KR101064134B1 - 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법, 이를 위한 액체배지 및 정량분석키트 - Google Patents

엔테로박터 사카자키의 정량분석방법, 이를 위한 액체배지 및 정량분석키트 Download PDF

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Abstract

엔테로박터 사카자키의 정량분석방법, 이를 위한 액체배지 및 정량분석키트가 제공된다.
이를 통해 엔테로박터 사카자키의 단순한 존부파악이 아닌 실제 단위부피당 엔테로박터 사카자키의 균수를 매우 쉽고 빠르게 계산할 수 있어 현장에서 적용이 용이하다. 나아가, 본 발명에 의한 엔테로박터 사카자키의 검출방법을 영유아 식품의 안전성을 확보하는 연구의 근간으로 사용함으로써 국내 분유 및 이유식 등 영유아 식품 관련 산업을 보호하고 국제적으로 국내의 식품 위생 및 안전성 분야에 지위향상을 도모할 수 있다.
엔테로박터 사카자키, 정량분석

Description

엔테로박터 사카자키의 정량분석방법, 이를 위한 액체배지 및 정량분석키트{Method for quantitative detection of Enterobacter sakazakii, liquid culture medium and quantitative detection kit therefor}
본 발명은 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법, 이를 위한 액체배지 및 정량분석키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 시료 내에 엔테로박터 사카자키의 존부만을 파악하는 것이 아니라 이를 단시간 내에 정량적으로 분석할 수 있는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법 및 이를 위한 정량분석키트를 제공하는 것이다.
엔테로박터 사카자키는 대장균군에 속하는 그람 음성 간균으로 주요 매개체로서 건조 조제분유가 보고되며 장염을 일으키기도 하고 피로 들어가면 패혈증, 뇌로 침입하면 뇌수막염을 일으킬 수 있으며 한 살 미만인 아기가 패혈증에 걸릴 경우 10 내지 20%의 사망률을, 뇌수막염일 경우 20 내지 30%의 사망률을 나타낸다. 이는 정상적인 면역력을 가진 사람에게는 크게 문제가 되지 않으나 신생아, 특히 면역력이 약한 신생아에게 치명적인 위험을 줄 수 있다.
또한, 선진국의 식중독 관련 통계자료를 살펴보면 전체 식중독 사고의 10% 미만만이 보고되고 나머지 90%는 정확히 집계되지 못하고 있는 실정이며 이러한 식 중독 사고의 미흡한 보고는 일반 병원이나 실험실에서 기술 설비가 부족하여 원인 식중독세균을 규명하지 못하는 것이 주요 원인으로 작용한다. 따라서 엔테로박터 사카자키에 의한 식중독의 예방, 식중독의 원인 파악 및 식품이나 식자재의 오염 현황 파악 등을 위하여 식품에서 엔테로박터 사카자키를 효율적으로 검출할 수 있는 기술 개발 및 정립은 매우 중요하다.
한편, 선택배지는 특정미생물의 생화학적 특성을 이용하여 대상으로 하는 미생물을 다른 미생물과 구별을 두면서 선택적으로 검출하고자 할 때 사용된다. 선택배지는 1). 검출대상으로 하는 균의 선택적 증균 2). 검출대상으로 하지 않는 균들의 성장 억제 3) 검출대상으로 하는 균을 그 이외의 균과 구별할 수 있는 선택성 부여를 목적으로 하므로 위의 세 가지 기능을 할 수 있는 성분을 포함하고 있어야 한다. 선택배지는 특정 미생물의 검출에서 가장 기본적으로 요구되는 도구이기 때문에 효과적인 선택배지를 개발하고, 배지의 효율을 증진시키고자 하는 노력은 계속되어왔다.
현재 엔테로박터 사카자키 검출을 위하여 사용되고 있는 선택배지는 선별력이 낮거나, 선별력은 높지만 구성물질의 희소성으로 인하여 경제성이 떨어지므로 경제적이면서도 효율성이 높은 엔테로박터 사카자키의 선택배지 개발이 요구되고 있다.
종전에 사용되어 왔던 엔테로박터 사카자키의 선택배지는 DFI 배지(Oxoid사에서 Chromogenic Enterobacter sakazakii agar라는 상용명으로 판매), ESPM(R&F products에서 Enterobacter sakazakii Chromogenic Plating medium라는 상용명으로 판매), ESIA(AES Laboratories에서 Enterobacter sakazakii isolation agar라는 상용명 판매)과 fluorogenic medium(Acumedia사에서 E. sakazakii medium라는 상용명으로 판매) 등이 있다. 각각의 액체배지에서, DFI, ESIA는 선택물질로 XαGlc을 사용하고, ESPM은 XαGlc과 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-cellobiosideSigma (XβCel)을 사용하며 선택적 형광배지는 MUG를 사용한다. Sigma사의 가격을 기준으로, XαGlc은 5 mg에 71.9 달러, XβCel은 25 mg에 450 달러, MUG의 가격은 10 mg에 28.8 달러이다. 각각의 배지를 1 L 제조하는데 사용되는 선택물질의 비용은 DFI medium 은 1438 달러, ESPM의 경우 2700달러, 선택적 형광배지는 144 달러가 소요되며, ESIA의 경우 무려 2157 달러가 소요된다. 이처럼 액체배지 제조에 많은 비용이 소요되어 공공기관이나 산업체 연구소 등에서 엔테로박터 사카자키와 관련된 연구에 있어서 경제적인 부담을 갖고있는 실정이다. 따라서 검출력이 높으면서 저렴한 엔테로박터 사카자키의 검출방법의 개발에 대한 필요성이 더욱 증대되고 있다.
이에, 본 발명자들은 대한민국특허출원 제2008-32370호에서는 살리신을 포함하는 엔테로박터 사카자키 검출용 선택배지를 개시하였다. 구체적으로 종래의 선택배지에 사용된 물질들과는 달리 살리신의 경우 비용이 저렴하면서도 민감성이 높아 현장에서 엔테로박터 사카자키를 검출하는데 대단히 뛰어나다.
그러나, 상기 선택배지에 살리신을 포함하는 것 만으로는 엔테로박터 사카자키의 존부를 파악하는 수준에 불과하므로 현장에서 이를 정량적으로 분석하기 어려운 문제가 있었다.
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 이진희석법을 이용하여 간편하고 저렴하면서도 현장에서 손쉽게 엔테로박터 사카자키를 정량적으로 분석할 수 있는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 두번째 과제는 상기 이진희석법을 용이하게 수행하기 위하여 엔테로박터 사카자키를 특이적으로 검출할 수 있는 엔테로박터 사카자키의 정량분석용 액체배지를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 세번째 과제는 현장에서 간단하게 엔테로박터 사카자키의 정량분석을 수행할 수 있도록 이진희석법을 실시할 수 있는 엔테로박터 사카자키의 정량분석키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 첫번째 과제를 달성하기 위해서,
이진희석법(two fold dilution)을 사용하여 엔테로박터 사카자키를 정량적으로 분석하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 이진희석법은 복수개의 웰 플레이트를 사용하며, 상기 복수개의 웰 플레이트는 엔테로박터 사카자키가 포함된 시료의 농도가 순차적으로 감소하도록 희석하여 배열될 수 있으며 이 경우 상기 복수개의 웰 플레이트의 수는 바람직하게는 2 ~ 40개일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 이진희석법은 하기 관계식 1을 만족할 수 있다.
[관계식 1]
D = 2n-1
상기 관계식 1에서 D는 희석배율, n은 배열된 웰 플레이트 중 해당 웰 플레이트의 순번
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 복수개로 배열된 웰플레이트 중 첫번째 웰 플레이트는 희석되지 않은 시료원액을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 엔테로박터 사카자키를 특이적으로 검출하기 위하여 상기 웰 플레이트는 살리신을 포함할 수 있으며, 이 경우 보다 바람직하게는 상기 엔테로박터 사카자키가 상기 살리신을 분해함으로써 발생하는 pH 변화를 검출하는 것을 통해 엔테로박터 사카자키를 특이적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 살리신은 이진희석이 완료된 후 상기 웰 플레이트에 첨가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 살리신이 첨가된 환경에서 검출대상 미생물을 30 내지 45℃의 온도에서 18시간 내지 24시간 동안 배양하여 배양 전과 후의 pH의 변화를 검출하는 것이 될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 pH 변화의 검출은 산 염 기 지시약을 이용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 산 염기 지시약은 뉴트랄 레드 또는 브로모크레졸 퍼플일 수 있으며, pH 미터기를 사용할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 pH의 변화는 pH 미터기를 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 살리신이 포함된 복수개의 웰 플레이트 중 엔테로박터 사카자키가 포함된 시료의 희석액과 반응하여 지시약의 색이 변화된 웰 플레이트를 계수할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 색이 변화된 웰 플레이트를 계수한 후, 회귀분석을 통해 회귀식을 산출하여 엔테로박터 사카자키를 정량분석할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 엔테로박터 사카자키를 포함하는 시료가 균액상태인 경우 상기 시료가 엔테로박터 사카자키만을 함유하면 하기 회귀식 1을 통해 농도를 산출하고, 다른 균주가 혼재되면 하기 회귀식 2를 통해 엔테로박터 사카자키의 농도를 산출할 수 있다.
[회귀식 1]
Y = aX + b
단, Y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, a는 0.68 ~ 0.88의 범위를 갖는 상수이며, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수가 n일때 log2n이고, b는 1.42 ~ 1.62의 범위를 갖는 상수이다.
[회귀식 2]
Y = cX + d
단, Y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, c는 0.61 ~ 0.81의 범위를 갖는 상수이며, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수가 n일때 log2n이고, d는 1.2 ~ 1.4의 범위를 갖는 상수이다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 엔테로박터 사카자키를 포함하는 시료가 수화분유 상태인 경우 상기 시료가 엔테로박터 사카자키만을 함유하면 하기 회귀식 3을 통해 농도를 산출하고, 다른 균주가 혼재되면 하기 회귀식 4를 통해 엔테로박터 사카자키의 농도를 산출할 수 있다.
[회귀식 3]
Y = eX + f
단, Y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, e는 0.75 ~ 0.85의 범위를 갖는 상수이며, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수가 n일때 log2n이고, f는 1.28 ~ 1.48의 범위를 갖는 상수이다.
[회귀식 4]
Y = gX + h
단, Y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, g는 0.86 ~ 1.06의 범위를 갖는 상수이며, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수가 n일때 log2n이고, h는 0.44 ~ 0.64의 범위를 갖는 상수이다.
또한 본 발명은 상기 두번째 과제를 달성하기 위해서,
엔테로박터 사카자키의 이진희석 후 첨가하는 액체배지에 있어서, 상기 액체배지는 엔테로박터 사카자키의 검출성분으로 살리신을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석용 액체배지를 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 액체배지는 산 염기 지시약을 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 액체배지는 엔테로박터 사카자키를 특이적으로 선별할 수 있는 제1성분, 엔테로박터 사카자키의 성장을 촉진하는 제2성분; 및 상기 엔테로박터 사카자키 이외의 다른 미생물의 성장을 억제하는 제3성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 액체배지는 용매 100중량부에 대하여 살리신 0.5 ~ 2 중량부, 상기 제1성분 0.0001 ~ 0.005 중량부, 상기 제2성분 0.1 ~ 0.3 중량부 및 상기 제3성분 0.1 ~ 0.5 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 용매는 물, 증류수를 사용할 수 있다.]
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제1성분은 산염기 지시약일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 산염기 지시약은 뉴트랄 레드 또는 브로모크레졸 퍼플일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면,상기 제2성분은 펩톤, 프로테오즈펩톤1, 프로테오즈펩톤3, 염화나트륨 및 트립톤으로 구성된 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제3성분은 담즙산, 크리스탈 바이올렛의 단독 또는 혼합일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 세번째 과제를 달성하기 위해서,
복수개의 웰플레이트가 상술한 본 발명의 액체배지를 고형화시켜 제조된 고형분을 포함하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 고형분은 상기 액체배지를 동결건조하여 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 복수개의 웰플레이트는 멀티 웰플레이트일 수 있다.
이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.
별도로 설명되어 있지 않다면, "수화분유"라 함은 통상의 영유아용 분유를 물에 녹인 상태를 의미한다.
"회귀분석(回歸分析, regression analysis)"이라 함은 통계학에서 관찰된 연속형 변수들에 대해 독립변수와 종속변수 사이의 인과관계에 따른 수학적 모델인 선형적 관계식을 구하여 어떤 독립변수가 주어졌을 때 이에 따른 종속변수를 예측하는 것으로서 이 수학적 모델이 얼마나 잘 설명하고 있는지를 판별하기 위한 적합도를 측정하는 분석 방법을 의미한다.
"회귀식"이라 함은 회귀분석을 통해 도출된 독립변수와 종속변수와의 관계를 나타내는 일반식을 의미한다.
"결정계수(R2)라 함은 회귀식(回歸式)의 적합도를 재는 척도이다. 회귀분석에서 종속변수 Y의 데이터 yi에 대하여, yi의 총변동합에 대한 변동합의 비율을 나타내는 것으로 그 값이 1에 가까울수록 회귀식의 적합도는 높아지는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 이진희석법(two fold dilution)을 사용하여 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법은 엔테로박터 사카자키의 단순한 존부파악이 아닌 실제 단위부피당 엔테로박터 사카자키의 개수를 매우 쉽고 빠르게 계산할 수 있어 현장에서 적용이 용이하다. 또한 기존의 평판 배지 방법보다 쉬워 전문가가 아닌 일반 사람도 수행 가능하며 노동력이 절감된다. 그리고 소량의 시료 및 시약을 사용하므로 경제적일 뿐 아니라 하나의 멀티 웰 플레이트를 이용할 수 있으므로 희석에 필요한 희석용기가 필요하지 않다. 나아가, 실험을 수행하고 저장하는데 필요한 공간이 적으며 평판배지를 사용할 때 일어날 수 있는 배지의 온도에 의한 미생물의 손상이 발생하지 않는다. 또한 실험 수행 후 폐기 및 멸균이 용이하며 실험 결과 판독이 쉽다. 그리고 기존의 방법에 비하여 민감도가 대단히 우수하므로 낮은 수준의 오염도 검출이 가능하다.
본 발명에 따른 살리신을 포함한 엔테로박터 사카자키의 액체배지는 검출대상으로 하는 미생물의 증식에 필요한 영양소를 제공함으로써 검출대상 미생물의 검출력이 높으며, 검출대상으로 하지 않는 미생물은 그 성장이 억제되거나 다른 성상 의 집락을 나타내어 선별력이 우수하다. 특히 지시약을 사용하여 pH의 변화를 측정할 경우, 엔테로박터 사카자키의 배양 후 후처리과정을 거치거나 별도의 기구를 사용하지 않고 육안으로 용이하게 식별 가능하다는 장점이 있다. 더욱이 본 발명의 액체배지에 의한 엔테로박터 사카자키의 군집은 지시약에 대한 단순한 색 변화를 넘어서 보락색 집락 주위로 투명한 보더가 생기므로 다른 미생물의 집락에 비교하여 선별력이 우수하다.
이에 더하여, 본 발명에 의한 엔테로박터 사카자키 액체배지는 종전에 사용되던 타 배지의 제조에 사용된 물질보다 가격이 저렴한 살리신을 사용하여 경제적 효율성이 높은 액체배지이다. 종래에 사용되던 배지와 달리 본 발명의 액체배지는 살리신(Sigma 판매)을 선택물질로 사용하는데, 살리신은 5 g에 26.3 달러로 실험의 결과 얻어진 최적의 양을 첨가하여 배지를 제조할 경우 배지 1 L 제조시 42 달러가 요구된다. 이는 종전의 배지에서 사용되는 선택물질보다 훨씬 저 비용으로, 엔테로박터 사카자키를 검출함에 그간 제기되어 왔던 경제적 문제점을 해소하는데 기여할 수 있다. 본 발명을 통해 여러 공공기관이나 산업체 연구소 등에서 종전의 액체배지가 가지고 있던 경제적 부담을 해소하면서 엔테로박터 사카자키 검출, 분리, 실험 등에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 살리신을 함유한 멀티 웰플레이트를 포함하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석 키트는 현장에서 손쉽게 이진희석법을 적용할 수 있을 뿐 아니라, 이진희석을 통해 종말점의 수만 파악해도 본 발명의 명세서에 기재된 회귀식 및 표 5를 통해 쉽고 빠르게 엔테로박터 사카자키의 농도를 추정할 수 있으므로 엔 테로박터 사카자키의 농도를 간단하면서도 정확하게 분석하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.
나아가, 본 발명에 의한 엔테로박터 사카자키의 검출방법을 영유아 식품의 안전성을 확보하는 연구의 근간으로 사용함으로써 국내 분유 및 이유식 등 영유아 식품 관련 산업을 보호하고 국제적으로 국내의 식품 위생 및 안전성 분야에 지위향상을 도모할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명은 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법, 이를 위한 액체배지 및 정량분석키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 엔테로박터 사카자키 검출방법에 있어서 이진희석법(two fold dilution)을 사용하여 엔테로박터 사카자키를 정량적으로 분석할 수 있는 것을 특징으로 한다.
상술한 바와 같이, 종래의 엔테로박터 사카자키의 검출방법은 거의 대부분 엔테로박터 사카자키의 존부파악에만 머물러 있을 뿐 아니라, 이에 대한 정량분석을 수행하기 위해서는 실험실에서 고도의 복잡한 실험을 거쳐야만 하는 불편함이 있었다. 또한 엔테로박터 사카자키를 검출하기 위한 검출배지 역시 그 비용이 매우 고가이므로 산업현장에서 활용되기 어려운 문제가 있었다.
이에 본 발명의 일실시예에 따른 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법은 이진희석법(two fold dilution)을 사용하여 엔테로박터 사카자키를 정량적으로 분석하여 상술한 문제점의 극복을 모색하였다.
구체적으로 본 발명에 적용되는 이진희석법을 상세히 설명하면, 복수개의 웰 플레이트를 사용하여 엔테로박터 사카자키를 정량적으로 분석하는 경우, 상기 복수개의 웰 플레이트는 엔테로박터 사카자키가 포함된 시료의 농도가 순차적으로 감소하도록 희석하여 배열하는 것이다. 다시 말해, 웰 플레이트의 개수가 5개인 경우 맨 처음 플레이트의 시료의 농도가 가장 높고 뒤로 갈수록 시료의 농도가 감소하도록 배열하게 된다. 이 경우 상기 복수개의 웰 플레이트의 수는 시료의 원액과 희석액이 각각 포함될 수 있는 최소한의 개수인 2개 이상이면 족하며, 바람직하게는 최대 증균농도가 109CFU/㎖인 점을 고려하여 2 ~ 40개일 수 있으며 환경 및 조건에 따라 웰 플레이트의 개수를 적절하게 달리하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 웰 플레이트가 복수개로 구비되어 하나의 세트를 형성하는 멀티 웰 플레이트를 사용할 수 있다.
상술한 이진희석법은 바람직하게는 배열된 웰플레이트 간에 시료의 농도가 순차적으로 2배씩 희석되도록 배열될 수 있다. 예를 들어 멸균 0.2% 펩톤수(희석액)를 첫 번째 웰을 제외한 나머지 웰에 100 ㎕씩 분주한다. 그 뒤 시료원액을 첫 번째 웰에 200 ㎕를 분주하고, 피펫으로 3, 4번 잘 섞어준 후 첫 번째 웰에서 100 ㎕를 취하여 두 번째 웰에 분주한다. 두 번째 웰에서 피펫으로 3, 4번 잘 섞어준 후 100 ㎕를 취하여 세 번째 웰에 분주한다. 위와 같은 과정을 마지막 웰까지 반복수행한다. 그 결과, 시료를 접종하기 전 100 ㎕의 희석액이 분주되어 있는 상태이므로 첫 번째 웰부터 마지막 웰까지 순차적으로 2배씩 희석되는 것이다.
상술한 내용을 일반화하면 하기 관계식 1로 표현할 수 있다.
[관계식 1]
D = 2n-1
상기 관계식 1에서 D는 희석배율, n은 배열된 웰 플레이트 중 해당 웰 플레이트의 순번
구체적으로, 상기 관계식 1은 복수개의 웰플레이트의 희석배율을 나타낸 것으로서, 예를 들어 5개의 웰플레이트가 존재하며 시료가 상기 웰플레이트에 순차적으로 이진희석된 경우 3번째 웰플레이트는 n=3이므로 이를 관계식 1에 대입하면 D=4가 되며 이는 첫번째 웰플레이트의 시료농도(시료원액)에 비하여 4배 희석된 것을 의미하는 것이다.
한편, 본 발명의 이진희석법은 통상의 정량분석을 위한 시료의 희석시 시료를 처음부터 2배 희석하여 웰플레이트에 분주하는 것과는 달리 첫번째 웰 플레이트는 희석되지 않은 시료원액을 사용할 수 있으므로 보다 정확한 정량분석 결과를 얻을 수 있다.
엔테로박터 사카자키가 포함된 시료에 대한 이진희석이 완료된 후, 엔테로박터 사카자키를 선택적으로 검출하기 위하여 상기 복수개의 웰플레이트에 액체배지를 첨가할 수 있으며, 바람직하게는 상기 액체배지는 비용이 저렴하면서도 엔테로박터 사카자키에 대하여 강한 선택성을 가지는 살리신이 포함된 액체배지를 첨가할 수 있다.
구체적으로, 살리신은 버드나무의 잎이나 껍질 속에 들어 있는 글리코시드이며 무색이나 흰색의 결정성 물질로 화학식은 다음과 같으며 도 1에 살리신의 3차원 구조식을 도시하였다.
Figure 112008086813176-pat00001
한편, 상기 엔테로박터 사카자키 검출방법은 상기 엔테로박터 사카자키가 상기 살리신을 분해함으로써 발생하는 pH 변화를 검출하는 것일 수 있다. 엔테로박터 사카자키는 살리신을 영양성분으로 사용하여 분해함으로써 대사작용에 의하여 pH가 낮은 산성물질을 생성한다. 따라서 엔테로박터 사카자키가 생육하는 환경에 살리신을 투여한 후 일정시간 배양하면 엔테로박터 사카자키가 합성한 물질에 의해 주변 pH가 낮아지는 것을 측정하는 것이 엔테로박터 사카자키를 검출하는 방법이 될 수 있다.
또한, 상기 살리신이 첨가된 환경에서 검출대상 미생물을 30 내지 45℃의 온도에서 18시간 내지 24시간 동안 배양하여 배양 전과 후의 pH의 변화를 검출하는 것이 될 수 있다. 미생물의 종류와 서식 환경에 따라 미생물 검출을 위한 적정온도와 배양시간은 상이하며, 미생물 검출의 효율을 높이고 특히 여러 종류의 미생물이 서식하는 시료에서 특정 미생물을 검출하는 경우 선별력과 검출력을 향상시키는데 있어 적정 배양온도 및 시간은 매우 중요한 요소가 된다. 이에 본 발명에서는 엔테로박터 사카자키의 검출을 위해 시료의 적정 배양시간 및 적정 배양온도를 제공한다. 구체적으로, 배양온도가 30℃ 미만일 경우 엔테로박터 사카자키 이외의 중온성 미생물이 성장하기에 좋은 조건이 되어 상기 미생물의 과다 증식으로 상대적으로 엔테로박터 사카자키의 성장이 저해되며, 43℃를 초과할 경우 엔테로박터 사카자키의 대사작용이 둔화 되고 미생물을 이루는 단백질의 변성이 초래되어 엔테로박터 사카자키의 생장이 저해되는 문제가 있다. 배양시간과 관련해서 18시간 미만 동안 배양할 경우 검출대상 미생물이 충분히 증균되지 않아 이들이 합성하는 산성물질이 pH 지시약이나 pH 미터기를 통해 측정되지 않거나 측정되더라도 그 결과가 정확하지 않을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면 특별히, 엔테로박터 사카자키만을 선택적으로 검출할 경우에는 상기 액체배지를 배양하는 단계는 42℃에서 18시간 동안 지속함이 바람직하고, 엔테로박터 사카자키만을 선택적으로 검출하는 것이 아닌 경우에는 상기 액체배지를 배양하는 단계는 37℃에서 24시간 동안 지속함이 바람직하다. 만일 42℃에서 배양할 경우 검출대상으로 하지 않는 균주의 성장이 억제되며 상대적으로 온도가 높아 엔테로박터 사카자키의 증식속도가 증가하므로 18시간동안 배양하는 것이 바람직하다. 다만, 엔테로박터 사카자키는 37℃에서 성장이 더 좋은 경향을 나타낸다. 이 경우 상대적으로 온도조건이 낮아 엔테로박터 사카자키의 증 식속도가 느려 상기의 경우보다 오랜시간 배양하는 것이 바람직하며 24시간이 적당하다. 따라서 다양한 미생물 가운데 엔테로박터 사카자키의 선택적 검출이 필요한 경우에는 42℃에서 18시간, 선택적 검출이 필요하지 않을 경우에는 37℃에서 24시간을 배양함이 바람직하다. 다만 이는 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명은 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 pH의 변화는 산 염기 지시약을 사용하여 측정하는 것으로 할 수 있다. 산 염기 지시약은 수소이온농도(pH)의 변화를 측정하는데 사용되는 지시약이다. 산 염기 지시약은 그 자체가 약한 산 또는 약한 염기이며, 이온이 되었을때의 색이 해리되지 않았을 때와 다르므로, 색이 용액 속에서 수소이온농도의 변화에 따라 변화한다. 지시약의 화학적 성질에 따라 산성지시약(페놀프탈레인·티몰블루 등)과 염기성지시약(메틸오렌지·메틸레드 등)으로 구분되며, 살리신으로부터 엔테로박터 사카자키가 산성물질을 생성함에 비추어 본 발명에서는 상기 지시약 중 산성용액에서 변색되는 염기성 지시약을 사용함이 바람직하다. 산 염기 지시약의 변색 범위 및 용액의 산도에 따른 색은 표 1에 도시한 바와 같다.
[표 1]
지시약 산성쪽 색 변색범위(pH) 염기성쪽 색
메틸 오렌지(Methyl Orange ) 적색 3.1～4.4 황색
메틸레드(Methyl Red) 적색 4.2～6.3 황색
페놀레드(Phenol Red) 황색 6.8～8.4 적색
브로모페놀 블루(Bromphenol Blue) 황색 3.0～4.6 청색
페놀프탈레인 (Phenolphthalein) 무색 8.3～10.0 적색
브롬타이몰 블루(Bromthymol Bule) 황색 6.2～7.6 청색
리트머스 용액 적색 6.0∼8.2 청색
티몰불루 용액 적색 1.2∼2.8 황색
티몰프탈레인 용액 무색 9.3∼10.5 청색
메틸엘로우(methyl yellow) 적색 2.9 ~ 4.1 황색
콩코레드(congo red) 청자색 3.0 ~ 5.2 적색
브롬크레졸그린(bromcresol green) 황색 3.8 ~ 5.4 청자색
브롬크레졸퍼플(bromcresol purple) 녹황색 5.2 ~ 6.8 청자색
뉴트랄레드(neutral red) 보라색 6.8 ~ 8.0 황색
구체적으로, 상기 산 염기 지시약은 뉴트랄 레드 또는 브로모크레졸 퍼플을 사용함이 바람직하다. 실험전 무균상태의 배지는 pH 6.8 내지 7 정도이며, 엔테로박터 사카자키가 배지내 존재시 살리신으로부터 산성물질을 합성하여 배지의 산도는 pH 5.4 내지 5.9가 된다. 따라서, 상술한 산성범위에서 지시약의 색변화를 육안으로 손쉽게 관찰할 수 있는 뉴트랄 레드 또는 브로모크레졸 퍼플을 지시약으로 사용하는 것이 유리하다.
또한 상기 pH의 변화는 pH 미터기를 이용하여 측정할 수 있다. pH는 수소이온(H+)의 농도를 나타내므로 용액 중에 직접 또는 간접으로 두 개의 전극을 삽입하여 전지를 형성하고, 이에 따라 나타나는 전위차를 측정하여 이 값을 pH로 나타내도록한 장치가 pH 미터기이다. 일 실시예에 의하면 pH 미터기는 당업자가 산도 측정시 일반적으로 사용하는 유리전극에 의한 것을 사용하나 이에 한정되지 않는다. 시료의 배양 전 pH가 6.8 내지 7의 중성을 나타내는 범위에 있는지 확인하여, 이물질의 함유로 인한 pH측정의 오판을 방지한다. 바람직한 일 실시예에 의하면 검출 대상이 되는 시료를 채취해 30 내지 45 ℃온도로 16 시간 이상, 바람직하게는 16내 지 18시간 방치하여 미생물을 증균시킨 후 pH미터기로 pH를 측정하여 pH의 범위가 5.4 내지 5.9일 경우 엔테로박터 사카자키가 존재한다고 판단가능하다.
그밖에 상기 pH의 변화의 측정은 상기 기재한 방법에 제한되지 않으며, 백금선 또는 백금판을 이용하는 수소전극이나 pH 시험지등 당업자가 pH를 측정하기 위해 일반적으로 사용하는 방법으로 할 수 있다.
한편, 상술한 살리신 및 지시약이 포함된 복수개의 웰 플레이트 중 엔테로박터 사카자키가 포함된 시료의 희석액과 반응하여 지시약의 색이 변화된 웰 플레이트를 계수하는 것을 통해 엔테로박터 사카자키를 정량분석할 수 있다. 상세하게는 상기 이진희석된 복수개의 웰 플레이트가 각각 살리신과 반응하면 pH가 변화하게 되고 그 결과 지시약의 색이 바뀌게 된다. 이진희석된 복수개의 웰플레이트는 뒤로 갈수록 희석농도가 높아지게 되므로 어느 수준 이상으로 희석된 웰플레이트에서는 pH의 변화가 미미하거나 더 이상 변화하기 않게 되어 결국 지시약의 색변화가 멈추게 된다. 다시 말해, 앞선 웰에 존재하는 엔테로박터 사카자키의 반이 다음 웰로 이동하기 때문에, 시료(원액)에 존재하는 엔테로박터 사카자키가 높은 수준으로 존재할 수록 엔테로박터 사카자키가 존재하는 웰의 수는 높아진다. 따라서 엔테로박터 사카자키의 초기 오염 농도(시료에 존재하는 엔테로박터 사카자키의 균수)와 웰플레이트의 색 변화가 종결되는 지점(종말점)은 양의 상관관계를 나타낸다. 이러한 원리로 엔테로박터 사카자키의 정량분석이 가능하다.
상술한 방법을 통해 웰플레이트의 색이 변화된 웰 플레이트를 계수한 후, 통계적인 회귀분석을 통해 회귀식을 산출하여 엔테로박터 사카자키를 정량분석할 수 있다. 구체적으로 복수개의 웰플레이트에서 시료가 순차적으로 이진희석되어 배열되어 있다면, 색변화가 완료된 지점의 웰플레이트의 순번이 종말점이 되는 것이다. 예를 들어, 도 1은 이진희석법을 통해 배열된 웰플레이트에서 지시약이 색이 변화된 종말점의 수를 나타내는 사진으로서, 도 1의 (A)에서 색이 변한 웰플레이트의 개수가 13개이므로 종말점은 13이며, 도 1의 (B)에서 색이 변한 웰플레이트의 개수가 28개이므로 종말점은 28이 된다. 상술한 방법을 통해 육안으로 종말점을 확인하였다면 이를 각각의 상황에서 회귀분석을 통해 회귀식을 산출할 수 있게 된다.
보다 구체적으로, 회귀분석을 통한 회귀식을 산출하기 위하여 종말점을 2FD로 환산하며, 2FD는 종말점의 2의 거듭제곱을 의미하는 것이다(종말점이 n라 한다면 2n). 상기에서 계산된 2FD 값을 상용로그를 취하여 회귀분석시 x의 값으로 사용할 수 있다.
회귀식에 사용되는 y값을 도출하기 위하여 이진희석법에 사용된 시료와 동일한 농도의 시료에 대하여 통상의 한천평판배양법을 통해 복수개의 웰플레이트에 시료를 10배씩 희석한 후 배양을 실시하고 배양 후 생성된 집락을 계수한다. 그 뒤 계수된 집락에 희석배수와 단위환산 배수를 곱하여 균수를 측정하여 그 값에 상용로그를 취한다. 다시 말해 통상의 미생물의 균수추정방법인 배지상에서 형성된 집락의 수를 통해 시료의 균수를 계수하는 것이다. 예를 들면, 103 배로 희석한 샘플을 100㎕분주 했을 경우 배지상에서 50개의 집락이 형성되었다면, 50*1000(희석배수)*10(단위환산)으로 500000 cfu/㎖로 추정할 수 있다. 그 결과 상기 과정을 통해 도출된 수치는 회귀분석시 y값으로 사용할 수 있다(실시예 3 참조).
한편, 본 발명에서는 y값을 도출하기 위하여 통상의 한천평판배양법을 통하여 균주수를 추정하였지만 이에 한정되는 것은 아니며 시료의 농도에 따라 엔테로박터 사카자키 균주의 균주수를 추정할 수 있는 통상의 다른 방법들이 적용될 수 있다. 예를 들어 최확수측정법(MPN), 탁도나 흡광도를 이용하여 균수를 측정하는방법, 전기전도도를 측정하는 기기를 이용하는 방법 및 미생물이 생성하는 여러 가지 물질을 측정하여 균수를 추정하는 방법을 사용하는 것도 가능하다.
상술한 방법에 의해 회귀분석에 필요한 x값과 y값이 얻어지면, 이에 대한 통계적인 회귀분석을 실시하여 일반적인 회귀식을 도출할 수 있게 된다. 보다 구체적으로, 하기 실시예 5 ~ 8과 같이 다양한 환경에서 다양한 농도의 시료를 제조한 후 이들 각각에 대하여 이진희석법에 의한 종말점의 계수를 통해 x값을 산출하고, 한천평판배양법을 통해 엔테로박터 사카자키의 균주 수(CFU/㎖)를 추정하여 이를 y값으로 산출하여 다양한 농도의 실험을 반복적으로 수행하여 분산형 그래프를 그리고 통계적인 회귀분석을 통하여 회귀식을 산출할 수 있게 된다.
보다 구체적으로 본 발명의 일구현예에 의하면 엔테로박터 사카자키를 포함하는 시료가 균액상태인 경우 상기 시료가 엔테로박터 사카자키만을 함유하면 하기 회귀식 1을 통해 농도를 산출하고, 다른 균주가 혼재되면 하기 회귀식 2를 통해 엔테로박터 사카자키의 농도를 산출할 수 있다. 하기 회귀식 1과 2는 각각 실시예 5, 6 및 표 4에 의해 뒷받침된다.
[회귀식 1]
Y = aX + b
단, Y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, a 는 0.68 ~ 0.88의 범위를 갖는 상수이며, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수가 n일때 log2n이고, b는 1.42 ~ 1.62의 범위를 갖는 상수이다.
[회귀식 2]
Y = cX + d
단, Y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, c는 0.61 ~ 0.81의 범위를 갖는 상수이며, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수가 n일때 log2n이고, d는 1.2 ~ 1.4의 범위를 갖는 상수이다.
본 발명의 다른 구현예에 의하면, 엔테로박터 사카자키를 포함하는 시료가 수화분유 상태인 경우 상기 시료가 엔테로박터 사카자키만을 함유하면 하기 회귀식 3을 통해 농도를 산출하고, 다른 균주가 혼재되면 하기 회귀식 4를 통해 엔테로박터 사카자키의 농도를 산출할 수 있다. 하기 회귀식 3과 4는 각각 실시예 7, 8 및 표 4에 의해 뒷받침된다.
[회귀식 3]
Y = eX + f
단, Y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, e는 0.75 ~ 0.85의 범위를 갖는 상수이며, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수가 n일때 log2n이고, f는 1.28 ~ 1.48의 범위를 갖는 상수이다.
[회귀식 4]
Y = gX + h
단, Y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, g는 0.86 ~ 1.06의 범위를 갖는 상수이며, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수가 n일때 log2n이고, h는 0.44 ~ 0.64의 범위를 갖는 상수이다.
상기 도출된 회귀식 1 ~ 4는 결국 각각의 상황에서 종말점의 개수에 따른 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 것을 의미하는 것이므로, 상기 회귀식에서 log값을 제거하는 경우 종말점의 개수에 따른 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖) 즉 추정균수를 산정할 수 있는 것이다. 이를 통해 표 5와 같이 종말점의 개수에 따른 추정균수에 대한 표를 제작할 수 있으며, 시료에 대한 이진희석을 실시한 후 종말점의 개수만 확인하면, 작성된 종말점과 추정균수의 관계를 나타내는 표를 통해 쉽게 추정균수를 산출할 수 있다. 보다 바람직하게는 시료의 환경이 회귀식 1 ~ 4의 환경과 동일하다면 하기 표 5를 통해 엔테로박터 사카자키의 추정균수를 도출해낼 수 있게 된다. 예를 들어 원액상태에서 엔테로박터 사카자키와 다른균이 혼재된 경우 이진희석을 통한 종말점의 수가 3이라면 엔테로박터 사카자키의 추정균수는 90 CFU/㎖인 것으로 추정할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 원액상태에서 엔테로박터 사카자키 균만 존재하는 경우, 다른균과 혼재된 경우 및 수화분유 상태에서 사카자키 균만 존재하는 경우, 다른균과 혼재된 경우만을 대상으로 실험을 실시하였지만, 이에 한정되는 것은 아니 며 산업현장에서 다양한 조건(예를 들어 음료수 등)에 대하여 상술한 회귀분석방법과 동일한 방법을 통하여 회귀분석을 실시하여 회귀식을 산출해낼 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 엔테로박터 사카자키의 정량분석용 액체배지는 엔테로박터 사카자키의 이진희석 후 첨가하는 액체배지에 있어서, 상기 액체배지는 엔테로박터 사카자키의 검출성분으로 살리신을 포함한다. 상술한 바와 같이 살리신은 버드나무의 잎이나 껍질 속에 들어 있는 글리코시드이며 무색이나 흰색의 결정성 물질인 당의 일종으로 본 발명의 액체배지에서 엔테로박터 사카자키의 영양성분인 동시에 타 미생물과 집락차이를 일으키는 검출물질로 사용되었다. 이 성분이 본 발명의 액체배지에 있어서 가장 핵심이 되는 요소로 엔테로박터 사카자키가 살리신을 분해하여 대사산물로 생성하는 특유한 산도를 가지는 물질로부터 엔테로박터 사카자키의 존재를 식별한다. 액체배지는 통상 펩톤(peptone)이나 염화나트륨(NaCl)등 중성물질이 포함되므로 미생물 배양 전의 배지의 pH는 6.8 내지 7 정도이다. 이러한 배지에 엔테로박터 사카자키 등의 미생물을 배양시키면 미생물이 당을 분해하여 산을 생성하는데, 특별히 엔테로박터 사카자키가 살리신을 분해하면 pH의 범위가 5.4 내지 5.9까지 낮아진다.
따라서 액체배지는 산 염기 지시약을 더 포함하는 것이 바람직한데 이는 상기 pH의 변화를 시료의 배양 후 후처리 없이 육안으로 쉽게 구별하고 나아가 종말점의 개수를 확인하기 위함이며, 바람직하게는 상기 산염기 지시약은 뉴트랄 레드 또는 브로모크레졸 퍼플을 사용할 수 있다. pH 지시약의 색이 변함으로써 살리신 을 분해하지 않는 타 미생물과 다른 색과 특징을 지닌 집락을 엔테로박터 사카자키의 집락으로 식별할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 액체배지는 살리신을 포함하는 것 외에도 엔테로박터 사카자키를 특이적으로 선별할 수 있는 제1성분, 엔테로박터 사카자키의 성장을 촉진하는 제2성분 및 상기 엔테로박터 사카자키 이외의 다른 미생물의 성장을 억제하는 제3성분을 더 포함할 수 있으며 상기 제1성분은 바람직하게는 상술한 산염기 지시약일 수 있다. 상기 제2성분과 제3성분은 이는 액체배지의 선택성을 높이기 위함이며, 선택성은 여러 종류의 미생물이 서식하는 시료에서 검출해내고자 하는 특정 미생물만을 선별하여 그 존부를 확인할 수 있는 능력을 의미한다. 상기 엔테로박터 사카자키의 성장을 촉진하는 제2성분은 엔테로박터 사카자키에 의한 대사작용이 특히 활발한 영양성분으로 주로 질소가 함유된 물질이며, 상기 성분 첨가시 엔테로박터 사카자키의 증식을 촉진하여 엔테로박터 사카자키의 검출이 용이하게 된다. 상기 엔테로박터 사카자키 이외의 다른 미생물의 성장을 억제하는 성분인 제3성분은 엔테로박터 사카자키의 생장에는 영향이 없으면서 그 외의 미생물의 대사작용이나 증식에 치명적인 결함을 주는 유해 물질이다. 상기 엔테로박터 사카자키 이외의 다른 미생물의 성장을 억제하는 성분을 배지에 첨가할 경우 검출 대상이 아닌 엔테로박터 사카자키 이외의 미생물의 증식이 억제되므로 타 미생물의 대사에 의한 pH 변화를 최소화할 수 있어 상기 배지의 검출력이 향상되며 더불어 타 미생물의 성장에 의한 영양성분의 부족, 성장공간의 부족 및 노폐물의 축적에 의한 독소물질 생산 등으로 엔테로박터 사카자키가 사멸되는 것을 방지하는 역할을 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면,상기 제2성분은 펩톤, 프로테오즈 펩톤1, 프로테오즈펩톤3, 염화나트륨 및 트립톤으로 구성된 군 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며 상기 제3성분은 담즙산, 크리스탈 바이올렛의 단독 또는 혼합일 수 있다. 그러나 이는 바람직한 일 실시예일 뿐 이에 한정됨 없이 엔테로박터 사카자키의 성장을 촉진하는 성분은 제2성분으로 포함할 수 있으며, 엔테로박터 사카자키 이외의 다른 미생물의 성장을 억제하는 물질은 제3성분으로 포함할 수 있다.
한편, 살리신은 상기 액체배지의 총 구성물의 부피 1L 당 5 내지 15g이 포함될 수 있다. 살리신이 액체배지의 총 구성물의 부피 1L당 5g 미만으로 함유될 경우 시료에 엔테로박터 사카자키가 존재하여 살리신을 영양성분으로 해서 산성 물질을 생성하더라도 그 양이 적어 pH 변화가 적어 검출의 정확성이 저하된다. 엔테로박터 사카자키가 존재하지 않는 시료의 경우에도 이물질의 유입등으로 다소의 pH 변화가 있을 수 있으며, 살리신이 액체배지의 총 구성물의 부피 1L당 5g 미만으로 함유된 배지의 경우 검출결과 지시약의 색이 변한 경우라도 색변화가 지시약에 의한 것인지 이물질의 유입등 주변환경에 의한 것인지 불분명한 문제가 생긴다. 또한 살리신은 미생물간 집락 차이를 일으키는 성분으로 사용됨과 동시에 탄소원으로 미생물의 영양성분의 역할을 한다. 따라서 살리신의 양이 총 구성물의 부피 1L당 5g 미만일경우 엔테로박터 배지 내 영양성분이 부족하여 사카자키의 집락과 배지 전체 색이 노랗게 변하여 액체배지로써 적합하지 않게 된다. 살리신이 액체배지의 총 구성물 의 부피 1L당 15g 이상 함유될 경우에는 배지제조에 비용이 높아져 비경제적이고, 살리신은 탄소원으로 미생물의 영양성분으로 사용되므로 엔테로박터 사카자키 뿐만 아니라 검출 대상으로 하지 않는 미생물 역시 이상증식해 엔테로박터 사카자키의 검출력을 저하시킨다.
본 발명의 액체배지에서 사용가능한 용매는 엔트로박터 사카자키 균주의 배양에 사용될 수 있는 것이면 종류의 제한이 없으나 바람직하게는 물, 증류수 등을 사용할 수 있다.
한편, 상기 액체배지의 조성은 용매 100중량부에 대하여 살리신 0.5 ~ 2 중량부, 상기 제1성분 0.0001 ~ 0.005 중량부, 상기 제2성분 0.1 ~ 0.3 중량부 및 상기 제3성분 0.1 ~ 0.5 중량부를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 복수개의 웰플레이트가 상술한 본 발명의 액체배지를 고형화시켜 제조된 고형분을 포함하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석 키트를 제공한다.
상기 고형분은 본 발명의 액체배지를 동결건조하여 제조될 수 있으나 이에 한정되지 않고 액체배지의 성분을 변형시키지 않으면서 이를 고형화시킬 수 있는 통상의 방법이 모두 적용될 수 있다.
본 발명의 엔테로박터 사카자키의 정량분석 키트의 사용방법을 간단히 설명하면 다음과 같다. 먼저 엔테로박터 사카자키의 정량분석 키트내에 포함된 복수개의 웰플레이트에 시료를 희석배율의 순으로 이진희석시켜 배열한다. 그 뒤 이를 적정한 온도조건에서 16 ~ 24시간 정도 배양하면(방치하면) 종말점의 수를 확인할 수 있다.
그 뒤 웰플레이트의 색이 변화된 종말점을 계수하고 이를 표 5에 대입하여 적절한 엔테로박터 사카자키의 추정균수를 산출한다. 결국 본 발명의 엔테로박터 사카자키의 정량분석 키트는 현장에서 손쉽게 이진희석법을 적용할 수 있을 뿐 아니라, 이진희석을 통해 종말점의 수만 파악해도 본 발명의 명세서에 기재된 회귀식 및 표 5를 통해 쉽고 빠르게 엔테로박터 사카자키의 농도를 추정할 수 있으므로 엔테로박터 사카자키의 농도를 간단하면서도 정확하게 분석하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
<실시예 1> 실험에 사용된 미생물
본 발명에서 사용된 다른 미생물들은 표 2와 같다. 사용된 미생물들은 식품위생에서 가장 문제가 되고 있는 병원성 미생물 또는 부패성 미생물이다. 구체적으로 본 발명의 실시예에 있어서, 엔트로박터 사카자키 균주만을 사용한 경우에는 하기 표 2의 엔트로박터 사카자키 ATCC 29004, 29544 및 51329를 접종하여 사용하였고, 다른 균주와 혼합한 경우에는 하기 표 2에 기재된 미생물을 모두 접종하여 사용하였다.
[표 2] 실험에 사용된 미생물
Figure 112008086813176-pat00002
<실시예 2> 액체배지의 제조
하기 표 3의 조성비를 가지는 엔트로박터 사카자키 정량분석용 액체배지를 제조하였다. 구체적으로 살리신은 엔트로박터 사카자키에 대한 선택성을 부여하는 물질로 사용하였고, 염화 나트륨은 미생물이 성장하는데 있어 삼투압을 유지하기 위하여 사용하였다. 담즙산염은 그람 양성균을 억제하기 위하여 사용하였으며, 브로모크레졸 퍼플은 지시약으로 사용하였다. 보다 구체적으로, 분말형태의 상기 성분들을 정량하여 증류수에 녹인 후 고압살균기에서 121℃에서 15분 동안 멸균하여 액체배지를 제조하였다.
[표 3] 액체배지의 조성
Figure 112008086813176-pat00003
< 실시예 3> 한천 평판 배양법의 수행
일반 미생물의 균수를 측정하기 위하여 널리 사용되는 방법으로 하기 실시예 4 이하의 이진희석법과의 회귀분석을 위하여 각 상황별로(실시예 5 ~ 8의 미생물 접종환경과 동일한 상황) 엔테로박터 사카자키의 균수(CFU/㎖)를 측정하였다. 구체적으로 시료 1 ㎖를 취하여 0.2% 멸균 펩톤수 9 ㎖에 분주하는 방법으로 10진 희석하고 각 단계의 희석액 100 ㎕를 2매의 평판배지에 분주하여 도말한 후 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 배양 후 생성된 집락을 계수하고 희석배수와 단위환산 배수를 곱하여 균수를 측정하고 상용로그를 취하였다. 균의 농도가 낮은 시료는 100 ㎕ 씩 10매의 평판배지에 분주하는 방법으로 검출한계를 낮추었다. 한천 평판 배양법을 통하여 도출된 값은 하기 실시예 5 ~ 8의 회귀분석에 대한 y값으로 사용하였다.
<실시예 4> 이진희석법의 수행
멸균된 멀티 웰 플레이트 3줄을 실험에 사용하였다. 구체적으로 멸균 0.2% 펩톤수(희석액)를 첫 번째 웰을 제외한 나머지 웰에 100 ㎕씩 분주하였다. 시료를 첫 번째 웰에 200 ㎕를 분주하고, 피펫으로 3, 4번 섞어준 후 첫 번째 웰에서 100 ㎕를 취하여 두 번째 웰에 분주하였다. 두 번째 웰의 시료를 잘 섞어준 후 100 ㎕를 취하여 세 번째 웰에 분주한다. 위와 같은 과정을 마지막 웰까지 반복수행하였다(2진 희석). 마지막 웰까지 시료의 희석이 끝나면 모든 웰에 상기 실시예 2에서 제조된 액체배지를 100 ㎕ 첨가한 후 37℃에서 20시간 배양하여 종말점(색변화가 발생한 마지막 웰의 순번)을 관찰하였다. 배양 전 웰의 색은 보라색이며 엔테로박터 사카자키가 존재할 경우 살리신을 분해하여 pH를 낮추므로 브로모크레졸 지시약의 색이 변하여 웰의 색은 노란색으로 변화하게 된다. 그 뒤 종말점을 2FD로 환산하는데, 2FD는 종말점의 2의 거듭제곱을 의미하는 것이다(종말점이 n라 한다면 2n). 상기에서 계산된 2FD 값을 상용로그를 취하여 회귀분석시 x의 값으로 사용하였다.
< 실시예 5> 균액 환경에서 엔테로박터 사카자키만 존재할 경우의 회귀분석
상기 실시예 1의 엔테로박터 사카자키 표준균주의 증균 혼합액을 희석하여 다양한 농도의 균액(시료)를 제조하였다. 하나의 시료를 대상으로 전통적인 한천 평판 배양법(실시예 3)을 통한 방법과 이진희석법(실시예 4)을 병행하여 균수를 측정하였고 그 결과를 회귀분석하여 회귀식을 도출하였다. 한편, 한천 평판 배양법에 서 도말에 사용된 평판 배지는 tryptic soy agar(TSA)로 보통 미생물의 영양배지로 널리 사용되는 배지이다. 이를 통해 다양한 농도의 실험을 반복 수행(n=50)하여 분산형 그래프를 그리고 통계분석을 통하여 회귀식을 산출하여 하기 표 4로 나타내었다. 또한 균액 환경에서 엔테로박터 사카자키만 존재할 경우의 회귀분석 그래프는 도 2에 나타내었다.
< 실시예 6> 균액 환경에서 엔테로박터 사카자키와 다른 미생물이 혼재할 경우의 회귀분석
상기 실시예 1 및 표 2에 명시된 실험에 사용된 균주의 증균액을 혼합하여 엔테로박터 사카자키를 다른 미생물과 혼재시켰다. 다양한 농도의 시료를 준비한 후 하나의 시료를 대상으로 실시예 3의 전통적인 한천 평판 배양법을 통한 균수 측정과 실시예 4의 이진희석법을 통한 균수 측정을 수행하였다. 이때 한천 평판 배양법에서 도말에 사용한 배지는 본 연구진에 의해 개발된 선별배지인 KR 배지 사용하였다(대한민국 특허출원 제2008-0032370호에 상세히 기재됨). KR 배지 상에서는 엔테로박터 사카자키는 그 외 다른 미생물과 다른 성상을 나타내므로 엔테로박터 사카자키만의 균수 측정이 가능하였다. 균수 측정 후 통계분석을 수행하였으며 균액 환경에서 엔테로박터 사카자키만 존재할 경우의 회귀분석을 실시하여 도 3에 도시하였고, 회귀분석을 통해 도출된 회귀식은 하기 표 4에 나타내었다.
< 실시예 7> 수화 분유에서 엔테로박터 사카자키만 존재할 경우의 회귀분석
본 발명의 이진희석법이 실제 현장에서 유용하게 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 엔테로박터 사카자키가 문제가 되고 있는 분유에서 결과 식을 도출하고자 수화 분유 환경에서 실험을 수행하였다. 구체적으로 분유에 엔테로박터 사카자키를 접종하기 앞서, 분유내 존재하는 미생물을 사멸하기 위하여 분유 제조 시 끓여서 식힌 멸균 증류수(70℃ 이상)로 분유를 수화한 후 63℃에서 30분 동안 열처리(저온살균)를 하였다. 다양한 농도의 엔테로박터 사카자키 증균 혼합액을 분유에 접종하여 시료를 제조하였다. 상기 명시된 바와 같이 전통적인 한천 평판 배양법(실시예 3)과 이진희석법(실시예 4)으로 균수(농도)를 측정하였다. 이때 한천 평판 배양법에서 도말에 사용된 배지로 TSA와 KR 배지를 병행하여 사용하였다. TSA를 사용하였을 때 회귀분석은 도 4에 도시하였고, KR 배지를 사용하였을 때는 도 4에 도시하였다. 이들의 회귀식은 하기 표 4에 나타내었다.
< 실시예 8> 수화 분유에서 엔테로박터 사카자키와 다른 미생물이 혼재할 경우의 회귀분석
실시예 1에 따라 엔테로박터 사카자키와 다른 균주의 증균 혼합액을 준비한 후 실시예 7과 같이 저온살균한 분유에 접종하여 다양한 농도의 시료를 준비하였다. 상기 명시된 방법과 같이 전통적인 한천 평판 배양법(실시예 3)과 이진희석법 방법(실시예 4)으로 균수를 측정하였다. 이때 한천 평판 배양법에서 도말에 사용된 배지로 KR 배지를 사용하였다. 회귀분석은 도 5로 도시하였고 이를 통해 도출된 회귀식은 표 4에 나타내었다.
상기 실시예 5 ~ 8의 조건에서 회귀분석을 실시하고(도 1 ~ 도 5) 이를 통해 적절한 회귀식을 도출하여 이를 표 4로 나타내었다. 하기 회귀식들의 R2(결정계수)의 값이 0.95-0.96으로 이는 도출된 회귀식의 유효성이 높다는 것을 의미한다.
[표 4]
Figure 112008086813176-pat00004
상기 표 4를 통해 도출된 회귀식 중 y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수(종말점의 개수)가 n일때 log2n이다.
한편, 상기 표 4를 통해 도출된 회귀식은 결국 각각의 상황에서 종말점의 개수에 따른 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 것을 의미하는 것이므로, 상기 회귀식에서 log값을 제거하는 경우 종말점의 개수에 따른 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖) 즉 추정균수를 산정할 수 있는 것이다. 그러므로, 현장에 서 본 발명의 엔테로박터 사카자키의 정량분석 키트를 통해 시료에 대한 이진희석을 실시한 후 종말점의 개수만 확인하면, 하기 표 5를 통해 손쉽게 추정균수를 산출할 수 있다.
[표 5] 각각의 환경 및 조건에서 종말점과 추정균수
균액환경에서 엔테로박터 사카자키만 존재할 경우 균액환경에서 엔테로박터 사카자키와 다른균이 혼재할 경우 수화 분유 환경에서 엔테로박터 사카자키만 존재할 경우 (TSA 적용) 수화 분유 환경에서 엔테로박터 사카자키만 존재할 경우 (KR medium 적용) 수화 분유 환경에서엔테로박터 사카자키와 다른균이 혼재할 경우
log CFU/ml CFU/ml log CFU/ml CFU/ml log CFU/ml CFU/ml log CFU/ml CFU/ml log
CFU/ml		 CFU/ml
1.76 58 1.52 33 1.61 41 1.6 42 0.35 2
2.00 100 1.74 55 1.86 72 1.9 73 0.64 4
2.24 173 1.95 90 2.10 127 2.1 126 0.93 9
2.47 298 2.17 148 2.35 223 2.3 218 1.22 17
2.71 513 2.39 243 2.59 391 2.6 376 1.52 33
2.95 884 2.60 400 2.84 686 2.8 649 1.81 64
3.18 1524 2.82 657 3.08 1204 3.0 1121 2.10 126
3.42 2627 3.03 1080 3.33 2115 3.3 1936 2.39 246
3.66 4528 3.25 1776 3.57 3713 3.5 3343 2.68 482
3.89 7803 3.47 2919 3.81 6519 3.8 5772 2.97 944
4.13 13449 3.68 4798 4.06 11445 4.0 9967 3.27 1848
4.37 23179 3.90 7886 4.30 20095 4.2 17211 3.56 3619
4.60 39947 4.11 12963 4.55 35283 4.5 29720 3.85 7087
4.84 68847 4.33 21308 4.79 61948 4.7 51320 4.14 13876
5.07 118654 4.54 35025 5.04 108767 4.9 88619 4.43 27169
5.31 204495 4.76 57573 5.28 190969 5.2 153027 4.73 53198
5.55 352436 4.98 94636 5.53 335297 5.4 264247 5.02 104163
5.78 607406 5.19 155558 5.77 588703 5.7 456301 5.31 203954
6.02 1046835 5.41 255701 6.01 1033624 5.9 787940 5.60 399348
6.26 1804169 5.62 420310 6.26 1814802 6.1 1360614 5.89 781933
6.49 3109396 5.84 690890 6.50 3186366 6.4 2349506 6.18 1531045
6.73 5358890 6.06 1135657 6.75 5594511 6.6 4057124 6.48 2997827
6.97 9235782 6.27 1866748 6.99 9822648 6.8 7005837 6.77 5869823
7.20 15917415 6.49 3068486 7.24 17246264 7.1 12097670 7.06 11493266
7.44 27432879 6.70 5043856 7.48 30280392 7.3 20890243 7.35 22504115
7.67 47279214 6.92 8290890 7.73 53165261 7.6 36073246 7.64 44063645
7.91 81483392 7.13 13628237 7.97 93345719 7.8 62291239 7.94 86277768
8.15 140432607 7.35 22401556 8.21 163893174 8.0 107564437 8.23 168934122
8.38 242028669 7.57 36822791 8.46 287757946 8.3 185742141 8.52 330777420
8.62 417124470 7.78 60527844 8.70 505235414 8.5 320739308 8.81 647670824
8.86 718893445 8.00 99493272 8.95 887074804 8.7 553852253 9.10 1268156382
9.09 1238977384 8.21 163543098 9.19 1557495151 9.0 956391410 9.39 2483083302
9.33 2135316395 8.43 268825664 9.44 2734595928 9.2 1651495544 9.69 4861941929
9.57 3680112458 8.65 441884974 9.68 4801308617 9.5 2851800533 9.98 9519809220
9.80 6342492259 8.86 726353011 9.93 8429971022 9.7 4924485754 10.27 18640034974
10.04 10930972493 9.08 1193950297 10.17 14801050528 9.9 8503596118 10.56 36497675090
본 발명은 손쉽게 엔테로박터 사카자키 균을 선별적으로 정량분석할 수 있어, 식품산업에 대단히 유용한 발명이다.
도 1은 본 발명의 이진희석법에 의한 종말점을 나타내는 사진이다.
도 2는균액 환경에서 엔테로박터 사카자키만 존재할 경우의 회귀식 및 회귀곡선의 그래프이다.
도 3은 균액 환경에서 엔테로박터 사카자키와 다른 미생물이 함께 존재할 경우의 회귀식 및 회귀곡선의 그래프이다.
도 4는 수화 분유에서 엔테로박터 사카자키만 존재할 경우, 한천 평판 배양법에서 TSA를 도말 배지로 사용할 경우의 회귀식 및 회귀곡선의 그래프이다.
도 5는 수화 분유에서 엔테로박터 사카자키만 존재할 경우, 한천 평판 배양법에서 KR medium를 도말 배지로 사용할 경우의 회귀식 및 회귀곡선의 그래프이다.
도 6은 수화 분유에서 엔테로박터 사카자키와 다른 미생물이 혼재할 경우의 회귀식과 결정계수를 나타낸다.

Claims (28)

  1. 이진희석법(two fold dilution)을 사용하여 엔테로박터 사카자키를 정량적으로 분석하되, 상기 이진희석법은 복수개의 웰 플레이트를 사용하며, 상기 복수개의 웰 플레이트는 엔테로박터 사카자키가 포함된 시료의 농도가 순차적으로 감소하도록 희석하여 배열되며, 엔테로박터 사카자키를 특이적으로 검출하기 위하여 상기 웰 플레이트는 살리신을 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 이진희석법은 하기 관계식 1을 만족하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
    [관계식 1]
    D = 2n-1
    상기 관계식 1에서 D는 희석배율, n은 배열된 웰 플레이트 중 해당 웰 플레이트의 순번
  4. 제1항에 있어서, 상기 복수개의 웰 플레이트의 수는 2 ~ 40개인 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 복수개로 배열된 웰플레이트 중 첫번째 웰 플레이트는 희석되지 않은 시료원액인 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 살리신은 이진희석이 완료된 후 상기 웰 플레이트에 첨가하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 엔테로박터 사카자키가 상기 살리신을 분해함으로써 발생하는 pH 변화를 검출하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
  9. 제8항에 있어서, 30 내지 43℃의 온도에서 16시간 내지 24시간 동안 배양하여 배양 전과 후의 pH의 변화를 검출하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 pH 변화의 검출은 산 염기 지시약을 이용하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 산 염기 지시약은 뉴트랄 레드 또는 브로모크레졸 퍼플인 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 pH의 변화의 검출은 pH 미터기를 사용하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
  13. 제1항에 있어서, 살리신이 포함된 복수개의 웰 플레이트 중 엔테로박터 사카자키가 포함된 시료의 희석액과 반응하여 지시약의 색이 변화된 웰 플레이트를 계수하는 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 색이 변화된 웰 플레이트를 계수한 후, 회귀분석을 통해 회귀식을 산출하여 엔테로박터 사카자키를 정량분석하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
  15. 제14항에 있어서, 엔테로박터 사카자키를 포함하는 시료가 균액상태인 경우 상기 시료가 엔테로박터 사카자키만을 함유하면 하기 회귀식 1을 통해 농도를 산출하고, 다른 균주가 혼재되면 하기 회귀식 2를 통해 엔테로박터 사카자키의 농도를 산출하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
    [회귀식 1]
    Y = aX + b
    단, Y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, a는 0.68 ~ 0.88의 범위를 갖는 상수이며, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수가 n일때 log2n이고, b는 1.42 ~ 1.62의 범위를 갖는 상수이다.
    [회귀식 2]
    Y = cX + d
    단, Y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, c는 0.61 ~ 0.81의 범위를 갖는 상수이며, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수가 n일때 log2n이고, d는 1.2 ~ 1.4의 범위를 갖는 상수이다.
  16. 제14항에 있어서, 엔테로박터 사카자키를 포함하는 시료가 수화분유 상태인 경우 상기 시료가 엔테로박터 사카자키만을 함유하면 하기 회귀식 3을 통해 농도를 산출하고, 다른 균주가 혼재되면 하기 회귀식 4를 통해 엔테로박터 사카자키의 농도를 산출하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석방법.
    [회귀식 3]
    Y = eX + f
    단, Y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, e는 0.75 ~ 0.85의 범위를 갖는 상수이며, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수가 n일때 log2n이고, f는 1.28 ~ 1.48의 범위를 갖는 상수이다.
    [회귀식 4]
    Y = gX + h
    단, Y는 엔테로박터 사카자키의 농도(CFU/㎖)에 log를 취한 값이고, g는 0.86 ~ 1.06의 범위를 갖는 상수이며, X는 색이 변화된 웰 플레이트의 개수가 n일때 log2n이고, h는 0.44 ~ 0.64의 범위를 갖는 상수이다.
  17. 엔테로박터 사카자키의 이진희석 후 첨가하는 액체배지에 있어서, 상기 액체배지는 용매 100중량부에 대하여 살리신 0.5 ~ 2 중량부, 엔테로박터 사카자키를 특이적으로 선별할 수 있는 제1성분 0.0001 ~ 0.005 중량부, 엔테로박터 사카자키의 성장을 촉진하는 제2성분 0.1 ~ 0.3 중량부 및 엔테로박터 사카자키 이외의 다른 미생물의 성장을 억제하는 제3성분 0.1 ~ 0.5 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석용 액체배지.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 액체배지는 산 염기 지시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석용 액체배지.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 제17항에 있어서, 상기 용매는 물 또는 증류수인 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석용 액체배지.
  22. 제17항에 있어서, 상기 제1성분은 산염기 지시약인 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석용 액체배지.
  23. 제22항에 있어서, 상기 산염기 지시약은 뉴트랄 레드 또는 브로모크레졸 퍼플인 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석용 액체배지.
  24. 제17항에 있어서, 상기 제2성분은 펩톤, 프로테오즈 펩톤1, 프로테오즈펩톤3 , 염화나트륨 및 트립톤으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석용 액체배지.
  25. 제17항에 있어서,
    상기 제3성분은 담즙산, 크리스탈 바이올렛의 단독 또는 혼합인 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석용 액체배지.
  26. 복수개의 웰플레이트가 제17항, 제18항 및 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 액체배지를 고형화시켜 제조된 고형분을 포함하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석 키트.
  27. 제26항에 있어서, 상기 고형분은 상기 액체배지를 동결건조하여 제조된 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석 키트.
  28. 제26항에 있어서, 상기 복수개의 웰플레이트는 멀티 웰플레이트인 것을 특징으로 하는 엔테로박터 사카자키의 정량분석 키트.
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EP2135959A1 (en) 2008-06-19 2009-12-23 Novexel Use of (1R,2S,5R) 1,6-Diazabicyclo [3,2,1]octane-2-carboxamide, 7-oxo-6-(sulfooxy)-, monosodium salt as a diagnostic reagent for detecting serine beta-lactamases

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논문1:Journal of Antimicrobial Chemotherapy*

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