CN101341249B - 用于检测微生物的方法和用于检测微生物的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

测试样品中的活微生物可通过下述步骤进行检测：a)用拓扑异构酶抑制剂和/或DNA回旋酶抑制剂处理测试样品，b)从测试样品提取DNA，和通过PCR扩增DNA的靶区域，和c)分析扩增产物。

Description

用于检测微生物的方法和用于检测微生物的试剂盒
技术领域
本发明涉及用于检测食品或临床样品中包含的微生物的方法，和用于检测微生物的试剂盒。更具体而言，本发明涉及用于检测微生物的方法和试剂盒，所述方法和试剂盒使得能够选择性检测食品或临床样品中包含的微生物活细胞。
背景技术
平板培养法已常规地用于测量食品、临床样品或环境中的一般活细菌计数。然而，平板培养法需要约2天的时间以获得结果。
因为关于食品的灭菌技术和加工技术的改善，区别测试样品中存在的微生物的存活和死亡状态的需要日益增加，即使在细胞以极其少量存在的情况下。特别是在食物卫生检查和临床测试领域中，作为用于检测细菌的快速方法，尝试通过经由PCR扩增对细菌特异的基因来测定细菌的存在或不存在以及确定细菌的量，所述基因扩增至这样的量从而使得基因可以在视觉上观察到。然而，如果靶向细菌DNA，那么同时检测到测试样品中最初包含的起源于死细胞的背景，并且因此通过PCR获得的阳性结果不一定暗示活细菌的存在。因此，食物卫生和临床测试领域中的目前情况是，尽管PCR是高度灵敏且快速的技术，但它并未被广泛使用。
目前，尝试通过下述方法仅检测和定量测试样品中的活细胞：以mRNA作为靶用逆转录酶制备cDNA并用对各种细菌特异的引物进行PCR。然而，在这种方法中，死细胞自身mRNA的逆转录未被抑制，并且当测试样品中包含104cfu/ml或104cfu/g或更多的死细胞时，检测到起源于死细胞的背景。因此，作为用于区别存活和死亡状态的方法，这种方法不能说是充分的。
具体而言，使用PCR法作为用于区别微生物例如细菌的存活和死亡状态的方法，专利文件1和2中描述的方法已得到公开。然而，在使用PCR法用于区别微生物例如细菌的存活和死亡状态的这些方法中仍存在下述问题。
关于专利文件1中公开的技术，提及用于区别实施于100℃10-30分钟高温长时间灭菌的煮沸食品中包含的死细胞，以及区别实施乙醇灭菌或甲醛灭菌的食品中包含的微生物的实施例。然而，不存在实际上实施此种巴氏消毒处理，特别是后面一种类型处理的食品。此外，不存在实施食物工业中目前主要的巴氏消毒法-低温长时间巴氏消毒法(LTLT巴氏消毒法)，高温短时间巴氏消毒法(HTST巴氏消毒法)，或超高温巴氏消毒法(UHT巴氏消毒法)的仅仅活微生物的假定检测，以及施用抗生素的传染病患者的临床样品中仅仅活的特定病原菌的检测。此外，在包含浓度为104cfu/ml或更高的死细胞背景的食品或临床样品测试样品的情况下，衍生自死细胞的最终PCR扩增产物的量超过了专利文件1的技术的检出限，并且因此不可能确定通过PCR获得的测试样品的阳性应答衍生自活细胞还是死细胞。
此外，作为专利文件2的技术，公开了通过利用与活细胞的那种相比较，死细胞的RNA/DNA摩尔比中的相对减少来区别活细胞和死细胞的方法。在这种方法中，提取总RNA，通过使用逆转录反应制备互补DNA，随后进行PCR以计算其Ct值，并且通过使用分别制备的校准曲线获得RNA的摩尔浓度。分别地，通过PCR扩增对应那种RNA的染色体DNA区域，以获得其Ct值，并且基于校准曲线计算染色体DNA的摩尔浓度，以获得RNA/DNA摩尔比。即，上述程序需要执行麻烦的总RNA提取以及使用逆转录反应和PCR 2个步骤。因此，在定量性能和速度方面，这种技术次于靶向DNA的通常PCR。进一步地，RNA在活细胞中连续生产，而衍生自死细胞的RNA在早期时分解。因此，该技术缺乏稳定性。此外，在包含高浓度死细胞的食品或临床样品中，只有那种浓度1/10的活细胞可以通过这种技术进行检测。因此，难以在要求速度、高灵敏性和精确度的食物卫生检查和临床测试领域中应用这种技术。
专利文件1：在日本未经审查公开的国际专利申请号2000-530118
专利文件2：国际专利公开WO2002/052034小册子
发明内容
通过本发明解决的问题
本发明的目的是提供与死细胞或损伤的细胞(损伤的细胞或活而非可培养的细胞(VNC细胞))形成对比，用于选择性检测食品或临床样品中包含的微生物活细胞(活且可培养的细胞)的方法，即可替代培养方法但事实上继承培养方法特征的快速检测方法，以及用于执行该方法的试剂盒。
用于解决问题的方法
本发明的发明人专心于对这样的方法进行研究，所述方法用于确定可应用于各种灭菌方法的细胞是存活还是死亡的，显示高检测灵敏性，适合于食物卫生检查，还使得能够检测医院或诊所场所的传染病患者中的特定病原菌。结果，他们发现在区别测试样品中的微生物活细胞与损伤的细胞的方法中，通过用拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物处理测试样品，或通过用乙锭单氮化物(ethidium monoazide)、用可见光照射、和除乙锭单氮化物外的拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物处理测试样品，通过PCR可以选择性扩增活细胞的染色体DNA，并且可以提供可替代培养方法的快速方法。因此，他们实现了本发明。
即，本发明提供了用于检测测试样品中的微生物活细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
a)用拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物处理测试样品的步骤，
b)从测试样品中提取DNA，和通过PCR扩增提取的DNA的靶区域的步骤，和
c)分析扩增产物的步骤。
在上述方法的优选实施方案中，扩增产物通过使用代表微生物和扩增产物量的关系的标准曲线进行分析，所述标准曲线通过使用微生物的标准样品进行制备。
在上述方法的优选实施方案中，PCR通过实时PCR来进行，并且PCR和扩增产物的分析同时进行。
在上述方法的优选实施方案中，测试样品是乳、乳制品、由乳或乳制品作为原材料生产的食品、血液样品、尿样品、脊髓液样品、滑液样品和胸膜液(pleural fluid)样品之一。
在上述方法的优选实施方案中，微生物是细菌。
在上述方法的优选实施方案中，靶区域是23S rRNA基因。在这个实施方案中，PCR优选通过使用引物SEQ ID NOS：1和2的引物组，或引物SEQ ID NOS：3和4的引物组来进行。
在上述方法的优选实施方案中，微生物是病原菌。在这个实施方案中，靶区域优选是致病性基因。此外，在这个实施方案中，PCR优选通过使用引物SEQ ID NOS：7和8的引物组来进行。
在上述方法的优选实施方案中，拓扑异构酶毒物选自安吖啶、喜树碱、阿霉素、椭圆玫瑰树碱、依托泊苷、米托蒽醌、saintopin、拓扑替康和CP-115,953。
在上述方法的优选实施方案中，DNA回旋酶毒物选自环丙沙星、氧氟沙星、依诺沙星、培氟沙星、氟罗沙星、诺氟沙星、萘啶酸、奥索利酸和吡咯米酸。
在上述方法的优选实施方案中，拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物是乙锭单氮化物，并且所述方法包括对加入乙锭单氮化物的测试样品实施可见光照射的步骤。
在上述方法的优选实施方案中，测试样品用乙锭单氮化物，和除乙锭单氮化物外的拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物进行处理。
在上述方法的优选实施方案中，在上述步骤a)前执行下述步骤：
d)用拓扑异构酶和/或DNA回旋酶处理测试样品的步骤。
此外，上述方法提供了用于通过PCR检测测试样品中的微生物活细胞的试剂盒，所述试剂盒包含下述元件：
拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物，和
用于通过PCR扩增待检测的微生物DNA靶区域的引物。
在上述试剂盒的优选实施方案中，该试剂盒包含拓扑异构酶和/或DNA回旋酶。
在上述试剂盒的优选实施方案中，拓扑异构酶毒物选自安吖啶、喜树碱、阿霉素、椭圆玫瑰树碱、依托泊苷、米托蒽醌、saintopin、拓扑替康和CP-115,953。
在上述试剂盒的优选实施方案中，DNA回旋酶毒物选自环丙沙星、氧氟沙星、依诺沙星、培氟沙星、氟罗沙星、诺氟沙星、萘啶酸、奥索利酸和吡咯米酸。
在上述试剂盒的优选实施方案中，该试剂盒包含乙锭单氮化物，和除乙锭单氮化物外的拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物。
在上述试剂盒的优选实施方案中，上述引物由引物SEQ ID NOS：1和2的引物组，或引物SEQ ID NOS：3和4的引物组组成。
在上述试剂盒的另一个优选实施方案中，上述引物由引物SEQ IDNOS：7和8的引物组组成。
附图简述
[图1]电泳照片显示了损伤的细胞的细胞内DNA酶对利斯特氏菌属(Listeria)(损伤的细胞)染色体DNA的影响，安吖啶对利斯特氏菌属(损伤的细胞)染色体DNA的影响，安吖啶对利斯特氏菌属(活细胞)染色体DNA的影响。
Non：未处理的，
安吖啶(-)：未添加安吖啶，
安吖啶(+)：添加安吖啶，
1：于30℃温育24小时，
2：于30℃温育48小时，
3：于30℃温育72小时。
[图2]电泳照片显示了损伤的细胞的细胞内DNA酶对肠杆菌属(Enterobacter)(损伤的细胞)染色体DNA的影响：
Non：未处理的，
1：于37℃温育24小时，
2：于37℃温育48小时，
3：于37℃温育72小时。
[图3]电泳照片显示了环丙沙星对肠杆菌属(活细胞和损伤的细胞)染色体DNA的影响：
Non：未处理的，
1：于37℃温育1.5小时，
2：于37℃温育3.5小时，
3：于37℃温育5小时，
4：于37℃温育72小时。
[图4]电泳照片显示了损伤的细胞的细胞内DNA酶对利斯特氏菌属(损伤的细胞)染色体DNA的影响：
Non：未处理的，
1：于30℃温育24小时，
2：于30℃温育48小时，
3：于30℃温育72小时。
[图5]电泳照片显示了环丙沙星对利斯特氏菌属(活细胞和损伤的细胞)染色体DNA的影响：
Non：未处理的，
1：于30℃温育1.5小时，
2：于30℃温育3.5小时，
3：于30℃温育5小时，
4：于30℃温育72小时。
[图6]靶向用环丙沙星处理的肠杆菌属(活细胞)23S rRNA基因的实时PCR中的扩增曲线(照相铜板照片)。
[图7]靶向用环丙沙星处理的肠杆菌属(活细胞)23S rRNA基因的实时PCR中的扩增产物的TM模式(照相铜板照片)。
[图8]靶向用环丙沙星处理的肠杆菌属(损伤的细胞)23S rRNA基因的实时PCR中的扩增曲线(照相铜板照片)。
[图9]靶向用环丙沙星处理的肠杆菌属(损伤的细胞)23S rRNA基因的实时PCR中的扩增产物的TM模式(照相铜板照片)。
[图10]靶向用环丙沙星处理的利斯特氏菌属(活细胞)23S rRNA基因的实时PCR中的扩增曲线(照相铜板照片)。
[图11]靶向用环丙沙星处理的利斯特氏菌属(损伤的细胞)23SrRNA基因的实时PCR中的扩增曲线(照相铜板照片)。
[图12]曲线图显示了包含细胞悬浮液的微型管在沸水中的浸没时间和微型管中的悬浮液温度的关系。
[图13]电泳照片显示了靶向用或未用EMA处理的7种细菌(活细胞和损伤的细胞)的16S rRNA基因的PCR基因扩增结果，对于每种细菌显示顺序为未用EMA处理的活细胞悬浮液、用EMA处理的活细胞悬浮液、未用EMA处理的损伤的细胞悬浮液、和用EMA处理的损伤的细胞悬浮液。这将同样应用于图14和15。
[图14]电泳照片显示了靶向用或未用EMA处理的4种细菌(活细胞和损伤的细胞)的23S rRNA基因的PCR基因扩增结果。
[图15]电泳照片显示了靶向用或未用EMA处理的利斯特氏菌属(活细胞和损伤的细胞)的23S rRNA基因的PCR基因扩增结果。
[图16]电泳照片显示了靶向用或未用EMA处理随后用DNA回旋酶毒物或拓扑异构酶毒物处理的利斯特氏菌属(活细胞和损伤的细胞)的hlyA基因的PCR基因扩增结果。
Non：未处理的，
E：EMA
1：EMA/环丙沙星，
2：EMA/喜树碱，
3：EMA/依托泊苷，
4：EMA/椭圆玫瑰树碱，
5：EMA/米托蒽醌，
6：EMA/安吖啶。
[图17]电泳照片显示了靶向用或未用EMA处理随后用DNA回旋酶毒物或拓扑异构酶毒物处理的利斯特氏菌属(活细胞和损伤的细胞)的16S rRNA基因的PCR基因扩增结果。
Non：未处理的，
E：EMA
1：EMA/环丙沙星，
2：EMA/喜树碱，
3：EMA/依托泊苷，
4：EMA/椭圆玫瑰树碱，
5：EMA/米托蒽醌，
6：EMA/安吖啶。
[图18]电泳照片显示了靶向用或未用EMA处理随后用DNA回旋酶毒物或拓扑异构酶毒物处理的利斯特氏菌属(活细胞和损伤的细胞)的23S rRNA的PCR基因扩增结果。
Non：未处理的，
E：EMA
1：EMA/环丙沙星，
2：EMA/喜树碱，
3：EMA/依托泊苷，
4：EMA/椭圆玫瑰树碱，
5：EMA/米托蒽醌，
6：EMA/安吖啶。
用于执行本发明的最佳方式
在下文中将详细解释本发明的优选实施方案。然而，本发明并不限于下述优选实施方案，并且可以在本发明的范围内自由地进行修改。在本说明书中，除非另有说明百分比在质量基础上使用。
<1>本发明的方法
本发明的方法是用于检测测试样品中的微生物活细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
a)用拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物处理测试样品的步骤，
b)从测试样品中提取DNA，和通过PCR扩增提取的DNA的靶区域的步骤，和
c)分析扩增产物的步骤。
在本说明书中，“测试样品”是检测其中存在的微生物活细胞的对象，并且它并不具体加以限制，只要活细胞的存在可以通过经由PCR扩增染色体DNA的特定区域进行检测。例子包括食品，例如乳、乳制品、由乳或乳制品作为原材料的食品，血液样品，尿样品，脊髓液样品，滑液样品和胸膜液样品等。乳、乳制品、由乳或乳制品作为原材料的食品是尤其优选的。在本发明中，测试样品可以是上述产品和生物样品本身中的任何一种，并且可以是通过稀释或浓缩上述产品和生物样品中的任何一种，或对上述产品和生物样品中的任何一种实施除根据本发明方法的处理外的预处理来获得的。预处理的例子包括热处理、过滤、离心等。
“微生物”是通过本发明的方法进行检测的对象，并且不具体加以限制，只要它可以经由PCR进行检测，并且拓扑异构酶毒物和DNA回旋酶毒物作用于微生物活细胞的方式不同于对于微生物死细胞和损伤的细胞的那种。优选例子包括细菌、丝状真菌、酵母等。细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌的例子包括葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌例如表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、链球菌属(Streptococcus)细菌、利斯特氏菌属细菌例如单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌例如蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)细菌等。革兰氏阴性细菌的例子包括由埃希氏菌属(Escherichia)细菌例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)代表的肠细菌、肠杆菌属(Enterobacter)细菌例如阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)细菌例如差异柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、和克雷伯氏菌属(Klebsiella)例如产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、和沙门氏菌属(Salmonella)细菌、弧菌属(Vibrio)细菌、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌等。
在本发明中，“活细胞”指处于这样的状态中的细胞：细胞可以增殖，并且当它在一般优选的培养条件下培养时显示微生物的代谢活性(活且可培养态)，并且是基本不含细胞壁损伤的细胞。作为上文提及的代谢活性，可以例示的是ATP活性，酯酶活性等。
“死细胞”是处于这样的状态中的细胞：它不能增殖，并且即使在最佳培养条件下培养也不显示代谢活性(死亡状态)。此外，它处于这样的状态中，尽管细胞壁的结构被维持，但细胞壁自身是高度损伤的，并且显示弱通透性的核染色剂例如碘化丙锭可以穿透细胞壁。
“损伤的细胞”(损伤的细胞或活而非可培养的细胞)是处于这样的状态中的细胞：即使当它在最佳培养条件下培养时它也几乎不增殖，因为由于人工应激或环境应激它是损伤的，并且它显示的代谢活性与活细胞比较处于较低水平，但与死细胞比较处于显著水平。
特别是在食物卫生检查和临床测试领域中，通过使用温和的热处理或施用抗生素显示损伤的细胞状态的细菌的检测是有吸引力的关注，并且本发明提供了用于检测微生物的方法，所述方法使得不仅能够检测活细胞，还能够区别活细胞与死细胞或损伤的细胞。
活细胞、损伤的细胞和死细胞的细胞数目单位通常由细胞数目(细胞)/ml表示。活细胞的数目可以近似为通过在合适的平板培养基上在最佳条件下培养细胞形成的集落数目(cfu/ml(集落生成单位/ml))。损伤的细胞的标准样品可以通过对活细胞悬浮液实施热处理例如在沸水中的热处理来制备。在这种情况下，此种样品中的损伤的细胞数目可以近似为热处理前的活细胞悬浮液的cfu/ml。尽管用于制备损伤的细胞的沸水中的热处理的时间依赖于微生物的类型而变，但例如实施例中描述的细菌的损伤的细胞可以通过约50秒的热处理来制备。此外，损伤的细胞的标准样品还可以通过用抗生素处理来制备。在此种情况下，损伤的细胞的细胞数目可以近似为细胞在合适的平板培养基上在最佳条件下培养时形成的集落数目(cfu/ml)，这通过用抗生素处理活细胞悬浮液后去除抗生素，测量可见光(波长：600nm)的透光度即浊度，且比较该浊度与活细胞密度已知的活细胞悬浮液的浊度来实现。
本发明的方法用于检测活细胞，并且与活细胞区别的微生物细胞可以是损伤的细胞或死细胞。
在本发明中，“活细胞的检测”包括确定测试样品中活细胞的存在或不存在和确定测试样品中活细胞的量。活细胞的量不限于绝对量，并且可以是相对于对照样品中的那种的相对量。
在下文中本发明的方法将对于每个步骤进行说明。
(1)步骤a)
测试样品用拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物进行处理的。
用于本发明的拓扑异构酶毒物和DNA回旋酶毒物指不抑制分别用于切割DNAs的拓扑异构酶和DNA回旋酶的活性，但抑制DNAs的再连接，或增强DNA切割的正向速率的那些。拓扑异构酶毒物和DNA回旋酶毒物优选是通过共价附着与微生物的染色体DNAs结合的那些，在可见光照射后插入染色体DNAs内且通过共价附着与染色体DNAs结合的那些，简单插入染色体DNAs内的那些，或与拓扑异构酶或DNA回旋酶形成复合物的那些。
可以使用拓扑异构酶毒物和DNA回旋酶毒物两者，或可以使用任何一种。
拓扑异构酶毒物和DNA回旋酶毒物优选是对活细胞，和损伤的细胞、死细胞、体细胞例如牛白细胞、白细胞和血小板等显示不同作用的那些，更具体而言，与对于活细胞的细胞壁的那种比较，对于损伤的细胞和死细胞的细胞壁和体细胞例如牛白细胞、白细胞和血小板等的细胞膜显示更高的通透性的那些。
拓扑异构酶毒物的例子包括安吖啶、喜树碱、阿霉素、椭圆玫瑰树碱、依托泊苷、米托蒽醌、saintopin、拓扑替康、CP-115,953等。可以单独使用一种拓扑异构酶毒物，或可以组合使用它们中的2种或更多种。
DNA回旋酶毒物的例子包括环丙沙星、氧氟沙星、依诺沙星、培氟沙星、氟罗沙星、诺氟沙星、萘啶酸、奥索利酸、吡咯米酸等。可以单独使用一种DNA回旋酶毒物，或可以组合使用它们中的2种或更多种。
可以适当地确定关于用拓扑异构酶毒物或DNA回旋酶毒物处理的条件。例如，使得能够容易区别活细胞与死细胞和损伤的细胞的条件可以通过下述方法来确定：向作为检测对象的微生物活细胞和死细胞或损伤的细胞的悬浮液中添加各种浓度的拓扑异构酶毒物或DNA回旋酶毒物，使它们放置各种时间段，随后通过离心等收获细胞，且通过PCR分析细胞。此外，使得能够容易区别作为检测对象的微生物活细胞与体细胞例如牛白细胞、血小板等的条件可以通过下述方法来确定：向活细胞和上述各种细胞的悬浮液中添加各种浓度的拓扑异构酶毒物，使它们放置预定时间，随后通过离心等收获活细胞和上述各种细胞，且通过PCR分析细胞。具体而言，此种条件的例子包括对于安吖啶1-100μg/ml的终浓度，25-37℃的温度，和5分钟-48小时的处理时间，对于椭圆玫瑰树碱0.05-5μg/ml的终浓度，25-37℃的温度，和10分钟-48小时的处理时间，对于喜树碱1-100μg/ml的终浓度，25-37℃的温度，和10分钟-48小时的处理时间，对于环丙沙星0.4-40μg/ml的终浓度，25-37℃的温度，和10分钟-48小时的处理时间，对于依托泊苷1-100μg/ml的终浓度，25-37℃的温度，和5分钟-48小时的处理时间，和对于米托蒽醌0.1-10μg/ml的终浓度，25-37℃的温度，和10分钟-48小时的处理时间。测试样品在预定条件下处理后，处理优选通过稀释，和/或离心分离等的消除来终止。
与活细胞的细胞壁比较，上述拓扑异构酶毒物和DNA回旋酶毒物更可能穿透损伤的细胞和死细胞的细胞壁。因此，认为如果处理时间在上文提及的范围内，那么毒物基本上不穿透活细胞的细胞壁，但它们穿透损伤的细胞、死细胞和如死细胞一样的活体细胞的细胞壁。还认为它们甚至穿透到活体细胞内，因为活体细胞只有细胞膜，但没有细胞壁。估计拓扑异构酶毒物或DNA回旋酶毒物因此穿透到体细胞的死细胞，死细菌和损伤的细菌内，随后通过共价附着杂乱地与染色体DNAs结合，插入DNAs内，或与拓扑异构酶形成复合物，并进一步抑制体细胞中通过拓扑异构酶II或拓扑异构酶I，或者死细胞或损伤的细胞中拓扑异构酶IV、或拓扑异构酶I、III或DNA回旋酶的DNAs再连接，或增强DNA切割的正向速率以引起染色体DNAs断裂。
如果与活细胞的那些比较，损伤的细胞和死细胞的染色体DNAs是优先断裂的，那么通过PCR扩增活细胞中的染色体DNA的靶区域，而损伤的细胞或死细胞中靶区域的切割抑制PCR扩增。例如，使用安吖啶或喜树碱，进一步引起交联，且因此抑制PCR扩增。因此，与损伤的细胞或死细胞比较，通过PCR可以更选择性地检测活细胞。
在死细胞中，细胞内的拓扑异构酶和/或DNA回旋酶活性可能丧失。此外，在损伤的细胞中这些酶的活性也可能减少或丧失。因此，在本发明的优选实施方案中，在步骤a)前测试样品用拓扑异构酶和/或DNA回旋酶进行处理(步骤d))。步骤d)稍后将详细说明。
在本发明的另一个优选实施方案中，拓扑异构酶毒物或DNA回旋酶毒物是乙锭单氮化物，并且所述方法包括对加入乙锭单氮化物的测试样品实施可见光照射的步骤。与微生物活细胞的细胞壁比较，乙锭单氮化物(EMA)更可能穿透损伤的细胞或死细胞的细胞壁。因此，认为EMA基本上不穿透活细菌的细胞壁，但它穿透损伤的细菌和死细菌的细胞壁，以及如死细胞一样的体细胞的细胞膜。当血液中的白细胞和血小板是活细胞时，EMA变得更可能穿透溶于灭菌水或低渗盐溶液的细胞的细胞膜。EMA穿透到如死细胞一样的体细胞、损伤的细菌和死细菌内，并杂乱地插入染色体DNAs内，随后只有插入的EMA通过可见光照射转变成氮宾，并且通过共价附着与染色体DNAs结合。估计它随后抑制体细胞中通过拓扑异构酶II，损伤的细菌或死细菌中拓扑异构酶IV或DNA回旋酶的DNAs再连接，以引起染色体DNAs断裂。
可以适当地确定关于用EMA处理的条件。例如，使得能够容易区别活细胞与损伤的细胞的条件可以通过下述方法来确定：向作为检测对象的微生物活细胞、损伤的细胞和死细胞的悬浮液中添加各种浓度的EMA，使它们放置各种时间段，随后用可见光照射它们，需要时通过离心等收获细胞，且通过PCR分析细胞。
通过使用各种照射时间进行如上提及的此种实验也可以适当地确定关于可见光照射的优选条件。具体而言，用EMA处理优选以0.5-100μg/ml的终浓度、4-10℃的温度进行5分钟-48小时。此外，EMA处理优选在光屏蔽下进行。作为可见光，包含500-700nm组分的可见光是优选的。关于可见光照射条件的具体例子包括与测试样品10-50cm的距离、100-750W的可见光照射5分钟-2小时。可见光照射优选在低温下进行，例如用冰冷却样品。
在本发明的特别优选的实施方案中，对测试样品实施EMA处理、可见光照射、和用除EMA外的拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物处理。在这样的情况下，EMA处理、可见光照射、和用除EMA外的拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物处理的顺序不具体加以限制，并且这些处理可以同时进行。
(2)步骤b)
从步骤a)中处理的测试样品中提取DNA，和通过PCR扩增提取的DNA的靶区域(White，T.J.等人，Trends Genet.，5，185(1989))。
用于从测试样品中提取DNA的方法不具体加以限制，只要提取的DNA可以在PCR中用作模板，并且提取可以根据用于提取微生物DNA的常用方法来达到。
DNA提取方法在例如Maniatis T.，Fritsch E.F.，Sambrook，J.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual”，第3版，Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001中描述。
在本发明中，“靶区域”不具体加以限制，只要选择可以通过PCR使用本发明使用的引物进行扩增且使得能够检测待检测的微生物的染色体DNA区域，并且它可以依赖于目的进行适当选择。例如，当测试样品中包含不同于待检测微生物的那种的细胞类型时，靶区域优选包含对作为检测对象的微生物特异的序列。进一步地，取决于目的，靶区域可以是包含几种微生物共同的序列的区域。此外，靶区域可以由单个区域或2个或更多个区域组成。如果使用适合于对作为检测对象的微生物特异的靶区域的引物组，和适合于广泛多样的微生物的染色体DNAs的引物组，那么可以同时测量作为检测对象的微生物的活细胞量和广泛多样的微生物的活细胞量。靶区域的长度例如通常为80-3000个核苷酸，优选900-3000个核苷酸，特别优选2000-3000个核苷酸。具体例子包括16S rRNA基因和23S rRNA基因。在这些中，23S rRNA基因是优选的。
用于PCR的引物不具体加以限制，只要选择使得能够特异性扩增上述靶区域的那些。适合于23S rRNA基因的引物的具体例子包括如SEQID NOS：1和2所示引物的引物组，以及如SEQ ID NOS：3和4所示引物的引物组。适合于16S rRNA基因的引物的例子包括如SEQ ID NOS：5和6所示引物的引物组。
当作为检测对象的微生物是病原菌时，靶区域的例子包括致病性基因。致病性基因的例子包括利斯特氏菌属细菌的李斯特菌溶胞素O(hlyA)基因，沙门氏菌属细菌的肠毒素基因和invA基因，病原性大肠埃希氏菌O-157的Vero细胞毒素基因，肠杆菌属细菌(阪崎肠杆菌)的MMS基因，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)肠毒素基因，蜡状芽孢杆菌的呕吐毒素(cereulide)(催吐毒素)基因和肠毒素基因，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)的各种毒素基因等。适合于致病性基因的引物的例子包括引物SEQ ID NOS：7和8的引物组。
如果使用适合于2种或更多种微生物的引物，那么可以检测测试样品中的2种或更多种微生物的活细胞。此外，如果使用对特定细菌特异的引物，那么可以检测测试样品中的特定细菌的活细胞。
PCR的条件不具体加以限制，只要依照PCR原理达到特异性扩增，并且它们可以适当地确定。
在本发明的实施方案中进行EMA处理和可见光处理的实施方案中，如果靶区域长，例如，它由2000个或更多核苷酸组成，那么即使只使用EMA处理和可见光照射处理也可以有效地检测活细胞。相比之下，当靶区域短时，例如，它由200个或更少核苷酸组成，那么优选使用除EMA外的拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物的处理与EMA处理和可见光处理的组合。
(3)步骤c)
随后分析PCR扩增产物。分析方法不具体加以限制，只要选择使得能够检测或定量PCR扩增产物的方法，并且例子包括电泳、实时PCR(Nogva等人，Application of 5’-nuclease PCR for quantitative detection ofListeria monocytogenes in pure cultures and water，skim milk andunpasteurized whole milk，Appl.Environ.Microbiol.，第66卷，2000，第4266-4271页；Nogva等人，Application of the 5’-nuclease PCR assay inevaluation and development of methods for quantitative detection ofCampylobacter jejuni，Appl.Environ.Microbiol.，第66卷，2000，第4029-4036页)等。通过电泳可以评估PCR扩增产物的量和大小。通过实时PCR，可以快速确定PCR扩增产物的量。当使用实时PCR时，因为荧光强度的变化一般对应于噪声水平，并且对于1-10的扩增循环数目基本上等于0，所以这些变化可以被视为不包含扩增产物的样品空白的值。通过计算关于1-10的扩增循环数目的荧光强度中变化的标准差SD，并将该标准差乘以10获得的荧光强度值被定义为阈值。首先提供超过阈值的荧光强度变化的循环的PCR循环数目被称为循环阈值(Ct值)。因此，在PCR溶液中较大起始量的DNA模板提供较小的Ct值，而在PCR溶液中较小起始量的DNA模板提供较大的Ct值。进一步地，即使使用相同量的DNA模板，在模板中PCR靶区域切割的较大发生提供关于那个区域PCR的较大Ct值。
进一步地，还可以通过分析扩增产物的解链温度(TM)模式来确定扩增产物的存在或不存在。
所有上述方法也可以用于最优化本发明的方法的各种条件。
当活细胞通过本发明的方法进行检测时，通过使用标准曲线可以增加活细胞存在或不存在的确定和PCR扩增产物分析中活细胞的定量的精确性，所述标准曲线代表微生物和扩增产物量的关系且通过使用鉴定的微生物的标准样品制备。尽管可以使用预先制备的标准曲线，但优选使用通过对标准样品和测试样品同时执行本发明方法的步骤制备的标准曲线。此外，如果预先确定微生物的量和DNA的量之间的关系，那么从微生物中分离的DNA也可以用作标准样品。
(4)步骤d)
如上所述，在死细胞中拓扑异构酶和/或DNA回旋酶的细胞内活性可能丧失，并且即使在用拓扑异构酶毒物或DNA回旋酶毒物处理后，染色体DNA也可能未被切割。即使在这样的情况下，如果在步骤a)前用拓扑异构酶和/或DNA回旋酶处理测试样品，那么在死细胞中也发生对DNA选择性的DNA切割，并且因此可以抑制通过PCR的靶区域扩增。
可以使用拓扑异构酶和DNA回旋酶两者，或可以使用它们中的任何一种。此外，对于每种酶，可以使用一类酶，或可以一起使用2类或更多类酶。
关于通过拓扑异构酶或DNA回旋酶反应的条件的具体例子包括在随后提及的参考实施例中提及的条件。然而，一般而言，对包含从食品或临床样品例如血液中收集的微生物的上清液实施在4℃和14,000xg下10分钟的冷冻离心，取出上清液，向残余物中加入1mL用于DNA切割的缓冲液(10mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.9，50mM氯化钾，50mM氯化钠，5mM氯化镁，0.01mM EDTA，2.5％甘油)，向混合物中加入终浓度为1-50mM的拓扑异构酶或DNA回旋酶，进一步加入终浓度为1-50mM的ATP，并且允许于30-37℃反应5-30分钟。因为ATP是拓扑异构酶和DNA回旋酶活性所需的，所以当测试样品用这些酶进行处理时，优选加入ATP和ATP合成系统。
<3>本发明的试剂盒
本发明的试剂盒是用于通过PCR检测测试样品中的微生物活细胞的试剂盒，并且包含拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物，和用于扩增作为通过PCR检测的对象的微生物DNA靶区域的引物。
在上述试剂盒中，拓扑异构酶毒物和DNA回旋酶毒物与对于本发明的方法说明的那些相同。
在本发明的试剂盒的优选实施方案中，该试剂盒包含EMA和除EMA外的另一种拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物作为拓扑异构酶毒物和/或DNA回旋酶毒物。
此外，除了上述元件外，本发明的试剂盒包含拓扑异构酶和/或DNA回旋酶。
本发明的试剂盒可以进一步包含稀释剂，用于通过拓扑异构酶和/或DNA回旋酶反应的反应溶液，描述本发明的方法的说明书等。
实施例
在下文中本发明将参考下述实施例更具体地进行解释。然而，本发明不限于下述实施例。
[实施例1]
用拓扑异构酶毒物分别处理微生物活细胞和损伤的细胞，并且检查每种染色体DNA的切割程度。
1.样品制备
1-1)活细胞和损伤的细胞悬浮液制备
单核细胞增生利斯特氏菌(单核细胞增生利斯特氏菌JCM 2873，在下文中也称为“利斯特氏菌”)是革兰氏阳性细菌，通过使用BHI液体培养基于30℃进行培养，对其中细胞处于对数期的40ml培养基实施在4℃和8,000xg下15分钟的冷冻离心，并取出上清液。向细胞中加入40ml生理盐水，使混合物充分搅动，且实施相似的冷冻离心，取出上清液，随后向细胞中加入10ml生理盐水以制备活细胞悬浮液。当在标准琼脂平板培养基上测量这种活细胞悬浮液的活细胞计数时，发现它是1.2×109cfu/ml。
此外，将1ml上述活细胞悬浮液置于1.5ml微型管内，使该管浸入沸水中50秒，且用冰水快速冷却以制备损伤的细胞悬浮液。认为这种悬浮液中包含的细胞包含少量活细胞和死细胞，但该细胞基本上由损伤的细胞组成，且因此该细胞被描述为“损伤的细胞”。此外，本发明的方法最初是用于检测活细胞的方法，并且与活细胞区别开的微生物细胞可以是损伤的细胞或死细胞。这同样将应用于下文提及的其他细菌。
1-2)拓扑异构酶毒物处理
向9ml新近制备的BHI液体培养基中加入各1ml上文制备的利斯特氏菌活细胞悬浮液和损伤的细胞悬浮液(分别为1.2×109cfu/ml)(对于活细胞和损伤的细胞，培养基中的细胞计数为1.2×108cfu/ml)，并且向培养基中加入溶于DMSO的100μl 5mg/ml安吖啶溶液。安吖啶的终浓度为50μg/ml，且DMSO的终浓度为1％。随后，每种类型的细胞于30℃温育24小时、48小时或72小时。
关于损伤的细胞，为了研究损伤的细胞中残留的活性DNA酶对损伤的细胞的染色体DNA的影响，向9ml新近制备的BHI液体培养基中加入1ml损伤的细胞悬浮液，随后向培养基中加入100μl DMSO代替上述安吖啶溶液(DMSO的终浓度：1％)，并且使细胞于30℃温育72小时。各1ml体积的活细胞悬浮液和损伤的细胞悬浮液用作对照。
1-3)DNA提取
对每种悬浮液实施在4℃和8,000xg下15分钟的冷冻离心，并且完全取出上清液。向沉淀中加入0.5ml 5mM EDTA溶液，且加入用10mM NaCl水溶液预先制备为5mg/ml的20μl消色肽酶(achromopeptidase)溶液(Wako Pure Chemical Industries，目录号：014-09661)，并且使混合物于50℃放置30分钟。随后，向混合物中加入0.5ml 10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，加入20μl 1250U/ml蛋白酶K(Sigma，E.C.3.4.21.64)，加入用无菌水预先制备为10％(w/v)的400μl SDS溶液，并且允许于50℃反应过夜。
将每种处理的悬浮液各以一半体积置于2个2ml体积微型管中，向悬浮液中加入0.5ml 1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)/饱和苯酚，并且使混合物轻微搅动15分钟。随后向混合物中加入0.5ml氯仿，并且使混合物轻微搅动5分钟。对混合物实施在4℃和6,000xg下10分钟的冷冻离心，将上层的水层转移至新的2ml体积微型管，向混合物中加入70μl 3M乙酸钠缓冲液(pH 5.2)和1.21ml 99.5％冷乙醇，并且使混合物轻微搅动。对混合物实施在4℃和15,000xg下10分钟的冷冻离心，取出上清液，并随后用0.4ml 70％冷乙醇洗涤残余物。向沉淀中加入0.5ml TE缓冲液(10mM Tris-HCl缓冲液，1mM EDTA·2Na)，并且使混合物于4℃放置过夜以使DNAs溶解。
向上述DNA溶液中加入用无菌水预先制备为10mg/ml的5μl RNA酶(Sigma，E.C.3.1.27.5)溶液，并且使混合物于37℃温育1小时。向混合物在加入0.25ml苯酚/氯仿(1/1)溶液，使混合物轻微搅动10分钟，向混合物中进一步加入0.25ml氯仿，并且使混合物轻微搅动5分钟。对混合物实施在4℃和6,000xg下10分钟的冷冻离心，将上层的水层转移至新的2ml体积微型管，向混合物中加入50μl 3M乙酸钠溶液和1ml 99.5％冷乙醇，并且使混合物轻微搅动。对混合物实施在4℃和15,000xg下10分钟的冷冻离心，取出上清液，随后用0.4ml 70％冷乙醇洗涤残余物，并且使沉淀干燥(上述程序也称为“RNA酶处理”)。
向干燥的沉淀中加入125μl TE缓冲液，并且使混合物于4℃放置过夜以使DNAs溶解且从而获得提取的DNAs。测量260nm和280nm处的纯化的DNA溶液的吸光度值(OD260，OD280，50μg/ml DNA溶液的OD260为1.0，室长度：1cm)，由OD260计算出DNA浓度，并且基于OD260/OD280估计纯化的DNA的纯度。
2.测试结果
对1-3)中提取的染色体DNAs实施通过使用0.8％琼脂糖凝胶的电泳。电泳完成后，将琼脂糖凝胶浸入1μg/ml溴化乙锭水溶液中20分钟，随后用离子交换的水洗涤2次，并且通过使用UV透照仪(波长：254nm)观察染色体DNA的切割程度。
通过电泳分析上述提取的DNAs。结果显示于图1中。图1显示了损伤的细胞中包含的DNA酶对利斯特氏菌(损伤的细胞)染色体DNA的影响，和安吖啶对利斯特氏菌(活细胞和损伤的细胞)染色体DNA的影响。
因此，当不向利斯特氏菌的损伤的细胞悬浮液中加入安吖啶，并且使细胞温育最高达72小时时，对于孔中剩余的极其长的DNA片段和定位于约19,329bp的长DNA片段无法看到任何显著差异，并且因此利斯特氏菌损伤的细胞的染色体DNA几乎不被活性在损伤的细胞中残留的DNA酶切割。然而，如果向损伤的细胞中加入安吖啶，并且使细胞温育最高达72小时，那么特别地孔中剩余的极其长的DNA片段明显减少，并且因此暗示通过安吖啶借助于利斯特氏菌损伤的细胞中残留的活性DNA回旋酶或拓扑异构酶达到了染色体DNAs各处被切割的状态。
进一步地，当向利斯特氏菌的活细胞悬浮液中加入安吖啶，并且使细胞温育最高达72小时时，孔中剩余的极其长的DNA片段和定位于约19,329bp的长DNA片段在24小时时临时减少，并且当其后继续温育时，2种DNA片段与温育时间成比例地增加。这种结果暗示安吖啶在24小时时穿透活细胞的细胞壁，以达到借助于活细胞中的DNA回旋酶或拓扑异构酶的染色体DNA切割状态，并且只受到安吖啶作用的轻微影响或几乎不受影响的剩余的利斯特氏菌活细胞通过第2次温育增殖。
此外，安吖啶是黄色着色和高度疏水性物质。因此，1-30分钟的短作用时间后，它几乎不穿透高度亲水性活细胞的未损伤的细胞壁，并且因此活细胞的沉淀是白色的。然而，因为损伤的细胞具有损伤的细胞壁和增加的疏水性，安吖啶穿透损伤的细胞的细胞壁，并且因此损伤的细胞的沉淀显示黄色。通过这个实施例证实，对于活细胞和损伤的细胞，如果安吖啶穿透细胞壁，那么它达到借助于细胞内DNA回旋酶和/或拓扑异构酶各处切割染色体DNAs的状态。然而，在短作用时间内，损伤的细胞的染色体将以随机方式适度地，但选择性切割，并且因此如果细胞用拓扑异构酶毒物例如安吖啶另外处理短时间段(例如，用拓扑异构酶毒物例如EMA处理后的另外处理)，那么变得可以通过使用PCR以高灵敏性区别活细胞与损伤的细胞或死细胞。
[实施例2]
使用由DNA回旋酶毒物处理的微生物活细胞和损伤的细胞的染色体DNAs通过靶向23S rRNA基因的PCR进行分析。
1.样品制备
1-1)活细胞和损伤的细胞悬浮液制备
阪崎肠杆菌(阪崎肠杆菌ATCC 51329菌株，在下文中也称为“肠杆菌”)是革兰氏阴性细菌，通过使用BHI液体培养基于37℃进行培养，对其中细胞处于对数期的40ml培养基实施在4℃和8,000xg下15分钟的冷冻离心，并取出上清液。向细胞中加入40ml生理盐水，使混合物充分搅动，且实施相似的冷冻离心，取出上清液，随后向细胞中加入10ml生理盐水以制备活细胞悬浮液。当在标准琼脂平板培养基上测量这种活细胞悬浮液的活细胞计数时，发现它是4.4×108cfu/ml。
此外，将1ml上述活细胞悬浮液置于1.5ml微型管内，且使该管浸入沸水中50秒，且用冰水快速冷却以制备损伤的细胞悬浮液。
单核细胞增生利斯特氏菌JCM 2873的活细胞悬浮液和损伤的细胞悬浮液以与实施例1中那种相同的方式进行制备。活细胞悬浮液中的活细胞计数为4.0×108cfu/ml。
1-2)DNA回旋酶毒物(环丙沙星)处理
向9ml新近制备的BHI液体培养基中加入各1ml的肠杆菌(活细胞和损伤的细胞)悬浮液和利斯特氏菌(活细胞和损伤的细胞)悬浮液(培养基中肠杆菌活细胞计数和损伤的细胞计数分别为4.4×107cfu/ml和4.4×107cfu/ml，并且培养基中利斯特氏菌活细胞计数和损伤的细胞计数分别为4.0×107cfu/ml和4.0×107cfu/ml)，并且向培养基中加入2ml环丙沙星溶液(130μg/ml，用生理盐水溶解)。
关于损伤的细胞，为了研究损伤的细胞中残留的活性DNA酶对损伤的细胞的染色体DNA的影响，向9ml新近制备的BHI液体培养基中加入各1ml的肠杆菌和利斯特氏菌损伤的细胞悬浮液，随后加入2ml生理盐水代替上述环丙沙星溶液。
随后，制备其中肠杆菌(活细胞和损伤的细胞)于37℃培养1小时30分钟、3小时30分钟、5小时和72小时的悬浮液。进一步地，制备其中利斯特氏菌(活细胞和损伤的细胞)于37℃培养1小时30分钟、3小时30分钟、5小时和72小时的悬浮液。此外，作为0小时培养时间的对照，肠杆菌和利斯特氏菌的活细胞和损伤的细胞悬浮液用作环丙沙星无添加活细胞悬浮液和环丙沙星无添加损伤的细胞悬浮液。
对每种悬浮液实施在4℃和8,000xg下15分钟的冷冻离心，完全取出上清液，并收集沉淀。通过下述方法提取关于肠杆菌和利斯特氏菌的DNAs。
1-3)DNA提取
通过下述方法提取肠杆菌的DNAs。
向沉淀中加入0.5ml 10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，且加入10μl1250U/ml蛋白酶K(Sigma，EC.3.4.21.64)，加入用无菌水预先制备为10％(w/v)的200μl SDS溶液，并且允许于50℃反应过夜。向处理的悬浮液中加入0.5ml 1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)/饱和苯酚，并且使混合物轻微搅动15分钟。随后向混合物中加入0.5ml氯仿，并且使混合物轻微搅动5分钟。对混合物实施在4℃和6,000xg下10分钟的冷冻离心，将上层的水层转移至新的2ml体积微型管，向混合物中加入70μl3M乙酸钠缓冲液(pH 5.2)和1.29ml 99.5％冷乙醇，并且使混合物轻微搅动。对混合物实施在4℃和15,000xg下10分钟的冷冻离心，取出上清液，并随后用0.4ml 70％冷乙醇洗涤残余物。向沉淀中加入0.5mlTE缓冲液(10mM Tris-HCl缓冲液，1mM EDTA·2Na)，并且使混合物于4℃放置过夜以使DNAs溶解。
向上述DNA溶液中加入用无菌水预先制备为10mg/ml的5μl RNA酶(Sigma，E.C.3.1.27.5)溶液，并且使混合物于37℃温育1小时。向混合物加入0.25ml苯酚/氯仿(1/1)溶液，使混合物轻微搅动10分钟，向混合物中进一步加入0.25ml氯仿，并且使混合物轻微搅动5分钟。对混合物实施在4℃和6,000xg下10分钟的冷冻离心，将上层的水层转移至新的2ml体积微型管，向混合物中加入50μl 3M乙酸钠溶液和1ml 99.5％冷乙醇，并且使混合物轻微搅动。对混合物实施在4℃和15,000xg下10分钟的冷冻离心，取出上清液，随后用0.4ml 70％冷乙醇洗涤残余物，并且使沉淀干燥(上述程序也称为“RNA酶处理”)。
向干燥的沉淀中加入125μl TE缓冲液，并且使混合物于4℃放置过夜以使DNAs溶解且从而获得提取的DNAs。测量260nm和280nm处的纯化的DNA溶液的吸光度值(OD260，OD280，50μg/ml DNA溶液的OD260为1.0，室长度：1cm)，由OD260计算出DNA浓度，并且基于OD260/OD280估计纯化的DNA的纯度。
利斯特氏菌DNAs通过实施例1，1-3)DNA提取的方法进行提取。
1-4)PCR扩增产物电泳
对1-3)中提取的染色体DNAs实施通过使用0.8％琼脂糖凝胶的电泳。电泳完成后，将琼脂糖凝胶浸入1μg/ml溴化乙锭水溶液中20分钟，随后用离子交换的水洗涤2次，并且通过使用UV透照仪(波长：254nm)观察染色体DNA的切割程度。
2.测试方法(靶向23S rRNA基因的PCR和电泳)
2-1)PCR主混合物(master mix)制备
制备下述组成的主混合物(总体积：50μl)
-Ex-Taq(Takara Shuzo，目录号：RR001B)：0.25μl
-10x Ex-Taq缓冲液(Takara Shuzo，目录号：RR001B)：5μl
-dNTP混合物(Takara Shuzo，目录号：RR001B)：4μl
-5pmol/μl SEQ ID NO：1(23S-F)DNA：2.5μl
-5pmol/μl SEQ ID NO：2(23S-R)DNA：2.5μl
-5pmol/μl SEQ ID NO：3(23S-MF)DNA：2.5μl
-5pmol/μl SEQ ID NO：4(23S-MR)DNA：2.5μl
-2x SYBA Green(BMA，目录号：50513)：10μl
-无菌水：15.75μl
-模板DNA(15ng/μl)：10μl
SEQ ID NOS：1和2的引物是用于扩增基本上所有23S rRNA区域的引物，并且它们提供了主要来自革兰氏阴性细菌的约2840bp扩增片段。SEQ ID NOS：3和4的引物对应于23S rRNA的中心区域，并且它们提供来自革兰氏阳性细菌(也来自革兰氏阴性细菌)的约900bp扩增片段。
2-2)用于扩增23S rRNA基因的PCR热循环特征
用于扩增肠杆菌23S rRNA基因的PCR热循环特征显示于表1中。
表1
Figure S200680038627XD00221
用于扩增利斯特氏菌23S rRNA基因的PCR热循环特征显示于表2中。
表2
2-3)PCR
用TE缓冲液将1-3)中制备的每种DNA溶液稀释至15ng/μl，并且10μl稀释的溶液在2-1)中用作模板DNA。即，在50μl PCR反应混合物中包含150ng模板DNA。使用10μl TE缓冲液作为阴性对照。
根据上文提及的2-2)中所示PCR热循环特征，通过使用实时PCR装置i循环仪(i Cycler)(Biorad，型号：iQ)进行扩增产物的PCR和TM分析(解链温度分析)。将实时PCR的阈值(边界值)设定为通过0-10个循环用SYBA Green获得的荧光量标准差SD乘以10得到的值。在每条实时PCR扩增曲线中，显示的值超过阈值的循环数目在下文中被称为“Ct值”。
3.测试结果
这个实施例的测试结果显示于图2-11中。图2显示了细胞内DNA酶对肠杆菌(损伤的细胞)染色体DNA的影响。图3显示了环丙沙星对相同细菌(活细胞和损伤的细胞)染色体DNAs的影响。图4显示了损伤的细胞的细胞内DNA酶对利斯特氏菌(损伤的细胞)染色体DNA的影响。图5显示了环丙沙星对相同细菌(活细胞和损伤的细胞)染色体DNA的影响。
此外，图6显示了关于靶向用环丙沙星处理的肠杆菌活细胞23SrRNA基因的实时PCR的扩增曲线。图7显示了图6中提及的扩增产物的TM模式分析结果。类似地，用相同药物处理的相同细菌损伤的细胞的实时PCR曲线和TM模式分析结果分别显示于图8和9中。此外，用相同药物处理的利斯特氏菌活细胞和损伤的细胞的实时PCR曲线分别显示于图10和11中。
根据图2中所示结果，证实损伤的细胞的染色体DNAs在72小时内被肠杆菌损伤的细胞中保留的DNA酶轻微切割。然而，如图3中所示，即使当环丙沙星作用于损伤的细胞1.5-5小时时，也观察到比用上述DNA酶观察到的那种明显更高程度的DNA切割现象。在活细胞的情况下，约19329bp的长染色体DNA片段相反地增加，并且因此证实通过环丙沙星作用短时间段，与活细胞比较，借助于细菌DNA回旋酶，损伤的细胞的染色体DNAs被更多地切割。
如图4中所示，关于损伤的细胞的染色体DNAs，即使在72小时后，对于衍生自染色体DNAs的约19329bp长片段也几乎观察不到由利斯特氏菌损伤的细胞的细胞内DNA酶引起的DNA切割现象。然而，如图5中所示，当环丙沙星作用于损伤的细胞72小时时，观察到由上述DNA酶引起的明显更严重的DNA切割现象。这被解释为环丙沙星对活细胞的作用和效应是相同的。
此外，当环丙沙星作用72小时时，对于肠杆菌的活细胞和损伤的细胞，PCR被明显抑制。然而，如通过Ct(活细胞，Cip 72小时)-Ct(活细胞，无Cip)＝13和Ct(损伤的细胞，Cip 72小时)-Ct(损伤的细胞，无Cip)＝17的计算显示，对于损伤的细胞，PCR被更多地抑制。即，当PCR在27个循环后终止时，对于活细胞进行的PCR结果被确定为阳性的，并且对于损伤的细胞进行的PCR结果被确定为阴性的。因此，证实活细胞和损伤的细胞可以通过使用环丙沙星加以区别。同样对于利斯特氏菌，如图10和图11中分别显示的，当PCR在20个循环后终止时，对于活细胞进行的PCR结果类似地被确定为阳性的，并且对于损伤的细胞进行的PCR结果类似地被确定为阴性的。因此，证实利斯特氏菌的活细胞和损伤的细胞也可以通过使用该药物加以区别。
基于如图7和9中所示环丙沙星对其作用72小时的阪崎肠杆菌活细胞和损伤的细胞染色体DNAs的PCR扩增产物的TM模式分析，估计关于活细胞的PCR扩增产物对应于23S rRNA基因作为靶，而关于损伤的细胞的PCR扩增产物不是靶向的扩增产物。认为由于模板DNA的23SrRNA基因中引起的多重切割，关于损伤的细胞的23S rRNA基因的部分区域被扩增为PCR扩增产物。如上所述，证实活细胞和损伤的细胞可以使用环丙沙星处理通过PCR加以区别。
[实施例3]
使用由EMA处理的微生物活细胞和损伤的细胞的染色体DNAs通过靶向16S rRNA基因或23S rRNA基因的PCR进行分析。
1.样品制备
1-1)革兰氏阴性细菌(活细胞和损伤的细胞)悬浮液制备
大肠埃希氏菌DH5α(在下文中也称为“大肠埃希氏菌”)、差异柠檬酸杆菌(差异柠檬酸杆菌JCM 1658，在下文中也称为“柠檬酸杆菌”)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)(肠炎沙门氏菌IID 604，在下文中也称为“沙门氏菌”)、和产酸克雷伯氏菌(产酸克雷伯氏菌JCM 1665，在下文中也称为“克雷伯氏菌”)，各自通过使用BHI液体培养基于37℃进行培养，对其中细胞处于对数期的40ml培养基实施在4℃和8,000xg下15分钟的冷冻离心，并取出上清液。随后向细胞中加入40ml生理盐水，使混合物充分搅动，且实施相似的冷冻离心，取出上清液，随后向细胞中加入10ml生理盐水以制备活细胞悬浮液。这些活细胞悬浮液的活细胞计数是大肠埃希氏菌：3.2×108cfu/ml，柠檬酸杆菌：6.7×107cfu/ml，沙门氏菌：1.9×108cfu/ml，和克雷伯氏菌：4.8×108cfu/ml。
此外，将各1ml上述活细胞悬浮液置于1.5ml微型管内，使该管浸入沸水中50秒，且用冰水快速冷却以制备损伤的细胞悬浮液。
1-2)革兰氏阳性细菌(活细胞和损伤的细胞)悬浮液制备
蜡状芽孢杆菌(蜡状芽孢杆菌JCM 2152，在下文中也称为“芽孢杆菌”)，和表皮葡萄球菌(表皮葡萄球菌KD，在下文中也称为“葡萄球菌”)于37℃进行培养，且单核细胞增生利斯特氏菌(单核细胞增生利斯特氏菌JCM 2873，在下文中也称为“利斯特氏菌”)于30℃进行培养，分别在BHI液体培养基中，对其中细胞处于对数期(对于芽孢杆菌为滋养体)的40ml每种培养基实施在4℃和8,000xg下15分钟的冷冻离心，并取出上清液。随后向细胞中加入40ml生理盐水，使混合物充分搅动，且实施相似的冷冻离心，取出上清液，随后向细胞中加入10ml生理盐水以制备活细胞悬浮液。这些活细胞悬浮液的活细胞计数是芽孢杆菌：3.0×107cfu/ml，利斯特氏菌：1.3×108cfu/ml，和葡萄球菌：1.1×106cfu/ml。
此外，将各1ml上述活细胞悬浮液置于1.5ml微型管内，使该管浸入沸水中50秒，且用冰水快速冷却以制备损伤的细胞悬浮液。
2.测试方法
2-1)EMA处理和可见光照射步骤
向体积1ml的每种革兰氏阴性细菌(活细胞和损伤的细胞)和革兰氏阳性细菌(活细胞和损伤的细胞)悬浮液中加入浓度为1000μg/ml的10μl EMA溶液，所述EMA溶液通过将EMA(Sigma，目录号：E2028)溶解于无菌水中，并使溶液通过0.45-μm微型过滤器进行过滤来制备，并且在光屏蔽下使混合物于4℃放置30分钟。随后将悬浮液置于冰上，并用500W的可见光照射10分钟，所述可见光来自置于悬浮液20cm距离处的灯(FLOOD PRF，100V，500W，Iwasaki Electric Co.，Ltd.)。添加EMA溶液和照射可见光的上述步骤也可以称为“EMA处理”。分别地，向1ml的每种革兰氏阴性细菌(活细胞和损伤的细胞)和革兰氏阳性细菌(活细胞和损伤的细胞)悬浮液中加入10μl无菌水代替EMA溶液，随后对混合物实施对于上述EMA处理使用的相同程序。
2-2)DNA提取
对包含革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌(各为EMA未处理和EMA处理的)活细胞和损伤的细胞的微型管实施在4℃和15,000xg下10分钟的冷冻离心。向每个微型管中加入990μl生理盐水，并且使混合物充分搅动。随后将混合物的总体积转移至2ml微型管，并实施在4℃和15,000xg下10分钟的冷冻离心，并且取出上清液。其后，提取DNA，测量DNA浓度，并且根据实施例1，1-3)DNA提取的方法评估纯度。
3.靶向16S rRNA基因或23S rRNA基因的PCR
3-1)PCR主混合物制备
制备下述组成的主混合物(总体积：50μl)
-Ex-Taq(Takara Shuzo，目录号：RR001B)：0.25μl
-10x Ex-Taq缓冲液(Takara Shuzo，目录号：RR001B)：5μl
-dNTP混合物(Takara Shuzo，目录号：RR001B)：4μl
-5pmol/μl SEQ ID NO：1(23S-F)DNA：2.5μl
-5pmol/μl SEQ ID NO：2(23S-R)DNA：2.5μl
-5pmol/μl SEQ ID NO：3(23S-MF)DNA：2.5μl
-5pmol/μl SEQ ID NO：4(23S-MR)DNA：2.5μl
-5pmol/μl SEQ ID NO：5(16S-F)DNA：2.5μl
-5pmol/μl SEQ ID NO：6(16S-R)DNA：2.5μl
-2x SYBA Green(BMA，目录号：50513)：10μl
-无菌水：15.75μl
-模板DNA(15ng/μl)：10μl
3-2)用于扩增16S rRNA基因的PCR热循环特征
用于扩增每种细菌16S rRNA基因的PCR热循环特征显示于表3中。
表3
Figure S200680038627XD00271
3-3)用于扩增23S rRNA基因的PCR热循环特征
用于扩增每种细菌23S rRNA基因的PCR热循环特征显示于表4(革兰氏阴性细菌)或表5(革兰氏阳性细菌)中。
表4
表5
Figure S200680038627XD00282
3-4)PCR
用TE缓冲液将2-2)中制备的每种DNA溶液稀释至15ng/μl，并且10μl稀释的溶液在3-1)中用作模板DNA。即，在50μl PCR反应混合物中包含150ng模板DNA。使用10μl TE缓冲液作为阴性对照。
根据上文提及的3-2)或3-3)中所示PCR热循环特征，通过使用实时PCR装置i循环仪(Biorad，型号：iQ)进行扩增产物的PCR和TM分析(解链温度分析)。实时PCR的阈值(边界值)和Ct值以与实施例2，2-3)的那种相同的方式进行计算。
3-5)琼脂糖凝胶电泳
由Seakem GTG琼脂糖(FMC，目录号：50070)和TAE缓冲液(4.84g/L Tris，1.142ml/L乙酸，0.149g/L EDTA·2Na)制备0.8％琼脂糖凝胶，并且λ-EcoT14I消化物(Takara Shuzo，Code：3401)和100bp DNA梯(Ladder)(Takara Shuzo，Code：3407A)用作标记。对于每种革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌，将10μl PCR溶液分配到孔内，并实施电泳。当溴酚蓝(BPB)在凝胶中迁移约90％时，终止电泳。
将在其上进行电泳的凝胶浸入1μg/ml溴化乙锭水溶液中20分钟，并用离子交换的水洗涤2次，随后通过使用UV透照仪(254nm)观察PCR扩增产物。
4.测试结果
图12中显示了当包含1ml细菌悬浮液的1.5ml微型管浸入沸水中时观察到的随着时间过去的细菌悬浮液温度变化。从图12中显示的关系可见，与在72-75℃下15-16秒的高温短时间巴氏消毒法(HTST巴氏消毒法)比较，在损伤的细胞悬浮液制备中使用的通过浸入沸水中50秒的热处理是略微更强的热处理，并且因此它对应于等价于超高温巴氏消毒法(UHT巴氏消毒法)的热处理。
使用16S rRNA基因作为靶的活细胞和损伤的细胞的区别结果显示于图13中，并且使用23S rRNA基因作为靶的活细胞和损伤的细胞的区别结果分别显示于图14和15中。在图13-15中，将每种细菌的PCR溶液装载到凝胶上，其顺序为对于EMA未处理的活细胞悬浮液、EMA处理的活细胞悬浮液、EMA未处理的损伤的细胞悬浮液、和EMA处理的损伤的细胞悬浮液的那些。
如图13中所示，当16S rRNA基因用作靶时，对于EMA处理的柠檬酸杆菌和克雷伯氏菌损伤的细胞没有观察到扩增产物，并且因此可以清楚区别活细胞和损伤的细胞。对于其他细菌，对于EMA处理的损伤的细胞观察到扩增产物，并且因此活细胞和损伤的细胞的区别是不确定的。
另一方面，根据图14和15中所示结果，揭示当23S rRNA基因用作靶时，活细胞和损伤的细胞可以通过对于革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌使用EMA处理清楚地加以区别。当在50μl体积中包含108cfu/ml水平的细菌损伤的细胞作为样品背景和150ng模板DNA的测试样品用于PCR时，损伤的细胞的PCR被完全抑制，而关于活细胞的PCR未被基本上完全抑制。此外，认为对于包含105-107cfu/ml的牛乳，关于损伤的细胞的PCR同样可以被完全抑制，并且可以检测低浓度的活细胞。因此，该方法可以应用于食物卫生检查中关于一般细菌的筛选测试。此外，在患有脓毒病和肝功能病症的患者的情况下，活细胞和损伤的细胞可能可以以104cfu/ml或更高的高浓度存在于血液中，并且同样在此种情况下，只有活细胞可以根据本发明进行快速检测。
[实施例4]
病原菌用EMA和拓扑异构酶毒物或DNA回旋酶毒物进行处理，并且活细胞及其损伤的细胞通过靶向致病性基因的PCR加以区别。
1.细菌培养物(活细胞)制备
利斯特氏菌(单核细胞增生利斯特氏菌JCM 2873)的活细胞悬浮液和损伤的细胞悬浮液以与实施例1那种相同的方式进行制备。活细胞悬浮液的活细胞计数是1.3×108cfu/ml。
2.测试方法
2-1)EMA处理和可见光照射步骤
以与实施例3那种相同的方式对利斯特氏菌活细胞悬浮液和损伤的细胞悬浮液各自实施EMA处理和可见光照射。EMA很可能穿透到没有外膜的革兰氏阳性细菌的细胞内，并且即使该细胞是细胞壁未损伤的活细胞。因此，在EMA添加后使悬浮液在光屏蔽下于4℃放置的时间缩短至5分钟，并且可见光照射时间也缩短至5分钟。此外，同样向每种活细胞悬浮液和损伤的细胞悬浮液中加入10μl无菌水代替EMA溶液，并且随后对混合物实施相同处理。
2-2)拓扑异构酶毒物或DNA回旋酶毒物处理步骤
上述EMA处理和可见光照射步骤完成后，对包含每种处理的悬浮液的微型管实施在4℃和15,000xg下10分钟的冷冻离心，并且取出上清液。向细胞中加入1ml生理盐水，使混合物充分搅动，并且实施相同条件的冷冻离心。取出上清液，随后向细胞中加入1ml生理盐水，并且使混合物充分搅动。如上所述，制备1管1ml EMA未处理的活细胞悬浮液，7管1ml EMA处理的活细胞悬浮液，1管1ml EMA未处理的损伤的细胞悬浮液，和7管1ml EMA处理的损伤的细胞悬浮液。
将EMA处理的活细胞和损伤的细胞悬浮液分成6组，每组由1管活细胞悬浮液和1管损伤的细胞悬浮液组成。向第1组悬浮液中加入体积8μl的DNA回旋酶毒物环丙沙星(0.5mg/ml，用生理盐水溶解)，向第2组悬浮液中加入体积10μl的拓扑异构酶毒物喜树碱(1mg/ml，溶解于二甲基亚砜中)，向第3组悬浮液中加入体积10μl的拓扑异构酶毒物依托泊苷(1mg/ml，溶解于二甲基亚砜中)，向第4组悬浮液中加入体积5μl的拓扑异构酶毒物椭圆玫瑰树碱(0.1mg/ml，溶解于二甲基亚砜中)，向第5组悬浮液中加入体积10μl的拓扑异构酶毒物米托蒽醌(0.1mg/ml，溶解于二甲基亚砜中)，且向第6组悬浮液中加入体积10μl的拓扑异构酶毒物安吖啶(1mg/ml，溶解于二甲基亚砜中)。每种样品于30℃温育30分钟，将样品的总体积转移至2ml微型管内，并实施在4℃和15,000xg下10分钟的冷冻离心，并且取出上清液。
2-3)DNA提取步骤
对于如上所述制备的每种样品，DNAs以与实施例1，“1-3)DNA提取”那种相同的方式进行提取。
3.靶向利斯特氏菌的各种基因的PCR
3-1)致病性基因，利斯特氏菌的李斯特菌溶胞素O(hlyA)基因的扩增
3-1-1)PCR主混合物制备
制备下述组成的主混合物(总体积：50μl)。
-Ex-Taq(Takara Shuzo，目录号：RR001B)：0.25μl
-10x Ex-Taq缓冲液(Takara Shuzo，目录号：RR001B)：5μl
-dNTP混合物(Takara Shuzo，目录号：RR001B)：4μl
-5pmol/μl SEQ ID NO：7(hlyA-F)DNA：2.5μl
-5pmol/μl SEQ ID NO：8(hlyA-R)DNA：2.5μl
-2x SYBA Green(BMA，目录号：50513)：10μl
-无菌水：15.75μl
-模板DNA(15ng/μl)：10μl
3-1-2)用于扩增hlyA基因的PCR热循环特征
表6
3-1-3)PCR
用TE缓冲液将上文提及的2-3)中制备的每种DNA溶液稀释至15ng/μl，并且10μl稀释的溶液在上文提及的3-1-1)中用作模板DNA。即，在50μl PCR混合物中包含150ng模板DNA。使用10μl TE缓冲液作为阴性对照。
根据上文提及的3-1-2)中所示PCR热循环特征，通过使用实时PCR装置i循环仪(Biorad，型号：iQ)进行PCR。
3-2)16S rRNA和23S rRNA基因的扩增
3-2-1)PCR主混合物制备
以与实施例3，3-1)“PCR主混合物制备”那种相同的方式制备主混合物(总体积：50μl)。
3-2-2)用于扩增16S rRNA基因的PCR热循环特征
应用实施例3，3-2)(表3)中提及的“用于扩增16S rRNA基因的PCR热循环特征”。
3-2-3)用于扩增革兰氏阳性细菌23S rRNA基因的PCR热循环特征
应用实施例3，3-3)(表5)中提及的“用于扩增革兰氏阳性细菌23SrRNA基因的PCR热循环特征”。
3-2-4)PCR
用TE缓冲液将2-3)中制备的每种DNA溶液稀释至15ng/μl，并且10μl稀释的溶液在上文提及的3-1-1)或3-2-1)中用作模板DNA。即，在50μl PCR混合物中包含150ng模板DNA。使用10μl TE缓冲液作为阴性对照。
根据上文提及的3-2-2)或3-2-3)中所示PCR热循环特征，通过使用实时PCR装置i循环仪(Biorad，型号：iQ)进行PCR。
3-3)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳
以与实施例2，1-4)“PCR扩增产物电泳”那种相同的方式进行电泳。对于hlyA基因扩增产物的检测，使用3％琼脂糖凝胶。
4.测试结果
关于靶向hlyA基因的情况的结果显示于图16中，并且关于靶向16SrRNA基因和23S rRNA基因的情况的结果分别显示于图17和18中。
如从图16和17中所示结果可见，当靶向hlyA和16S rRNA基因时，损伤的细胞的DNA扩增仅被EMA处理轻微抑制。然而，当使用拓扑异构酶毒物或DNA回旋酶毒物处理连同EMA处理时，损伤的细胞的DNA扩增被进一步抑制。特别地，当靶向hlyA基因时，通过使用依托泊苷、米托蒽醌或安吖啶连同EMA，并且当靶向16S rRNA基因时，通过使用喜树碱、依托泊苷、椭圆玫瑰树碱或安吖啶连同EMA，损伤的细胞的DNA扩增被明显抑制。
此外，如从图18中所示结果可见，当靶向23S rRNA基因时，通过使用EMA和另一种拓扑异构酶毒物或DNA回旋酶毒物，关于活细胞的PCR被类似地明显抑制。
当焦点集中在特定病原菌快速进行活细胞与损伤的细胞或死细胞的区别时，存在更优选靶向短至100-200bp的较短基因区域的趋势，以增强对于致病性基因的特异性。认为如果靶区域与上文所述的一样短，那么即使当EMA穿透损伤的细胞的细胞壁以引起DNAs切割时，靶区域也未被切割且被扩增，并且因此，PCR未被完全抑制。另一方面，即使靶向极其短的113bp的hlyA基因，通过使用EMA和拓扑异构酶毒物或DNA回旋酶毒物组合，关于108cfu/ml水平的利斯特氏菌损伤的细胞的PCR基本上被完全抑制，而关于活细胞的PCR未被抑制。认为这是因为例如拓扑异构酶毒物使DNAs在不同于由EMA交联位置的位置随机交联，以抑制切割中的再连接以及通过损伤的细胞仍有活性的细胞内DNA回旋酶、细菌拓扑异构酶I、III和IV的再连接，并且因此与由单独的EMA引起的DNA切割状态相比较，提供了DNAs以更明显的程度被各处切割的状态，从而导致甚至在100-200bp的短靶基因中的切割。
因此，可能明确地区别食品或各种临床样品中的特定病原菌活细胞与其损伤的细胞或死细胞，所述食品或各种临床样品包含高浓度的特定病原菌的背景损伤的细胞。然而，为了抑制关于死细胞的PCR扩增产物，优选预先加入ATP和Mg2+以及拓扑异构酶或DNA回旋酶(酶)，因为与损伤的细胞不同，拓扑异构酶或DNA回旋酶在死细胞中可以是灭活的。
例如，在施用抗结核剂的结核患者的痰中，这是在治疗中或晚期时的测试样品，由于抗结核剂结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)损伤的细胞以108-109cfu/ml的浓度存在。即使在这样的情况下，单独的活细胞也可以通过本发明的方法进行检测。
[参考实施例1]来自食品的测试样品的制备
用于制备测试样品的方法将在下文例示，其中假定其中微生物污染作为食品的牛乳的情况，所述牛乳是适合于本发明方法的一种测试样品。
向牛乳中加入终浓度为1-5mM，尤其是2mM的EDTA溶液，且加入终浓度为0.1-0.5％，尤其是0.1％的Tween 80，并且对混合物实施在4℃和10,000xg下10分钟的冷冻离心。优选加入终浓度为10-20U/m1的脂肪酶(Sigma，E.C.3.1.1.3)，允许于30-37℃反应30分钟-1小时，随后加入终浓度为20U/ml的蛋白酶K(Sigma，E.C.3.4.21.64)，并且使混合物放置30分钟-1小时。取出混合物的表面脂质层和中间水层，并且收集沉淀物。所述沉淀物包含细菌、体细胞例如乳房上皮细胞(epitheliocyte)和牛白细胞，并且当混合物在10,000xg或更高g下离心时，它们进一步包含由蛋白酶K不完全降解产生的微团蛋白质降解产物(微团酪蛋白不完全降解产物)。微团酪蛋白不完全降解产物被认为由α，β-酪蛋白的高度疏水性亚微团(submicelle)组成。
向沉淀物中加入与起始体积相同体积的生理盐水以形成悬浮液，对所述悬浮液实施在4℃和100xg下5分钟的冷冻离心，并且收集包含微生物等的上清液。
[参考实施例2]来自血液的测试样品(1)的制备
向肝素化的血液中加入相同体积的生理盐水，对混合物实施在4℃和10,000xg下5分钟的冷冻离心，取出上清液，并且收集沉淀物。所述沉淀物包含细菌、血小板、单核的细胞例如单核细胞和淋巴细胞、粒细胞和红细胞。
[参考实施例3]来自血液的测试样品(2)的制备
向肝素化的血液中加入相同体积的生理盐水，对混合物实施在4℃和100xg下5分钟的冷冻离心，以使混合物分离成血浆和血细胞组分(单核的细胞例如单核细胞和淋巴细胞、粒细胞和红细胞)，并且收集包含微生物的血浆。
[参考实施例4]来自血液的测试样品(3)的制备
向肝素化的血液中加入相同体积的生理盐水。在无菌试管中，首先填充与稀释2次的肝素化的血液那种相同体积的Ficoll-Paque[Amersham Bioscience，5.7g/100ml Ficoll 400，9g/100ml泛影酸钠，比重：1.077g/ml]，并且在使试管倾斜时在其上缓慢地覆盖上述稀释2次的肝素化的血液。随后对该层实施在4℃和100xg下5分钟的冷冻离心，并且收集包含微生物的上清液。在Ficoll Paque上覆盖稀释2次的肝素化的血液前，优选加入终浓度为10-20U/ml的脂肪酶(Sigma，E.C.3.1.1.3)溶液，随后加入10-50U/ml脱氧核糖核酸酶I(Sigma，E.C.3.1.21.1)溶液，允许于30-37℃反应30分钟-1小时，随后加入终浓度为10-20U/ml的蛋白酶K(Sigma，E.C.3.4.21.64)，并且允许于30-37℃反应30分钟-1小时。
[参考实施例5]来自血液的测试样品(4)的制备
向无菌试管中预先加入肝素化的血液1/2体积的MonopolyTM[Amersham Bioscience，Ficoll和甲泛影钠(Metrizoate)的混合物，比重：1.115g/ml]，并且在使试管倾斜时在其上缓慢地覆盖肝素化的血液。随后对该层实施在4℃和100xg下5分钟的冷冻离心，并且收集包含微生物的上清液。
工业适用性
根据本发明，通过可替代培养方法、事实上继承培养方法特征的快速方法，与死细胞(死亡状态)和损伤的细胞(损伤的或活而非可培养态)相比较，可以更选择性地检测食品或临床样品中包含的微生物活细胞(活且可培养态)。
序列表
<110>KYUSHU UNIVERSITY
<120>用于检测微生物的方法和用于检测微生物的试剂盒
<130>F167-C5307
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物23S-F
<400>1
cagtcagagg cgatgaagga cgtgc                                      25
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物23S-R
<400>2
ccggttagct caacccatcg ctgcg                                      25
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物23S-MF
<400>3
accaggattt tggcttagaa g                                          21
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物23S-MR
<400>4
cacttacccc gacaaggaat                                      20
<210>5
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物16S-F
<400>5
agtttgatcc tggctc                                          16
<210>6
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物16S-R
<400>6
ggctaccttg ttacga                                          16
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物hlyA-F
<400>7
tgcaagtcct aagacgcca                                       19
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物hlyA-R
<400>8
cactgcatct ccgtggtata ctaa                                      24

Claims (32)

1.一种用于通过区别测试样品中选自柠檬酸杆菌和克雷伯氏菌的微生物活细胞与死细胞和/或损伤的细胞来检测活细胞的用于非诊断目的的方法，其包括下述步骤：
a)用选自乙锭单氮化物、安吖啶、喜树碱、阿霉素、椭圆玫瑰树碱、依托泊苷、米托蒽醌、saintopin、拓扑替康和CP-115，953的拓扑异构酶毒物或选自环丙沙星、氧氟沙星、依诺沙星、培氟沙星、氟罗沙星、诺氟沙星、萘啶酸、奥索利酸和吡咯米酸的DNA回旋酶毒物处理所述测试样品的步骤，其中当所述拓扑异构酶毒物是乙锭单氮化物时，对加入乙锭单氮化物的所述测试样品实施可见光的照射；
b)从所述测试样品中提取DNA，和通过PCR扩增所述提取的DNA的16S rRNA的900-3000个核苷酸长度的区域的步骤；和
c)分析扩增产物的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中所述扩增产物通过将产物与代表所述微生物和所述扩增产物量的关系的标准曲线比较来进行分析，所述标准曲线通过使用所述微生物的标准样品进行制备。
3.根据权利要求2的方法，其中PCR通过实时PCR来进行，并且PCR和所述扩增产物的分析同时进行。
4.根据权利要求1的方法，其中所述测试样品选自乳、乳制品、由乳或乳制品作为原材料生产的食品、血液样品、尿样品、脊髓液样品、滑液样品和胸膜液样品。
5.根据权利要求1的方法，其中PCR通过使用引物SEQ ID NOS：5和6的引物组来进行。
6.根据权利要求1的方法，其中在所述步骤a)前执行下述步骤：
d)用拓扑异构酶和/或DNA回旋酶处理所述测试样品的步骤。
7.一种用于通过区别测试样品中的微生物活细胞与死细胞和/或损伤的细胞来检测活细胞的用于非诊断目的的方法，其包括下述步骤：
a)用乙锭单氮化物处理测试样品，并用可见光照射加入乙锭单氮化物的所述测试样品的步骤；
b)用除乙锭单氮化物外的拓扑异构酶毒物和/或除乙锭单氮化物外的DNA回旋酶毒物处理所述测试样品的步骤；
c)从所述测试样品中提取DNA，和通过PCR扩增所述提取的DNA的靶区域的步骤，其中所述靶区域的长度为100-3000个核苷酸；和
d)分析扩增产物的步骤。
8.根据权利要求7的方法，其中所述扩增产物通过将产物与代表所述微生物和所述扩增产物量的关系的标准曲线比较来进行分析，所述标准曲线通过使用所述微生物的标准样品进行制备。
9.根据权利要求8的方法，其中PCR通过实时PCR来进行，并且PCR和所述扩增产物的分析同时进行。
10.根据权利要求7的方法，其中所述测试样品选自乳、乳制品、由乳或乳制品作为原材料生产的食品、血液样品、尿样品、脊髓液样品、滑液样品和胸膜液样品。
11.根据权利要求7的方法，其中所述微生物是细菌。
12.根据权利要求11的方法，其中所述靶区域是23S rRNA基因。
13.根据权利要求12的方法，其中PCR通过使用引物SEQ ID NOS：1和2的引物组，或引物SEQ ID NOS：3和4的引物组来进行。
14.根据权利要求7的方法，其中所述微生物是病原菌。
15.根据权利要求14的方法，其中PCR通过使用引物SEQ ID NOS：7和8的引物组来进行。
16.根据权利要求7的方法，其中在所述步骤a)前执行下述步骤：
e)用拓扑异构酶和/或DNA回旋酶处理所述测试样品的步骤。
17.一种用于根据权利要求1的方法时的试剂盒，其包含下述元件：
选自乙锭单氮化物、安吖啶、喜树碱、阿霉素、椭圆玫瑰树碱、依托泊苷、米托蒽醌、saintopin、拓扑替康和CP-115，953的拓扑异构酶毒物或选自环丙沙星、氧氟沙星、依诺沙星、培氟沙星、氟罗沙星、诺氟沙星、萘啶酸、奥索利酸和吡咯米酸的DNA回旋酶毒物，和
用于通过PCR扩增待检测的选自柠檬酸杆菌和克雷伯氏菌的微生物DNA的16S rRNA基因的900-3000个核苷酸长度的区域的引物。
18.一种用于根据权利要求7的方法时的试剂盒，其包含下述元件：
乙锭单氮化物；
选自安吖啶、喜树碱、阿霉素、椭圆玫瑰树碱、依托泊苷、米托蒽醌、saintopin、拓扑替康和CP-115，953的拓扑异构酶毒物和/或选自环丙沙星、氧氟沙星、依诺沙星、培氟沙星、氟罗沙星、诺氟沙星、萘啶酸、奥索利酸和吡咯米酸的DNA回旋酶毒物；和
用于通过PCR扩增待检测的微生物DNA靶区域的引物，其中所述靶区域的长度为100-3000个核苷酸。
19.根据权利要求17的试剂盒，其进一步包含拓扑异构酶和/或DNA回旋酶。
20.根据权利要求18的试剂盒，其进一步包含拓扑异构酶和/或DNA回旋酶。
21.根据权利要求17的试剂盒，其中所述引物由引物SEQ ID NOS：5和6的引物组组成。
22.根据权利要求18的试剂盒，其中所述引物由引物SEQ ID NOS：1和2的引物组，或引物SEQ ID NOS：3和4的引物组组成。
23.根据权利要求18的试剂盒，其中所述引物由引物SEQ ID NOS：7和8的引物组组成。
24.一种用于通过区别测试样品中选自革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的微生物活细胞与死细胞和/或损伤的细胞来检测活细胞的用于非诊断目的的方法，其包括下述步骤：
a)用选自乙锭单氮化物、安吖啶、喜树碱、阿霉素、椭圆玫瑰树碱、依托泊苷、米托蒽醌、saintopin、拓扑替康和CP-115，953的拓扑异构酶毒物或选自环丙沙星、氧氟沙星、依诺沙星、培氟沙星、氟罗沙星、诺氟沙星、萘啶酸、奥索利酸和吡咯米酸的DNA回旋酶毒物处理所述测试样品的步骤，其中当所述拓扑异构酶毒物是乙锭单氮化物时，对加入乙锭单氮化物的所述测试样品实施可见光的照射；
b)从所述测试样品中提取DNA，和通过PCR扩增所述提取的DNA的23S rRNA的900-3000个核苷酸长度的靶区域的步骤；和
c)分析扩增产物的步骤。
25.根据权利要求24的方法，其中所述扩增产物通过将产物与代表所述微生物和所述扩增产物量的关系的标准曲线比较来进行分析，所述标准曲线通过使用所述微生物的标准样品进行制备。
26.根据权利要求25的方法，其中PCR通过实时PCR来进行，并且PCR和所述扩增产物的分析同时进行。
27.根据权利要求24的方法，其中所述测试样品选自乳、乳制品、由乳或乳制品作为原材料生产的食品、血液样品、尿样品、脊髓液样品、滑液样品和胸膜液样品。
28.根据权利要求24的方法，其中PCR通过使用引物SEQ ID NOS：1和2的引物组，或引物SEQ ID NOS：3和4的引物组来进行。
29.根据权利要求24的方法，其中在所述步骤a)前执行下述步骤：
d)用拓扑异构酶和/或DNA回旋酶处理所述测试样品的步骤。
30.一种用于根据权利要求24的方法时的试剂盒，其包含下述元件：
选自乙锭单氮化物、安吖啶、喜树碱、阿霉素、椭圆玫瑰树碱、依托泊苷、米托蒽醌、saintopin、拓扑替康和CP-115，953的拓扑异构酶毒物或选自环丙沙星、氧氟沙星、依诺沙星、培氟沙星、氟罗沙星、诺氟沙星、萘啶酸、奥索利酸和吡咯米酸的DNA回旋酶毒物，和
用于通过PCR扩增待检测的选自革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的微生物DNA的23S rRNA基因的900-3000个核苷酸长度的靶区域的引物。
31.根据权利要求30的试剂盒，其进一步包含拓扑异构酶和/或DNA回旋酶。
32.根据权利要求30的试剂盒，其中所述引物由引物SEQ ID NOS：1和2的引物组，或引物SEQ ID NOS：3和4的引物组组成。
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