KR100955884B1 - 살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 검출방법 및 이를이용한 엔테로박터 사카자키의 선택배지 - Google Patents

살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 검출방법 및 이를이용한 엔테로박터 사카자키의 선택배지 Download PDF

Info

Publication number
KR100955884B1
KR100955884B1 KR1020080032370A KR20080032370A KR100955884B1 KR 100955884 B1 KR100955884 B1 KR 100955884B1 KR 1020080032370 A KR1020080032370 A KR 1020080032370A KR 20080032370 A KR20080032370 A KR 20080032370A KR 100955884 B1 KR100955884 B1 KR 100955884B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
enterobacter sakazaki
medium
sakazaki
enterobacter
detection
Prior art date
Application number
KR1020080032370A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090106949A (ko
Inventor
이민석
김선애
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to KR1020080032370A priority Critical patent/KR100955884B1/ko
Publication of KR20090106949A publication Critical patent/KR20090106949A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100955884B1 publication Critical patent/KR100955884B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
    • G01N31/221—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators for investigating pH value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

엔테로박터 사카자키의 검출방법 및 엔테로박터 사카자키의 선택배지가 제공된다.
본 발명에 따른 엔테로박터 사카자키 검출방법은 상기 엔테로박터 사카자키의 검출성분으로 살리신을 사용하는 것을 특징으로 하며, 기존에 사용되던 고가의 물질 대신 저렴한 살리신을 사용하는 엔테로박터 사카자키의 검출방법을 제공하여 공공기관이나 산업체 연구소 등에서 가지고 있던 경제적 부담을 해소하며, 본 발명에 의한 엔테로박터 사카자키의 검출방법을 영유아 식품의 안전성을 확보하는 연구의 근간으로 사용함으로써 국내 분유 및 이유식 등 영유아 식품 관련 산업을 보호하고 국제적으로 국내의 식품 위생 및 안전성 분야에 지위향상을 도모할 수 있다.
살리신, 엔테로박터 사카자키

Description

살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 검출방법 및 이를 이용한 엔테로박터 사카자키의 선택배지{Method for detection of Enterobacter sakazakii using salicin and medium for detection of Enterobacter sakazakii}
본 발명은 살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 검출방법 및 엔테로박터 사카자키의 선택배지에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 기존에 사용되던 고가의 물질 대신 살리신을 사용한 검출력 및 선별력이 우수하며 효율성이 높고 경제적인 선택배지에 관한 것이다.
엔테로박터 사카자키는 대장균군에 속하는 그람 음성 간균으로 주요 매개체로서 건조 조제분유가 보고되며 장염을 일으키기도 하고 피로 들어가면 패혈증, 뇌로 침입하면 뇌수막염을 일으킬 수 있으며 한 살 미만인 아기가 패혈증에 걸릴 경우 10 내지 20%의 사망률을, 뇌수막염일 경우 20 내지 30%의 사망률을 나타낸다. 이는 정상적인 면역력을 가진 사람에게는 크게 문제가 되지 않으나 신생아, 특히 면역력이 약한 신생아에게 치명적인 위험을 줄 수 있다.
또한, 선진국의 식중독 관련 통계자료를 살펴보면 전체 식중독 사고의 10% 미만만이 보고되고 나머지 90%는 정확히 집계되지 못하고 있는 실정이며 이러한 식 중독 사고의 미흡한 보고는 일반 병원이나 실험실에서 기술 설비가 부족하여 원인 식중독세균을 규명하지 못하는 것이 주요 원인으로 작용한다. 따라서 엔테로박터 사카자키에 의한 식중독의 예방, 식중독의 원인 파악 및 식품이나 식자재의 오염 현황 파악 등을 위하여 식품에서 엔테로박터 사카자키를 효율적으로 검출할 수 있는 기술 개발 및 정립은 매우 중요하다.
한편, 선택배지는 특정미생물의 생화학적 특성을 이용하여 대상으로 하는 미생물을 다른 미생물과 구별을 두면서 선택적으로 검출하고자 할 때 사용된다. 선택배지는 1). 검출대상으로 하는 균의 선택적 증균 2). 검출대상으로 하지 않는 균들의 성장 억제 3) 검출대상으로 하는 균을 그 이외의 균과 구별할 수 있는 선택성 부여를 목적으로 하므로 위의 세 가지 기능을 할 수 있는 성분을 포함하고 있어야 한다. 선택배지는 특정 미생물의 검출에서 가장 기본적으로 요구되는 도구이기 때문에 효과적인 선택배지를 개발하고, 배지의 효율을 증진시키고자 하는 노력은 계속되어왔다.
현재 엔테로박터 사카자키 검출을 위하여 사용되고 있는 선택배지는 선별력이 낮거나, 선별력은 높지만 구성물질의 희소성으로 인하여 경제성이 떨어지므로 경제적이면서도 효율성이 높은 엔테로박터 사카자키의 선택배지 개발이 요구되고 있다.
종전에 사용되어 왔던 엔테로박터 사카자키의 선택배지는 DFI medium(Oxoid사에서 Chromogenic Enterobacter sakazakii agar라는 상용명으로 판매), ESPM(R&F products에서 Enterobacter sakazakii Chromogenic Plating medium라는 상용명으로 판매), ESIA(AES Laboratories에서 Enterobacter sakazakii isolation agar라는 상용명 판매)과 fluorogenic medium(Acumedia사에서 E. sakazakii medium라는 상용명으로 판매) 등이 있다. 각각의 선택배지에서, DFI, ESIA는 선택물질로 XαGlc을 사용하고, ESPM은 XαGlc과 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-cellobiosideSigma (XβCel)을 사용하며 fluorogenic medium은 MUG를 사용한다. Sigma사의 가격을 기준으로, XαGlc은 5 mg에 71.9 달러, XβCel은 25 mg에 450 달러, MUG의 가격은 10 mg에 28.8 달러이다. 각각의 배지를 1 L 제조하는데 사용되는 선택물질의 비용은 DFI medium 은 1438 달러, ESPM의 경우 2700달러, fluorogenic medium은 144 달러가 소요되며, ESIA의 경우 무려 2157 달러가 소요된다. 이처럼 선택배지 제조에 많은 비용이 소요되어 공공기관이나 산업체 연구소 등에서 엔테로박터 사카자키와 관련된 연구에 있어서 경제적인 부담을 갖고있는 실정이다. 따라서 검출력이 높으면서 저렴한 엔테로박터 사카자키의 검출방법의 개발에 대한 필요성이 더욱 증대되고 있다.
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 살리신을 이용하여 간편하고 저렴하며 검출력이 높은 엔테로박터 사카자키 검출방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 두번째 과제는 엔테로박터 살리신이 검출물질로 사용된 선별력이 우수하며 경제성 있는 엔테로박터 사카자키 선택배지를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 첫번째 과제를 달성하기 위해서,
엔테로박터 사카자키 검출방법에 있어서, 상기 엔테로박터 사카자키의 검출성분으로 살리신을 사용하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 검출방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 엔테로박터 사카자키 검출방법은 상기 엔테로박터 사카자키가 상기 살리신을 분해함으로써 발생하는 pH 변화를 검출하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 살리신이 첨가된 환경에서 검출대상 미생물을 30 내지 45℃의 온도에서 18시간 내지 24시간 동안 배양하여 배양 전과 후의 pH의 변화를 검출하는 것이 될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 pH 변화의 검출은 산 염 기 지시약을 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 산 염기 지시약은 뉴트랄 레드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 pH의 변화는 pH 미터기를 이용하여 측정할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 두번째 과제를 달성하기 위해서,
엔테로박터 사카자키를 검출하기 위한 선택배지에 있어서, 상기 선택배지는 엔테로박터 사카자키의 검출성분으로 살리신을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지를 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 선택배지는 산 염기 지시약을 더 포함하는것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 선택배지는 엔테로박터 사카자키의 성장을 촉진하는 제 1 성분; 및 상기 엔테로박터 사카자키 이외의 다른 미생물의 성장을 억제하는 제 2 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면,상기 제 1성분은 펩톤, 프로테오즈펩톤1, 프로테오즈펩톤3, 트립톤으로 구성된 군 중에서 선택되는 하나 이상인것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제 2 성분은 담즙산 또는 크리스탈 바이올렛 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 살리신은 상기 선택배지 의 총 구성물의 부피 1L 당 5 내지 15g이 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제 1 성분은 총 구성물의 부피 1L 당 10 내지 20g의 펩톤인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 선택배지는 상기 엔테로박터 사카자키와는 상이한 미생물을 검출하기 위한 제 3 성분을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 미생물은 황화수소를 발생하는 장내세균이고, 상기 제 3 성분은 티오황산나트륨 및 구연산 철 암모늄의 조합일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 산 염기 지시약은 뉴트랄 레드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 산 염기 지시약은 상기 엔테로박터 사카자키와는 상이한 미생물에 의한 pH 변화를 검출하기 위한 제 4 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 미생물은 크렙시엘라 속이며, 제 4 성분은 브로모크레졸 그린 또는 브로모크레졸 퍼플을 사용하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 살리신을 포함한 엔테로박터 사카자키의 선택배지는 검출대 상으로 하는 미생물의 증식에 필요한 영양소를 제공함으로써 검출대상 미생물의 검출력이 높으며, 검출대상으로 하지 않는 미생물은 그 성장이 억제되거나 다른 성상의 집락을 나타내어 선별력이 우수하다. 특히 지시약을 사용하여 pH의 변화를 측정할 경우, 엔테로박터 사카자키의 배양 후 후처리과정을 거치거나 별도의 기구를 사용하지 않고 육안으로 용이하게 식별 가능하다는 장점이 있다. 더욱이 본 발명의 선택배지에 의한 엔테로박터 사카자키의 군집은 지시약에 대한 단순한 색 변화를 넘어서 보락색 집락 주위로 투명한 보더가 생기므로 다른 미생물의 집락에 비교하여 선별력을 더한다.
본 발명에 의한 엔테로박터 사카자키 선택배지는 종전에 사용되던 타 배지의 제조에 사용된 물질보다 가격이 저렴한 살리신을 사용하여 경제적 효율성이 높은 선택배지이다. 종래에 사용되던 배지와 달리 본 발명의 선택배지는 살리신(Sigma 판매)을 선택물질로 사용하는데, 살리신은 5 g에 26.3 달러로 실험의 결과 얻어진 최적의 양을 첨가하여 배지를 제조할 경우 배지 1 L 제조시 42 달러가 요구된다. 이는 종전의 배지에서 사용되는 선택물질보다 훨씬 저 비용으로, 엔테로박터 사카자키를 검출함에 그간 제기되어 왔던 경제적 문제점을 해소하는데 기여할 수 있다. 본 발명을 통해 여러 공공기관이나 산업체 연구소 등에서 종전의 선택배지가 가지고 있던 경제적 부담을 해소하면서 엔테로박터 사카자키 검출, 분리, 실험 등에 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 의한 엔테로박터 사카자키의 검출방법을 영유아 식품의 안전성을 확보하는 연구의 근간으로 사용함으로써 국내 분유 및 이유식 등 영유아 식품 관련 산업을 보호하고 국제적으로 국내의 식품 위생 및 안전성 분야에 지위향상을 도모할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명은 살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 검출방법 및 엔테로박터 사카자키 선택배지에 관한것으로 구체적으로, 엔테로박터 사카자키 검출방법에 있어서, 상기 엔테로박터 사카자키의 검출성분으로 살리신을 사용하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 검출방법을 제공한다. 살리신은 버드나무의 잎이나 껍질 속에 들어 있는 글리코시드이며 무색이나 흰색의 결정성 물질로 화학식은 다음과 같으며 도 1에 살리신의 3차원 구조식을 도시하였다.
Figure 112008025100673-pat00001
한편, 상기 엔테로박터 사카자키 검출방법은 상기 엔테로박터 사카자키가 상기 살리신을 분해함으로써 발생하는 pH 변화를 검출하는 것일 수 있다. 엔테로박터 사카자키는 살리신을 영양성분으로 사용하여 분해함으로써 대사작용에 의하여 pH가 낮은 산성물질을 생성한다. 따라서 엔테로박터 사카자키가 생육하는 환경에 살리신을 투여한 후 일정시간 배양하면 엔테로박터 사카자키가 합성한 물질에 의해 주변 pH가 낮아지는 것을 측정하는 것이 엔테로박터 사카자키를 검출하는 방법이 될 수 있다.
또한, 상기 살리신이 첨가된 환경에서 검출대상 미생물을 30 내지 45℃의 온도에서 18시간 내지 24시간 동안 배양하여 배양 전과 후의 pH의 변화를 검출하는 것이 될 수 있다. 미생물의 종류와 서식 환경에 따라 미생물 검출을 위한 적정온도와 배양시간은 상이하며, 미생물 검출의 효율을 높이고 특히 여러 종류의 미생물이 서식하는 시료에서 특정 미생물을 검출하는 경우 선별력과 검출력을 향상시키는데 있어 적정 배양온도 및 시간은 매우 중요한 요소가 된다. 이에 본 발명에서는 엔테로박터 사카자키의 검출을 위해 시료의 적정 배양시간 및 적정 배양온도를 제공한다. 구체적으로, 배양온도가 30℃ 미만일 경우 엔테로박터 사카자키 이외의 중온성 미생물이 성장하기에 좋은 조건이 되어 상기 미생물의 과다 증식으로 상대적으로 엔테로박터 사카자키의 성장이 저해되며, 45℃를 초과할 경우 엔테로박터 사카자키의 대사작용이 둔화 되고 미생물을 이루는 단백질의 변성이 초래되어 엔테로박터 사카자키의 생장이 저해되는 문제가 있다. 배양시간과 관련해서 18시간 미만 동안 배양할 경우 검출대상 미생물이 충분히 증균되지 않아 이들이 합성하는 산성물질이 pH 지시약이나 pH 미터기를 통해 측정되지 않거나 측정되더라도 그 결과가 정확하지 않을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면 특별히, 엔테로박터 사카자키만을 선택적으로 검출할 경우에는 상기 선택배지를 배양하는 단계는 42℃에서 18시간 동안 지속함이 바람직하고, 엔테로박터 사카자키만을 선택적으로 검출하는 것이 아닌 경우에는 상기 선택배지를 배양하는 단계는 37℃에서 24시간 동안 지속함이 바람직하다. 이러한 배양조건은 하기 실시예5에 의한 실험을 통하여 최적의 조건을 찾아낸 것이다. 42℃에서 배양할 경우 검출대상으로 하지 않는 균주의 성장이 억제되며 상대적으로 온도가 높아 엔테로박터 사카자키의 증식속도가 증가하므로 18시간동안 배양하는 것이 바람직하다. 다만, 엔테로박터 사카자키는 37℃에서 성장이 더 좋은 경향을 나타낸다. 이 경우 상대적으로 온도조건이 낮아 엔테로박터 사카자키의 증식속도가 느려 상기의 경우보다 오랜시간 배양하는 것이 바람직하며 24시간이 적당하다. 따라서 다양한 미생물 가운데 엔테로박터 사카자키의 선택적 검출이 필요한 경우에는 42℃에서 18시간, 선택적 검출이 필요하지 않을 경우에는 37℃에서 24시간을 배양함이 바람직하다. 다만 이는 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 pH의 변화는 산 염기 지시약을 사용하여 측정하는 것으로 할 수 있다. 산 염기 지시약은 수소이온농도(pH)의 변화를 측정하는데 사용되는 지시약이다. 산 염기 지시약은 그 자체가 약한 산 또는 약한 염기이며, 이온이 되었을때의 색이 해리되지 않았을 때와 다르므로, 색이 용액 속에서 수소이온농도의 변화에 따라 변화한다. 지시약의 화학적 성질에 따라 산성지시약(페놀프탈레인·티몰블루 등)과 염기성지시약(메틸오렌지·메틸레드 등)으로 구분되며, 살리신으로부터 엔테로박터 사카자키가 산성물질을 생성함에 비추어 본 발명에서는 상기 지시약 중 산 성용액에서 변색되는 염기성 지시약을 사용함이 바람직하다. 산 염기 지시약의 변색 범위 및 용액의 산도에 따른 색은 표 1에 도시한 바와 같다.
지시약 산성쪽 색 변색범위(pH) 염기성쪽 색
메틸 오렌지(Methyl Orange ) 적색 3.1～4.4 황색
메틸레드(Methyl Red) 적색 4.2～6.3 황색
페놀레드(Phenol Red) 황색 6.8～8.4 적색
브로모페놀 블루(Bromphenol Blue) 황색 3.0～4.6 청색
페놀프탈레인 (Phenolphthalein) 무색 8.3～10.0 적색
브롬타이몰 블루(Bromthymol Bule) 황색 6.2～7.6 청색
리트머스 용액 적색 6.0∼8.2 청색
티몰불루 용액 적색 1.2∼2.8 황색
티몰프탈레인 용액 무색 9.3∼10.5 청색
메틸엘로우(methyl yellow) 적색 2.9 ~ 4.1 황색
콩코레드(congo red) 청자색 3.0 ~ 5.2 적색
브롬크레졸그린(bromcresol green) 황색 3.8 ~ 5.4 청자색
브롬크레졸퍼플(bromcresol purple) 녹황색 5.2 ~ 6.8 청자색
뉴트랄레드(neutral red) 보라색 6.8 ~ 8.0 황색
구체적으로, 상기 산 염기 지시약은 뉴트랄 레드를 사용함이 바람직하다. 실험전 균 없는 상태 배지는 pH 6.8 내지 7 정도이며, 엔테로박터 사카자키가 배지내 존재시 살리신으로부터 산성물질을 합성하여 배지의 산도는 pH 5.4 내지 5.9가 된다. 뉴트랄레드는 pH 6.8 이하일 경우 황색에서 보라색으로 변색 되므로, 본 발명의 실시에 있어서 가장 적합한 지시약이다.
또한 상기 pH의 변화는 pH 미터기를 이용하여 측정할 수 있다. pH는 수소이온(H+)의 농도를 나타내므로 용액 중에 직접 또는 간접으로 두 개의 전극을 삽입하여 전지를 형성하고, 이에 따라 나타나는 전위차를 측정하여 이 값을 pH로 나타내도록한 장치가 pH 미터기이다. 일 실시예에 의하면 pH 미터기는 당업자가 산도 측정시 일반적으로 사용하는 유리전극에 의한 것을 사용하나 이에 한정되지 않는다. 시료의 배양 전 pH가 6.8 내지 7의 중성을 나타내는 범위에 있는지 확인하여, 이물질의 함유로 인한 pH측정의 오판을 방지한다. 바람직한 일 실시예에 의하면 검출 대상이 되는 시료를 채취해 30 내지 45 ℃온도로 18 내지 24시간 방치하여 미생물을 증균시킨 후 pH미터기로 pH를 측정하여 pH의 범위가 5.4 내지 5.9일 경우 엔테로박터 사카자키가 존재한다고 판단가능하다. 특히, pH 미터기를 사용하여 시료의 pH를 측정하므로 엔테로박터 사카자키를 검출하는 경우 엔테로박터의 존재여부에 대한 검출을 넘어서 정량적인 검출이 가능하다는 장점이 있다. 구체적으로 pH 범위가 5.7 내지 5.9일 경우 엔테로박터 사카자키가 105내지 106CFU/ml수준으로 존재한다고 볼 수 있으며, pH 범위가 5.4 내지 5.6일 경우 엔테로박터 사카자키가 107 내지 108CFU/ml수준으로 존재한다고 판단 가능하다. 다만 pH범위가 5.0 이하로 측정되는 경우에는 시료에 크랩시엘라 속등과 같이 엔테로박터 사카자키 이외에 pH를 낮추는 물질을 생성하는 미생물이 존재한다고 판단함이 타당하다. 또한 시료의 배양 전과 비교하여 pH의 변화가 없거나 높아진 경우는 엔테로박터 사카자키나 크렙시엘라등 살리신을 분해하는 미생물이 존재하지 않는다고 판단할 수 있다. pH 미터기를 사용하여 엔테로박터 사카자키가 살리신을 분해하여 산성물질을 생성하였는지 여부를 결정하는 것은 엔테로박터 사카자키 검출에 있어서 간편하고 정확한 방법이 될 수 있다.
그밖에 상기 pH의 변화의 측정은 상기 기재한 방법에 제한되지 않으며, 백금선 또는 백금판을 이용하는 수소전극이나 pH 시험지등 당업자가 pH를 측정하기 위해 일반적으로 사용하는 방법으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 엔테로박터 사카자키를 검출하기 위한 선택배지에 있어서, 상기 선택배지는 엔테로박터 사카자키의 검출성분으로 살리신을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지를 제공한다. 살리신은 버드나무의 잎이나 껍질 속에 들어 있는 글리코시드이며 무색이나 흰색의 결정성 물질로 구조식은 도 1에 도시하였다. 살리신은 당의 일종으로 본 발명의 선택배지에서 엔테로박터 사카자키의 영양성분인 동시에 타 미생물과 집락차이를 일으키는 검출물질로 사용되었다. 이 성분이 본 발명의 선택배지에 있어서 가장 핵심이 되는 요소로 엔테로박터 사카자키가 살리신을 분해하여 대사산물로 생성하는 특유한 산도를 가지는 물질로부터 엔테로박터 사카자키의 존재를 식별한다. 선택배지는 통상 펩톤(peptone)이나 염화나트륨(NaCl)등 중성물질이 포함되므로 미생물 배양 전의 배지의 pH는 6.8 내지 7 정도이다. 이러한 배지에 엔테로박터 사카자키 등의 미생물을 배양시키면 미생물이 당을 분해하여 산을 생성하는데, 특별히 엔테로박터 사카자키가 살리신을 분해하면 pH의 범위가 5.4 내지 5.9까지 낮아진다.
따라서 선택배지는 산 염기 지시약을 더 포함하는 것이 바람직한데 이는 상기 pH의 변화를 시료의 배양 후 후처리 없이 육안으로 쉽게 구별하기 위함이다. pH 지시약의 색이 변함으로써 살리신을 분해하지 않는 타 미생물과 다른 색과 특징을 지닌 집락을 엔테로박터 사카자키의 집락으로 식별할 수 있다.
상기 선택배지는 엔테로박터 사카자키의 성장을 촉진하는 제 1 성분; 및 상기 엔테로박터 사카자키 이외의 다른 미생물의 성장을 억제하는 제 2 성분을 더 포함할 수 있다. 이는 선택배지의 선택성을 높이기 위함이며, 선택성은 여러 종류의미생물이 서식하는 시료에서 검출해내고자 하는 특정 미생물만을 선별하여 그 존부를 확인할 수 있는 능력을 의미한다. 상기 엔테로박터 사카자키의 성장을 촉진하는 제 1 성분은 엔테로박터 사카자키에 의한 대사작용이 특히 활발한 영양성분으로 주로 질소가 함유된 물질이며, 상기 성분 첨가시 엔테로박터 사카자키의 증식을 촉진하여 엔테로박터 사카자키의 검출이 용이하게 된다. 상기 엔테로박터 사카자키 이외의 다른 미생물의 성장을 억제하는 성분은 엔테로박터 사카자키의 생장에는 영향이 없으면서 그 외의 미생물의 대사작용이나 증식에 치명적인 결함을 주는 유해 물질이다. 상기 엔테로박터 사카자키 이외의 다른 미생물의 성장을 억제하는 성분을 배지에 첨가할 경우 검출 대상이 아닌 엔테로박터 사카자키 이외의 미생물의 증식이 억제되므로 타 미생물의 대사에 의한 pH 변화를 최소화할 수 있어 상기 배지의 검출력이 향상되며 더불어 타 미생물의 성장에 의한 영양성분의 부족, 성장공간의 부족 및 노폐물의 축적에 의한 독소물질 생산 등으로 엔테로박터 사카자키가 사멸되는 것을 방지하는 역할을 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면,상기 제 1성분은 펩톤, 프로테오즈 펩톤1, 프로테오즈펩톤3, 트립톤으로 구성된 군 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며 상기 제 2 성분은 담즙산 또는 크리스탈 바이올렛 또는 이들의 조합일 수 있다. 그러나 이는 바람직한 일 실시예 일뿐 이에 한정됨 없이 엔테로박터 사카자키의 성장을 촉진하는 성분은 제 1 성분으로 포함할 수 있으며, 엔테로박터 사카자키 이외의 다른 미생물의 성장을 억제하는 물질은 제 2 성분으로 포함할 수 있다.
한편, 살리신은 상기 선택배지의 총 구성물의 부피 1L 당 5 내지 15g이 포함될 수 있다. 살리신이 선택배지의 총 구성물의 부피 1L당 5g 미만으로 함유될 경우 시료에 엔테로박터 사카자키가 존재하여 살리신을 영양성분으로 해서 산성 물질을 생성하더라도 그 양이 적어 pH 변화가 적어 검출의 정확성이 저하된다. 엔테로박터 사카자키가 존재하지 않는 시료의 경우에도 이물질의 유입등으로 다소의 pH 변화가 있을 수 있으며, 살리신이 선택배지의 총 구성물의 부피 1L당 5g 미만으로 함유된 배지의 경우 검출결과 지시약의 색이 변한 경우라도 색변화가 지시약에 의한 것인지 이물질의 유입등 주변환경에 의한 것인지 불분명한 문제가 생긴다. 또한 살리신은 미생물간 집락 차이를 일으키는 성분으로 사용됨과 동시에 탄소원으로 미생물의 영양성분의 역할을 한다. 따라서 살리신의 양이 총 구성물의 부피 1L당 5g 미만일경우 엔테로박터 배지 내 영양성분이 부족하여 사카자키의 집락과 배지 전체 색이 노랗게 변하여 선택배지로써 적합하지 않게 된다. 살리신이 선택배지의 총 구성물의 부피 1L당 15g 이상 함유될 경우에는 배지제조에 비용이 높아져 비경제적이고, 살리신은 탄소원으로 미생물의 영양성분으로 사용되므로 엔테로박터 사카자키 뿐만 아니라 검출 대상으로 하지 않는 미생물 역시 이상증식해 엔테로박터 사카자키의 검출력을 저하시킨다.
또한, 상기 제 1 성분은 총 구성물의 부피 1L 당 10 내지 20g의 펩톤인 것이 바람직하다. 이는 실시예 3 및 실시예4에 의한 실험을 통하여 본 발명의 실시에 있어 최적의 펩톤함량을 정한 것이다. 펩톤이 10 g/L 미만 함유된 배지에서는 영양성분의 부족으로 엔테로박터 사카자키 균의 집락이 매우 작게 형성되어 결과 확인이 용이하지 않으며 영양성분의 부족으로 집락의 색과 배지 전체의 색이 노랗게 변할 수 있다. 펩톤이 20 g/L 이상 함유될 경우 배지 제조에 있어 경제적이지 못하다는 단점이 있으며, 배지 내 영양성분의 과다로 검출대상이 되는 미생물 외의 미생물이 과다 증식하여 배지의 선별력 및 검출력이 저하된다.
상기 선택배지는 상기 엔테로박터 사카자키와는 상이한 미생물을 검출하기 위한 제 3 성분을 더 포함하는 것일 수 있다. 이는 엔테로박터 사카자키 이외의 미생물이 함유된 시료를 대상으로 엔테로박터 사카자키의 존부를 검출할 경우 선택성을 향상시키기 위한 것이다. 특히 엔테로박터 사카자키와 함께 생장하는 그 이외의 미생물이 상기 제 2 성분에 의해 억제되지 않거나 억제되는 정도가 미미할 경우 상기 제 3 성분을 포함하는 배지를 사용하여 제 3 성분에 의해 검출된 엔테로박터 사카자키 이외의 미생물과 엔테로박터 사카자키를 뚜렷하게 구별할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 미생물은 황화수소를 발생하는 장내세균이고, 상기 제 3 성분은 티오황산나트륨 및 구연산 철 암모늄의 조합일 수 있다. 살리신이 첨가된 기본 배지에 티오황산나트륨과 구연산 철 암모늄을 첨가하면 황화수소를 생성하는 장내세균을 검출할 수 있다. 상기 성분이 포함된 배지에서 황화수소를 생성하는 장내세균(Citrogacter , Salmonella , Erwinia , Edwardsiella , Proteus 등)은 검은색 집락을 형성하는 반면, 엔테로박터 사카자키는 황화수소를 생성하지 않아 검은색 집락을 형성하지 않는다. 따라서 상기 두 성분의 추가는 배지의 선별력을 향상시켜줄 수 있다.
본 발명의 엔테로박터 사카자키 선택배지에 첨가되는 상기 산 염기 지시약은 뉴트랄 레드를 사용하는 것이 바람직하다. 살리신으로부터 엔테로박터 사카자키가 산성물질을 생성함에 비추어 본 발명에서는 상기 지시약 중 산성용액에서 변색되는 염기성 지시약을 사용함이 바람직하다. 산 염기 지시약의 변색 범위 및 용액의 산도에 따른 색은 표 1에 도시한 바와 같다. 구체적으로, 상기 산 염기 지시약은 뉴트랄 레드를 사용함이 바람직하다. 엔테로박터 사카자키의 살리신을 이용한 대사작용을 통해 pH는 배양전 6.8 내지 7.0가량이었던 배지의 산도가 엔테로박터 사카자키 배양 후pH 5.4 내지 5.9 까지 변한다. 뉴트랄레드는 pH 6.8 이하일 경우 보라색으로 변색되므로, 본 발명의 실시에 있어서 가장 적합한 지시약이다.
상기 산 염기 지시약은 상기 엔테로박터 사카자키와는 상이한 미생물에 의한 pH 변화를 검출하기 위한 제 4 성분을 더 포함할 수 있다. 이는 검출대상 시료에 엔테로박터 사카자키 이외의 미생물이 함유되어 있을 경우 선택성을 향상시키기 위한 것이다. 특히 엔테로박터 사카자키와 함께 생장하는 그 이외의 미생물이 상기 제 2 성분에 의해 억제되지 않거나 억제되는 정도가 미미할 경우 상기 선택배지에 첨가함이 바람직하며, 특히 상기 살리신을 분해하여 엔테로박터 사카자키가 생성하는 산성의 물질과 다른 pH 범위를 갖는 물질을 합성하는 미생물이 존재할 경우 이를 검출하기 위한 제 4 성분을 배지에 함유시키며 이는 상기 산 염기 지시약과 변색범위가 상이한 산 염기 지시약일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 미생물은 크렙시엘라 속이며, 제 4 성분은 브로모크레졸 그린 또는 브로모크레졸 퍼플을 사용하는 것일 수 있다. 크랩시엘라 속이 생성하는 물질은 pH 5 이하로 그 범위가 엔테로박터 사카자키가 합성하는 물질의 산도와 상이하므로 다른 종류의 지시약을 추가적으로 사용하여 구별이 가능하다. 브로모크레졸 퍼플, 브로모크레졸 그린은 수소이온 농도에 따라 각각 pH5.2, pH3.8 이하에서 변색 되므로 크렙시엘라 속에 의한 pH변화를 측정이 가능하다. 따라서, 검출대상이 되는 시료에 크랩시엘라 속과 엔테로박터 사카자키가 혼재되어 있는 경우에 뉴트랄 레드에 브로모크레졸 퍼플이나 브로모크레졸 그린을 함께 사용하면 크렙시엘라 속에 의한 pH변화를 측정할 수 있어, 상대적으로 엔테로박터 사카자키의 검출력을 높이는 효과가 있다. 도 3a에서 뉴트랄 레드 단독 사용한 배지, 뉴트랄 레드와 브로모크레졸 퍼플 조합사용한 배지, 뉴트랄 레드와 브로모크레졸 그린의 조합사용한 배지에서의 엔테로박터 사카자키의 집락을 제시하였다. 도 3b에서는 뉴트랄 레드 단독 사용한 배지, 뉴트랄 레드와 브로모크레졸 퍼플 조합사용한 배지, 뉴트랄 레드와 브로모크레졸 그린의 조합사용한 배지에서의 크랩시엘라속의 집락을 제시하였다. 도 3a를 참고하면 지시약의 조절로 엔테로박터 사카자키의 성상은 크게 변하지 않음을 알 수 있으며, 도 3b를 참조하면 지시약의 조절로 인하여 크랩시엘라 속은 집락의 색이 변하여 엔테로박터 사카자키와의 구별이 더 용이해 짐을 알 수 있다.
또한 본 발명에 의한 엔테로박터 사카자키 선택배지에 미생물을 접종하는 단계; 상기 선택배지를 30 내지 45℃에서 18시간 내지 24시간 동안 배양하는 단계를 거쳐 상기 배양된 선택배지로부터 보라색 집락 주위에 투명하거나 백색의 보더를 형성한 집락을 엔테로박터 사카자키의 집락으로 선별할 수 있다. 구체적으로 일 실시예에 따르면, 분말형태의 상기 선택배지를 정량하여 증류수에 녹인 후 고압살균기에서 121℃에서 15분 동안 멸균 후 약 45 내지 50℃로 식혀 페트리디쉬에 적당량을 분주하여 반고체성의 선택배지를 제조한다. 제조된 배지에 미생물을 접종한 후 적절한 배양환경(엔테로박터 사카자키의 경우 30 내지 45℃의 온도에서 18시간 내지 24시간이 적절)에서 배양하면 미생물은 집락을 형성하게 된다. 미생물이 종류나 배지의 성분 등에 따라서 생성된 집락은 색, 모양, 등의 독특한 특징을 가지게 된다. 이러한 독특한 특징의 부여가 선택배지상에서 대상으로 하는 미생물을 분리하는데 핵심이 되는 요소이다. 본 발명 선택배지에서 엔테로박터 사카자키는 살리신을 분해하여 pH 감소를 야기하고 이는 지시약으로 사용된 뉴트랄 레드의 색은 보라색으로 변하게 된다. 결국 엔테로박터 사카자키는 보라색의 집락을 나타내는데, 엔테로박터 사카자키는 이러한 보라색 집락 주위로 투명-유백색의 보더를 형성하는 특징을 가지고있어 다른 미생물과의 분별이 용이하다. 도 4는 살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 선택배지에서 엔테로박터 사카자키의 집락을 나타낸 것이다. 도5를 참조하면 본 발명 선택배지에서 엔테로박터 사카자키는 보라색의 중심에 투명-유백색의 보더를 가진 집락을 형성함을 알 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
실시예1 ).실험에 사용된 균주
본 발명에서 사용된 다른 미생물들은 표 2와 같다. 사용된 미생물들은 식품위생에서 가장 문제가 되고 있는 병원성 미생물 또는 부패성 미생물이다.
사용된 균주
Enterobacter sakazakii ATCC 12868 Klebsiella pneumoniae Kla
Enterobacter sakazakii ATCC 29004 Klebsiella pneumoniae Revco 41
Enterobacter sakazakii ATCC 29544 Klebsiella pneumoniae ATCC 13882
Enterobacter sakazakii ATCC 51329 Salmonella typhimurium ATCC 19585
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692 Salmonella enterica 4509
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Salmonella enteritidis ATCC 13076
Pseudomonas putida ATCC 21025 Hafnia alvei ATCC 29926
Enterococcus faecalis ATCC 29212 Hafnia alvei ATCC 29927
Citrobacter freundii ATCC 8090 Hafnia alvei ATCC 13337
Listeria innocua ATCC 51742 Escherichia coli ATCC 25922
Listeria innocua ATCC 33090 Escherichia coli WADDL 2701
Listeria monocytogenes ATCC 19111 Escherichia coli WADDL 4083
Listeria monocytogenes ATCC 19112 Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894
Listeria monocytogenes ATCC 19114 Escherichia coli O157:H7 ATCC 43895
Staphylococcus aureus ATCC 27664 Escherichia coli O157:H7 ATCC 35150
Staphylococcus aureus ATCC 13565 Escherichia coli O157:H7 ATCC 43889
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Shigella sonnei ATCC 9290
Bacillus cereus ATCC 10876 Shigella flexneri ATCC 9199
Bacillus cereus ATCC 13061 Yersinia enterocolitica ATCC 23715
Bacillus cereus ATCC 11778 　
실시예2 ). 선택배지의 구성성분
선택배지의 기본 성분이란, 본 발명에서 중점을 두어 조절한 성분 외에 통상적으로 대장균군의 선택배지에서 사용되는 성분과 그 양을 의미한다. 조절성분이란 최적의 성분 조합조건을 분석하기 위하여 실험에서 조절된 성분을 의미한다. 표 3에 기본 성분과 실험에 사용하여 조절된 성분을 나타내었다.
　 성분 적정함량(g/L)
기본성분 염화나트륨 5
한천 15
크리스탈 바이올렛 0.001~0.002
담즙산 No. 3 1~2
뉴트랄 레드 0.01~0.04
조절성분 탄소원(살리신) 양 조절(5~15)
질소원(펩톤, 프로테오즈 펩톤" I, 프로테오즈 펩톤 III, 트립톤) 양 조절(10~20)
선택능을 향상시키기 위하여 첨가되는 성분 브로모크레졸 그린 양 조절(0.01~0;04)
브로모크레졸 퍼플 양 조절(0.01~0;04)
티오황산나트륨 0.5~1.5
　구연산 철 암모늄 0.5~1.5
실시예3 ). 실험 미생물에 대한 질소원에 따른 성상 검정
본 실험에 사용된 질소원으로는 펩톤(1), 프로테오즈 펩톤 1(2), 프로테오즈 펩톤 3(3), 트립톤(4)이 사용되었다. 질소원외의 성분 및 양을 고정하고 질소원만을 조절한 배지를 제조하였다. 또한 일반적으로 영양배지로 사용되는 표준한천배지와 검출력을 비교하기 위하여 표준한천배지 또한 제조하였다.
엔테로박터 사카자키 균주의 증균 혼탁액 혼합, 대상으로 하지 않는 균주들의 증균 혼탁액 혼합, 실험에 사용된 모든 균주(엔테로박터 사카자키와 검출대상으로 하지 않는 균주)의 증균 혼탁액 혼합물을 적절하게 희석한 후 질소원이 조절된 각 배지에 도말하여 균의 검출력과 선별력(대상으로 하는 미생물과 대상으로 하지 않는 미생물의 분별의 용이성)을 비교하였다. 검출력의 결과는 하기 표 4로 나타내었으며, 그 결과 (1)과 (3)이 검출력이 우수하여 표준한천배지와 통계적 차이가 없었다. 선별력의 측면에서는 (1)배지가 가장 우수하였다. 표 4는 상기 조건의 배지의 검출력의 차이를 나타낸 표이며, 각각 세 번 반복하여 실험을 한 결과의 평균에 ± 표준오차를 나타내었다.
사용된 질소원 Avg log CFU/ml
E. sakazakii 의 증균 혼탁액 검출대상으로 하지 않는 균주의 증균혼탁액 실험에 사용된 모든 균주의 증균 혼탁액
(1)펩톤 6.27 ± 0.07 5.74 ± 0.09 5.72 ± 0.03
(2)프로테오즈 펩톤 I 6.10 ± 0.20 5.68 ± 0.11 5.81 ± 0.06
(3)프로테오즈 펩톤 III 6.40 ± 0.06 5.78 ± 0.14 5.74 ± 0.12
(4)트립톤 6.14 ± 0.18 5.69 ± 0.13 5.73 ± 0.14
표준한천배지 6.84 ± 0.07 6.74 ± 0.01 6.78 ± 0.05
실시예4 ). 선정된 질소원과 살리신(선택물질이자 탄소원)의 함유량 조절
선정된 질소원인 펩톤과 살리신의 성분을 조절하여 표 5에 도시한 대로 6가지의 배지를 제조하였다. 엔테로박터 사카자키 균주의 증균 혼탁액, 대상으로 하지 않는 균주들의 증균 혼탁액 및 실험에 사용된 모든 균주의 증균 혼탁액 혼합물을 적절하게 희석한 후 영양성분이 조절된 각 배지에 도말하여 균의 검출력과 선별력을 비교하였다. 표 5는 6가지 배지의 검출력의 차이를 나타낸 것이다. 각각 세 번 반복하여 실험을 한 결과의 평균에 ± 표준오차를 나타내었다.
영양성분의 양(g/L) Avg log CFU/ml
배지종류 펩톤 살리신 E. sakazakii 의 증균 혼탁액 검출대상으로 하지 않는 균주의 증균혼탁액 실험에 사용된 모든 균주의 증균 혼탁액
A 20 10 6.29 ± 0.09 5.74 ± 0.09 5.74 ± 0.04
B 20 5 6.24 ± 0.04 5.66 ± 0.03 5.55 ± 0.07
C 10 10 6.30 ± 0.09 5.73 ± 0.03 5.73 ± 0.03
D 10 5 6.37 ± 0.07 5.63 ± 0.07 5.76 ± 0.03
E 5 10 6.29 ± 0.16 5.61 ± 0.04 5.66 ± 0.07
F 5 5 6.35 ± 0.05 5.64 ± 0.08 5.61 ± 0.10
표준한천 배지 6.89 ± 0.09 6.74 ± 0.01 6.79 ± 0.05
검출력의 실험 결과 각 배지 사이에서 유의적인 차이는 나타나지 않았으나, 균의 성상의 측면에서는 차이가 나타났다. 펩톤이 5 g/L가 함유된 E, F 배지에서는 영양성분의 부족으로 엔테로박터 사카자키 균의 집락이 매우 작게 형성되어 결과 확인이 용이하지 않았다. 살리신이 5 g/L가 들어간 B, D, F 배지는 배양시간이 24시간이 넘어가자, 살리신의 부족으로 집락의 색과 배지 전체의 색이 노랗게 변하였다. 펩톤이 조절된 A와 C, B와 D 배지 사이에서는 차이가 나타나지 않았다. 따라서 살리신은 5 g/L이상 첨가함이 바람직하다.
실시예5 ).배양 시간 및 온도 설정
적절한 배양 시간 및 온도를 설정하기 위하여 선택배지에 미생물을 도말 한 후 배양시간을 18, 24, 48 시간으로 조절하고, 배양 온도를 30, 37, 42℃로 조절하여 미생물을 배양하였다. 표 6 배양조건에 따른 미생물의 검출력을 실험한 결과를 나타내었다. 각각 세 번 반복하여 실험을 한 결과의 평균에 ± 표준오차를 나타내었다.
　 배양시간 배지상에서의 집락 수
30℃ 37℃ 42℃
E. sakazakii 의 증균 혼탁액 18 296.83 ± 18.81 303.50 ± 18.26 271.67 ± 24.92
24 297.17 ± 18.84 303.67 ± 18.34 271.83 ± 25.07
48 297.17 ± 18.84 303.67 ± 18.34 271.83 ± 25.07
검출대상으로 하지 않는 균주의 증균혼탁액 18 98.33 ± 5.09 99.50 ± 2.08 62.50 ± 6.06
24 110.83 ± 10.92 102.83 ± 2.03 92.17 ± 3.16
48 112.17 ± 11.51 103.33 ± 1.64 96.50 ± 4.93
실험에 사용된 모든 균주의 증균 혼탁액 18 86.67 ± 8.79 100.50 ± 3.79 76.50 ± 37.76
24 90.00 ± 9.31 102.50 ± 4.91 90.50 ± 40.62
48 90.82 ± 9.74 103.00 ± 5.06 110.00 ± 32.01
배양 조건에 따른 차이는 검출대상으로 하지 않는 균주의 혼합 증균액의 18시간 배양한 경우의 결과만 유의적으로 나타났다. 42℃에서 배양할 경우 검출대상으로 하지 않는 균주의 성장이 억제되었으므로 42℃에서 18시간동안 배양하는 것이 좋으나, 엔테로박터 사카자키는 37℃에서 성장이 더 좋은 경향을 나타내었다(유의적 차이는 없었음). 따라서 다양한 종류의 미생물이 혼재된 시료 중에서 엔테로박터 사카자키만 선택적으로 검출할 경우에는 42℃에서 18시간, 엔테로박터 사카자키만이 배양되어 선택적 검출이 필요하지 않을 경우에는 37℃에서 24시간이 적당할 것이라고 판단된다.　
도 1은 살리신의 3차원 구조식이다.
도 2는 살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 선택배지에서 배양된 엔테로박터사카자키와 크렙시엘라의 집락을 나타낸 것이다.
도 3a는 좌부터 뉴트랄 레드만을 첨가한 배지, 뉴트랄 레드와 브로모크레졸 퍼플을 첨가한 배지 및 뉴트랄 레드와 브로모크레졸 블루를 첨가한 배지상에서 엔테로박터 사카자키의 집락을 나타낸 것이다.
도 3b는 좌부터 뉴트랄 레드만을 첨가한 배지, 뉴트랄 레드와 브로모크레졸 퍼플을 첨가한 배지 및 뉴트랄 레드와 브로모크레졸 블루를 첨가한 배지상에서 크랩시엘라의 집락을 나타낸 것이다.
도 4는 살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 선택배지에서 엔테로박터 사카자키의 집락을 나타낸 것이다.

Claims (18)

  1. 엔테로박터 사카자키 검출방법에 있어서,
    상기 엔테로박터 사카자키의 검출성분으로 살리신을 사용하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 검출방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 엔테로박터 사카자키 검출방법은 상기 엔테로박터 사카자키가 상기 살리신을 분해함으로써 발생하는 pH 변화를 검출하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 검출방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 살리신이 첨가된 환경에서 검출대상 미생물을 30 내지 45℃의 온도에서 18시간 내지 24시간 동안 배양하여 배양 전과 후의 pH의 변화를 검출하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 검출방법.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 pH 변화의 검출은 산 염기 지시약을 이용하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 검출방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 산 염기 지시약은 뉴트랄 레드를 사용하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 검출방법.
  6. 제 2항에 있어서,
    상기 pH의 변화의 검출은 pH 미터기를 사용하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 검출방법.
  7. 엔테로박터 사카자키를 검출하기 위한 선택배지에 있어서,
    상기 선택배지는 엔테로박터 사카자키의 검출성분으로 살리신을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 선택배지는 산 염기 지시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 선택배지는 엔테로박터 사카자키의 성장을 촉진하는 제 1 성분; 및 상기 엔테로박터 사카자키 이외의 다른 미생물의 성장을 억제하는 제 2 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 제 1 성분은 펩톤, 프로테오즈 펩톤1, 프로테오즈펩톤3, 트립톤으로 구성된 군 중에서 선택되는 하나 이상 인것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 제 2 성분은 담즙산 또는 크리스탈 바이올렛 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지.
  12. 제 7항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 살리신은 상기 선택배지의 총 구성물의 부피 1L 당 5 내지 15g이 포함됨을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 제 1 성분은 총 구성물의 부피 1L 당 10 내지 20g의 펩톤인 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지.
  14. 제 7항에 있어서,
    상기 선택배지는 상기 엔테로박터 사카자키와는 상이한 미생물을 검출하기 위한 제 3 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 미생물은 황화수소를 발생하는 장내세균이고, 상기 제 3 성분은 티오황산나트륨 및 구연산 철 암모늄의 조합인 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지.
  16. 제 8항에 있어서,
    상기 산 염기 지시약은 뉴트랄 레드를 사용하는것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지.
  17. 제 8항에 있어서,
    상기 산 염기 지시약은 상기 엔테로박터 사카자키와는 상이한 미생물에 의한 pH 변화를 검출하기 위한 제 4 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 미생물은 크렙시엘라 속이며, 제 4 성분은 브로모크레졸 그린 또는 브로모크레졸 퍼플을 사용하는것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키 선택배지.
KR1020080032370A 2008-04-07 2008-04-07 살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 검출방법 및 이를이용한 엔테로박터 사카자키의 선택배지 KR100955884B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080032370A KR100955884B1 (ko) 2008-04-07 2008-04-07 살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 검출방법 및 이를이용한 엔테로박터 사카자키의 선택배지

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080032370A KR100955884B1 (ko) 2008-04-07 2008-04-07 살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 검출방법 및 이를이용한 엔테로박터 사카자키의 선택배지

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090106949A KR20090106949A (ko) 2009-10-12
KR100955884B1 true KR100955884B1 (ko) 2010-05-06

Family

ID=41536800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080032370A KR100955884B1 (ko) 2008-04-07 2008-04-07 살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 검출방법 및 이를이용한 엔테로박터 사카자키의 선택배지

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100955884B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101064134B1 (ko) * 2008-12-17 2011-09-15 고려대학교 산학협력단 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법, 이를 위한 액체배지 및 정량분석키트
CN102135541A (zh) * 2010-09-03 2011-07-27 李克生 阪崎肠杆菌检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100626568B1 (ko) 1998-03-18 2006-09-25 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-글루탐산을 생산하는 박테리아 및 이를 생산하는 방법
US20060257967A1 (en) 2005-05-13 2006-11-16 Lawrence Restaino Chromogenic plating media for the identification of Enterobacter sakazakii
US20070026482A1 (en) 2005-07-05 2007-02-01 Washington State University Fluorogenic selective and differential medium for isolation of Enterobacter sakazakii
KR20080027848A (ko) * 2006-02-17 2008-03-28 모리나가 뉴교 가부시키가이샤 미생물 검출법 및 미생물 검출 키트

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100626568B1 (ko) 1998-03-18 2006-09-25 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-글루탐산을 생산하는 박테리아 및 이를 생산하는 방법
US20060257967A1 (en) 2005-05-13 2006-11-16 Lawrence Restaino Chromogenic plating media for the identification of Enterobacter sakazakii
US20070026482A1 (en) 2005-07-05 2007-02-01 Washington State University Fluorogenic selective and differential medium for isolation of Enterobacter sakazakii
KR20080027848A (ko) * 2006-02-17 2008-03-28 모리나가 뉴교 가부시키가이샤 미생물 검출법 및 미생물 검출 키트

Also Published As

Publication number Publication date
KR20090106949A (ko) 2009-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sanjee et al. Microbiological quality assessment of frozen fish and fish processing materials from Bangladesh
FI98379C (fi) Elatusaine ja menetelmä salmonellojen tunnistamiseksi
KR101602286B1 (ko) 리스테리아를 배양하기 위한 배양 배지, 방법, 및 리스테리아를 검출하기 위한 방법
WO1996040861A1 (en) Microbiological media for isolation and identification of enteric pathogens such as e. coli and salmonella
US20080160555A1 (en) Detecting a Microorganism Strain in a Liquid Sample
Mladenović et al. Isolation and identification of Enterobacteriaceae from traditional Serbian cheese and their physiological characteristics
IE60699B1 (en) A test set and a process for the determination of antibiotics in milk and a novel streptococcus thermophilus strain to be used therein.
CN103614451A (zh) 一种化妆品微生物的检测方法
Mari et al. Qualitative and guantitative validation of the micro biological survey method for Listeria spp., Salmonella spp., Enterobacteriaceae and Staphylococcus aureus in food samples
KR101747347B1 (ko) 바실러스 세레우스 그룹으로부터 박테리아를 검출하는 방법
Khueankhancharoen et al. Optimized microscale detection of amino acid decarboxylase for rapid screening of Salmonella in the selective enrichment step
Kim et al. A new cost-effective, selective and differential medium for the isolation of Cronobacter spp.
KR100955884B1 (ko) 살리신을 이용한 엔테로박터 사카자키의 검출방법 및 이를이용한 엔테로박터 사카자키의 선택배지
EP1300471B1 (en) Nutritional mixture and method for early identification and count of gram-negative organisms
Ketema et al. Microbiological safety of fruit juices served in cafes/Resturants, Jimma Town, Southwest Ethiopia
Umar et al. Comparative studies on the prevalence of salmonella species in two homemade fermented beverages (Zobo and Kunun-Zaki) Sold At Samaru, Zaria, Kaduna, Nigeria
CN105861623B (zh) 一种用于检测阪崎肠杆菌的显色培养基
Dhinesh et al. Microbial pathogens in canned fish collected from Tamil Nadu
Landeka et al. Microbiological and physicochemical quality of honey in Bosnia and Herzegovina
MXPA03002053A (es) Medio de cultivo y metodo para la identificacion de microorganismos gram-negativos.
KR101064134B1 (ko) 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법, 이를 위한 액체배지 및 정량분석키트
KR101945846B1 (ko) 대장균군/대장균 간이 검출법 및 검출장치
US10233477B2 (en) Culture medium for microorganisms including para-aminobenzoic acid as a selective agent
KR102622998B1 (ko) 비브리오 미미쿠스 검출용 선택배지 조성물 및 이를 이용한 비브리오 미미쿠스 검출방법
RU2812423C1 (ru) Дифференциально-селективная питательная среда для выделения шигелл и сальмонелл сухая (Гектоеновый энтеро-агар)

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130405

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140304

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee