JP2001519172A - 多重置換増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
ラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、自己維持(self
−sustained)配列複製(3SR)、核酸配列に基づく増幅(NASB
A)、鎖置換増幅(SDA)、およびQβレプリカーゼでの増幅(Birken
meyerおよびMushahwar, J. Virological Me
thods, 35:117−126 (1991); Landegren,
Trends Genetics, 9:199−202 (1993))が
含まれる。
、その結果そのプライマーで開始されるDNA複製が目的の核酸配列を複製する
ような2つのプライマーの使用を含む。変性工程を使用してテンプレート鎖から
複製された鎖を分離することによって、同じプライマーを用いた別の回の複製は
、目的の核酸配列の幾何級数的な増幅をもたらし得る。PCR増幅は、増幅反応
が連続的に進行し得ず、そして一連の反応条件において核酸サンプルを多重サイ
クルに供することによって実施されねばならないという欠点を有する。
は、同じPCR反応においてある生物のゲノム全体を増幅するランダムまたは部
分的にランダムなプライマーの使用を包含する。この技術は、プライマー対が中
程度の間隔でゲノムDNAの全体にわたってハイブリダイズするような、ランダ
ムまたは部分的にランダムな配列の充分数のプライマーを有することに依存する
。次いで、そのプライマーで開始した複製は、別のプライマーがハイブリダイズ
し得る複製鎖重複部位を生じ得る。このゲノムサンプルを多重重複サイクルに供
することによって、そのゲノム配列が増幅される。ゲノム全体PCRは、PCR
の他の形態と同じ欠点を有する。
g)である。ここで、目的は、生物学的サンプルにおける多くの異なる分子種の
相対濃度を決定することである。目的のRNAのいくつかは、比較的低濃度で存
在し、そして分析前にそれらを増幅することが所望される。ポリメラーゼ連鎖反
応を使用してそれらを増幅することは不可能である。なぜなら、このmRNA混
合物は、代表的に、5,000〜20,000の異なる分子種からなる複合物で
あるからである。ポリメラーゼ連鎖反応は、異なる分子種が異なる速度で増幅し
、mRNAの相対濃度を歪めるという欠点を有する。
の手順が記載されている。例えば、Lockhartら、Nature Bio
technology 14:1675−1680(1996)において、二本
鎖cDNAが強力なRNAポリメラーゼプロモーターが各cDNAの末端に取り
込まれるような様式において合成された。次いで、このプロモーター配列を使用
してcDNAを転写し、各cDNA分子について約100〜150RNAコピー
が生成した。この弱い増幅系は、少なくとも100,000細胞を含む生物学的
サンプルのRNAプロフィール作成を可能にした。しかし、非常に少数の細胞を
含むサンプルのプロフィール分析を可能にするより強力な増幅方法についての必
要性が存在する。
466 520 A1、およびPCT出願WO 95/25180、およびWO
95/03430に記載されている。
くの増幅がもたらされる増幅方法に対する必要性が存在する。
増幅する方法を提供することである。
の高度に複雑な核酸サンプルを増幅する方法を提供することである。
であり、ここで多重コピーの標的核酸配列が単回増幅サイクルにおいて生じる。
増幅する方法を提供することである。
するためのキットを提供することである。
の高度に複雑な核酸サンプルを増幅するためのキットを提供することである。
多重プライマーによる核酸配列の鎖置換増幅に基づく。多重鎖置換増幅(MSD
A)と称される、この方法の1つの好ましい形態において、2セットのプライマ
ー、右のセットおよび左のセットが使用される。右のセットのプライマーにおけ
るプライマーは各々が標的ヌクレオチド配列の一つの側に隣接するヌクレオチド
配列に相補的な部分を有し、そして左のセットのプライマーにおけるプライマー
は各々がその標的ヌクレオチド配列の他方の側に隣接するヌクレオチド配列に相
補的な部分を有する。右のセットにおけるプライマーは、その標的ヌクレオチド
配列を含む核酸分子の一つの側に相補的であり、そして左のセットにおけるプラ
イマーは反対の鎖に相補的である。両方のセットにおけるプライマーの5’末端
は、そのプライマーが核酸分子における隣接配列にハイブリダイズする場合、目
的の核酸配列から遠位にある。好ましくは、各セットの各メンバーは、その標的
ヌクレオチド配列に隣接する別個でかつ重複していないヌクレオチド配列に対し
て相補的な部分を有する。各プライマーにて開始する複製およびその標的核酸配
列にわたって継続することによって増幅が進行する。この方法の主要な特徴は、
複製の間の介在プライマーの置換である。一旦右のセットのプライマーから伸長
する核酸鎖が、左のセットのプライマーがハイブリダイズする核酸分子の領域に
達し、そして逆もそうなると、別の回のプライミングおよび複製が起こる。これ
は、その標的核酸配列のネスティドセットの複数コピーが短時間の期間で合成さ
れることを可能にする。右のセットおよび左のセットにおける充分な数のプライ
マーを用いることによって、数回のみの複製が、目的の核酸配列の数十万ものコ
ピーを産生するために必要とされる。この開示された方法は、ポリメラーゼ連鎖
反応に対して利点を有する。なぜなら、それは、等温条件下で実施され得るから
である。サーマルサイクルは必要とされない。なぜなら、伸長鎖(または、適合
可能な鎖置換タンパク質)の頭部でのポリメラーゼがそれの先の鎖を置換し、そ
れによってハイブリダイゼーションが利用可能になるからである。多重鎖置換増
幅の他の利点は、非常に長い核酸セグメント(50キロ塩基の程度で)を増幅す
る能力、およびより短いセグメント(10キロ塩基以下)を迅速に増幅する能力
を包含する。多重鎖置換増幅において、意図されない部位での単一のプライミン
グ事象は、これらの部位での人為的増幅をもたらさない(なぜなら、意図された
部位での増幅が意図されない部位での単一の鎖複製を迅速に凌駕するからである
。)。
において、プライマーのランダムなセットを使用して、ゲノム核酸のサンプル(
または高度に複雑な核酸の別のサンプル)をランダムにプライミングする。ラン
ダムまたは部分的にランダムな配列の充分に大きなセットのプライマーを選択す
ることによって、そのセットにおけるプライマーは、そのサンプルにおける核酸
にわたって分布する核酸配列に対して、総合的に、そしてランダムに相補的とな
る。各プライマーにて高度に処理能力のあるポリメラーゼ開始を伴う複製および
自然に終結するまで継続することによって増幅が進行する。この方法の主要な特
徴は、ポリメラーゼによる複製の間の介在プライマーの置換である。この方法で
、ゲノム全体の多重重複コピーが短時間で合成され得る。この方法は、ポリメラ
ーゼ連鎖反応よりも利点を有する。なぜなら、これは、等温条件下で行われ得る
からである。ゲノム全体鎖置換増幅の他の利点は、ゲノム全体PCRより高レベ
ルの(5倍まで高い)増幅を含み、増幅はPCRよりもあまり配列依存的ではな
く、そしてPCRに伴って生じ得るような再アニール人為産物も遺伝子シャフリ
ング人為産物も存在しない(なぜなら、変性および再アニールのサイクルが存在
しないからである)。
ましい形態において、DNAのフラグメントが、好ましくはリンカーとまず一緒
に連結される。次いで、連結されたDNAは、適切なプライマーを用いる鎖置換
合成によって増幅される。ランダムなセットのプライマーを使用して、ゲノム全
体増幅と類似した様式においてDNAコンカテマーの合成をランダムにプライミ
ングし得る。ゲノム全体増幅におけるように、ランダムまたは部分的にランダム
な配列の充分大きなセットのプライマーを選択することによって、そのセットに
おけるプライマーは、連結DNAにわたって分布する核酸配列に対して総合的に
かつランダムに相補的となる。リンカーを使用してDNAフラグメントを連結す
る場合、リンカー配列に対して相補的なプライマーを使用して、そのコンカテマ
ーを増幅し得る。そのリンカーから、連結されたDNAの一区画を通じて、次の
リンカーへと合成が進行し、そしてそれを超えて継続する。リンカー領域が複製
されるにつれて、DNA合成のための新しいプライミング部位が作製される。こ
のようにして、連結DNAサンプル全体の多重重複コピーが短時間に合成され得
る。
知でありかつ確立されている用途のためのものであり得る。例えば、増幅された
配列は、蛍光標識の検出、酵素連結検出系、抗体媒介標識検出、および放射標識
の検出のような核酸についての従来の検出系のいずれかを用いて検出され得る。
開示される方法の主要な特徴は、増幅がサイクルではなく連続的等温複製におい
て生じることである。これによって、増幅があまり複雑でなく、そして出力にお
いてはるかにより一貫することとなる。鎖置換によって、単回連続的等温反応に
おいて、核酸配列またはサンプルの多重コピーの迅速な生成が可能になる。次い
で、開示された本発明を用いて生成されたDNAは、任意の目的または他の任意
の所望の方法において使用され得る。例えば、PCRを使用して、ゲノム全体鎖
置換方法によって予め増幅した任意の特定のDNA配列をさらに増幅し得る。
酸サンプルの増幅を可能にする特定の材料および手順を使用する。
列は、複数の核酸分子、例えばゲノム全体増幅の場合、核酸分子における複数の
部位、または核酸分子の単一の領域を含み得る。多重鎖置換増幅について、一般
に、標的配列は、核酸分子または核酸サンプル中の単一の領域である。ゲノム全
体増幅について、標的配列は、ゲノム全体または核酸サンプルである。標的配列
は、目的の任意の核酸サンプルであり得る。多くのこのような核酸サンプルの供
給源、同定、および調製は公知である。増幅または検出方法における使用につい
て公知または同定されている核酸サンプルが、本明細書中に記載される方法のた
めに使用されることが好ましい。核酸サンプルは、単一細胞由来の核酸サンプル
であり得る。多重鎖置換増幅について、好ましい標的配列は、例えば長さまたは
組成に起因して、PCRを使用する増幅が困難である配列である。ゲノム全体増
幅について、好ましい標的配列は、単一細胞由来の核酸サンプルである。連結さ
れたDNAの多重鎖置換増幅について、標的は、連結されたDNAである。開示
される方法における使用のための標的配列は、好ましくは、複雑であり、そして
非反復性である(リンカー連結されたDNAにおけるリンカー、およびゲノムD
NAにおける反復性DNAの切片を除く)核酸分子またはサンプルの部分である
。
DA反応において同時に増幅され得るが、簡便にするために、以下の議論では、
増幅されるべき目的の単一の核酸配列の特徴に言及する。この配列は、以下で標
的配列という。MSDAのための標的配列は、2つの型の標的領域(増幅標的お
よびハイブリダイゼーション標的)を含むことが好ましい。ハイブリダイゼーシ
ョン標的は、プライマーセット中のプライマーに相補的な標的配列中の配列を含
む。増幅標的は、増幅されるべき標的配列の部分である。この目的のために、増
幅標的は、好ましくはハイブリダイゼーション標的の下流、またはそれに隣接す
る。標的配列を選択するための特定の配列または構造上の要件は存在しない。標
的配列内のハイブリダイゼーション標的および増幅標的は、プライマーセット中
のプライマーに対する標的配列の関係によって規定される。プライマーは、選択
される標的配列にマッチするように設計される。図1の上方のパネルは、プライ
マーセット中のプライマーが、どのように標的配列中の領域を規定し得るかの例
を示す。プライマーがハイブリダイズする部位中およびその部位の周辺の配列が
増幅されるので、増幅されるべき配列とそのプライマーのハイブリダイゼーショ
ンの部位とは離れていることが好ましいが、そのことは要求されない。この例を
、図3に示す。
されるDNAフラグメントが増幅標的であり、そしてリンカーがハイブリダイゼ
ーション標的である。ハイブリダイゼーション標的(すなわち、リンカー)は、
増幅のために使用されるプライマーに相補的である配列を含む。増幅のために好
ましい形態の連結されたDNAは、連結されたcDNAである。
配列を有するオリゴヌクレオチドである。この配列を、プライマーの相補的部分
という。プライマーの相補的部分は、プライマーと標的配列との間の特異的かつ
安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであり得る。一般に、これ
は、10〜35ヌクレオチド長であるが、好ましくは16〜24ヌクレオチド長
である。ゲノム全体増幅には、プライマーは12〜60ヌクレオチド長であるこ
とが好ましい。
なる配列を含むことが好ましい。この配列を、プライマーの非相補的部分という
。プライマーの非相補的部分は、存在する場合、DNA複製間に安定な置換を促
進するように作用する。プライマーの非相補的部分はまた、RNAポリメラーゼ
についてのプロモーターのような機能的配列を含み得る。プライマーの非相補的
部分は、任意の長さであり得るが、一般に1〜100ヌクレオチド長であり、そ
して好ましくは4〜8ヌクレオチド長である。ランダムまたは部分的にランダム
なプライマーがゲノム全体増幅について使用される場合、非相補的部分の使用は
、好ましくない。
イマーの相補的部分は、標的配列におけるハイブリダイゼーション標的に相補的
であるように設計される。プライマーセットにおいて、各プライマーの相補的部
分が、標的配列の異なる部分に相補的であることが好ましい。このセット中のプ
ライマーが、標的配列中の隣接する部位に相補的であることがより好ましい。標
的配列中のこのような隣接する部位がまた、標的配列中の増幅標的に隣接するこ
ともまた好ましい。
いに分離されることが好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット
中のプライマーが、互いに、少なくとも5塩基離れていることが好ましい。ハイ
ブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、少なくと
も10塩基離れていることが好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマー
セット中のプライマーが、互いに、少なくとも20塩基離れていることがなおさ
らに好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが
、互いに、少なくとも30塩基離れていることがなおさらに好ましい。ハイブリ
ダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、少なくとも4
0塩基離れていることがなおさらに好ましい。ハイブリダイズされる場合、プラ
イマーセット中のプライマーが、互いに、少なくとも50塩基離れていることが
なおさらに好ましい。
500塩基以下で離れていることが好ましい。ハイブリダイズされる場合、プラ
イマーセット中のプライマーが、互いに、約400塩基以下で離れていることが
より好ましい。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが
、互いに、約300塩基以下で離れていることがなおさらに好ましい。ハイブリ
ダイズされる場合、プライマーセット中のプライマーが、互いに、約200塩基
以下で離れていることがなおさらに好ましい。上記の分離の好ましい上限および
下限の組み合わせが、特に意図され、すべての中間の範囲を含む。ハイブリダイ
ズされる場合、プライマーセット中のプライマーは、互いに、同じ塩基数離れて
いる必要はない。ハイブリダイズされる場合、プライマーセット中のプライマー
は、互いに、ほぼ同じ塩基数離れていることが好ましい。
ではない。なぜなら、このパラメーターは、正味の重合速度に依存するからであ
る。進行性DNAポリメラーゼは、1秒あたり5〜300ヌクレオチドの範囲に
及び得る特徴的な重合速度を有し、そしてアクセサリーssDNA結合タンパク
質およびヘリカーゼの存在または非存在によって影響され得る。非進行性ポリメ
ラーゼの場合において、正味の重合速度は、酵素の濃度に依存する。なぜなら、
より高い濃度では、より多くの再開始事象が存在し、そして正味の重合速度が増
大されるからである。進行性ポリメラーゼの例は、φ29DNAポリメラーゼで
あり、これは、1秒あたり50ヌクレオチドで進行する。非進行性ポリメラーゼ
の例は、Ventエキソ(−)DNAポリメラーゼであり、これは、低い濃度で
1秒あたり4ヌクレオチド、またはより高い濃度で1秒あたり16ヌクレオチド
の有効な重合速度を与える。
は使用されるポリメラーゼに合わせて調整される。迅速な重合速度を有するポリ
メラーゼを使用する場合には、長いプライマー間隔が好ましい。より遅い重合速
度を有するポリメラーゼを使用する場合には、より短いプライマー間隔が好まし
い。以下のアッセイは、任意のポリメラーゼでの至適な間隔を決定するために使
用され得る。このアッセイは、プライマーセットを用い、各プライマーは、5つ
の左側プライマーおよび5つの右側プライマーから作製される。プライマーセッ
トは、異なるプライマー間隔を有するプライマーの異なるセットの各々と、同じ
標的配列に隣接してハイブリダイズするように設計される。間隔は、プライマー
セット間で、25ヌクレオチド〜400ヌクレオチドの範囲内の25ヌクレオチ
ドの増加量で組織的に変化される(各セット内のプライマーの間隔は同じである
)。一連の反応が行われ、ここで同じ標的配列は、プライマーの異なるセットを
使用して増幅される。DNAの最も高い実験収量を生じる間隔は、特定のDNA
ポリメラーゼ、または使用されるDNAポリメラーゼおよびアクセサリータンパ
ク質の組み合わせについての至適なプライマー間隔である。
、隣接する部位にハイブリダイズされるプライマーから複製される鎖まで伸長し
、そしてそれを置換する。隣接する鎖の置換は、隣接する鎖を、別のプライマー
に対するハイブリダイゼーション、および引き続いての別の回の複製の開始につ
いて利用可能にする。プライマーがハイブリダイズする標的配列の領域をを、標
的配列のハイブリダイゼーション標的という。図1の上方のパネルは、標的配列
、および標的配列の増幅標的に対するプライマーセットの好ましい関係のうちの
1つを示す。
ーを含み得る。MSDAについて、プライマーセットが、複数のプライマーを含
むことが好ましい。プライマーセットが3以上のプライマーを含むことがより好
ましい。プライマーセットが、4以上、5以上、6以上、または7以上のプライ
マーを含むことがなおさらに好ましい。一般により多くのプライマーが使用され
るほど、得られる増幅のレベルはより高い。プライマーセットが有し得るプライ
マー数に対する必須の上限は存在しない。しかし、所定の標的配列について、プ
ライマーセット中のプライマー数は、一般に、標的配列において利用可能なハイ
ブリダイゼーション部位の数に限定される。例えば、標的配列が10,000ヌ
クレオチドのDNA分子であり、そして20ヌクレオチドのプライマーが使用さ
れる場合、標的配列中に500の非重複20ヌクレオチド部位が存在する。重複
部位が所望されるか、または受容可能である場合には、これよりもより多いプラ
イマーでさえ、使用され得る。プライマーセットが約300以上のプライマーを
含むことが好ましい。プライマーセットが約200以上のプライマーを含むこと
が好ましい。プライマーセットが約100以上のプライマーを含むことがなおよ
り好ましい。プライマーセットが約50以上のプライマーを含むことがより好ま
しい。プライマーセットが7〜約50のプライマーを含むことが最も好ましい。
上記のプライマーセットにおけるプライマーの数についての好ましい上限および
下限の任意の組み合わせが特に意図され、すべての中間の範囲を含む。
ライマーセットおよび左側のプライマーセットというプライマーの2つのセット
を含む。右側のプライマーセットおよび左側のプライマーセットは、標的配列の
反対側の鎖に相補的であるように設計される。右側のプライマーセットの相補的
な部分が、右側のハイブリダイゼーション標的に各々相補的であること、および
各々が、右側のハイブリダイゼーション標的の異なる部分に相補的であることが
好ましい。左側のプライマーセットの相補的な部分が各々左側のハイブリダイゼ
ーション標的に相補的であること、および各々が左側のハイブリダイゼーション
標的の異なる部分に相補的であることが好ましい。右側のハイブリダイゼーショ
ン標的および左側のハイブリダイゼーション標的は、標的配列中の増幅標的の反
対の末端に隣接する。これらの関係の好ましい形態を、図1の上方のパネルに示
す。右側のプライマーセットおよび左側のプライマーセットの各々が、プライマ
ーセットについて上記の好ましい数のプライマーを含むことは好ましい。特に、
右側のプライマーセットまたは左側のプライマーセットが、プライマーセットに
ついて複数のプライマーを含むことは好ましい。右側のプライマーセットまたは
左側のプライマーセットが、3以上のプライマーを含むことはより好ましい。右
側のプライマーセットまたは左側のプライマーセットが、4以上、5以上、6以
上、または7以上のプライマーを含むことはなおより好ましい。右側のプライマ
ーセットまたは左側のプライマーセットが、プライマーセットについて約200
以下のプライマーを含むことは好ましい。右側のプライマーセットまたは左側の
プライマーセットが、プライマーセットについて約100以下のプライマーを含
むことはより好ましい。右側のプライマーセットまたは左側のプライマーセット
の各々が、プライマーセットについて7〜約100のプライマーを含むことが最
も好ましい。上記のプライマーセットにおけるプライマーの数についての好まし
い上限および下限の任意の組み合わせが特に意図され、すべての中間の範囲が含
まれる。所定の標的配列について、右側のプライマーセットおよび左側のプライ
マーセットが同じプライマー数を含むこともまた好ましい。所定の標的配列につ
いて、右側のプライマーセットおよび左側のプライマーセットが、類似の長さお
よび/またはハイブリダイゼーション特徴のプライマーから構成されることもま
た好ましい。
いて、ランダムまたは部分的にランダムなヌクレオチド配列を有するプライマー
セットが使用されることが好ましい。顕著に複雑な核酸サンプル(これは、WG
SDAについての好ましい標的配列である)において、サンプル中に存在する特
定の核酸配列は公知である必要はなく、そしてプライマーは、任意の特定の配列
に相補的であるように設計される必要はない。むしろ、核酸サンプルの複雑性は
、ランダムまたは部分的にランダムな配列の種々のプライマーに相補的であサン
プル中の、大多数の異なるハイブリダイゼーション標的配列を生じる。WGSD
Aにおける使用のためのプライマーの相補的部分は、十分にランダム化され得る
か、ランダム化されている部分のみを有し得るか、または他の様式で選択的にラ
ンダム化され得る。
ライマーの相補的な部分中のヌクレオチドの総数の20%〜100%である。よ
り好ましくは、ランダムな塩基位置の数は、プライマーの相補的な部分中のヌク
レオチドの総数の30%〜100%である。最も好ましくは、ランダムな塩基位
置の数は、プライマーの相補的な部分中のヌクレオチドの総数の50%〜100
%である。ランダムまたは部分的にランダムな配列を有するプライマーセットは
、各位置の任意のヌクレオチドの添加がランダム化されるのを可能にすることに
よって、標準的な技術を使用して合成され得る。プライマーセットは、類似の長
さおよび/またはハイブリダイゼーション特徴のプライマーから構成されること
もまた好ましい。
の多重鎖置換増幅について、ランダムまたは部分的にランダムなヌクレオチド配
列を有するプライマーセットが使用され得る。顕著に複雑な核酸サンプル(例え
ば、多くの配列の混合物から連結されたDNA)において、サンプル中に存在す
る特定の核酸配列は公知である必要はなく、そしてプライマーは、任意の特定の
配列に相補的であるように設計される必要はない。むしろ、核酸サンプルの複雑
性は、ランダムまたは部分的にランダムな配列の種々のプライマーに相補的であ
るサンプル中の、大多数の異なるハイブリダイゼーション標的配列を生じる。M
SDA−CDにおける使用のためのプライマーの相補的部分は、十分にランダム
化され得るか、ランダム化されている部分のみを有し得るか、または他の様式で
選択的にランダム化され得る。
ライマーの相補的な部分中のヌクレオチドの総数の20%〜100%である。よ
り好ましくは、ランダムな塩基位置の数は、プライマーの相補的な部分中のヌク
レオチドの総数の30%〜100%である。最も好ましくは、ランダムな塩基位
置の数は、プライマーの相補的な部分中のヌクレオチドの総数の50%〜100
%である。ランダムまたは部分的にランダムな配列を有するプライマーセットは
、ランダム化される各位置での任意のヌクレオチドの付加を可能にすることによ
って、標準的な技術を使用して合成され得る。プライマーセットは、類似の長さ
および/またはハイブリダイゼーション特徴のプライマーから構成されることも
また好ましい。
マーを使用して増幅が行われ得る。これは、MSDA−CDの好ましい形態であ
る。各プライマーの相補的部分がリンカー中の配列に相補的であるように設計さ
れることが好ましい。リンカー連結されたDNAとの使用のためのプライマーは
、リンカー配列の両方の鎖に相補的なプライマーを含むことが好ましい。これを
図4に示す。プライマーが互いに相補的ではないこともまた好ましい。このこと
は、プライマーが互いにハイブリダイズするのを防ぐ。DNAを連結するために
使用されるリンカーが十分に長い場合、リンカー配列の異なる部分に相補的なプ
ライマーセットが使用され得る。これは、MSDAにおける状況に等価であり、
そしてプライマーセットは、MSDAプライマーセットについて議論されるのと
同じ様式で設計および使用され得る。ランダムなプライマーは、リンカーがDN
Aを連結するために使用されていても、使用されていなくても、連結されたDN
Aを増幅するために使用され得る。
が、配列の複数の縦列反復から構成される核酸分子でないか、またはその部分で
はないことが好ましい。標的配列が、単一配列の複数の縦列反復から構成される
核酸分子ではないか、またはその部分ではないことがより好ましい。循環複製(
circle replication)を回転させることによって合成された
単一の配列の複数の縦列反復から構成される核酸分子でないか、またはその部分
ではないことが最も好ましい。循環複製を回転させることによって作製されるそ
のような縦列反復DNAの例は、WO 97/19193において記載される縦
列配列DNAである。同一またはほぼ同一のDNAフラグメントから連結される
DNAは、循環複製を回転させることによって作製されず、そのため循環複製を
回転させることによって合成された単一の配列の複数の縦列反復から構成される
核酸分子ではない。従って、標的配列は、単一の配列の複数の縦列反復から構成
される核酸分子ではないが、いくつかのそのような標的配列(例えば、同一また
はほぼ同一のDNAフラグメントから連結されるDNA)は、循環複製を回転さ
せることによって合成された単一の配列の複数の縦列反復(例えば、WO97/
19193において記載される縦列配列DNA)から構成される核酸分子よりも
好ましい。開示される方法についての標的配列がWO 97/19193におい
て記載される方法によって生成されないことが好ましい。
分析するために使用されるべき配列を含み得る。そのような配列の例は検出タグ
であり、検出タグは、プライマーの非相補的部分中に存在する特定のヌクレオチ
ド配列である。検出タグは、検出プローブに相補的な配列を有する。検出タグは
、それらのコグネイト検出プローブを使用して検出され得る。検出タグは、増幅
された鎖の末端に取り込まれるようになる。結果物は、検出プローブの相補的な
部分に相補的である検出タグ配列を有する増幅されたDNAである。存在する場
合、プライマー上に、1、2、3、または3より多くの検出タグが存在し得る。
プライマーが1、2、3、または4の検出タグを有することが好ましい。最も好
ましくは、プライマーは1つの検出タグを有する。一般に、プライマーは10以
下の検出タグを有することが好ましい。プライマーのサイズを除いて、プライマ
ー上に存在し得る検出タグの数に対する必須の限定は存在しない。複数の検出タ
グが存在する場合、それらは同じ配列を有し得、またはそれらは異なる配列を有
し得、各異なる配列は、異なる検出プローブに相補的である。プライマーが検出
タグを含み、これらが単一の検出プローブに対してすべて相補的であるように同
じ配列を有することが好ましい。いくつかの複数の検出方法について、プライマ
ーが6までの検出タグを含むこと、および検出タグ部分が、検出タグ部分の各々
が異なる検出プローブに相補的であるように異なる配列を有することが好ましい
。類似の効果は、各々が単一の異なる検出タグを有するプライマーセットを使用
することによって達成され得る。検出タグは、それぞれ、検出タグと検出プロー
ブとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さであ
り得る。この目的のために、10〜35ヌクレオチド長が好ましく、検出タグ部
分が15〜20ヌクレオチド長であることが最も好ましい。
まれ得る配列の別の例は、アドレスタグである。アドレスタグは、アドレスプロ
ーブに相補的な配列を有する。アドレスタグは、増幅される鎖の末端に取り込ま
れるようになる。結果物は、アドレスプローブの相補的な部分に相補的であるア
ドレスタグ配列を有する増幅されたDNAである。存在する場合、プライマー上
に、1、または1より多くのアドレスタグが存在し得る。プライマーが1または
2のアドレスタグを有することが好ましい。最も好ましくは、プライマーは1つ
のアドレスタグを有する。一般に、プライマーは10以下のアドレスタグを有す
ることが好ましい。プライマーのサイズを除いて、プライマー上に存在し得るア
ドレスタグの数に対する必須の限定は存在しない。複数のアドレスタグが存在す
る場合、それらは同じ配列を有し得、またはそれらは異なる配列を有し得、各異
なる配列は、異なるアドレスプローブに相補的である。プライマーがアドレスタ
グを含み、これらが単一のアドレスプローブに対してすべて相補的であるように
同じ配列を有することが好ましい。アドレスタグ部分は、それぞれ、アドレスタ
グとアドレスプローブとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持
する任意の長さであり得る。この目的のために、10〜35ヌクレオチド長が好
ましく、アドレスタグ部分が15〜20ヌクレオチド長であることが最も好まし
い。
二本鎖DNA分子である。MSDA−CDについて、リンカーは2つの主な目的
を果たす:DNAフラグメントの連結を促進すること、および増幅を促進するこ
と。第1の目的のために、リンカーは、一般に、連結されるべきDNAフラグメ
ントの末端と適合性である末端を有するように設計される。例えば、DNAフラ
グメントが平滑末端を有する(または、末端が平滑にされる)場合、平滑末端化
リンカーが使用される。1つ以上のヌクレオチドで末端をつながれたDNAフラ
グメントについて、リンカーは、相補的テイルを有するべきである。そのような
テイル化(tailing)の例は、cDNAの3’末端への単一のアデノシン
残基の付加である。増幅を促進するために、リンカーは、MSDA−CDにおい
て使用されるべきプライマーに相補的な1つ以上の配列を有するべきである。そ
のような配列を、リンカーのプライマー相補的部分という。リンカーのプライマ
ー相補的部分は、プライマーの相補的部分に相補的である。プライマー相補的部
分は、それが意図されたプライマーの部分に相補的である限り、任意の配列を有
し得る。リンカーの反対の鎖上にプライマー相補的部分が存在する場合、それら
は重複するべきではない。プライマーはまた、1つ以上の制限酵素切断部位を有
し得る。そのような制限部位は、増幅されたDNAがフラグメント、および好ま
しくは連結された元々のDNAフラグメントを示すフラグメントに切断されるこ
とを可能にする。この目的のために、まれな制限部位(例えば、8塩基の認識部
位)が使用されることが好ましい。この型のリンカーの構造の例を以下に示す:
ーター配列は、増幅されたDNAが、MSDA−CDの後の転写によってさらに
増幅されるのを可能にする。2つのプロモーターがリンカーに組み込まれる場合
、それらは、好ましくはリンカーの異なる鎖上に位置される。両方の3’末端に
単一の突出するチミジン残基、および両方の5’末端にリン酸基を有するリンカ
ーの例を以下に示す(Pはリン酸を示す):
る配置が好ましい。任意の数のプライマーおよびプロモーターが使用され得る。
しかし、連結されるべきDNAがcDNAである場合、プロモーターは、cDN
A合成のために使用されるプライマーの部分としてcDNAに組み込まれること
が好ましい(Lockhartら)。
出標識は、増幅された核酸に直接取り込まれ得るか、または検出分子に結合し得
る。本明細書で使用する場合、検出標識は、増幅された核酸と直接的または間接
的に会合し得、そして測定可能で検出可能なシグナルを、直接的または間接的の
いずれかで生じる任意の分子である。核酸に取り込まれる、または核酸プローブ
に結合するための多くのこのような標識は、当業者に公知である。開示した方法
における使用に適切な検出標識の例は、放射性同位体、蛍光分子、燐光分子、酵
素、抗体、およびリガンドである。
チルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−2−オキサ−1,3−ジ
アゾール−4−イル(NBD)、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、4
’−6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)、およびシアニン染
料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5およびCy7を含む。好ましい蛍光
標識は、フルオレセイン(5−カルボキシフルオレセイン−N−ヒドロキシスク
シンイミドエステル)およびローダミン(5,6−テトラメチルローダミン)で
ある。好ましい蛍光標識は、FITCおよびシアニン染料Cy3、Cy3.5、
Cy5、Cy5.5、およびCy7である。これらの蛍光体の吸収極大および発
光極大は、それぞれ:FITC(490 nm;520 nm)、Cy3(55
4 nm;568 nm)、Cy3.5(581 nm;588 nm)、Cy
5(652 nm;672 nm)、Cy5.5(682 nm;703 nm
)、およびCy7(755 nm;778 nm)であり、従って、それらの同
時検出を可能にする。蛍光標識は、種々の市販の供給源(Molecular
Probes, Eugene, OR and Research Orga
nics, Cleveland, Ohioを含む)から入手可能である。
らは合成中に増幅産物に直接取り込まれ得るからである。増幅されたDNAまた
はRNAに取り込まれ得る検出標識の例は、BrdUrd(HoyおよびSch
imke, Mutation Research 290:217−230(
1993))、BrUTP(Wansickら、J. Cell Biolog
y 122:283−293(1993))、およびビオチン(Langerら
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6633(
1981))またはジゴキシゲニン(Kerkhof, Anal. Bioc
hem. 205:359−364(1992))のような適切なハプテンで改
変されたヌクレオチドのようなヌクレオチドアナログを含む。適切な蛍光で標識
されたヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネート−dUTP、シア
ニン−3−dUTP、およびシアニン−5−dUTP(Yuら、Nucleic
Acids Res., 22:3226−3232(1994)である。D
NAの好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、BrdUrd(BUDR三リ
ン酸、Sigma)であり、そしてRNAの好ましいヌクレオチドアナログ検出
標識は、ビオチン−16−ウリジン−5’−三リン酸(ビオチン−16−dUT
P、Boehringher Mannheim)である。フルオレセイン、C
y3、およびCy5は、直接標識のためにdUTPに結合し得る。Cy3.5お
よびCy7は、ビオチンで標識したプローブまたはジゴキシゲニンで標識したプ
ローブの二次検出のためのアビジンまたは抗ジゴキシゲニン結合体として入手可
能である。
該分野で周知の鋭敏な方法を用いて検出され得る。例えば、ビオチンは、ストレ
プトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体(Tropix,Inc.)(こ
れは、ビオチンに結合し、続いて適切な基質(例えば、化学発光基質CSPD:
3−(4−メトキシスピロ−[1,2,−ジオキセエタン−3−2’−(5’−
クロロ)トリシクロ[3.3.1.13.7]デカン]−4−イル)フェニルホス フェート二ナトリウム;Tropix,Inc.)の化学発光によって次に検出
される)を用いて検出され得る。
ニウム−エステル標識したDNAプローブ(GenProbe, Inc.,
Arnoldら、Clinical Chemistry 35:1588−1
594(1989)に記載される)である。アクリジニウム−エステル標識した
検出プローブは、洗浄を伴わないで、増幅されたRNAの検出を可能にする。な
ぜなら、ハイブリダイズしていないプローブはアルカリで破壊され得るからであ
る(Arnoldら、(1989))。
る。任意の公知の検出標識は、開示されたプローブ、タグ、および方法とともに
使用され得、開示された方法を用いて増幅された核酸を標識および検出する。検
出標識によって生じるシグナルを検出および測定するための方法はまた、当業者
に公知である。例えば、放射性同位体は、シンチレーションカウンティングまた
は直接的可視化によって検出され得る;蛍光分子は、蛍光分光光度計で検出され
得る;燐光分子は、分光光度計によって検出され得るかまたはカメラで直接可視
化され得る;酵素は、酵素によって触媒される反応の産物の検出または可視化に
よって検出され得る;抗体は、抗体に結合した二次検出標識を検出することによ
って検出され得る。本明細書中で用いられる場合、検出分子は、増幅された核酸
と相互作用し、そして一つ以上の検出標識が結合された分子である。
たオリゴヌクレオチドである。検出プローブの相補的な部分は、検出プローブと
検出タグとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の
長さであり得る。この目的のために、10〜35ヌクレオチドの長さが好ましく
、16〜20ヌクレオチド長の検出プローブの相補的な部分が最も好ましい。検
出プローブは、上記の任意の検出ラベルを含み得る。好ましい標識は、ビオチン
および蛍光分子である。特に好ましい検出プローブは、分子ビーコンである。分
子ビーコンは、検出プローブがハイブリダイズされた場合にのみ蛍光部分が蛍光
を発する蛍光部分で標識された検出プローブである(TyagiおよびKram
er, Nature Biotechnol. 14:303−309(19
95))。このようなプローブの使用は、標識検出の前にハイブリダイズしてい
ないプローブを除去する必要性を排除する。なぜなら、ハイブリダイズしていな
い検出プローブは、シグナルを生成しないからである。これは、複合アッセイに
特に有用である。
リゴヌクレオチドである。アドレスプローブの相補的な部分は、アドレスプロー
ブとアドレスタグとの間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する
、任意の長さであり得る。この目的のために、10〜35ヌクレオチドの長さが
好ましく、12〜18ヌクレオチド長のアドレスプローブの相補的な部分が最も
好ましい。アドレスプローブは、単一の相補的な部分または複数の相補的な部分
を含み得る。好ましくは、アドレスプローブは、直接的にまたはスペーサー分子
を介してのいずれかで、固体の支持体に結合される。アドレスプローブと固体の
支持体とのこのような組み合わせは、固体の検出器の好ましい形態である。
レオチドが、確立されたオリゴヌクレオチド合成法を使用して合成され得る。オ
リゴヌクレオチドを生成または合成する方法は、当該分野において周知である。
そのような方法は、標準的な酵素消化後のヌクレオチドフラグメント単離(例え
ば、Sambrookら, Molecular Cloning: A La
boratory Manual, 第2版(Cold Spring Har
bor Laboratory Press, Cold Spring Ha
rbor, N.Y., 1989)第5、6章)を参照のこと)から、純粋な
合成法、例えば、MilligenまたはBeckman System 1
Plus DNA合成機(例えば、Millingen−Biosearch,
Burlington, MAのModel 8700自動合成機、またはA
BI Model 380B)を用いるシアノエチルホスホロアミダイト法によ
る合成法まで範囲であり得る。オリゴヌクレオチドを作製するのに有用な合成法
はまた、Ikutaら, Ann. Rev. Biochem. 53:32
3−356(1984)(ホスホトリエステルおよびホスファイト−トリエステ
ル法)およびNarangら, Methods Enzymol., 65:
610−620(1980)(ホスホトリエステル法)に記載される。タンパク
質核酸分子は、Nielsenら, Bioconjug. Chem. 5:
3−7(1994)に記載される方法のような、公知の方法を使用して作製され
得る。
ドまたは核酸の特定の部分に相補的であるように設計され、その結果、安定なハ
イブリッドがそれらの間に形成され得る。これらのハイブリッドの安定性は、L
esnickおよびFreier, Biochemistry 34:108
07−10815(1995)、McGrawら, Biotechnique
s 8:674−678(1990)、およびRychlikら, Nucle
ic Acids Res. 18:6409−6412(1990)に記載さ
れる方法のような、公知の方法を用いて計算され得る。
または支持体である。固体検出器の好ましい形態は、アレイ検出器である。アレ
イ検出器は、そこに複数の異なるアドレスプローブまたは検出分子がアレイ、格
子、または他の組織的な様式で結合した固体検出器である。
合し得る任意の固体物質を含み得る。これはアクリルアミド、セルロース、ニト
ロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプ
ロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス
、ポリケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、
シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル
、ポリフマル酸プロピル(polypropylfumerate)、コラーゲ
ン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸のような物質を含む。固体基材
は、薄いフィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、繊維、不織布、成形
された高分子、粒子、および微粒子を含む、任意の有用な形態を有し得る。固体
基材のための好ましい形態は、マイクロタイターディッシュである。マイクロタ
イターディッシュの最も好ましい形態は、標準96ウェルタイプである。
法の産物の捕捉を可能にする。そのような捕捉は、続く検出工程を妨げ得る反応
成分を洗い去る、好都合な手段を提供する。異なるアドレスプローブを固体検出
器の異なる領域に付着させることにより、異なる増幅産物が、固体検出器上の異
なる位置、従って診断的な位置で捕捉され得る。例えば、マイクロタイタープレ
ート複合アッセイにおいて、96までの異なる増幅核酸(各々が異なるプライマ
ーのセットを介して増幅された異なる標的配列を表す)に特異的なアドレスプロ
ーブは、各々が異なるウェル中で、マイクロタイタープレート上に固定され得る
。捕捉および検出は、増幅核酸に対応する標的配列がサンプル中に存在した、増
幅核酸に対応するウェルの中でのみ起こる。
。アドレスプローブおよび検出プローブを含むオリゴヌクレオチドは、確立され
た結合法を用いて基材に結合され得る。例えば、適切な付着法は、Peaseら
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11):
5022−5026(1994)、およびKhrapkoら, Mol Bio
l(Mosk)(USSR)25:718−730(1991)により記載され
る。カゼイン被覆スライド上の3’アミンオリゴヌクレオチドの固定方法は、S
timpsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:6379−6383(1995)により記載される。固体基材にオリゴ
ヌクレオチドを付着させる好ましい方法は、Guoら, Nucleic Ac
ids Res. 22:5456−5465(1994)により記載される。
支持体である。標的配列は、好ましくは、標的サンプルまたはアッセイサンプル
中に送達される。固体サンプルの好ましい形態は、アレイサンプルである。アレ
イサンプルは、そこに複数の異なる標的サンプルをアレイ、格子、または他の組
織的な様式で結合または接着している、固体サンプルである。
接着し得る、任意の固体物質を含み得る。これはアクリルアミド、セルロース、
ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポ
リプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガ
ラス、ポリケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロ
ン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエス
テル、ポリフマル酸プロピル(polypropylfumerate)、コラ
ーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸のような物質を含む。固体
基材は、薄いフィルムまたは膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、スライド、繊維
、織物繊維、成形された高分子、粒子、および微粒子を含む、任意の有用な形態
を有し得る。固体基材のための好ましい形態は、マイクロタイターディッシュお
よびガラススライドである。マイクロタイターディッシュの最も好ましい形態は
、標準96ウェルタイプである。
核酸の形成を可能にする。そのような局在化は、続く検出工程を妨げ得る反応成
分を洗い去る好都合な手段を提供し、そして複数の異なるサンプルを同時にアッ
セイする好都合な方法を提供する。増幅した核酸は、異なるサンプルが接着する
各部位に独立して形成され得る。固体サンプルを形成するための標的配列または
他のオリゴヌクレオチド分子の固定のために、上記の方法が使用され得る。
点のアレイとして接着しているガラススライドである。各点は、好ましくは直径
0.1〜2.5mmであり、最も好ましくは直径およそ2.5mmである。その
ような微少アレイは、例えば、Schenaら, Science 270:4
87−470(1995)により記載される方法を使用して製造され得る。簡潔
には、微少アレイは、プリントチップを備えたアレイマシンによって、ポリ−L
−リジン被覆顕微鏡スライド(Sigma)上に製造され得る。チップは、例え
ば、96−ウェルのマイクロタイタープレートからの1μlのDNAサンプル(
0.5mg/ml)で充填され、そして所望の間隔で複数のスライド上に1スラ
イドあたり約0.005μlで配置される。次いで、プリントされたスライドは
、湿潤チャンバー内で2時間再水和され、100℃で1分間急速乾燥(snap
−dry)され、0.1%SDS中ですすがれ、そして50% 1−メチル−2
−ピロリジノンおよび50%ホウ酸から成る緩衝液中に調製された0.05%無
水コハク酸で処理され得る。次いでスライド上のDNAは、例えば、使用の直前
に90℃で2分間、蒸留水中で変性され得る。微少アレイ固体サンプルは、例え
ば、コンピュータ制御XYステージおよび顕微鏡対物レンズを有するレーザー蛍
光スキャナによって、スキャンされ得る。混合ガス、多線レーザーは、複数の蛍
光物質の連続的な励起を可能にする。
置換因子と組み合せて、複製中に遭遇したハイブリダイズ鎖を置換し得るにちが
いない。このようなポリメラーゼを、本明細書中で鎖置換DNAポリメラーゼと
呼ぶ。鎖置換DNAポリメラーゼは5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を欠くこ
とが好ましい。鎖置換は、標的配列の複数コピーの合成を生じるために必要であ
る。5’→3’エキソヌクレアーゼ活性は、存在すれば、合成鎖の破壊をもたら
し得る。開示された方法における使用のためのDNAポリメラーゼは、高度に進
行性であることもまた好ましい。開示された方法における使用のためのDNAポ
リメラーゼの適合性は、鎖置換複製を行うその能力を評価することにより容易に
決定され得る。好ましい鎖置換DNAポリメラーゼとしては、Bstラージフラ
グメントDNAポリメラーゼ(エキソ(−)Bst;Aliottaら,Gen
et.Anal.(Netherlands)12:185−195(1996
))およびエキソ(−)Bca DNAポリメラーゼ(Walker and
Linn,Climical Chemistry 42:1604−1608
(1996))である。他の有用なポリメラーゼには、バクテリオファージφ2
9 DNAポリメラーゼ(Blancoらの、米国特許第5,198,543号
および同第5,001,050号)、ファージM2 DNAポリメラーゼ(Ma
tsumotoら、Gene 84: 247 (1989))、ファージφP
RD1 DNAポリメラーゼ(Jungら、Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 84: 8287 (1987))、エキソ(−)VE
NT(登録商標)DNAポリメラーゼ(Kongら、J.Biol.Chem.
268: 1965−1975 (1993))、DNAポリメラーゼIのK
lenowフラグメント(Jacobsenら、Eur.J.Biochem.
45: 623−627 (1974))、T5 DNAポリメラーゼ(Ch
atterjeeら、Gene 97: 13−19 (1991))、Seq
uenase(U.S.Biochemicals)PRD1 DNAポリメラ
ーゼ(ZhuおよびIto, Biochim.Biophys.Acta.
1219: 267−276 (1994))、およびT4 DNAポリメラー
ゼホロ酵素(KaboordおよびBenkovic, Curr.Biol.
5: 149−157 (1995))が挙げられる。エキソ(−)Bst
DNAポリメラーゼが最も好ましい。
置換因子の存在下で鎖置換複製を行い得る任意のDNAポリメラーゼは、たとえ
このDNAポリメラーゼが、このような因子の非存在下で鎖置換複製を行わない
としても、開示される方法における使用のために適切であると考えられる。鎖置
換複製において有用な鎖置換因子として、BMRF1ポリメラーゼアクセサリー
サブユニット(Tsurumiら、J.Virology 67(12): 7
648−7653 (1993))、アデノウイルスDNA結合タンパク質(Z
ijderveldおよびvan der Vliet, J.Virolog
y 68(2): 1158−1164 (1994))、単純ヘルペスウイル
スタンパク質ICP8(BoehmerおよびLehman, J.Virol
ogy 67(2): 711−715 (1993);Skaliterおよ
びLehman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91(22): 10665−10669 (1994))、一本鎖DNA結合
タンパク質(SSB; RiglerおよびRomano, J.Biol.C
hem. 270: 8910−8919 (1995));T4ファージ遺伝
子32タンパク質(Villemain and Giedroc,Bioch
emistry 35:14395−14404(1996))およびウシ胸腺
ヘリカーゼ(Siegelら、J.Biol.Chem. 267: 1362
9−13635 (1992))が挙げられる。
セイのような、鎖置換複製アッセイにおいてポリメラーゼを使用することにより
決定され得る。この実施例のアッセイは適切に改変され得る。例えば、ヘリカー
ゼはSSBの代わりに使用され得る。このようなアッセイは、使用される酵素に
ついて最適な活性に適した温度で行われるべきである。例えばφ29DNAポリ
メラーゼについては32℃、エキソ(−)Bst DNAポリメラーゼについて
は46℃〜64℃、または高度好熱性生物由来の酵素については約60℃〜70
℃である。60℃〜70℃のアッセイについてのプライマー長を、ランダムプラ
イマーについては20塩基まで、または特定のプライマーについては22塩基ま
で増加し得る。ポリメラーゼを選択する別の有用なアッセイは、Kongら,J
.Biol.Chem.268:1965−1975(1993)に記載される
プライマーブロックアッセイである。このアッセイは、伸長するプライマーの上
流にハイブリダイズしその進行をブロックするオリゴヌクレオチドの存在下また
は非存在下におけるM13 ssDNA鋳型を使用するプライマー伸長アッセイ
からなる。このアッセイにおいてこのブロッキングプラーマーを置換し得る酵素
は、この公開した方法について有用である。
組み合せによりともにパッケージされ得る。
本方法を使用し、1つ以上の特異的な配列(多重鎖置換増幅)、高度に複雑なゲ
ノム全体または他のDNA(ゲノム全体鎖置換増幅)、あるいは連結したDNA
(連結したDNAの多重鎖置換増幅)を増幅し得る。一般的にこの開示した方法
は、プライマーの標的核酸配列とのハイブリダイゼーション、およびこのハイブ
リダイゼーションプライマーによりプライミングされる標的配列の複製を含み、
その結果、標的配列の複製は、この標的配列と相補的な複製した鎖を生じる。複
製の間、成長している複製した鎖は、鎖置換複製を介して、他の複製した鎖を、
この標的配列(または別の置換した鎖)から置換する。複製した鎖のこのような
置換の例を、図中に説明する。本明細書中に使用される複製した鎖は、標的配列
または別の複製した鎖にハイブリダイズしたプライマーの伸長から生じる核酸鎖
である。鎖置換複製は、複製した鎖の成長末端が、この鋳型鎖(または別の複製
鎖)由来の別の鎖に遭遇し、置換するDNA複製を言う。他の複製鎖による複製
鎖の置換は、標的配列の複数コピーが、単一の等温反応中に作製されるようにす
るこの開示した方法の特徴である。
、2セットのプライマー、右セットおよび左セットが使用される。右セットプラ
イマーにおけるプライマーは各々、標的ヌクレオチド配列の片側に隣接するヌク
レオチド配列に相補的な部分を有し、ならびに左セットのプライマー中のプライ
マーの各々はこの標的ヌクレオチド配列の別側に隣接するヌクレオチドに相補的
な部分を有する。右セットのプライマーはこの標的ヌクレオチド配列を含む核酸
分子1つの鎖に相補的であり、左セットのプライマーはこの反対側の鎖に相補的
である。両セットのプライマーの5’末端は、このプライマーがこの核酸分子中
の隣接する配列にハイブリダイズする場合、目的の核酸配列に遠位である。好ま
しくは、各セットの各メンバーは、この標的ヌクレオチド配列に隣接する別々の
および非重複のヌクレオチド配列に相補的な部分を有する。増幅は、各プライマ
ーで開始した複製により進行し、そしてこの標的核酸配列を介して継続する。本
方法の重要な特徴は、複製中の在介プライマーの置換である。一旦、右セットの
プライマーから伸長した核酸鎖が、この左セットのプライマーがハイブリダイズ
する核酸分子の領域に到達する場合、およびその逆の場合、そして逆に、別の回
のプライミングおよび複製が起こる。これは、この標的核酸配列の入れ子のセッ
トの複数コピーが短期間に合成されるようにする。
サンプルと混合し、プライマー標的サンプル混合物を産生し、そしてこのプライ
マー標的サンプル混合物を、このプライマー標的サンプル混合物中のプライマー
および標的配列間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベート
する工程、および(b)DNAポリメラーゼをこのプライマー標的サンプル混合
物と混合し、ポリメラーゼ標的サンプル混合物を産生し、この標的配列の複製を
促進する条件下で、このポリメラーゼ標的サンプル混合物をインキュベートする
工程。鎖置換複製は好ましくは、鎖置換DNAポリメラーゼまたは適合鎖置換因
子と組み合せたDNAポリメラーゼを使用することにより達成される。MSDA
の好ましい例を、図1で説明する。MSDAの別の例を、図3で説明する。
3回の複製のみが数十万コピーの目的の核酸配列を産生するために必要である。
例えば、26プライマーの右および左プライマーセットを各々使用して、200
,000コピーの5000ヌクレオチド増幅標的が10分間(4回のプライミン
グおよび複製を表す)に生成され得ることが推定され得る。26プライマーの右
および左プライマーセットを各々使用して、200,000コピーの47,00
0ヌクレオチド増幅標的が60分間(再度4回のプライミングおよび複製を表す
)に生成され得ることもまた推定され得る。これらの計算は、1秒あたり50ヌ
クレオチドのポリメラーゼ伸長速度に基づく。反応は継続され、かつ等温(サイ
クルは要求されない)であることが重視される。
等温条件下で実施されるからである。温度サイクルは必要ではない、なぜなら伸
長している鎖の頭部でこのポリメラーゼ(または適合鎖置換因子)が、その前方
の鎖を置換し、これによりこの鎖のハイブリダイゼーションに利用可能にする。
多重鎖置換増幅の別の利点は、非常に長い核酸セグメント(50キロベースのオ
ーダーで)を増幅する能力、およびより短いセグメント(10キロベース以下)
の迅速な増幅を含む。長い核酸セグメントは、この開示した方法で増幅され得る
。なぜなら連続的な合成を妨げ得るか、または複製した鎖の再ハイブリダイゼー
ションに起因するアーチファクトの形成を可能にするサイクルがないからである
。多重鎖置換増幅において、意図しない部位での単一のプライミング事象は、こ
れらの部位でのアーチファクトの増幅を導かない(なぜなら意図した部位での増
幅は、意図しない部位での一本鎖複製を迅速に追い越すからである)。
おいて、ランダムなまたは部分的にランダムなセットのプライマーが使用され、
ゲノム核酸のサンプル(または高度に複雑な核酸の別のサンプル)にランダムに
プライムする。ランダムまたはほとんどランダムな配列の十分に大きなセットの
プライマーを選択することにより、このセットのプライマーは、集合的に、ラン
ダムに、試料中の核酸中に分布する核酸配列に相補的となる。増幅は、各プライ
マーで開始した前進的なポリメラーゼを用いた複製により進行し、そして自然に
終結するまで継続する。この方法の重要な特徴は、ポリメラーゼによる置換中の
介在プライマーの置換である。この方法において、ゲノム全体の複数の重複する
コピーは、短期間で合成され得る。ゲノムサンプル上のWGSDAにおいて、イ
ンキュベーションの180分後、各プライマーは平均で55,000塩基まで伸
長されていることが推定され得る。十分に高い濃度のプライマーを使用すること
により、複製した鎖上のさらなるプライミング事象はさらなる回数のコピーをも
たらす。180分後、400コピーのゲノム全体が生成されることが推定され得
る。
は高度に複雑な他の核酸サンプル)を用いてランダムまたは部分的にランダムな
プライマーのセットを混合して、プライマー標的サンプル混合物を生成し、そし
てこのプライマー標的サンプル混合物中のプライマーおよびゲノムDNA間のハ
イブリダイゼーションを促進する条件下でこのプライマー標的サンプル混合物を
インキュベートする工程、および(b)DNAポリメラーゼとこのプライマー標
的サンプル混合物とを混合し、ポリメラーゼ標的サンプル混合物を産生し、そし
てゲノムDNA複製を促進する条件下でこのポリメラーゼ標的サンプル混合物を
インキュベートする工程。鎖置換複製は好ましくは、鎖置換DNAポリメラーゼ
または適合鎖置換因子と組み合せたDNAポリメラーゼを使用することにより達
成される。WGSDAは図2で説明する。
で行われ得るからである。ゲノム全体鎖置換増幅の他の利点には、ゲノム全体P
CRよりも高レベルの増幅(5倍高いレベルまで)が挙げられ、増幅はPCRよ
りも配列依存性ではなく、かつPCRを用いて生じ得るような再アニールアーチ
ファクトまたは遺伝子シャッフリングアーチファクトはない(なぜなら変性また
は再アニールのサイクルがないからである)。
用のような任意の目的であり得る。例えば、増幅配列は、蛍光標識の検出、酵素
連結検出系、抗体媒介標識検出,および放射活性標識の検出のような核酸に対す
る従来の検出系のいずれをも用いて検出され得る。開示された方法の鍵となる特
徴は、増幅がサイクルでは起こらず、連続的な等温複製で起こることである。こ
れは、増幅を、より簡単し、そして出力においてより大きな一致をもたらす。鎖
置換は、単一の連続等温反応で、核酸配列または試料の複数コピーの迅速生成を
可能にする。
内で所望の間隔でハイブリダイズすることを可能にする濃度で用いられることが
好ましい。例えば、プライマーのセットを、それらが、平均して4000〜80
00塩基ごとにハイブリダイズすることを可能にする濃度で用いることにより、
これらの部位で開始したDNA複製が伸び、そして隣接部位から複製される鎖を
置換する。プライマーは、規則的な間隔で標的配列にハイブリダイズすることは
予期されないことに注意すべきである。むしろ、平均の間隔は、プライマー濃度
の一般的機能である。
のハイブリダイゼーション、および引き続く別のラウンドの複製の開始に利用可
能にする。プライマーセット中のプライマーが標的配列にハイブリダイズする間
隔は、増幅のレベルを決定する。例えば、平均間隔が短い場合、隣接鎖は迅速お
よび頻繁に置換される。平均間隔が長い場合、隣接鎖は、長い行程の複製後のみ
に置換される。
れる限り進行する前進的な鎖置換重合反応における鎖置換を触媒し、60,00
0ヌクレオチドまで、またはそれより大きい分子を生成する。好適な鎖置換DN
Aポリメラーゼは、大フラグメントBst DNAポリメラーゼ(Exo(−)
Bst)、exo(−)Bca DNAポリメラーゼ、バクテリオファージφ2
9のDNAポリメラーゼおよびSequenaseである。鎖置換複製の間に、
反応中に生成されるDNAを標識するために、放射活性、またはブロモデオキシ
ウリジン三リン酸のような改変ヌクレオチドをさらに含み得る。あるいは、ビオ
チン化ヌクレオチドのような(Langerら(1981))、結合成分を提供
する適切な前駆体を含み得る。
oc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5487−5851(19
92)、Teleniusら、Genomics 13:718−725(19
92)、Cheungら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9
3:14676−14679(1996)、およびKukasjaarviら、
Genes、Chromosomes and Cancer 18:94−1
01(1997)に記載されている。これらの刊行物に記載された増幅DNAの
使用はまた、一般に、本明細書で開示された方法を用いて増幅されたDNAに適
用可能である。PCRを基礎にしたゲノム全体増幅とは異なり、ゲノム全体鎖置
換増幅は、ハプロ型分析に適切である。なぜなら、WGSDAは、PCRを基礎
にしたゲノム全体増幅より長いフラグメントを生じるからである。PCRを基礎
にしたゲノム全体増幅はまた、ハプロ型分析により適切ではない。なぜなら、P
CRにおける各サイクルが、同一フラグメント中に一緒に置かれる、(ゲノム中
の)遠い配列の会合を生じるプライミング事象に機会を引き起こすからである。
の別の好適な形態では、連結されたDNAが増幅される。連結されたDNAの好
適な形態は、連結されたcDNAである。連結されたDNAは、WGSDAにお
けるように、ランダムまたは部分的にランダムなセットのプライマーを用いてか
、または連結されたDNA中の特異的ハイブリダイゼーション標的に相補的な特
異的プライマーを用いて増幅され得る。MSDA−CDは、複合体混合物または
比較的短い核酸試料(すなわち、ほぼ100〜6,000ヌクレオチドの範囲に
あるフラグメント)の増幅に好適である。メッセンジャーRNAは、このような
複合体混合物の最も重要な例である。MSDA−CDは、細胞中のすべてのcD
NAを増幅する手段を提供し、これは等価な様式である。連結されたcDNAは
、5,000倍まで増幅され得るので、MSDA−CDは、ほんの2〜3の細胞
に基づくRNAプロファイル分析を可能にする。MSDA−CDを実施するため
に、DNAは、まず第一に連結工程に供しなければならない。(mRNAのよう
な)RNA試料が増幅される場合、RNAは、最初に、標準的な方法を用いて二
本鎖cDNAに変換される。このcDNA、または増幅されるべき他のDNAフ
ラグメントの任意のセットは、次いで、好ましくはリンカーを取り込んでDNA
連結物に変換される。
り連結(concatenate)され得る。DNAを連結(concaten
ate)する場合、DNAフラグメントの末端の状態(平滑、スタッガーまたは
ラガッド)が考慮されるべきである。例えば、制限酵素もを用いた消化により産
生されるようなスタッガー末端は、オーバーハング配列が適合する場合、連結化
を媒介するために用いられ得る。ラガッドまたはスタッガー末端をもつDNAは
、連結の前に平滑末端にされ得る。これら操作のすべては、周知でありかつ一般
の使用である。リンカーが用いられる場合、リンカーは、(平滑末端リンカーを
用いて)平滑末端DNA、または適合するオーバーハング末端を有するDNA(
この場合リンカーはアダプターの形態であり得る)のいずれかに連結され得る。
を示す。第一に、cDNAは、目的のmRNAから作成される。この例では、c
DNAは、それがリン酸化5’末端を含むような方法で作成される。次いで、c
DNAを、Taq DNAポリメラーゼを用いて両方の3’末端に1つのアデノ
シン残基をテールとして付ける(例えば、Brownsteinら、Biote
chniques 20:1004−1010(1996)により、そしてRe
search Genetics,Inc.のカタログにおいて記載されるよう
に)。次いで、このAテールcDNAは、標準的な連結緩衝液(例えば、Hol
tonおよびGraham、Nucl.Acids Res.19:1156(
1991)、およびPromegaカタログ(Promega Biotec、
Madison、WI、1997)206頁中のpGEM−Tベクターの使用の
ための指示書を参照のこと)中、ATPおよびT4 DNAリガーゼの存在下で
、Tテールリンカーと混合され、そして反応物を、一晩16#Cでインキュベー トし、長い連結されたDNA分子を生成する。この連結された分子は、交互する
順序にある、構造−リンカー−DNA−リンカー−DNA−リンカー−DNA−
の、タンデムに連結されたcDNAおよびリンカーからなる。このAテールおよ
びTテール法は、リンカーおよびDNAフラグメントの、タンデムな、連結され
た(concatenated)連結(ligation)を得るための多くの
可能な方法の1つの例に過ぎない。リンカーなしにDNAフラグメントを連結し
、構造−DNA−DNA−DNA−DNA−の連結された分子を得ることもまた
可能である。リンカーを備えた連結されたDNAフラグメントを、本明細書では
、リンカー−連結されたDNAまたはリンカー−DNA連結物と呼ぶ。リンカー
なしの連結されたDNAフラグメントを、本明細書では、非リンカー−連結され
たDNAまたは非リンカー−DNA連結物と呼ぶ。用語連結されたDNAおよび
DNA連結物は、リンカー−連結されたDNAおよび非リンカー−連結されたD
NAの両方をいう。リンカー−DNA連結物の増幅は、非リンカー−DNA連結
物の増幅より特異的かつ効率的である。なぜなら、特異的プライマーをリンカー
配列に指向させ得るからである。従って、このリンカー−DNA連結法は、MS
DA−CDを実施する好適な形態である。
SDA−CDを用いて得られ得るDNA増幅の程度は、連結されたDNAの長さ
により影響されるからである。連結されたDNAが長い程、そしてそれがより多
くのリンカーを含む程、増幅プロセスはより効率的である。一般に、連結は、高
濃度でフラグメントを連結することが好まれる。
示す。リンカーの異なる鎖上の異なる配列上でプライムする、2つの異なるリン
カー特異的プライマーを用いた。この2つのプライマーは、互いに相補的である
べきではない。図4の一番上は、取り込まれたリンカーを有する二本鎖DNA連
結物である。DNAを変性してそれを一本鎖にし、そして2つのリンカー特異的
プイラマーを利用して、複数鎖置換により増幅する。MSDA−CDは、DNA
試料を5,000倍増幅すると推定され得る。mRNAプロファイリング(Lo
ckhartら)の場合には、転写増幅と組み合わせて用い、検出の限界を改善
し得、わずか20細胞を含む試料中のプロファイリング分析を可能する。
換増幅は、(a)プライマーを連結されたDNA試料と混合し、プライマー−標
的試料混合物を生成すること、そしてこのプライマー−標的試料混合物を、この
プライマー−標的試料混合物中で上記プライマーと上記連結されたDNAとの間
のハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートすること、および
(b)DNAポリメラーゼを、上記プライマー−標的試料混合物と混合し、ポリ
メラーゼ−標的試料混合物を生成すること、およびこのポリメラーゼ−標的試料
混合物を、連結されたDNAの複製を促進する条件下でインキュベートすること
によって実施され得る。好ましくは、鎖置換複製は、鎖置換DNAポリメラーゼ
、または適合する鎖置換因子と組み合わせたDNAポリメラーゼを用いることに
より達成される。
使用のような任意の目的であり得る。例えば、増幅配列は、蛍光標識の検出、酵
素連結検出系、抗体媒介標識検出,および放射活性標識の検出のような核酸に対
する従来の検出系のいずれをも用いて検出され得る。開示された方法の鍵となる
特徴は、増幅がサイクルでは起こらず、連続的な等温複製で起こることである。
これは、増幅を、より簡単し、そして出力においてより大きな一致をもたらす。
鎖置換は、単一の連続等温反応で、核酸配列または試料の複数コピーの迅速生成
を可能にする。リンカーまたはプライマーがプロモーター配列を含む、連結され
たDNAに対して実施された、MSDA−CDによって増幅されたDNA中の配
列は、プロモーターを用いる転写増幅によりさらに増幅され得る。
は、制限酵素消化によりフラグメント化され得る。増幅DNAの切断は、さらな
るプロセッシングおよび増幅DNAの分析を可能または簡略化し得る。用いられ
る部位がまれであるような場合(例えば、8塩基認識部位)、得られるフラグメ
ントは、連結された当初のDNAフラグメントを示す。
れは連結されたDNAをランダムにプライムする。ランダムまたは大部分がラン
ダムな配列のプライマーの十分に大きなセットを選択することにより、セット中
のプライマーは、連結されたDNA中に分布される核酸配列に対して、集合的、
およびランダム、相補的である。増幅は、各プライマーで開始された前進的ポリ
メラーゼを用いた複製により進行し、そして自然に停止するまで継続する。この
方法の鍵となる特徴は、ポリメラーゼによる複製の間に介在するプライマーの置
換である。このようにして、全連結されたDNA試料の複数の重複するコピーが
短時間に合成され得る。
Aの多重鎖置換増幅は、(a)ランダムまたは部分的にランダムなプライマーの
セットを連結されたDNA試料と混合し、プライマー−標的試料混合物を生成す
ること、そしてこのプライマー−標的試料混合物を、このプライマー−標的試料
混合物中で上記プライマーと上記連結されたDNAとの間のハイブリダイゼーシ
ョンを促進する条件下でインキュベートすること、および(b)DNAポリメラ
ーゼを、上記プライマー−標的試料混合物と混合し、ポリメラーゼ−標的試料混
合物を生成すること、およびこのポリメラーゼ−標的試料混合物を、連結された
DNAの複製を促進する条件下でインキュベートすることによって実施され得る
。ランダムまたは部分的にランダムなプライマーを用いるMSDA−CDはWG
SDAと類似であり、そしてほぼ図2に示されるように進行する。
セットは、プライマーを核酸試料内で所望の間隔でハイブリダイズすることを可
能にする濃度で用いられることが好ましい。例えば、プライマーのセットを、そ
れらが、平均して4000〜8000塩基ごとにハイブリダイズすることを可能
にする濃度で用いることにより、これらの部位で開始したDNA複製が伸び、そ
して隣接部位から複製される鎖を置換する。プライマーは、規則的な間隔で標的
配列にハイブリダイズすることは予期されないことに注意すべきである。むしろ
、平均の間隔は、プライマー濃度の一般的機能である。
のハイブリダイゼーション、および引き続く別のラウンドの複製の開始に利用可
能にする。プライマーセット中のプライマーが標的配列にハイブリダイズする間
隔は、増幅のレベルを決定する。例えば、平均間隔が短い場合、隣接鎖は迅速お
よび頻繁に置換される。平均間隔が長い場合、隣接鎖は、長い行程の複製後のみ
置換される。
り直接的に検出され得る。
チン化ヌクレオチド、ジゴキシゲニン含有ヌクレオチド、またはブロモデオキシ
ウリジン)を取り込むことからなる。例えば、100ヌクレオチドごとに4アナ
ログの頻度で、シアニン色素UTPアナログ(Yuら、(1994))を取り込
み得る。インサイチュで増幅された核酸を検出するための好ましい方法は、Br
dUrdをともなう増幅の間にDNAを標識し、続いて取り込まれたBUDRに
ビオチン化抗BUDR抗体(Zymed Labs,San Francisc
o,CA)を結合させ、続いてビオチン部分にストレプトアビジン-ペルオキシ ダーゼ(Life Sciences,Inc.)を結合させ、最終的に、フル
オレセイン-トリアミド(DuPont de Nemours&Co.,Me dical Products Dept.)による蛍光を発光させることであ
る。
NAまたはRNAを検出することからなる。例えば、プライマーは、その非相補
的部分に、公知の任意の配列(検出タグと呼ばれる)を含むように設計され得る
。2次ハイブリダイゼーション工程は、これらの検出タグに検出プローブを結合
させるために使用され得る。検出プローブは、例えば、酵素、蛍光部分、または
放射性同位元素を用いて、上記のように標識され得る。プライマーあたり3つの
検出タグ、および各検出プローブあたり4つの蛍光部分を用いることにより、複
製鎖ごとに合計12の蛍光シグナルを入手し得る。
レイ検出 増幅核酸の検出は、異なるプライマー(各セットは、異なる標的配列を増幅す
るために設計されている)のセットを用いることにより複合化され得る。それら
の標的を見出し得るプライマーのみが、増幅産物を生じる。所定の増幅核酸を、
半導体検出器中の固定位置に捕獲するために2つの代替法がある。1つは、プラ
イマーの非相補的部分に、各独特のセットのプライマーについて独特のアドレス
タグ配列を含めることである。次いで、所定のセットのプライマーを使用して増
幅された核酸は、特異的なアドレスタグ配列に対応する配列を含む。第2番目の
そして好適な代替法は、標的配列中に存在する配列をアドレスタグとして用いる
ことである。 (d)酵素連結検出 標識ヌクレオチドの取り込みによって標識された増幅核酸は、確立した酵素連
結検出システムで検出され得る。例えば、ビオチン−16−UTP(Boehr
ingher Mannheim)の取り込みによって標識された増幅核酸は、
以下のように検出され得る。核酸を、増幅核酸中に存在する標的配列(または、 その相補物)に相補的な相補的DNAオリゴヌクレオチド(アドレスプローブ) とのハイブリダイゼーションによって、固体ガラス表面上に固定する。ハイブリ
ダイゼーション後、ガラススライドを洗浄し、そしてアルカリフォスファターゼ
-ストレプトアビジンコンジュゲート(Tropix,Inc.,Bedfor d,MA)と接触させる。この酵素−ストレプトアビジンコンジュゲートは、増
幅核酸上のビオチン部分へ結合する。過剰な酵素コンジュゲートを取り除くため
スライドを再び洗浄し、そして化学蛍光基質CSPD(Tropix,Inc.
)を添加し、そしてカバーガラススリップで覆う。次いで、スライドをBior
ad Fluorimagerで画像化し得る。
の改変方法は、直鎖置換増幅(LSDA)と呼ばれ、そしてすべてのプライマー
が標的配列の同じ鎖に相補的であるプライマーセットを用いることにより達成さ
れる。LSDAでは、MSDAにおけるように、プライマーのセットが標的配列
にハイブリダイズし、そして鎖置換増幅が起こる。しかし、標的配列の1つの鎖
のみが増幅される。LSDAは、新たなセットのプライマーを標的配列にハイブ
リダイズさせるために、複製の各ラウンドの間に熱サイクリングを必要とする。
このような熱サイクリングは、PCRで用いられるそれと同様である。しかし、
直線状、または単一プライマーPCRとは異なり、LSDAにおける複製の各ラ
ウンドは、標的配列の複数コピーを生じる。用いた各プライマーに対して1コピ
ーが作成される。従って、LSDAで20のプライマーが用いられる場合、20
コピーの標的配列が、複製の各サイクルで作成される。
増幅され得る。この目的のために、プロモーター配列を、鎖置換増幅に用いたプ
ライマーの非相補的部分中、またはMSDA−CDについてDNAを連結するた
めに用いるリンカー配列に含め得る。
ーセットの各々が7)を用いる多重置換増幅を例示する。各セット中のプライマ
ーは、増幅されるべき領域のそれぞれの側にある対向する鎖にハイブリダイズす
るように設計されている。
利用可能であることを保証する。合計10μgのバクテリオファージλDNAを
、100μlのT4リガーゼ緩衝液(10mM Tris、pH7.5、0.2
0M NaCl、10mM MgCl2、2mM ATP)中に溶解した。T4 DNAリガーゼを最終濃度8単位/μlに添加し、そしてDNA中の任意のニ
ックを閉鎖するために、この材料を、1.5時間37#Cでインキュベートし、 それを完全に二本鎖にした。次いで、このDNA溶液を、蒸留水で5倍に希釈し
、20ng/μlの最終DNA濃度とした。
を、18.2μlの蒸留水、および適切な複数プライマー混合物(標準的なホス
ホルアミダイト化学により作成されたプライマー)と混合した。本実施例で用い
たプライマーを以下に示す。命名は、左プライマーに対して「PL」そして右プ
ライマーに対して「PR」である。7つの左プライマーおよび7つの右プライマ
ーを用いた。7プライマーの各セットについて、配列は、互いの間が300〜4
00ヌクレオチドの間隔を置いている。プライマーにより標的されるλDNAは
、マップ位置39500〜22000により境界を画される領域内に位置し、そ
して合計約17500塩基を含む。この領域は、2322bpおよび9416b
pのλHindIIフラグメントを包含する。
イクロモル濃度であるように添加した。λDNAおよびプライマー混合物を、ラ
ムダDNAを変性するために95#Cで2.5分間加熱し、そしてチューブを直 ちに氷中に置いた。
た: (a)3μlの10×反応緩衝液、40mM Tris−HCl(pH7.5
)、25mM NaCl、8mM MgCl2、6.7mM DTT、5%v/ v DMSO(ジメチルスルホキシド)、および400μM mM dATP、
dGTP、dCTP、dTTPの最終濃度を生じるように設計されている。いく
つかのMSDA反応は、1%〜7%の範囲にある異なる濃度のDMSOでより良
好に進み得る。
B)。
e2.0(Amersham Life Sciences)。
に、30mM Tris−HCl(pH8.2)、150mM NaCl、1m
M EDTAを含む緩衝液中、55#Cで2〜24時間の任意の時間インキュベ ートされ得る。増幅収率は、増幅されるべきDNA領域の各側上により多くのプ
ライマーを用いることにより増大され得る。このために適切な数のプライマーは
、所望のDNAドメインの各側上に10〜30プライマーの範囲であり得る。各
側上に24を超えるプライマー数は、非特異的増幅の頻度を増大し得る。
れるようなゲノム全体増幅についてである。
フェノール/クロロホルムを用いる抽出を用いて抽出した。このDNAは、Pi
co−Green色素法(Molecular Probes,Inc.Eug
ene,Oregon;Kit P−7589)を用いて定量し、次いでこの材
料を、TE−0.2緩衝液(10mM Tris pH8.3、0.2mM E
DTA)中に希釈し、1ng/μlの最終DNA濃度を得た。
500μlの微小遠心分離チューブ中で混合し、そして97#Cで5分間変性し た。次いでチューブを直ちに氷中に置いた。
薬を添加することによりセットアップし、以下に示す最終濃度を与えた: (a)3μlの10×反応緩衝液、25mM Tris−HCl(pH8.8
)、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.
1% Triton X−100、5%v/vDMSO(ジメチルスルホキシド
)、および400μM mM dATP、dGTP、dCTP、dTTPの最終
濃度を生じるように設計されている。
レオチドプライマー。
ンパク質。
リメラーゼ大フラグメント(New England Biolabs)。
的の核酸を含む二本鎖核酸分子である(斜線領域)。右のセットのプライマーお
よび左のセットのプライマーがこの核酸分子にハイブリダイズする。中部に示す
のは、各プライマーから伸長されつつある、複製される核酸の多重鎖である。各
伸長鎖の末端におけるポリメラーゼは、その先のプライマーの伸長鎖を置換する
。下部に示すのは、さらに伸長された、複製される核酸の多重鎖である。新たに
複製された鎖におけるそれらの相補的な部位にハイブリダイズする次のセットの
プライマーもまた示される。新たに複製された鎖によって、続きの鎖のポリメラ
ーゼ伸長による置換を介してプライマーへのハイブリダイゼーションについて利
用可能になる。
ゲノムDNAの図的表現がある。ランダムまたは部分的にランダムなプライマー
のセットからのプライマーがその核酸分子に対してハイブリダイズする(プライ
マー長は、測定されることを意図しない)。単純さのために、ゲノムDNAの1
分子の一部のみを示す。中部に示すのは、各プライマーから伸長されつつある、
複製される核酸の多重鎖である。各伸長鎖の末端でのポリメラーゼが、それが遭
遇する任意のプライマーの伸長鎖を置換する。ランダムまたは部分的にランダム
なプライマーのセットからのさらなるプライマーもまた示し、これは、新たに複
製された鎖における相補的部位にハイブリダイズする。新たに複製された鎖は、
次の鎖を伸長するポリメラーゼによる置換を通してプライマーへのハイブリダイ
ゼーションについて利用可能にされる。下部に示すのは、さらに伸長した、複製
された核酸の多重鎖である。単純さのために、もとの合成鎖のうち4つのみ(上
側の標的配列鎖上の2つおよび下側の標的配列鎖上の2つ)を、下部パネルに示
す。
的の核酸を含む二本鎖核酸分子である(斜線領域)。右のセットのプライマー(
上部パネル中の上側鎖)および左のセットのプライマー(上部パネル中の下側の
鎖)がこの核酸分子にハイブリダイズする。中部に示すのは、各プライマーから
伸長されつつある、複製される核酸の多重鎖である。新たに複製された鎖のそれ
らの相補部位に対してハイブリダイズするプライマーの次のセットもまた示され
る。この新たに複製された鎖は、次の鎖を伸長するポリメラーゼによる置換を通
してそのプライマーへのハイブリダイゼーションについて利用可能にされる。各
伸長鎖の末端におけるポリメラーゼは、その先のプライマーの伸長鎖を置換する
。下部に示すのは、さらに伸長した、複製された核酸の多重鎖である。単純さの
ために、もとの合成鎖のうち4つのみ(上側の標的配列鎖上の2つおよび下側の
標的配列鎖上の2つ)を、下部パネルに示す。
上部には、リンカーと連結したDNAの図的表現がある。中部には、リンカー配
列と相補的なプライマーが、連結DNAの変性鎖にハイブリダイズされる(リン
カーおよびプライマーの長さは測定されることを意図しない)。単純さのために
、連結DNAの1分子の一部のみを示す。下部に示すのは、各プライマーから伸
長されつつある、複製される核酸の多重鎖である。各伸長鎖の末端のポリメラー
ゼは、それが遭遇する任意のプライマーの伸長鎖を置換する。新たに複製された
鎖上の複製されたリンカー配列における相補部位に対してハイブリダイズするさ
らなるプライマーもまた示される。新たに複製された鎖は、次の鎖を伸長するポ
リメラーゼによる置換を通じてそのプライマーとのハイブリダイゼーションにつ
いて利用可能にされる。
Claims (18)
- 【請求項1】 核酸を増幅する方法であって、以下の工程: (a)1セットのプライマーと標的サンプルとを混合して、プライマー−標的
サンプル混合物を生成する工程、および該プライマー−標的サンプル混合物を、
該プライマー−標的サンプル混合物における該プライマーと核酸との間のハイブ
リダイゼーションを促進する条件下でインキュベートする工程であって、ここで
、 該1セットのプライマーがランダムヌクレオチド配列を有するプライマーを含
み、そして各プライマーが定常部分およびランダム部分を含み、そして各プライ
マーの該定常部分が同じヌクレオチド配列を有し、そして各プライマーの該ラン
ダム部分がランダムヌクレオチド配列を有する、工程; (b)DNAポリメラーゼと該プライマー−標的サンプル混合物とを混合して
、ポリメラーゼ−標的サンプル混合物を生成する工程、および該ポリメラーゼ−
標的サンプル混合物を、該核酸の複製を促進する条件下でインキュベートする工
程であって、ここで、 該核酸の複製が複製鎖を生じ、そして複製の間に、少なくとも1つの該複製鎖
が別の複製された鎖の鎖置換複製によって該核酸から置換されている、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項2】 前記標的サンプルが高度に複雑な核酸サンプルである、請求
項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記標的サンプルがゲノム核酸サンプルである、請求項2に
記載の方法。 - 【請求項4】 前記プライマーが12〜60ヌクレオチド長である、請求項
2に記載の方法。 - 【請求項5】 前記プライマーが12〜40ヌクレオチド長である、請求項
4に記載の方法。 - 【請求項6】 前記プライマーが15〜40ヌクレオチド長である、請求項
5に記載の方法。 - 【請求項7】 前記プライマーが15〜25ヌクレオチド長である、請求項
6に記載の方法。 - 【請求項8】 前記プライマーがすべて同じ長さである、請求項2に記載の
方法。 - 【請求項9】 標的核酸配列を増幅する方法であって、以下の工程: (a)2セットのプライマーと標的サンプルとを混合して、プライマー−標的
サンプル混合物を生成する工程、および該プライマー−標的サンプル混合物を、
該プライマー−標的サンプル混合物における該プライマーと該標的配列との間の
ハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートする工程であって、
ここで、 該標的配列が連結されたDNAであって、そして該連結されたDNAがリンカ
ーと連結されており、そして各リンカーがプライマー相補部分を含み、そして各
プライマーが相補部分を含み、そして各プライマーの該相補部分が該リンカーの
該相補部分に相補的である、工程; (b)DNAポリメラーゼと該プライマー−標的サンプル混合物とを混合して
、ポリメラーゼ−標的サンプル混合物を生成する工程、および該ポリメラーゼ−
標的サンプル混合物をインキュベートして、そして該標的配列が複製される工程
であって、ここで、 該標的配列の複製が複製された鎖を生じ、そして複製の間に、該複製された鎖
の少なくとも1つが、別の複製された鎖の鎖置換複製によって該標的配列から置
換される、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項10】 前記2セットのプライマーが、右のセットのプライマーお
よび左のセットのプライマーとからなり、ここで、 該リンカーが第一の鎖および第二の鎖を有する二本鎖であり、 該該右のセットのプライマーの相補性部分がすべて、前記リンカーの第一の鎖
と相補的であり、そして 該左のセットのプライマーの相補性部分がすべて、前記リンカーの第二の鎖と
相補的である、 請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 前記右のセットのプライマーが単一プライマーからなり、
そして前記左のセットのプライマーが単一プライマーからなる、請求項10に記
載の方法。 - 【請求項12】 前記連結されたDNAが、複数のDNAフラグメントを一
緒に連結することによって形成される、請求項9に記載の方法。 - 【請求項13】 前記DNAフラグメントがmRNAから作製されたcDN
Aである、請求項12に記載の方法。 - 【請求項14】 前記mRNAが細胞から単離されたmRNAの混合物を含
む、請求項13に記載の方法。 - 【請求項15】 請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法であって、さ
らに(b)前記ポリメラーゼ−標的サンプル混合物を、鎖置換を促進する条件下
でインキュベートする工程、を包含する、方法。 - 【請求項16】 前記複製を促進する条件が実質的に等温である、請求項1
〜14のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項17】 前記複製を促進する条件がサーマルサイクリング工程を包
含しない、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項18】 前記工程(b)がサーマルサイクリング工程を包含しない
、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
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