JP5688702B2 - 核酸増幅方法およびその利用 - Google Patents
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Description
[1]以下の(a)〜(e)を含む反応液を調製する反応液調製工程と、得られた反応液を用いて核酸合成を行う核酸合成工程とを有し、核酸合成工程の後に核酸の熱変性工程を有しないことを特徴とする核酸増幅方法。
(a)反復配列を有する鋳型核酸
(b)前記鋳型核酸の反復配列内に結合するプライマー1
(c)前記鋳型核酸の相補鎖の反復配列内に結合するプライマー2
(d)鎖置換型DNA合成酵素
(e)前記鎖置換型DNA合成酵素の基質となるヌクレオチド
[2]反復配列が、10〜500塩基対の長さを有し、1000塩基対以内の間隔で3回以上存在することを特徴とする前記[1]に記載の核酸増幅方法。
[3]核酸合成工程を等温で行うことを特徴とする前記[1]または[2]に記載の核酸増幅方法。
[4]前記[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸増幅方法を用いることを特徴とする病原体検出方法。
[5]前記[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸増幅方法を用いることを特徴とするアレルゲン検出方法。
[6]前記[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸増幅方法を用いることを特徴とする生物種鑑別方法。
[7]前記[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸増幅方法において、配列番号1で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号2で表される塩基配列からなるプライマー2とを用いることを特徴とする結核菌検出方法。
[8]前記[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸増幅方法において、配列番号3で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号4で表される塩基配列からなるプライマー2とを用いることを特徴とするサルモネラ菌検出方法。
[9]前記[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸増幅方法において、配列番号5で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号6で表される塩基配列からなるプライマー2とを用いることを特徴とするリーシュマニア検出方法。
[10]前記[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸増幅方法を実施するためのキットであって、鋳型核酸の反復配列内に結合するプライマー1、および、当該鋳型核酸の相補鎖の反復配列内に結合するプライマー2、を包含することを特徴とするキット。
[11]さらに、鎖置換型DNA合成酵素を包含することを特徴とする前記[10]に記載の核酸増幅用キット。
[12]配列番号1で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号2で表される塩基配列からなるプライマー2とを包含し、結核菌の反復配列を特異的に増幅することを特徴とする前記[10]または[11]に記載のキット。
[13]配列番号3で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号4で表される塩基配列からなるプライマー2とを包含し、サルモネラ菌の反復配列を特異的に増幅することを特徴とする前記[10]または[11]に記載のキット。
[14]配列番号5で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号6で表される塩基配列からなるプライマー2とを包含し、リーシュマニアの反復配列を特異的に増幅することを特徴とする前記[10]または[11]に記載のキット。
最初に、図1〜図6を用いて本発明の核酸増幅方法の原理について説明する。本発明の核酸増幅方法は、(a)反復配列を有する鋳型核酸、(b)前記鋳型核酸の反復配列内に結合するプライマー1、(c)前記鋳型核酸の相補鎖の反復配列内に結合するプライマー2、および(d)鎖置換型DNA合成酵素を用い、等温条件で実施可能な核酸増幅方法である。図1〜図6では、鋳型核酸の反復配列はスペーサーを挟む反復構造を有しているが、鋳型核酸の反復配列においてスペーサーは無くてもよい。
(a)反復配列を有する鋳型核酸
(b)前記鋳型核酸の反復配列内に結合するプライマー1
(c)前記鋳型核酸の相補鎖の反復配列内に結合するプライマー2
(d)鎖置換型DNA合成酵素
(e)前記鎖置換型DNA合成酵素の基質となるヌクレオチド
本発明の核酸増幅方法は、反復配列を有する核酸を鋳型核酸とし、当該反復配列内に結合するプライマー1と、鋳型核酸の相補鎖の反復配列内に結合するプライマー2との2種類のプライマーを用いて核酸を増幅する方法であり、等温条件下で実施可能な方法である。生物のゲノム上には、多数の反復配列領域が存在し、その配列の多くは種特異的であることが知られている。したがって、本発明の核酸増幅方法は、特定生物検出の用途に極めて有用である。また、反復配列の種類によっては同一種内の個体あるいは系統ごとにその保持状況が異なるため、特定の系統の検出や個体もしくは株の型別に使用することも可能である。さらに、本発明の核酸増幅方法は、LAMP法に匹敵する反応速度および増幅効率を有し、LAMP法よりも簡便性、コストの点で優れているので、感染症診断、環境衛生検査、食品検査、研究用試薬等の分野で、LAMP法に代わる核酸増幅方法として使用されることが期待できる。具体的には、病原体の検出、アレルゲンの検出、毒素産生生物の混入の検出、有用微生物の検出、生物種の鑑別、生物種内における特定の系統の識別や個体の型別などに好適に利用することができる。
本発明は、上記本発明の核酸増幅方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットは、少なくとも鋳型核酸の反復配列内に結合するプライマー1、および、当該鋳型核酸の相補鎖の反復配列内に結合するプライマー2を包含するものであればよい。特定の生物のゲノム上に存在する反復配列を特異的に増幅可能なプライマー1およびプライマー2をキットに包含させることにより、特定生物(病原体、アレルゲン等を含む)検出用のキットを提供することが可能となる。本発明のキットは、プライマー1およびプライマー2を必須に包含するものであればよく、プライマー1および2以外のキットの構成は特に限定されないが、鎖置換型DNA合成酵素を包含することが好ましい。これら以外にも、必要な試薬や器具等を適宜選択してキットの構成とすればよい。例えば、鎖置換型DNA合成酵素の基質となるヌクレオチド、陽性対照用鋳型核酸、増幅用反応液、反応用チューブ、試料調製用試薬類、取扱説明書等が挙げられる。
結核菌ゲノム上に存在するDR(Direct Repeat)と呼ばれる反復配列をターゲットとして試験を実施した。文献(Mutations in rpoB gene of rifampicin resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis in Japan. Suzuki Y, Katsukawa C, Inoue K, Yin Y, Tasaka H, Ueba N, Makino M. Kansenshogaku Zasshi. 1995 69:413-9.)に記載の方法に従い、日本人の患者から分離された多剤耐性結核菌株からゲノムDNAを取得し、25ng/μLから25fg/μLまで10倍段階希釈したDNA試料を調製した。陰性対照として蒸留水を用いた。使用したプライマーを表1に示した。
DNA合成反応に伴って反応液中のデオキシヌクレオチド3リン酸より放出されるピロリン酸とマグネシウムイオンが結合してピロリン酸マグネシウムの白沈が生じることから、濁度を指標として遺伝子増幅反応の進行を評価した。濁度はテラメックス株式会社製リアルタイム濁度測定装置(LA−200)を用いて経時的に測定した。
反応液中の増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析した結果を図8に示した。その結果70塩基対前後のDNA断片を1単位として、その整数倍の様々な長さの断片が検出された。
実施例1と同じ組成の反応液を用いて、表3に示した21種の非定型抗酸菌(結核菌群菌以外のマイコバクテリウム属菌)による特異性試験を行った。非定型抗酸菌株は、いずれも(公財)結核予防会結核研究所から入手した標準菌株より実施例1と同じ方法によってゲノムDNAを抽出し、2.5ng/μL液を調製して用いた。また、陽性対照として結核菌群菌であるMycobacterium bovis BCG Tokyo株を使用し、同様に抽出DNA溶液を調製した。陰性対照としては蒸留水を用いた。これらの試料液を反応液に2μLずつ添加し、68℃で反応させた。遺伝子増幅反応の進行は実施例1に同じく濁度を指標とし、テラメックス株式会社製リアルタイム濁度測定装置(LA−200)を用いて90分間観察を行った。
実施例1と同じ組成の反応液に、1μLの蛍光目視・検出試薬(栄研化学)を加えて用いた。反応液にDNA試料を2μL添加し、68℃で1時間反応させた。陰性対照として蒸留水2μL添加し、同様に反応させた。
反応終了時の目視観察の結果を図9に示し、紫外線ランプ下での観察結果を図10に示した。図9では、結核菌DNAを含む全てのチューブにおいて溶液は緑黄色を示したが、陰性対象(NC)では溶液の色は橙色であり、50fg(=約10個の結核菌)までの視認による検出が可能であることが示された。また、図10では、結核菌DNAを含む全てのチューブにおいて溶液は蛍光を発しており、50fg(=約10個の結核菌)までの紫外線ランプ下での視認による検出が可能であることが示された。
サルモネラ(Salmonella enterica subsp. enterica serovar enteritidis)ゲノム上に存在する直列型反復配列(Tandem Repeat)をターゲットとして試験を実施した。DNA抽出キット(Qiagen DNA Mini Kit)により、タイ人の患者から分離されたサルモネラ(血清型 Enteritidis)株よりゲノムDNAを取得し、5ng/μLから50fg/μLまで10倍段階希釈したDNA試料を調製した。陰性対照として蒸留水を用いた。使用したプライマーを表4に示した。
リーシュマニア(Leishmania donovani)ゲノム上に存在する直列型反復配列(Tandem Repeat)をターゲットとして試験を実施した。DNA抽出キット(Qiagen DNA Mini Kit)により、ガーナ人の患者から分離されたリーシュマニア(Leishmania donovani)株よりゲノムDNAを取得し、1.8ng/μLから180fg/μLまで10倍段階希釈したDNA試料を調製した。陰性対照として蒸留水を用いた。使用したプライマーを表5に示した。
Claims (15)
- 以下の(a)〜(e)を含む反応液を調製する反応液調製工程と、得られた反応液を用いて核酸合成を行う核酸合成工程とを有し、核酸合成工程の後に核酸の熱変性工程を有しないことを特徴とする核酸増幅方法。
(a)反復配列を有する鋳型核酸
(b)前記鋳型核酸の反復配列内に特異的に結合するプライマー1
(c)前記鋳型核酸の相補鎖の反復配列内に特異的に結合するプライマー2
(d)鎖置換型DNA合成酵素
(e)前記鎖置換型DNA合成酵素の基質となるヌクレオチド - プライマー1とプライマー2とが向き合った間隔に応じたサイズの増幅産物が生成することを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅方法。
- 反復配列が、10〜500塩基対の長さを有し、1000塩基対以内の間隔で3回以上存在することを特徴とする請求項1または2に記載の核酸増幅方法。
- 核酸合成工程を等温で行うことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅方法を用い、目的の病原体が有する反復配列に特異的なプライマー1およびプライマー2による特異的増幅産物の有無を判定することを特徴とする病原体検出方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅方法を用い、目的のアレルゲンを提供する生物が有する反復配列に特異的なプライマー1およびプライマー2による特異的増幅産物の有無を判定することを特徴とするアレルゲン検出方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅方法を用い、目的の生物が有する反復配列に特異的なプライマー1およびプライマー2による特異的増幅産物の有無を判定することを特徴とする生物種鑑別方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅方法において、配列番号1で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号2で表される塩基配列からなるプライマー2とを用いることを特徴とする結核菌検出方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅方法において、配列番号3で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号4で表される塩基配列からなるプライマー2とを用いることを特徴とするサルモネラ菌検出方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅方法において、配列番号5で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号6で表される塩基配列からなるプライマー2とを用いることを特徴とするリーシュマニア検出方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅方法を実施するためのキットであって、
鋳型核酸の反復配列内に特異的に結合するプライマー1、および、当該鋳型核酸の相補鎖の反復配列内に特異的に結合するプライマー2、を包含することを特徴とするキット。 - さらに、鎖置換型DNA合成酵素を包含することを特徴とする請求項11に記載のキット。
- 配列番号1で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号2で表される塩基配列からなるプライマー2とを包含し、結核菌の反復配列を特異的に増幅することを特徴とする請求項11または12に記載のキット。
- 配列番号3で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号4で表される塩基配列からなるプライマー2とを包含し、サルモネラ菌の反復配列を特異的に増幅することを特徴とする請求項11または12に記載のキット。
- 配列番号5で表される塩基配列からなるプライマー1と、配列番号6で表される塩基配列からなるプライマー2とを包含し、リーシュマニアの反復配列を特異的に増幅することを特徴とする請求項11または12に記載のキット。
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