KR101945846B1 - 대장균군/대장균 간이 검출법 및 검출장치 - Google Patents

대장균군/대장균 간이 검출법 및 검출장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효소발색법을 이용하여 식중독균을 신속 용이하게 검출할 수 있는 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 발명의 식중독균의 검출 방법 및 검출 장치는 가정, 급식소 또는 농식품산업현장의 생활용품으로부터 식중독균을 신속 용이하고 효과적으로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 식중독균의 검출 방법 및 검출 장치를 통해 현장에서 신속 용이하게 식중독균을 분석할 수 있어, 식중독균에 대한 상시 모니터링 체계를 확보하고 식중독 사고를 예방할 수 있다.

Description

대장균군/대장균 간이 검출법 및 검출장치{Screening protocol and device for detection of coliform bacteria and Escherichia coli}
본 발명은 효소발색법을 이용하여 식중독균을 신속 용이하게 검출할 수 있는 방법 및 장치에 관한 것이다.
대장균은 위생지표세균으로 특히 분변오염의 지표로 알려져 있다. 병원성 미생물을 개별적으로 검사하는 것은 현실적으로 어려우므로, 위생지표세균을 조사하면 전반적인 위상상태를 확인할 수 있다. 대장균의 10%는 병원성 대장균이며 국내에서 이에 의한 식중독 사례가 2015년도 39건, 2123명으로 식중독의 원인 중 가장 높은 비율을 차지하고 있다. 종래의 대장균을 검사하는 방법은 증균, 선택배지에서 분리 및 동정하는 과정으로 이루어지며, 약 4일 정도 소요된다. 이러한 생화학적 방법에 기초한 종래의 대장균 분석법은 시간이 오래 걸리며 전문성이 요구된다.
최근 대장균 검사에 효소발색법의 원리를 이용한 분석법이 증가하고 있는 추세이다. 효소발색법은 대장균이 β-D-galactosidase 및 β-D-glucuronidase를 분비하여 효소발색법에 이용되는 시약 중 발색기질을 분해하여 색깔의 변화를 일으키고 형광색을 나타내는 원리를 이용한 기술이다. 이러한 효소발색법은 환경부, 미환경청(EPA) 및 AOAC의 수질검사법에도 등재된 공인된 시험법이며, 18시간 내에 대장균 유무를 신속하게 검사할 수 있다.
그러나, 효소발색법은 인큐베이트, UV 장치 및 고압멸균기 등의 특수한 장비를 요구하는 방법으로, 가정, 급식소 또는 농식품 산업현장에 적용하는데 한계가 있다. 따라서, 상기와 같은 생활 환경에서 용이하고 효과적으로 식중독균을 검출할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 가정, 급식소 또는 농식품 산업현장 등의 일상적인 생활 환경에서 용이하고 효과적으로 식중독균을 검출할 수 있는 방법 및 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 일상생활용품으로부터 시료를 채취하고, 이에 효소발색기질을 처리한 후, 종래의 효소발색법에 사용되던 인큐베이터를 가정용 발효기로, UV 장치를 휴대용 UV 램프로, 고압멸균기를 정수 소독약으로 대체함으로써, 현장에서 식중독균을 용이하고 효과적으로 검출할 수 있는 놀라운 발견을 하여 본 발명을 완성하였다. 종래의 효소발색법을 이용한 검출 방법 및 본 발명의 식중독균의 검출 방법을 비교하여 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.
항 목 종래의 검출 방법 본 발명의 검출 방법
경제성 분석 비용 ○재료비
＊작업도구 : 12,000원
＊장갑 : 12,000원
＊물 : 13,000원
＊농산물 : 15,000원
○인건비 : 3만원/건
= 10,000원/h × 3 h
＊배지 준비, 전처리, 분리, 동정에 총 3시간 소요		 ○재료비
＊작업도구: 2,500원
＊장갑: 4,000원
＊물: 5,000원
＊농산물: 12,000원
○인건비 : 거의 없음
분석 시간 4일 소요 18시간
장비비용 ＊인큐베이터: 최소 80만원
＊UV 장치: 최소 50만원
＊고압멸균기: 250만원		 ＊발효기 : 10만원
＊UV 손전등 : 1,5000원
분석 장소 실험실 어느 곳이든 가능
편이성 ＊샘플처리, 균주, 분리에 노동력이 필요함
＊초자 세척이 필요함		 ＊샘플처리시간 5분이내
＊초자 세척이 필요 없음
정확성 ＊숙련도가 필요함 ＊누구든지 가능함
＊색깔과 형광을 띌 시 100% 대장균임
본 발명은 (s1) 시료를 채취하는 단계; (s2) 상기 시료에 효소 발색 기질을 첨가하는 단계; (s3) 상기 (s2) 단계의 시료를 발효기에 넣고 배양하는 단계; (s4) 배양 후 휴대용 UV 램프를 사용하여 발색 여부를 확인하는 단계를 포함하는 식중독균의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 일반 가정, 급식소 또는 농식품산업현장에서 작업도구, 작업자의 손, 장갑, 농산물 및 종자 등을 포함하는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상으로부터 채취될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발색 기질은 효소발색법을 통하여 식중독균, 바람직하게 대장균을 검출할 수 있는 기질이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 Colilert 18®(IDEXX, 미국)이 사용될 수 있다. 상기 Colilert 18은 일반적으로 용수 중 대장균을 검사하는데 사용되나, 본 발명에서는 일상생활용품으로부터 대장균을 검출하는데 사용될 수 있다. 상기 Colilert 18은 배양된 시료에 휴대용 UV 램프로 비출때 노란색 형광을 띄면 대장균이 있는 것으로 판정할 수 있다. 상기 Colilert 18의 사용과 관련하여, 대장균은 β-D-galactosidase를 분비하여 발색기질인 β-D-galactopyranoside를 o-nitrophenyl 및 β-D-galactopyranoside로 분해하여 노란색 발색을 나타낼 수 있다. 또한, 대장균은 β-D-glucuronidase를 분비하여 발색기질인 4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide를 분해하여 β-D-glucuronide 및 4-methyl-umbelliferone으로 분해하여 형광색을 나타낼 수 있다(도 6).
본 발명에 있어서, 상기 (s3) 배양 단계는 33 내지 40℃, 바람직하게 35 내지 37℃에서 12 내지 24시간, 바람직하게 15 내지 21시간 동안 배양할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식중독균은 바실러스, 리스테리아, 살모넬라, 대장균, 황색포도상구균 및 캠필로박터 등을 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게 상기 식중독균은 대장균일 수 있다.
또한, 본 발명의 식중독균의 검출 방법은 (s5) 검출 후 정수 알약을 첨가하여 식중독균을 살균시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정수 알약은 물 속에 있는 콜라레, 이질 또는 장티푸스 등의 수인성 전염병균을 살균할 수 있는 염소계 소독제가 사용될 수 있으며, 예를 들어 아쿠아탭스가 사용될 수 있다. 상기 살균 단계를 통해 작업 도구 등에 존재하는 식중독균을 효과적으로 살균하고, 작업 도구를 위생적으로 폐기할 수 있다.
또한, 본 발명은 배양기 및 UV 램프를 포함하는 식중독균 검출 장치를 제공한다. 상기 식중독균 검출 장치는 채취된 시료를 용이하게 배양할 수 있도록 배양기를 포함하며, UV 램프를 통해 배양기에서 배양된 시료에 형광 여부를 즉각적으로 확인할 수 있어, 식중독균 배양 및 결과 확인을 동시에 함으로써 신속 용이하고 효과적으로 식중독균을 검출할 수 있다. 상기 식중독균 검출 장치의 외부 및 내부의 구성을 도 8 및 도 9에 나타내었다.
본 발명의 식중독균 검출 장치는 예를 들어, 365 nm의 UV 램프를 장착할 수 있으며, 컴패트한 사이즈로 공간활용도가 높다. 또한, 상기 장치는 2~3 kg 정도의 무게로 휴대하기 용이할 수 있으며, 시가잭을 결합하여 차량 운반 중에도 배양이 가능하여 실험 시간을 단축할 수 있다.
또한, 본 발명의 식중독균 검출 장치는 온도 조절부를 포함할 수 있으며, 이를 통해 배양기의 온도가 각각의 식중독균에 적절하게 설정될 수 있다. 예를 들어, 바실러스 및 리스테리아는 30℃로, 살모넬라, 대장균 및 포도상구균은 37℃로, 캠필로박터는 42℃로 온도가 설정되어 각각 배양될 수 있다. 이러한 온도 설정 장치를 통해, 본 발명의 식중독균 검출 장치는 다양한 식중독균을 용이하고 효과적으로 검출할 수 있다. 본 발명의 식중독균 검출 장치는 급식소, 농식품산업체 또는 식품분석기관 등에서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 식중독균 검출 장치를 사용하여, 효소발색법을 통해 식중독균을 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 검출 방법은 종래의 식중독균 검출 방법에 비해, 생활 현장에서 신속 용이하게 식중독균을 검출할 수 있다.
본 발명의 식중독균의 검출 방법 및 검출 장치는 가정, 급식소 또는 농식품산업현장의 생활용품으로부터 식중독균을 신속 용이하고 효과적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 식중독균의 검출 방법 및 검출 장치를 통해 현장에서 신속 용이하게 식중독균을 분석할 수 있어, 식중독균에 대한 상시 모니터링 체계를 확보하고 식중독 사고를 예방할 수 있다.
도 1은 효소발색법을 이용한 종래의 식중독균 검출 방법 및 본 발명의 식중독균 검출 방법을 비교하여 나타낸 표이다.
도 2 내지 도 5는 본 발명의 식중독균 검출 방법을 사용하여 작업도구(도 2), 작업자 손(도 3), 물(도 4) 또는 농산물(도 5)로부터 대장균을 검출하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 6은 대장균으로부터 분비된 효소가 발색 기질을 분해하는 것을 나타낸 도면이다.
도 7은 시간 경과에 따른 발효기 내 온도 변화를 나타낸 그래프이다.
도 8 및 도 9는 본 발명의 식중독균 검출 장치의 기기 외부(도 8) 및 내부(도 9)의 구성을 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실험예 1: Colilert 18의 첨가량 결정
Colilert 18을 물뿐만 아니라, 작업도구, 작업자 손 또는 농산물 등에 확대 적용하기 위해, 적정 첨가량을 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 실험 결과, 시료별 적절한 Colilert 18의 첨가량을 하기 표 2에 나타내었다.
대상시료별 전치료 용액 용량 및 Colilert 18 첨가량
대상시료 전처리 용액 colilert 18 첨가량
물 100ml 2.7g
작업도구 10ml 0.27g
작업자손 50ml 1.35g
농산물 및 종자 250ml 6.75g
실험예 2: Colilert 18의 특이성 조사
균주는 E. coli 38주, Yersinia spp. 3주, Enterobacter spp. 3주, Hafnia spp. 1주, Klebsiella spp. 6주, Salmonella spp. 28주, Shigella spp. 9주, S. aureus 3주, Listeria spp. 5주, Cronobacter spp. 3주, Pantoea spp. 2주, Enterococcus spp. 1주, Citrobacter spp. 2주, Serratia spp. 1주, Pectobacterium spp. 1주, Providencia spp. 2주, Acinetobacter spp. 2주, Pseudomonas spp. 5주 및 Kocuria spp. 1주를 사용하였다.
배지는 Colilert 18을 멸균 증류수에 녹여서 사용하였다. 균주 접종 및 확인은 하기의 단계에 따라 수행하였다.
① Listeria monocytogenes를 제외한 식중독균과 일부 천연 박테리아는 TSB를 2ml씩 분주한 24 웰 플레이트에 1-2 콜로니를 접종하고 37℃에서 24시간 배양하였다.
② Listeria monocytogenes 및 일부 천연 박테리아는 TSB를 2ml씩 분주한 24 웰 플레이트에 1-2 콜로니를 접종하고 30℃에서 24시간 배양하였다.
③ Colilert 18을 24 웰 플레이트에 2ml씩 분주하였다.
④ 최적의 온도에서 배양된 대상균주는 colilert 18이 포함된 24 웰 플레이트에 10㎕씩 접종하고 37℃ 및 44℃에서 18시간 배양하였다.
⑤ 배양 후 색깔과 UV 손전등(365nm)을 사용하여 형광유무를 관찰하였다.
Colilert 18의 특이성 조사 결과, 온도에 관계 없이 91.4%의 대장균은 양성 반응을 보인 반면, 8.6%의 대장균은 음성 반응을 보였다. 음성을 보인 대장균은 E. coli O157:H7으로 이들은 β-glucuronidase를 분비하지 않기 때문에 형광을 나타내지 않는 특성이 있다. 37℃에서 위양성을 보인 경우는 3.8%이며, 주로 Shigella spp.의 일부가 위양성을 보였으며 44℃로 온도를 높이면 위양성 결과는 나타나지 않았다.
Colilert 18에서 양성 반응을 보인 비율
　 37℃ 44℃
E. coli 91.4%(35/38) 91.4%(35/38)
Non-E. coli 3.8%(3/78) 0%(0/0)
위양성 유발 균주 Shigella flexneri NCCP 11203
Shigella sonnei NCCP 16122
Shigella sonnei ATCC 25981 		-　
실험예 3: Colilert 18의 민감성 조사
균주는 E. coli 7주(E. coli NCCP 13715, E. coli NCCP 13718, E. coli NCCP 13719, E. coli NCCP 13721, E. coli 무순 생산 환경에서 분리된 균주 3주)를 사용하였다. 배지는 Colilert 18을 멸균 증류수에 녹여서 사용하였다. 균주 접종 및 확인은 하기 단계에 따라 수행하였다.
① TSA에 배양된 E. coli를 1 콜로니 취하여 10ml TSB에 접종하고 37℃에서 진탕배양하였다.
② 4℃, 4000rpm, 10분간 원심분리하고 PBS로 두 번 세척한 후 O.D.600nm 1로 맞추었다.
③ 균액 1ml을 취한 후 9ml 0.1% 펩톤(pepton) 함유된 물에 혼합하고, 이후 단계희석하여 최종농도 101이하, 101, 102 및 103 CFU/ml로 조정하였다.
④ colilert 18 용액 9ml, 49ml, 99ml 및 249ml에 희석된 균액(101이하, 101, 102, 및 103 CFU/ml)을 각각 1ml씩 접종하고 37℃에서 18시간 배양하였다.
⑤ 배양 후 색깔과 UV 손전등(365nm)을 사용하여 형광유무를 관찰하였다.
Colilert 18의 민감성 조사 결과, 37℃에서는 10마리 이하도 충분히 검출가능하여 민감성이 높았으나, 44℃에서는 민감성이 낮아지는 경향을 보였다.
Tempe
rature
(℃)		 Strains 10㎖당 대장균수
(CFU/10ml)		 50㎖당 대장균수
(CFU/50ml)		 100㎖당 대장균수
(CFU/100ml)		 250㎖당 대장균수
(CFU/250ml)
>101 101 102 103 >101 101 102 103 >101 101 102 103 >101 101 102 103
37℃ E. coli NCCP 13715 + + + + + + + + + + + + + + + +
E. coli NCCP 13718 + + + + + + + + + + + + + + + +
E. coli NCCP 13719 + + + + + + + + + + + + + + + +
E. coli NCCP 13721 + + + + + + + + + + + + + + + +
E. coli (무순 모니터링) + + + + + + + + + + + + + + + +
E. coli (무순 모니터링) + + + + + + + + + + + + + + + +
E. coli (무순 모니터링) + + + + + + + + + + + + + + + +
44.5℃ E. coli NCCP 13715 + + + + - + + + - + + + - - + +
E. coli NCCP 13718 + + + + + + + + - + + + - + + +
E. coli NCCP 13719 + + + + + + + + + + + + - - + +
E. coli NCCP 13721 + + + + - + + + - + + + - + + +
E. coli (무순 모니터링) + + + + + + + + + + + + - + + +
E. coli (무순 모니터링) + + + + + + + + + + + + - - + +
E. coli (무순 모니터링) + + + + + + + + + + + + - - + +
실험예 4: 정수 알약을 이용한 살균 효과 조사
균주는 E. coli 7주(E. coli NCCP 13715, E. coli NCCP 13718, E. coli NCCP 13719, E. coli NCCP 13721, E. coli 무순 생산 환경에서 분리된 균주 3주)를 사용하였다. 배지는 Colilert 18을 멸균 증류수에 녹여서 사용하였다. 균주 접종 및 확인은 하기 단계에 따라 수행하였다.
① TSA에 배양된 E. coli를 1 콜로니 취하여 10ml TSB에 접종하고 37℃에서 진탕배양하였다.
② 4℃, 4000rpm, 10 분간 원심분리하고 PBS로 두 번 세척한 후 O.D.600nm 1로 맞추었다.
③ 균액 1ml을 취한 후 9ml 0.1% 펩톤 함유 물에 혼합하고 이후 단계 희석하여 최종농도 103 CFU/ml로 조정하였다.
④ Colilert 18 용액 9ml, 49ml, 99ml 및 249ml에 희석된 균액(103 CFU/ml)을 각각 1ml씩 접종하고 37℃에서 18시간 배양하였다.
⑤ 정수알약(Aquatabs 167mg, Medentech, Ireland)을 10ml에 1알, 50ml에 1알, 100ml에 각각 1알 또는 2알, 및 250ml에 1알, 2알, 3알 또는 4알을 넣고 1시간 실온에서 반응시켰다.
⑥ 반응이 끝난 후 1ml을 취하여 일반세균수 측정용 건조필름(3M, USA)에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하여 균수를 측정하였다.
정수알약을 이용한 살균 효과 조사 결과, 균주를 배양한 후 미생물 수는 약 108 CFU/ml이었으며, 용량이 커질수록 미생물 수가 많기 때문에 미생물을 사멸시키는데 필요한 정수알약의 수가 늘어났다.
작업도구 분석에 필요한 10ml, 작업자 장갑 또는 손 분석에 필요한 50ml에는 정수알약 1알, 물을 분석에 필요한 100ml에는 정수알약 2알, 농산물을 분석하는데 필요한 250ml에는 정수알약을 4알을 넣었을 때, 대장균이 모두 사멸하는 것으로 나타났다.
정수알약 수에 따른 미생물 사멸 효과
Strains 10㎖ 50㎖ 100㎖ 250㎖
1알 1알 1알 2알 1알 2알 3알 4알
E. coli NCCP 13715 - - + - + + + -
E. coli NCCP 13718 - - + - + + + -
E. coli NCCP 13719 - - + - + + + -
E. coli NCCP 13721 - - + - + + + -
E. coli (무순 모니터링) - - + - + + + -
E. coli (무순 모니터링) - - + - + + + -
E. coli (무순 모니터링) - - + - + + + -
실험예 5: 발효기 온도 측정
발효기의 온도를 30℃에서 48℃까지 2℃ 간격으로 설정하고 온도계를 삽입한 후, 30분 간격으로 2시간 동안 측정하여 발효기의 설정값과 실제 온도값을 비교하였다.
또한 실험기간인 24시간 동안의 발효기 내의 온도 변화를 관찰하기 위하여 발효기 온도를 40℃ 및 46℃로 설정하고 로그가 부착된 온도계를 삽입하여, 24시간 동안 30분 간격으로 온도를 측정하였다. 하기 표 6 및 도 7에 발효기의 설정 온도와 실제 온도를 조사한 결과를 나타내었다.
설정온도 실제온도
30℃ 25.2℃
32℃ 26.6℃
34℃ 27.6℃
36℃ 30.7℃
38℃ 33.4℃
40℃ 36.0℃
42℃ 38.9℃
44℃ 40.8℃
46℃ 43.8℃
48℃ 47.5℃
실험예 6: 배양 온도에 따른 대장균 검출율
Colilert 18은 온도에 따라 특이성 및 민감성에 차이가 있으므로, 시료에 Colilert 18을 적용하였을 때, 배양온도가 대장균 검출에 영향을 미치는지 여부를 농업용수 및 농산물을 대상으로 조사하였다.
대상시료는 농업용수 10점, 어린잎 5점 및 무순 5점에 적용하였다. 농업용수는 강원도 평창 배추밭 인근의 지하수 2점 및 하천수 8점을 1L 멸균된 플라스틱 비커를 이용하여 채취한 후 2L 무균채수병에 담았다. 어린잎 및 무순은 전북 전주시에 위치한 마켓에서 구매하여 사용하였다.
농업용수에 대한 실험 방법은 하기 단계에 따라 수행하였다.
① 실험은 종래의 분석방법인 막 여과법을 대조군으로 사용하였다. 이를 위하여, 농업용수는 0.45 ㎛ 막(memberane) 필터를 이용하여 100ml을 여과한 후, 미생물이 포집된 막 필터는 100ml 멸균병에 담았다. 이후 EC broth 100ml을 가하고 37℃ 및 44℃에서 각각 18시간 배양하였다.
② 실험군으로는 농업용수 100ml을 멸균병에 담은 후 Colilert 18(2.7g)을 넣고 시약이 녹을 때까지 흔들어 준 후 37℃ 및 44℃에서 각각 18시간 배양하였다. 배양 후 색깔 및 UV 손전등을 이용하여 형광 여부를 체크하였다.
③ Colilert 18에서 양성반응을 보인 시료와 대조군에서 원인균을 분리하여 Colilert 18의 정확성을 평가하였다. 이를 위하여 EC, colilert 18에서 배양된 액 100㎕를 취하여 가스포집관이 든 10ml의 EC broth에 재접종하고 44℃에서 24~48시간 배양하였다.
④ 배양 후 10㎕ 루프(loop)를 이용하여 배양액을 취한 후, EMB배지에 도말하고 37℃에서 24시간 배양하였다.
⑤ EMB 배지에서 금속광택이 있는 집락을 취하여 NA에 계대하고 37℃에서 24시간 배양하고, VITEK 장비를 이용하여 최종 대장균임을 동정하였다.
어린잎채소 및 무순에 대한 실험 방법은 하기 단계에 따라 수행하였다.
① 어린잎채소 및 무순을 100g씩 취하여 각각 멸균백에 넣고 500ml의 멸균증류수를 가한 후 2분동안 손으로 흔들어 균질화시켰다.
② 멸균된 메스실린더를 이용하여 125m씩 멸균팩에 나누어 담았다.
③ 이후 대조군는 기존에 대장균 분석에 많이 이용되는 2×EC 배지를 125ml씩 첨가하였다.
④ 실험군에는 멸균증류수 125ml을 추가한 후, Colilert 18 배지(6.75g)를 넣고 시약이 잘 녹을 수 있도록 약 1분간 흔들어 주었다.
⑤ 대조군 및 실험군 모두 온도 37℃ 및 44℃에서 각각 18시간 배양하였으며, 이후의 과정은 상기 농업용수 분석에서와 같다.
온도에 따른 대장균 검출율을 조사한 결과, 종래의 검출법 및 본 발명의 검출법 모두 44℃보다 37℃에서 검출율이 높게 나타나, 37℃에서 배양하는 것이 바람직함을 확인하였다.
　시료 　온도 종래의 방법 본 발명의 방법　
증균 분리 동정 증균 분리 동정
EC EC→ EMB EC → EMB → VITEK colilert 18 colilert 18 → EMB colilert 18 → EMB → VITEK
물 37℃ -1)　 90%(9/10) 90%(9/10) 80%(8/10) 80%(8/10) 80%(8/10)
44℃ - 70%(7/10) 70%(7/10) 80%(8/10) 80%(8/10) 80%(8/10)
　농산물 어린잎
　		 37℃ - 100%(5/5) 100%(5/5) 100%(5/5) 100%(5/5) 100%(5/5)
44℃ - 80%(4/5) 80%(4/5) 100%(5/5) 100%(5/5) 100%(5/5)
무순
　		 37℃ - 80%(4/5) 80%(4/5) 80%(4/5) 80%(4/5) 80%(4/5)
44℃ - 60%(3/5) 60%(3/5) 60%(3/5) 60%(3/5) 60%(3/5)
합계 37℃ - 90%(18/20) 90%(18/20) 85%(17/20) 85%(17/20) 85%(17/20)
44℃ - 70%(14/20) 70%(14/20) 80%(16/20) 80%(16/20) 80%(16/20)
1): 양성 반응을 확인할 수 없음.
실험예 7: 검출 기기에 따른 대장균 검출율
현장에서 인큐베이터를 발효기로 대체하는 것이 가능한지를 조사하기 위하여, 작업도구, 작업자 손, 농업용수, 농산물 및 종자의 대장균 검출에 인큐베이터 및 발효기를 사용하고 그 결과를 비교하였다.
대상시료는 작업도구 18점(칼 9점 및 도마 9점), 작업자 장갑 10점, 농업용수 10점과 농산물 20점(어린잎채소 10점 및 무순 10점), 및 종자 10점(무순 5점 및 알팔파 5점)에 적용하였다. 작업도구는 무순 생산농가 3곳에서 생리식염수를 적신 멸균거즈를 이용하여 전표면을 문질러서 채취하였다. 또한, 작업자 장갑은 멸균백에 멸균증류수 50ml을 붓고 장갑을 낀 채로 손을 넣은 후 30초 동안 씻어서 채취하였다. 농업용수는 강원도 평창 배추밭 인근의 지하수 2점 및 하천수 8점을 1L멸균된 플라스틱 비커를 이용하여 채취한 후 2L 무균채수병에 담았다. 어린잎 및 무순은 전북 전주시에 위치한 마켓에서 구매하여 사용하였다. 무순 종자는 무순 생산 농가에서 사용중인 종자를 멸균 백에 1kg을 채취하였고, 알팔파는 시중에 판매중인 종자를 구매하여 사용하였다.
작업도구에 대한 실험 방법은 하기 단계에 따라 수행하였다.
① 채취된 시료에 증류수 30ml을 가하여 혼합한 후, 5ml씩 15ml 코니컬 투브에 담았다.
② 이후 대조군은 종래의 대장균 분석에 많이 이용되는 2×EC 배지를 5ml 첨가하였다.
③ 실험군에는 멸균증류수 5ml을 추가한 후, Colilert 18 배지(0.27g)를 넣고 시약이 잘 녹을 수 있도록 약 1분간 흔들어 주었다.
④ 대조군은 37℃ 인큐베이터에, 실험군은 37℃ 인큐베이터 또는 발효기에서 각각 18시간 배양하였으며, 이후의 과정은 상기 온도에 따른 대장균 검출률 실험과 같다.
작업자 장갑에 대한 실험 방법은 하기 단계에 따라 수행하였다.
① 채취된 시료 25ml씩 50ml 코니컬 투브에 담았다.
② 이후 대조군는 종래의 대장균 분석에 많이 이용되는 2×EC 배지를 25ml 첨가하였다.
③ 실험군에는 멸균증류수 25ml을 추가한 후, Colilert 18 배지(1.35g)를 넣고 시약이 잘 녹을 수 있도록 약 1분간 흔들어 주었다.
④ 대조군은 37℃ 인큐베이터에, 실험군은 37℃ 인큐베이터 또는 발효기에서 각각 18시간 배양하였으며, 이후의 과정은 상기 온도에 따른 대장균 검출률 실험과 같다.
농업용수에 대한 실험 방법은 하기 단계에 따라 수행하였다.
① 실험은 종래의 분석방법인 막여과법 대조군으로 사용하였다. 이를 위하여, 농업용수는 0.45㎛ 막 필터를 이용하여 100ml을 여과하였고, 이후 미생물이 포집된 막 필터는 100ml 멸균병에 담았다. 이후 EC broth 100ml을 가하고 37℃에서 18시간 배양하였다.
② 실험군으로는 농업용수 100ml을 멸균병에 담은 후 Colilert 18(2.7g)을 넣고 시약이 녹을 때까지 흔들어 준 후 인큐베이터와 배양기를 이용하여 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양 후 색깔 및 UV 손전등을 이용하여 형광 여부를 체크하였다.
③ 이후의 과정은 상기 온도에 따른 대장균 검출률 실험과 같다.
어린잎채소 및 무순에 대한 실험 방법은 하기 단계에 따라 수행하였다.
① 어린잎채소 및 무순을 100g씩 취하여 각각 멸균백에 넣고, 500ml의 멸균증류수를 가한 후 2분동안 손으로 흔들어 균질화시켰다.
② 멸균된 메스실린더를 이용하여 125m씩 멸균팩에 나누어 담았다.
③ 이후 대조군은 종래의 대장균 분석에 많이 이용되는 2×EC 배지를 125ml 첨가하였다.
④ 실험군에는 멸균증류수 125ml을 추가한 후, Colilert 18 배지(6.75g)를 넣고 시약이 잘 녹을 수 있도록 약 1분간 흔들어 주었다.
⑤ 대조군은 37℃로 인큐베이터에, 실험군은 37℃로 인큐베이터 또는 발효기에서 각각 18시간 배양하였으며, 이후의 과정은 상기 온도에 따른 대장균 검출률 실험과 같다.
검출 기기에 따른 대장균 검출율을 조사한 결과, 종래의 분석법으로 분석하였을 때는 44.1%의 시료에서 대장균이 검출되었으며, Colilert 18을 이용하여 인큐베이터 및 발효기에서 각각 배양한 후 대장균을 검출하였을 때는 각각 48.5% 및 47.1%의 시료에서 대장균이 검출되었다. 즉, 종래의 검출법보다 본 발명의 검출법에서 대장균 분리율이 현저하게 높은 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, Colilert 18을 이용한 본 발명의 식중독균 검출 방법은 사용법이 매우 간편하면서 정확성이 현저하게 높다. 또한, 본 발명의 검출 방법은 발효기를 식중독균 분석에 활용함으로써 저비용으로 신속 용이하게 검출이 가능하다.
시료 종래의 검출 방법
(인큐베이터)		 Colilert 사용
(인큐베이터)		 본 발명의 검출 방법
(발효기)
증균 분리 동정 증균 분리 동정 증균 분리 동정
EC EC→EMB EC→EMB→VITEK colilert 18 colilert→EMB colilert→EMB
→VITEK		 colilert18 colilert→EMB colilert→EMB→VITEK
작업도구 칼 - 11.1%
(1/9)		 11.1%
(1/9)		 11.1%
(1/9)		 11.1%
(1/9)		 11.1%
(1/9)		 11.1%
(1/9)		 11.1%
(1/9)		 11.1%
(1/9)
도마 - 0%
(0/9)		 0%
(0/9)		 11.1%
(1/9)		 11.1%
(1/9)		 11.1%
(1/9)		 11.1%
(1/9)		 11.1%
(1/9)		 11.1%
(1/9)
작업자 장갑 - 30%
(3/10)		 30%
(3/10)		 30%
(3/10)		 30%
(3/10)		 30%
(3/10)		 30%
(3/10)		 30%
(3/10)		 30%
(3/10)
물 - 90%
(9/10)		 90%
(9/10)		 80%
(8/10)		 80%
(8/10)		 80%
(8/10)		 80%
(8/10)		 80%
(8/10)		 80%
(8/10)
농산물 어린잎 - 100%
(10/10)		 100%
(10/10)		 100%
(10/10)		 100%
(10/10)		 100%
(10/10)		 100%
(10/10)		 100%
(10/10)		 100%
(10/10)
무순 - 70%
(7/10)		 70%
(7/10)		 90%
(9/10)		 90%
(9/10)		 90%
(9/10)		 80%
(8/10)		 80%
(8/10)		 80%
(8/10)
종자　 무 - 0%
(0/5)		 0%
(0/5)		 0%
(0/5)		 0%
(0/5)		 0%
(0/5)		 0%
(0/5)		 0%
(0/5)		 0%
(0/5)
알팔파 - 0%
(0/5)		 0%
(0/5)		 20%
(1/5)		 20%
(1/5)		 20%
(1/5)		 20%
(1/5)		 20%
(1/5)		 20%
(1/5)
총계 - 44.1%
(30/68)		 44.1%
(30/68)		 48.5%
(33/68)		 48.5%
(33/68)		 48.5%
(33/68)		 47.1%
(32/68)		 47.1%
(32/68)		 47.1%
(32/68)
1): 양성반응을 확인할 수 없음.

Claims (9)

  1. (s1) 시료를 채취하는 단계;
    (s2) 상기 시료에 효소 발색 기질인 Colilert 18®을 첨가하는 단계;
    (s3) 상기 (s2) 단계의 시료를 휴대용 발효기에 넣고 배양하는 단계;
    (s4) 배양 후 365nm 파장을 갖는 휴대용 UV 램프를 사용하여 발색 여부를 확인하는 단계; 및
    (s5) 검출 후 정수 알약을 첨가하여 식중독균을 살균시키는 단계
    를 포함하는 식중독균의 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소 발색 기질은 대장균 검출용 기질이며, 상기 식중독균은 대장균인 것을 특징으로 하는 식중독균의 검출 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (s3) 배양 단계는 33 내지 40℃에서 12 내지 24시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 식중독균의 검출 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 식중독균은 바실러스, 리스테리아, 살모넬라, 대장균, 황색포도상구균 및 캠필로박터를 포함하는 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 식중독균의 검출 방법.
  5. 삭제
  6. 배양기, 365 nm 파장을 갖는 UV 램프, 및 온도 조절부를 포함하며,
    상기 온도 조절부는 바실러스 또는 리스테리아 배양시 30℃; 살모넬라, 대장균 또는 포도상구균 배양시 37℃; 및 캠필로박터 배양시 42℃의 온도로 조절되며,
    효소 발색 기질인 Colilert 18®가 첨가된 시료의 발색 여부를 확인하는 휴대용 식중독균 검출 장치.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제6항의 식중독균 검출 장치를 사용하여, 효소발색법을 통해 식중독균을 검출하는 방법.
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