WO2021132596A1

WO2021132596A1 - プライマーセット及びそれを用いて標的核酸を検出する方法

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Publication number: WO2021132596A1
Application number: PCT/JP2020/048826
Authority: WO
Inventors: 重彦宮本
Original assignee: 株式会社カネカ
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-07-01
Also published as: JPWO2021132596A1; US20230067733A1; EP4083202A1; CN114901817A

Abstract

本発明の一以上の実施形態は、固相担体上での検出が可能な標的核酸の増幅産物を調製するための、ポリヌクレオチドタグを付加したプライマーを用いる核酸増幅反応における反応効率の低下を解決する。　本発明の一以上の実施形態は、標的核酸の５'末端の部分ポリヌクレオチドＡ'の相補鎖とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＡを３'末端に含む第１ポリヌクレオチドと、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドである第１ポリヌクレオチドタグとを含む第１プライマー、標的核酸の３'末端の部分ポリヌクレオチドＢ'とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＢを３'末端に含む第２ポリヌクレオチドを含む第２プライマー、並びに、標的核酸の相補鎖に対して、前記第１プライマーの前記ポリヌクレオチドＡと競合的にハイブリダイズする第３ポリヌクレオチドを含み、且つ、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドを含まない第３プライマーを含む、プライマーセットに関する。

Description

プライマーセット及びそれを用いて標的核酸を検出する方法

　本発明の一以上の実施形態は、固相担体上での検出が可能な標的核酸の増幅産物を核酸増幅反応により調製するためのプライマーセットに関する。
　本発明の一以上の実施形態はまた、前記プライマーセットを含む、標的核酸を検出するためのキットに関する。
　本発明の一以上の実施形態はまた、前記プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うことを含む、標的核酸の検出方法に関する。
　本発明の一以上の実施形態はまた、前記プライマーセットを２以上含む、マルチプレックスプライマーセットに関する。

　近年、操作性に優れ、迅速で簡便な標的核酸の検出方法として、クロマトグラフィーに基づく遺伝子検出方法が注目されている（例えば特許文献１参照）。この方法の概要は次の通りである。核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドタグを付加したポリヌクレオチドプライマーを用いる核酸増幅反応により、標的核酸を増幅して、ポリヌクレオチドタグが付加された標的核酸断片を生成する。一方で、クロマトグラフ用のテストストリップに、前記ポリヌクレオチドタグと結合するプローブ（例えば前記ポリヌクレオチドタグの相補ポリヌクレオチド）を予め固定化しておく。そしてこのテストストリップに、タグ付加された標的核酸断片を含む試料をアプライし、毛細管現象を利用してテストストリップ中を展開させ、前記プローブに標的核酸断片を捕捉し、検出する。

　一方で、核酸増幅法として、試料の温度変化のためにサーマルサイクラーを必要とするＰＣＲ法と異なり、等温で目的遺伝子を増幅する等温核酸増幅法が開発されている。等温核酸増幅法は、簡便な装置で実施可能であること、反応時間が短く検出感度が高いことなど、ＰＯＣ（Ｐｏｉｎｔ　ｏｆ　Ｃａｒｅ）検査への応用に適した特性を有する。等温核酸増幅法としては、ＲＰＡ法（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＲＩＡｍｐ法（Ｔａｎｄｅｍ　Ｒｅｐｅａｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＤＡ法（Ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等の方法が知られている。

　ポリヌクレオチドタグを付加したポリヌクレオチドプライマーを等温核酸増幅法に用いることを開示する先行技術文献として特許文献２及び特許文献３が挙げられる。

　特許文献２では、ＬＡＭＰ法に用いる６つのプライマーのうち所定の２つにタグ配列と標識物質結合物質を付加すること、並びに、それを用いて増幅された増幅産物を固相担体上で捕捉して検出することが記載されている。
　特許文献３では、新規な原理に基づく等温核酸増幅法において、プライマーに、核酸増幅反応に対して独立であるタグを付加することが記載されている。

特開２０１６－７３３１２号公報ＷＯ２０１７／４３１１４ＷＯ２０１８／０３８２３２特許第５６８８７０２号公報

（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．ｖｏｌ．８、Ａｒｔｉｃｌｅ１９２）

　本発明者らは、ＰＣＲ法、等温核酸増幅法等の核酸増幅反応において、ポリヌクレオチドタグを付加したプライマーを用いる場合、タグを付加していないプライマーを用いる場合と比較して、核酸増幅反応の効率が低下する場合があることを見出した。また、鎖置換型ポリメラーゼを用いる等温増幅反応において、ポリヌクレオチドタグを付加したプライマーを用いることによる核酸増幅反応の効率の低下が特に顕著となる場合があることを見出した。

　そこで本発明の一以上の実施形態は、固相担体上での検出が可能な標的核酸の増幅産物を調製するための、ポリヌクレオチドタグを付加したプライマーを用いる核酸増幅反応における反応効率の低下を、解決すべき課題とする。

　本明細書では、上記課題を解決するための手段として以下の発明を開示する。
（１）固相担体上での検出が可能な標的核酸の増幅産物を核酸増幅反応により調製するためのプライマーセットであって、
　前記プライマーセットは、第１プライマー、第２プライマー及び第３プライマーを含み、
　前記第１プライマーは、標的核酸の５’末端の部分ポリヌクレオチドＡ’の相補鎖とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＡを３’末端に含む第１ポリヌクレオチドと、前記第１ポリヌクレオチドの５’末端に連結された、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドである第１ポリヌクレオチドタグとを含み、
　前記第２プライマーは、前記標的核酸の３’末端の部分ポリヌクレオチドＢ’とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＢを３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含み、
　前記第３プライマーは、前記標的核酸の相補鎖に対して、前記第１プライマーの前記ポリヌクレオチドＡと競合的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＣを３’末端に含む第３ポリヌクレオチドを含み、且つ、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドを含まない、
前記プライマーセット。
（２）前記第３プライマーの前記ポリヌクレオチドＣは、前記標的核酸の前記部分ポリヌクレオチドＡ’の相補鎖に含まれる５０％以上の塩基数のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能である、（１）に記載のプライマーセット。
（３）前記第１プライマーと前記第３プライマーとの合計量に対する、前記第３プライマーの比率が、１モル％以上、９０モル％以下である、（１）又は（２）に記載のプライマーセット。
（４）前記第１プライマーと前記第３プライマーとの合計量に対する、前記第３プライマーの比率が、２．５モル％以上、７５モル％以下である、（３）に記載のプライマーセット。
（５）前記第１プライマーにおいて、前記第１ポリヌクレオチドタグの３’末端と、前記第１ポリヌクレオチドの５’末端とが、核酸増幅反応を阻害する阻害物質を介して連結されている、（１）～（４）の何れか一に記載のプライマーセット。
（６）前記第２プライマーは、前記第２ポリヌクレオチドに連結された標識物質を更に含む、（１）～（５）の何れか一に記載のプライマーセット。
（７）前記標識物質が、ビオチン、蛍光色素又はハプテンである、（６）に記載のプライマーセット。
（８）前記プライマーセットは、第４プライマーを更に含み、
　前記第２プライマーは、前記第２ポリヌクレオチドの５’末端に連結された、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドである第２ポリヌクレオチドタグを更に含み、
　前記第４プライマーは、前記標的核酸に対して、前記第２プライマーの前記ポリヌクレオチドＢと競合的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＤを３’末端に含む第４ポリヌクレオチドを含み、且つ、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドを含まない、（１）～（５）の何れか一に記載のプライマーセット。
（９）前記第４プライマーの前記ポリヌクレオチドＤは、前記標的核酸の前記部分ポリヌクレオチドＢ’に含まれる５０％以上の塩基数のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能である、（８）に記載のプライマーセット。
（１０）前記第２プライマーと前記第４プライマーとの合計量に対する、前記第４プライマーの比率が、１モル％以上、９０モル％以下である、（８）又は（９）に記載のプライマーセット。
（１１）前記第２プライマーと前記第４プライマーとの合計量に対する、前記第４プライマーの比率が、２．５モル％以上、７５モル％以下である、（１０）に記載のプライマーセット。
（１２）前記第２プライマーにおいて、前記第２ポリヌクレオチドタグの３’末端と、前記第２ポリヌクレオチドの５’末端とが、核酸増幅反応を阻害する阻害物質を介して連結されている、（８）～（１１）の何れか一に記載のプライマーセット。

（１３）（１）～（７）の何れか一に記載のプライマーセットと、固相担体を含む核酸検出デバイスとを含み、
　前記固相担体は、前記第１ポリヌクレオチドタグと結合可能な捕捉物質を含む捕捉物質保持部を含む、
標的核酸を検出するためのキット。
（１４）（８）～（１２）の何れか一に記載のプライマーセットと、固相担体を含む核酸検出デバイスとを含み、
　前記固相担体は、前記第１ポリヌクレオチドタグと結合可能な捕捉物質を含む捕捉物質保持部と、前記第２ポリヌクレオチドタグと結合可能な標識物質を含む標識物質保持部とを含む、
標的核酸を検出するためのキット。
（１５）前記核酸検出デバイスは、核酸増幅産物を含む試料を受容するための試料受容部を更に含む、（１３）又は（１４）に記載のキット。

（１６）標的核酸を含む可能性のある被検物質を、（１）～（１２）の何れか一に記載のプライマーセットを用いた核酸増幅反応に供することを含む核酸増幅工程、及び、
　前記核酸増幅工程にて得られた反応産物中の標的核酸を検出する検出工程を含む、
標的核酸を検出する方法。
（１７）前記検出工程において、前記標的核酸の検出を、固相担体を用いて行う、（１６）に記載の方法。
（１８）前記核酸増幅工程における前記核酸増幅反応が、鎖置換型ポリメラーゼを用いて行われる、（１６）又は（１７）に記載の方法。
（１９）前記核酸増幅工程における前記核酸増幅反応が、ＲＰＡ法、ＴＲＩａｍｐ法、ＬＡＭＰ法又はＨＤＡ法により行われる、（１８）に記載の方法。
（２０）前記核酸増幅工程における前記核酸増幅反応が、ＰＣＲ法により行われる、（１６）又は（１７）に記載の方法。

（２１）（１）～（１２）の何れか一に記載のプライマーセットを２以上含み、
　前記２以上のプライマーセットを用いた核酸増幅反応により増幅される標的核酸が互いに異なる、
　マルチプレックスプライマーセット。

　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１９－２３９０４５号の開示内容を包含する。

　本発明の一以上の実施形態のプライマーセットを用いた核酸増幅反応により、固相担体上での検出が可能な、ポリヌクレオチドタグが付加した標的核酸の増幅産物を効率的に調製することが可能である。

図１－１（ａ）に、標的核酸１と標的核酸１の相補鎖２とを含む被検核酸３、第１プライマー１０、第２プライマー２０、第３プライマー３０の一例を模式的に示す。図１－１（ｂ１）は、被検核酸３を鋳型とする、第１プライマー１０と第２プライマー２０とによる等温核酸増幅反応を模式的に示す。図１－１（ｂ２）は、被検核酸３を鋳型とする、第３プライマー３０と第２プライマー２０とによる等温核酸増幅反応を模式的に示す。図１－２（ｃ１）は、それ以前の核酸増幅反応による増幅産物である標的核酸１と相補鎖２の二本鎖に、第１プライマー１０と第２プライマー２０とがハイブリダイズしてポリメラーゼ伸長反応が開始する反応を示す。図１－２（ｃ２）は、標的核酸１と相補鎖２の二本鎖を鋳型とする、第３プライマー３０と第２プライマー２０とによる等温核酸増幅反応を模式的に示す。図１－２（ｄ）は、５’末端に第１ポリヌクレオチドタグ１２が連結した標的核酸１と、５’末端に標識物質２３が連結した相補鎖２との二本鎖核酸である検出用核酸７を示す。図２（ａ）は、標的核酸１と標的核酸１の相補鎖２とを含む被検核酸３、第１プライマー１０、第２プライマー２０、第３プライマー３０、第４プライマー４０の一例を模式的に示す。図２（ｂ）は、５’末端に第１ポリヌクレオチドタグ１２が連結した標的核酸１と、５’末端に第２ポリヌクレオチドタグ２２が連結した相補鎖２との二本鎖核酸である検出用核酸８を示す。図３はラテラルフロー型核酸検出デバイス７００の模式図を示す。７１：固相担体、７２：コンジュゲートパッド（標識物質保持部）、７３：サンプルパッド（試料受容部）、７４：吸収パッド、７５：基材、７６：捕捉物質保持部。図４は、実施例２においてフォワードプライマー及びリバースプライマーとして、ＤＮＡタグを付加したプライマーと付加していないプライマーの比率が異なるプライマーを用い、段階希釈した異なる濃度の標的核酸の、ＴＲＩＡｍｐ法による核酸増幅を行った結果を示す。図５は、実施例４での、ＤＮＡタグを付加していないフォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマーミックス１、ＤＮＡタグ付加フォワードプライマーとビオチン付加リバースプライマーとのプライマーミックス２、ＤＮＡタグ付加フォワードプライマーとＤＮＡタグを付加していないフォワードプライマーとビオチン付加リバースプライマーとのプライマーミックス３を用いた標的核酸のＴＲＩＡｍｐ法による核酸増幅反応をリアルタイムＰＣＲ装置で測定した結果を示す。

　以下、本発明の一以上の実施形態を詳細に説明する。

＜用語＞
　本発明の一以上の実施形態において核酸及びポリヌクレオチドという用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを指し、典型的にはＤＮＡである。また核酸及びポリヌクレオチドという用語は、塩基数は特に限定するものではなくオリゴヌクレオチドも包含する。本発明の一以上の実施形態において、核酸増幅反応の鋳型となる標的核酸、標的核酸の相補鎖及びポリヌクレオチドは、典型的には、天然のヌクレオチドの重合体である。天然のヌクレオチドとは、天然のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシルの塩基、および、デオキシリボース又はリボースの糖部、および、リン酸基から構成されるヌクレオチドのことであり、各部分が人工的な修飾を受けていないヌクレオチドのことである。天然のヌクレオチドは通常はＤ型ヌクレオチドである。Ｄ型ヌクレオチドとは、糖部分がＤ型のデオキシリボースもしくはリボースからなるヌクレオチドを示す。

　ポリヌクレオチドとは、相対的に長いポリヌクレオチドの一部に含まれる部分ポリヌクレオチドであってもよい。「ポリヌクレオチドＰ１を含むポリヌクレオチドＰ２」或いは「ポリヌクレオチドＰ２がポリヌクレオチドＰ２を含む」という場合、ポリヌクレオチドＰ１がポリヌクレオチドＰ２の全体（すなわちポリヌクレオチドＰ１とポリヌクレオチドＰ２とは一致する）である場合と、ポリヌクレオチドＰ１がポリヌクレオチドＰ２の部分ポリヌクレオチドである場合の両方を包含する。

　本発明の一以上の実施形態において「標的核酸」とは、検出及び／又は増幅しようとする塩基配列を含む核酸、或いは、検出及び／又は増幅しようとする塩基配列の相補塩基配列を含む核酸を指す。標的核酸はその相補鎖とともに二本鎖として存在していてもよい。二本鎖として存在する標的核酸の一方の鎖を指して「標的核酸」と称してもよい。検出しようとする核酸と、その相補鎖とのどちらを「標的核酸」と称しても良い。すなわち、本発明の一以上の実施形態において「標的核酸を検出する」又は「標的核酸を増幅する」とは、標的核酸自体を目的として標的核酸を検出又は増幅することと、標的核酸の相補鎖又は標的核酸と相補鎖との二本鎖核酸の検出又は増幅を目的として、標的核酸、標的核酸の相補鎖、又は、標的核酸と相補鎖との二本鎖核酸を検出又は増幅することの両方を包含する。

　本発明の一以上の実施形態における標的核酸の全長は特に限定されず、通常は２０塩基以上、４０塩基以上、又は１００塩基以上の長さである。標的核酸の全長の上限は特に限定されないが通常は１０００塩基以下、５００塩基以下又は４００塩基以下の長さである。

　本発明の一以上の実施形態において核酸増幅反応の鋳型となる核酸は、標的核酸及び／又はその相補鎖を一部に含む限りＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。通常は、核酸増幅反応の鋳型となる核酸は、標的核酸を少なくとも一部に含むポリヌクレオチド鎖と、該ポリヌクレオチド鎖の相補鎖との、二本鎖ＤＮＡである。

　鋳型となる核酸は、天然のものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。例えば、生体試料から抽出された天然の核酸であってもよく、ＰＣＲ等により増幅されたものや、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等であってもよい。

　本発明の一以上の実施形態において、ポリヌクレオチドＸがポリヌクレオチドＹに「ハイブリダイズする」とは、ポリヌクレオチドＸ（特にＤＮＡ）が、ストリンジェントな条件で、ポリヌクレオチドＹ（特にＤＮＡ）にハイブリダイズし、ポリヌクレオチドＹの塩基配列を有していないポリヌクレオチドにはハイブリダイズしないことを意味する。すなわちハイブリダイズするとは、特異的にハイブリダイズすることを指す。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning, 4th Ed (2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェントな条件を設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーション工程では、ナトリウム濃度が２５～５００ｍＭ、好ましくは２５～３００ｍＭであり、温度が４０～６８℃、好ましくは４０～６５℃である。より具体的には、ハイブリダイゼーションは、１～７×ＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ）、０．０２～３％ＳＤＳ、温度４０℃～６０℃で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行っても良く、洗浄工程は、例えば０．１～２×ＳＳＣ、０．１～０．３％ＳＤＳ、温度５０～６５℃で行うことができる。ただし、後述する第１ポリヌクレオチドタグ（固定化用タグ）と、ポリヌクレオチドが付加された固相担体とのハイブリダイゼーション、及び、後述する第２ポリヌクレオチドタグ（標識用タグ）と、ポリヌクレオチドが付加された標識物質とのハイブリダイゼーションは、ここで挙げたストリンジェントな条件で行う必要はなく、後述する条件で行うことができる。

　ポリヌクレオチドＸがポリヌクレオチドＹにハイブリダイズする場合、ポリヌクレオチドＸ（特にＤＮＡ）とポリヌクレオチドＹ（特にＤＮＡ）とが、核酸増幅反応のアニーリング条件においてハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するのに十分な水素結合を形成することができる組み合わせであればよく、相互に完全な相補塩基配列である必要はない。例えば、ポリヌクレオチドＸの塩基配列（以下の説明で「塩基配列Ｘ」と称する）と、ポリヌクレオチドＹの塩基配列（以下の説明で「塩基配列Ｙ」と称する）との間に、１０塩基中に１以下のミスマッチ、２０塩基中に１以下のミスマッチ、または３０塩基中に１以下のミスマッチなど、いくつかのミスマッチが存在していてもよい。
　ポリヌクレオチドＸがポリヌクレオチドＹにハイブリダイズする場合、通常は以下の（Ａ）～（Ｃ）の１以上の関係を満たす。

　（Ａ）塩基配列Ｘの相補塩基配列と塩基配列Ｙとが同一である。なお、塩基配列Ｘの相補塩基配列と塩基配列Ｙの一方がＤＮＡの塩基配列であり、他方がＲＮＡの塩基配列である場合、一方におけるチミンと他方におけるウラシルとは同一の塩基であるとみなす。
　（Ｂ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘの相補配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入された塩基配列である。
　（Ｃ）塩基配列Ｙが、塩基配列Ｘの相補配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列である。

　前記（Ｂ）において「１若しくは数個」とは好ましくは１～５個、より好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、特に好ましくは１個又は２個を指し、最も好ましくは１個である。

　前記（Ｃ）において、同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。ここで、ギャップがある場合、上記の全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数である。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。

　前記（Ｃ）において、同一性は、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性である。
　前記（Ａ）～（Ｃ）のうち前記（Ａ）が特に好ましい。
　「ポリヌクレオチドＸがポリヌクレオチドＹにハイブリダイズ」は、「塩基配列Ｘが塩基配列Ｙにハイブリダイズする」という表現と同義の意味で用いられる。

　本発明の一以上の実施形態においてプライマーセットを構成するポリヌクレオチドの製造方法は特に限定されず、ポリヌクレオチド合成装置を利用して製造してもよいし、受託合成サービスを利用して製造してもよい。

　本明細書において「核酸増幅反応に対して独立な」ポリヌクレオチドとは、「核酸増幅反応に関与しない」ポリヌクレオチドと言い換えることもできる。「核酸増幅反応に対して独立な」ポリヌクレオチドは、核酸増幅反応の鋳型として利用されないポリヌクレオチドであり、核酸増幅反応により二本鎖化されないポリヌクレオチドである。

＜核酸増幅反応＞
　本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットを用いる核酸増幅反応は、耐熱性ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応であってもよいし、鎖置換型ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応であってもよい。ポリメラーゼは核酸ポリメラーゼを指し、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくはＤＮＡポリメラーゼである。

　耐熱性ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応としてはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が挙げられる。耐熱性ポリメラーゼとしては、市販のＤＮＡポリメラーゼを利用することが可能であり、例えばＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（登録商標）等を好適に利用することができる。また、温度、時間、緩衝液の組成等は、用いるＤＮＡポリメラーゼや、各プライマーの濃度等に応じて、適宜選択することができる。ＰＣＲ法での変性、アニーリング、伸長の各工程の時間、温度、緩衝液組成、基質ヌクレオチド濃度、サイクル数等の各条件は選択したＤＮＡポリメラーゼ、プライマー配列、標的核酸の塩基数、鋳型濃度等の要素を考慮して適宜設定することができる。

　鎖置換型ポリメラーゼは、標的核酸を含む二本鎖核酸の水素結合を自ら解離しつつ、新しいＤＮＡ鎖を合成する酵素であり、例えば、φ２９　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、９６－７　ＤＮＡポリメラーゼ、Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼ及びＣｓａ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ等を挙げることができる。鎖置換型ポリメラーゼは、二本鎖の解離のための熱変性を必要としないため、等温での核酸増幅が可能である。

　鎖置換型ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応としては、等温核酸増幅法が好ましく、ＲＰＡ法（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＲＩＡｍｐ法（Ｔａｎｄｅｍ　Ｒｅｐｅａｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＤＡ法（Ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等の方法が例示できる。

　ＲＰＡ法及びＴＲＩＡｍｐ法では標的核酸を増幅するために少なくとも一対のプライマーセットが用いられる。ここで一対のプライマーセットのうちの１つのプライマーとして、本発明の一以上の実施形態にプライマーセットの第１プライマー及び第３プライマーを用い、別の１つのプライマーとして、本発明の一以上の実施形態にプライマーセットの第２プライマー、或いは、第２プライマー及び第４プライマーを用いることができる。

　ＬＡＭＰ法では、１つの標的核酸を増幅するために４種以上のプライマーが用いられる。ＬＡＭＰ法における４種以上のプライマーのうち１つのプライマーとして、本発明の一以上の実施形態にプライマーセットの第１プライマー及び第３プライマーを用い、別の１つのプライマーとして、本発明の一以上の実施形態にプライマーセットの第２プライマー、或いは、第２プライマー及び第４プライマーを用いることができる。好ましくは、前記１つのプライマー及び前記別の１つのプライマーのうち一方又は両方は、ループプライマーである。

　鎖置換型ポリメラーゼを用いる等温核酸増幅法は、標的核酸を含む鋳型核酸、プライマー、鎖置換型ポリメラーゼ、及び、基質ヌクレオチド、並びに、必要に応じて他の酵素（例えばＲＰＡ法では、他の酵素としてリコンビナーゼ及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を用いる）を共存させ、増幅プライマーが鋳型核酸と安定な塩基対結合を形成することができ、且つ、酵素活性を発揮しうる温度でインキュベートすることで進行する。等温核酸増幅法による核酸増幅反応の温度、緩衝液組成、基質ヌクレオチド濃度、反応時間等の各条件は、選択した鎖置換型ポリメラーゼ、プライマー配列、標的核酸の塩基数、鋳型核酸濃度等の要素を考慮して適宜設定することができる。ＲＰＡ法に用いるリコンビナーゼとしては、例えば、ＵｖｓＸ、ＲｅｃＡおよびそれらのアナログが挙げられる。

＜プライマーセット＞
　第１プライマー、第２プライマー及び第３プライマーを含む本発明の一以上の実施形態のプライマーセットは、分析しようとする被検物質が標的核酸の塩基配列を含む核酸含んでいる場合に、被検物質中の標的核酸を鋳型とする核酸増幅反応により、一端に第１ポリヌクレオチドタグが連結した標的核酸を含む検出用核酸を調製することができるプライマーセットである。
　以下、各プライマーの構造について説明し、続いて、プライマーセットの好ましい実施形態について説明する。

（第１プライマー）
　第１プライマーは、標的核酸の５’末端の部分ポリヌクレオチドＡ’の相補鎖とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＡを３’末端に含む第１ポリヌクレオチドと、前記第１ポリヌクレオチドの５’末端に連結された、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドである第１ポリヌクレオチドタグとを含む。

　部分ポリヌクレオチドＡ’は、標的核酸の５’末端の塩基を含む、連続した複数の塩基からなる、標的核酸の部分ポリヌクレオチドである。部分ポリヌクレオチドＡ’の塩基数は特に限定されないが、例えば８塩基以上、１０塩基以上、１２塩基以上、１５塩基以上、１７塩基以上、又は、２０塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、２７塩基以下、又は、２５塩基以下とすることができる。

　ポリヌクレオチドＡは、部分ポリヌクレオチドＡ’の相補鎖とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであればよい。ポリヌクレオチドＡの好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドＡの３’末端の連続した１塩基以上、好ましくは２塩基以上、好ましくは３塩基以上、より好ましくは５塩基以上、最も好ましくは全体の塩基配列が、部分ポリヌクレオチドＡ’の対応する部分の塩基配列と同一である。ポリヌクレオチドＡの塩基数は特に限定されず、部分ポリヌクレオチドＡ’の塩基数に応じて適宜決定し得るが、例えば８塩基以上、１０塩基以上、１２塩基以上、１５塩基以上、１７塩基以上、又は、２０塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、２７塩基以下、又は、２５塩基以下とすることができる。

　第１ポリヌクレオチドの塩基配列は、その３’末端に、ポリヌクレオチドＡの塩基配列を含んでいればよく、ポリヌクレオチドＡの塩基配列の５’末端側に更に他の塩基配列が付加されたものであってもよいし、ポリヌクレオチドＡの塩基配列のみからなっていてもよい。すなわち、ポリヌクレオチドＡは、第１ポリヌクレオチドの３’末端を含む部分ポリヌクレオチドであってもよいし、第１ポリヌクレオチドの全体であってもよい。第１ポリヌクレオチドの塩基数はポリヌクレオチドＡの塩基数に応じて適宜決定し得るが、例えば８塩基以上、１０塩基以上、１２塩基以上、１５塩基以上、１７塩基以上、又は、２０塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、２７塩基以下、又は、２５塩基以下とすることができる。

　第１プライマーは、第１ポリヌクレオチドと、その５’末端に連結された、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドである第１ポリヌクレオチドタグとを含む。第１ポリヌクレオチドタグは、「第１タグ」又は「固定化用タグ」と称する場合がある。第１ポリヌクレオチドタグに含まれるポリヌクレオチドは、本発明の一以上の実施形態のプライマーセットによる核酸増幅反応の実質的な支障とならないものであれば特に限定されないが、塩基数が例えば５～５０、好ましくは１０～３５であるポリヌクレオチドであり、例えば、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６４（２００７）７８－８５に記載されている塩基配列を含むポリヌクレオチドが好ましいものとして例示できる。

　第１ポリヌクレオチドタグは、後述する固相担体に含まれる捕捉物質と結合することが可能である。第１ポリヌクレオチドタグが付加された標的核酸を含む検出用核酸は、固相担体の捕捉物質保持部に固定され検出することができる。

　第１ポリヌクレオチドの５’末端と第１タグとは、核酸増幅反応での伸長により、第１タグが、プライマーとして機能する第１ポリヌクレオチドと共に二本鎖化されないように連結されている。第１ポリヌクレオチドの５’末端と第１タグの３’末端とが連結されてもよいし、第１ポリヌクレオチドの５’末端と第１タグの５’末端とが連結されていてもよいが、好ましくは、第１ポリヌクレオチドの５’末端と、第１タグの３’末端とが連結されている。

　一以上の実施形態では、第１ポリヌクレオチドの５’末端と、第１タグとは、核酸増幅反応を阻害する阻害物質（以下「スペーサー」と称する場合がある）を介して連結されている。

　別の実施形態では、第１タグは、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドであることができる。この場合、第１ポリヌクレオチドと第１タグとは上記のスペーサーを介さずに直接連結されていてもよい。

　前記スペーサーとしては、核酸増幅反応におけるポリメラーゼ反応の進行を抑制または停止することができ、第１タグの二本鎖化を防ぐものであればよく、例えば、強固なヘアピン構造やシュードノット構造を有する核酸配列、Ｌ型核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）もしくはＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＬＮＡ））、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、下記式Ｉで表されるアゾベンゼン構造を含む二価基、脂肪鎖（アルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖）、５’－５’結合、３’－３’結合のような逆位配列構造を含む二価基等が挙げられるがこれらに限定はされない。このようなスペーサーにより、第１ポリヌクレオチドと第１タグとは、同一方向に連結することができる。すなわち、第１タグの３’末端と、第１ポリヌクレオチドの５’末端とを前記スペーサーを介して連結できる。

　式Ｉで表される二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を接続する場合、該二価基の一方の３’末端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の５’末端のヌクレオチドのリン酸基を指し、他方の５’端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の３’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。
　脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の式（ＩＶ）で表されるスペーサーが挙げられる。
５’－Ｏ－Ｃ_ｍＨ_２ｍ－Ｏ－３’　式（ＩＶ）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｍは１以上４０以下の整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）

　式（ＩＶ）においてｍは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（ＩＶ）中のＨは、置換基により置換されていてもよく、置換基としては、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。置換基としてのアルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１～８であることが好ましく、より好ましくは１～４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。

　また、他のスペーサーとしては、以下の式（Ｖ）で表されるスペーサーが挙げられる。５’－（ＯＣ_ｎＨ_２ｎ）_Ｌ－Ｏ－３’　式（Ｖ）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、Ｌは、１以上の整数であって、（ｎ＋１）×Ｌが４０以下となる整数を表す。Ｈは、置換基により置換されていてもよい。）

　式（Ｖ）において（ｎ＋１）×Ｌは、好ましくは２以上３６以下であり、より好ましくは３以上１６以下である。式（Ｖ）中のＨの置換基は、式（ＩＶ）中の置換基と同様の態様が適用される。
　また、２つのポリヌクレオチド分子が５’－５’結合される場合は上記の式（ＩＶ）又は式（Ｖ）で表される脂肪鎖のスペーサーを用いることができる。

　他の脂肪鎖のスペーサーとしては、例えば、以下の二価基が挙げられる。

　これらの二価基を介して２つのポリヌクレオチド分子を接続する場合、各二価基の一方の端のリン酸基は、一方のポリヌクレオチド分子の３’末端又は５’末端のヌクレオチドのリン酸基を指し、他方の端の酸素原子は、他方のポリヌクレオチド分子の５’末端又は３’末端のヌクレオチドのリン酸基とリン酸エステル結合を形成する。

（第２プライマー）
　第２プライマーは、標的核酸の３’末端の部分ポリヌクレオチドＢ’とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＢを３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含む。

　部分ポリヌクレオチドＢ’は、標的核酸の３’末端の塩基を含む、連続した複数の塩基からなる、標的核酸の部分ポリヌクレオチドである。部分ポリヌクレオチドＢ’の塩基数は特に限定されないが、例えば８塩基以上、１０塩基以上、１２塩基以上、１５塩基以上、１７塩基以上、又は、２０塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、２７塩基以下、又は、２５塩基以下とすることができる。

　ポリヌクレオチドＢは、部分ポリヌクレオチドＢ’とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであればよい。ポリヌクレオチドＢの好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドＢの３’末端の連続した１塩基以上、好ましくは２塩基以上、好ましくは３塩基以上、より好ましくは５塩基以上、最も好ましくは全体の塩基配列が、部分ポリヌクレオチドＢ’の相補鎖の対応する部分の塩基配列と同一である。ポリヌクレオチドＢの塩基数は特に限定されず、部分ポリヌクレオチドＢ’の塩基数に応じて適宜決定し得るが、例えば８塩基以上、１０塩基以上、１２塩基以上、１５塩基以上、１７塩基以上、又は、２０塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、２７塩基以下、又は、２５塩基以下とすることができる。

　第２ポリヌクレオチドの塩基配列は、その３’末端に、ポリヌクレオチドＢの塩基配列を含んでいればよく、ポリヌクレオチドＢの塩基配列の５’末端側に更に他の塩基配列が付加されたものであってもよいし、ポリヌクレオチドＢの塩基配列のみからなっていてもよい。すなわち、ポリヌクレオチドＢは、第２ポリヌクレオチドの３’末端を含む部分ポリヌクレオチドであってもよいし、第２ポリヌクレオチドの全体であってもよい。第２ポリヌクレオチドの塩基数はポリヌクレオチドＢの塩基数に応じて適宜決定し得るが、例えば８塩基以上、１０塩基以上、１２塩基以上、１５塩基以上、１７塩基以上、又は、２０塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、２７塩基以下、又は、２５塩基以下とすることができる。

　本発明の一以上の実施形態では、第２プライマーは、第２ポリヌクレオチドと、第２ポリヌクレオチドに連結された標識物質とを含み得る。この実施形態に係る第２プライマーを含むプライマーセットによる標的核酸の増幅産物である検出用核酸は、一端に第１ポリヌクレオチドタグを含み、他端に標識物質を含む。この検出用核酸は、第１ポリヌクレオチドタグと結合可能な捕捉物質を含む捕捉物質保持部を備える固相担体上に捕捉し、標識物質を指標として検出することができる。

　ここで標識物質としては、核酸増幅反応を阻害しない標識物質であればよい。また、標識物質は、それ自体が検出できる標識物質であってもよいし、二次的な反応により別の検出可能な物質と結合することができる標識物質であってもよい。

　核酸増幅反応を阻害しない標識物質としては、ビオチン、色素、ハプテン、放射性同位体元素含有物質等が挙げられる。色素としては蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のフルオロセイン、シアニン等）が例示できる。ハプテンとしてはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が例示できる。

　ビオチンは、アビジン又はストレプトアビジンが連結された検出可能な物質との二次的な反応により検出できる。ハプテンは、抗体が連結された検出可能な物質との二次的な反応により検出できる。ここでいう検出可能な物質としては、色素、放射性物質のほか、着色粒子、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等）等であってもよく、好ましくは着色粒子である。「着色粒子」とは、金属（例えば、金、銀、銅、白金等）粒子、金属ロッド、着色されたラテックス粒子、色素を包含するシリカナノ粒子等が使用できる。

　第２ポリヌクレオチドへの標識物質の結合位置は核酸増幅反応を阻害しない位置であれば特に限定されないが、通常は、第２ポリヌクレオチドの５’末端である。

　本発明の別の一以上の実施形態では、第２プライマーは、第２ポリヌクレオチドと、第２ポリヌクレオチドの５’末端に連結された、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドである第２ポリヌクレオチドタグを含む。この実施形態に係る第２プライマーを含むプライマーセットによる標的核酸の増幅産物である検出用核酸は、一端に第１ポリヌクレオチドタグを含み、他端に第２ポリヌクレオチドタグを含む。この検出用核酸は、第１ポリヌクレオチドタグと結合可能な捕捉物質を含む捕捉物質保持部を備える固相担体上に捕捉し、第２ポリヌクレオチドタグと結合可能な標識物質と結合させることで、標識物質を指標として検出することができる。第２ポリヌクレオチドタグと結合可能な標識物質を、固相担体の標識物質保持部に予め含ませておき、固相担体に適用された検出用核酸を含む試料が標識物質保持部と接触したときに、前記検出用核酸の第２ポリヌクレオチドタグと標識物質とを結合させることが好ましい。

　第２ポリヌクレオチドタグは、「第２タグ」又は「標識用タグ」と称する場合がある。第２ポリヌクレオチドタグに含まれるポリヌクレオチドは、本発明の一以上の実施形態のプライマーセットによる核酸増幅反応の実質的な支障とならないものであれば特に限定されないが、塩基数が例えば５～５０、好ましくは１０～３５であるポリヌクレオチドであり、例えば、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６４（２００７）７８－８５に記載されている塩基配列を含むポリヌクレオチドが好ましいものとして例示できる。

　第２ポリヌクレオチドの５’末端と第２タグとは、核酸増幅反応での伸長により第２タグが、プライマーとして機能する第２ポリヌクレオチドと共に二本鎖化されないように連結されている。第２ポリヌクレオチドの５’末端と第２タグの３’末端とが連結されてもよいし、第２ポリヌクレオチドの５’末端と第２タグの５’末端とが連結されていてもよいが、好ましくは、第２ポリヌクレオチドの５’末端と第２タグの３’末端とが連結されている。

　一以上の実施形態では、第２ポリヌクレオチドの５’末端と、第２タグとは、核酸増幅反応を阻害する阻害物質（スペーサー）を介して連結されている。第２ポリヌクレオチドの５’末端と第２タグとを連結するスペーサーは、第１ポリヌクレオチドの５’末端と第１タグとを連結するスペーサーとして記載したものと同様の範囲から選択することができる。

　別の実施形態では、第２タグは、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、Ｌ型核酸、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオチドなどの修飾核酸を含むポリヌクレオチドのように、ポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応での伸長により二本鎖化されないポリヌクレオチドであることができる。この場合、第２ポリヌクレオチドと第２タグとは上記のスペーサーを介さずに直接連結されていてもよい。

　第２タグと結合可能な標識物質は、好ましくは、第２タグにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド（例えば、第２タグの塩基配列と相補的な配列を含むポリヌクレオチド）が連結された標識物質である。第２タグを含む検出用核酸と、第２タグにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドが連結された標識物質とのハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションが生じる条件であればよく特に限定はされないが、例えば２０℃～４０℃にて、１０ｍＭ～５０ｍＭのリン酸を含む緩衝液（ｐＨ６～７）中で反応させることにより行うことができる。ハイブリダイゼーション効率を高めるべく、緩衝液にはさらに塩化ナトリウム等の塩を含めることができる。

　第２タグにハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドが連結された標識物質としては、第２ポリヌクレオチドに連結する標識物質として上記の標識物質のほか、着色粒子、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ等）等であってもよく、好ましくは着色粒子である。「着色粒子」とは、金属（例えば、金、銀、銅、白金等）粒子、金属ロッド、着色されたラテックス粒子、色素を包含するシリカナノ粒子等を包含する。

（第３プライマー）
　第３プライマーは、標的核酸の相補鎖に対して、第１プライマーのポリヌクレオチドＡと競合的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＣを３’末端に含む第３ポリヌクレオチドを含み、且つ、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドを含まない。
　第３プライマーは、好ましくは、第３ポリヌクレオチドのみからなる。

　「標的核酸の相補鎖に対して、第１プライマーのポリヌクレオチドＡと競合的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＣ」とは、第１プライマーのポリヌクレオチドＡ及び第３プライマーのポリヌクレオチドＣの一方が標的核酸の相補鎖にハイブリダイズした場合には、他方が同じ標的核酸の相補鎖にハイブリダイズできない関係であることを意味する。例えば、第３プライマーのポリヌクレオチドＣが、標的核酸の部分ポリヌクレオチドＡ’の相補鎖（第１プライマーのポリヌクレオチドＡとハイブリダイズ可能な部分）に含まれる、５０％以上、６０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％の塩基数のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能である場合に、ポリヌクレオチドＣは、標的核酸の相補鎖に対して、第１プライマーのポリヌクレオチドＡと競合的にハイブリダイズ可能である。

　ポリヌクレオチドＣの好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドＣの３’末端の連続した１塩基以上、好ましくは２塩基以上、好ましくは３塩基以上、より好ましくは５塩基以上、最も好ましくは全体の塩基配列が、部分ポリヌクレオチドＡ’の対応する部分の塩基配列と同一である。ポリヌクレオチドＣの塩基数は特に限定されず、部分ポリヌクレオチドＡ’の塩基数に応じて適宜決定し得るが、例えば８塩基以上、１０塩基以上、１２塩基以上、１５塩基以上、１７塩基以上、又は、２０塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、２７塩基以下、又は、２５塩基以下とすることができる。ポリヌクレオチドＣは、特に好ましくは、ポリヌクレオチドＡと同一である。

　第３ポリヌクレオチドの塩基配列は、その３’末端に、ポリヌクレオチドＣの塩基配列を含んでいればよく、ポリヌクレオチドＣの塩基配列の５’末端側に更に他の塩基配列が付加されたものであってもよいし、ポリヌクレオチドＣの塩基配列のみからなっていてもよい。すなわち、ポリヌクレオチドＣは、第３ポリヌクレオチドの３’末端を含む部分ポリヌクレオチドであってもよいし、第３ポリヌクレオチドの全体であってもよい。第３ポリヌクレオチドの塩基数はポリヌクレオチドＣの塩基数に応じて適宜決定し得るが、例えば８塩基以上、１０塩基以上、１２塩基以上、１５塩基以上、１７塩基以上、又は、２０塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、２７塩基以下、又は、２５塩基以下とすることができる。第３ポリヌクレオチドは、特に好ましくは、第１ポリヌクレオチドと同一である。

（プライマーセットを用いた核酸増幅反応の機構）
　本発明の一以上の実施形態のプライマーセットを用いて等温核酸増幅法により標的核酸を増幅する反応の一例において、標的核酸のフォワードプライマーとして、第３プライマーを、第１プライマーとともに併用することの意義を、図１－１及び図１－２を参照して説明する。

　図１－１（ａ）に、標的核酸１と標的核酸１の相補鎖２とを含む被検核酸３、第１プライマー１０、第２プライマー２０、第３プライマー３０の一例を模式的に示す。

　被検核酸３は、二本鎖ＤＮＡであり、その一部に、相互にハイブリダイズした、標的核酸１と、相補鎖２を含む。標的核酸１は５’末端に部分ポリヌクレオチドＡ’４を含み、３’末端に部分ポリヌクレオチドＢ’５を含む。標的核酸１の相補鎖２は、３’末端に、部分ポリヌクレオチドＡ’４の相補鎖６を含む。

　第１プライマー１０は、部分ポリヌクレオチドＡ’４の相補鎖６とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＡを３’末端に含む第１ポリヌクレオチド１１と、第１ポリヌクレオチド１１の５’末端に連結された、核酸増幅反応に対して独立な第１ポリヌクレオチドタグ１２とを含む。

　第２プライマー２０は、部分ポリヌクレオチドＢ’５とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＢを３’末端に含む第２ポリヌクレオチド２１と、標識物質２３とを含む。

　第３プライマー３０は、標的核酸１の相補鎖２に対して、第１プライマー１１の第１ポリヌクレオチド１１に含まれるポリヌクレオチドＡと競合的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＣを３’末端に含む第３ポリヌクレオチド３１を含み、且つ、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドを含まない。

　被検核酸３中の標的核酸１を、上記のプライマーセットと鎖置換型ポリメラーゼを用いる等温核酸増幅法により増幅するとき、初期の反応として、図１－１（ｂ１）に示す、被検核酸３に第１プライマー１０と第２プライマー２０とがハイブリダイズしてポリメラーゼ伸長反応が開始する反応と、図１－１（ｂ２）に示す、被検核酸３に第３プライマー３０と第２プライマー２０とがハイブリダイズしてポリメラーゼ伸長反応が開始する反応が生じると推定される。

　第１プライマー１０は、核酸増幅反応に関与しない第１ポリヌクレオチドタグ１２を含むため、被検核酸３中の標的核酸１の相補鎖２と、図１－１（ｂ１）に示すようにハイブリダイズするには立体障害が大きいと考えられる。しかも、鎖置換型ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応は、二本鎖の被検核酸３の水素結合を高温条件により解離する工程を含まないため、上記の立体障害の影響はＰＣＲ法におけるものより大きいと考えられる。これに対して、第３プライマー３０は、核酸増幅反応に関与しないポリヌクレオチドを含まないため、被検核酸３中の標的核酸１の相補鎖２と、図１－１（ｂ２）に示すようにハイブリダイズし易いと考えられる。このため、核酸増幅反応の初期段階では、図１－１（ｂ２）に示す、第３プライマー３０と第２プライマー２０とによる標的核酸１の増幅反応が進行し易く、図１－１（ｂ１）に示す、第１プライマー１０が関与する増幅反応が進行し難いと考えられる。

　核酸増幅反応が進むと、図１－２（ｃ１）及び図１－２（ｃ２）に示すように、それ以前の核酸増幅反応の増幅産物である断片化された標的核酸１とその相補鎖２とを鋳型とする増幅反応が支配的になる。増幅産物である断片化された標的核酸１とその相補鎖２との二本鎖に対しては、第１プライマー１０の立体障害の影響は小さいため、フォワードプライマーとして第１プライマー１０を利用する図１－２（ｃ１）に示す反応と、第３プライマー３０を利用する図１－２（ｃ２）に示す反応がともに進行する。なお、図示していないが、５’末端に第１ポリヌクレオチドタグ１２が連結した標的核酸１の断片が鋳型となる増幅反応も進行する。

　最終的な増幅産物には、図１－２（ｄ）に示す、５’末端に第１ポリヌクレオチドタグ１２が連結した標的核酸１と、５’末端に標識物質２３が連結した相補鎖２との二本鎖核酸である検出用核酸７が含まれる。この検出用核酸７は、第１ポリヌクレオチドタグ１２と結合する捕捉物質を保持する捕捉物質保持部を含む固相担体に固定することができ、標識物質２３を指標として検出が可能である。なお、図示しないが、増幅産物には、５’末端に第１ポリヌクレオチドタグ１２が連結していない標的核酸１と、５’末端に標識物質２０が連結した相補鎖２との二本鎖核酸も含まれる。

　本発明者らは、本明細書に記載する実験において、フォワードプライマーとして第３プライマー３０を併用せず第１プライマー１０のみを用い、リバースプライマーとして第２プライマー１０を用いたＰＣＲ法及び等温核酸増幅法による標的核酸１の増幅では、反応効率が低いのに対して、フォワードプライマーとして第１プライマー１０と第３プライマー３０を併用した場合には反応効率が顕著に向上することを見出した。この傾向は、ＰＣＲ法よりも、鎖置換型ポリメラーゼを用いる等温核酸増幅法において特に顕著であった。実験結果から、核酸増幅反応の初期の段階では立体障害の大きい第１プライマー１０が関与する増幅反応が進行し難いため、フォワードプライマーとして第１プライマー１０のみを用いる場合は増幅反応の効率が低いという上記の推定の妥当性が裏付けられた。これに対して、第１プライマー１０と第３プライマー３０とを併用する本実施形態では、核酸増幅反応の初期に主に第３プライマー３０と第２プライマー２０とによる標的核酸１の増幅反応が進行し、標的核酸１の生成が進むにつれて第１プライマー１０と第２プライマー２０とによる標的核酸１の増幅反応も進行するため、固相担体で検出可能な検出用核酸７を効率的に得ることができる。

（第１プライマーと第３プライマーとの量比）
　本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットにおいて、第１プライマーと第３プライマーとの量比は特に限定されず適宜調整できる。例えば、第１プライマーと第３プライマーとの合計量に対する第３プライマーの比率は、好ましくは１モル％以上、より好ましくは２．５モル％以上、より好ましくは１０モル％以上、より好ましくは２５モル％以上、最も好ましくは４０モル％以上であり、好ましくは９０モル％以下、より好ましくは７５モル％以下であることができる。

（第４プライマーを更に含むプライマーセットの実施形態）
　上記の通り第２プライマーは、第２ポリヌクレオチドに加えて、第２ポリヌクレオチドの５’末端に連結された、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドである第２ポリヌクレオチドタグを更に含んでいてもよい。リバースプライマーとして、第２ポリヌクレオチドタグを含む第２プライマーのみを用いた場合、フォワードプライマーとして第１プライマーのみを用いた場合と同じく、第２ポリヌクレオチドタグを含む第２プライマーの立体構造が影響して初期の核酸増幅反応の効率が低くなる傾向がある。

　そこでリバースプライマーとして第２ポリヌクレオチドタグを含む第２プライマーを用いる場合には、更に、標的核酸に対して第２プライマーのポリヌクレオチドＢと競合的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＤを３’末端に含む第４ポリヌクレオチドを含み、且つ、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドを含まない第４プライマーを併用することが好ましい。

　第４プライマーは、好ましくは、第４ポリヌクレオチドのみからなる。

　「標的核酸に対して、第２プライマーのポリヌクレオチドＢと競合的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＤ」とは、第２プライマーのポリヌクレオチドＢ及び第４プライマーのポリヌクレオチドＤの一方が標的核酸にハイブリダイズした場合には、他方が同じ標的核酸にハイブリダイズできない関係であることを意味する。例えば、第４プライマーのポリヌクレオチドＤが、標的核酸の部分ポリヌクレオチドＢ’（第２プライマーのポリヌクレオチドＢとハイブリダイズ可能な部分）に含まれる、５０％以上、６０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は１００％の塩基数のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能である場合に、ポリヌクレオチドＤは、標的核酸に対して、第２プライマーのポリヌクレオチドＢと競合的にハイブリダイズ可能である。

　ポリヌクレオチドＤの好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドＤの３’末端の連続した１塩基以上、好ましくは２塩基以上、好ましくは３塩基以上、より好ましくは５塩基以上、最も好ましくは全体の塩基配列が、部分ポリヌクレオチドＢ’の相補鎖の対応する部分の塩基配列と同一である。ポリヌクレオチドＤの塩基数は特に限定されず、部分ポリヌクレオチドＢ’の塩基数に応じて適宜決定し得るが、例えば８塩基以上、１０塩基以上、１２塩基以上、１５塩基以上、１７塩基以上、又は、２０塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、２７塩基以下、又は、２５塩基以下とすることができる。ポリヌクレオチドＤは、特に好ましくは、ポリヌクレオチドＢと同一である。

　第４ポリヌクレオチドの塩基配列は、その３’末端に、ポリヌクレオチドＤの塩基配列を含んでいればよく、ポリヌクレオチドＤの塩基配列の５’末端側に更に他の塩基配列が付加されたものであってもよいし、ポリヌクレオチドＤの塩基配列のみからなっていてもよい。すなわち、ポリヌクレオチドＤは、第４ポリヌクレオチドの３’末端を含む部分ポリヌクレオチドであってもよいし、第４ポリヌクレオチドの全体であってもよい。第４ポリヌクレオチドの塩基数はポリヌクレオチドＤの塩基数に応じて適宜決定し得るが、例えば８塩基以上、１０塩基以上、１２塩基以上、１５塩基以上、１７塩基以上、又は、２０塩基以上とすることができ、４０塩基以下、３０塩基以下、２７塩基以下、又は、２５塩基以下とすることができる。第４ポリヌクレオチドは、特に好ましくは、第２ポリヌクレオチドと同一である。

　この実施形態において第２プライマーと第４プライマーとの量比は特に限定されず適宜調整できる。例えば、第２プライマーと第４プライマーとの合計量に対する第４プライマーの比率は、好ましくは１モル％以上、より好ましくは２．５モル％以上、より好ましくは１０モル％以上、より好ましくは２５モル％以上、最も好ましくは４０モル％以上であり、好ましくは９０モル％以下、より好ましくは７５モル％以下であることができる。

　図２（ａ）に、標的核酸１と標的核酸１の相補鎖２とを含む被検核酸３、第１プライマー１０、第２プライマー２０、第３プライマー３０、第４プライマー４０の一例を模式的に示す。図２に示す例での標的核酸１、相補鎖２、被検核酸３、第１プライマー１０及び第３プライマー３０の特徴は、図１－１及び図１－２に示すものと同一であるから説明を省略する。

　本実施形態では、第２プライマー２０は、部分ポリヌクレオチドＢ’５とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＢを３’末端に含む第２ポリヌクレオチド２１と、第２ポリヌクレオチド２１の５’末端に連結された、核酸増幅反応に対して独立な第２ポリヌクレオチドタグ２２とを含む。

　第４プライマー４０は、標的核酸１に対して、第２プライマー２０の第２ポリヌクレオチド２１に含まれるポリヌクレオチドＢと競合的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＤを３’末端に含む第４ポリヌクレオチド４１を含み、且つ、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドを含まない。

　図２（ａ）に示す実施形態の第１プライマー１０、第２プライマー２０、第３プライマー３０、第４プライマー４０を用いて、被検核酸３を鋳型として核酸増幅反応を行い調製される最終的な増幅産物には、図２（ｂ）に示す、５’末端に第１ポリヌクレオチドタグ１２が連結した標的核酸１と、５’末端に第２ポリヌクレオチドタグ２２が連結した相補鎖２との二本鎖核酸である検出用核酸８が含まれる。この検出用核酸８は、第１ポリヌクレオチドタグ１２と結合可能な捕捉物質を含む捕捉物質保持部を備える固相担体上に捕捉し、第２ポリヌクレオチドタグ２２と結合可能な標識物質と結合させることで、標識物質を指標として検出することができる。

＜標的核酸増幅産物の検出＞
　本発明の一以上の実施形態はまた、
　標的核酸を含む可能性のある被検物質を、本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットを用いた核酸増幅反応に供することを含む核酸増幅工程、及び、
　前記核酸増幅工程にて得られた反応産物中の標的核酸を検出する検出工程を含む、
標的核酸を検出する方法に関する。

　本発明の一以上の実施形態において、被検物質を含む分析対象試料は特に限定されないが、典型的には、飲食品、動物植物等の生体の一部（器官、組織、細胞、血液、体液等）、糞便、微生物、ウイルス等を含む試料が挙げられる。

　分析対象試料から取得された被検物質を核酸増幅反応に利用することができる。被検物質は、分析対象試料から抽出され精製された核酸であってもよいし、分析対象試料から抽出され粗精製された核酸であってもよい。被検物質が核酸である場合、被検核酸と称する場合がある。あるいは、細胞や組織の一部等の比較的高濃度で被検核酸を含む試料であれば、分析対象試料自体をそのまま核酸増幅反応に供することもできる。また分析対象試料から調製されたｃＤＮＡも鋳型として利用可能である。鋳型として用いる被検物質は好ましくはＤＮＡである。
　以下、前記核酸増幅工程及び前記検出工程、並びに必要に応じて行う標識化工程の好ましい実施形態について説明する。

（１．核酸増幅工程）
　核酸増幅工程における核酸増幅反応の好ましい実施形態は既述の通りである。

　核酸増幅工程において本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットを用いることで、被検物質中に標的核酸が含まれている場合、一端に第１ポリヌクレオチドタグが連結した標的核酸を含む検出用核酸を得ることができる。

　２以上の異なる標的核酸を検出する場合には、２以上の標的核酸を増幅できるように設計された２セット以上の前記プライマーセットの組み合わせであるマルチプレックスプライマーセットを用い、分析対象試料から取得された被検物質に対して、核酸増幅反応を行うことができる。マルチプレックスプライマーセットについては別途後述する。

（２．検出工程）
　検出工程は、核酸増幅工程にて得られた反応産物中の標的核酸を検出する工程であり、好ましくは、反応産物を、第１ポリヌクレオチドタグと結合可能な捕捉物質を含む捕捉物質保持部を含む固相担体に接触させ、固相担体の捕捉物質保持部において、前記検出用核酸を検出する工程である。

　核酸増幅工程にて得られた反応産物とは、増幅産物として前記検出用核酸を含んでいる可能性のある、核酸増幅反応の反応液や、該反応液から増幅産物を更に高濃度化した試料等を指す。

　核酸増幅工程に用いるプライマーセットが、標識物質が連結された第２プライマーを含む実施形態である場合には、前記検出用核酸には標識物質が連結しているため、標識物質を指標として検出用核酸を検出することができる。

　核酸増幅工程に用いるプライマーセットが、第２ポリヌクレオチドタグが連結された第２プライマーを含む実施形態である場合には、前記検出用核酸には第２ポリヌクレオチドタグが連結しているため、標識物質を第２ポリヌクレオチドタグに結合させる標識工程を更に行うことができる。

　固相担体は特に限定はされないが、樹脂、金属、多糖類、鉱物等からなるものを利用することができ、メンブレン、フィルム、不織布、プレート、ゲル等の形状とすることができる。好ましくは固相担体は、溶液中の増幅産物や標識物質が展開できるように多孔質構造を有するものである。利用可能な固相担体としては、例えば、ろ紙、ニトロセルロースメンブレン、ポリエーテルスルフォンメンブレン、ナイロンメンブレン、乾燥させた各種ゲル（シリカゲル、アガロースゲル、デキストランゲル、ゼラチンゲル）、シリコン、ガラス、プラスチック等が挙げられる。固相担体の大きさ及び形態は、各種操作や検出に適切なものを適宜選択することができる。

　固相担体の捕捉物質保持部に保持される捕捉物質としては、第１ポリヌクレオチドタグと結合できるものであれば特に限定されないが、好ましくは、第１ポリヌクレオチドタグとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドである。第１ポリヌクレオチドタグとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、特に好ましくは、第１ポリヌクレオチドタグの相補塩基配列を含むポリヌクレオチドである。第１ポリヌクレオチドタグの塩基配列と、捕捉物質として用いるポリヌクレオチドの塩基配列とは容易に改変することができるため、結合特異性を制御することが容易である。例えば、１つの固相担体上で異なる標的核酸を含む複数の検出用核酸を含む試料を展開して検出する場合には、前記複数の検出用核酸毎に、塩基配列の異なる第１ポリヌクレオチドタグが付加されるように第１プライマーを設計するとともに、固相担体上の複数の異なる位置に、各検出用核酸の第１ポリヌクレオチドタグと特異的にハイブリダイズできるポリヌクレオチドを保持する捕捉物質保持部を設けることができる。

　捕捉物質は、化学的結合を介して固相担体の捕捉物質保持部に保持させても良いし、多孔質の固相担体の捕捉物質保持部に含浸させることにより保持させてもよい。

　固相担体の捕捉物質保持部への反応産物の接触は、前記反応産物中に前記検出用核酸が含まれていた場合に前記捕捉物質保持部に前記検出用核酸の第１ポリヌクレオチドタグが結合できるように適宜調節された条件（例えば上述の特異的ハイブリダイゼーションが形成される条件、或いは、ｐＨ５～９程度の緩衝液条件）で行えばよい。

　標的核酸を含む検出用核酸の検出は、固相担体の捕捉物質保持部に捕捉された前記検出用核酸が標識物質を含む場合は、標識物質を検出、好ましくは目視検出することにより行うことができる。

（３．標識工程）
　標識工程は、前記プライマーセットの第２プライマーが第２ポリヌクレオチドタグを含む場合、或いは、前記プライマーセットの第２プライマーが二次的な反応により別の検出可能な物質と結合することができる標識物質を含む場合に行う工程である。この場合、標的核酸を含む検出用核酸には、第２ポリヌクレオチドタグ、又は、標識物質が付加されている。標識工程では、反応産物と標識物質又は検出可能な物質とを接触させることで、標的核酸を含む検出用核酸中の第２ポリヌクレオチドタグに標識物質又は検出可能な物質を結合させる。標識工程は、前記反応産物を固相担体に接触させる前に行ってもよいし、接触させた後に行ってもよいし、接触させると同時に行ってもよい。

　第２ポリヌクレオチドタグと結合可能な標識物質の具体例は、第２プライマーの説明のなかで説明した通りである。

＜本発明の一以上の実施形態のキット＞
　本発明の一以上の実施形態はまた、標的核酸を検出するためのキットであって、
　本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットと、固相担体を含む核酸検出デバイスとを含み、
　前記固相担体は、前記第１ポリヌクレオチドタグと結合可能な捕捉物質を含む捕捉物質保持部を含む、
標的核酸を検出するためのキットに関する。

　前記プライマーセットが、第２ポリヌクレオチドタグが連結された第２プライマーを含む実施形態では、前記固相担体は、前記捕捉物質保持部に加えて、前記第２ポリヌクレオチドタグと結合可能な標識物質を含む標識物質保持部を更に含むことが好ましい。

　本発明の一以上の実施形態のキットにはさらに、ＰＣＲ用緩衝液、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸クロマトグラフィー展開溶液等を含めることができる。
　前記固相担体の特徴は上記の通りである。

　前記固相担体を含む核酸検出デバイスを利用することにより、反応産物中の前記検出用核酸の有無を検出・判別することができ、簡便かつ迅速に結果を得ることができる。

　本発明の一以上の実施形態にて利用可能な核酸検出デバイスの一実施形態の模式図を図３に示すが、核酸検出デバイスは本実施形態に限定されるものではない。なお、以下の説明において、各部材に付された符号は、図３中に示される符号に対応する。

　図３の核酸検出デバイス７００は、基材７５の上に、前記核酸増幅工程の反応産物を受容するための試料受容部であるサンプルパッド７３、標識物質を保持する標識物質保持部であるコンジュゲートパッド７２、前記検出用核酸に含まれる第１ポリヌクレオチドと結合可能な捕捉物質が保持された捕捉物質保持部７６を一部に含む多孔質固相担体７１、及び吸収パッド７４を、互いがこの順に接触するように配置して形成される。固相担体７１の捕捉物質保持部７６は、前記捕捉物質が限局して配置・固定化された部分である。サンプルパッド７３、コンジュゲートパッド７２、固相担体７１及び吸収パッド７４は上記固相担体として利用可能な多孔質構造を有する部材により構成することができる。これらは同一の部材より構成されていてもよいし、異なる部材より構成されていてもよい。基材７５はその上に配置された各種部材を支持することができ、核酸検出デバイス７００の操作を容易にするものであればよく、例えば紙、樹脂、金属、鉱物等からなるものを利用することができる。標識物質を展開溶液中に混合する場合や、標識物質が予め付加された第２プライマーを含む実施形態のプライマーセットによる増幅産物を検出する場合には、コンジュゲートパッド７２は省略することができる。核酸検出デバイス７００一部はコンタミネーションの予防や試験中の固相担体表面からの液体の揮発を防止するため、ポリエステルなどのフィルムで覆われていてもよい。

　核酸増幅工程により得られた核酸増幅反応の反応産物を含む試料をサンプルパッド７３に添加する。前記試料としては核酸増幅反応の反応産物をそのまま添加してもよいし、適当な展開溶液（例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ＳＳＣ緩衝液）と共に添加してもよい。展開溶液には必要に応じて、界面活性剤、塩、タンパク質、核酸等をさらに含めることができる。サンプルパッド７３に添加された試料は、図３中の矢印で示す方向に上流から下流に向かってキャピラリー現象により展開する。

　また別の態様としては、容器（例えば、ＰＣＲチューブ、エッペンチューブ、９６穴プレート等）に収容した前記検出用試料及び／又は展開溶液に、核酸検出デバイス７００のサンプルパッド７３を浸漬させる方法で展開することもできる。

　また、核酸増幅反応の反応産物を含む試料及び／又は展開溶液を保持した容器に浸漬して用いられる核酸検出デバイスでは、図３に図示する核酸検出デバイス７００からサンプルパッド７３を省略することができる。更に、基材７５上の固相担体７１の、吸収パッド７４が配置されていない側の端部が前記試料及び／又は展開溶液に直接浸漬される形態としてもよい。

　第２ポリヌクレオチドタグが付加された第２プライマーを含む実施形態のプライマーセットによる増幅産物を検出する場合には、前記検出用核酸は、第２ポリヌクレオチドタグと結合可能な標識物質が保持された標識物質保持部であるコンジュゲートパッド７２を通過する際に、標識物質と結合して標識される。
　次いで、前記検出用核酸は、固相担体７１を通過する際に、捕捉物質保持部７６の捕捉物質と接触し、捕捉物質保持部７６に捕捉・結合される。

　前記反応産物に前記検出用核酸が存在する場合には、固相担体７１の捕捉物質保持部７６に捕捉・結合された前記検出用核酸に結合した標識物質が検出される。標識物質が目視確認できるものであれば、標識物質に起因して捕捉物質保持部７６が呈色する。当該標識物質の検出（呈色）の有無を指標にして、前記検出用核酸の有無を判別することができ、それに基づいて、被検物質中の標的核酸の有無を判別することができる。

＜マルチプレックスプライマーセット＞
　本発明の別の一以上の実施形態は、
　上述した本発明の一以上の実施形態に係るプライマーセットを２以上含み、
　前記２以上のプライマーセットを用いた核酸増幅反応により増幅される標的核酸が互いに異なる、
　マルチプレックスプライマーセットに関する。

　この実施形態では、２以上のプライマーセットに含まれる第１プライマーの第１ポリヌクレオチドタグは塩基配列が互いに異なり、異なる捕捉物質と結合するものであることが好ましい。

　マルチプレックスプライマーセットを用いた核酸増幅反応による反応産物を検出するための固相担体は、好ましくは、固相担体の異なる位置に、互いに異なる捕捉物質が保持された２以上の捕捉物質保持部を有する。この実施形態では、好ましくは、各捕捉物質は、２以上のプライマーセットに含まれる第１プライマーの第１ポリヌクレオチドタグの１つとハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドである。

＜実施例１＞
（１）プライマーの設計
　ＴＲＩＡｍｐ反応に用いるプライマーは、特許文献４に記載されている結核菌の反復配列を標的核酸としたフォワードプライマーＤＲａ２１（配列番号１）とリバースプライマーＤＲｂ１９（配列番号２）を参考に作製した。

　フォワードプライマーＤＲａ２１の５’末端側に、ポリメラーゼ阻害物質としてアゾベンゼン構造を含む上記式Ｉで表される二価基を介して、核酸クロマトグラフィーのメンブレン捕捉用のＤＮＡタグ配列（Ｔａｇ１）（配列番号３）の３’末端側を連結したＤＲａ２１－Ｔａｇ１を作製した。
　Ｔａｇ１：５’－ＡＴＧＣＴＡＣＣＧＴＡＴＧＣＣＣＡＧＴＧ－３’（配列番号３）

　リバースプライマーＤＲｂ１９の５’末端側に、ポリメラーゼ阻害物質としてアゾベンゼン構造を含む上記式Ｉで表される二価基を介して、金コロイド標識用のＤＮＡタグ配列（Ｔａｇ２）（配列番号４）の３’末端側を連結したＤＲｂ１９-Ｔａｇ２を作製した。Ｔａｇ２：５’－ＧＡＣＡＡＣＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡ－３’（配列番号４）
　使用したプライマーを表１に示す。

（２）オリゴヌクレオチド結合金コロイドの作製
　Ｇｏｌｄ　Ｃｏｌｌｏｉｄ（４０ｎｍ，９．０×１０^１０（粒子数／ｍｌ）、Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏｃｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）と下記の配列番号５で表されるチオール基含有オリゴヌクレオチドを混合し、５０℃で１６時間インキュベートした。６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加し混和後、再度５０℃で４０時間インキュベートした。

　インキュベート後、遠心（６０００ｒｐｍ、１５分間）を行い、上清を除去し、５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）を添加した。このバッファー置換を再度行った。
　調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。
　（チオール基含有オリゴヌクレオチド）：５’－ＴＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＧＴＴＧＴＣ－ＳＨ－３’（配列番号５）

　配列番号５で示すチオール基含有オリゴヌクレオチドは、３’末端のシトシンヌクレオチドの３’位のリン酸基と、ＨＯ－（ＣＨ_２）_ｍ－ＳＨ（ｍは６）で表される化合物の水酸基とがリン酸エステル結合により結合したものである。

（３）タグ捕捉物質を保持するメンブレンの作製
　タグ捕捉物質として、下記の配列番号６で表されるオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を、メルクミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（Ｈｉ－Ｆｌｏｗ１８０）に、ディスペンサーを用いて、展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布した。その後４０℃で３０分間乾燥させることでタグ捕捉物質保持部を備えたメンブレンとした。
　（オリゴヌクレオチドプローブ）：５’－ＣＡＣＴＧＧＧＣＡＴＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴ－３’（配列番号６）

（４）ラテラルフロー型核酸検出デバイスの作製
　作製したラテラルフロー型核酸検出デバイスは、図３の模式図に示される検出デバイスに準拠して作製した。

　すなわち、基材７５としてポリプロピレン製バッキングシート（Ｌｏｈｍａｎｎ社）、コンジュゲートパッド７２として上記（２）で作製したコンジュゲートパッド、捕捉物質保持部７６を備えた固相担体７１として上記（３）で作製したタグ捕捉物質保持部を備えたメンブレン、サンプルパッド７３としてグラスファイバー製のサンプルパッド、吸収パッド７４としてセルロース製の吸収パッドを、それぞれ図７に示すように互いに重なり合わせて貼り合わせ、ラテラルフロー型核酸検出デバイス７００を作製した。

（５）ＴＲＩＡｍｐ反応
　上記（１）に記載のプライマーを用いて、表２に示すプライマーミックスを作製した。

　次に、４０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．２％ツイーン２０、１．８Ｍベタイン、１．６ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸、１２ｍＭ硫酸マグネシウムからなる２ｘＴＲＩＡｍｐ緩衝液ミックスを調製した。

　次に、ＴＲＩＡｍｐ緩衝液ミックス１２．５μＬ、各プライマーミックス２μＬ、８ユニットのＢｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、１万倍希釈のＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩ溶液５μＬにＤＮＡ試料２μＬを添加して、全量２５μＬのＴＲＩＡｍｐ反応液を調製した。ＤＮＡ試料には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ株から抽出、精製したＤＮＡ溶液（１００ｐｇ／μＬ）を使用した。

　反応は、ロシュ社製リアルタイムＰＣＲ装置（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６）を用いて、６８℃で１時間反応を行い、蛍光を経時的に測定した。

　反応後、反応液５μＬをラテラルフロー型の核酸検出デバイスのサンプルパッドに添加し、８０μＬの展開液を添加し、着色ラインを目視にて判定した。非常に強い着色が確認できた場合に「＋＋＋」、着色が確認できた場合に「＋＋」、微弱な着色が確認できた場合に「＋」、着色が確認できなかった場合に「－」とした。
　結果を表３に示す。

　全量ＤＮＡタグを付加したプライマーを使用したプライマーミックス５を用いた場合、ＴＲＩＡｍｐ反応は進行するが、ＤＮＡタグを付加したプライマーを含まないプライマーミックス１と比較して、反応速度の著しい低下を示した。これに対し、プライマーミックス５のプライマーの一部をＤＮＡタグを付加しないプライマーに置き換えたプライマーミックス２～４では、プライマーミックス５と比較して速い反応速度を示した。特に、全体の半量以上を置きかえたプライマーミックス３および２では、陽性判定に要した時間はプライマーミックス５の約半分に短縮された。ＤＮＡタグを付加したプライマーを含むいずれのプライマーミックスでも、ラテラルフロー型の核酸検出デバイスの着色ラインによる検出が可能であった。

　以上の結果から、ＤＮＡタグを付加したプライマーを用いるとＴＲＩＡｍｐ反応は阻害されるが、ここにＤＮＡタグを付加していないプライマーを添加することでその阻害を大幅に改善可能であることが示された。

＜実施例２＞
　実施例１にて、ＤＮＡタグを付加したプライマーを用いるとＴＲＩＡｍｐ反応の反応速度は低下することを示した。さらに、ＤＮＡタグを付加したプライマーの一部をＤＮＡタグを付加していないプライマーに置換することで速度低下を抑制できることを示した。しかし、実施例１は、増幅産物量をＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩの蛍光にて測定しているため、実際に核酸検出デバイスで検出可能なＤＮＡタグが付加された増幅産物量が増加しているかは確認できていない。

　そこで、ＤＮＡタグを付加したプライマーにＤＮＡタグを付加していないプライマーを種々の割合で混合し、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ株から抽出したＤＮＡの段階希釈液を用いた検出下限試験を行った。プライマーは実施例１と同じものを使用した。標的核酸を含む前記ＤＮＡ試料を添加しない実験をネガティブコントロール実験（Ｎｅｇａ）とした。プライマーミックスの組成を表４に示す。比較例として、全量ＤＮＡタグを付加したプライマーからなるプライマーミックス（比較例１）を調製した。

　ＴＲＩＡｍｐ反応は、ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩを添加しない以外は、実施例１と同様に実施した。反応後、反応液５μＬをラテラルフロー型の核酸検出デバイスのサンプルパッドに添加し、８０μＬの展開液を添加し、着色ラインを目視にて判定した。非常に強い着色が確認できた場合に「＋＋＋」、着色が確認できた場合に「＋＋」、微弱な着色が確認できた場合に「＋」、着色が確認できなかった場合に「－」とした。

　結果を図４及び表５に示す。ＤＮＡタグを付加したプライマーのみからなるプライマーミックスを使用した比較例では、５０ｐｇまで検出可能であったのに対し、ＤＮＡタグを付加していないプライマーを含有するプライマーミックス１は５ｐｇ、プライマーミックス２は５００ｆｇ、プライマーミックス３～５では５ｆｇまで検出することが可能であった。タグ付加率２５％以下のプライマーミックス４及び５では、着色ラインが薄くなる傾向を認めた。タグ付加率５０％のプライマーミックス３が、検出下限と着色ラインの濃さの観点で最も良好な性能を示した。

＜比較例２＞
　ＤＮＡタグを付加していないフォワードプライマーＤＲａ２１（配列番号１）及びリバースプライマーＤＲｂ１９（配列番号２）からなるプライマーミックスを調製し、実施例１と同様、リアルタイムＰＣＲ装置にて反応と蛍光測定を実施した。ＤＮＡ試料には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ　ＢＣＧ株から抽出したＤＮＡの段階希釈液を用いた。標的核酸を含む前記ＤＮＡ試料を添加しない実験をネガティブコントロール実験（Ｎｅｇａ）とした。

　結果を表６に示す。ＤＮＡタグを付加していないプライマーでの検出下限は１００ｆｇであった。上記実施例２のプライマーミックス３～５における検出下限は５ｆｇである。本発明の一以上の実施形態の構成のプライマーミックスを用いることで、リアルタイムＰＣＲ装置を使用することなく従来法より高感度検出が可能であることが示された。

＜実施例３＞
　表７のプライマーミックスを用いた以外は、実施例２と同様に実施した。

　結果を表８に示す。タグ含有率（全プライマー量に占めるＤＮＡタグを付加したプライマーの割合）９９％のプライマーミックス１は、比較例３と同等の検出下限を示したが、検出下限濃度である５ｐのライン着色強度の向上を認めた。タグ含有率９７．５％および９５％のプライマーミックスでは、５００ｆｇの検出が可能であり、検出下限性能の向上を示した。

＜実施例４＞
　ＤＲｂ１９－Ｔａｇ２の代わりに、ＤＲｂ１９プライマーの５’末端に定法により、標識物質としてビオチンを修飾したＤＲｂ１９－ｂｉｏｔｉｎを使用し、表９に示すプライマーミックスを作製した。また、ラテラルフロー型核酸検出デバイスのコンジュゲートパッドの作製には、ビオチンに結合する検出可能な物質としてストレプトアビジン結合金コロイドを使用した。それ以外は、実施例１と同様の方法で実施した。

　リアルタイムＰＣＲ装置での蛍光測定の結果を図５に示す。ＤＮＡタグを付加しないフォワードプライマーを含むプライマーミックス１と比べて、フォワードプライマーの全量を、ＤＮＡタグを付加したプライマーに置き換えたプライマーミックス２では、増幅の立ち上がりが大幅に遅れた。フォワードプライマーの半分をＤＮＡタグを付加しないプライマーに置き換えたプライマーミックス３では、増幅速度が大幅に改善した。

＜実施例５＞
　実施例４のプライマーミックス２及び３を用いて、実施例３と同様の検出下限試験を実施した。

　結果を表１０に示す。タグ付加率１００％のプライマーミックス２の検出下限が５００ｆｇであるのに対し、タグ付加率５０％のプライマーミックス３は５０ｆｇを検出可能であった。この実験により、本発明の一以上の実施形態の構成のプライマーミックスの使用による増感効果を確認することができた。

＜実施例６＞
　本発明の一以上の実施形態の構成のプライマーミックスによる増感効果がＲＰＡ法でも得られるか検証を実施した。

（１）プライマーの設計
　ＲＰＡ反応に用いるプライマーとして、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのｆｔｓＹ遺伝子を特異的に結合するフォワードプライマーｆｔｓＹ－１Ｆ（配列番号７）とリバースプライマーｆｔｓＹ－１Ｒ（配列番号８）を設計した。

　フォワードプライマーｆｔｓＹ－１Ｆの５’末端側に、ポリメラーゼ阻害物質としてアゾベンゼン構造を含む上記式Ｉで表される二価基を介して、核酸クロマトグラフィーのメンブレン捕捉用のＤＮＡタグ配列（Ｔａｇ３）の３’末端側を連結したｆｔｓＹ－１Ｆ－Ｔａｇ３を作製した。
　Ｔａｇ３：５’－ＴＣＧＡＧＴＧＡＣＡＧＣＴＡＡＴＧＴＧＴＧＡＴ－３’（配列番号９）

　リバースプライマーｆｔｓＹ－１Ｒの５’末端側に、ポリメラーゼ阻害物質としてアゾベンゼン構造を含む上記式Ｉで表される二価基を介して、金コロイド標識用のＤＮＡタグ配列（Ｔａｇ２）（配列番号４）を連結したｆｔｓＹ－１Ｒ-Ｔａｇ２を作製した。
　実施例６で使用したプライマーを表１１に示す。

（２）タグ捕捉物質を保持するメンブレンの作製
　タグ捕捉物質として、下記の配列番号１０で表されるオリゴヌクレオチドプローブを含む溶液を、メルクミリポア社製ニトロセルロースメンブレン（Ｈｉ－Ｆｌｏｗ１８０）に、ディスペンサーを用いて、展開方向と直交する幅１ｍｍのライン状に塗布した。その後４０℃で３０分間乾燥させることでタグ捕捉物質保持部を備えたメンブレンとした。
　（オリゴヌクレオチドプローブ）：５’－ＡＴＣＡＣＡＣＡＴＴＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＣＧＡ－３’（配列番号１０）

（３）ラテラルフロー型核酸検出デバイスの作製
　上記（２）で調製したタグ捕捉物質保持部を備えたメンブレンを固相担体７１として用いた以外は、実施例１と同様の方法でラテラルフロー型核酸検出デバイスを作製した。

（４）ＲＰＡ反応
　ＲＰＡ反応はＴｗｉｓｔＤｘ社のＴｗｉｓｔＡｍｐ　Ｂａｓｉｃキットを使用して実施した。プライマーミックスには、ＤＮＡタグを付加したプライマーと付加していないプライマーを表１２に示す割合で混合したものを使用した。また、比較例４として、ＤＮＡタグを付加したプライマーのみからなるプライマーミックスを作製した。

　プライマーミックス４．８μＬ、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｆｒｅｅ　Ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ２９．５μＬ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２５９２３）から抽出したＤＮＡの段階希釈液（５ｎｇ／μＬ～５０ｆｇ／μＬ）２μＬ、滅菌蒸留水１１．２μＬを混合し、再溶解液を調製した。再溶解液を凍結乾燥ＲＰＡ反応ペレットが入ったチューブに添加し、試薬を再溶解した。その後、２８０ｍＭの酢酸マグネシウム２．５μＬを添加、混合後、３７℃で２０分間反応を行った。

　反応後、反応液５μＬをラテラルフロー型の核酸検出デバイスのサンプルパッドに添加し、８０μＬの展開液を添加し、着色ラインを目視にて判定した。非常に強い着色が確認できた場合に「＋＋＋」、着色が確認できた場合に「＋＋」、微弱な着色が確認できた場合に「＋」、着色が確認できなかった場合に「－」とした。

　結果を表１３に示す。ＤＮＡタグを付加したプライマーのみからなるプライマーミックスを使用した比較例４の検出下限は１０ｎｇであったのに対し、プライマーミックス１～３では１ｐｇ～１０ｐｇまで検出が可能であり、ＤＮＡタグを付加していないプライマーの共存による検出下限性能の向上が確認できた。

＜実施例７＞
　本発明の一以上の実施形態の構成のプライマーミックスによる増感効果がＬＡＭＰ法でも得られるか検証を実施した。

（１）プライマーの設計
　ＬＡＭＰ反応に用いるプライマーは、非特許文献１（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．ｖｏｌ．８、Ａｒｔｉｃｌｅ１９２）記載のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのＮｕｃ遺伝子を増幅するプライマーセットを使用した。使用したプライマーを表１４に示す。

　ループプライマーＳａｕ－ＬＦ（配列番号１５）の５’末端側に、ポリメラーゼ阻害物質としてアゾベンゼン構造を含む上記式Ｉで表される二価基を介して、核酸クロマトグラフィーのメンブレン捕捉用のＤＮＡタグ配列（Ｔａｇ１）（配列番号３）の３’末端側を連結したＳａｕ－ＬＦ－Ｔａｇ１を作製した。

　ループプライマーＳａｕ－ＬＢ（配列番号１６）の５’末端側に、ポリメラーゼ阻害物質としてアゾベンゼン構造を含む上記式Ｉで表される二価基を介して、金コロイド標識用のＤＮＡタグ配列（Ｔａｇ２）（配列番号４）の３’末端側を連結したＳａｕ-Ｔａｇ２を作製した。

（２）ＬＡＭＰ反応
　２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％ツイーン２０、０．９Ｍベタイン、０．８ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸、６ｍＭ硫酸マグネシウム、８ユニットのＢｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、１．６μＭのＳａｕ－ＦＩＰ、１．６μＭのＳａｕ－ＢＩＰ、０．８μＭのＳａｕ－Ｆ３、０．８μＭのＳａｕ－Ｂ３、０．４μＭのＳａｕ－ＬＦ、０．４μＭのＳａｕ－ＬＢ、０．４μＭのＳａｕ－ＬＦ－Ｔａｇ１、０．４μＭのＳａｕ－ＬＢ－Ｔａｇ２を含む組成の反応液を用いた。比較例として、上記反応液のループプライマーとして、０．８μＭのＳａｕ－ＬＦおよび０．８μＭのＳａｕ－ＬＢを用いた反応液を作製した。この反応液に、ＤＮＡ試料を２μＬ添加して、６２℃で１時間反応させた。

　反応後、反応液５μＬを実施例２と同様のラテラルフロー型の核酸検出デバイスのサンプルパッドに添加し、８０μＬの展開液を添加した。乾燥後、浜松ホトニクス社製のイムノクロマトリーダーにてラインの着色強度を測定した。

　ループプライマー全量をＤＮＡタグを付加したプライマーとした比較例のライン着色強度は２５ｍＡｂｓであったのに対し、ループプライマーの半量をＤＮＡタグを付加していないプライマーに置き換えた条件では５０ｍＡｂｓとタグ付加産物量の増加が確認できた。

＜実施例８＞
　本発明の一以上の実施形態の構成のプライマーミックスによる増感効果がＰＣＲ法でも得られるか検証を実施した。

（１）ＰＣＲ反応
　ＰＣＲ反応の検証には、実施例６と同じプライマーを使用し、表１５に示すプライマーミックスを調製した。比較例５としてＤＮＡタグを付加したプライマーのみからなるプライマーミックスを調製した。

　２ｘＨＳＴａｑ　ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｍｉｘ　ＵＮＧ　ｐｌｕｓ（タカラバイオ）のマニュアルに従い反応液を調製した。１０μＬの２ｘＨＳＴａｑ　ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｍｉｘに１μＭのプライマーミックスを２μＬ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓから抽出したＤＮＡ試料２μＬ（１００ｐｇ／μＬ～１０ｆｇ／μＬ）、滅菌蒸留水６μＬを混合し、２０μＬのＰＣＲ反応液を調製した。

　ＰＣＲ反応液をサーマルサイクラー（Ｂｉｏｒ社、ＬｉｆｅＥｃｏ）にセットし、９４℃で３分間反応後、９４℃－５秒／５８℃－５秒／７２℃－１５秒のサイクルを３５回行った。

　結果を表１６に示す。ＤＮＡタグを付加したプライマーのみからなるプライマーミックスを使用した比較例５の検出下限は２０ｐｇであったのに対し、プライマーミックス１～３ではいずれも２ｐｇまで検出が可能であり、ＤＮＡタグを付加しないプライマーの共存による検出下限性能の向上を認めた。

　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims

　固相担体上での検出が可能な標的核酸の増幅産物を核酸増幅反応により調製するためのプライマーセットであって、
　前記プライマーセットは、第１プライマー、第２プライマー及び第３プライマーを含み、
　前記第１プライマーは、標的核酸の５’末端の部分ポリヌクレオチドＡ’の相補鎖とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＡを３’末端に含む第１ポリヌクレオチドと、前記第１ポリヌクレオチドの５’末端に連結された、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドである第１ポリヌクレオチドタグとを含み、
　前記第２プライマーは、前記標的核酸の３’末端の部分ポリヌクレオチドＢ’とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＢを３’末端に含む第２ポリヌクレオチドを含み、
　前記第３プライマーは、前記標的核酸の相補鎖に対して、前記第１プライマーの前記ポリヌクレオチドＡと競合的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＣを３’末端に含む第３ポリヌクレオチドを含み、且つ、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドを含まない、
前記プライマーセット。
　前記第３プライマーの前記ポリヌクレオチドＣは、前記標的核酸の前記部分ポリヌクレオチドＡ’の相補鎖に含まれる５０％以上の塩基数のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能である、請求項１に記載のプライマーセット。
　前記第１プライマーと前記第３プライマーとの合計量に対する、前記第３プライマーの比率が、１モル％以上、９０モル％以下である、請求項１又は２に記載のプライマーセット。
　前記第１プライマーと前記第３プライマーとの合計量に対する、前記第３プライマーの比率が、２．５モル％以上、７５モル％以下である、請求項３に記載のプライマーセット。
　前記第２プライマーは、前記第２ポリヌクレオチドに連結された標識物質を更に含む、請求項１～４の何れか一項に記載のプライマーセット。
　前記プライマーセットは、第４プライマーを更に含み、
　前記第２プライマーは、前記第２ポリヌクレオチドの５’末端に連結された、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドである第２ポリヌクレオチドタグを更に含み、
　前記第４プライマーは、前記標的核酸に対して、前記第２プライマーの前記ポリヌクレオチドＢと競合的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドＤを３’末端に含む第４ポリヌクレオチドを含み、且つ、核酸増幅反応に対して独立なポリヌクレオチドを含まない、請求項１～４の何れか一項に記載のプライマーセット。
　前記第４プライマーの前記ポリヌクレオチドＤは、前記標的核酸の前記部分ポリヌクレオチドＢ’に含まれる５０％以上の塩基数のポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能である、請求項６に記載のプライマーセット。
　前記第２プライマーと前記第４プライマーとの合計量に対する、前記第４プライマーの比率が、１モル％以上、９０モル％以下である、請求項６又は７に記載のプライマーセット。
　前記第２プライマーと前記第４プライマーとの合計量に対する、前記第４プライマーの比率が、２．５モル％以上、７５モル％以下である、請求項８に記載のプライマーセット。
　請求項１～５の何れか一項に記載のプライマーセットと、固相担体を含む核酸検出デバイスとを含み、
　前記固相担体は、前記第１ポリヌクレオチドタグと結合可能な捕捉物質を含む捕捉物質保持部を含む、
標的核酸を検出するためのキット。
　請求項６～９の何れか一項に記載のプライマーセットと、固相担体を含む核酸検出デバイスとを含み、
　前記固相担体は、前記第１ポリヌクレオチドタグと結合可能な捕捉物質を含む捕捉物質保持部と、前記第２ポリヌクレオチドタグと結合可能な標識物質を含む標識物質保持部とを含む、
標的核酸を検出するためのキット。
　標的核酸を含む可能性のある被検物質を、請求項１～９の何れか一項に記載のプライマーセットを用いた核酸増幅反応に供することを含む核酸増幅工程、及び、
　前記核酸増幅工程にて得られた反応産物中の標的核酸を検出する検出工程を含む、
標的核酸を検出する方法。
　前記検出工程において、前記標的核酸の検出を、固相担体を用いて行う、請求項１２に記載の方法。
　前記核酸増幅工程における前記核酸増幅反応が、鎖置換型ポリメラーゼを用いて行われる、請求項１２又は１３に記載の方法。
　請求項１～９の何れか一項に記載のプライマーセットを２以上含み、
　前記２以上のプライマーセットを用いた核酸増幅反応により増幅される標的核酸が互いに異なる、
　マルチプレックスプライマーセット。