KR20220032945A

KR20220032945A - 카르복실화 산화철 나노입자로 표지된 나노자성 항체와 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20220032945A
Application number: KR1020200114915A
Authority: KR
Inventors: 성하수; 김소연; 최진일
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2020-09-08
Publication date: 2022-03-15
Also published as: KR102433429B1

Abstract

본 발명은 병원성 미생물의 신속 고감도 진단을 위한 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트, 상기 키트를 제조하는 방법 및 상기 키트를 이용한 병원성 미생물의 고감도 신속 진단법을 제공한다.

Description

카르복실화 산화철 나노입자로 표지된 나노자성 항체와 이의 제조 방법 {Nanomagnetic antibody labelled with carboxylated iron oxide nanoparticle and the preparation method thereof}

본 발명은 병원성 미생물의 신속 고감도 진단을 위한 측방유동면역진단 키트와 이를 이용한 병원성 미생물의 진단법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 병원성 미생물의 신속 고감도 진단을 위한 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트와 이를 이용한 병원성 미생물의 진단법에 관한 것이다.

기후변화 등으로 인해 감염 질환 환자의 발생이 지속적으로 증가하는 추세에 있다. 예를 들어, 대한민국의 경우 식품 매개 감염 질환은 노로바이러스, 장출혈성대장균, 장관독소대장균, 장병원성대장균, 살모넬라, 장염비브리오균, 황색포도상구균, 클로스트리디움퍼프린젠스, 캠필로박터제주니, 쿠도아 원충, 바실러스세레우스와 같은 원인 병원체의 순서대로 발병율이 높다. 또한, 미국에서 발생하는 식중독의 주요 원인 바이러스 및 세균은 노로바이러스, 살모넬라, 클로스트리움퍼프린젠스, 캠필로박터제주니, 황색포도상구균, 클로스트리움보툴리눔, 리스테리아, 시가독소생성대장균 O157, 비브리오 등으로 알려져 있다.

감염 질환에 대한 신속한 처방과 후속 조치를 위해서는 병원체에 대한 감염자, 감염 의심자 또는 병원체에 의한 오염이 의심되는 사물에 존재할 수 있는 병원체를 단시간에 고민감도로 진단하는 기술이 요구된다. 또한, 단시간에 고민감도 검사법을 이용하여 현장 진단을 통해 병원체 감염 양성 시료를 선별하는 것은 전체 시료를 대상으로 하는 진단검사에 소요되는 시간, 비용 및 노동력을 감소시킬 수 있다.

기존의 면역진단용 항체 키트는 수 시간 이상의 배양을 통해 일정 수 이상의 병원체가 확보되어야 검사가 가능하다. 따라서, 면역진단 항체 키트의 정확성과 편의성을 향상시키기 위해서는 병원체에 대한 민감도의 개선과 진단검사 과정의 단순화가 필요하다. 분석 대상 병원체들과 반응시약을 혼합하여 몇 분 동안 처리한 후, 상등액을 취하여 분석에 이용하는 방법은 면역진단검사의 과정을 단순화시킬 수 있다. 따라서, 면역진단검사의 민감도를 향상시키고 검사의 정확도를 높여 병원체를 검출하는 기술은 진단검사에 소요되는 다양한 재원의 감소시키는데 유리하다.

PCR 검사가 전문가용 기기, 바이오 안전시설을 갖춘 실험실 및 숙련된 전문가를 필요로 하는 것과는 대조적으로 면역진단 스트립은 그 구조가 비교적 간단하고, 대량 생산에 소요되는 비용이 적다. 측방유동면역분석법 (lateral flow immunoassay)에 많이 채택되는 교질 골드 스트립을 이용한 진단법은 RT-PCR을 이용한 진단법에 비해 민감도가 수백 내지 수천 배 정도 낮은 것으로 알려져 있다.

산화철 나노입자와 같은 자성 입자는 면역진단에서 일반적으로 사용되는 광학적인 표지자들에 비해 여러 가지 장점을 가진다. 자성 나노입자는 광 불투과성 매질에도 적용이 가능하다. 생체 시료는 기저 자성 신호가 없기 때문에 자성 나노입자로 표지된 생체 시료는 높은 신호 대 잡음 비를 나타낼 수 있고, 검사에 사용되는 시약의 화학반응이나 광표백 (photo-bleaching)에 의해 영향을 받지 않아 안정적인 신호를 제공한다. 외부 자기장을 이용하여 자성 표지된 시료의 조작이 가능하며, 자성을 이용한 혼합 (magnetic mixing)과 자성을 이용한 수세 및 분리 (magnetic washing and separation) 등을 통해 진단 효율을 향상시키고 검사 소요 시간을 단축시킬 수 있다.

일반적으로 산화철 나노입자는 열분해법, 전기화학법, 초음파합성법, 공침법 등의 방법을 통해 제조된다. 공침법은 다른 제조방법에 비해 낮은 제조 비용, 높은 수율 그리고 고위험 용매 또는 고온의 조건이 필요하지 않다는 장점을 가진다.

분석 대상 항원에 대한 나노자성항체의 민감도는 나노자성입자와 항체의 결합의 균일도에 크게 영향을 받는다. 나노자성항체의 과정에서 자성나노입자에 항체를 균일하게 결합시키려면 반응액에서 상자성 나노입자들이 소수성 인력에 의해 응집되려는 경향을 억제시켜야 한다. 일반적으로, 수용액 상에서 자성나노입자의 응집을 억제하기 위해서는 친수성 저분자 물질, 친수성 고분자 물질 및 양친매성 물질 등으로 자성나노입자의 표면을 코팅하는 것과 같은 방법들이 이용되고 있으며, 이 때 항체와의 결합을 위해 자성나노입자의 표면을 코팅하는데 이용되는 물질은 항체의 고유한 특성을 변화시키지 않으면서, 자성나노입자에 충분한 수분산성과 정전기적 반발력을 제공할 수 있어야 한다.

측방 유동 (lateral flow) 면역 진단 방법을 이용한 면역검사법은 항원과 항체의 반응 유무를 형광 검출 등을 이용하여 진단하는 방법으로서 효소면역분석법에 비해 그 절차가 간단하고, 신속하게 진단할 수 있어 다양한 분야에서 이를 활용한 진단 키트의 개발이 이루어지고 있다.

대한민국 특허공보 제10-1945846호 B1 (2019.01.30)

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 병원성 미생물을 고감도로 신속하게 검출할 수 있는 새로운 진단 키트 및 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 카르복실화 자성나노입자를 이용하여 병원체의 항체를 표지한 나노자성항체를 이용하여 나노자성항체-항원-포획 항체에서 나노자성입자에 의해 나노자성항체가 나타내는 색의 강도를 육안 관찰 등의 방법으로 판별하여 병원체의 항원을 정성분석하거나, 나노자성항체가 나타내는 자성의 강도를 측정하여 병원체의 항원을 정량분석하는 방법을 제공하고자 한다. 또한, 시료 전처리 방법의 단순성 및 병원체의 항원에 대한 나노자성항체의 민감성으로 인해 병원체를 고감도로 신속하게 진단하는 방법을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 병원성 미생물의 신속 고감도 진단을 위한 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트, 상기 키트를 제조하는 방법 및 상기 키트를 이용한 병원성 미생물의 고감도 신속 진단법을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 구현예는 다음을 포함하는 병원성 미생물 검출용 나노자성항체 기반 면역진단 키트 및 이의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예는 병원성 미생물의 신속 고감도 진단을 위한 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트의 제조방법으로서,

a) 카르복실화 자성 나노입자를 제공하는 단계;

b) 상기 카르복실화 자성 나노입자를 활성화시키는 단계;

c) 상기 활성화된 자성 나노입자를 병원성 미생물의 항체와 결합시켜 나노자성항체를 제조하는 단계; 및

d) 병원성 미생물 항원과 반응할 상기 나노자성항체를 컨쥬게이트 패드에 제공하는 단계를 포함하는, 병원성 미생물 검출용 나노자성항체 기반 면역진단 키트 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 병원성 미생물의 신속 고감도 진단은 자성 나노입자를 병원체의 항체와 결합시킨 나노자성항체를 통해 이루어지며, 나노자성항체의 제조를 위해서는 항체와 공유 결합이 가능한 관능기를 그 표면에 가지는 자성 나노입자가 필요하다. 상기 병원성 미생물은 특히 식중독 유발균일 수 있으며, 예를 들어, 장출혈성대장균, 살모넬라균 및 노로바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 a) 단계에서, 활성화 이전에 자성 나노입자를 세정하고 완전히 현탁시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 자성 나노입자는 단일 입자의 크기가 350 내지 400 nm의 크기를 갖는 초상자성 산화철 (Fe₃O₄) 나노입자일 수 있다. 항체의 표면에 존재하는 아민기와 반응하여 공유결합을 형성하기 위해 산화철 나노입자는 카르복실기, 이소시아네이트기, 아실아자이드기, 알데하이드기, 에폭사이드기 등의 관능기를 가질 수 있고, 바람직하게는 카르복실기, 이소시아네이트기, 가장 바람직하게는 카르복실기를 가질 수 있다. 표면이 카르복실화된 자성 나노입자의 크기는 350 내지 400 나노미터일 수 있다. 표면이 카르복실화된 자성 나노입자, 바람직하게 표면이 카르복실화된 산화철 나노입자는 항체와의 결합이 유리하고, 본 발명의 신속 고감도 진단을 위한 스트립에 적용 시 안정적인 반응이 가능하다.

상기 b) 단계는 카르복실화 자성 나노입자와 병원성 미생물의 항체 간의 결합력을 향상시키기 위한 단계이다. 상기 카르복실화 자성 나노입자는 본 발명의 목적 달성을 위해 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), 및 N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 및 N-hydroxysuccinimide (NHS)의 혼합물, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 및 N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS)의 혼합물, EDC 및 N-hydroxysuccinimide (NHS)의 혼합물, 및/또는 EDC 및 N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS)의 혼합물과 반응시켜 활성화시킬 수 있다. 상기 화합물로 활성화할 때 항체와의 반응성 향상이 우수하다. 상기 '활성화'를 통해 결합 대상인 항체와의 반응성을 향상시킬 수 있다.

상기 c) 단계는 활성화된 나노자성항체와 병원성 미생물의 항체를 커플링하는 단계를 포함한다. 상기 b) 단계에서 제조한 활성화된 자성나노입자를 검출대상인 병원성 미생물의 항체와 반응시켜 병원성 미생물의 항체와 결합시킬 수 있다. 바람직하게 상기 결합은 공유결합일 수 있으며, 커플링에 특별히 제한은 없지만 바람직하게 아미드 커플링을 포함한다. 본 발명에서 나노자성항체를 이용한 병원성 미생물 검출의 민감도는 나노자성항체에 대한 항원의 결합 형태에 좌우될 수 있다.

상기 c) 단계에서 자성 나노입자에 결합시키는 항체는 병원성 미생물의 항체로서 자성 나노입자와 결합이 가능한 다클론 항체 및/또는 단클론 항체일 수 있고 바람직하게는 단클론 항체일 수 있다. 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 나노자성항체에서 자성 나노입자에 병원성 미생물의 항체의 반응률은 81.0 내지 99.99%이고, 바람직하게는 92.0 내지 99.99%이고, 가장 바람직하게는 92.0 내지 99.99%이다. 나노자성항체에 결합된 병원체 항원의 검출을 위해 사용되는 포획 항체는 병원성 미생물의 항체로서 다클론 항체 및 단클론 항체이고, 바람직하게는 다클론 항체일 수 있다. 이를 통해 진단 감도를 향상시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예는 병원성 미생물의 검출을 위한 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트를 제공한다.

본 발명의 일 실시예는 병원성 미생물의 신속 고감도 진단을 위한 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트로서,

상기 키트는 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드 및 검출부를 포함하고,

상기 컨쥬게이트 패드는 병원성 미생물 항원이 나노자성항체와 반응하는 곳이며, 상기 나노자성항체는 자성 나노입자를 병원성 미생물의 항체와 결합시켜 형성되며,

상기 검출부는 병원성 미생물 항원과 결합된 나노자성항체를 포획 항체와 결합시켜 병원성 미생물 항원을 검출할 수 있다.

상기 검출부는 병원성 미생물 항원과 결합된 나노자성항체를 포획 항체와 결합시켜 병원성 미생물 항원을 검출하는 시험선과 병원성 미생물 항원과 결합되지 않은 나노자성항체를 항IgG항체와 결합시켜 검출하는 대조선을 포함하고, 이러한 검출부를 이용하여 병원성 미생물의 신속 고감도 진단하는 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트를 제공한다.

상기 키트는 샘플패드, 상기 샘플패드의 일단부와 접촉하는 컨쥬게이트 패드, 상기 컨쥬게이트 패드의 일단부와 접촉하는 NC 멤브레인, 상기 NC 멤브레인과 접촉하는 흡수패드가 순차 연결된 구조를 포함할 수 있다. 상기 자성 나노입자는 단일 입자가 350 내지 400 nm의 크기를 갖는 초상자성 산화철 (Fe₃O₄) 상자성 나노입자일 수 있다.

상기 병원성 미생물 항원은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게 장출혈성대장균, 살모넬라균 및 노로바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 키트는 형태가 특별히 제한되지 않으며, 업계에서 흔히 사용되는 진단 스트립 및 진단 패드 등의 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트는 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 검출부를 포함한 NC 멤브레인 및 흡수 패드를 중첩되게 하여 검사하고자하는 시료가 포함된 샘플 용액이 샘플 패드로부터 순차적으로 일정한 방향으로 흘러가면서 반응할 수 있도록 제공될 수 있다.

상기 측방유동면역진단 키트를 구성하는 패드 및 멤브레인은 나일론, 폴리에스터, 셀룰로오스, 폴리설폰, 폴리비닐리덴디플루오라이드, 셀룰로오스 아세테이트, 유리섬유, 니트로셀룰로오스로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예는 다음과 같은 단계를 포함하는 병원성 미생물, 바람직하게 식중독 유발 미생물의 고감도 신속 진단법을 제공한다.

S1) 병원성 미생물을 전처리하여 시료를 제공하는 단계;

S2) 상기 방법으로 제작된 측방유동면역진단 키트를 제공하는 단계,

S3) 상기 샘플을 상기 측방유동면역진단 키트의 샘플 패드에 로딩시키는 단계; 및

S4) 상기 키트의 검출부의 시험선에서 병원성 미생물의 항원이 결합된 나노자성항체가 포획 항체에 결합되어 생성된 자성 신호를 측정하거나, 나노자성항체가 나타내는 색의 강도를 육안 또는 색차계로 판별하여 상기 검체 내 병원성 미생물 항원을 정량, 정성 또는 정량 및 정성 분석하는 단계

상기 S1) 단계는 샘플 준비 단계로, 병원성 미생물 세포의 용해 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예는 세포 가열(heating)을 통해 병원성 미생물을 처리하는 것과 같은 시료 전처리 단계를 포함할 수 있다. 또한 세포 현탁액을 고온에서 일정 시간 동안 처리한 후, 원심 분리하고 상등액을 취하여 준비하는 방법을 이용할 수 있다. 세포 heating법 이외에도 세포 용해 (cell lysis)를 통해 병원성 미생물을 용해시킬 수 있으며, 업계에서 일반적으로 사용되는 광학적(optical), 기계적(mechanical), 음향학적(acoustic), 전기적(electrical) 및/또는 화학적(chemical) 방식 등이 모두 사용될 수 있다. 상기 세포 전처리 방법은 분석 대상인 미생물의 종류에 따라 업계에서 사용되는 일반적인 방법을 선택적으로 이용할 수 있다.

상기 분석법으로 병원성 미생물을 진단하는데 소요되는 시간은 3 내지 20분, 바람직하게는 5 내지 15분, 가장 바람직하게는 10분이다. 상기 진단검사에서 병원체 시료의 전처리에 소요되는 시간은 20 내지 60분, 바람직하게는 30 내지 50분, 더 바람직하게는 40분일 수 있다.

상기 진단법을 이용하는 경우 병원성 미생물이 결합 또는 미결합된 나노자성항체의 자성나노입자가 나타내는 색상의 강도는 육안 또는 색차계 (colorimeter)를 이용하여 판별할 수 있고, 편의성 측면에서는 육안 판별이 바람직하다. 상기 진단검사에서 병원성 미생물과 결합된 나노자성항체를 자성 검출기를 이용하여 검출하는데 소요되는 시간은 1분 이하, 바람직하게는 30초 이하, 가장 바람직하게는 20초 이하이다.

따라서, 본 발명의 진단법을 이용할 경우 1시간 이내에 병원성 미생물의 신속한 진단이 가능할 수 있다.

본 발명의 나노자성항체는 분석 대상 항원의 검출 민감도를 증진시킨다. 나노자성항체를 이용한 진단은 적은 수의 병원체로 항원의 검출이 가능하여 병원체의 장시간 배양이 요구되지 않는다. 또한, 병원체 시료의 단순한 전처리 과정을 통해 신속한 분석이 가능하다.

본 발명은 병원체의 항원이 결합된 나노자성항체에 결합된 병원체의 항원의 양을 나노자성검출기로 정량 분석하거나 나노자성항체의 자성나노입자가 나타내는 고유한 색상의 강도를 육안 관찰 등을 통해 분석하여 항원이 결합된 나노자성항체의 양을 정성적으로 판별하는 것이 가능하여 다양한 병원체의 정량 분석 및 정석 분석에 활용이 가능하다.

본 발명의 진단 방법은 별도의 발색 기질을 필요로 하지 않고, 산화철 나노입자의 인공 효소 작용이 필요하지 않으며, 발색시킨 기질의 변색 가능성이 없으므로, 기존 진단 방법에 비해 편리하게 사용할 수 있다는 장점이 있다.

본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 자성 검출기에 의해 검출된 카르복실화 초상자성나노입자 (C-SPIONP)의 질량에 따른 자성 신호의 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 C-SPIONP, EHEC의 나노자성항체 (EHEC Ab-SPIONP), Salmonella의 나노자성항체 (Salmonella Ab-SPIONP) 및 Norovirus G1의 나노자성항체 (Norovirus G1-SPIONP)의 제타 전위 값을 나타낸 것이다.
도 3a는 EHEC의 나노자성항체의 젤 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 Salmonella의 나노자성항체의 젤 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 Norovirus G1의 나노자성항체의 젤 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 스트립의 구조를 나타낸 것이다.
도 5a는 EHEC의 vt1 및 vt2 유전자에 대한 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 Salomonella의 sdf-1, invA 및 prt 유전자에 대한 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 EHEC와 Salmonella를 세포 heating법으로 처리한 후 나노자성항체 기반 면역진단스트립을 이용하여 정성 및 정량 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 장출혈성대장균 (EHEC, Enterohemorrhagic Escherichia coli)의 나노자성항체 제조

EHEC에 대한 나노자성항체는 350 ~ 400 nm의 직경을 갖는 카르복실화 초상자성 산화철 나노입자 (Carboxylated superparamagnetic iron oxide nanoparticle (C-SPIONP, MP350-CA-1, NANOCS, New York, NY, USA)를 정제하는 단계, C-SPIONP의 카르복실기를 활성화하는 단계 및 활성화된 SPIONP와 EHEC의 항체를 아미드 커플링을 통해 결합시키는 단계를 통해 제조되었다. EHEC의 항체와 C-SPIONP의 아미드 커플링을 위한 3단계의 과정은 다음과 같다.

제 1 단계: C-SPIONP 정제

1-1) 100 uL의 C-SPIONP를 EP (Eppendorf) 튜브에 가한다.

1-2) 과정 1-1)의 EP 튜브에 1 mL의 활성화/커플링 완충액 (50 mM MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, pH 6.0)을 가한다.

1-3) 1-2)의 과정을 마친 C-SPIONP 현탁액을 17,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한다.

1-4) 1-3)의 원심 분리를 마친 액으로부터 상등액을 버린다.

1-5) 1-2) ~ 1-4)의 과정을 2회 더 수행한 후, 1 mL의 활성화/커플링 완충액을 가한다.

제 2 단계: C-SPIONP의 활성화

2-1) EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) 용액 제조

2-1-1) 192 mg의 EDC에 1.0 mL의 탈이온수를 가하여 1 M EDC 용액을 제조한다.

2-1-2) 2-1-1)의 과정에서 제조된 1 M EDC 용액을 탈이온수로 희석하여 200 mM EDC 용액을 제조한 후 섭씨 -20도에 보관한다.

2-2) Sulfo-NHS (N-Hydroxyssulfosuccinimide) 용액 제조

2-2-1) 43.4 mg의 Sulfo-NHS에 1.0 mL의 활성화/커플링 완충액을 가하여 200 mM Sulfo-NHS 용액을 제조한 후 분주하여 섭씨 -20도에 보관한다.

3) 제 1 단계에서 준비된 정제 C-SPIONP에 24 uL의 200 mM EDC 용액과 24 uL의 200 mM NHS 용액을 가한 후, 30분 동안 상온 진탕 배양한다.

4) 3)의 과정을 마친 반응 혼합물을 17,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거한다.

5) 4)의 과정을 마친 반응 혼합물에 1 mL의 활성화/커플링 완충액을 가하여 10분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거한다.

6) 5)의 과정을 2회 반복한다.

7) 6)의 과정을 마친 반응 혼합물에 700 uL의 활성화/커플링 완충액을 가한다.

제 3 단계 활성화 SPIONP와 EHEC 검출 항체의 커플링

8) 제 2단계 과정 (7)에서 준비한 활성화 C-SPIONP가 담긴 700 uL의 완충액에 300 uL의 2 mg/mL EHEC 검출 항체 (Anti-Shiga toxin II subunit B Antibody, Mouse Monoclonal Antibody, Cat. No. 40019-MM13, Sino Biological Inc., Wayne, PA, USA) 용액을 가한 후, 상온에서 2.5시간 동안 진탕 배양한다.

9) 8)의 과정을 마친 반응 혼합물에 30 uL의 에탄올아민을 첨가한 후, 30분 동안 상온 진탕 배양한다.

10) 9)의 과정을 마친 반응 혼합물을 17,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상등액을 취하여 미반응 항체의 양을 분석하여 활성화 SPIONP에 대한 항체의 반응률을 구한다.

11) 10)의 과정을 마친 반응 혼합물에 1 mL의 블록킹 완충액 (0.5% (w/v) casein을 함유한 50 mM Tris)을 가하여 상온에서 2시간 진탕 배양한다. Overnight 반응도 가능하다.

12) 11)의 과정을 마친 반응 생성물을 17,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상등액을 버린다.

13) 12)의 과정을 마친 반응 생성물에 1 mL의 블록킹 완충액을 가한 후 피펫팅하여 현탁시킨다.

14) 13)의 과정을 마친 반응 생성물을 17,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한다.

15) 13) ~ 14)의 과정을 반복한다.

16) 15)의 과정을 마친 반응 생성물로부터 상등액을 제거한 후, 1 mL의 블록킹 완충액을 가한다.

17) 16)의 과정을 통해 제조된 반응 생성물인 EHEC의 나노자성항체를 사용할 때까지 섭씨 4도에 보관한다.

<실시예 2> 살모넬라 (Salmonella)의 나노자성항체 제조

EHEC의 검출 항체 대신 Salmonella의 검출 항체 (Rabbit purified polyclonal antiboby, Ig fraction, Cat. No. J142, EastCoast Bio, North Berwick, ME, USA)를 사용하는 것을 제외하고 실시예 1에 제시한 방법과 동일한 방법을 사용하여 Salmonella의 나노자성항체를 제조했다.

<실시예 3> 노로바이러스 G1형 (Norovirus G1)의 나노자성항체 제조

EHEC의 검출 항체 대신 Norovirus G1의 검출 항체 (Mouse monoclonal antibody, Cat. No. HM022, EastCoast Bio, North Berwick, ME, USA)를 사용하는 것을 제외하고 실시예 1에 제시한 방법과 동일한 방법을 사용하여 Norovirus G1의 나노자성항체를 제조했다.

실험예 1) C-SPIONP의 자성 신호 측정

병원체 항원에 대한 나노자성항체의 제조에 사용된 C-SPIONP의 자성 신호를 자성 검출기 (NMP Bio Strip Analyzer, MagRay 3000B, Magsolution Inc., Daejeon, Republic of Korea)로 측정하였고, 도 1에 나타낸 바와 같이 2, 5, 10, 15 및 20 ug로 질량을 변화시킨 C-SPIONP에 대하여 자성 검출기에 의해 검출된 C-SPIONP의 자성 신호 값은 0.9913의 상관계수 (R²) 값을 가지면서 비례하였다.

실험예 2) C-SPIONP및 나노자성항체의 제타 전위 측정

C-SPIONP와 나노자성항체의 제타 전위는 각각의 입자를 인산완충용액 (pH 7.4)에 분산시킨 용액 1 mL을 취하여 제타 전위 측정 셀에 주입한 후, 제타 전위 측정 장비 (Zetasizer nano ZS, Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire, USA)를 이용하여 측정하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, C-SPIONP는 입자 표면의 카르복실기로 인해 -13.5±5.47 mV의 제타 전위를 나타낸 반면, 상기 실시예와 같이 EDC/NHS로 활성화된 C-SPIONP를 병원체의 항체와 결합시켜 제조한 EHEC의 나노자성항체, Salmonella의 나노자성항체 및 Norovirus GI의 나노자성항체는 각각 -5.44±4.37 mV, -5.57±6.31 mV 및 13.5±11.8 mV의 전위값을 나타냈다. 나노자성항체의 제타 전위가 C-SPIONP보다 상승한 것으로부터 C-SPIONP 표면의 활성화를 통해 카르복실기의 수가 감소하고, 활성화된 C-SPIONP가 병원체의 항체와 반응하였음을 간접적으로 확인할 수 있다.

실험예 3) 나노자성항체의 젤 전기영동 실험

SPIONP와 병원체의 항체의 커플링 반응을 통해 병원체에 대한 나노자성항체의 형성을 확인하기 위해 병원체의 항체와 나노자성항체에 대하여 각각 도데실 황산 나트륨 (sodium dodecylsulfate, SDS)-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (polyacrylamide gel electrophoresis) (SDS-PAGE)을 실시하였다. 전기영동 키트는 10% 아크릴아미드 키트 (Cat. No. 161-0183, TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 사용했다.

젤 제작 키트로부터 3 mL의 resolver A 용액, 3 mL의 resolver B 용액, 30 μL의 10% 과황산암모늄 (APS, Ammonium persulfate) 용액 및 3 μL의 테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED, Tetramethylethylenediamine)을 순서대로 가하고 혼합하여 resolve 젤 용액을 제조한 후, cast에 주입하였다. 젤 키트로부터 1 mL의 stacker A 용액, 1 mL의 stacker B 용액, 10 μL의 10% APS 및 2 μL의 TEMED를 순서대로 가하고 혼합하여 stacking 젤 용액을 제조한 후, resolve 젤 상부에 주입하였다. 젤에 comb을 삽입한 후 30분 동안 젤을 경화시켰다. 젤로부터 comb을 제거한 후 tris/glycine/SDS (T/G/SDS) 러닝 완충액으로 젤을 세정하였다. 전기영동장치 (BIO-RAD Mini-Protein® Tetra System, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)에 젤을 세팅하고 T/G/SDS 러닝 완충액을 채웠다. 시료 용액과 시료 완충액 (2X)을 2:1 (v/v)로 혼합하고 전자레인지를 이용하여 3분간 가열하였다. 젤 상단의 well에 시료를 로딩하고 20 mA/gel의 전류를 가하여 시료를 전기영동하였다. 브로모페놀 블루 (Bromophenol blue, BPB)가 젤의 하단까지 이동하면 장치에 공급되는 전류를 차단하고, 젤을 꺼내 멸균수로 세정하였다. 코마시 블루 (Coomassie blue) 염색 용액에 젤을 넣고 1시간 동안 진탕시킨 후, 멸균수로 30분간 세정하여 젤을 염색하였다. 그 결과를 도 3a 내지 도 3c에 나타내었다.

도 3a 내지 도 3c는 나노자성항체의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다. 도 3a 내지 도 3c에 나타낸 바와 같이 각 병원체의 항체는 젤 상에서 밴드가 관찰되는 반면, 항체가 결합된 SPIONP 즉, 나노자성항체는 1) 폴리아크릴아미드 젤의 기공보다 그 크기가 커서 젤의 기공을 통과하지 못하기 때문에 전기 영동에 의해 이동한 나노자성항체의 밴드가 젤 상에서 관찰되지 않았고, 2) SPIONP와 반응하지 않은 항체에 의한 밴드도 관찰되지 않았으며, 3) 나노자성항체를 전기영동한 lane의 상단, 중앙 및 하단 부위의 자성의 세기를 자성검출기를 이용하여 측정하였을 때, lane의 상단부에서만 자성이 검출되는 등의 결과로부터 병원체의 항체와 SPIONP의 커플링을 확인하였다.

실험예 4) SPIONP 에 항체의 반응률과 항체고정화도 분석

SPIONP에 결합된 항체의 양은 Pierce?? Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit (Cat#: 23236 ThermoScientific, Rockford, IL, USA)를 이용한 단백질 정량법으로 분석하였다. 활성화 C-SPIONP와 커플링 반응 전 항체의 양은 높은 working range (100-1500μg/mL)의 표준 프로토콜을, 그리고 반응 후 미반응 항체의 양은 낮은 working range (1-25μg/mL)의 마이크로 프로토콜을 이용하여 분석하였다.

SPIONP와 항체의 커플링 반응 전 반응액 내의 항체와 커플링 반응 후 상등액의 미반응 항체를 상기 기술한 키트에 제공된 테스트 프로토콜에 따라 발색 반응시킨 후, 흡광도를 595 nm에서 microplate plate reader (Hidex sense 425-301, Hidex Oy. Turku, Finland)로 측정하였다. 우혈청 알부민 (BSA, Bovine serum albumin) 표준 용액을 이용하여 작성한 검량선을 이용하여 항체의 농도를 구하였고, 다음의 식을 이용하여 항체의 반응률과 항체 고정화도를 산출하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

항체 반응률 (%) = [(반응 전 반응액의 항체량 (μg/mL) - 반응 후 상등액의 항체량 (μg/mL))]/반응 전 반응액의 항체량 (μg/mL) X 100

항체 고정화도 (μg/g) = 커플링 반응된 항체 중량 (μg/mL)/C-SPIONP 중량 (g/mL)

SPIONP에 결합된 항체의 반응률 및 고정화도는 하기 표 1에 나타냈다.

병원성 미생물	반응 전 반응액의 항체량 (μg/mL)	반응 후 상등액의 항체량 (μg/mL)	반응률 (%)	항체 고정화도 (μg/g C-SPIONP)
EHEC	74.3±23.5	0.014±0.007	99.98	185.22
Salmonella	201.2±23.6	15.52±0.91	92.29	464.20
Norovirus G1	234.2±43.1	0.006±0.005	99.99	585.49

표 1에 나타낸 바와 같이 활성화 SPIONP에 대한 병원체 항원의 항체의 반응률은 92.29 ~ 99.99%이고, 고정화도는 185.22 ~ 585.49 ug/g의 값을 나타내었다.

<실시예 4> EHEC 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 스트립의 제조

EHEC 나노자성항체을 적용한 면역진단 스트립은 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 흡습 패드 및 지지 카드로 구성되었다. 모든 재료는 두께가 4 mm가 되도록 하였고, 지지 카드의 길이는 70 mm가 되도록 했다. 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드, 나이트로셀룰로오스 (NC) 멤브레인 및 흡습 패드의 길이는 각각 21 mm, 9 mm, 25 mm및 21 mm가 되도록 했다. 샘플 패드와 컨쥬게이트 패드를 1% BSA 0.5% NaCl 및 1% Tween 20을 함유한 0.01 M phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 습윤시키고 37 °C에서 1시간 이상 건조한 후 상온에서 건조하였다. 탈이온수로 100배 희석하여 최종 농도가 20 μg/mL이 되도록 준비한 포획 항체 (Anti-Shiga toxin II subunit B Antibody, Mouse Monoclonal Antibody, Cat. No. 40019-MM08, Sino Biological, Inc., Wayne, PA, USA)는 0.1 μL씩 NC 멤브레인의 시험선에 3 내지 4회 스팟팅하였다. 50 mM MES 완충액으로 50배 희석하여 최종 농도가 20 μg/mL이 되도록 한 goat anti-rabbit-IgG antibody는 NC 멤브레인의 대조선에 0.1 μL씩 3 내지 4회 스팟팅하였다. 시험선과 대조선에 항체가 스팟팅된 멤브레인을 37 °C에서 2시간 동안 건조했다. 실시예 1에서 제조한 EHEC의 나노자성항체 20 μL를 컨쥬게이트 패드에 스팟팅하고 37 °C에서 1시간 이상 건조했다. 샘플 패드와 컨쥬게이트 패드, 컨쥬게이트 패드와 NC 멤브레인 및 NC 멤브레인과 흡습 패드가 서로 2 mm 이상 겹치도록 면역진단 스트립을 제조하였다. 제조된 나노자성항체 스트립을 도 4에 나타내었다.

<실시예 5> Salmonella의 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 스트립의 제조

EHEC의 항체가 커플링된 나노자성항체 대신 Salmonella의 나노자성항체를 사용하는 것을 제외하고 실시예 4에 제시된 것과 동일한 방법을 통해 Salmonella의 나노자성항체에 기반한 측방유동면역진단 스트립을 제조했다.

실험예 5) 병원체 미생물 확보, 배양 및 검증

질병관리본부 국가병원체자원은행 (NCCP, National Culture Center for Pathogens)으로부터 분양받은 병원체 미생물 표준 균주인 EHEC (NCCP No. 15955)와 Salmonella Typhimurium (NCCP No. 16207)을 tryptic soy broth (TSB) 배지에 접종 후 37 ^oC에서 4시간 동안 배양하였고, tryptic soy agar (TSA) 배지에 도말한 후 37 ^oC에서 12시간 이상 배양하여 colony 선별을 진행했다.

각 세균의 선별된 colony 가운데 일부를 TSB 배지를 사용하여 37 ^oC에서 4시간 동안 배양하여 증균시킨 세균이 병원체의 검증에 사용되었다. 증식된 세균을 포함하는 증균액 1.0 mL를 미량원심관에 옮긴 후, 14,000 rpm에서 3분간 원심 분리하였다. 원심분리를 마친 후 미량원심관으로부터 상층액을 버리고 균체를 0.5 mL의 2차 증류수로 현탁시켰다. 그 현탁액을 15 분간 끓는 물로 중탕하여 세포를 파쇄한 후 14,000 rpm 에서 2분간 원심분리하였다. 원심분리를 마친 세포파쇄액으로부터 상층액 5 ㎕를 취하여 중합효소연쇄반응 (PCR, Polymerase Chain Reaction)의 DNA 주형으로 이용하였다. 표 2에 제시한 염기서열을 갖는 DNA 프라이머 세트 (QuantiNova, Qiagen, Venlo, The Netherland)를 10 pmol 첨가하여 95 ^oC (2 min) → 50 cycle (95 ^oC (5 sec) → 60 ^oC (10 sec)) → melting curve analysis (70 ~ 95 ^oC)와 같은 프로토콜에 따라 실시간 PCR을 수행하였다.

국가병원체자원은행 (NCPP) 분양 EHEC와 Salmonella의 검증에 사용한 RT-PCR 프라이머 세트는 하기 표 2와 같다.

병원체 미생물	프라이머	염기서열	산물크기 (bp)
EHEC	vt1_f	CGTACGGGGATGCAGATAAATCGC	210
	vt1_r	CAGTCATTACATAAGAACGCCCAC
	vt2_f	GTTCTGCGTTTTGTCACTGTCAC	326
	vt2_r	GTCGCCAGTTATCTGACATTCTGG
Salmonella	sdf-1_f	CTTTCTCAGATTCAGGGAGTATATCA	123
	sdf-1_r	TGAACTACGTTCGTTCTTCTGGT
	invA_f	AGCGTACTGGAAAGGGAAAG	115
	invA_r	ATACCGCCAATAAAGTTCACAAAG
	prt_f	AGCTCCATAGAAATGCTCCAAT	130
	prt_r	GAACATCACTGCCACCAAATAC

도 5a에 나타낸 바와 같이 EHEC는 독소유전자인 vt1과 vt2에 대한 RT-PCR 분석을 통하여 amplification curve와 melting peak을 확인하였다. 두 가지 독소유전자의 Cq 값은 모두 15 내지 20의 범위에서 관찰되었고, 증폭 시킨 vt1과 vt2의 melting peak은 각각 80.5 와 82.5 ^oC에서 관찰되었다. 도 5b에 나타낸 바와 같이 Salmonella는 독소유전자인 sdf-1, invA 및 prt에 대한 RT-PCR 분석을 통하여 amplification curve와 melting peak을 확인하였다. sdf-1, invA 및 prt 독소유전자들의 Cq 값은 모두 20 내지 22의 범위에서 관찰되었고, 증폭시킨 sdf-1, invA 및 prt의 melting peak은 각각 78.5, 79.0 및 76.0 ^oC에서 관찰되었다.

실험예 6) 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 스트립을 이용한 병원성 미생물 검출

EHEC 또는 Salmonella의 검출은 실시예 4 및 실시예 5에서 제조된 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 스트립을 사용하여 실시하였다. EHEC 또는 Salmonella의 전처리 방법으로 heating법을 사용했다. 50 μL의 세균 배양액을 100 μL의 이차증류수로 현탁시켰다. 세포 현탁액을 100 ^oC에서 3분 30초 동안 heating한 후, 얼음에 1분 동안 방치하였다. 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 다른 튜브로 옮기고 150 μL의 이차증류수를 첨가한 후 스트립 반응을 진행하였다. 세포 heating법으로 처리한 세균의 나노자성항체 기반 면역스트립 분석 결과를 도 6에 나타내었고, 시험을 마친 면역스트립의 컨쥬게이트 패드, 시험선 및 대조선이 나타내는 색상의 강도와 자성 신호의 비율을 하기 표 3에 나타내었다.

표 3은 EHEC와 Salmonella로 처리된 나노자성항체 기반 면역진단 스트립의 컨쥬게이트 패드, 시험선 및 대조선의 색 강도와 자성 신호 비율을 보여준다.

	색 강도		⁴⁾자성 신호 비율 (%)
	EHEC	Salmonella	EHEC	Salmonella
¹⁾CP	+++++	++++	60	40
²⁾TL	++	++	20	30
³⁾CL	++	+++	20	30

¹⁾ CP = 컨쥬게이트 패드, ²⁾ TL = 시험선, ³⁾ CL = 대조선

⁴⁾ 자성 신호 비율:

CP 자성 신호 비율 = [CP 진폭 값 / (CP 진폭 값 + TL 진폭 값 + CL 진폭 값)] x 100,

TL 자성 신호 비율 = [TL 진폭 값 / (CP 진폭 값 + TL 진폭 값 + CL 진폭 값)] x 100,

CL 자성 신호 비율 = [CL 진폭 값 / (CP 진폭 값 + TL 진폭 값 + CL 진폭 값)] x 100

도 6에서 병원체의 항원과 결합된 나노자성입자가 면역진단스트립의 시험선과 대조선에 존재하는 항체와 결합하면서 나타내는 색상의 강도는 검출 시험 시작 후 10분 이내에 육안으로 확인이 가능하였고, 면역진단스트립의 컨쥬게이트 패드, 시험선 및 대조선에 각각 존재하는 나노자성항체가 나타내는 자성 신호를 주파수혼합방식의 자성검출기로 측정하여 병원성 미생물의 항원을 검출하였다.

Claims

병원성 미생물의 검출을 위한 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트로서,
상기 키트는 샘플 패드, 컨쥬게이트 패드 및 검출부를 포함하고,
상기 컨쥬게이트 패드는 병원성 미생물 항원이 나노자성항체와 반응하는 곳이며, 상기 나노자성항체는 자성 나노입자를 병원성 미생물의 항체와 결합시켜 형성되며,
상기 검출부는 병원성 미생물 항원과 결합된 나노자성항체를 포획 항체와 결합시켜 병원성 미생물 항원을 검출하는, 병원성 미생물의 검출을 위한 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트.
제1항에 있어서, 상기 자성 나노입자는 단일 입자가 350 내지 400 nm의 크기를 갖는 초상자성 산화철 (Fe₃O₄) 나노입자인 것을 특징으로 하는 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트.
제1항에 있어서, 상기 병원성 미생물 항원은 장출혈성대장균, 살모넬라균 및 노로바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트.
병원성 미생물의 검출을 위한 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트 제조방법으로,
a) 카르복실화 자성 나노입자를 제공하는 단계;
b) 상기 카르복실화 자성 나노입자를 활성화시키는 단계;
c) 상기 활성화된 자성 나노입자를 병원성 미생물의 항체와 결합시켜 나노자성항체를 제조하는 단계; 및
d) 병원성 미생물 항원과 반응할 상기 나노자성항체를 컨쥬게이트 패드에 제공하는 단계를 포함하는,
병원성 미생물의 검출을 위한 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 b) 단계는
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), 및 N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 사용하여 상기 카르복실화 자성 나노입자를 활성화하는 것을 특징으로 하는 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트 제조방법.
제4항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 제조방법으로 제조된,
장출혈성대장균, 살모넬라균 및 노로바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 병원성 미생물 신속 진단을 위한 나노자성항체 기반 측방유동면역진단 키트.
S1) 병원성 미생물을 전처리하여 시료를 제공하는 단계;
S2) 제4항 또는 제5항의 방법에 따라 제작된 측방유동면역진단 키트를 제공하는 단계;
S3) 상기 S1) 단계의 시료를 상기 측방유동면역진단 키트의 샘플 패드에 로딩시키는 단계; 및
S4) 상기 키트의 검출부의 시험선에서 병원성 미생물의 항원이 결합된 나노자성항체가 포획 항체에 결합되어 생성된 자성 신호를 측정하거나, 나노자성항체의 색의 강도를 육안으로 판별하여 상기 시료 내 병원성 미생물 항원을 정량, 정성 또는 정량 및 정성 분석하는 단계를 포함하는, 병원성 미생물의 진단법.
제7항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 장출혈성대장균, 살모넬라균 및 노로바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 진단법.
제7항에 있어서, S1)단계에 소요되는 시간을 포함해 병원성 미생물의 진단에 소요되는 시간이 1시간 이내인 진단법.