CN101842494B

CN101842494B - 用于改进的核酸扩增反应的嵌合引物

Info

Publication number: CN101842494B
Application number: CN200880105297.0A
Authority: CN
Inventors: 奥菲尔·皮莱格
Original assignee: Genaphora Ltd
Current assignee: Infinix
Priority date: 2007-07-03
Filing date: 2008-07-03
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2028-07-03
Also published as: AU2008272421B2; ES2647237T3; WO2009004630A1; EP2162551B1; CN101842494A; EP2162551A1; CA2691942C; US20100291635A1; AU2008272421A1; CN103320506B; CA2691942A1; CN103320506A; US8460874B2

Abstract

提供了用于核酸序列扩增的方法。本方法使用RNA/DNA嵌合寡核苷酸作为引物。所述引物具有沿其长度散在分布的RNA残基，且引物中没有两个核糖核苷酸是彼此相邻的。本方法可用于减少如引物二聚体等非特异性扩增产物。本发明还提供了包含用于实践本扩增方法的RNA/DNA嵌合寡核苷酸引物的试剂盒。

Description

用于改进的核酸扩增反应的嵌合引物

发明领域

本发明涉及核酸扩增领域。具体来说，本发明涉及DNA引物和探针中的核糖核苷酸在减少DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应中的非特异性产物的用途。

发明背景

在如聚合酶链反应(PCR)和实时定量PCR(qPCR)等DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应中会产生非特异性扩增产物。此人工产物来源于由引物之间或者引物与探针(如TaqMan^TM及分子信标探针)之间的弱相互作用所产生的不恰当的杂交产物，这些杂交产物命名为引物二聚体(Rychlik，1995)和引物-探针二聚体。反应混合物中，引物3’端和非靶向寡核苷酸链中碱基的弱互补性导致这些不希望得到的产物的形成。这将使引物和非靶向链发生退火，随之在热稳定性DNA聚合酶的作用下发生非特异性二聚体的起始和延伸，从而导致不希望得到的副产物的有效扩增。

在实时PCR中，30个循环以后(Watson，1989)在3’末端至少一个核苷酸存在互补性、以及40个循环以后根本无3’互补性的情况下，由于掩盖低浓度靶序列检测的非特异性副产物的出现，从而使此问题更加严重。在多重PCR扩增反应和qPCR中，由于在反应混合物中多对引物和探针的存在，导致反应的敏感性和质量降低，使得此问题尤为突出。需要提前将靶序列扩增到高拷贝数的高分辨率熔解(HRM)分析对样品的纯度尤为敏感。扩增后人工产物如引物二聚体或者非特异性副产物的存在可能使HRM的结果难以解释。

Ferrie等(1992)表明在冷启动的条件下，在多重反应中，不考虑任何的引物互补性，两种不同引物的每一种可能的组合都将形成引物二聚体。

通过仔细的引物设计、严谨PCR规程的使用(Don等，1991)以及“热启动”酶的使用(Chou等，1992；D’Aquila等，1991；TaqMan^TM PCR试剂盒规程，P.E.Applied Biosystems)可以减少非特异性扩增产物。但是，热启动酶确实“泄露(leak)”，很明显没有绝对的热启动酶。

几种减少PCR中非特异性扩增产物的方法已有描述：美国专利申请2003/0175769批露了聚-羟基-芳基-聚-酸和3-6邻羟基酸部分作为可以避免引物二聚体形成的核酸扩增反应添加剂的用途。欧洲专利申请EP0866071和PCT申请WO 2006/112818批露了在引物3’末端或其附近的共价修饰的核苷酸减少非特异性扩增产物，尤其是引物二聚体的用途。

欧洲专利申请EP 1201768批露了减少非特异性扩增的方法和试剂，其涉及寡核苷酸引物的使用，其中引物3’端3个核苷酸中的至少一个是选择自以下所组成的组的修饰的核苷酸：2’-O-氨基-甲基-核苷酸、2’-氨基-甲基-核苷酸、2’-氟-核苷酸和阿拉伯糖核苷酸。

美国专利第7,205,129号和PCT申请WO 01/64952批露了在核酸扩增过程中基于使用模板缺省性寡核苷酸作为引物以减少人工产物的方法的应用。这些模板缺省性寡核苷酸包括模板缺省性核苷酸，优选位于5’末端或其附近。这些模板缺省性核苷酸可以是修饰的核苷酸、衍生的核苷酸、核苷酸类似物或者核糖核苷酸，它们并不能充当核酸合成的模板，也就是说，它们阻止了和包含模板缺省性核苷酸的核酸链互补的核酸链在模板缺省性核苷酸位点或所述位点以外的合成。换句话说，US7,205,129和WO 01/64952中批露的模板缺省性寡核苷酸引物并不能被完全复制。和本发明不同，US 7,205,129和WO 01/64952教导了在模板缺省性核苷酸位点或所述位点以外阻止DNA延伸。

引物不经过任何修饰的标准情况限制了依赖于DNA依赖性DNA聚合酶扩增如qPCR和HRM等测定的检测敏感性。30个循环以后扩增产物的出现被定义为“黄昏区(twilight zone)”。该检测是有问题的，并且进一步的检测如Tm(解链温度)分析和产物测序等是必需的。

阻止非特异性模板非依赖性产物的形成将防止引物的失活以及反应向无信息作用的副产物方向偏离。在DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应中，非特异性模板非依赖性产物出现的消除或者任何延后应该增强反应的有效性、特异性以及敏感性。

在核酸扩增反应中，现存的消除或者减少人工产物的方法包括对引物进行化学修饰或者向引物中插入RNA碱基序列(两个以上连续的碱基)，这需要特殊的酶促或者其它复杂的化学反应，或者对引物5’末端的核苷酸进行修饰以使反应的起始充分。

因此，存在未被满足的对更简单、更有效、且更经济的改进核酸扩增反应方法的需求，尤其是对具有改善的特异性和敏感性的实时PCR和高分辨率熔解分析应用的需求。

发明概述

本发明提供了减少或者消除非特异性扩增产物和其它人工产物的方法，这些产物是通过体外DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应应用产生的，诸如但不限于聚合酶链反应(PCR)、实时定量PCR(qPCR)和高分辨率熔解(HRM)分析。更具体的说，本发明提供了在DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应中为减少或消除非特异性扩增产物而设计和使用RNA/DNA嵌合引物和探针的材料、试剂盒和方法。

本发明通过在引物和探针的DNA序列中以非随机性的方式，优选不在5’末端并避免RNA连续序列，沿着引物或探针的长度散在嵌入核糖核苷酸来减少非特异性模板非依赖性副产物的形成。本发明的方法阻碍了DNA在RNA修饰位点合成的起始，但是允许在引物的RNA修饰位点以外的DNA延伸。

现已发现，另人吃惊的是，在DNA引物和/或探针(即，RNA/DNA嵌合分子)中仅并入一些核糖核苷酸，即可对减少体外DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应所产生的不期望的人工产物的生成具有有益的影响，条件是所述核糖核苷酸是不相邻的。只向DNA引物和/或探针中嵌入一些RNA碱基是简单的并且不需要任何特殊的酶促添加剂或者化学操作。

不希望被任何特殊的理论或者作用机制所约束，本发明部分基于这个发现，即在模板链中处于起始区附近的RNA碱基的存在显著降低DNA合成的起始效率，但模板链中所嵌入的RNA碱基对于引物链DNA的延伸影响没有这么显著，条件是RNA碱基不相邻。在本发明的上下文中，起始区被定义为DNA合成在引物-模板双链体上开始的点。

现批露，在DNA引物和探针中预先设计的位置嵌入RNA碱基显著减少了DNA依赖性DNA扩增反应中非特异性扩增产物的形成。在标准的扩增反应条件下(即当引物和探针只包含DNA时)，由于反应混合物中存在大量的过剩引物，引物和探针除了为希望的靶序列的扩增外，也为导致引物扩增的不希望的非特异性反应提供了一个功能性的起始区。相对比之下，本发明中RNA/DNA嵌合引物和探针被设计为在形成非特异性双链体时提供了一个非功能性的起始区，从而在反应混合物中使RNA/DNA嵌合体-靶模板双链体成为唯一可用的起始区。但是，因为在没有和本发明的RNA/DNA嵌合引物中一样的RNA连续序列存在的条件下，即使模板中只嵌入了若干核糖核苷酸时，DNA的延伸也是可能的，所以靶序列的扩增将会进行下去，即使效率稍有降低。

因此，本发明提供了用于通过使用RNA/DNA嵌合寡核苷酸引物而减少或消除DNA依赖性DNA聚合酶扩增中非特异性模板非依赖性产物的方法，因此提高了用PCR检测和定量靶序列的特异性和敏感性。根据可选的实施方案，使用RNA/DNA嵌合寡核苷酸引物和探针进行扩增。

本发明还提供了用于减少或消除DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应中非特异性模板非依赖性产物的试剂盒，其包括用于DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应的RNA/DNA嵌合引物和必需的化学成分以及酶。根据可选的实施方案，使用RNA/DNA嵌合寡核苷酸引物和探针进行扩增。

一方面，本发明提供了减少或消除DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应中人工产物和非特异性扩增产物形成的方法。本方法包括使用至少一个RNA/DNA嵌合寡核苷酸作为正向引物或者作为反向引物以及DNA依赖性DNA聚合酶来扩增靶序列，和使用任选地一个或多个寡核苷酸探针，其中嵌合寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸；且其中位于嵌合寡核苷酸的3’末端或位于嵌合寡核苷酸的3’末端的10个核苷酸以内的核糖核苷酸的数目将允许当引物和预期的靶序列形成双链体时的DNA合成的起始而不会阻止DNA的延伸，并且将阻碍从引物-引物二聚体或引物-探针二聚体起始的DNA合成；并且其中引物中没有两个核糖核苷酸彼此相邻。

在一些实施方案中，正向引物和反向引物都是RNA/DNA嵌合寡核苷酸。

在一些实施方案中，用于扩增反应的所有的引物和探针均具有与3’末端碱基相同的碱基。在优选的实施方案中，嵌合寡核苷酸相同的3’末端碱基选自A或T。在某些实施方案中，和至少一个嵌合引物3’末端的所述碱基“互补”的碱基或者和所述“互补”碱基相邻的碱基是核糖核苷酸。举例来说，如果末端碱基是T，则引物里的每个A可被替换为核糖核苷酸，或者核糖核苷酸可被置于与引物中的每个A相邻，以阻碍任何假设的可能形成的引物-引物二聚体扩增的起始。

在不同的实施方案中，在反应混合物中，每个嵌合引物或探针包含至少一个核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一个引物或探针的3’末端互补的至少一个核苷酸处，或位于该核苷酸上游或下游1至5个核苷酸内。在优选的实施方案中，在反应混合物中，每个嵌合引物或探针包含核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一个引物或探针的3’末端互补的至少一个核苷酸处或者与该核苷酸相邻。

本发明的方法可应用于任何DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应和扩增产物的检测方法中。在一些实施方案中，DNA依赖性DNA聚合酶扩增选自由以下所组成的组：指数滚环扩增(ERCA)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、聚合酶链反应(PCR)、实时定量PCR(qPCR)、自主序列复制(3SR)、使用Qβ复制酶的扩增、和循环测序。在优选的实施方案中，DNA依赖性DNA聚合酶扩增是实时定量PCR(qPCR)。

另一方面，本发明提供了实施DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应的试剂盒。该试剂盒利用上述方法和材料，可用于减少或消除DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应中的非特异性扩增产物。

在一些实施方案中，此试剂盒包括：(i)至少一个作为正向引物或者作为反向引物的RNA/DNA嵌合寡核苷酸，以及任选地一个或多个寡核苷酸探针，其中嵌合寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸，其中位于嵌合寡核苷酸的3’末端或位于嵌合寡核苷酸的3’末端的10个核苷酸以内的核糖核苷酸的数目及组成将允许当引物和预期的靶序列形成双链体时的DNA合成的起始而不会阻止DNA的延伸，并且将阻碍从引物-引物二聚体或者引物-探针二聚体起始的DNA合成，其中引物中没有两个核糖核苷酸彼此相邻；(ii)DNA依赖性DNA聚合酶；和(iii)实施扩增反应的必需试剂和缓冲剂。

在一些实施方案中，试剂盒中的所有的引物和探针均具有与3’末端碱基相同的碱基。在优选的实施方案中，嵌合寡核苷酸相同的3’末端碱基选自A或T。在某些实施方案中，和至少一个嵌合引物3’末端的所述碱基“互补”的碱基或者和所述“互补”碱基相邻的碱基是核糖核苷酸。

在不同的实施方案中，在试剂盒中，每个嵌合引物或探针包含至少一个核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一个引物或探针的3’末端互补的至少一个核苷酸处或位于该核苷酸上游或下游1至5个核苷酸内。在优选的实施方案中，在试剂盒中，每个嵌合引物或探针包含核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一个引物或探针的3’末端互补的至少一个核苷酸处或者与该核苷酸相邻。

本试剂盒可用于进行任何种类的DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应。根据不同的实施方案，DNA依赖性DNA聚合酶扩增选自由以下所组成的组：指数滚环扩增(ERCA)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、聚合酶链反应(PCR)、实时定量PCR(qPCR)、自主序列复制(3SR)、使用Qβ复制酶的扩增、和循环测序。

在一些实施方案中，试剂盒还包含检测核酸扩增产物的工具，举例来说，可检测的标记、荧光性探针或者小沟结合物荧光染料。

根据下面的详细描述和随后的实施例可以更加充分的理解本发明。

附图简述

图1是显示利用RNA/DNA嵌合引物，模板依赖的扩增的第一个循环是如何进行的图解。起始区(IN)和延伸区(EL)没有嵌入的RNA碱基。模板序列(SEQ ID NO：1)是一个假想的序列，并且和NCBI核苷酸数据库中的序列没有显著相似性。RNA碱基为黑体。

图2是显示利用RNA/DNA嵌合引物，模板依赖的扩增的第二个循环是如何进行的图解。延伸区(EL)包含RNA碱基。RNA碱基为黑体。

图3是显示利用RNA/DNA嵌合引物，模板依赖的扩增的第三个循环是如何进行的图解。延伸区(EL)包含RNA碱基。RNA碱基为黑体。

图4是显示DNA合成的起始是如何在RNA/DNA嵌合引物二聚体中被阻断的图解。DNA合成的起始是无效率或者是不可能的，因为两条链上的起始区(IN)都包含RNA碱基。嵌入的RNA碱基为黑体。

图5代表了使用RNA/DNA嵌合引物和常规DNA引物的菌株犬埃里希氏体(Ehrlichia canis，EC)16s RNA基因的实时定量PCR测定结果。

图6显示了使用RNA/DNA嵌合引物和常规DNA引物的菌株犬埃里希氏体(EC)16s RNA基因的检测产物之间ΔC(t)值的差异。这里将ΔC(t)计算为模板样品的C(t)值和非靶对照(NTC)的C(t)值之间的差异。

图7显示了相比常规DNA引物(图7B)，使用RNA/DNA嵌合引物(图7A)的菌株犬埃里希氏体(EC)16s RNA基因的实时定量PCR检测测定的更高敏感性。

图8显示了相比常规DNA引物(图8B)，使用RNA/DNA嵌合引物(图8A)的菌株犬巴倍氏菌(Babesia canis，BC)hsp70基因的实时定量PCR检测测定的更高敏感性。

图9代表使用DNA引物(图9A)和嵌合引物(图9B)的犬ACTB基因的Tm(解链温度)分析。图9A显示使用DNA引物的高稀释度非特异性产物峰，而在嵌合引物的情况下，唯一显著的峰则是ACTB峰。一个显著的峰是进行后续PCR HRM分析的先决条件。

发明详述

本发明提供了用于减少或消除在体外DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应期间产生的非特异性扩增产物和其它人工产物的方法和试剂盒。本方法应用了RNA/DNA嵌合寡核苷酸引物，以及任选地，应用RNA/DNA嵌合寡核苷酸探针。它们简单、不昂贵而且对任何DNA依赖性DNA聚合酶扩增方法都适用。

定义

为帮助对于本发明的理解，下面定义几个术语。

如本文所用，“引物二聚体”或者“引物-探针二聚体”是扩增反应的双链模板非依赖性人工产物，长度通常接近两个引物长度或者引物和探针长度的总和减去重叠区域。

术语“探针”、“分子信标探针”、“TaqMan探针”和“双标记探针”指一种和特定核酸杂交的核酸探针。对于分子信标来说，探针是发夹形状的序列，中间为和靶序列互补的一段核苷酸，末端则包含短互补序列，其中一端共价结合荧光团(报告染料)，另一端则结合淬灭染料。在初始状态下，两个末端杂交，报告染料和淬灭染料距离足够靠近，以便报告染料的荧光被淬灭染料充分的淬灭掉。相反，杂交探针导致形成其中淬灭程度降低的线性构象。对于TaqMan探针和双重标记探针来说，探针则不必要为发夹形状，并且反应应包括5’-＞3’的水解酶，该水解酶水解5’的标记碱基，从而使探针和淬灭剂分离。因此，通过监测荧光染料的发射光变化，间接地监测扩增产物的形成是可能的(参见，例如，Tyagi，S.和Kramer，F.R.，NatureBiotechnology 14：303-308(1996)；以及Tyagi，S.等，Nat.Biotechnol.16：49-53(1998))。因此，随着反应的进行，扩增产物的数量增加，荧光也随之增加。扩增曲线被描述为代表作为循环数的函数的荧光变化，其中设置一个任意的阈值，通常是从起始循环计算的基线发射平均值以上的10个标准差。一旦阈值被选定，扩增曲线和阈值交叉的点就被定义为阈值循环(C(t))或者交叉点(CP)。阈值循环预知序列的数量。

术语“双链DNA结合染料”或者“非特异性探针”指的是不和单链DNA相互作用但是积极掺入双链DNA并且在此状态下一旦激发则发光的化学成分。荧光染料的例子包括但不限于SYBR Green I、SYTO 9、LC Green、Eva Green等。

如本文所用，术语“核苷酸”或者指脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)或者指核糖核苷酸(包括D-核糖)。术语“核糖核苷酸”和“RNA碱基”以及术语“脱氧核糖核苷酸”和“DNA碱基”可以交互使用。

术语“寡核苷酸”定义为包含两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的分子，优选是6个以上。它的精确大小将取决于很多因素，而这些因素则取决于寡核苷酸最后的功能和用途。

如本文所用的术语“引物”指的是寡核苷酸，它可以充当引物延伸产物的寡核苷酸合成的起始点，引物延伸产物和充当模板的核酸链互补。在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下，在合适的温度和pH中，引物延伸得以起始。

术语“靶标”和“靶序列”指的是待扩增的核酸区域或序列。如本文所用的术语“非特异性扩增”和“模板非依赖性扩增”可以交互使用，指的是非靶序列的核酸序列的扩增，来源于引物和非靶序列的序列的杂交然后充当底物用于引物延伸。

术语“RNA/DNA嵌合体”和“RNA/DNA嵌合寡核苷酸”可以交互使用，定义为包含脱氧核糖核苷酸和至少一个核糖核苷酸的寡核苷酸，其可以在核酸扩增反应中充当引物或者探针。

如本文所用，术语“起始区”指的是引物延伸产物的DNA合成起始发生的区域。它包括在DNA合成的方向上，DNA合成起始和延伸几个核苷酸的点。

本文使用术语“上游”和“下游”来定义在寡核苷酸序列内一个核苷酸相对于另外一个核苷酸的位置。一个核苷酸位于另外一个核苷酸的上游指的是第一个核苷酸位于另外一个核苷酸的5’端。一个核苷酸位于另外一个核苷酸的下游指的是第一个核苷酸位于另外一个核苷酸的3’端。

优选实施方案的描述

已发现RNA/DNA嵌合体引物的使用可以减少或者甚至消除非特异性扩增产物。在已批露的方法中，这种非特异性扩增人工产物包含起始区域的RNA，且其扩增很差。由于非特异性扩增产物的减少或甚至消除，在寡核苷酸引物和探针选定位置里核糖核苷酸的存在增强了实时PCR测定的敏感性。该选择过程并非随机而是可能需要仔细的设计以得到最佳结果。一般来说，RNA碱基可以沿着引物从3’末端直至最后一个5’碱基散在分布。因为引物二聚体是最普遍的人工产物，所以RNA嵌入的最重要的候选碱基位于引物的中部周围。引物5’末端是修饰列表中最不重要的碱基。在设计嵌合体时，首要避免的是会阻止DNA延伸的RNA链。

不希望被任何理论或者作用机制所约缚，似乎非特异性扩增产物主要是当引物3’末端和另一条引物或探针上互补的碱基产生碱基配对时，或者甚至是当引物3’末端和相同引物上互补的碱基自配对时产生的。

因此，在DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应中，如果靠近与另外一个引物或探针的3’端或者其本身3’端互补的碱基处存在核糖核苷酸，那么由于起始区核糖核苷酸的存在，引物二聚体或引物-探针二聚体的延伸将会受到阻碍，并且非特异性扩增产物的产生将会减少甚至消除。

因此，本发明提供了减少或消除DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应中非特异性扩增产物的方法，所述方法包括进行核酸扩增反应，使用了至少一个RNA/DNA嵌合寡核苷酸作为正向引物或者作为反向引物以及DNA依赖性DNA聚合酶来扩增靶序列，和使用任选地一个或多个寡核苷酸探针，其中嵌合寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸；且其中位于嵌合寡核苷酸的3’末端或者位于嵌合寡核苷酸的3’末端的10个核苷酸以内的核糖核苷酸的数目将允许当引物和预期的靶序列形成双链体时的DNA合成的起始而不阻止DNA的延伸，并且将阻碍从引物-引物二聚体或引物-探针二聚体起始的DNA合成；且其中引物中没有两个核糖核苷酸彼此相邻。

当正向引物和反向引物都是RNA/DNA嵌合体时，得到较好的减少非特异性扩增产物的效率。在一些实施方案中，用于扩增反应的所有引物和探针在3’末端都有相同的碱基。期望所有的引物都含有相同的3’末端以最小化需要修饰的碱基数目。在优选的实施方案中，用于扩增反应的所有引物的3’末端都是A或T。

在一些实施方案中，在反应混合物中，至少一个嵌合引物或探针包含核糖核苷酸，此核糖核苷酸位于和其自身3’端或者另外一个引物或探针3’端互补的至少一个核苷酸处，或者与该核苷酸相邻。

在不同的实施方案中，在反应混合物中，每个嵌合引物或探针包含至少一个核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一个引物或探针的3’末端互补的至少一个核苷酸处，或位于该核苷酸1至5个核苷酸内。在优选的实施方案中，在反应混合物中，每个嵌合引物或探针包含核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’端或者另外一个引物或探针的3’端互补的至少一个核苷酸处或者与该核苷酸相邻。

对于RNA碱基的取代来说，无数的构型可用于本发明公开的RNA/DNA嵌合体中，从修饰任何一个和其自身或者其它引物3’端互补的核苷酸或修饰其相邻物(neighbor)到修饰所有这样的核苷酸，只要在修饰的寡核苷酸中没有RNA链的产生。但是修饰所有和其自身以及其它引物3’端互补的核苷酸或所有这样的核苷酸的相邻物并无必要，因为会产生RNA较多的区域并阻断延伸。

RNA碱基可沿着引物从3’末端直至最后一个5’碱基散在分布。因为引物二聚体是最普遍的人工产物，所以需要修饰的最重要的碱基位于引物的中部周围。引物5’端是修饰列表中最不重要的碱基。在设计嵌合体时，首要避免的是会阻止DNA延伸的RNA链。

一般来说，扩增引物的设计和应用在本领域中众所周知。本发明的引物的特征在于将RNA碱基包含在引物序列中。引物的其它方面，比如全长和序列，是按照标准的引物设计规范挑选出来的。本领域技术人员将会知道，通过仔细的设计，用于特定应用的RNA/DNA嵌合体引物或探针的最佳序列将需要最少的实验。

所批露的方法可与任何核酸扩增反应一起使用，如单重和多重反应以及需要核酸扩增反应作为在前步骤的检测，例如HRM分析。使用所批露的RNA/DNA嵌合体的核酸扩增的形式包括涉及指数扩增的恒温或热循环核酸扩增反应、需要指数扩增的恒温或热循环核酸扩增反应、涉及恒温线性扩增的核酸扩增反应、需要恒温线性扩增的核酸扩增反应、涉及滚环扩增的核酸扩增反应、涉及聚合酶链反应的核酸扩增反应和不涉及热循环的核酸扩增反应。核酸扩增反应的例子是指数滚环扩增(ERCA)(在PCT申请第WO 97/19193号中称为链置换级联扩增，以及在Lizardi等，NatureGenetics 19(3)：225232(1998)中称为超分支滚环扩增)和滚环扩增(RCA)(美国专利第5,854,033号；PCT申请第WO 97/19193号；Lizardi等，NatureGenetics 19(3)：225232(1998))；多重置换扩增(MDA)(PCT申请WO99/18241)；链置换扩增(SDA)(Walker等，Nucleic Acids Research 20：16911696(1992)，Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：392396(1992))；基于核酸序列的扩增(NASBA)(Compton，Nature 350：9192(1991))；转录介导的扩增(TMA)(Nelson，Crit Rev Clin Lab Sci 35：369414(1998))；聚合酶链反应(PCR)，实时PCR，以及其它涉及热循环的指数扩增技术，自主序列复制(3SR)和使用Qβ复制酶的扩增(Birkenmeyer和Mushahwar，J.Virological Methods 35：117 126(1991)；Landegren，Trends Genetics 9：199202(1993))；多种涉及热循环的线性扩增技术比如循环测序(Craxton等，Methods Companion Methods in Enzymology 3：20 26(1991))。

使用所批露的RNA/DNA嵌合体的核酸扩增测定的优选形式包括“实时PCR”测定，在这里也指“定量PCR(qPCR)”，和“高分辨率熔解(HRM)”分析。在qPCR方法中，PCR反应的进行是边发生边检测的(也就是实时的)。在这些方法中，荧光双链DNA结合染料，(如SYBR Green I)，或者双重标记探针(如分子信标或者Taqman探针)被用于实时测量扩增产物的量。双重标记探针和非特异性荧光染料之间的最重要的区别在于非特异性荧光染料检测所有的双链DNA，包括非特异性扩增产物。另一方面，双重标记探针方法具有对于不同的序列需要合成不同探针的缺点，这样就增加了测定建立和运行的费用。另外，特异性探针不能进行后续的PCR分析如Tm(解链温度)和HRM，而非特异性染料则是可能的。

在高分辨率熔解(HRM)测定中，在封闭管中进行的PCR后续方法使PCR扩增子中的遗传变异(SNP，突变，甲基化)分析成为可能。它通过允许对双链DNA进行更为详细的热变性研究，并且获得比以往更多的信息，从而比经典的熔解曲线分析更为强大。HRM基于核酸的解离(熔解)行为表征核酸样品。样品可以根据它们的序列、长度、GC含量或链互补性而被分辨出来。即使单个碱基的改变比如SNP(单核苷酸多态性)也可以很容易的被鉴别出来。

最重要的高分辨率熔解应用是基因扫描，是在测序前或者作为测序的替代方法寻找PCR扩增子中未知变异的存在。PCR产物中的突变通过高分辨率熔解是可检测的，因为它们改变了DNA熔解曲线的形状。新一代的DNA染料、高端仪器和复杂分析软件的结合允许检测这些改变，并得出关于潜在的序列群集的信息。

试剂盒

本发明还提供试剂盒，通常是包括用于实施本方法的组分的多容器单元。在一些实施方案中，试剂盒包括一个引物或一组引物，其中至少一个是如本文所公开的RNA/DNA嵌合体。试剂盒的其它组分包括实施本扩增反应所必需的试剂和酶，例如底物核苷三磷酸、二价阳离子、反应缓冲剂、合适的DNA聚合酶、操作规程以及实施反应的说明书。

本试剂盒可用于涉及核酸扩增反应的任何应用，比如传染原的诊断试剂盒、染色体异常产前诊断的试剂盒、遗传病诊断试剂盒、性别确定试剂盒等。在一些实施方案中，试剂盒还包括检测扩增反应产物的工具。扩增产物形成时的测量有很多选择。一种方法应用标记，例如仅结合双链DNA的染料。在这类方法中，扩增产物(为双链)在溶液中结合染料分子形成复合体，利用合适的染料，区别溶液中游离的染料分子和结合在扩增产物上的染料分子是可能的。例如，某些染料只有在结合到扩增产物时才会发荧光。可用于此种普通类方法的染料的实例包括但不限于Molecular Probes，Inc.的Syber Green^TM和Pico Green^TM、Idaho technology.的LCGreen、溴化乙锭、碘化丙锭、色霉素、吖啶橙、Hoechst 33258、Toto-1、Yoyo-1、DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐)。

另外，扩增产物的测量和检测也可以通过例如监测放射性、比色法、吸收、荧光共振能量转移(FRET)、磁性参数或者酶促活性得以实现。因此，可以采用的引物和/或探针的标记包括但不限于荧光团、生色团、放射性同位素、电子密集试剂、酶和具有特异结合配偶体的配体(如生物素-亲和素)。

RNA/DNA嵌合引物的合成

RNA/DNA嵌合引物的合成使用本领域中众所周知的标准化学手段实施，例如Beaucage等1981，Tetrahedron Lett.22：1859-1862的二乙基亚磷酰胺方法；以及美国专利第4,458,066号的固相支持方法。优选地，使用商购获得的核苷酸亚磷酰胺在商购获得的自动DNA合成仪中进行合成反应。如这里所用的适用于合成含修饰核苷酸的寡核苷酸的核苷酸亚磷酰胺和支持物是商购获得的。RNA/DNA嵌合寡核苷酸的合成通过向正在增长的链上逐步加入脱氧核苷和核糖核苷单体而得以实施。每次的添加包括将核苷单体的反应性3’亚磷基偶联至结合到固相支持物上的另外一个核苷的5’羟基上。最后一个核苷加完后，寡核苷酸从支持物上被切下来，保护基团从碱基上被移除，且RNA/DNA嵌合寡核苷酸经纯化后使用。

效率

尽管并不希望被任何理论或者任何特别的机制所约缚，但是据信在DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应中，当RNA被嵌入到起始区时，DNA合成的起始效率受到妨碍，但当RNA嵌入到模板序列中时，DNA延伸的效率受到更低强度的影响。

但是，当产生并不想要的非模板性杂交如RNA/DNA嵌合体引物二聚体时，起始区包含RNA碱基。再一次不希望被任何理论或者任何特别的机制所约缚，认为这会导致扩增循环在动力学上和/或热力学上的无效率。将RNA碱基并入到DNA引物上可能会使碱基配对不稳定。但是，引物二聚体不稳定可能要比引物-靶DNA杂交体的不稳定更为复杂。Nakano等研究了DNA嵌合接点的热力学，且表明嵌合接点(rd/dd和dr/dd)的最近邻ΔG37℃和DNA杂交体(dd/dd)并不同(Nakano等(2004)J Am ChemSoc，126，1088-1095)。其并不总是增加但是发生的更频繁。

因此，使用RNA/DNA嵌合引物在低模板DNA扩增反应中减少引物-二聚体人工产物，导致任何DNA依赖的DNA-聚合反应中的检测敏感性的增加。

下面的实施例用一个假想的靶序列进行更为详细的阐述。参考图1，靶模板SEQ ID NO：1所设定的序列将用RNA/DNA嵌合体引物进行扩增(正向引物：SEQ ID NO：2；反向引物：SEQ ID NO：3)。在第一个扩增循环中，扩增子全长的起始和合成包括只用DNA碱基作为模板。

现在参考图2和图3，可以看到熔解和退火后，因为嵌入RNA的引物现在是延伸区的一部分，第二个和第三个扩增循环效率较低，但仍可扩增。在模板依赖的扩增中，RNA碱基总是仅位于延伸区。

另一方面，当不希望得到的非模板杂交发生时，如图4中的RNA/DNA嵌合体引物二聚体，起始区包括RNA碱基。这将引起第一次扩增循环以及所有后续循环的无效率。因此，使用RNA/DNA嵌合体引物在低模板DNA扩增反应中减少引物-二聚体人工产物，且导致任何DNA依赖性DNA-聚合反应中检测敏感性的增加。

本发明呈现了RNA/DNA嵌合体引物对于减少DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应中不希望得到的非特异性扩增产物具有有利效果的证据。这些发现表明RNA/DNA嵌合体引物消除了非特异性扩增产物，并增加了在实时PCR测定中检测低浓度基因拷贝的敏感性及能力。

现在将通过下面的实施例来阐述本发明，这些实施例预期以非限制性形式进行解释。

实施例

方法

标准寡核苷酸以及RNA/DNA嵌合寡核苷酸由Integrated DNATechnologies，Inc.(USA)合成，使用标准的亚磷酰胺化学以及使用IDT的专利合成平台。通过SinglePlexer^TM软件(GenAphora Ltd)进行RNA/DNA嵌合寡核苷酸qPCR测定的引物设计。几个单个RNA碱基被嵌在每个引物中。20μl反应物包含0.5μM每个引物，10⁴质粒DNA和10μl DyNAmo^TMFlash

Green qPCR试剂盒(Finnzymes Oy)。扩增循环为：95℃，7min(第一循环)；94℃，10s；61℃，30s；读板；76℃，1s；读板；39循环；然后61℃，1min；并在65℃-95℃进行解链温度分析。使用提前克隆到pGMT easy(Promega)的菌株犬埃里希氏体(EC)的16s RNA基因、菌株犬巴倍氏菌(BC)hsp70基因和犬肌动蛋白进行测定。利用Chromo4(Bio Rad)，使用双份样品，在～1到～10⁶拷贝/μl不同稀释度内，实施实时qPCR。ΔC(t)值计算为样品的C(t)和非模板对照的C(t)之间的差异。

实施例1

对10⁴拷贝的菌株犬埃里希氏体(EC)的16s RNA基因进行实时PCR，采用DNA引物以及RNA/DNA嵌合引物。

DNA引物：

正向引物：5’-TCGCTATTAGATGAGCCTACGT3’(SEQ ID NO：4)

反向引物：5’-GAGTCTGGACCGTATCTCAGTT-3’(SEQ ID NO：5)

RNA/DNA嵌合引物

(嵌入的RNA碱基为黑体)：

正向引物：5’-TCGCUATUAGATGAGCCUACGT-3’(SEQ ID NO：6)

反向引物：5’-GAGTCTGGACCGUATCTCAGTT-3’(SEQ ID NO：7)

结果呈现在图5中。正如所看到的，当使用DNA引物时、在缺乏模板的情况下，在27个循环以后可以检测到明显的人工产物(见非模板性对照(NTC)曲线)，但是当使用嵌合引物时人工产物仍保持在检测阈值以下。实际上，特异性模板依赖性产物的C(t)值被延后了大概3个循环，但是非特异性产物的消除使检测延长到比常规DNA引物反应至少多13个循环。

RNA/DNA嵌合引物的这一效果在图6中得到进一步展示，其显示了6份样品所计算的ΔC(t)值。可以看到，嵌合引物的检测能力比常规DNA引物多4个循环以上。

实施例2

对一系列稀释度的菌株犬埃里希氏体(EC)的16s RNA基因进行实时PCR，采用和实施例1中相同的DNA以及嵌合引物。结果呈现在图7A和7B中。利用下面的引物对一系列稀释度的菌株犬巴倍氏菌(BC)hsp70基因进行另外一个实时PCR，其结果呈现在图8A和8B中。

DNA引物：

正向引物：5’-GTCATCACTGTGCCTGCGTACT-3’(SEQ ID NO：8)

反向引物：5’-GCATGACGTTGAGACCGGCAAT-3’(SEQ ID NO：9)

RNA/DNA嵌合引物：

(嵌入的RNA碱基为黑体)：

正向引物：5’-GTCATCACTGTGCCTGCGUACT-3’(SEQ ID NO：10)

反向引物：5’-GCATGACGTTGAGACCGGCAAT-3’(SEQ ID NO：11)

此实施例显示当使用RNA/DNA嵌合引物时，扩增反应的敏感性增加。在两个例子中，使用嵌合引物使得检测低浓度的基因拷贝成为可能，可以达到每管几个拷贝。

实施例3

在这个实施例中，利用DNA和嵌合引物对系列稀释度的犬ACTB基因进行qPCR，然后进行Tm分析。

DNA引物：

正向引物：5’-GCGCAAGTACTCTGTGTGGAT-3’(SEQ ID NO：12)

反向引物：5’-GTCGTACTCCTGCTTGCTGAT-3’(SEQ ID NO：13)

RNA/DNA嵌合引物：

(嵌入的RNA碱基为黑体)：

正向引物：5’-GCGCAAGUACTCTGTGTGGAT-3’(SEQ ID NO：14)

反向引物：5’-GTCGUACTCCTGCTTGCTGAT-3’(SEQ ID NO：15)

本实施例展示了在低模板浓度下，在进行HRM分析前，通过使用PCR嵌合引物得到提高的特异性。当使用DNA引物时(图9A)，在Tm图中可以看到非特异性产物峰在70℃到78℃的范围内，而高浓度模板中所预期的扩增子的Tm峰则在81℃到82℃的范围内。图9B显示了当使用DNA/RNA嵌合引物时所得到的Tm图。这里仅在低浓度和高浓度情况下可以看到所预期的峰。通过用DNA/RNA嵌合引物所得到的Tm图也使低浓度情况下的PCR后HRM分析成为可能。

虽然对本发明进行了特别的描述，但是本领域技术人员将会意识到可以做很多变更和修改。所以，本发明不应解释为仅限于所特别描述的实施方案，并且通过参考随后的权利要求将更容易理解本发明的范围和概念。

参考文献

1.Rychlik，W.(1995)Mol.Biotechnol.3，129-134

2.Watson，R.(1989)Amplifications，5-6

3.Ferrie，R.M.，Schwarz，M.J.，Robertson，N.H.，Vaudin，S.，Super，M.，Malone，G.和Little，S.(1992)Am.J.Hum.Genet.51，251-262

4.Don，R.H.，Cox，P.T.，Wainwright，B.J.，Baker，K.和Mattick，J.S.(1991)Nucleic Acids Res.19，4008

5.Chou，Q.，Russell，M.，Birch，D.E.，Raymond，J.和Bloch，W.(1992)Nucleic Acids Res.20，1717-1723

6.D’Aquila，R.T.，Bechtel，L.J.，Videler，J.A.，Eron，J.J.，Gocczyca，P.和Ksplan，J.C.(1991)Nucleic Acids Res.19，3749

7.TaqMan PCR Reagent Kit Protocol：Part Number 402823，Revision A，May 1996page 18：P.E.Applied Biosystems

8.Tyagi，S.和Kramer，F.R.(1996)Nature Biotechnology 14：303-308

9.Tyagi，S.等人.(1998)Nat.Biotechnol.16：49-53

10.Lizardi等人.(1998)Nature Genetics 19(3)：225-232

11.Walker等人.(1992)Nucleic Acids Research 20：1691-1696

12.Walker等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：392-396

13.Compton(1991)Nature 350：91-92

14.Nelson(1998)Crit Rev Clin Lab Sci 35：369-414

15.Birkenmeyer和Mushahwar(1991)J.Virological Methods 35：117-126

16.Landegren(1993)Trends Genetics 9：199-202

17.Craxton等人.(1991)Methods Companion Methods in Enzymology3：20-26

18.Beaucage等人.(1981)Tetrahedron Lett.22：1859-1862

19.Nakano，S.，Kanzaki，T.和Sugimoto，N.(2004)J Am.Chem.Soc.126，1088-1095

序列表

<110>吉纳珀莱有限公司

<120>用于改进的核酸扩增反应的嵌合引物

<130>ZTAL/001 PCT

<140>US 60/947,685

<141>2007-07-03

<160>15

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA序列

<400>1

gcatactaag ctgagcgaca ttggccgtag ccatgcatgt attgctgcta gctgact 57

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>2

gcatactaag ctgagcga 18

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>3

agtcagctag cagcaata 18

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>4

tcgctattag atgagcctac gt 22

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

gagtctggac cgtatctcag tt 22

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>6

tcgcuatuag atgagccuac gt 22

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>7

gagtctggac cguatctcag tt 22

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>8

gtcatcactg tgcctgcgta ct 22

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>9

gcatgacgtt gagaccggca at 22

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>10

gtcatcactg tgcctgcgua ct 22

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>11

gcatgacgtt gagaccggca at 22

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>12

gcgcaagtac tctgtgtgga t 21

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>13

gtcgtactcc tgcttgctga t 21

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>14

gcgcaaguac tctgtgtgga t 21

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>15

gtcguactcc tgcttgctga t 21

Claims

1.至少一个RNA/DNA嵌合寡核苷酸作为正向引物或者作为反向引物或者作为探针和DNA依赖性DNA聚合酶在制备用于在DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应中减少或消除人工产物和非特异性扩增产物形成的试剂盒中的用途，

其中所述嵌合寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸；

其中位于所述嵌合寡核苷酸的3’末端或位于所述嵌合寡核苷酸的3’末端的10个核苷酸以内的核糖核苷酸的数目将允许当所述引物和预期的靶序列形成双链体时的DNA合成的起始而不会阻止DNA的延伸，并且将阻碍从引物-引物二聚体或者引物-探针二聚体起始的DNA合成；和

其中所述嵌合寡核苷酸中没有两个核糖核苷酸彼此相邻。

2.根据权利要求1所述的用途，其中进行核酸扩增反应的步骤使用为RNA/DNA嵌合寡核苷酸的至少一个引物和至少一个探针。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述正向引物和所述反向引物都是RNA/DNA嵌合寡核苷酸。

4.根据权利要求1所述的用途，其中在所述扩增反应中使用的所有的引物和探针均具有与3’末端碱基相同的碱基。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述嵌合寡核苷酸的所述相同的碱基选自A或T。

6.根据权利要求1所述的用途，其中与至少一个嵌合寡核苷酸的所述3’末端互补的碱基或者与所述互补碱基相邻的碱基是核糖核苷酸。

7.根据权利要求1所述的用途，其中在反应混合物中，每个嵌合寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一个引物或探针的3’末端互补的至少一个核苷酸处或者位于该核苷酸上游或下游1至5个核苷酸内。

8.根据权利要求7所述的用途，其中在所述反应混合物中，每个嵌合寡核苷酸包含核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一个引物或探针的3’末端互补的至少一个核苷酸处或者与该核苷酸相邻。

9.根据权利要求1-8所述的用途，其中所述DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应选自由以下所组成的组：指数滚环扩增(ERCA)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、聚合酶链反应(PCR)、实时定量PCR(qPCR)、自主序列复制(3SR)、使用Qβ复制酶的扩增、和循环测序。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述DNA依赖性DNA聚合酶扩增反应是实时定量PCR(qPCR)。

11.根据权利要求1所述的用途，所述试剂盒还包括：

实施所述扩增反应的必需试剂和缓冲剂。

12.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂盒还包括检测所述扩增反应的产物的工具。