养基对李斯特菌的富集是选择性的；在一些实施方案中，所述富集培养基是LESS Plus富集培养基；在一些实施方案中，所述收集装置是拭子、棉签或海绵；在一些实施方案中，所述测定是热稳定解旋酶依赖性等温扩增(tHDA)测定；在一些实施方案中，所述测定是等温切口酶扩增反应(NEAR)测定。

附图说明

当参考附图阅读以下详细描述时，可以更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点。

图1示出了从环境样品中检测李斯特菌的方法的示例性工作流程图。

具体实施方式

在以下描述中，给予许多具体细节以提供对实施方案的透彻理解。可以在没有一个或多个具体细节的情况下或者用其他方法、组分、材料等来实践所述实施方案。在其他情况下，没有详细示出或描述众所周知的结构、材料或操作，以避免模糊实施方案的各个方面。

在整个本说明书中对“一个实施方案(one embodiment)”、“一种实施方案(anembodiment)”或“实施方案(embodiments)”的提及意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在至少一种实施方案中。因此，在整个本说明书中各处短语“在一个实施方案中(in one embodiment)”或“在一个实施方案中(in an embodiment)”的出现不一定都指代相同的实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。

除非另有指示，否则当公开或要求保护任何类型的范围时，旨在单独公开或要求保护此类范围可能合理涵盖的每个可能数字，包括其中涵盖的任何子范围。此外，当公开或要求保护一个数值范围，申请人旨在单独反映此类范围可能合理涵盖的每个可能数字时，申请人还旨在公开一个范围来反映其中涵盖的任何和所有子范围和子范围的组合并且可以与之互换。

在术语“包括”及其变体在说明书和权利要求书中出现的情况下，这些术语不具有限制意义。

如本文所用，“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、“所述(the)”、“至少一个/种(a)”和“一个/种或多个/种”可互换使用。因此，例如，一种微生物可以解释为意指“一种或多种”微生物。

术语“和/或”意指一个或所有列出的要素或者任何两个或更多个列出的要素的组合。

如本文所用，术语“李斯特菌”是指革兰氏阳性杆状细菌，包括历史上公认的物种：格氏李斯特菌(L.grayi)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、氏李斯特菌(L.ivanovii)、单核细胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)和威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)；以及新描述的物种：水生李斯特菌(L.aquatica)、L.booriae、L.cornellensis、L.fleischmannii、L.floridensis、L.grandensis、马氏李斯特菌(L.marthii)、L.newyorkensis、L.riparia和罗氏李斯特菌(L.rocourtiae)。

收集

待测试样品的提供可以包括提供被怀疑含有靶微生物的样品。样品可以是任何可以包含如本文定义的靶微生物的样品。本方法包括收集环境样品(例如，用拭子/海绵从表面收集或从土壤、沉积物、污染物收集)。在食品/饮料安全行业中，环境采样包括从生产食品/饮料的环境(例如，制造厂或商用厨房)中收集样品，以确定所述环境是否含有有害细菌，诸如沙门氏菌(Salmonella)李斯特菌。生产食品/饮料的环境包括食品/饮料接触表面(例如，切片机、搅拌器、器具或传送带)和非食品接触表面(例如，地板、排放管(drain)、推车(cart)或设备外壳)。食品或饮料加工环境样品的非限制性例子包括食品处理表面样品(例如，传送带、刀片、切割表面、混合设备表面、过滤器、储存容器)、房室样品(例如，墙壁、地板、排放管、通风设备)和清洁设备(例如，软管、清洁工具)。环境采样很重要，因为环境污染-缺乏适当的监测和控制-可能导致成品食品/饮料产品的污染。

在一些实施方案中，可以分析源自各种食品或饮料来源的测试样品中靶微生物的存在或不存在。食物来源的非限制性例子包括生的或加工的肉、生的或加工的水果或蔬菜、非流体乳制品(例如，奶酪、黄油和冰淇淋)、坚果、香料、配料和糖浆。饮料来源的非限制性例子包括饮用水、果汁或蔬菜汁、奶和发酵饮料。经巴氏杀菌的食物或饮料也可以是合适的来源。

在一些实施方案中，环境样品来自低浓度环境，即具有低浓度李斯特菌细胞的环境(例如，表面)。如本文所用，术语“低浓度环境”意指从环境中收集的样品中约1至约50个李斯特菌细胞。在其他实施方案中，样品中李斯特菌的浓度是约2-50个细胞、5-50个细胞、5-25个细胞、少于或等于50个细胞、少于或等于40个细胞、少于或等于30个细胞、少于或等于20个细胞、少于或等于10个细胞或少于或等于5个细胞。在一些实施方案中，样品中李斯特菌的浓度是约1-50CFU、2-50CFU、5-50CFU、5-25CFU、少于或等于50CFU、少于或等于40CFU、少于或等于30CFU、少于或等于20CFU、少于或等于10CFU、或少于或等于5CFU。如本文所用，术语“CFU”意指菌落形成单位，其是微生物学中用于估计样品中活细菌(或真菌)细胞数量的单位。在其他实施方案中，环境样品来自这样的环境，使得样品中存在超过50个细胞和/或超过50CFU的李斯特菌。在一些实施方案中，所述环境使得环境样品中存在约1-100个细胞或更多和/或约1-100CFU或更多的李斯特菌。

本发明的方法和试剂盒可以包括收集装置。所述收集装置从表面收集环境样品。

在一些实施方案中，所述收集装置是海绵，例如环境海绵。例如，可以使用带有聚氨酯海绵的EZ Reach海绵采样器(World Bioproducts LLC)。在一些实施方案中，将海绵在肉汤中预湿，所述肉汤例如Letheen肉汤、LESS Plus肉汤(Neogen Corporation)、LESS肉汤或Demi-Fraser肉汤。在一些实施方案中，将海绵在中和缓冲液、缓冲蛋白胨水或培养基中预湿。在一些实施方案中，海绵上的预湿液体的体积是约5-25ml。海绵比其他采样装置有利地采集更大的表面积。

在一些实施方案中，所述收集装置是拭子。所述拭子可以由棉花或聚酯构成，并且可以在肉汤溶液中预湿。在一些实施方案中，将拭子在Letheen肉汤中预湿。在其他实施方案中，将拭子在中和缓冲液、缓冲蛋白胨水或培养基中预湿。在一些实施方案中，拭子上的预湿液体肉汤的体积是约1-10ml。在一些实施方案中，所述拭子作为含有Letheen肉汤溶液的聚丙烯管和帽以及具有聚丙烯杆和聚酯纤维尖端的拭子提供。在一些实施方案中，所述拭子作为带有Letheen肉汤的Veriswab采样器出售(World Bioproducts LLC)。在一些实施方案中，所述拭子作为带有Letheen肉汤的3M拭子采样器出售。在一些实施方案中，所述拭子作为3M Quick拭子出售。

在一些实施方案中，环境样品的收集包括用收集装置(例如，拭子或海绵)擦拭表面的区域。在一些实施方案中，所述区域是1x1英寸的区域、4x4英寸的区域或12x12英寸的区域。在一些实施方案中，擦拭包括在多个方向上擦拭。在一些实施方案中，所述表面是平坦表面。在一些实施方案中，所收集的环境样品包含约5至约50个李斯特菌细胞或约2至约50个李斯特菌细胞。在一些实施方案中，所收集的环境样品包含约5至约50CFU或约2至约50CFU的李斯特菌细胞。在一些实施方案中，所收集的环境样品包含超过50个李斯特菌细胞或超过50CFU的李斯特菌细胞。

孵育

在收集环境样品时，样品经受孵育以增加样品中可用于检测的细胞的数量(并且从而增加靶核酸的数量)。样品中活细胞与死细胞的相对比例将转化(在一些情况下显著地)为更大比例的活细胞。这在食品安全测试中是有利的，在食品安全测试中，环境表面上活细胞的存在是特别关注的。

在孵育容器中进行孵育。所述孵育容器可以是袋、瓶或其他合适的容器。在一些实施方案中，所述孵育容器是袋，例如Whirl-Pak袋。在一些实施方案中，所述孵育容器配备有摇床装置，即摇床孵育器。

所述孵育容器装有具有环境样品的富集培养基/肉汤。通过将收集装置(例如，海绵或拭子)直接放置到孵育容器中使得收集装置接触肉汤，可以将环境样品转移到孵育容器中。所述富集培养基/肉汤可以对李斯特菌的富集是选择性的。例如，所述富集肉汤可以是Letheen肉汤、LESS Plus肉汤(Neogen Corporation)、LESS肉汤或Demi-Fraser肉汤。在一些实施方案中，所述富集肉汤包含以下组分中的一种或多种(例如，大部分或全部)：酪蛋白的酶消化物、大豆粉的酶消化物、酵母提取物、右旋糖、氯化钠、磷酸一钾、磷酸二钾、磷酸二钠、环己酰亚胺、萘啶酸、吖啶黄和水。在一些实施方案中，所述富集肉汤包含3-吗啉代丙磺酸、氯化锂和碳酸钠中的一种或多种。在一些实施方案中，所述富集肉汤包含以下组分中的一种或多种(例如，大部分或全部)：胰蛋白酶解酪蛋白大豆肉汤、酵母提取物、磷酸一钾、磷酸二钠、丙酮酸钠、盐酸吖啶黄、萘啶酸、环己酰亚胺和水。

使用低体积的富集肉汤，即约50ml或更少(例如，约1ml至约50ml)。在一些实施方案中，孵育容器中富集肉汤的体积是约1ml至约50ml，例如约5ml、约10ml、约25ml或约50ml。在一些实施方案中，孵育容器中富集肉汤的体积是约5ml至约50ml。在一些实施方案中，孵育容器中富集肉汤的体积是约1ml至约10ml。在一些实施方案中，当收集装置是海绵时，使用约5ml至约50ml、约5ml至约25ml、或约25ml至约50ml(例如，约25ml)富集肉汤。在一些实施方案中，当收集装置是拭子时，使用约1ml至约10ml、约1ml至约5ml、或约5ml至约10ml(例如，约5ml)富集肉汤。低体积的富集肉汤导致较高浓度的测试分析物，这有助于在较短的富集期内以高灵敏度(低检测限(LOD))检测李斯特菌。

将富集肉汤中的样品在富集容器中孵育约12小时或更短，例如约4至约12小时或约6至约12小时的孵育时间段。在一些实施方案中，所述孵育期是约4-10小时、约4-8小时、约6-10小时、或约6-8小时。在一些实施方案中，所述孵育期是约7-10小时或约7-9小时。在一些实施方案中，在约36℃的温度下进行孵育。

在一些实施方案中，将一部分环境样品(例如，约1ml或5ml)孵育更长时间(最多24h)并且用于培养确认方法。所述培养确认方法可以包括获得一部分样品(例如，1ml或5ml)并且将所述部分与额外的肉汤(例如，LESS Plus富集肉汤或李斯特菌指示肉汤)合并，并且划线到培养基(例如，选择性显色琼脂)上。

样品裂解

在一些实施方案中，所孵育的样品经受浓缩以增加单位体积液体中细胞的浓度。合适的浓缩方法包括过滤、离心和使用磁珠。可以将去除了液体培养基/肉汤(上清液)的浓缩细胞重悬在较小体积的液体(例如，裂解缓冲液)中。

在一些实施方案中，将一等分试样(50至250μL)的孵育样品直接添加到裂解缓冲液中，无需任何进一步的浓缩步骤。

在孵育和或浓缩后，样品经受裂解以释放可通过李斯特菌检测测定检测的核酸。裂解可以通过合适的方法进行，诸如热裂解、化学裂解、机械裂解等。在一些实施方案中，将细胞悬浮在包含裂解细胞的裂解酶的裂解缓冲液中。在一些实施方案中，将细胞悬浮在裂解缓冲液中并且在检测测定期间保留在缓冲液中。例如，可以将细胞悬浮在包含硫酸钠、硫酸镁、聚(环氧乙烷)辛基苯基醚、磷酸钾、溶菌酶和蛋白酶K的裂解缓冲液(NeogenCorporation)中。

检测

在检测李斯特菌的存在的测定中检测裂解后释放的核酸。在一些实施方案中，所述测定利用DNA扩增。在一些实施方案中，所述测定使用逆转录酶从靶RNA产生cDNA。在一些实施方案中，所述测定是等温切口酶扩增反应(NEAR)测定。在一些实施方案中，所述测定是热稳定解旋酶依赖性等温扩增(tHDA)测定。在一些实施方案中，所述测定利用荧光检测。在一些实施方案中，所述测定是定量聚合酶链式反应(qPCR)测定。在一些实施方案中，所述测定是环介导的等温扩增(LAMP)测定、基于核酸序列的扩增(NASBA)测定、链置换扩增(SDA)测定、多重置换扩增(MDA)测定、滚环扩增(RCA)测定或网状分枝扩增方法(RAM)测定。

在一些实施方案中，所述测定在少于约4小时，例如约2小时或更少或约1小时或更少内提供结果。

在一些实施方案中，从样品收集到检测测定结果的整个检测过程在约12小时或更少，例如约10小时或更少、约9小时或更少、约8小时或更少、约7小时或更少、或约6小时或更少内完成。在一些实施方案中，从样品收集到检测测定结果的整个检测过程在约6至约12小时，例如约6-10小时、约8-10小时、约7-9小时、或约6-8小时内完成。

用于等温检测和扩增核酸(例如，RNA)的方法和试剂描述于国际专利申请公开号WO 2009/012246中，将所述专利申请其通过引用整体并入本文。简言之，扩增核酸靶序列的方法依赖于产生切口(nicking)和延伸反应，以在比传统扩增反应(例如像链置换扩增反应)更短的时间范围内扩增更短的序列。本发明的实施方案包括，例如，在等温条件下仅使用两种模板(以扩增靶序列)、一种或两种切口酶和一种聚合酶的反应。在示例性实施方案中，所述聚合酶和切口酶是嗜热的，并且反应温度显著低于杂交靶区域的解链温度。所述切口酶仅在双链双链体中的一条链中产生切口，使得不需要像常规链置换扩增的情况那样掺入经修饰的核苷酸。本发明的方法不需要初始热变性步骤。由于反应简单，因此在示例性实施方案中，反应非常容易进行，不需要特殊的设备，诸如热循环仪，并且可以在仅约2.5至约10分钟内从基因组DNA扩增20-30聚体产物108至约1000倍。所述方法能够在同时逆转录步骤中扩增RNA。

李斯特菌测定是一种等温扩增和检测系统，所述系统靶向核糖体RNA(rRNA)，所述核糖体RNA是一种高拷贝数靶标。甚至单一李斯特菌细胞的裂解可以释放大约1,000至10,000个拷贝的rRNA。因为裂解反应以小体积进行，因此目标浓度足够高，使得随后转移到/>测定试剂管的5-100μL等分试样(例如，50微升)的裂解物将含有足够数量的用于检测的靶rRNA分子。

美国专利号7,662,594中描述了用于等温检测和扩增核酸的其他方法，将所述专利申请其通过引用整体并入本文。这些方法描述了核酸(例如，RNA)的解旋酶依赖性扩增。本发明的实施方案包括，例如，向李斯特菌RNA中添加包含逆转录酶、解旋酶(例如，热稳定UVrD解旋酶)、任选地单链结合蛋白、寡核苷酸引物和一种或多种聚合酶的混合物；以及逆转录所述RNA以形成cDNA，并且通过解旋酶依赖性扩增来扩增所述cDNA。

在一些实施方案中，通过自动读取器读取测定结果。在其他实施方案中，通过酶检测方法或凝胶电泳检测测定结果。

在本发明方法的一些实施方案中，所述测定检测从低浓度环境中的李斯特菌细胞释放的靶核酸。所述测定的检测(下)限(LOD)可以是约7个细胞(即，环境样品中7个李斯特菌细胞)，或LOD可以是约5个细胞，或LOD可以是约3个细胞，或LOD可以是约2个细胞。在其他实施方案中，所述测定的LOD可以使得所述测定能够从环境中收集的样品中检测出少至1-10个细胞、1-5个细胞、2-5个细胞、5-10个细胞、5-15个细胞、或10-20个细胞，例如少至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个李斯特菌细胞。在一些实施方案中，所述测定的LOD可以是约7CFU(即，环境样品中7CFU个李斯特菌细胞)，或LOD可以是约5CFU，或LOD可以是约3CFU，或LOD可以是约2CFU。在其他实施方案中，所述测定的LOD可以使得所述测定能够从环境中收集的样品中检测出少至1-10CFU、1-5CFU、2-5CFU、5-10CFU、5-15CFU或10-20CFU，例如少至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20CFU的李斯特菌细胞。

试剂盒

本发明的方面包括具有本文所述方法中使用的组分的试剂盒。试剂盒可以包括以下中的一种或多种：收集装置、具有肉汤的收集装置、孵育容器、富集培养基、培养箱、浓缩设备和供应品(离心机、离心管、过滤器、磁珠)、裂解缓冲液、以及测定设备和试剂(引物、探针、dNTP、酶、光学读取器等)。

在一些实施方案中，一种用于检测环境样品中李斯特菌的存在的试剂盒，所述试剂盒包括：用于收集包含细胞的环境样品的收集装置；含有约50ml或更少富集培养基的孵育容器；以及用于扩增和检测所述样品中的李斯特菌核酸的测定。

在一些实施方案中，所述孵育容器含有约1ml至约50ml富集培养基。在一些实施方案中，所述富集培养基对李斯特菌的富集是选择性的。在一些实施方案中，所述富集培养基是LESS Plus富集培养基。在一些实施方案中，所述收集装置是拭子、棉签或海绵。在一些实施方案中，所述测定是热稳定解旋酶依赖性等温扩增(tHDA)测定。在一些实施方案中，所述测定是等温切口酶扩增反应(NEAR)测定。

实施例

实施例1

用于从环境样品中检测李斯特菌的示例性方法(诸如图1中所示)如下：

1)用环境海绵或拭子擦抹表面以收集环境样品。

2)将海绵放置在含有2-25ml LESS Plus富集肉汤或非选择性肉汤的Whirl-袋中。

3)将样品在35℃下孵育约4-6小时。(在富集肉汤中留出1ml样品用于培养确认)

4)如果希望，则通过离心和去除上清液来浓缩样品中的细胞。

5)将细胞重悬在小体积的裂解缓冲液中，或者取一等分试样的富集肉汤并且裂解细胞。

6)在(NEAR)或tHDA测定中运行样品(或其等分试样)(约1小时)来检测李斯特菌。

从样品收集到李斯特菌检测的总时间是约6-8小时。

平行地，示例性培养确认方法可以用于验证检测的可靠性：

1)在富集肉汤中获得1ml样品。

2)添加9-10mL LESS Plus富集肉汤或李斯特菌指示肉汤。将样品在35℃下孵育约16-24小时。

3)划线到选择性/显色琼脂上。

实施例2

李斯特菌当天环境样品研究

使用以下材料：

单核细胞增多性李斯特菌ATCC 19115，

ANSR李斯特菌测定试剂盒，

用Letheen中和缓冲液预湿的环境拭子和海绵，

磷酸盐缓冲盐水(PBS)、胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)、LESS Plus富集肉汤、改良琼脂(MOX)。

环境样品制备：

在制造设施中使用环境拭子(Letheen拭子)和海绵(EZ海绵)擦抹环境表面(池排放管(sink drain)、地漏)(使用拭子擦抹1X1英寸表面以及使用海绵擦抹4X4英寸表面)，使得拭子和海绵被天然微生物群落污染。用低水平的单核细胞增多性李斯特菌(2-7CFU)接种受污染的拭子/海绵，并且在冰箱中保持3天以模拟用于李斯特菌细胞的推荐冷应激程序。

李斯特菌当天程序：

在4℃下保持3天以模拟冷应激后，将10mL(对于拭子)或25mL(对于海绵)LESSPlus富集肉汤添加到拭子或海绵中，充分混合以将靶生物体释放并且提取到肉汤中。将样品在35℃下孵育6小时。在富集期结束时，取一等分试样(1mL)用于以5000g离心10min。去除上清液，并且添加500μL ANSR裂解缓冲液并且进行裂解步骤。对于没有浓缩步骤的测试样品，在富集期结束时，取一等分试样(50μL)，并且添加450μL ANSR裂解缓冲液用于裂解步骤。

ANSR李斯特菌程序：

然后通过等温ANSR李斯特菌测定对样品进行检测。简言之，将样品在37℃下裂解10min，然后在80℃下进行热灭活步骤20min。添加一等分试样(50μL)的裂解物以再水合LRN试剂，用于在ANSR读取器中检测。在表1中，阳性ANSR李斯特菌结果标注为总检出样品比总测试样品(#阳性/#测试)，表明环境样品中存在或不存在李斯特菌。

培养确认程序：

继续将剩余的拭子和海绵样品与肉汤在35℃下孵育总共24h，然后划线到MOX板上，用于观察和计数典型的李斯特菌菌落。在表1中，阳性ANSR培养结果标注为总检出样品比总测试样品(#阳性/#测试)，表明环境样品中存在或不存在李斯特菌。

结果和结论：

表1示出了研究结果。

在存在背景微生物群落的情况下，使用拭子和海绵进行6小时富集(通过离心步骤浓缩或不浓缩)的李斯特菌当天测定有效检测出低水平(2-7CFU)的李斯特菌。所述测定显示出与需要样品富集24小时的培养方法可比较的结果。因此，出人意料地发现，此实施例2的李斯特菌当天测定可以用于在样品收集的当天或同一工作班次内检测来自环境表面(包括低浓度环境)的李斯特菌。

表1：

Claims (27)

1.一种检测环境样品中李斯特菌(Listeria)的方法，所述方法包括以下步骤：

使用收集装置收集包含细胞的环境样品；

将所述样品转移到含有约50ml或更少富集培养基的孵育容器中；

将所述孵育容器中的细胞孵育约12小时或更短；

裂解所述细胞以从所述细胞中释放核酸；以及

进行靶向核酸序列的检测测定，用于扩增和检测从所述细胞中释放的李斯特菌核酸。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括在裂解所述细胞之前浓缩所述细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述孵育容器含有约1ml至约50ml富集培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述富集培养基对李斯特菌的生长是选择性的。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述富集培养基对李斯特菌的生长是非选择性的。

6.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括将所述孵育容器中的细胞孵育约4至约12小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述收集装置是拭子、棉签或海绵。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述收集装置是海绵。

9.根据权利要求1所述的方法，其中从收集所述样品到检测所扩增的核酸的时间是12小时或更短。

10.根据权利要求8所述的方法，其中从收集所述样品到检测所扩增的核酸的时间是8小时或更短。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测测定是热稳定解旋酶依赖性等温扩增(tHDA)测定。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测测定是等温切口酶扩增反应(NEAR)测定。

13.根据权利要求2所述的方法，其中所孵育的细胞的浓缩包括离心或过滤。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述环境样品是从包含约2至约50个李斯特菌细胞的低浓度环境中收集的，并且其中所述检测测定检测所述样品中的李斯特菌。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述低浓度环境包含约5至约50个李斯特菌细胞。

16.根据权利要求1所述的方法，其中在孵育之前，所述环境样品包含约2至约50个李斯特菌细胞，并且其中所述检测测定检测所述样品中的李斯特菌。

17.根据权利要求15所述的方法，其中在孵育之前，所述环境样品包含约5至约50个李斯特菌细胞。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测测定靶向的核酸序列来自从所述细胞中释放的RNA。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法具有足够的灵敏度来检测具有少至7个李斯特菌细胞的环境样品中李斯特菌的存在。

20.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法具有足够的灵敏度来检测具有少至3个李斯特菌细胞的环境样品中李斯特菌的存在。

21.根据权利要求3所述的方法，其中所述收集装置是海绵，并且所述孵育容器含有约5ml至约50ml富集培养基。

22.根据权利要求3所述的方法，其中所述收集装置是拭子，并且所述孵育容器含有约1ml至约10ml富集培养基。

23.一种用于检测环境样品中李斯特菌的存在的试剂盒，所述试剂盒包括：

用于收集包含细胞的环境样品的收集装置；

含有约50ml或更少富集培养基的孵育容器；以及

用于扩增和检测所述样品中的李斯特菌核酸的测定；

其中所述试剂盒能够在从收集所述样品到检测所扩增的核酸的12小时或更短的时间内检测来自低浓度环境的李斯特菌。

24.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述孵育容器含有约1ml至约50ml富集培养基。

25.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述富集培养基是LESS Plus富集培养基。

26.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述收集装置是拭子、棉签或海绵。

27.根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述测定是热稳定解旋酶依赖性等温扩增(tHDA)测定或等温切口酶扩增反应(NEAR)测定。