KR101120270B1

KR101120270B1 - 미생물 검출법 및 미생물 검출 키트

Info

Publication number: KR101120270B1
Application number: KR1020097008647A
Authority: KR
Inventors: 신이치 요시다; 다카시 소에지마
Original assignee: 모리나가 뉴교 가부시키가이샤
Priority date: 2007-08-16
Filing date: 2008-08-01
Publication date: 2012-03-06
Also published as: CA2666448C; EP2077334A4; CN101617057A; RU2410440C1; AU2008287928B2; RU2009120527A; KR20090078333A; CA2666448A1; JP4378537B2; AU2008287928A1; US8221975B2; EP2077334B1; CN101617057B; US20120277121A1; WO2009022558A1; JPWO2009022558A1; NZ576113A; EP2077334A1; US20110053790A1

Abstract

이하의 공정에 의해 피검 시료 중의 미생물의 생균을 검출한다. a) 상기 피검 시료에, 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 DNA를 가교하는 가교제를 첨가하는 공정, b) 가교제를 첨가한 피검 시료에 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사 처리를 행하는 공정, c) 광 조사 처리한 피검 시료에 함유된 가교제를 제거하는 공정, d) 가교제를 제거한 피검 시료에 배지를 첨가하여 보온하는 공정, e) 보온한 피검 시료에 다시 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 DNA를 가교하는 가교제를 첨가하는 공정, f) 가교제를 첨가한 피검 시료에 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사 처리를 행하는 공정, g) 상기 피검 시료로부터 DNA를 추출하고, 추출된 DNA의 타겟 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 공정, 및 h) 증폭 산물을 해석하는 공정.

미생물 검출법, 미생물 검출 키트, 증폭 산물, PCR 증폭, DNA 마이크로어레이법

Description

미생물 검출법 및 미생물 검출 키트 {METHOD AND KIT FOR DETECTION OF MICROORGANISM}

본 발명은 식품이나 생체 시료 중에 포함되는 미생물, 공업용수나 수돗물 등의 환경 중에 포함되는 미생물의 검출법, 및 미생물 검출 키트에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 식품이나 생체 시료, 공업용수나 수돗물 등의 환경 중에 포함되는 미생물의 생균의 선택적인 검출이 가능한 검출법 및 미생물 검출 키트에 관한 것이다.

식품이나 생체 시료, 또는 환경 중의 일반 생균수의 측정에는, 종래 평판 배양법이 이용되어 왔다. 그러나, 평판 배양법은 결과가 얻어지기까지 2 일간 정도의 시간이 소요된다.

식품의 살균 기술이나 가공 기술이 향상됨으로 인해, 미량으로도 피검 시료 중에 존재하는 미생물의 생사 상태를 식별할 필요성이 높아지고 있다. 특히 식품 위생 검사나 임상 검사 영역에서는, 세균의 신속 검출법으로서 PCR법에 의해 각 세균의 특이 유전자를 시각적으로 파악되는 양까지 증폭하여, 각 세균의 존재 유무를 판별 및 정량하는 시도가 이루어지고 있다. 그러나, 세균의 DNA를 타겟으로 한 경우, 피검 시료에 원래 포함되어 있는 사균의 백 그라운드까지 검출되기 때문에, PCR에서 양성 판정이 나온 경우 반드시 살아있는 세균의 존재를 시사하고 있다고는 할 수 없었다. 이 때문에, 식품 위생이나 임상 검사 분야에서는 PCR은 고감도ㆍ신속함에도 보급되어 있지 않은 것이 현실이었다.

최근에는 mRNA를 타겟으로 하여 역전사 효소에 의해 cDNA를 제조한 후, 각 세균의 특이 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고, 피검 시료 중 생균만을 검출ㆍ정량하는 시도가 이루어지고 있다. 그러나 이 방법에서는 사균의 mRNA의 역전사 그 자체가 저해되는 것은 아니고, 10⁴ cfu/ml 또는 10⁴ cfu/g 이상의 사균이 피검 시료에 포함되어 있는 경우 사균의 백 그라운드를 검출해 버리기 때문에, 생사의 판별법으로는 충분하다고는 할 수 없었다.

구체적으로는, PCR법을 이용한 세균 등의 미생물의 생사를 판별하는 방법으로는, 특허 문헌 1 또는 특허 문헌 2에 기재된 방법이 개시되어 있다. 그러나 이들 PCR법을 이용한 세균 등의 미생물의 생사를 판별하는 방법에는 이하에 나타낸 바와 같은 문제가 남겨져 있었다.

상기 특허 문헌 1의 기술은 100 ℃, 10 내지 30 분의 고온 장시간 가열 살균이 실시된 일부 끊인(비등) 식품 중에서의 사균이나, 에탄올 살균이나 포름알데히드 살균을 실시한 식품 중 미생물의 식별을 예시하고 있지만, 특히 후자에 대해서는 실제 그러한 살균 처리가 실시되고 있는 식품은 존재하지 않는다. 또한, 현재 식품업계에서 주류를 이루는 살균 방법인 저온 유지 살균(LTLT 살균), 고온 단시간(HTST 살균) 또는 초고온 순간 가열 살균(UHT 살균)이 실시된 식품 중 살아있는 미생물만의 검출이나, 항생 물질 투여를 받은 감염증 환자에 있어서의 임상 검체 중 살아있는 특정 병원균 등의 검출은 상정되지 않았다. 또한, 특허 문헌 1의 기술에서는, 피검 시료 중에 사균 백 그라운드가 10⁴ cfu/ml 이상의 농도로 존재하는 식품이나 임상 검체인 경우, 사균 유래의 PCR 최종 증폭 산물량이 검출 한계 이상이 되어, 피검 시료의 PCR 양성 반응이 생균 유래인지 사균 유래인지 식별이 불가능하다.

또한, 상기 특허 문헌 2의 기술은, 사(死)세포의 RNA/DNA 몰비가 생세포의 그것과 비교하여 상대적으로 저하되는 것을 이용한 생균과 사균을 식별하는 방법을 개시한 것이다. 이 방법은, 총 RNA를 추출하고 역전사 반응을 이용하여 상보적 DNA를 제조하고, 그 후 PCR을 행하여 그 Ct값을 산출하고, 별도로 제작한 검량선에 의해 RNA의 몰 농도를 구하고, 한편으로 이 RNA에 상당하는 염색체 DNA의 영역을 PCR에 의해 증폭하여 Ct값을 구하고, 상기 검량선으로부터 염색체 DNA의 몰 농도를 산출함으로써 RNA/DNA의 몰비를 구하는 것이다. 즉, 상기 조작은 번잡한 총 RNA 검출을 행할 필요가 있고, 역전사 반응-PCR이라는 2 단계를 수반하기 때문에, 정량성이나 신속성에서 DNA를 타겟으로 한 통상적인 PCR보다 열악하다. 또한, 생균에서는 RNA가 연속적으로 생산되는 한편, 사균 유래의 RNA는 조기에 분해되기 때문에 안정성이 부족하다. 또한, 고농도의 사균을 포함하는 식품이나 임상 검체에서는 그 1/10 농도의 생균밖에 검출할 수 없다. 따라서, 신속, 고감도, 또한 정확성이 요구되는 식품 위생 검사나 임상 검사에서는 적용이 곤란하였다.

특허 문헌 1: 일본 특허 공표 제2003-530118호 공보

특허 문헌 2: 국제 공개 제2002/052034호 공보

<발명의 개시>

<발명이 해결하고자 하는 과제>

본 발명은 식품이나 생체 시료 중에 포함되는 미생물의 생균(live cell)(Viable-and-Culturable cell)을 사균(Dead cell)이나 손상균(Injured cell 또는 Viable-but-Non Culturable cell; 「VNC cell」)에 비해 선택적으로 검출하는 방법, 즉 배양법의 특성을 그대로 이어받은 신속 대체 검출법, 및 동일한 방법을 실시하기 위한 키트를 제공하기 위한 것이다.

<과제를 해결하기 위한 수단>

본 발명자들은 각종 살균 방법에 적용 가능한 검출 감도가 높은 식품 위생 검사에 알맞은 미생물의 생사 판별법, 및 병원이나 임상 현장에서 감염증 환자에서의 특정 병원균의 검출도 가능한 방법에 대해서 예의 검토한 결과, 피검 시료 중 미생물의 생균 및 손상균을 판별하는 방법에서, 피검 시료를 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 DNA를 가교하는 가교제로 처리하여 350 nm 내지 700 nm의 파장을 갖는 광 조사를 행하고, 일단 상기 가교제를 제거한 후, 피검 시료 중에 포함되는 미생물의 배양에 알맞은 배지를 첨가하여 일정 시간 보온하고, 다시 상기 가교제로 처리하여 350 nm 내지 700 nm의 파장을 갖는 광 조사를 행하고, 이어서 미생물 중의 염색체 DNA를 선택적으로 핵산 증폭 반응에 의해 증폭함으로써, 상기 판별을 신속하게 행할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 피검 시료 중의 미생물의 생균을 검출하기 위한 방법으로서, 이하의 공정을 포함하는 방법을 제공한다.

a) 상기 피검 시료에, 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 DNA를 가교하는 가교제를 첨가하는 공정,

b) 가교제를 첨가한 피검 시료에 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사 처리를 행하는 공정,

c) 광 조사 처리한 피검 시료에 함유된 가교제를 제거하는 공정,

d) 가교제를 제거한 피검 시료에 배지를 첨가하여 보온하는 공정,

e) 보온한 피검 시료에 다시 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 DNA를 가교하는 가교제를 첨가하는 공정,

f) 가교제를 첨가한 피검 시료에 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사 처리를 행하는 공정,

g) 상기 피검 시료로부터 DNA를 추출하고, 추출된 DNA의 타겟 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 공정, 및

h) 증폭 산물을 해석하는 공정.

상기 방법은 상기 증폭 산물의 해석을, 미생물의 표준 시료를 이용하여 작성된 미생물량 및 증폭 산물과의 관련을 나타내는 표준 곡선을 이용하여 행하는 것을 바람직한 양태로 하고 있다.

또한, 상기 방법은 상기 핵산 증폭법이 PCR법, LAMP법, SDA법, LCR법 또는 DNA 마이크로어레이법인 것을 바람직한 양태로 하고 있다.

또한 상기 방법은 상기 PCR법을 리얼 타임 PCR법에 의해 행하고, PCR과 증폭 산물의 해석을 동시에 행하는 것을 바람직한 양태로 하고 있다.

또한 상기 방법은 상기 피검 시료가 식품, 혈액 시료, 뇨 시료, 수액 시료, 활액 시료, 흉수 시료, 공업용수, 수돗물, 지하수, 하천수 또는 빗물 중 어느 것인 것을 바람직한 양태로 하고 있다.

또한 상기 방법은 상기 가교제가 에티듐 모노아자이드(ethidium monoazide), 에티듐 디아지드(ethidium diazide), 프솔라렌(psolaren), 4,5',8-트리메틸 프솔라렌(4,5',8-trimethyl psolaren) 및 8-메톡시 프솔라렌(8-methoxy psolaren)에서 선택되는 것을 바람직한 양태로 하고 있다.

또한 상기 방법은 상기 타겟 영역이 50 내지 5000 염기의 영역인 것을 바람직한 양태로 하고 있다.

또한 상기 방법은 상기 미생물이 병원성 세균인 것을 바람직한 양태로 하고 있다. 이 양태에 있어서는, 상기 타겟 영역이 병원 유전자인 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 피검 시료 중의 미생물의 생균을 핵산 증폭법에 의해 검출하기 위한 키트로서, 하기 요소를 포함하는 키트를 제공한다:

350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 DNA를 가교하는 가교제, 배지, 및 검출 대상의 미생물 DNA의 타겟 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭하기 위한 프라이머.

상기 키트는 상기 핵산 증폭법이 PCR법, LAMP법, SDA법, LCR법 또는 DNA 마이크로어레이법인 것을 바람직한 양태로 하고 있다.

또한 상기 키트는 상기 가교제가 에티듐 모노아자이드(ethidium monoazide), 에티듐 디아지드(ethidium diazide), 프솔라렌(psolaren), 4,5',8-트리메틸 프솔라렌(4,5',8-trimethyl psolaren) 및 8-메톡시 프솔라렌(8-methoxy psolaren)에서 선택되는 것을 바람직한 양태로 하고 있다.

도 1은 가교제(EMA)의 단회 처리 및 다단계 처리에 의한 리스테리아균(생균 및 손상균)의 hlyA-PCR의 최종 증폭 산물 밴드 강도를 나타내는 전기 영동 사진. 생(生): 리스테리아 생균, 손(損): 리스테리아 손상균

도 2는 가교제(EMA)의 단회 처리 및 다단계 처리에 의한 엔테로박터ㆍ사카자키균(생균 및 손상균)의 ompA-PCR의 최종 증폭 산물 밴드 강도를 나타내는 전기 영동 사진. 생: 엔테로박터ㆍ사카자키균 생균, 손: 엔테로박터ㆍ사카자키균 손상균

도 3은 가교제(EMA)의 단회 처리 및 다단계 처리에 의한 엔테로박터ㆍ사카자키균(생균 및 손상균)의 MMS-PCR의 최종 증폭 산물 밴드 강도를 나타내는 전기 영동 사진. 생: 엔테로박터ㆍ사카자키균 생균, 손: 엔테로박터ㆍ사카자키균 손상균

도 4는 가교제(EMA)의 단회 처리 및 다단계 처리에 의한 살모넬라균(생균 및 손상균)의 invA-PCR의 최종 증폭 산물 밴드 강도를 나타내는 전기 영동 사진. 생: 살모넬라균 생균, 손: 살모넬라균 손상균

도 5는 가교제(EMA)의 단회 처리 및 다단계 처리에 의한 살모넬라균(생균 및 손상균)의 enterotoxin-PCR의 최종 증폭 산물 밴드 강도를 나타내는 전기 영동 사 진. 생: 살모넬라균 생균, 손: 살모넬라균 손상균

<발명을 실시하기 위한 최선의 양태>

다음에, 본 발명의 바람직한 실시 형태에 대하여 상세히 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 바람직한 실시 형태로 한정되지 않고, 본 발명의 범위 내에서 자유롭게 변경할 수 있는 것이다. 또한, 본 명세서에 있어서 백분율은 특별히 언급이 없는 한 질량에 의한 표시이다.

본 발명의 방법에 있어서는 그의 검출 대상으로서, 결과적으로 증폭하는 것이 가능하다면, 핵산 전반, 구체적으로는 1개쇄 DNA, 2개쇄 DNA, 1개쇄 RNA 및 2개쇄 RNA를 예시할 수 있고, 그 중에서도 DNA를 검출 대상으로 하는 것이 바람직하고, 2개쇄 DNA가 특히 바람직하다.

<1> 본 발명의 방법

본 발명의 방법은 피검 시료 중의 미생물의 생균을 검출하기 위한 방법으로서, 이하의 공정을 포함하는 방법이다.

e) 보온한 피검 시료에 다시 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 DNA 를 가교하는 가교제를 첨가하는 공정,

h) 증폭 산물을 해석하는 공정.

본 명세서에서 「피검 시료」란, 그 중에 존재하는 미생물의 생균을 검출하는 대상이고, 핵산 증폭법에 의한 염색체 DNA의 특정 영역의 증폭에 의해 존재를 검출하는 것이 가능한 것이면 특별히 제한되지 않지만, 식품, 혈액 시료, 뇨 시료, 수액 시료, 활액 시료, 흉수 시료, 공업용수, 수돗물, 지하수, 하천수 또는 빗물 등을 들 수 있다. 특히 식품으로서는, 청량 음료, 탄산 음료, 영양 음료, 과즙 음료, 유산균 음료 등의 음료(이들 음료의 농축 원액 및 제조용 분말을 포함함); 아이스크림, 아이스 샤베트, 빙수 등의 빙과; 가공유, 유음료, 발효유, 버터 등의 유제품; 경장 영양 식품, 유동식, 육아용 밀크, 스포츠 음료; 특정 보건용 식품, 건강 보조 식품 등의 기능성 식품 등이 바람직하다. 본 발명에 있어서는, 피검 시료는 상기와 같은 제품 또는 생체 시료 그 자체일 수도 있고, 이것을 희석 또는 농축시킨 것, 또는 본 발명의 방법에 의한 처리 이외의 전처리를 행한 것일 수도 있다. 상기 전처리로서는, 가열 처리, 여과, 원심 분리 등을 들 수 있다.

또한, 피검 시료 중에 존재하는 미생물 이외의 세포, 단백질 콜로이드 입자, 및 지방 등의 협잡물은 효소 처리 등에 의해 제거 또는 감소시킬 수도 있다. 상기 피검 시료 중에 존재하는 미생물 이외의 세포로서는, 피검 시료가 우유, 유제품, 우유 또는 유제품을 원료로 하는 식품인 경우에는, 소 백혈구 및 유선 상피 세포 등을 들 수 있다. 또한, 피검 시료가 혈액 시료, 뇨 시료, 수액 시료, 활액 시료 또는 흉수 시료 등의 생체 시료인 경우에는, 적혈구, 백혈구(과립구, 호중구, 호염기구, 단구, 림프구 등) 및 혈소판 등을 들 수 있다.

상기 효소로서는, 상기 협잡물을 분해할 수 있고, 또한 검출 대상인 미생물의 생균을 손상시키지 않는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 지질 분해 효소 및 단백질 분해 효소를 들 수 있다. 상기 효소는 1종류의 효소를 단독으로 사용할 수도 있고, 2종류 또는 그 이상의 효소를 병용할 수도 있지만, 지질 분해 효소 및 단백질 분해 효소를 둘다 이용하는 것이 바람직하다.

지질 분해 효소로서는 리파제, 포스파타제 등을, 단백질 분해 효소로서는 프로테이나제 K, 프로나제 등을 들 수 있다.

「미생물」은 본 발명의 방법에 의해 검출되는 대상이고, 핵산 증폭법에 의해 검출하는 것이 가능하고, 또한 가교제의 미생물에 대한 작용이 생균과 사균이나 손상균에서 다른 것이면, 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 세균, 사상균, 효모 등을 들 수 있다. 세균으로서는, 그람 양성균 및 그람 음성균이 모두 포함된다. 그람 양성균으로는, 포도구균(스타필로코커스ㆍ에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)) 등의 스타필로코커스속 세균, 스트렙토코커스속 세균, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 등의 리스테리아속 세균, 바실루스ㆍ세레우스(Bacillus cereus) 등의 바실루스속 세균, 마이코박테리움속 세균, 보툴리누 스균(클로스트리디움ㆍ보툴리눔), 웰치(welchii)균(클로스트리디움ㆍ퍼프린젠스) 등의 클로스트리디움속 세균 등을 들 수 있다. 또한, 그람 음성균으로서는, 에쉐리치아 콜리(Escherichia coli) 등의 에쉐리치아속 세균, 엔테로박터ㆍ사카자키(Enterobacter sakazakii) 등의 엔테로박터속 세균, 시트로박터ㆍ코세리(Citrobacter koseri) 등의 시트로박터속 세균, 클렙시엘라ㆍ옥시토카(Klebsiella oxytoca) 등의 클렙시엘라속 세균으로 대표되는 장내 세균군, 살모넬라속 세균, 비브리오속 세균, 슈도모나스속 세균 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 「생균」(live cell)이란, 일반적으로 바람직한 배양 조건에 의해 배양하였을 때에 증식이 가능하며, 그 미생물이 갖는 대사 활성을 나타내는 상태(Viable-and-Culturable state)이고, 세포벽의 손상은 거의 없는 미생물을 말한다. 또한, 여기서 말하는 대사 활성이란 ATP 활성이나 에스테라제 활성을 예시할 수 있다.

「사균」(Deadcell)이란, 바람직한 배양 조건에 의해 배양한 경우이더라도 증식은 불가능하며, 대사 활성을 나타내지 않는 상태(Dead)의 미생물이다. 또한, 세포벽의 구조는 유지되고 있지만, 세포벽 자체는 고도로 손상을 받았고, 요오드화 프로피듐과 같은 약투과성 핵 염색제 등이 세포벽을 투과하는 상태이다.

「손상균」(Injured cell 또는 Viable-but-Non Culturable cell)이란, 인위적 스트레스 또는 환경적 스트레스에 의해 손상을 받고 있기 때문에, 일반적으로 바람직한 배양 조건에 의해서 배양한 경우에도 증식은 곤란하지만, 그 미생물이 갖는 대사 활성은 생균과 비교하면 저하되어 있는데 사균과 비교하면 유의하게 활성 을 갖는 상태의 미생물이다.

특히 식품 위생 검사나 임상 검사에서, 온화한 가열 처리나 항생 물질 투여에 의해 손상균의 상태를 나타낸 세균의 검출이 주목받고 있고, 본 발명에서는 생균의 검출뿐만 아니라, 생균과 사균 또는 손상균과의 식별도 가능한 미생물의 검출 방법을 제공하는 것이다.

또한, 생균, 손상균 및 사균의 균수 단위는 통상 모두 세포수(cells)/ml로 표시된다. 생균의 세포수는 바람직한 평판 배지 상에서 바람직한 조건으로 배양하였을 때의 콜로니 형성수(cfu/ml(colony forming units/ml))로 근사시킬 수 있다. 또한, 손상균의 표준 시료는, 예를 들면 생균 현탁액을 가열 처리, 예를 들면 비등수 중에서 가열 처리함으로써 제조할 수 있지만, 그 경우의 손상균의 세포수는 가열 처리하기 전의 생균 현탁액의 cfu/ml로 근사시킬 수 있다. 또한, 손상균을 제조하기 위한 비등수 중에서의 가열 시간은 미생물의 종류에 따라 다르지만, 예를 들면 실시예에 기재된 세균에서는, 50 초 정도로 손상균을 제조할 수 있다. 또한, 손상균의 표준 시료는 항생 물질 처리에 의해서도 제조할 수 있는데, 그 경우에 손상균의 세포수는 생균 현탁액을 항생 물질로 처리한 후, 항생 물질을 제거하고, 가시광(파장 600 nm)의 투과도, 즉 탁도를 측정하여, 생균수 농도를 미리 알고 있는 생균 현탁액의 탁도와 비교함으로써, 바람직한 평판 배지 상에서 바람직한 조건으로 배양하였을 때의 콜로니 형성수(cfu/ml)로 근사시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 생균의 검출이 목적이고, 생균과 구별되는 미생물은 손상균이거나 사균일 수도 있다.

본 발명에서 「생균의 검출」이란, 피검 시료 중 생균의 유무 판별 및 생균의 양의 결정을 모두 포함한다. 또한, 생균의 양이란, 절대적인 양으로 한정되지 않고, 대조 시료에 대한 상대적인 양일 수도 있다.

이하, 본 발명의 방법을 공정마다 설명한다.

(1) 스텝 a)

피검 시료를 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 DNA를 가교하는 가교제로 처리한다.

본 발명에서 사용되는 가교제란, 염색체 DNA에 인터칼레이트하고, 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 염색체 DNA에 공유 결합하여 DNA의 분자 사이를 가교하는 것이다.

상기 가교제는 생균과, 손상균 또는 사균 및 소 백혈구 등의 체세포, 백혈구, 혈소판 등에 대한 작용이 다른 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는 생균의 세포벽보다 손상균 또는 사균의 세포벽, 또는 소 백혈구 등의 체세포, 백혈구, 혈소판 등의 세포막에 대하여 투과성이 높은 것이 바람직하다.

상기 가교제로서는, 에티듐 모노아자이드(ethidium monoazide), 에티듐 디아지드(ethidium diazide), 프솔라렌(psolaren), 4,5',8-트리메틸 프솔라렌(4,5',8-trimethyl psolaren:PMA) 및 8-메톡시 프솔라렌(8-methoxy psolaren) 등을 들 수 있다. 가교제는 1종류를 단독으로 이용할 수도 있고, 2종류 또는 그 이상을 병용할 수도 있다.

가교제에 의한 처리의 조건은 적절하게 설정하는 것이 가능하고, 예를 들면 검출 대상의 미생물의 생균 및 사균 또는 손상균의 현탁액에 다양한 농도의 가교제를 첨가하고, 다양한 시간 동안 놓아둔 후, 원심 분리 등에 의해서 균체를 분리하여 핵산 증폭법으로 분석함으로써, 생균과 사균 또는 손상균을 구별하기 쉬운 조건을 결정할 수 있다. 또한, 검출 대상의 미생물의 생균, 및 소 백혈구 등의 체세포 또는 혈소판 등의 현탁액에 다양한 농도의 가교제를 첨가하고, 소정 시간 방치한 후, 원심 분리 등에 의해서 균체 및 상기 각종 세포를 분리하여 핵산 증폭법으로 분석함으로써, 생균과 각종 세포를 구별하기 쉬운 조건을 결정할 수 있다. 이러한 조건으로서, 구체적으로는 에티듐 모노아자이드에서는 최종 농도 1 내지 100 μg/ml, 4 내지 10 ℃, 5 분 내지 48 시간, 에티듐 디아지드에서는 최종 농도 1 내지 100 μg/ml, 4 내지 10 ℃, 5 분 내지 48 시간, 프솔라렌에서는 최종 농도 1×10^-5 내지 10 μg/ml, 25 내지 37 ℃, 5 분 내지 48 시간, 4,5',8-트리메틸 프솔라렌에서는 최종 농도 1×10^-5 내지 10 μg/ml, 25 내지 37 ℃, 5 분 내지 48 시간, 8-메톡시 프솔라렌에서는 최종 농도 1×10^-5 내지 10 μg/ml, 25 내지 37 ℃, 5 분 내지 48 시간을 들 수 있다.

(2) 스텝 b)

다음에, 가교제를 첨가한 피검 시료에 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사 처리를 행한다.

상기 가교제는 생균의 세포벽보다 사균 및 손상균의 세포벽쪽이 투과하기 쉽다. 따라서, 상기에 나타내는 작용 시간 내이면 생균의 세포벽은 실질적으로 투과 하지 않고, 손상균 또는 사균 또는 사세포로 되어 있는 체세포의 세포막은 투과한다고 생각된다. 또한, 살아있는 체세포라도 세포막만을 가지고, 세포벽을 갖지 않기 때문에 상기 가교제는 투과한다고 생각된다. 그 결과, 가교제는 체세포의 사세포 및 사균 및 손상균의 세포 내에 진입하고, 계속해서 염색체 DNA와 무질서하게 공유 결합하거나, 또는 인터칼레이트하여 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사를 행함으로써 DNA의 분자 사이를 가교하고, 염색체 DNA 내에 변형이 생기는 결과, 염색체 DNA가 파괴(단편화ㆍ절단)된다고 추정된다.

350 nm 내지 700 nm 파장의 광이란, 적어도 350 nm 내지 700 nm 파장의 광을 포함할 수 있고, 단파장광일 수도 있고, 복합광일 수도 있다. 또한, 모든 성분이 350 nm 내지 700 nm의 범위 내일 수도 있고, 350 nm보다 단파장의 광, 및/또는 700 nm 이상의 장파장의 광을 포함할 수도 있지만, 강도 분포에서의 피크가 350 nm 내지 700 nm의 범위 내인 것이 바람직하다. 또한, 광 조사만에 의해서 미생물의 염색체 DNA를 절단하는 정도의 단파장 성분은 포함하지 않는 것이 바람직하다.

생균보다 손상균이나 사균의 염색체 DNA가 우선적으로 파괴되면, 생균에서는 염색체 DNA의 타겟 영역이 핵산 증폭법에 의해 증폭되는 것에 대하여, 손상균이나 사균에서는 타겟 영역이 파괴(절단)되는 결과, 핵산 증폭 반응이 저해되고, 생균을 손상균이나 사균에 비해 선택적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태는 상기 가교제가 에티듐 모노아자이드이고, 에티듐 모노아자이드를 첨가한 피검 시료에 350 nm 내지 700 nm 파장의 광선을 조사하는 공정을 포함한다. 에티듐 모노아자이드(EMA)는 미생물의 생균의 세포벽보다 손상 균이나 사균의 세포벽을 투과하기 쉽다. 따라서, EMA는 생균의 세포벽은 실질적으로 투과하지 않고, 손상균이나 사균의 세포벽이나 사세포로 되어 있는 체세포의 세포막은 투과한다고 생각된다. 또한, 혈액 중의 백혈구, 혈소판이 생세포인 경우, EMA는 멸균수나 저장(低張)성 염 용액하에서 상기 세포의 세포막을 보다 잘 투과한다. EMA는 체세포의 사세포 및 손상균 및 사균의 세포 내에 진입하여 핵 내 DNA에 무질서하게 인터칼레이트한 후, 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 인터칼레이트된 EMA만이 나이트렌으로 변환되고, 핵 내 DNA에 공유 결합하여 DNA의 분자 사이를 가교한다. 또한, 염색체 DNA의 각 염기 및 데옥시리보스에 대하여 도처에서 공유 결합한 EMA에 의해 염색체 DNA 내에 큰 변형이 생기고, 그 결과 염색체 DNA가 파괴(단편화)되는 것으로 추정된다.

에티듐 모노아자이드 이외의 가교제라도, 미생물의 생균의 세포벽보다 손상균이나 사균의 세포벽을 투과하기 쉽고, 350 nm 내지 700 nm 파장의 광선(장파장 자외선 또는 가시광선)을 조사함으로써 DNA를 가교하고, 염색체 DNA를 파괴하는 것이면 본 발명에 사용할 수 있다.

EMA에 의한 처리의 조건은 적절하게 설정하는 것이 가능하고, 예를 들면 검출 대상의 미생물의 생균, 및 손상균이나 사균의 현탁액에 다양한 농도의 EMA를 첨가하고, 다양한 시간 동안 놓아둔 후, 가시광을 조사하고, 필요에 따라서 원심 분리 등에 의해서 균체를 분리하고, 핵산 증폭법에 의해 분석함으로써 생균과 사균 및 손상균을 구별하기 쉬운 조건을 결정할 수 있다. 또한, 광 조사의 조건도 조사 시간을 변화시켜 상기 실험을 행함으로써 바람직한 조건을 결정할 수 있다. 광 조 사의 조건으로서 구체적으로는, 피검 시료로부터 10 내지 50 cm의 거리에서 100 내지 750 W의 상기 파장의 광을 5 분 내지 2 시간 조사하는 조건을 들 수 있다. 광 조사는 저온하에서, 예를 들면 시료를 빙냉시켜 행하는 것이 바람직하다.

(3) 스텝 c)

광 조사 처리한 피검 시료로부터, 피검 시료 중에 포함되는 미반응의 가교제를 제거한다.

이 공정은, 스텝 b) 후에 빠르게 행하는 것이 바람직하다. 가교제를 제거하는 방법으로서는, 피검 시료를 원심 분리하고, 미생물을 포함하는 침전과 가교제를 포함하는 상청을 분리하여 상청을 제거하는 방법을 들 수 있다. 이 경우, 가교제를 제거한 후, 적절하게 세정제로 미생물을 세정하는 공정을 추가하는 것도 가능하다.

(4) 스텝 d)

계속해서, 가교제를 제거한 피검 시료에 배지를 첨가하여 보온한다.

배지는 피검 시료 중에 포함되는 미생물의 배양에 알맞은 배지인 것이 바람직하고, 액체 배지를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 구체적으로는 브이욘(bouillon) 배지, 펩톤 배지, 브레인 하트 인퓨젼(BHI) 브로스 등을 예시할 수 있다. 보온은 대상 미생물의 증식에 알맞은 온도, 예를 들면 상기 미생물의 최적 배양 온도 또는 그에 준하는 온도인 것이 바람직하다. 대상 미생물의 최적 배양 온도는, 예를 들면 대상 미생물을 다양한 온도에서 배양하여, 미생물이 가장 증식하는 온도를 선택함으로써 결정할 수 있다. 예를 들면, 상기에서 예시한 세균으로 서는, 통상 20 ℃ 내지 43 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 37 ℃, 보다 바람직하게는 30 ℃ 내지 37 ℃이다. 또한, 피검 시료 중의 미생물이 증식하는 한, 보온 시간은 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는 예를 들면, 0.5 내지 48 시간, 바람직하게는 1 내지 24 시간, 보다 바람직하게는 2 내지 3 시간이다. 미생물을 포함하는 피검 시료를 배지 중에서 보온함으로써, 가교제가 취입되지 않고, 염색체 DNA가 파괴되지 않은 생균은, 배지 중에서의 보온에 의해 배양되어 증식하고, 피검 시료 중의 생균의 유무 판별 및 생균의 양의 결정에서의 검출 감도의 향상이 기대된다.

(5) 스텝 e), f)

스텝 e), f)는 각각 상기 스텝 a), b)와 동일하다.

상기 스텝 d)를 행함으로써, 피검 시료 중의 생균에 대해서는 증식하는 것이 기대되기 때문에, 스텝 d) 후에, 또한 스텝 e), f)를 실시함으로써 생균과 그 이외의 균과의 검출 감도의 차를 높이는 것이 가능하다. 이에 의해서, 피검 시료 중의 생균, 손상균 또는 사균의 유무 판별 및 생균의 양의 결정에 있어서 비약적인 검출 감도의 향상이 가능해진다. 스텝 e)에서 첨가하는 가교제는 스텝 a)에서 첨가한 가교제와 동일할 수도 있고, 다른 것일 수도 있다.

본 발명의 특히 바람직한 양태는 피검 시료에 대하여 가교제 첨가 및 광 조사 처리와 원심 분리 등에 의한 가교제 제거, 및 배지의 첨가, 및 보온, 추가로 다시 가교제 첨가 및 광 조사 처리를 연속적으로 행하는 것이지만, 상기 일련의 처리를 행한 후, 또한 복수회, 가교제 제거, 배지의 첨가, 및 보온, 추가로 다시 가교제 첨가 및 광 조사 처리를 행함으로써 한층 더 검출 감도의 향상도 가능하다. 구 체적으로는 스텝 a) 및 b) 후, 스텝 c), d), e) 및 f)를 2회 또는 그 이상 반복할 수 있다.

후술하는 실시예 및 비교예에 있어서, 스텝 a), b)만을 행하고, 스텝 e), f)를 행하지 않는 것을 「단회 처리」, 스텝 a), b)에 더하여 스텝 e), f)를 행하는 것을 「다단계 처리」라고 하는 경우가 있다.

(6) 스텝 g)

스텝 a 내지 f)에서 처리된 피검 시료로부터 DNA를 추출하고, 추출된 DNA의 타겟 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭한다. 핵산 증폭법으로서는, PCR법(문헌[White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)]), LAMP법(Loop-Mediated Isothermal Amplification: 문헌[신규 유전자 증폭법(LAMP법)의 원리와 응용, 노토미 즈구노리, 나가타니 도루, BIO INDUSTRY, Vol.18, No.2, 15-23, 2001]), SDA법(Strand Displacement Amplification: 문헌[Edward L. Chan, Ken Brandt, Karen Olienus, Nick Antonishyn, Greg B. Horsman., Performance characteristics of the Becton Dickinson ProbeTec System for direct detection of Chlamydia trachomatis and Ncisseria gonorrhoeae in male and female urine specimens in comparison with the Roche Cobas system. Arch. Pathol. Lab. Med., 124:1649-1652, 2000]), LCR법(Ligase Chain Reaction: 문헌[Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci USA, Vol.88, p.189-193, 1991]), DNA 마이크로어레이법(Validation of Virulence and Epidemiology DNA Microarray for Identification and Characterization of Staphylococcus aureus Isolates: 문헌[Richard P. Spence, et al., J. Clin. Microbiol., Vol.46, No.5, p1620-1627, 2008]) 등이 각각 예시된다. 또한, 본 발명에 있어서는, PCR법을 이용하는 것이 특히 바람직하지만, 이것으로 제한되지 않는다.

피검 시료로부터의 DNA의 추출은, 추출된 DNA가 핵산 증폭 반응에서의 주형으로서 기능할 수 있는 한 특별히 제한되지 않고, 일반적으로 이용되고 있는 미생물의 DNA의 추출법에 따라서 행할 수 있다.

DNA의 추출법은, 예를 들면 문헌[Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual.3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]에 기재되어 있다.

본 발명에 있어서 「타겟 영역」이란, 염색체 DNA 중, 본 발명에서 사용되는 프라이머를 이용한 핵산 증폭법에 의해 증폭될 수 있는 영역이고, 검출 대상의 미생물을 검출할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, 목적에 따라서 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 피검 시료에 검출 대상의 미생물과 다른 종류의 세포가 포함되는 경우에는, 타겟 영역은 검출 대상의 미생물에 특이적인 배열을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 목적에 따라서는 복수종의 미생물에 공통되는 배열을 갖는 것일 수도 있다. 또한, 타겟 영역은 단일할 수도, 복수개일 수도 있다. 검출 대상의 미생물에 특이적인 타겟 영역에 대응하는 프라이머 세트와, 광범위한 미생물의 염색체 DNA에 대응하는 프라이머 세트를 이용하면, 검출 대상의 미생물의 생균량과 다수종의 미생물의 생균량을 동시에 측정할 수 있다. 타겟 영역의 길이로서는, 통상 50 내지 5000 염기, 바람직하게는 50 내지 2000 염기, 특히 바람직하게는 50 내 지 500 염기를 들 수 있다.

핵산의 증폭에 사용되는 프라이머는 각종 핵산 증폭법의 원리에 기초하여 적절하게 설정하는 것이 가능하고, 상기 타겟 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

또한, 검출 대상의 미생물이 병원성 세균인 경우에는, 타겟 영역으로서는 병원 유전자를 들 수 있다. 병원 유전자로서는, 리스테리아속 세균의 리스테리오리신 O(hlyA) 유전자, 살모넬라속 세균의 enterotoxin(엔테로톡신) 유전자나 invasion(invA) 유전자, 병원성 대장균 O-157의 베로 독소 유전자, 엔테로박터속 세균의 outer-membrane-protein A(ompA) 유전자(엔테로박터ㆍ사카자키균) 및 macromolecular synthesis(MMS) 오페론(엔테로박터ㆍ사카자키균), 황색 포도상 구균 엔테로톡신 유전자, 바실루스ㆍ세레우스균의 세레우리드(구토 독소) 유전자나 엔테로톡신 유전자, 보툴리누스균의 각종 독소 유전자 등을 들 수 있다. 또한, 병원 유전자에 대응하는 프라이머로서는, 예를 들면 리스테리아균의 hlyA 유전자에 대응하는 서열 1 및 2에 나타내는 프라이머 세트, 엔테로박터ㆍ사카자키균의 ompA 유전자에 대응하는 서열 3 및 4에 대한 프라이머 세트, 및 엔테로박터ㆍ사카자키균의 MMS 오페론에 대응하는 서열 5 및 6에 대한 프라이머 세트를 들 수 있다.

복수종의 미생물에 공통되는 프라이머를 이용하면, 피검 시료 중의 복수종의 미생물의 생균을 검출할 수 있다. 또한, 특정 세균에 특이적인 프라이머를 이용하면, 피검 시료 중의 특정 균종의 생균을 검출할 수 있다.

핵산 증폭 반응의 조건은 각 핵산 증폭법(PCR법, LAMP법, SDA법, LCR법 등) 의 원리에 따른 특이적인 증폭이 일어나는 한 특별히 제한되지 않고, 적절하게 설정할 수 있다.

(7) 스텝 h)

계속해서, 핵산 증폭법에 의해 증폭한 증폭 산물을 해석한다.

해석법은 핵산 증폭 산물의 검출 또는 정량이 가능한 것이면 특별히 제한되지 않고, 전기 영동법 등이 예시된다. 또한, 핵산 증폭법에 PCR법을 이용한 경우에는, 리얼 타임 PCR법(문헌[Nogva et al./Application of 5'-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk. Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, 2000, pp. 4266-4271], 문헌[Nogva et al./Application of the 5'-nuclease PCR assay in evaluation and development of methods for quantitative detection of campylobacter jejuni. Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, 2000, pp. 4029-4036])을 이용하는 것이 가능하다.

전기 영동법에 따르면, 핵산 증폭 산물의 양 및 그의 크기를 평가할 수 있다. 또한, 리얼 타임 PCR법에 따르면, 신속하게 PCR 증폭 산물의 정량을 행할 수 있다.

리얼 타임 PCR법을 채용하는 경우, 일반적으로 증폭 사이클수 1 내지 10까지는 형광 강도의 변화는 노이즈 수준으로 0과 같기 때문에, 이들을 증폭 산물 0의 샘플 블랭크로 간주하여, 이들의 표준 편차 SD를 산출하고 그 SD값에 10을 곱한 값을 임계값으로 하고, 그 임계값을 최초로 상회하는 PCR 사이클수를 사이클 임계 값(threshold value)(Ct값)이라 한다. 따라서, PCR 반응 용액에 초기의 DNA 주형량이 많을수록 Ct값은 작은 값이 되고, 주형 DNA량이 적을수록 Ct값은 큰 값이 된다. 또한, 주형 DNA량이 동일하더라도, 그 주형 내의 PCR의 타겟 영역에 절단이 들어간 비율이 많아질수록, 동일 영역의 PCR 반응의 Ct값은 큰 값이 된다.

또한, 증폭 산물의 유무는 증폭 산물의 융해 온도(TM) 패턴을 해석함으로써도 행할 수 있다.

상기 각 방법은 본 발명의 방법에서의 여러 조건의 최적화시에도 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해서 생균을 검출하는 경우, 핵산 증폭 산물의 해석은 동정되어 있는 미생물의 표준 시료를 이용하여 작성된 미생물량 및 증폭 산물과의 관련을 나타내는 표준 곡선을 이용하면 생균의 유무 또는 정량의 정밀도를 높일 수 있다. 표준 곡선은 미리 작성해 둔 것을 사용할 수 있지만, 피검 시료와 동시에 표준 시료에 대해서 본 발명의 각 스텝을 행하여 작성한 표준 곡선을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 미리 미생물량과 DNA량과의 상관을 조사해두면, 그 미생물로부터 단리된 DNA를 표준 시료로서 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 의한 생균의 검출이 생균의 양의 결정을 포함하는 경우, 스텝 d)에서 생균이 증식하기 때문에, 피검 시료 중의 생균의 양을 결정하기 위해서는, 이 증식의 정도를 고려할 필요가 있다. 그를 위해서는, 예를 들면 상기한 바와 같이 미생물의 표준 시료를 이용하여 미생물량과 증폭 산물과의 관련을 나타내는 표준 곡선을 작성해두면 좋다.

<2> 본 발명의 키트

본 발명의 키트는 피검 시료 중의 미생물의 생균을 핵산 증폭법에 의해 검출하기 위한 키트로서, 가교제, 배지, 및 검출 대상의 미생물 DNA의 타겟 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭하기 위한 프라이머를 포함한다.

상기 핵산 증폭 반응은 PCR법, LAMP법, SDA법 또는 LCR법인 것이 바람직하다. 또한, 상기 키트에 있어서, 가교제나 배지는 본 발명의 방법에서 설명한 것과 동일하다.

본 발명의 키트의 바람직한 양태는 가교제가 에티듐 모노아자이드(ethidium monoazide), 에티듐 디아지드(ethidium diazide), 프솔라렌(psolaren), 4,5',8-트리메틸 프솔라렌(4,5',8-trimethyl psolaren) 및 8-메톡시 프솔라렌(8-methoxy psolaren)에서 선택되는 것이 바람직하고, 특히 에티듐 모노아자이드를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 키트는 희석액, 가교제 반응용 반응액, 본 발명의 방법을 기재한 설명서 등을 더 포함할 수도 있다.

다음에 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

1. 시료의 제조-리스테리아ㆍ모노사이토게네스(생균 및 손상균) 현탁액의 제조

그람 양성 세균인 리스테리아ㆍ모노사이토게네스(Listeria monocytogenes JCM 2873; 이하, 「리스테리아」라 약기하는 경우가 있음)를, 브레인 하트 인퓨젼(BHI) 브로스를 이용하여 30 ℃에서 배양하고, 대수 증식기의 배양액 40 ml를 4 ℃에서 8,000×g, 15 분간 냉각 원심 분리하여 상청을 제거하였다. 균체에 생리 식염수 40 ml를 첨가하여 잘 교반하고, 동일하게 냉각 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 균체에 10 ml의 생리 식염수를 첨가하여 생균 현탁액으로 하였다. 이 생균 현탁액의 생균수를 표준 한천 평판 배지에 의해 측정한 결과, 1.3×10⁸ cfu/ml였다.

또한, 상기 생균 현탁액 1 ml를 1.5 ml 마이크로튜브에 넣고, 비등수에 50초 침적(沈積) 후, 빙수에 의해 급냉시켜 손상균 현탁액을 제조하였다. 또한, 이 현탁액 중의 세포에는 소수의 생균 및 사균도 일부 포함된다고 생각되지만, 주로 손상균이기 때문에 단순히 「손상균」이라 기재한다. 또한, 본 발명의 방법은 본래 생균을 검출하는 방법이고, 생균과 구별되는 미생물은 손상균인지 사균인지는 상관없다.

2. 시험 방법

2-1) 다단계 처리(본 발명의 방법)

상기에서 제조한 리스테리아의 생균 현탁액 및 손상균 현탁액에 대하여, 에티듐 모노아자이드(EMA)를 최종 농도 0 또는 100 μg/ml로 첨가하고, 차광하에 4 ℃, 5 분 방치 후, 각 현탁액을 얼음 위에 두고, 현탁액으로부터 20 cm의 거리에 설치한 500 W의 가시광선(FLOOD PRF: 100 V, 500 W, 이와사키 덴키사 제조, 파장: 500 내지 700 nm)을 5 분간 조사하였다. 그 후, 4 ℃에서 15,000×g, 10 분간 냉각 원심 분리하여 상청을 제거하고, 동일한 용량의 생리 식염수를 첨가하여 교반 후, 4 ℃에서 15,000×g, 10 분간 냉각 원심 분리를 행하여 상청을 제거 후, 동일한 용량의 브레인 하트 인퓨젼(BHI) 브로스를 첨가하여 30 ℃에 의해 2 시간 인큐베이션하였다.

1회째 EMA 처리시, EMA 농도 0의 생균 및 손상균 현탁액에는 EMA를 다시 첨가하지 않고, EMA 농도 100 μg/ml의 생균 및 손상균 현탁액에는 EMA를 최종 농도 10 μg/ml 또는 25 μg/ml로 다시 첨가하고, 차광하에 4 ℃, 5 분 방치 후, 각 현탁액을 얼음 위에 두고, 현탁액으로부터 20 cm의 거리에 설치한 500 W의 가시광선을 5 분간 조사하였다.

2-2) 단회 처리(비교예 1)

1.에서 제조한 리스테리아의 생균 현탁액 및 손상균 현탁액에 대하여, 에티듐 모노아자이드(EMA)를 최종 농도 0, 10 또는 25 μg/ml로 첨가하고, 차광하에 4 ℃, 5 분 방치 후, 각 현탁액을 얼음 위에 두고, 현탁액으로부터 20 cm의 거리에 설치한 500 W의 가시광선(FLOOD PRF: 100V 5OOW, 이와사키 덴키사 제조, 파장: 500 내지 700 nm)을 5 분간 조사하였다.

2-3) PCR 시험에 사용되는 각 세균 현탁액의 제조

상기 2-1) 및 2-2)에서 처리된 리스테리아의 생균 및 손상균의 각 현탁액을 넣은 마이크로튜브를 4 ℃에서 15,000×g, 10 분간 냉각 원심 분리하였다. 상청을 제거 후, 1 ml의 생리 식염수를 첨가하여 잘 교반하고, 동일한 냉각 원심 처리를 행하였다(세정 처리). 또한 1회 동일한 세정 처리를 행한 후, 펠릿에 10 μl의 TE 버퍼(10 mM 트리스염산 완충액, 1 mM EDTAㆍ2 Na)를 첨가하여 잘 교반하였다.

3. 리스테리아균의 병원 유전자(short DNA)를 타겟으로 한 PCR

3-1) 병원 유전자 리스테리아ㆍ리스테리오리신 O(hlyA) 유전자 증폭

세균으로부터의 염색체 DNA의 용출 및 PCR 반응을 연속하여 자동적으로 행할 수 있는 G&g 사이언스사(가나가와껭 요코하마시) 제조 다이렉트 버퍼 MIX를 사용하고, PCR 마스터 믹스(전량 50.5 μl)를 제조하였다. 본 버퍼 MIX에는 PCR 반응에 이용되는 세균 유래의 주형 DNA에 세균 유래의 단백질이 흡착되는 것을 저지하는 성분(계면활성제), 및 DNA 폴리머라제에 세균 유래의 다당류가 흡착되는 것을 저지하는 성분(계면활성제)을 포함하고, 그 이외에 리얼 타임 PCR 반응에 필요한 조성을 포함하고 있다. PCR 마스터 믹스의 상세한 것은 하기와 같다.

ㆍG&g 사이언스사 다이렉트 버퍼 MIX: 42 μl

ㆍ(5 U/μl) Ex-Taq(다카라 슈조사 제조, 카탈로그 번호: RR001B): 0.5 μl

ㆍ(10 pmol/μl) 서열 1(hlyA-F) DNA: 4 μl

ㆍ(10 pmol/μl) 서열 2(hlyA-R) DNA: 4 μl

또한, 상기 시약 전부를 합하면 전량 50.5 μl가 되지만, G&g 사이언스사 다이렉트 버퍼 MIX에는, 전량 50.5 μl의 PCR 마스터 믹스에 있어서 필요 성분이 하기의 최종 농도가 되도록 미리 제조되었다.

ㆍEx-Taq Buffer(다카라 슈조사 제조, 카탈로그 번호: RRO01B): 1×

ㆍdNTP mixture(다카라 슈조사 제조, 카탈로그 번호: RR001B): 각 0.2 mM

ㆍSYBA Green(BMA사 제조, 카탈로그 번호: 50513): 0.4×

3-2) hlyA 유전자 증폭용 PCR 서멀 사이클 프로파일

3-3) PCR 반응

상기 2-3)에서 제조한 각 시험 현탁액의 5 μl를 상기 3-1)에서 제조한 PCR 마스터 믹스(50.5 μl)에 첨가하였다. 네가티브 컨트롤로서는 TE 버퍼 5 μl를 이용하였다.

3-2)에서 나타낸 PCR 서멀 사이클 프로파일에 따라서, 리얼 타임 PCR 장치 iCycler(바이오라드사 제조, 기종 번호:iQ)를 이용하여 PCR 반응을 행하였다.

4. PCR 증폭 산물의 아가로스 겔 전기 영동

상기 3-3)의 PCR 증폭 산물을 3 ％ 아가로스 겔을 이용하여 전기 영동하였다. 전기 영동 종료 후, 아가로스 겔을 1 μg/ml 에티듐브로마이드 수용액에 20 분간 침지하고, 이어서 이온 교환수로 2회 세정한 후, UV 트랜스일루미네이터(254 ㎚)에 의해 hlyA 유전자 증폭 산물의 증폭 정도를 관찰하였다.

5. 시험 결과

리스테리아의 생균 및 손상균에 대하여, 다단계 처리를 행한 후 hlyA 유전자를 타겟으로 한 PCR을 행하여 아가로스 겔 전기 영동한 결과를 도 1(다단계 처리 레인)에 나타내고, 그 PCR 최종 증폭 산물의 밴드 강도를 수치화한 것을 표 2에 나타내었다. 또한, 리스테리아의 생균 및 손상균에 대하여, 단회 처리를 행한 후 hlyA 유전자를 타겟으로 한 PCR을 행하여 아가로스 겔 전기 영동한 결과를 도 1(단회 처리 레인)에 나타내고, 그 PCR 최종 증폭 산물의 밴드 강도를 수치화한 것을 표 3에 나타내었다. 표 중에서의 밴드 강도는 밴드의 농담을 바이오라드사 제조 GS-700 Imaging Densitometer(덴시토미터: 측정 파장 600 nm)를 이용하여 전기 영동 방향으로 밴드를 스캔하였을 때의 측정값이다.

다단계 처리에 있어서 EMA 미첨가의 경우, 리스테리아의 생균과 손상균 모두 hlyA 유전자 증폭 산물로 추찰되는 밴드가 검출되고, 생균만을 특이적으로 검출할 수 없었다. 그러나, 다단계 처리로 EMA를 첨가한 경우(EMA 100 μg/ml-인큐베이션-EMA 25 또는 10 μg/ml), 생균에서는 밴드는 명료하게 검출되었지만, 손상균에서는 밴드는 거의 또는 전혀 검출되지 않게 되었다. 따라서, 다단계 처리에 의해 생균만 선택적으로 검출하는 것이 PCR에 의해 가능해졌다. 동일하게 표 2에 나타낸 바와 같이, 밴드 강도를 수치화한 데이터로부터도 다단계 처리에 의해 113 bp라는 짧은 유전자를 타겟으로 한 PCR에서도, 명료하게 생균과 손상균의 식별이 가능해졌다.

한편, 단회 처리에 있어서 EMA 미첨가의 경우, PCR에 의해 hlyA 유전자 증폭 산물로 추찰되는 밴드가 리스테리아의 생균과 손상균 모두 검출되어, 생균만을 선택적으로 검출할 수 없었다. 또한, 단회 처리로 EMA를 10 μg/ml 첨가한 경우, 생균과 손상균 모두 hlyA 유전자 증폭 산물로 추찰되는 밴드가 검출되어, 생균만을 특이적으로 검출할 수 없었다. 단회 처리로 EMA를 25 μg/ml 첨가한 경우, 생균 및 손상균 모두 hlyA 유전자 증폭 산물로 추찰되는 밴드가 거의 소실에 가까운 형태까지 감소하여, 생균만을 특이적으로 검출하는 것은 불가능하였다. 표 3에 있어서도, 단회 처리에 의해 113 bp라는 짧은 유전자(hlyA)를 타겟으로 한 PCR에서는 생균과 손상균의 명료한 식별은 불가능하였다.

6. 고찰

특정 병원 세균에 촛점을 맞추어 생균과 손상균(사균도 포함함)의 식별을 신속하게 행하는 경우, 병원 세균만 특이적으로 검출하기 위해서, 및 또한 정량적 리얼 타임 PCR에 의해 시험액 중의 세균수를 정량하기 위해서, 80 내지 200 염기라는 짧은 유전자 영역을 타겟으로 하는 경향이 있다. 비교예 1에 나타내어지는 단회 처리의 경우, 10 μg/ml보다 고농도의 EMA를 이용하여 처리하면, 손상균뿐만 아니라 생균의 세포벽도 투과하고, 생균 및 손상균의 염색체 DNA를 도처에서 세균 내 효소에 의존하지 않고 직접적으로 2개쇄를 절단하기 때문에, 생균만을 특이적으로 검출할 수 없다고 생각된다. 또한, 단회 처리로 EMA를 10 μg/ml 또는 그 이하의 농도로 작용시킨 경우, EMA는 손상균의 세포벽을 투과하기 어렵고, 고빈도로 염색체 DNA가 절단될 가능성은 낮다. 따라서, PCR 타겟 영역이 짧은 경우, 모든 손상균 세포의 염색체 DNA의 타겟 영역이 반드시 절단되는 것은 아니고, 그 결과 PCR은 완전히 억제되지 않는다고 생각된다.

한편, 다단계 처리에 있어서는, EMA를 1회 작용시킨 후, EMA가 다소 생균을 투과하여 생균수가 감소되었다고 해도, 배양에 알맞은 배지 중에서 인큐베이션함으로써, 생균수를 원래 수치로 복귀시키거나 생균의 확산 펌프를 회복시키거나, 미반응 EMA를 균체 밖으로 배출시키는 것이 가능하기 때문에, 작용시키는 EMA의 1회째 농도는 100 μg/ml 등의 고농도가 가능하고, 손상균의 염색체 DNA는 고농도 EMA에 의해 도처에서 매우 심하게 절단을 받게 되어, 그 후의 배지 중에서의 인큐베이션을 행하더라도 생균과는 달리 세포수를 늘리는 것은 불가능하다. 그와 같은 상황하에, 5 분 등의 단시간에서는 생균의 세포벽에는 거의 투과하지 않는 농도, 예를 들면 10 μg/ml로 다시 EMA를 작용시키면, 손상균의 세포벽에만 EMA가 투과하여 염색체 DNA의 절단을 한층 더 촉진시키고, 손상균만 PCR 최종 증폭 산물의 밴드가 검출되지 않는 것이라고 생각된다.

[실시예 2]

1. 시료의 제조-엔테로박터ㆍ사카자키(생균 및 손상균) 현탁액의 제조

그람 음성 세균인 엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii ATCC 6538P주; 이하, 「사카자키」라 약기하는 경우가 있음)를 브레인 하트 인퓨젼(BHI) 브로스를 이용하여 37 ℃에서 배양하고, 대수 증식기의 배양액 5 ml를 4 ℃에서 8,000×g, 15 분간 냉각 원심 분리하여 상청을 제거하였다. 균체에 생리 식염수 5 ml를 첨가하여 잘 교반하고, 동일하게 냉각 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 균체에 5 ml의 생리 식염수를 첨가하고, 또한 10배 희석하여 생균 현탁액으로 하였다. 이 생균 현탁액의 생균수를 표준 한천 평판 배지에 의해 측정한 결과, 8.38±0.25 log₁₀cfu/ml였다.

또한, 상기 생균 현탁액 1 ml를 1.5 ml 마이크로튜브에 넣고, 비등수에 2 분 침적 후, 빙수에 의해 급냉시켜 손상균 현탁액을 제조하였다. 또한, 이 현탁액 중의 세포에는 소수의 생균 및 사균도 일부 포함된다고 생각되지만, 주로 손상균이기 때문에 단순히 「손상균」이라 기재하였다. 또한, 본 발명의 방법은 본래 생균을 검출하는 방법이고, 생균과 구별되는 미생물은 손상균인지 사균인지는 상관없다.

2. 시험 방법

2-1) 다단계 처리(본 발명의 방법)

상기에서 제조한 사카자키의 생균 현탁액 및 손상균 현탁액에 대하여, 에티듐 모노아자이드(EMA)를 최종 농도 0, 10, 25 또는 100 μg/ml로 첨가하고, 차광하에 4 ℃, 10 분 방치 후, 각 현탁액을 얼음 위에 두고, 현탁액으로부터 20 cm의 거리에 설치한 500 W의 가시광선(FLOOD PRF: 100 V, 500 W, 이와사키 덴키사 제조, 파장: 500 내지 700 nm)을 5 분간 조사하였다. 그 후, 4 ℃에서 15,000×g, 10 분간 냉각 원심 분리하여 상청을 제거하고, 동일한 용량의 생리 식염수를 첨가하여 교반 후, 4 ℃에서 15,000×g, 10 분간 냉각 원심 분리를 행하여 상청을 제거 후, 동일한 용량의 브레인 하트 인퓨젼(BHI) 브로스를 첨가하여 37 ℃에 의해 2 시간 인큐베이션하였다.

1회째 EMA 처리시, EMA 농도 0의 생균 및 손상균 현탁액에는 EMA를 다시 첨가하지 않고, EMA 농도 10, 25 또는 100 μg/ml의 생균 및 손상균 현탁액에는 EMA를 최종 농도 10 μg/ml로 다시 첨가하고, 차광하에 4 ℃, 10 분 방치 후, 각 현탁액을 얼음 위에 두고, 현탁액으로부터 20 cm의 거리에 설치한 500 W의 가시광선을 5 분간 조사하였다.

2-2) 단회 처리(비교예 2)

1.에서 제조한 사카자키의 생균 현탁액 및 손상균 현탁액에 대하여, 에티듐 모노아자이드(EMA)를 최종 농도 0, 10, 25 또는 100 μg/ml로 첨가하고, 차광하에 4 ℃, 10 분 방치 후, 각 현탁액을 얼음 위에 두고, 현탁액으로부터 20 cm의 거리에 설치한 500 W의 가시광선(FLOOD PRF: 100 V, 500 W, 이와사키 덴키사 제조, 파장: 500 내지 700 nm)을 5 분간 조사하였다.

2-3) PCR 시험에 사용되는 각 세균 현탁액의 제조

상기 2-1) 및 2-2)에서 처리된 사카자키의 생균 및 손상균의 각 현탁액을 넣은 마이크로튜브를 4 ℃에서 15,000×g, 10 분간 냉각 원심 분리하였다. 상청을 제거 후, 1 ml의 생리 식염수를 첨가하여 잘 교반하고, 동일한 냉각 원심 처리를 행하였다(세정 처리). 또한 1회 동일한 세정 처리를 행한 후, 펠릿에 초기 용량과 동일한 용량의 멸균수를 첨가하여 잘 교반하였다.

3. 사카자키의 outer-membrane-proteinA(ompA) 유전자 및 macromolecular synthesis(MMS) 오페론(short DNA)을 타겟으로 한 PCR

3-1) ompA 유전자 및 MMS 유전자 증폭

세균으로부터의 염색체 DNA의 용출 및 PCR 반응을 연속하여 자동적으로 행할 수 있는 G&g 사이언스사(가나가와껭 요코하마시) 제조 다이렉트 버퍼 MIX를 사용하고, PCR 마스터 믹스(전량 25.25 μl)를 제조하였다. 본 버퍼 MIX에는 PCR 반응에 이용되는 세균 유래의 주형 DNA에 세균 유래의 단백질이 흡착되는 것을 저지하는 성분(계면활성제), 및 DNA 폴리머라제에 세균 유래의 다당류가 흡착되는 것을 저지하는 성분(계면활성제)을 포함하고, 그 이외에 리얼 타임 PCR 반응에 필요한 조성을 포함하고 있다. PCR 마스터 믹스의 상세한 것은 하기와 같다.

ompA 유전자 검출용 PCR 마스터 믹스의 각 성분을 하기에 나타내었다.

ㆍG&g 사이언스사 다이렉트 버퍼 MIX: 21 μl

ㆍ(5 U/μl) Ex-Taq(다카라 슈조사 제조, 카탈로그 번호: RR001B): 0.25 μl

ㆍ(10 pmol/μl) 서열 3(ompA-F) DNA: 2 μl

ㆍ(10 pmol/μl) 서열 4(ompA-R) DNA: 2 μl

MMS 유전자 검출용 PCR 마스터 믹스의 각 성분을 하기에 나타내었다.

ㆍG&g 사이언스사 다이렉트 버퍼 MIX: 21 μl

ㆍ(10 pmol/μl) 서열 5(MMS-F) DNA: 2 μl

ㆍ(10 pmol/μl) 서열 6(MMS-R) DNA: 2 μl

또한, 상기 시약 전부를 합하면 전량 25.25 μl가 되지만, G&g 사이언스사 다이렉트 버퍼 MIX에는, 전량 25.25 μl의 PCR 마스터 믹스에 있어서 필요 성분이 하기의 최종 농도가 되도록 미리 제조되었다.

ㆍEx-Taq Buffer(다카라 슈조사 제조, 카탈로그 번호: RRO01B): 1×

ㆍSYBA Green(BMA사 제조, 카탈로그 번호: 50513): 0.4×

3-2) ompA 유전자 및 MMS 유전자 증폭용 PCR 서멀 사이클 프로파일

3-3) PCR 반응

상기 2-3)에서 제조한 각 시험 현탁액의 2 μl를 상기 3-1)에서 제조한 PCR 마스터 믹스(25.25 μl)에 첨가하였다. 네가티브 컨트롤로서는 멸균수 2.5 μl를 이용하였다.

4. PCR 증폭 산물의 아가로스 겔 전기 영동

상기 3-3)의 PCR 증폭 산물을 2 ％ 아가로스 겔을 이용하여 전기 영동하였다. 전기 영동 종료 후, 아가로스 겔을 1 μg/ml 에티듐브로마이드 수용액에 20 분간 침지하고, 이어서 이온 교환수로 2회 세정한 후, UV 트랜스일루미네이터(파장 254 ㎚)에 의해 ompA 유전자 및 MMS 유전자 증폭 산물의 증폭 정도를 관찰하였다.

5. 시험 결과

사카자키의 생균 및 손상균에 대하여, 다단계 처리를 행한 후 ompA 유전자를타겟으로 한 PCR을 행하여 아가로스 겔 전기 영동한 결과를 도 2(다단계 처리 레인)에 나타내고, 그 PCR 최종 증폭 산물의 밴드 강도를 수치화한 것을 표 5에 나타내었다. 또한, 사카자키의 생균 및 손상균에 대하여, 단회 처리를 행한 후 ompA 유전자를 타겟으로 한 PCR을 행하여 아가로스 겔 전기 영동한 결과를 도 2(단회 처리 레인)에 나타내고, 그 PCR 최종 증폭 산물의 밴드 강도를 수치화한 것을 표 6에 나타내었다. 표 중에서의 밴드 강도는 밴드의 농담을 바이오라드사 제조 GS-700 Imaging Densitometer(덴시토미터: 측정 파장 600 nm)를 이용하여 전기 영동 방향으로 밴드를 스캔하였을 때의 측정값이다. 또한, 다단계 처리 및 단회 처리의 각 리얼 타임 PCR 커브의 최초 상승(initial rising) 사이클수(Ct값)를 표 7에 나타내었다.

동일하게 MMS 유전자에 대하여, 다단계 처리 후의 PCR 최종 증폭 산물을 아가로스 전기 영동한 결과를 도 3(다단계 처리 레인), 그 PCR 밴드를 수치화한 것을 표 8에, 단회 처리의 전기 영동 결과를 도 3(단회 처리 레인)에 나타내고, 그 PCR 밴드를 수치화한 것을 표 9에 나타내었다. 또한, 다단계 처리 및 단회 처리의 각 리얼 타임 PCR 커브의 최초 상승 사이클수(Ct값)를 표 10에 나타내었다.

다단계 처리에 있어서 EMA 미첨가의 경우, 사카자키의 생균과 손상균 모두 ompA 유전자 및 MMS 유전자 증폭 산물로 추찰되는 밴드가 검출되어, 생균만을 특이적으로 검출할 수 없었다. 그러나, 다단계 처리로 EMA를 첨가한 경우(EMA 100 μg/ml-인큐베이션-EMA 10 μg/ml), 생균에서는 밴드는 명료하게 검출되었지만, 손상균에서는 밴드는 거의 또는 전혀 검출되지 않게 되었다(손상균의 경우, 타겟 유전자보다 짧은 밴드가 존재하지만, 이것은 프라이머 이량체임). 따라서, 다단계 처리에 의해 생균만 선택적으로 검출하는 것이 PCR에 의해 가능해졌다. 동일하게 표 5 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 밴드 강도를 수치화한 데이터로부터도 다단계 처리에 의해 469 bp 및 78 bp라는 비교적 짧거나, 또는 매우 짧은 유전자를 타겟으로 한 PCR에서도, 명료하게 생균과 손상균의 식별이 가능해졌다.

또한, 표 7의 각 Ct값도 고려하면, 단회 처리 EMA 25 μg/ml에서도 생균과 손상균의 식별이 가능해졌지만, 생균의 Ct값이 20.9±0.6이 되었고, 다단계 처리(EMA 10/10 μg/ml)의 생균의 Ct값 15.9±0.4와 비교하여 5.0 정도 커졌고, 즉 단회 처리의 경우, 생사의 식별이 가능해지더라도 생균의 검출 한계가 다단계 처리보다 약 2 log₁₀cells/ml 정도 열악하기 때문에 저농도의 사카자키를 검출할 수 없었다.

6. 고찰

MMS 유전자(78 bp)라는 매우 짧은 유전자를 타겟으로 한 PCR의 경우, 비교예 2에 나타내어지는 단회 처리에서는, 10 μg/ml의 EMA를 이용하여 처리하였을 때는 EMA가 손상균에만 선택적으로 투과하고, 손상균의 염색체 DNA를 도처에서 세균 내 효소에 의존하지 않고 직접적으로 EMA가 2개쇄를 절단한다. 그러나, 손상균수가 10⁸ cfu/ml 수준의 고농도이면, 모든 손상균의 타겟 MMS 유전자 영역에 반드시 절단이 들어간다고는 할 수 없고, 그 결과 EMA의 농도가 높아도 단회 처리에 있어서는 손상균의 PCR 최종 증폭 산물은 음성이 되지 않았다고 해석된다. 또한, 단회 처리로 EMA를 10 μg/ml 또는 그 이하의 농도로 작용시킨 경우, EMA는 손상균의 세포벽을 투과하기 어렵고, 고빈도로 염색체 DNA가 절단을 받았을 가능성은 낮다. 따라서, PCR 타겟 영역이 짧은 경우, 모든 손상균 세포의 염색체 DNA의 타겟 영역이 반드시 절단되는 것은 아니고, 그 결과 PCR은 완전히 억제되지 않는다고 생각된다.

한편, 다단계 처리에 있어서는, EMA를 1회 작용시킨 후, EMA가 다소 생균을 투과하여 생균수가 감소하였다고 해도, 배양에 알맞은 배지 중에서 인큐베이션함으로써 생균수를 원래 수치로 복귀시키거나, 생균의 확산 펌프를 회복시키거나, 미반응 EMA를 균체 밖으로 배출시키는 것이 가능하다. 한편, 손상균의 염색체 DNA는 EMA에 의해 도처에서 심하게 절단을 받고는 있지만, PCR 증폭 대상 유전자가 짧은 경우, 모든 염색체 DNA의 본 영역에 반드시 절단이 들어가는 것은 아니지만 또한 그 후의 배지 중에서의 인큐베이션을 행하더라도 생균과는 달리 세포수를 늘리는 것은 불가능하다. 그와 같은 상황하에, 예를 들면 10 μg/ml로 다시 EMA를 작용시키면, 손상균의 세포벽에만 EMA가 투과하고 염색체 DNA의 절단을 한층 더 촉진시켜, 손상균만 PCR 최종 증폭 산물의 밴드가 검출되지 않는 것이라고 생각된다.

[실시예 3]

1. 시료의 제조-살모넬라ㆍ엔테리티디스(생균 및 손상균) 현탁액의 제조

그람 음성 세균인 살모넬라ㆍ엔테리티디스(Salmonella enteritidis IIP 604; 이하, 「살모넬라」라 약기하는 경우가 있음)를 브레인 하트 인퓨젼(BHI) 브로스를 이용하여 37 ℃에서 배양하고, 대수 증식기의 배양액 5 ml를 4 ℃에서 8,000×g, 15 분간 냉각 원심 분리하여 상청을 제거하였다. 균체에 생리 식염수 5 ml를 첨가하여 잘 교반하고, 동일하게 냉각 원심 분리하여 상청을 제거한 후, 균체에 5 ml의 생리 식염수를 첨가하고, 또한 10배 희석하여 생균 현탁액으로 하였다. 이 생균 현탁액의 생균수를 표준 한천 평판 배지에 의해 측정한 결과, 8.06±0.02 log₁₀cfu/ml였다.

또한, 상기 생균 현탁액 1 ml를 1.5 ml 마이크로튜브에 넣고, 비등수에 2 분 침적 후, 빙수에 의해 급냉시켜 손상균 현탁액을 제조하였다. 또한, 이 현탁액 중의 세포에는 소수의 생균 및 사균도 일부 포함된다고 생각되지만, 주로 손상균이기 때문에 단순히 「손상균」이라 기재한다. 또한, 본 발명의 방법은 본래 생균을 검출하는 방법이고, 생균과 구별되는 미생물은 손상균인지 사균인지는 상관없다.

2. 시험 방법

2-1) 다단계 처리(본 발명의 방법)

상기에서 제조한 살모넬라의 생균 현탁액 및 손상균 현탁액에 대하여, 에티듐 모노아자이드(EMA)를 최종 농도 농도 0, 10, 25 또는 100 μg/ml로 첨가하고, 차광하에 4 ℃, 10 분 방치 후, 각 현탁액을 얼음 위에 두고, 현탁액으로부터 20 cm의 거리에 설치한 500 W의 가시광선(FLOOD PRF: 100 V, 500 W, 이와사키 덴키사 제조, 파장: 500 내지 700 nm)을 5 분간 조사하였다. 그 후, 4 ℃에서 15,000×g, 10 분간 냉각 원심 분리하여 상청을 제거하고, 동일한 용량의 생리 식염수를 첨가하여 교반 후, 4 ℃에서 15,000×g, 10 분간 냉각 원심 분리를 행하여 상청을 제거 후, 동일한 용량의 브레인 하트 인퓨젼(BHI) 브로스를 첨가하여 37 ℃에 의해 2 시간 인큐베이션하였다.

2-2) 단회 처리(비교예 3)

1.에서 제조한 살모넬라의 생균 현탁액 및 손상균 현탁액에 대하여, 에티듐 모노아자이드(EMA)를 최종 농도 0, 10, 25 또는 100 μg/ml로 첨가하고, 차광하에 4 ℃, 10 분 방치 후, 각 현탁액을 얼음 위에 두고, 현탁액으로부터 20 cm의 거리에 설치한 500 W의 가시광선(FLOOD PRF: 100 V, 500 W, 이와사키 덴키사 제조, 파장: 500 내지 700 nm)을 5 분간 조사하였다.

2-3) PCR 시험에 사용되는 각 세균 현탁액의 제조

상기 2-1) 및 2-2)에서 처리된 살모넬라의 생균 및 손상균의 각 현탁액을 넣은 마이크로튜브를 4 ℃에서 15,000×g, 10 분간 냉각 원심 분리하였다. 상청을 제거 후, 1 ml의 생리 식염수를 첨가하여 잘 교반하고, 동일한 냉각 원심 처리를 행하였다(세정 처리). 또한 1회 동일한 세정 처리를 행한 후, 펠릿에 초기 용량과 동일한 용량의 멸균수를 첨가하여 잘 교반하였다.

3. 살모넬라의 invasion gene(invA) 유전자 및 엔테로톡신 유전자(모두 short DNA)를 타겟으로 한 PCR

3-1) invA 유전자 및 엔테로톡신 유전자 증폭

invA 유전자 검출용 PCR 마스터 믹스의 각 성분을 하기에 나타내었다.

ㆍG&g 사이언스사 다이렉트 버퍼 MIX: 21 μl

ㆍ(10 pmol/μl) invA-F DNA: 2 μl

invA-F: 살모넬라균 invA 유전자 검출용 Primer Set SIN-1(제품 코드: S018; TakaraBio)

invA-R: 살모넬라균 invA 유전자 검출용 Primer Set SIN-2(제품 코드: S018; TakaraBio)

엔테로톡신 유전자 검출용 PCR 마스터 믹스의 각 성분을 하기에 나타내었다.

ㆍG&g 사이언스사 다이렉트 버퍼 MIX: 21 μl

ㆍ(10 pmol/μl) enterotoxin-F DNA: 2 μl

ㆍ(10 pmol/μl) enterotoxin-R DNA: 2 μl

enterotoxin-F: 살모넬라균 엔테로톡신 유전자 검출용 Primer Set STN-1(제품 코드: S019; TakaraBio)

enterotoxin-R: 살모넬라균 엔테로톡신 유전자 검출용 Primer Set STN-2(제품 코드: S019; TakaraBio)

ㆍEx-Taq Buffer(다카라 슈조사 제조, 카탈로그 번호: RRO01B): 1×

ㆍSYBA Green(BMA사 제조, 카탈로그 번호: 50513): 0.4×

3-2) invA 유전자 및 엔테로톡신 유전자 증폭용 PCR 서멀 사이클 프로파일

3-3) PCR 반응

4. PCR 증폭 산물의 아가로스 겔 전기 영동

상기 3-3)의 PCR 증폭 산물을 2 ％ 아가로스 겔을 이용하여 전기 영동하였다. 전기 영동 종료 후, 아가로스 겔을 1 μg/ml 에티듐브로마이드 수용액에 20 분간 침지하고, 이어서 이온 교환수로 2회 세정한 후, UV 트랜스일루미네이터(파장 254 ㎚)에 의해 invA 유전자 및 엔테로톡신 유전자 증폭 산물의 증폭 정도를 관찰하였다.

5. 시험 결과

살모넬라의 생균 및 손상균에 대하여, 다단계 처리를 행한 후 invA 유전자를 타겟으로 한 PCR을 행하여 아가로스 겔 전기 영동한 결과를 도 4(다단계 처리 레인)에 나타내고, 그 PCR 최종 증폭 산물의 밴드 강도를 수치화한 것을 표 12에 나타내었다. 또한, 살모넬라의 생균 및 손상균에 대하여, 단회 처리를 행한 후 invA 유전자를 타겟으로 한 PCR을 행하여 아가로스 겔 전기 영동한 결과를 도 4(단회 처리 레인)에 나타내고, 그 PCR 최종 증폭 산물의 밴드 강도를 수치화한 것을 표 13에 나타내었다. 표 중에서의 밴드 강도는 밴드의 농담을 바이오라드사 제조 GS-700 Imaging Densitometer(덴시토미터: 측정 파장 600 nm)를 이용하여 전기 영동 방향으로 밴드를 스캔하였을 때의 측정값이다. 또한, 다단계 처리 및 단회 처리의 각 리얼 타임 PCR 커브의 최초 상승 사이클수(Ct값)를 표 14에 나타내었다.

동일하게 엔테로톡신 유전자에 대하여, 다단계 처리 후의 PCR 최종 증폭 산물을 아가로스 전기 영동한 결과를 도 5(다단계 처리 레인), 그 PCR 밴드를 수치화한 것을 표 15에, 단회 처리의 전기 영동 결과를 도 5(단회 처리 레인)에 나타내고, 그 PCR 밴드를 수치화한 것을 표 16에 나타내었다. 또한, 다단계 처리 및 단회 처리의 각 리얼 타임 PCR 커브의 최초 상승 사이클수(Ct값)를 표 17에 나타내었다.

다단계 처리에 있어서 EMA 미첨가의 경우, 살모넬라의 생균과 손상균 모두 invA 유전자 및 entcrotoxin 유전자 증폭 산물로 추찰되는 밴드가 검출되어, 생균만을 특이적으로 검출할 수 없었다. 그러나, 다단계 처리로 EMA를 첨가한 경우(EMA 10 μg/ml-인큐베이션-EMA 10 μg/ml), 생균에서는 밴드는 명료하게 검출되었지만, 손상균에서는 밴드는 거의 또는 전혀 검출되지 않게 되었다. 따라서, 다단계 처리에 의해 생균만 선택적으로 검출하는 것이 PCR에 의해 가능해졌다. 동일하게 표 12 및 표 15에 나타낸 바와 같이, 밴드 강도를 수치화한 데이터로부터도 다단계 처리에 의해 378 bp 및 264 bp라는 비교적 짧거나, 또는 매우 짧은 유전자를 타겟으로 한 PCR에서 명료하게 생균과 손상균의 식별이 가능해졌다.

또한, 표 14의 각 Ct값도 고려하면, 단회 처리 EMA 25 μg/ml 및 100 μg/ml에서도 생균과 손상균의 식별이 가능해졌지만, 생균의 Ct값이 각각 18.2±0.3, 27.7±3.8이 되었고, 다단계 처리(EMA 10/10 μg/ml)의 생균의 Ct값 16.0±3.5와 비교하여 2.2 및 11.7 정도 커졌고, 즉 단회 처리의 경우, 생사의 식별이 가능해지더라도, 생균의 검출 한계가 다단계 처리보다 약 1 log₁₀cells/ml 또는 4 log₁₀cells/ml 정도 열악하기 때문에 저농도의 사카자키를 검출할 수 없었다.

6. 고찰

invA 및 엔테로톡신 유전자(378 bp 및 284 bp)라는 짧은 유전자를 타겟으로 한 PCR의 경우, 비교예 3에 나타내어지는 단회 처리에서는, 10 μg/ml의 EMA를 이용하여 처리하였을 때는, EMA가 손상균의 염색체 DNA를 도처에서 세균 내 효소에 의존하지 않고 직접적으로 EMA가 2개쇄를 절단하여 PCR을 억제하였다. 그러나, 생균에 있어서는, EMA 농도가 높아지면 Ct값이 상승하여, 생균의 검출 한계의 저하를 초래하였다.

한편, 다단계 처리에 있어서는, EMA를 1회 작용시킨 후 EMA가 다소 생균을 투과하여 생균수가 감소되었다고 해도, 배양에 알맞은 배지 중에서 인큐베이션함으로써, 생균수를 원래 수치로 복귀시키거나 생균의 확산 펌프를 회복시키거나 미반응 EMA를 균체 밖으로 배출시키는 것이 가능하다. 한편, 손상균의 염색체 DNA는 EMA에 의해 도처에서 심하게 절단을 받고는 있지만, PCR 증폭 대상 유전자가 짧은 경우, 모든 염색체 DNA의 본 영역에 반드시 절단이 들어가는 것은 아니지만 또한 그 후의 배지 중에서의 인큐베이션을 행하더라도 생균과는 달리 세포수를 늘리는 것은 불가능하였다. 그와 같은 상황하에, 예를 들면 10 μg/ml로 다시 EMA를 작용시키면, 손상균의 세포벽에만 EMA가 더 투과하고 염색체 DNA의 절단을 한층 더 촉진시켜, 손상균만 PCR 최종 증폭 산물의 밴드가 검출되지 않는 것이라고 생각된다. 또한, 표 14 및 17의 Ct값에 의해 평가하더라도, 다단계 처리쪽이 도중에 배지 중에서의 인큐베이션을 도입하였기 때문에, 결과적으로 생균의 검출 한계도 향상시키고 이에 의해 저농도의 생균만의 검출을 가능하게 하는 것으로 결론지어졌다.

이상으로부터, 본 발명의 방법(다단계 처리)에 있어서 그람 음성 세균으로서 엔테로박터ㆍ사카자키, 살모넬라, 또한 그람 양성 세균으로서 리스테리아의 80 내지 500 염기 정도의 총 5개의 짧은 유전자를 타겟으로 하여 PCR을 행한 경우, 어떤 케이스에서도 10⁸ cells의 손상균(사균도 포함함)의 PCR 최종 증폭 산물이 검출되지 않고, 생균의 PCR 최종 증폭 산물이 검출되었기 때문에, 최대 10⁵ 내지 10⁷ cells/ml의 각종 병원 세균ㆍ손상균이나 사균을 포함하는 우유에서도, 생균을 특이적으로 검출하는 것이 가능하였다. 또한, 본 실시예 2에 나타낸 바와 같이 사카자키에 특이적으로 존재하지만 반드시 병원성과는 직접적으로는 관여하지 않은 MMS 유전자를 이용하더라도, 다단계 처리에 의해 짧은 유전자를 타겟으로 한 PCR에서 생균과 손상균의 식별을 가능하게 하였고, 본원이 병원 세균만을 타겟한 것이 아니라 병원 세균을 포함하여 부패균 등의 일반 세균에도 적용 가능한 것을 시사하였다. 따라서, 식품 위생 검사의 0-157, 살모넬라, 리스테리아, 엔테로박터ㆍ사카자키, 캄필로박터ㆍ제주니, 황색 포도상 구균, 세레우스균, 보툴리누스균, 웰치균 등의 그람 음성 세균 및 그람 양성 세균의 검사로서 널리 적용하는 것이 가능하다고 생각하였다.

또한, 균혈증이며 간기능 장해를 갖는 환자의 경우, 혈액 중에 병원 세균의 생균 및 항생 물질 손상균이 10⁴ cells/ml 이상의 고농도로 존재할 가능성도 있고, 그와 같은 케이스에서도 본 발명에 의해 병원 세균의 생균만을 검출할 수 있는 것으로 기대된다. 또한, 결핵 환자의 항결핵제에 의한 치유 경과 관찰에 적용하는 경우 주로 객담(喀痰)이 검사 재료가 되지만, 결핵 환자의 치료 전에서의 결핵균의 생균수는 10⁸ 내지 10⁹ cells/g인 경우가 상당수를 차지하고, 이들 환자의 치료 후기에는 항결핵제에 의한 손상 결핵균이 10⁷ 내지 10⁸ cells/g의 농도로 존재하였다. 그와 같은 상황하에, 배양 가능한 살아있는 결핵균을 정량하는 것이 배양법의 신속 대체법으로서 기대되지만, 본 발명에 의해 PCR을 결핵 환자의 치료 경과 진단에 응용하는 것이 가능해진다고 생각되었다.

[참고예 1] 식품으로부터의 피검 시료의 제조

본 발명의 피검 시료의 하나인 식품으로서, 우유 중에 미생물이 혼입된 경우를 상정한 피검 시료의 제조법을 이하에 예시한다.

우유에, 최종 농도가 1 내지 5 mM, 특히 2 mM가 되도록 EDTA 용액, 및 최종 농도가 0.1 내지 0.5 ％, 특히 0.1 ％가 되도록 Tween80을 각각 첨가하고, 10,000×g에서 10 분간 4 ℃에 의해 냉각 원심 분리하였다. 또한, 최종 농도 10 내지 20 U/ml의 리파제(시그마사 제조 E.C.3.1.1.3)를 첨가하고, 30 내지 37 ℃에 의해 30 분 내지 1 시간 동안 처리한 후, 최종 농도가 20 U/ml가 되도록 프로테이나제 K(시그마사 제조 E.C.3.4.21.64)를 첨가하여 30 분 내지 1 시간 동안 방치하는 것이 바람직하다. 액 표면의 지방층 및 중간부의 수층을 제거하고, 침사(沈渣)를 회수하였다. 이 침사에는 세균, 유선 상피 세포, 소 백혈구 등의 체세포가 포함되어 있고, 10,000×g 이상에서 원심 분리한 경우에는, 프로테이나제 K에 의해 불완전하게 분해된 미셀 단백질 분해물(카제인 미셀 불완전 분해물)도 포함된다. 여기서 카제인 미셀 불완전 분해물은 소수성이 높은 α,β-카제인의 서브미셀이라고 생각된다.

상기 침사에 당초와 동일한 용량의 생리 식염수를 첨가하여 현탁한 후, 100×g에서 5 분간 4 ℃에서 냉각 원심 분리하고, 미생물 등이 존재하는 상청을 회수하였다.

[참고예 2] 혈액으로부터의 피검 시료의 제조(1)

헤파린 처리(heparinized) 혈액에 동일한 용량의 생리 식염수를 첨가하고, 10,000×g에서 5 분간 4 ℃에서 원심 분리하고, 상청은 제거하고 침사를 회수하였다. 이 침사에는 세균, 혈소판, 단구나 림프구 등의 단핵구, 과립구 및 적혈구가 포함되어 있었다.

[참고예 3] 혈액으로부터의 피검 시료의 제조(2)

헤파린 처리 혈액에 동일한 용량의 생리 식염수를 첨가하고, 100×g에서 5 분 4 ℃에서 냉각 원심 분리하고, 혈장과 혈구 성분(단구나 림프구 등의 단핵구, 및 과립구 및 적혈구)으로 분리하고, 미생물이 존재하는 혈장을 회수하였다.

[참고예 4] 혈액으로부터의 피검 시료의 제조(3)

헤파린 처리 혈액에 동일한 용량의 생리 식염수를 첨가하였다. 멸균 시험관에 우선 2배 희석된 헤파린 처리 혈액과 동일한 용량의 Ficoll-Paque[아마샴 바이오사이언스사 제조; Ficoll 400(피콜 400)은 5.7 g/100 ml, 디아트리조에이트나트륨은 9 g/100 ml, 비중 1.077 g/ml]를 충전하고, 그 후 상기 2배 희석된 헤파린 처리 혈액을 시험관을 비스듬히 기울이면서 천천히 중층하였다. 계속해서, 100×g, 5 분간, 4 ℃에서 냉각 원심 분리하고, 미생물이 존재하는 상청을 회수하였다. 또한, Ficoll-Paque에 2배 희석된 헤파린 처리 혈액을 중층하기 전에 최종 농도 10 내지 20 U/ml의 리파제(시그마사 제조 E.C.3.1.1.3) 용액을 첨가한 후, 10 내지 50 U/ml의 데옥시리보뉴클레아제 I(시그마사 제조, EC3.1.21.1) 용액을 첨가하고, 30 내지 37 ℃에 의해 30 분 내지 1 시간 동안 처리한 후, 최종 농도 10 내지 20 U/ml가 되도록 프로테이나제 K(시그마사 제조 E.C.3.4.21.64)를 첨가하고, 30 내지 37 ℃에 의해 30 분 내지 1 시간 동안 처리하는 것이 바람직하다.

[참고예 5] 혈액으로부터의 피검 시료의 제조(4)

멸균 시험관에 미리 헤파린 처리 혈액의 1/2 용량이 되도록 Monopoly^TM[아마샴 바이오사이언스사 제조; Ficoll(피콜)과 Metrizoate(메트리조에이트)의 혼합액, 비중 1.115 g/ml] 첨가해두고, 시험관을 기울이면서 천천히 헤파린 처리 혈액을 중층하였다. 그 후, 100×g, 5 분, 4 ℃에서 냉각 원심 분리하고, 세균이 존재하는 상청을 회수하였다.

본 발명에 의해, 핵산 증폭법에 의한 간편하면서 신속한 식품 및 생체 시료, 공업용수나 수돗물 등의 환경 중의 생균ㆍ손상균ㆍ사균의 판별이 가능해진다. 본 발명의 방법 및 키트는 자주 검사에 응용 가능하고, 경제성도 우수하다.

SEQUENCE LISTING <110> KYUSHU UNIVERSITY <120> Method and Kit for Detecting Microorganism <130> FP186-C7308 <150> JP2007-212366 <151> 2007-08-16 <160> 6 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer hlyA-F <400> 1 tgcaagtcct aagacgcca 19 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer hlyA-R <400> 2 cactgcatct ccgtggtata ctaa 24 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer ompA-F <400> 3 ggatttaacc gtgaactttt cc 22 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer ompA-R <400> 4 cgccagcgat gttagaaga 19 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer MMS-F <400> 5 gggatattgt cccctgaaac ag 22 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer MMS-R <400> 6 cgagaataag ccgcgcatt 19

Claims

a) 피검 시료에, 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 DNA를 가교하는 가교제를 첨가하는 공정,

b) 가교제를 첨가한 피검 시료에 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사 처리를 행하는 공정,

c) 광 조사 처리한 피검 시료에 함유된 가교제를 제거하는 공정,

d) 가교제를 제거한 피검 시료에 배지를 첨가하여 보온하는 공정,

e) 보온한 피검 시료에 다시 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 DNA를 가교하는 가교제를 첨가하는 공정,

f) 가교제를 첨가한 피검 시료에 350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사 처리를 행하는 공정,

g) 상기 피검 시료로부터 DNA를 추출하고, 추출된 DNA의 타겟 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭하는 공정, 및

h) 증폭 산물을 해석하는 공정

을 포함하는, 피검 시료 중의 미생물의 생균, 사균 및 손상균을 식별하여 미생물의 생균을 검출하기 위한 방법.
제1항에 있어서, 상기 증폭 산물의 해석을, 미생물의 표준 시료를 이용하여 작성된 미생물량 및 증폭 산물과의 관련을 나타내는 표준 곡선을 이용하여 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 핵산 증폭법이 PCR법, LAMP법, SDA법, LCR법 또는 DNA 마이크로어레이법인 방법.
제2항에 있어서, 상기 핵산 증폭법이 PCR법, LAMP법, SDA법, LCR법 또는 DNA 마이크로어레이법인 방법.
제3항에 있어서, 상기 PCR법을 리얼 타임 PCR법에 의해 행하고, PCR과 증폭 산물의 해석을 동시에 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 PCR법을 리얼 타임 PCR법에 의해 행하고, PCR과 증폭 산물의 해석을 동시에 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 피검 시료가 식품, 혈액 시료, 뇨 시료, 수액 시료, 활액 시료, 흉수 시료, 공업용수, 수돗물, 지하수, 하천수 또는 빗물 중 어느 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 피검 시료가 식품, 혈액 시료, 뇨 시료, 수액 시료, 활액 시료, 흉수 시료, 공업용수, 수돗물, 지하수, 하천수 또는 빗물 중 어느 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 피검 시료가 식품, 혈액 시료, 뇨 시료, 수액 시료, 활액 시료, 흉수 시료, 공업용수, 수돗물, 지하수, 하천수 또는 빗물 중 어느 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 피검 시료가 식품, 혈액 시료, 뇨 시료, 수액 시료, 활액 시료, 흉수 시료, 공업용수, 수돗물, 지하수, 하천수 또는 빗물 중 어느 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 피검 시료가 식품, 혈액 시료, 뇨 시료, 수액 시료, 활액 시료, 흉수 시료, 공업용수, 수돗물, 지하수, 하천수 또는 빗물 중 어느 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 피검 시료가 식품, 혈액 시료, 뇨 시료, 수액 시료, 활액 시료, 흉수 시료, 공업용수, 수돗물, 지하수, 하천수 또는 빗물 중 어느 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교제가 에티듐 모노아자이드(ethidium monoazide), 에티듐 디아지드(ethidium diazide), 프솔라렌(psolaren), 4,5',8-트리메틸 프솔라렌(4,5',8-trimethyl psolaren) 및 8-메톡시 프솔라렌(8-methoxy psolaren)에서 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타겟 영역이 50 내지 5000 염기의 영역인 방법.
제13항에 있어서, 상기 타겟 영역이 50 내지 5000 염기의 영역인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 병원성 세균인 방법.
제13항에 있어서, 상기 미생물이 병원성 세균인 방법.
제14항에 있어서, 상기 미생물이 병원성 세균인 방법.
제15항에 있어서, 상기 미생물이 병원성 세균인 방법.
제16항에 있어서, 상기 타겟 영역이 병원 유전자인 방법.
제17항에 있어서, 상기 타겟 영역이 병원 유전자인 방법.
제18항에 있어서, 상기 타겟 영역이 병원 유전자인 방법.
제19항에 있어서, 상기 타겟 영역이 병원 유전자인 방법.
350 nm 내지 700 nm 파장의 광 조사에 의해 DNA를 가교하는 가교제,

배지, 및

검출 대상의 미생물 DNA의 타겟 영역을 핵산 증폭법에 의해 증폭하기 위한 프라이머

를 포함하는, 피검 시료 중의 미생물의 생균, 사균 및 손상균을 식별하여 미생물의 생균을 핵산 증폭법에 의해 검출하기 위한 키트.
제24항에 있어서, 상기 핵산 증폭법이 PCR법, LAMP법, SDA법, LCR법 또는 DNA 마이크로어레이법인 키트.
제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 가교제가 에티듐 모노아자이드(ethidium monoazide), 에티듐 디아지드(ethidium diazide), 프솔라렌(psolaren), 4,5',8-트리메틸 프솔라렌(4,5',8-trimethyl psolaren) 및 8-메톡시 프솔라렌(8-methoxy psolaren)에서 선택되는 것인 키트.