ES2230631T3 - Cebadores modificados. - Google Patents
Cebadores modificados.Info
- Publication number
- ES2230631T3 ES2230631T3 ES98104461T ES98104461T ES2230631T3 ES 2230631 T3 ES2230631 T3 ES 2230631T3 ES 98104461 T ES98104461 T ES 98104461T ES 98104461 T ES98104461 T ES 98104461T ES 2230631 T3 ES2230631 T3 ES 2230631T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- primers
- modified
- group
- amplification
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 217
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 217
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 51
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 69
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 66
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 57
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 44
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 44
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 34
- -1 2-naphthylmethyl group Chemical group 0.000 claims description 29
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 26
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 15
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 12
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 12
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 11
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 6
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 4
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 4
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 378
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 78
- 239000002585 base Substances 0.000 description 67
- 239000000047 product Substances 0.000 description 63
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 60
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 54
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 53
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 46
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 32
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 28
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 27
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000009471 action Effects 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 17
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 16
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 13
- 125000006502 nitrobenzyl group Chemical group 0.000 description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 10
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 10
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 10
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 10
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 9
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 8
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 8
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 8
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 241000237955 Nassarius Species 0.000 description 7
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 7
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 7
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 7
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Substances C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 5
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- TWZSNBJODPRUAV-GZBFAFLISA-N 4-(benzylamino)-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(NCC=2C=CC=CC=2)C=C1 TWZSNBJODPRUAV-GZBFAFLISA-N 0.000 description 4
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 4
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000035322 succinylation Effects 0.000 description 4
- 238000010613 succinylation reaction Methods 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 3
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 3
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 3-methyladenine Chemical compound CN1C=NC(N)=C2N=CN=C12 FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010420 art technique Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N benzyl bromide Chemical compound BrCC1=CC=CC=C1 AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;6-amino-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XHBSBNYEHDQRCP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-methyl-3,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound O=C1NC(=N)N(C)C2=C1N=CN2 XHBSBNYEHDQRCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 3-[chloro-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(Cl)OCCC#N QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- FFKUHGONCHRHPE-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione;7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 FFKUHGONCHRHPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GGZZISOUXJHYOY-UHFFFAOYSA-N 8-amino-4-hydroxynaphthalene-2-sulfonic acid Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C=C2C(N)=CC=CC2=C1O GGZZISOUXJHYOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000003498 Agave tequilana Species 0.000 description 1
- 235000005451 Agave tequilana Nutrition 0.000 description 1
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UCHMVRFYJYBEJV-SLLHVTCXSA-N C1[C@@H]([C@H](O[C@H]1N2CN=C3C2=NC=NC3(C(=O)C4=CC=CC=C4)NCC5=CC=CC=C5)CO)O Chemical compound C1[C@@H]([C@H](O[C@H]1N2CN=C3C2=NC=NC3(C(=O)C4=CC=CC=C4)NCC5=CC=CC=C5)CO)O UCHMVRFYJYBEJV-SLLHVTCXSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241001649081 Dina Species 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008021 Nucleoside-Triphosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010075285 Nucleoside-Triphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 208000007542 Paresis Diseases 0.000 description 1
- 239000013616 RNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LTKCXZGFJFAPLY-OERIEOFYSA-N [1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2-oxopyrimidin-4-yl]azanium;chloride Chemical compound Cl.O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 LTKCXZGFJFAPLY-OERIEOFYSA-N 0.000 description 1
- SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N [amino(ethoxy)phosphanyl]oxyethane Chemical compound CCOP(N)OCC SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013581 critical reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid Chemical compound ClO QWPPOHNGKGFGJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 235000020070 mezcal Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- PEECTLLHENGOKU-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-4-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1.CN(C)C1=CC=NC=C1 PEECTLLHENGOKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N n-[9-[(2r,4s,5r)-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]purin-6-yl]benzamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OC[C@@H]1[C@@H](O)C[C@H](N2C3=NC=NC(NC(=O)C=4C=CC=CC=4)=C3N=C2)O1 LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000004533 oil dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 125000006503 p-nitrobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1[N+]([O-])=O)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 208000012318 pareses Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940083251 peripheral vasodilators purine derivative Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M phenylmercury acetate Chemical compound CC(=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012987 post-synthetic modification Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 229940083082 pyrimidine derivative acting on arteriolar smooth muscle Drugs 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran thf Chemical compound C1CCOC1.C1CCOC1 WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Paints Or Removers (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A OLIGONUCLEOTIDOS MODIFICADOS PARA UTILIZACION EN LA AMPLIFICACION DE UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO. LAS AMPLIFICACIONES REALIZADAS EMPLEANDO LOS OLIGONUCLEOTIDOS MODIFICADOS, PRODUCEN UN PRODUCTO DE AMPLIFICACION MENOS INESPECIFICO, ESPECIALMENTE UN DIMERO CEBADOR Y EN UN MAYOR RENDIMIENTO CONCOMITANTE DEL PRODUCTO DE AMPLIFICACION REQUERIDO, COMPARADAS CON LAS AMPLIFICACIONES LLEVADAS A CABO UTILIZANDO COMO CEBADORES OLIGONUCLEOTIDOS NO MODIFICADOS.
Description
Cebadores modificados.
La presente invención, se refiere al sector de la
biología molecular y a la química del ácido nucleico. De una forma
más específica, ésta, se refiere a procedimientos y reactivos para
mejorar el rendimiento productivo de las reacciones de
amplificación del ácido nucleico. La invención, por lo tanto, tiene
aplicaciones en cualquier sector, en el cual, se utilice la
amplificación del ácido nucleico.
La invención de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), hizo posible la amplificación in vitro de
secuencias del ácido nucleico. La PCR, se describe en los
documentos de patente estadounidenses US n^{os} 4.683,195;
4.683.202; y 4.965.188. Saiki et al. 1985, Science
230: 1350-1354; Mullis et al., 1986,
Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol. 51:
263-273; y Mullis y Faloona, 1987; Methods Enzymol:
155: 335-350. El desarrollo y la aplicación
de la PCR, se describe extensivamente en la bibliografía
correspondiente a la literatura especializada. Así, por ejemplo, una
amplia gama de temas relacionados con la PCR, se describen en PCR
Technology-principles and applications for DNA
amplification (Tecnología de la PCR-principios y
aplicaciones para la amplificación de DNA), 1989 (ed. H.A. Erlich)
Stockson Press, New York; PCR Protocols: A guide for methods and
applications (Una guía para métodos y aplicaciones), 1990 (ed. M.A.
Innis et al.) Academic Press, San Diego; y PCR Strategies
(Estrategias de PCR), 1995, (ed. M.A. Innis et al.),
Academic Press, San Diego. Firmas comerciales, tales como Perking
Elmer (Norwalk, CT), comercializan reactivos para la PCR y publican
protocolos referentes a la PCR.
Desde las publicaciones originales de las
amplificación del ácido nucleico, se han descrito varias
amplificaciones de ácido nucleico, basadas en cebadores,
incluyendo, pero no de una forma limitativa, a Ligasa Chain Reaction
(Reacción en cadena de la Ligasa),(LCR, Wu and Vallace, 1989,
Genomics 4: 560-569 y Barany, 1991, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88: 189-193); Polymerasa
Ligasa Chain Reaction (Reacción en cadena de la Polimerasa Ligasa)
(Barany, 1991), PCR Methods and Aplic. 1:5-16);
Gap-LCR (publicación de solicitudes de patente
internacional PCT nº WO 90/01069); Repair Chain Reaction
(Publicación de la solicitud de patente europea
EP-A-nº 439.182 A2), 3SR (Kwoh et
al), 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
1173-1177; Guatelli et al. 1990, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87: 1874-1878; publicación de
solicitud de patente internacional PCT nº WO 92/0880 A), y NASBA
(Patente estadounidense US nº 5.130.238). Un estudio de los
sistemas de amplificación, es el que se proporciona por parte de
Abramson and Myers, 1993, Current Opinion, en Biotechnology, 4:
41-47.
La especificidad de las reacciones de
amplificación basadas en cebadores, depende la especificidad de la
hibridación de los cebadores. Bajo las elevadas temperaturas
utilizadas en una amplificación típica, los cebadores, hibridan
únicamente a la secuencia pretendida como diana. No obstante, las
mezclas de reacciones de amplificación, se realizan a la
temperatura ambiente, bien por debajo de la temperatura necesaria
para asegurar la especificidad de la hibridación de cebadores. Bajo
estas condiciones menos severas, los cebadores, pueden enlazarse de
una forma no específica a otras secuencias de ácido nucleico,
únicamente parcialmente complementarias, o a otros cebadores, e
iniciar la síntesis de productos de extensión no deseados, los
cuales pueden amplificarse conjuntamente con la secuencia diana. La
amplificación de productos de extensión de amplificadores no
deseados, puede completarse con la amplificación, de las secuencias
diana deseadas y puede hacer decrecer de una forma significativa la
eficacia de la amplificación de la secuencia deseada.
Un tipo de producto de amplificación, no
específico, frecuentemente observado, es un artefacto independiente
del molde de reacciones de amplificación, al cual se le hace
referencia como "dímero cebador". El dímero cebador, es un
fragmento de doble hebra, cuya longitud se encuentra, de una forma
típica, cercana a la suma de dos longitudes de cebadores, y que
parece ocurrir cuando, un cebador, se extiende más allá del otro
cebador. La concatenación resultante, forma un molde no deseado, el
cual, debido a su corta longitud, se amplifica de una forma
eficiente.
La especificaciones no específicas, pueden
reducirse procediendo a reducir la formación de los productos de
extensión de cebadores, previamente al inicio de la reacción. En
otro procedimiento, al cual se le hace referencia como un protocolo
de "inicio en caliente", se procede a retener dos o más
reactivos críticos, de la mezcla de la reacción, hasta que, la
temperatura, haya aumentado lo suficiente como para proporcionar la
necesaria especificidad de la hibridación. Así, de este modo, la
mezcla de reacción, no puede soportar la extensión de cebadores,
durante el tiempo en el que, las condiciones de reacción, no
aseguren la hibridación específica de los cebadores.
Los procedimientos manuales del tipo "inicio en
caliente", en los cuales, los tubos de reacción se abren después
de la etapa de incubación inicial a alta temperatura, y en los que
se añaden los reactivos que faltan, son de un trabajo intensivo e
incrementan el riesgo de contaminación de la mezcla de reactivos.
De una forma alternativa, puede utilizarse un material sensible al
calor, tal como la cera, para separar o secuestrar los componentes
de la reacción, tal y como se describe en la patente estadounidense
U.S: nº 5.411.876, y Chou et al., 1992, Nucl. Acids Res.
20(7): 1717-1723. En estos procedimientos,
una incubación de pre-reacción de alta temperatura,
funde el material sensible al calor, permitiendo, con ello, el que
se mezclen los reactivos.
Otro procedimiento para reducir la formación de
los productos de extensión de cebadores al inicio de la reacción,
consiste en la inhibición reversible por calor de la DNA polimerasa,
mediante anticuerpos
DNA-polimierasa-específicos, tal y
como se describe en la patente estadounidense U.S. nº 5.338.671. Los
anticuerpos, se incuban con la DNA-polimerasa, en un
tampón, a la temperatura ambiente, previamente a la reunión de la
mezcla de reacción, con objeto de permitir la formación del complejo
del anticuerpo de DNA-polimerasa. La inhibición
anticuerpo de la actividad DNA-polimerasa, se
inactiva mediante incubación de pre-reacción a alta
temperatura. Una desventaja de este procedimiento, reside en el
hecho de que, la producción de anticuerpos específica de la
DNA-polimerasa, es cara, y necesita de mucho tiempo,
especialmente, en grandes cantidades. Además de ello, la adición de
anticuerpos a la mezcla de reacción, requiere el proceder a
rediseñar la reacción de amplificación.
La formación de productos de extensión,
previamente al inicio de la reacción, puede también inhibirse
mediante la adición, a la reacción, de una proteína de enlace de
hebra individual, con enlaces no covalentes a los cebadores, de una
forma reversible por calor, e inhibe la extensión de cebadores,
evitando la hibridación.
La amplificación no específica, puede también
reducirse procediendo a degradar enzimáticamente los productos de
reacción formados previamente al inicio de la reacción, utilizando
los procedimientos descritos en la patente estadounidense U.S. nº
5.418.149. La degradación de los productos de extensión nuevamente
sintetizados, se logra mediante la incorporación, en la mezcla de
reacción, de UTP y UNG, e incubando la mezcal de reacción, a una
temperatura de 45-60ºC, previamente a llevar a cabo
la reacción de amplificación. La extensión de cebadores, tiene como
resultado la formación de DNA que contiene uracilo, el cual se
degrada mediante UNG, bajo las condiciones de la
pre-amplificación. Una desventaja de este
procedimiento, reside en el hecho de que, la degradación de los
productos de extensión, compite con la formación de producto de
extensión y la eliminación de producto de extensión de cebadores, no
específico, será, probablemente, menos completa. Una ventaja de este
procedimiento, reside en el hecho que, el DNA que contiene uracilo,
introducido en la mezcla de reacción, como una contaminación de la
reacción previa, se degrada también y, así, de esta forma, el
procedimiento, reduce también el problema de contaminación de una
PCR, mediante el ácido nucleico amplificado procedente de reacciones
previas.
Las técnicas convencionales de biología molecular
y de la química del ácido nucleico, las cuales se encuentran dentro
de las técnicas habituales del arte especializado de esta técnica,
se encuentran plenamente explicadas en la bibliografía
especializada. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Clonación molecular - Un
manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York; Oligonucleotide Síntesis (Síntesis de
oligonucleótidos) (M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hibridation
(Hibridación del ácido nucleico) (B.D. Hames and S.J. Higgings. ed.,
1984); y una serie, Methods in Enzymology (Procedimientos en
enzymología) (Academic Press. Inc.).
La presente invención, proporciona cebadores
oligonucleótidos covalentemente modificados, para la amplificación
in vitro, de secuencias de ácido nucleico. La utilización de
cebadores modificados de la invención, tiene como resultado una
reducción de la amplificación no específica, especialmente, la
formación de dímeros de cebadores, y/o el incremento concomitante en
el rendimiento productivo de la diana pretendida, relativa a una
amplificación llevada a cabo con cebadores no modificados.
En uno de sus aspectos, la invención, se refiere
a un cebador oligonucleótido, para la amplificación de una secuencia
de ácido nucleico, la cual tiene la estructura general:
5'---S_{1}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{R}}---3'---
\hskip0,5cmo
\hskip0,5cm5'---S_{1}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{R}}---S_{2}---3'
en donde, S_{1}, representa una
primera secuencia de nucléotidos entre aproximadamente 5 y
aproximadamente 50 nucleótidos de
longitud;
en donde, S_{2}, representa una segunda
secuencia entre uno y tres nucleótidos de longitud;
en donde, N, representa un nucleótido, el cual
contiene una base de purina o pirimidina, la cual contiene una amina
exocíclica;
en donde, R, representa un grupo modificador, en
donde, R, está enlazado, de una forma covalente, a N, mediante una
amina exocíclica, y en donde, R, tiene la estructura:
R_{1}---
\melm{H}{C}{\uelm{\para}{}}---R_{2}
en donde, R_{1}y R_{2},
representan, de una forma independiente, un grupo alquilo
C_{1}-C_{10}, un grupo alcoxi, un grupo fenilo,
un grupo fenoxi, un grupo fenilo sustituido, un grupo naftilo, o un
grupo naftilo sustituido. Los grupos alquilo, pueden ser
ramificados o no
ramificados.
En una forma preferida de presentación, N, es un
nucleótido convencional modificado, en cuyo caso, N es una
adenosina, histidina, o guanosina, y la porción del modificador, se
encuentra covalentemente unida a la amina exocíclica de una base
adenina, guanina, o citosina. En una forma de presentación más
preferida, N, es una adenosina.
En una forma preferida de presentación, R es un
grupo 2-naftilmetilo; un grupo bencilo; o un grupo
bencilo sustituido. Los grupos bencilos sustituidos, preferidos,
tienen la estructura:
en donde, R_{3}, representa un
grupo alquilo C_{1}-C_{6}, ramificado o lineal,
de una forma más preferible, un grupo alquilo
C_{1}-C_{4}, ramificado o lineal, un grupo
metoxi, o un grupo nitro. De una forma preferible, R_{3}, se
encuentra unido en la posición
para.
En una forma más preferida de presentación, R,
es un grupo bencilo, p-metilbencilo,
p-tert.-butilbencilo,
p-metoxibeniclo, o
2-naftilmetilo.
Otro aspecto de la invención, se refiere a la
amplificación de cebadores, los cuales se modifican mediante la
unión covalente foto-lábil de un grupo modificador,
lo cual tiene como resultado un inhibición parcial o completa de la
extensión de cebadores. El modificador foto-lábil,
puede enlazarse, bien ya sea a la amina exocíclica, tal y como los
nucleótidos modificados descritos anteriormente, arriba, o bien ya
sea al anillo de nitrógeno. En una forma de presentación, por lo
menos un grupo nitrobencilo, se encuentra unido a la amina
exocíclicla de una base de adenina, guanina, o citosina del
nucleótido del terminal 3'.
Otro aspecto de la invención, es un par de juegos
de cebadores, en donde, por lo menos uno de los cebadores, se
modifica de la forma que se indica anteriormente, arriba. En una
forma preferida de presentación, ambos miembros de un par de
cebadores, o todos los miembros de un juego de cebadores, se
encuentran modificados.
Otro aspecto de la invención, se refiere a
procedimientos para la amplificación de ácido nucleico, los cuales
comprenden el llevar a cabo una reacción de amplificación,
utilizando los cebadores modificados de la invención.
Otro aspecto de la invención, se refiere a un
procedimientos para amplificar ácido nucleico diana, los cuales
comprenden el llevar a cabo una reacción de amplificación,
utilizando los cebadores foto-lábiles modificados de
la invención, en donde, la mezcla de reacción, se irradia con una
luz suficiente como para eliminar el grupo modificador y permitir la
formación de productos de extensión de los cebadores. En una forma
de presentación de la invención, la irradiación, se lleva a cabo en
una etapa por separado, previamente al inicio de la reacción de
amplificación, pero después de que la mezcla de reacción se haya
calentado a una temperatura mayor de aproximadamente 50ºC. En otras
formas de presentación, la etapa de irradiación, se combina con una
etapa preliminar del procedimiento de amplificación, tal como la
etapa de transcripción inversa de una reacción de amplificación de
RNA, o la etapa inicial desnaturalización, en una reacción de
amplificación de RNA.
Otro aspecto de la invención, se refiere a
equipos, a modo de "kits" para la amplificación in vitro
de secuencias de ácido nucleico, "kits" éstos los cuales
comprenden un par de cebadores, en los cuales, por lo menos uno de
los cebadores, se modifica de la forma que se ha descrito aquí.
Estos equipos a modo de kits de la presente invención, pueden
también incluir uno o más reactivos de amplificación, por ejemplo,
una polimerasa o ligasa del ácido nucleico, trifosfatasa nucleósido,
y tampones apropiados.
La figura 1, muestra los resultados de
amplificación de HIV-1 RNA, llevada a cabo
utilizando cebadores bencilados, tal y como de describe en el
ejemplo 5.
La figura 2, muestra los resultados de
amplificación de HCV RNA, llevada a cabo utilizando cebadores
bencilados, tal y como de describe en el ejemplo 6.
La figura 3, muestra los resultados de
amplificación de HCV RNA, llevada a cabo utilizando cebadores
modificados con uno de tres grupos modificados, tal y como de
describe en el ejemplo 7.
La figura 4, muestra los resultados de
amplificación de HCV RNA, llevada a cabo utilizando cebadores
modificados foto-lábiles, tal y como de describe en
el ejemplo 8.
La figura 5, muestra los resultados de
amplificación de DNA microbacteriana, llevada a cabo utilizando
cebadores modificados con un grupo bencilo y cebadores modificados
con un grupo p-tert.-butilbencilo, tal y como de
describe en el ejemplo 10.
La figura 6, muestra un esquema general de
reacción, apropiado para la síntesis de dA modificada con bencilo o
bencilo sustituido, controlada por vidrio poroso (CPG).
Para ayudar en la comprensión de la invención, ha
continuación, se facilita la definición de varios términos.
Los términos "ácido nucleico" y
"oligonucleótido", se refieren a polidesoxirribonucleótidos
(los cuales contienen
2-desoxi-D-ribosa),
a polirribonucleótidos (los cuales contienen
D-ribosa), y a cualquier otro tipo de
polinucleótido, el cual sea un N glicósido de una base de purina o
de pirimidina, o una base de purina modificada o pirimidina
modificada. No existe una distinción pretendida en la longitud,
entre los términos "ácido nucleico", y "oligonucleótido"
y, estos términos, se utilizarán de una forma intercambiable. Estos
términos, se refieren únicamente a la estructura primaria de la
molécula. Así, de este modo, estos términos, incluyen al DNA de
hebra individual, y al DNA de doble hebra, así como también al RNA
de hebra individual y al RNA de doble hebra.
El término "convencional", en referencia a
las bases de ácido nucleico, nucleósidos, o nucleótidos, se refiere
a aquéllos que se encuentran de una forma natural en los
polinucleótidos que se describen. Los cuatro desoxirribonucleótidos
de DNA convencionales (también denominados mayores), contienen las
bases de purina, adenina guanidina, y la bases de pirimidina,
citosina y timina. Los cuatro ribonucleótidos convencionales de RNA,
contienen las bases de purina, adenina guanidina, y la bases de
pirimidina, citosina y uracilo. Adicionalmente a las convencionales
o comunes, anteriormente mencionadas, arriba, en algunos ácidos
nucleicos, se encuentra también un determinado número de otros
derivados de purina y pirimidina, denominados bases raras o menores.
Tal y como se utiliza aquí, en este documento, "no
convencional", en referencia a las bases de ácido nucleico,
nucleósidos, o nucleótidos, se refiere a bases raras o menores de
ácido nucleico, nucleósidos, o nucleótidos, y modificaciones,
derivaciones, o análogos de bases, nucleósidos y nucleótidos
convencionales, e incluye a los nucleótidos sintéticos que tienen
porciones de bases modificadas y/o porciones de azúcar modificadas
(véase, a dicho efecto, Protocols for Oligonucleotide Conjugates,
Methodes in Molecular Biology (Protocolos para conjugados
Oligonucleótidos, Métodos en biología molecular, volumen 26 (Sudhir
Agrawal, Ed. Humana Press, Totowa NJ (1994)); y Oligonucleotides and
Analogues, A Practical Approach (Oligonucleótidos y análogos, una
propuesta práctica) (Fritz Eckstein, Ed. IRL. Press, Oxford
University Press, Oxford).
Los oligonucleótidos, pueden prepararse mediante
cualquier tipo de procedimiento apropiado, incluyendo, por ejemplo,
a la clonación y restricción de secuencias apropiadas y síntesis
química directa, mediante un procedimiento tal como el
correspondiente al procedimiento de del fosfotriéster de Narang
et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:
90-99; el procedimiento del fosfodiéster de Brown
et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:
109-151; el procedimiento de la dietilfosforamidita
de Beacage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22,:
1859-1862, y el procedimiento del soporte sólido, de
la patente estadounidense U.S. nº 4.458.066. Una revisión de los
procedimientos de síntesis, es la que se proporciona por parte de
Goodschild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(2);
165-187.
El término "apareamiento de bases" al cual
se le hace también referencia, en el arte de esta técnica
especializada, como "apareamiento de bases de
Watson-Crick", se refiere al bien conocido enlace
del hidrógeno de pares complementarios de bases adenina - timina y
guanina - citosina, en una estructura de doble hebra, adenina -
uracilo y
\hbox{guanina -}citosina en una molécula híbrida de RNA/DNA, y al enlace de análogos, de pares de oligoncleótidos, no convencionales.
El término "hibridación", se refiere a la
formación de una estructura dúplex, mediante dos ácidos nucleicos de
hebra individual, debido al apareamiento de bases complementarias,
La hibridación, puede acontecer entre hebras de ácido nucleico
completamente complementarias, o entre hebras de ácido nucleico
"substancialmente complementarias", las cuales contienen
regiones menores de apareamientos fallidos. A las condiciones bajo
las cuales hibridan únicamente hebras de ácido nucleico
completamente complementarias, se les hace referencia como
"condiciones rigurosas de hibridación" o "condiciones de
hibridación específicas de una frecuencia". Pueden lograrse
dúplex estables de secuencias substancialmente complementarias, bajo
unas condiciones menos severas de hibridación; el grado de
apareamiento fallido tolerado, puede controlarse mediante un ajuste
apropiado de las condiciones de hibridación. Aquéllas personas
especializadas en el arte de la tecnología del ácido nucleico,
pueden determinar la estabilidad del dúplex empíricamente,
considerando un número de variables, incluyendo, por ejemplo, la
longitud de la concentración de pares de bases de los
oligonucléotidos, resistencia iónica, y la incidencia de los pares
de bases con apareamiento fallido, seguido del gobierno o control
mediante la tecnología correspondiente a este arte de técnica
(véase, por ejemplo, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning
- A Laboratory Manual (Clonación Molecular - Un manual de
Laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
New York,; y Wetmur, 1991, Critical Review in Biochem. Y Mol. Biol.
26(3/4): 227-259).
El término "cebador", se refiere a un
oligonucleótido capaz de actuar como un punto de iniciación de la
síntesis de DNA, bajo condiciones en las cuales, se induce la
síntesis de un producto de extensión de un cebador, complementario a
un ácido nucleico, a saber, bien ya sea en presencia de diferentes
trifosfatos nucleósidos, y un agente para la extensión (por ejemplo,
DNA polimerasa o transcriptasa inversa), en un tampón apropiado, y a
una temperatura apropiada. Tal y como se utiliza aquí, en este
documento, el término "cebador", se pretende que abarque a los
oligonucleótidos utilizados para procesos de amplificación
mediatizados por ligación, en los cuales, un oligonucleótido, se
"extiende" mediante ligación a un segundo oligonucleótido, el
cual hibrida en una posición adyacente. Así, de esta forma, el
término "extensión de cebadores" tal y como se utiliza aquí, se
refiere a ambas, la polimerización de trifosfatos nucleósidos,
utilizando el cebador como punto de iniciación de la síntesis de
DNA, y a la ligación de dos cebadores para formar un producto de
extensión.
Un cebador, es preferiblemente un DNA de hebra
individual. La longitud apropiada de un cebador, depende del uso
pretendido del cebador, pero, típicamente, se encuentra comprendido
dentro de unos márgenes que van de 6 a 50 nucleótidos. Las moléculas
cortas de cebadores, requieren generalmente temperaturas más frías,
con objeto de formar complejos suficientemente estables con el
molde. Un cebador, necesita reflejar la secuencia exacta del ácido
nucleico del molde, pero debe ser lo suficientemente complementaria
como para hibridar con el molde. El diseño de cebadores apropiados
para la amplificación de una determinada secuencia diana, es bien
conocida en arte de la técnica especializada, y se encuentra
descrita en la literatura correspondiente a la bibliografía
especializada, citada aquí.
Los cebadores, pueden incorporar características
adicionales, las cuales permiten la detección o inmovilización de un
cebador, pero no alteran la propiedad básica del cebador, la de
actuar como un punto de iniciación de la síntesis de DNA. Así, por
ejemplo, los cebadores, pueden contener una secuencia adicional de
ácido nucleico, en el extremo 5', la cual no hibrida al ácido
nucleico diana, pero facilita la clonación del producto amplificado.
A la región del cebador la cual es suficientemente complementaria al
molde, para hibridar, se le hace aquí referencia como la región
hibridante.
Los términos "diana", "secuencia
diana", región diana'' y "ácido nucleico diana", se refieren
a un región o subsecuencia de un ácido nucleico que debe
amplificarse.
Tal y como se utiliza aquí, un cebador, es
"específico" para una secuencia diana, si el número de
apareamientos fallidos presentes entre la secuencia del cebador y la
secuencia diana, es inferior al número de apareamientos fallidos
entre la secuencia del cebador y las secuencias no dianas que pueden
encontrarse presentes en la muestra. Pueden elegirse las condiciones
de hibridación, bajo las cuales, se forman dúplex estables,
únicamente si el número de apareamientos fallidos presentes, no es
mayor que el número de apareamientos fallidos presentes entre la
secuencia del cebador y la secuencia diana. Bajo estas condiciones,
el cebador, puede formar un dúplex estable, únicamente con una
secuencia diana. Así, de esta forma, la utilización de cebadores
específicos de la diana, bajo las apropiadas condiciones severas,
posibilita la amplificación específica de aquéllas secuencias diana,
las cuales contienen los sitios diana de enlace de cebadores. La
utilización de condiciones de amplificación de secuencias
específicas de secuencias, posibilita la amplificación específica de
aquéllas secuencias diana las cuales contienen los sitios diana de
enlace de cebadores, exactamente complementarios.
El término "amplificación no específica", se
refiere a la amplificación de secuencias de ácido nucleico,
distintas que la secuencia diana, la cual resulta de la hibridación
de cebadores, a otras secuencias distintas que la secuencia diana, y
que sirven entonces como un substrato para la extensión de
cebadores. La hibridación de un cebador a una secuencia no diana, se
le hace referencia como "hibridación no específica", y puede
acontecer durante las condiciones de
pre-amplificación de reducida severidad, a bajas
temperaturas.
El término "dímero cebador", se refiere a un
producto de amplificación, no específico, independiente del molde,
el cual resulta de la extensión de cebadores, en donde, otro
cebador, sirve como un molde. A pesar de que el dímero cebador
aparece frecuentemente como siendo un concatámero de dos cebadores,
es decir, un dímero; aparecen también concatámeros de más de dos
cebadores. El término "dímero cebador", se utiliza aquí, de una
forma general, para abarcar un producto de amplificación, no
específico, independiente del molde.
El término "mezcla de reacción", se refiere
a una solución la cual contiene reactivos necesarios para llevar a
cabo una determinada reacción. Una "mezcla de reacción de
amplificación", la cual se refiere a una solución que contiene
reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de
amplificación, contiene típicamente cebadores de oligonucleótidos, y
una DNA polimerasa o ligasa, en un tampón apropiado. Una mezcla de
reacción de "PCR", contiene típicamente cebadores
oligonucleótidos, una DNA polimerasa termoestable, dNTP's, y un
catión de metal divalente, en un tampón apropiado. A una mezcla de
reacción, se le hace referencia como completa, si ésta contiene
todos los reactivos necesarios para capacitar la reacción, y se le
hace referencia como incompleta, si ésta contiene únicamente un
subjuego de los reactivos necesarios. Se entenderá el hecho, por
parte de aquéllas personas especializadas en el arte de esta técnica
especializada, de que, los componentes de la reacción, se almacenan,
de una forma rutinaria, como soluciones separadas, conteniendo, cada
una de ellas, un subjuego de los componentes totales, por razones
de conveniencia, estabilidad de almacenaje, o para permitir un
ajuste en dependencia de la aplicación de las concentraciones de los
componentes y que, los componentes de la reacción, se combinan
previamente a la reacción, con objeto de crear una mezcla de
reacción completa. Además de ello, se entenderá el hecho, por parte
de una persona especializada en este arte de la técnica, de que, los
componentes de la reacción, se envasan por separado, para la
comercialización y que, los equipos, a modo de "kits"
comerciales, de utilidad, pueden contener un subjuego de los
componentes de la reacción, los cuales incluyen los cebadores
modificados de la invención.
Los cebadores de amplificación de la invención,
se modifican mediante el enlace covalente de un grupo, a uno de los
cuatro nucleótidos, en el extremo 3' del cebador. En una forma de
presentación, un cebador modificado de la invención, consiste en una
secuencia de ácido nucleico, la cual tiene la estructura
general:
5'---S_{1}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{R}}---3'---
\hskip0,5cmo
\hskip0,5cm5'--- S_{1}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{R}}---S_{2}---3'
en donde, S_{1}, representa una
primera secuencia de nucléotidos entre aproximadamente 5 y
aproximadamente 50 nucleótidos de
longitud;
en donde, S_{2}, representa una segunda
secuencia entre uno y tres nucleótidos de longitud;
en donde, N, representa un nucleótido, el cual
contiene una base de purina o pirimidina, la cual contiene una amina
exocíclica;
en donde, R, representa un grupo modificador, en
donde, R, está enlazado, de una forma covalente, a N, mediante una
amina exocíclica, y en donde, R, tiene la estructura descrita
posteriormente, más abajo.
Tal y como se muestra en los ejemplos, el efecto
de la modificación, se maximiza cuando, la modificación, es el
nucleótido del extremo 3'. Así, de una forma preferible, el cebador,
consta de un nucleótido del extremo 3', modificado.
El nucleótido modificado, se selecciona entre
aquéllos cuya base contiene una amina exocíclica, la cual se
encuentra involucrada en el apareamiento de bases del nucleótido con
su nucleótido complementario. De una forma típica, los cebadores,
son DNA que contiene únicamente nucleótidos convencionales. De las
cuatro bases de nucleótidos convencionales que se encuentran en el
DNA, la adenina, la guanina, y la citosina, contienen una amina
primaria exocíclica, la cual se encuentra involucrada en el
apareamiento de bases con la base complementaria. En el aspecto
preferido de la invención, el cebador, se modifica mediante la unión
de un grupo modificador individual a la amina exocíclica,
sustituyendo a uno o más hidrógenos del grupo amina, los cuales, en
la base no modificada, son capaces de involucrarse en el
apareamiento de bases. Las estructuras de los nucleótidos
modificados, las cuales contienen una base modificada de adenina,
guanina, y citosina, respectivamente, se muestran abajo, a
continuación:
en donde, S, representa una porción
de azúcar y, R, representa el grupo
modificado.
La presente invención, no se limita a los
cebadores consistentes en nucleótidos convencionales. Cualquier
análogo de nucleótido, en el cual, la porción de la base, contiene
un amina primaria exocíclica, la cual se encuentra involucrada en el
apareamiento de bases que es una base complementaria, es modificable
tal y como se describe aquí. Los ejemplos de nucleótido no
convencionales, incluyen a las 3-metiladenina,
7-metilguanina, 3-metilguanina,
5-metilcitosina, y
5-hidroximetilcitosina.
El grupo modificador, limita la capacidad de la
base modificada, para participar en el enlace de hidrógeno, debido
al hecho de que, el modificador, sustituye a uno de los átomos de
hidrógeno. El átomo de hidrógeno remanente, puede todavía,
participar en el enlace de hidrógeno. Los modificadores, pueden por
lo tanto incluir ambas, las cinética y la termodinámica de la
hibridación. Se consideran un variedad de grupos modificadores, los
cuales tienen las siguientes propiedades.
1. que interfieran con el apareamiento de bases
de Watson - Crick, de la base modificada con la base complementaria,
pero que no la impidan,
2. que interfieran con la extensión del cebador
modificado, pero que no la impidan; y
3. que permitan la síntesis de una hebra
complementaria al producto de extensión del cebador modificado.
El grupo modificador, interfiere estéricamente
con el apareamiento de bases y, así, de este modo, con la extensión
del cebador. Así de esta forma, la masa física del modificador,
influye en el grado de interferencia con la hibridación. Cuando se
incorpora un nucleótido modificado de adenosina o cistidina, en el
ácido nucleido de doble hebra, el grupo modificador, sobresale hacia
el interior del espacio central de la estría mayor. Como
consecuencia de ello, incluso los grupos modificadores relativamente
grandes, podrían provocar una pequeña perturbación estérica de la
estructura del dúplex. No obstante, los modificadores apropiados, no
son tan grandes como para que se evite el enlace del hidrógeno, o
que se evite la extensión enzimática del hidroxilo 3' del cebador.
Cuando el nucleótido de guanosina modificado se incorpora en un
ácido nucleico de doble hebra, el grupo modificador, sobresale hacia
el interior de la estría menor, lo cual proporciona menos espacio
para acomodar la masa del grupo modificado. Consecuentemente, se
prefieren los grupos modificadores más pequeños, para la unión a la
base de guanina.
Los productos de extensión de cebadores los
cuales se utilizan como moldes en los ciclos subsiguientes de
amplificación, contienen la base modificada introducida mediante el
cebador. El grupo modificador, se elige de tal forma que, la
presencia de las base modificada en el molde, no provoca la
terminación de la extensión de los cebadores, o la inhibición de las
extensión de los cebadores. De una forma preferible, la naturaleza
del grupo modificador, no debería dar lugar a eventos mutagénicos,
en donde se pierda la identidad de la base modificada, en la
replicación de un molde derivado de un cebador. El efecto de la base
modificada, en el molde, en la extensión de cebadores, puede
someterse a test de ensayo, de una forma rutinaria, siguiendo las
directrices proporcionadas aquí, en este documento, y las
proporcionadas en la tecnología correspondiente al arte
especializado (véase, por ejemplo, Geniazdowski y Cera, 1996, Chem.
Rev. 96: 619-634).
Los grupos modificadores, R, los cuales
satisfacen las propiedades anteriormente mencionadas, son apropiados
para su uso en los procedimientos de la presente invención. Los
grupo modificadores preferidos, tienen la estructura:
R_{1}---
\melm{H}{C}{\uelm{\para}{}}---R_{2}
en donde, R_{1} y R_{2},
representan, de una forma independiente, un grupo alquilo
C_{1}-C_{10}, un grupo alcoxi, un grupo fenilo,
un grupo fenoxi, un grupo fenilo sustituido, un grupo naftilo, o un
grupo naftilo sustituido. Los grupos alquilo, pueden ser ramificados
o lineales. Pueden también utilizarse grupos alquilo más grandes,
de hasta
C_{20}.
En una forma preferida de presentación, R es un
grupo 2-naftilmetilo; un grupo bencilo; o un grupo
bencilo sustituido. Los grupos bencilos sustituidos, preferidos,
tienen la estructura:
en donde, R_{3}, representa un
grupo alquilo C_{1}-C_{6}, ramificado o lineal,
de una forma más preferible, un grupo alquilo
C_{1}-C_{4}, ramificado o lineal, un grupo
metoxi, o un grupo nitro. El grupo alquilo
C_{1}-C_{4}, ramificado o lineal, es metilo,
etilo, propilo, iso-propilo,
iso-butilo, tert.-butilo, y por el estilo. El metilo
y el tert.-butilo, son grupos alquilo preferidos. De una forma
preferible, R_{3}, se encuentra unida a la posición
para.
Los grupos modificadores R, particularmente
preferidos, se muestran abajo, a continuación:
En los ejemplos, se describen un gran número de
grupos modificadores. De una forma general, las selección empírica
de un grupo modificador apropiado particular de la clase de
compuestos descritos, puede llevarse a cabo de una forma rutinaria,
por parte de una persona especializada en el arte de esta técnica,
siguiendo las directrices proporcionadas aquí, en este documento. De
una forma preferible, la idoneidad de un grupo particular, se
determina empíricamente, utilizando los cebadores modificados en una
reacción de amplificación. La amplificación exitosa, indica ambos
criterios, que la base modificada no inhibe totalmente la extensión
de los cebadores, y que la presencia de la base modificada en un
molde derivado de un cebador, no provoca la terminación de la
extensión de cebadores. La reducción de un dímero cebador, se
determina tal y como se describe en los ejemplos.
En una forma de presentación alternativa de la
invención, los cebadores, se modifican con uno o más de los grupos
foto-lábiles, los cuales pueden eliminarse mediante
la exposición a la luz, después de que la reacción haya alcanzado
las condiciones de alta temperatura de la reacción, las cuales
aseguran su especificidad. Debido al hecho de que, el modificador,
se elimina previamente a la extensión de cebadores, el cebador
modificado, no necesita ser extensible, previamente a la eliminación
del grupo. Ejemplos de modificadores foto-lábiles
que pueden utilizarse en los procedimientos de la presente
invención, se describen en Pillai, 1989, "Photoremovable
Protecting Groups in Organic Síntesis", - Grupos protectores
foto-eliminables, en Síntesis Orgánica -, Síntesis;
1-26.
De una forma preferible, los cebadores
foto-lábiles de la invención, están modificados en
el nucleótido del extremo 3', mediante la unión de uno o dos grupos
o-nitrobencilo:
En los cebadores modificados mediante la unión de
un grupo nitrobencilo individual, a la amina primaria exocíclica de
una porción de base, la amina secundaria resultante, puede todavía
participar en el apareamiento de bases, si el grupo amina se hace
girar, de tal forma que, el hidrógeno remanente, se oriente hacia la
base complementaria. Tal y como de describe en los ejemplos, estos
cebadores, pueden utilizarse en la amplificación, con o sin
eliminación con luz UV.
Los cebadores modificados mediante la unión de
dos grupos nitrobencilo a la amina exocíclica de la base, no pueden
extenderse. La inhibición, resulta, de una forma presumible, de la
inhabilidad de la base modificada para experimentar apareamiento de
bases, la cual queda excluida, debido al hecho de que, ambos
hidrógenos de la amina exocíclica, se reemplazan por grupos
nitrobencilos masivos. La utilización de los cebadores modificados
con los dos grupos nitrobencilo, en una amplificación, en la cual,
la mezcla de reacción se ha expuesto a la luz UV, durante un
transcurso de tiempo suficiente como para eliminar los grupos
bencilos, permitiendo con ello el que tenga lugar la extensión de
cebadores, se describe en los ejemplos.
En un forma alternativa de presentación, el grupo
modificador, es encuentra unido al nitrógeno del anillo. Los
cebadores modificados mediante la unión de un grupo nitrobencilo al
nitrógeno del anillo de la base, no pueden extenderse, debido a la
incapacidad de la base modificada para experimentar apareamiento de
bases. La eliminación de los grupos nitrobencilo, mediante la
exposición a la luz ultravioleta, permite el que tenga lugar la
extensión de cebadores.
La utilización de cebadores
foto-lábiles, los cuales no pueden extenderse hasta
que, el grupo modificador se elimine, proporcione esencialmente unas
condiciones de pre-reacción. La reacción, se irradia
y, los cebadores, se desbloquean hasta únicamente después de que la
temperatura de reacción se haya elevado a la temperatura la cual
asegura la especificidad de la reacción.
La síntesis de cebadores modificados, se lleva a
cabo utilizando medios químicos standard, bien conocidos en el arte
de la técnica especializada. Los procedimientos para la introducción
de estos modificadores, puede dividirse en cuatro clases.
1. El modificador, puede introducirse mediante la
utilización de nucleósido modificado, tal como un soporte de
síntesis de DNA.
2. El modificador, puede introducirse mediante la
utilización de un nucleósido modificado, tal como una
fosforamidita.
3. El modificador, puede introducirse mediante la
utilización de un reactivo, durante la síntesis de DNA, (por
ejemplo, tratamiento de bencilamina de una amidita convertible,
cuando se incorpora en una secuencia de DNA.
4. Modificación post-sintética.
El modificador, puede introducirse como un reactivo de la reacción,
cuando se contacta con DNA sintética.
La síntesis de cebadores particulares, se
describe en los ejemplos. Los cebadores adicionalmente modificados,
pueden sintetizarse utilizando procedimientos standard de síntesis,
de un forma análoga.
De una forma preferible, los cebadores
modificados, se sintetizan utilizando un soporte de síntesis,
derivado, controlado por vidrio poroso controlado (CPG). Un esquema
general de reacción, para la síntesis de dA CPG derivada, es el que
se muestra en la figura 6. Pueden añadirse grupos modificados
particulares, mediante la utilización del apropiado agente
alquilante de haluro de alquilo, haluro de bencilo, haluro de
bencilo sustituido, haluro de metilnaftilo, o haluro de metilnaftilo
sustituido. La síntesis de la dA CPG de bencilo y de
p-tert.-bencilo, se describe, en los ejemplos 1 y 2,
seguido del esquema mostrado en la Figura 6.
La alquilación del grupo amino exocíclico, puede
llevarse a cabo utilizando procedimientos análogos a la metilación
descrita por parte de Griffin y Reese, 1963, Biochim. Acta
68: 185-192. Los procedimientos adicionales
de síntesis, se describen en Aritoma et al. 1995. J. Chem.
Soc. Perkin Trans. 1: 1837-1849.
Los procedimientos de la presente invención,
comprenden la realización de amplificación basada en cebadores,
utilizando los cebadores modificados de la presente invención. De
una forma general, los cebadores modificados, pueden sustituirse por
cebadores no modificados, los cuales contienen la misma secuencia
nucleótida, en una amplificación basada en cebadores, sin ningún
cambio en las condiciones de la reacción de amplificación. Por
supuesto, una persona especializada en el arte de la técnica,
reconocerá el hecho de que, la re-optimización menor
de rutina de la condiciones de la reacción, pueden ser
beneficiosas, en algunas reacciones.
En una forma preferida de presentación, los
cebadores modificados de la presente invención, se utilizan en la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). No obstante, la
invención, no se limita a ningún sistema particular de
amplificación. Los cebadores modificados de la presente invención,
pueden utilizarse en cualquier sistema de amplificación a base de
cebadores, en el cual, pueden formarse dímeros de cebadores o
productos no específicos de la amplificación. Los ejemplos, incluyen
a los procedimientos de amplificación descritos en las referencias
citadas anteriormente, arriba, en este documento. A medida que se
van desarrollando otros sistemas, dichos sistemas, pueden
beneficiarse de la práctica de esta invención.
Los procedimientos de la presente invención, son
apropiados para la amplificación de, bien ya se DNA o bien ya sea
RNA. Así, por ejemplo, la amplificación del RNA, en la que se
utiliza una transcripción inversa/reacción en cadena de la
polimerasa (RT-PCR), es bien conocida en el arte
especializado, y se describe en las patentes estadounidenses U.S.
n^{os} 5.322.770 y 5.310.652, Myers and Gelfand, 1991,
Biochemistry 30(31):7661-7666, Young et
al., 1993, J.Clin. Microbiol. 31 (4):
882-886, y Mulder et al., 1994, J. Clin.
Microbiol. 32(2): 292-300.
En la amplificación a base se cebadores, la
extensión de cebadores, se lleva a cabo, de una forma típica, a una
temperatura elevada, utilizando una enzima termoestable, tal como la
DNA polimerasa. La enzima, inicia la síntesis en el extremo 3' del
cebador, y procede en la dirección hacia el extremo 5' del molde,
hasta que se haya terminado la síntesis. Las DNA polimerasas
termoestables, purificadas, de utilidad en las reacciones de
amplificación, son bien conocidas en el arte especializado de la
técnica, e incluyen, aunque de no de una forma limitada a ellas, a
las enzimas descritas en la patente (estadounidense) U.S. nº
4.889.818; la patente U.S. nº 5.079.352; la patente U.S. nº
5.352.600; la patente U.S. nº 5.491.086; y los documentos
internacionales de patente WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO
92/06202; WO 92/09689; y la patente estadounidense U.S. nº
5.210.036. Una revisión de las DNA polimerasas termoestables, se
proporcionan en Abramson, 1995, en PCR Strategies, - Estrategias de
PCR -, (ed. M.A. Innis et al.), páginas
39-57, Academic Press. San Diego.
En una forma preferida de presentación,
particularmente, para la amplificación de DNA, la amplificación, se
lleva a cabo utilizando una enzima reversiblemente inactivada, tal y
como se describe en La utilización de un enzima reversiblemente
inactivada, la cual se reactiva bajo las condiciones de alta
temperatura, y reduce adicionalmente la amplificación no específica,
mediante la inhibición de la extensión de cebadores, previamente al
inicio de la reacción. Una DNA polimerasa termoestable,
reversiblemente inactivada, desarrollada por parte de la firma
Hoffmann - La Roche (Nutley, NJ), y comercializada por parte de la
firma Perking Elmer (Norwalk, CT), se describe en Birch et
al., 1996, Nature 381 (6581):
445-446.
El efecto del grupo modificador, en la capacidad
de la enzima, para extender el cebador, depende, en parte, de la
enzima particular utilizada y, en parte, de las condiciones de
reacción seleccionadas. Así, por ejemplo, La Tth DNA polimerasa, es
más permisiva cuando se utiliza Mn^{2+}, como el guión divalente,
como en algunas amplificaciones de RNA, en lugar de Mg^{2+}. Una
persona especializada en el arte de la técnica, reconocerá el hecho
de que, en la selección de rutina, de un grupo modificador
apropiado, se considerará la enzima y las condiciones de
reacción.
Los procedimientos de preparación de muestras
para las reacciones de amplificación, son bien conocidas en el arte
de la técnica especializada, en la bibliografía aquí citada. El
procedimiento particular utilizado, no es una parte crítica de la
presente invención. Una persona especializada en el arte de esta
técnica, puede optimizar las condiciones de reacción, para su uso
con los conocidos procedimientos de preparación de muestras.
Los procedimientos de análisis de ácidos
nucleicos amplificados, son bien conocidos en el arte de la técnica
especializada, y se describen enteramente en la bibliografía aquí
citada. El procedimiento particular utilizado, no es una parte
crítica de la presente invención. Una persona especializada en el
arte de esta técnica, puede seleccionar un procedimiento de análisis
apropiado, en dependencia de la aplicación.
Un procedimiento preferido para analizar una
amplificación de reacción, es mediante el control del incremento de
la cantidad total de DNA de doble hebra, en la mezcla de reacción,
tal y como se describe en Higuchi et al. 1992, Bio/Technology
10: 413-417; Higuchi et al., 1993,
Bio/Technology 11: 1026-1030: Publicaciones
de Patentes Europeas n^{os} 512.334 y 640.828. En este
procedimiento, al cual se le hace referencia como "PCR
cinética", la detección de la DNA de doble hebra, se basa en la
fluorescencia incrementada que exhiben el bromuro de etidio (EtBr) y
otros marcadores de enlace de DNA, cuando se unen a DNA de doble
hebra. La amplificación, se lleva a cabo en presencia de un
marcador. El incremento del DNA de doble hebra, resultante de la
síntesis de secuencias diana, tiene como resultado un incremento
detectable de la fluorescencia, el cual se controla durante la
amplificación. Así, de este modo, los procedimientos, posibilitan el
control del progreso de una reacción de amplificación.
En una PCR cinética, la fluorescencia medida,
depende de la cantidad total de DNA de doble hebra presente, cuando
resulta de una amplificación no específica, o de una amplificación
con la secuencia diana. El control de la fluorescencia, permite la
medición del incremento de la cantidad total de DNA de doble hebra,
pero, el incremento resultante de la amplificación de la secuencia
diana, no se mide de una forma independiente del incremento
resultante de un producto de amplificación, no específico. Los
cebadores modificados de la presente invención, son particularmente
de utilidad en la PCR cinética, debido al hecho de que, éstos, no
únicamente reducen la cantidad de dímero cebador formado, sino que
también retardan la formación de cantidades detectables de dímero
cebador. Un retardo en la formación de dímeros, hasta después de que
haya acontecido un significante incremento en la secuencia diana,
capacita el control independiente de la amplificación de secuencias
específicas DINA, y minimiza la interferencia del dímero
cebador.
La presente invención, se refiere también a
equipos a modo de "kits", unidades
multi-recipientes que comprenden componentes de
utilidad para la práctica del presente procedimiento. Un equipo a
modo de "kit", de utilidad, contiene cebadores, encontrándose,
por lo menos uno de ellos, modificado tal y como se describe aquí,
para la amplificación del ácido nucleico. Otros componentes ópticos
del equipo a modo de "kit", incluye, por ejemplo, un agente
para catalizar la síntesis de los productos de extensión de
cebadores, los nucleósidos trifosfatos de substrato, apropiados
tampones de reacción, e instrucciones para realizar el presente
procedimiento.
Los ejemplos de la presente invención, los cuales
se presentan abajo, a continuación, se proporcionan únicamente para
propósitos ilustrativos, y no para limitar la invención. A raíz de
la lectura del texto precedente, y de los ejemplos que se facilitan
a continuación, resultarán evidentes, para aquellas personas
comúnmente especializadas en este arte de la técnica, numerosas
formas de presentación de la presente invención, las cuales caen
dentro del ámbito de las reivindicaciones que siguen a los
ejemplos.
Los cebadores modificados mediante la adición de
un grupo bencilo, se sintetizaron mediante uno de los procedimientos
que se describen posteriormente, abajo. Se procedió a sintetizar los
cebadores modificados en la base del extremo 3', utilizando Vidrio
de Poro controlado (CPG) con
N^{6}-bencildesoxiadenosina, para iniciar la
síntesis del DNA. Los cebadores modificados en una base interna, se
sintetizaron utilizando
N^{6}-bencildosoxiadenosina fosforamidita.
En los ejemplos, se utilizan las siguientes
abreviaciones
DMAP | 4-dimetilaminopiridina |
DMF | N,N'-dimetilformamida |
TEA | Trietanolamina |
EDC | hidroxicloruro de 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)-carbodiimida |
THF | Tetrahidrofurano |
DMT | 4,4'-dimetoxitritilo |
I.CAA-CPG | Vidrio de poro controlado, con alquiloamino de cadena larga. |
Etapa
1
Se procedió a añadir piridina (10 ml), a
N^{6}-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritril)-2'-desoxiadenosina
(657 mg, 1,0 mmol; Aldrich Chemical Co., Milwaukke, WI) y, la
mezcla, se secó mediante evaporación, bajo la acción del vacío. Se
repitió la operación. La espuma resultante, se disolvió en DMF
anhidra (15 ml; Aldrich Chemicals CO, Milwaukee, WI), y se enfrió a
una temperatura de 5ºC. Se procedió a añadir hidruro sódico (44 mg,
1,1 mmol, 1,1 equivalentes, dispersión en aceite al 66%), bajo una
atmósfera de argón, y se agitó a la temperatura ambiente, durante un
transcurso de tiempo de 45 minutos. Se añadió bromuro de bencilo
(143 \mul, 206 mg, 1,2 mml, 1,2 equivalentes; Aldrich Chemicals
Co., Milwaukee, WI), en un transcurso de tiempo de 2 minutos y, la
mezcla, se agitó durante el transcurso de toda la noche, a la
temperatura ambiente. La mezcla, se secó por evaporación, bajo la
acción del vacío y, el residuo, se repartió entre acetato de etilo y
agua (10 ml cada uno), y se extrajo. La fase acuosa, se reextrajo
con acetato de etilo y (10 ml) y, los extractos combinados, se
secaron sobre sulfato magnésico anhidro, se filtraron y se
evaporaron. El producto crudo, se purificó mediante cromatografía
sobre gel de sílice (75 g), utilizando metanol, trietilamina,
cloruro de metileno (3: 0,5: 96,5). Las fracciones que contenían el
producto, se combinaron y secaron, mediante evaporación, para
proporcionar la N^{6}-benzoil,
n^{6}-bencil,
5'-O-DMT-2'-desosoxiadenosina
(410 mg, 54%) esperada. La estructura del producto, se confirmó
mediante MMR.
Etapa
2
Se procedió a añadir piridina (10 ml), a la
N^{6}-benzoil,
N^{6}-bencil-5'-O-DMT-2'-desoxiadenosina
(295 mg, 0,39 mmol) y, la mezcla, se secó mediante evaporación, bajo
la acción del vacío. Se repitió la operación. Se añadió piridina
anhidra fresca (10 ml), conjuntamente con anhídrido succínico (200
mg, 2 mmol, 5,0 equivalentes) y DMAP (24 mg) y, la solución, se
agitó bajo atmósfera de argón, durante el transcurso de toda la
noche, a la temperatura ambiente. Se procedió a eliminar la masa del
disolvente, bajo la acción de vacío y, el residuo, se repartió entre
cloruro de metileno (20 ml) y solución de citrato sódico (20 ml, 0,1
M, pH 5,0) y se extrajo. La fase acuosa, se extrajo con más cloruro
de metileno (20 ml) y, los extractos combinados, se secaron sobre
sulfato sulfato sódico anhidro, se filtraron, y se secaron mediante
evaporación. El producto, se purificó mediante cromatografía sobre
gel de sílice (4,5 g), utilizando acetato de etilo, trietilamina,
cloruro de metileno (32: 1: 67), para proporcionar el
3'-succinato éster esperado,
N^{6}-benzoil-N^{6}-bencil-3'-O-succinato-5'-O-DMT-2'-desoxiadenosina
(247 mg, 74%).
Etapa
3
Se procedió a preparar CPG lavado con ácido, de
la siguiente forma: Se procedió a lavar LCAA - CPG (1,0 g,
LCA00500C, 500 anstrom, 8,6 (mol/g; CPG Inc., Fairfield, NJ), con
ácido dicloroacético en diclorometano (2%, 20 ml), procediendo a
hacerlo girar periódicamente, durante un transcurso de tiempo de 20
minutos, a la temperatura ambiente. El CPG lavado con ácido, se
filtro en una frita de vidrio, y se lavó con diclorometano, hasta
que se encontrara libre de ácido. Se procedió a secar la materia en
forma de polvo, con aire y, a continuación, se secó a la temperatura
ambiente, bajo la acción de vacío, durante el transcurso de toda la
noche.
El acoplamiento de nucleósido modificado
intermedio al CPG lavado con ácido, se realizó de la siguiente
forma: Se procedió a añadir TEA (100 \mul), a una solución de
N^{6}-benzoil-N^{6}-bencil-3'-O-succinato-5'-O-DMT-2'-desoxiadenosina
(170 mg, 0,2 mmol), preparada de la forma que se ha descrito
anteriormente, arriba, en diclorometano (10 ml) y, la solución, se
concentró a aproximadamente 5 ml, bajo atmósfera de argón. Se
procedió a añadir, en forma secuencial, DMAP (12 mg, 0,1 mmol, 0,5
equivalentes), TEA (10 \mul), EDC (384 mg, 2,0 mmol, 10
equivalentes), y el CPG lavado con ácido, de arriba. Se añadió
piridina anhidra (5 ml) y, la mezcla, se selló y se agitó durante
tres días, a la temperatura ambiente. El CPG, se filtró, bajo la
acción del vacío y se lavó extensamente, con isopropanol y, a
continuación, con diclorometano, se secó con aire y, después, se
secó bajo la acción del vacío, durante un transcurso de tiempo de 1
hora.
El bloqueo del extremo de terminal, con formación
de casquete, del CPG derivado, se realizó de la siguiente forma: Al
CPG-derivado, se le añadieron las soluciones Cap A
y Cap B (5 ml cada una, anhídrido
acético/2,6-Lutidina/THF y 10%
N-metilamidazol en THF; Glen Research DNA synthesis,
Saterling, VA) y, la mezcla, se agitó durante un transcurso de
tiempo de 4 horas, a la temperatura ambiente. El CPG, se filtró bajo
la acción del vacío, y se lavó extensamente, con isopropanol, a
continuación con diclorometano, aire seco y, después, se secó bajo
la acción del vacío, durante el transcurso de toda la noche.
Se procedió a sintetizar la
N^{6}-benzoil,
N^{6}-bencil,-5'-O-DMT-2'-desoxiadenosina,
de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba.
Se procedió a añadir, a la
N^{6}-benzoil-5'-O-DMT-2'-desoxiadenosina
(196 mg, 0,26 mmol), en THF (8 ml), diisopropiletilamina (350
\mul, 270 mg, 2,04 mmol, 7,8 equivalentes) y
2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamidita
(161 mg, 0,68 mmol, 2,6 equivalentes; Aldrich Chemical Co.,
Milwaukee, WI) y, la mezcla, se agitó durante un tiempo de 30
minutos, a la temperatura ambiente, bajo una atmósfera de argón. La
mezcla, se secó, bajo la acción del vacío y, el residuo, se repartió
entre bicarbonato sódico (5%, 20 ml) y acetato de etilo (20 ml). La
fase orgánica, se lavó con la solución de bicarbonato, agua, y
salmuera saturada (20 ml cada uno), de forma secuencial, se secó
sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó. El residuo, se
purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice (4
g), utilizando acetona/hexano/TEA (34: 65: 0,7), para proporcionar
la fosforamidita deseada (248 mg, 100%).
Se procedió a transferir CPG adenosina, derivada
con bencilo (25 mg, 1,0 (mol), al interior de columnas de síntesis
vacías (Glen Research, Sterling, VA) y, éstas, se utilizaron para
fabricar oligonucleótidos sobre un sintetizador de DNA del tipo ABI
374 DNA shyntesizer (Perking Elmer, Applied Biosystems Division,
Foster City, Ca), utilizando síntesis convencional y condiciones de
desprotección. Se procedió a purificar el DMT-DNA, y
se convirtió en el 5'-hidroxi-DNA,
mediante HPLC con/sin conexión de DMT, a intervalos, (DMT On/Off
HPLC) del tipo standard, utilizando una columna de purificación del
tipo Rainin Pure -DNA column, en un sistema de HPLC Rainin (Rainin
Instrument Co, Woburn, MA). Los oligonucleótidos, se analizaron
utilizando un sistema de capilaridad ABI, de electroforesis (Perking
Elmer, Applied Biosystems Division, en una columna del tipo Dionex
Nucleopak (Dionex Corp. Sunnyvale, CA).
De una forma similar, se procedió a llevar a cabo
la síntesis de cebadores internamente modificados, utilizando un CPG
no modificado, y la fosforamidita sintetizada, de la forma
anteriormente descrita, arriba.
El presente ejemplo, describe la síntesis de
cebadores modificados en el extremo 3' de la adenosina, con un grupo
p-tert.-butilbencilo. Los cebadores modificados, se
sintetizaron esencialmente de la forma descrita en el Ejemplo 1,
pero utilizando
N^{6}-(p-tert.-butilbencil)desoxiadenosina
CPG. La síntesis del CPG derivado, se describe abajo, a
continuación.
Etapa
1
Se procedió a añadir DMF (anhidra, 10 ml), a la
N^{6}-benzoil-5'-O-(4,4'dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina
(658 mg, 1,0 mmol), y se evaporó hasta secado. Se procedió a repetir
la operación. Se añadió DMF fresca (10 ml), bajo atmósfera de argón.
Se añadió hidruro sódico (44 mg, 60% en aceite), 1,1 mmol) y, la
mezcla, se agitó durante un tiempo de 0,5 horas, a la temperatura
ambiente. Se añadió bromuro de (tert.-butil)bencilo (272 mg,
1,2 mmol), por goteo, y se agitó a la temperatura ambiente, durante
el transcurso de toda la noche. El disolvente, se eliminó bajo la
acción de vacío y, el residuo, se repartió entre acetato de etilo y
agua (20 ml cada uno). La fase orgánica, se secó con agua (3 veces,
20 ml), se secó sobre sulfato magnésico anhidro, se filtró, y se
evaporó hasta secado. El producto crudo, se purificó mediante
cromatografía de columna, sobre gel de sílice (100 g), utilizando
cloruro de metileno : metanol : trietilamina 96,5: 5,3 : 0,5, para
proporcionar la
N^{6}-benzoil-N^{6}-(p-tert.-butilbencil)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina
(229 mg, 28,5%).
Etapa
2
Se procedió a tratar la
N^{6}-benzoil-N^{6}-(p-tert.-butilbencil)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina
(217 mg, 0,27 mmol), con anhídrido succínico (125 mg, 5
equivalentes) y DMAp (17 mg, 0,5 equivalentes), en piridina (10 ml).
La preparación y la cromatografía, tal y como se describen en el
Ejemplo 1, anteriormente descrito, arriba, proporcionaron el
3'-O-succinato de
N^{6}-benzoil-N^{6}-(p-tert.-butilbencil)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina
(199 mg, 82%).
Etapa
3
El succinato (180 mg, 0,2 mmol) de la etapa 2,
anterior, se trató con el LCAA-CPG lavado con ácido,
tal y como se describe en el Ejemplo 1. El CPG, se bloqueó en el
extremo de terminal, con formación de casquete, y se secó al vacío,
para proporcionar el CPG derivado de
3'-O-succionato de
N^{6}-benzoil-N^{6}-(p-tert.-butilbencil)-5'-O(4,4'dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina
(1,065 g).
Se sintetizaron cebadores modificados en la
adenosina del extremo 3' adenosina, con un grupo metilo, utilizando
un N^{6}-metil dA CPG (22 mg, 1 \mumol, Glen
Research, Sterling VA). El N^{6}-metil dA CPG, se
emplazó en un columna de síntesis vacía, y se fabricaron cebadores,
según condiciones de standard de síntesis y desprotección. Los
cebadores, se purificaron utilizando HPLC con/sin conexión de DMT, a
intervalos (DMT On/Off HPLC), de la forma descrita en el Ejemplo
1.
El presente ejemplo, describe la síntesis de
cebadores modificados en la adenosina del extremo 3' con bien ya sea
uno, o bien ya sea dos grupos nitrobencilo. Los cebadores
modificados, se sintetizaron esencialmente de la forma que se
describe en el ejemplo 1, pero utilizando, bien ya sea un
mononitrobencil dA CPG o bien ya sea un
bis-nitrobencil dA CPG.
El procedimiento general para la síntesis de CPG
derivados de
N^{6}-benzoil-N^{6}-bencil-2'-desoxiadenosina
(véase el Ejemplo 1), se aplicó a la síntesis de CPG derivada de
N^{6}-benzoil-N^{6}-ortonitrobencil-2'-desoxidenosina,
mediante la sustitución de bromuro de
orto-nitrobencilo, como agente alquilante. Las
etapas subsiguientes, para el CPG, fueron idénticas a las descritas
en el Ejemplo 1, excepto en cuanto al hecho de que, adicionalmente,
los intermediarios, se protegieron de la luz ambiente, envolviendo
los matraces de reacción en folio de aluminio.
Siguiendo la síntesis de CPG derivado, los
cebadores, se sintetizaron al y como se describe en el Ejemplo 1,
pero se aislaron mediante extracción de fases sólida, utilizando
columnas prescindibles Nensorb Prep (NEN Research Products
Biotechnology Systems, Du Pont Co, Boston MA), utilizando los
protocolos de la forma que se describen por parte del
fabricante.
Se procedió a sintetizar
bis-nitrobenzil-desoxiadenosina CPG,
tal y como se describe posteriormente, abajo. A continuación de la
síntesis del CPG derivado, los cebadores, se sintetizaron y se
purificaron tal y como se describe para los cebadores de
mononitrobencilo.
Etapa
1
Se procedió a secar monohidrato de
2'-desoxiadenosina (538 mg, 2,0 mmol, Aldrich
Chemical, Milkaukee, WI), con piridina anhidra (2 veces, 10 ml),
bajo la acción de vacío. El residuo, se disolvió en DMF anhidra (10
ml, Aldrich, Milwaukee, WI), bajo atmósfera de argón, y se añadió
hidruro de sodio (88 mg, 2,2 mmol, 1,1 equivalentes, 60%, dispersión
en aceite), y se agitó durante un transcurso de tiempo de 40
minutos, a la temperatura ambiente. Se procedió a añadir bromuro de
2-nitrobencilo (710 mg, 3,3 mmol, 1,5 equivalentes)
y, la solución, se agitó durante un tiempo de 4 horas, a la
temperatura ambiente. Se procedió a eliminar la DMF por evaporación,
bajo la acción de vacío y, el residuo, se repartió entre acetato de
etilo y agua (20 ml cada uno). La fase acuosa, se extrajo con
acetato de etilo (20 ml) y, los extractos combinados, se lavaron con
agua (20 ml) y se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se
evaporaron. El producto crudo, se purificó mediante cromatografía de
columna sobre gel de sílice (50 g, utilizando 3% MeOH en
CH_{2}Cl_{2}), para proporcionar
2'-desoxi-N^{6}-bis-orto-nitrobenciladenosina
(30 mg, 30%).
Se procedió a añadir piridina anhidra (10 ml) a
la
2'-desoxi-N^{6}-bis-orto-nitrobenciladenosina
(200 mg, 0,518 mmol), y se evaporó hasta secado. Se añadió piridina
(10 ml, seguido de cloruro de
4-4'-dimetoxitritilo (900 mg, 2,3
mmol, 4,5 equivalentes) y trietilamina (280, mg, 2,76 mmol, 4,0
equivalentes) y se agitó a la temperatura ambiente, bajo una
atmósfera de argón, durante un tiempo de 5 horas. Se añadió agua
(0,5 ml), y se agitó durante 20 minutos). La mezcla, se repartió
entre éter y agua (20 ml cada una) y, la fase acuosa, se reextrajo
con éter (20 ml). Los extractos, se combinaron y se lavaron con agua
(20 ml), y se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron y
se evaporaron. El material, se purificó mediante cromatografía sobre
gel de sílice (4 g, utilizando 0,7-2,5% metanol en
cloruro de metileno) para proporcionar
5'-O-DMT-N^{6}-bis-orto-nitrobencil-2'-desoxiadenosina
(121 mg, 33%).
Etapa
2
Se procedió a secar
5'-O-DMT-N^{6}-bis-orto-nitrobencil-2'-desoxiadenosina
(121 mg, 0,141 mmol), por evaporación, con piridina anhidra (2
veces, 3 ml). Se añadió piridina (3 ml), anhídrido succínico (58 mg,
0,58 mml, 4 equivalentes) y DMAP (11 mg, catalítica) y, la solución,
se agitó a la temperatura ambiente, durante un transcurso de tiempo
de 3 días. La solución, se evaporó en vacío y, el residuo, se
distribuyó entre cloruro de metileno (10 ml) y tampón de citrato
sódico (0,1 M, pH 5,0, 10 ml). La fase orgánica, se secó sobre
sulfato sódico anhídrido, se filtró, y se evaporó hasta secado. El
producto crudo, se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (2
g, utilizando EtOAc: CH_{2}Cl_{2}: TEA, 32.67,1, 10 ml y, a
continuación, MeOH:CH_{2}Cl_{2}, 3: 97: 25 ml), para
proporcionar una espuma amarilla, de tonalidad pálida, consistente
en el 3'-O-succinato de
5'-O-DMT-N^{6}-bis-orto-nitrobencil-2'-desoxiadenosina
(138 mg, 99,5%).
Etapa
3
El acoplamiento del nucleósido intermediario
modificado al CPG lavado con ácido, se realizó de la siguiente
forma. Se trató 3'-O-succinato de
5'-O-DMT-N^{6}-bis-orto-nitrobencil-2'-desoxiadenosina
(37 mg, 0,04 mmol), con TEA (16 (l) en vial de vidrio coloreado en
color ámbar, y se evaporó. A este residuo, se le añadió piridina
anhidra (1,5 ml), TEA (2 \mul), DMAP (2,4 mg), EDC (76 mg, 0,04
mmol) y LCCC-CPG (200 mg), lavado con ácido y, la
mezcla, se agitó en un mezclador orbital, durante un transcurso de
tiempo de tres días, a la temperatura ambiente. Se procedió a
filtrar el CPG, bajo la acción de presión reducida, y se lavó
extensamente con isopropanol y, a continuación, con cloruro de
metileno, se secó con aire, y después, se secó bajo la acción de
vacío, durante 1 hora.
El bloqueo del extremo de terminal, con formación
de casquete, del CPG derivado, se realizó tal y como se describe en
el ejemplo 1.
Con objeto de demostrar el efecto de los
cebadores modificados en la formulación de dímero cebador, se
procedió a llevar a cabo comparaciones de amplificación de
HIV-1 RNA, utilizando ambos, cebadores modificados
y cebadores no modificados. Adicionalmente a ello, con objeto de
valorar el efecto de la posición del nucleótido modificado, en la
reducción del dímero cebador, se procedió a llevar a cabo
amplificaciones, utilizando tres cebadores diferentes, modificado
corriente arriba, los cuales diferían únicamente en la localización
de la base modificada.
Se sintetizaron moldes de HIV-1
RNA, utilizando un vector de transcripción de HIV-1
RNA, esencialmente, tal y como se describe en Mulder et al.,
1994, J. Clin. Microbiol. 32(2):
292-300.
Se procedió a llevar a cabo amplificaciones,
utilizando ambos, cebadores no modificados y cebadores modificados.
Las secuencias nucleótidas de cebadores no modificados, se muestran
posteriormente, abajo, orientadas en la dirección 5' a 3'. El
cebador corriente arriba RAR 1032MB (SEQ ID NO: 1) y el cebador
corriente abajo RAR1033MB (SEQ ID NO: 2), amplifican un producto de
175 pares de bases, correspondientes a las posiciones nucleótidas
2956 a 3130, de la secuencia de la cepa de referencia HXB2 del
HIV-1 (nº de acceso al GenBank - banco de genes -:
nº K03455).
Cebador | SEQ ID NO | Secuencia |
RAR1032MB | 1 | CAATGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAA |
RAR1033MB | 2 | CCCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA |
Las designaciones de los cebadores anteriores, de
arriba, se refieren a los cebadores no modificados. Los cebadores
modificados, se sintetizaron tal y como se describe en el ejemplo 1,
consistiendo, estos cebadores, en las mismas secuencias de
nucleótidos que las de los cebadores modificados, pero que contienen
una adenosina bencilada, bien ya sea en la posición del extremo 3',
o bien ya sea en una posición uno o más nucleótidos corriente arriba
del extremo 3'. Las formas modificadas de los cebadores, se designan
aquí de la siguiente forma:
Cebador | SEQ ID NO | Posición del nucleótido modificado |
RAR1032MBA1 | 1 | extremo 3' |
RAR1033MBA2 | 1 | 1 del extremo 3' |
RAR1032MBA4 | 1 | 3 del extremo 3' |
RAR1033MBA1 | 2 | extremo 3' |
Se procedió a llevar a cabo amplificaciones, en
reacciones de 100 \mul, utilizando los siguientes reactivos:
100 copias de cebador de RNA de HIV
50 mM tricina (pH, 8,33),
110 mM KOAc,
300 \muM de cada uno de los dATC, dCTP, y
dGTP
50 \muM dTTP
500 \muM dUTP
50 \muM de cada uno de los cebadores,
3,5 mM Mn(OAc)_{2},
13% glicerol,
20 unidades de Z05 DBA polimerasa*, y
20 unidades de UNG**.
* descrita en la patente estadounidense US nº
5.455.170
** fabricado y desarrollado por Hoffmann - La
Roche, y comercializado por Perking Elmer, Norwalk, CT.
La ciclación de la temperatura de la
amplificación, se realizó en un ciclador térmico de DNA del tipo
TC480 DNA thermal cicler (Perking Elmer, Norwalk, CT), utilizando el
siguiente perfil de temperatura:
Incubación de recirculación: | 45^{o}C durante 4 minutos; |
Transcripción inversa: | 60^{o}C, durante 30 minutos; |
46 ciclos: | desnaturalización a 95^{o}C durante 45 segundos, reasociación/extensión, |
a 60^{o}C, durante 45 segundos | |
Extensión final: | 60^{o}C, durante 7 minutos |
Retención post-reacción: | 10^{o}C, hasta análisis (durante corto tiempo). |
La presencia de producto amplificado, se detectó
mediante electroforesis en gel, de la siguiente forma. Se procedió a
fraccionar productos de reacción, utilizando un gel de agarosa (100
ml de NusSieve al 3% y SeaChem al 0,5%), y se utilizó tampón
corriente de IX TBE (0,089 M Tris, 0,089 M ácido bórico, 0,0025 M
EDTA disódico. Se procedió a añadir bromuro de etidio (0,5
\mug/ml), con objeto de marcar con color cualquier DNA
presente. Se procedió a llevar a cabo electroforesis, a 100 volt,
durante un transcurso de tiempo de aproximadamente 1 hora. Las
bandas de DNA, marcadas de color de tinción con bromuro de etidio,
se visualizaron utilizando radiación UV.
Los resultados de análisis de electroforesis en
gel, se ven en la figura 1. Los números de ruta, corresponden a cada
una de las amplificaciones, utilizando combinaciones de cebadores
modificados e inmodificados, tal y como se ve en la tabla que se
facilita posteriormente, abajo. Las bandas correspondientes al
producto de HIV pretendido, se indican en la figura, mediante una
flecha. Las otras bandas, en el gel, corresponden a amplificaciones
no específicas y, de una forma particular, dímeros cebadores.
\hskip3,5cm Cebadores | N^{o} de ruta | |
Corriente arriba | Corriente abajo | |
RAR1032MB | RAR1033MB | 1 |
RAR1032MBA1 | RAR1033MB | 2 |
RAR1032MBA2 | RAR1033MB | 3 |
RAR1032MBA4 | RAR1033MB | 4 |
RAR1032MB | RAR1033MBA1 | 5 |
RAR1032MBA1 | RAR1033MBA1 | 6 |
RAR1032MBA2 | RAR1033MBA1 | 7 |
RAR1032MBA4 | RAR1033MBA1 | 8 |
Debido al hecho de que, la formación de dímero
cebador, compite con la formación del producto de amplificación
pretendido, una reducción en el dímero cebador tiene como resultado,
de una forma típica, un incremento concomitante en la cantidad de
producto pretendido formado. Así, de este modo, el efecto de los
cebadores modificados, puede verse procediendo a comparar la
cantidad de dímero cebador formado, con relación a la cantidad
formada utilizando cebadores inmodificados, y comparando la cantidad
de la diana formada, con relación a la cantidad formada utilizando
cebadores inmodificados.
Una comparación de los resultados, utilizando dos
cebadores inmodificados (es decir, no modificados) (ruta 1), con los
resultados utilizando un cebador 3'-modificado
individual (rutas 2 y 5) y los resultados utilizando dos cebadores
3'-modificados (ruta 6), indica el hecho de que, se
obtuvo un decrecimiento de dímero cebador, utilizando, bien ya sea
uno o bien ya se dos cebadores modificados. En amplificaciones en
las que se utiliza un cebador 3'-modificado, se
observó una pequeña diferencia en la reducción de dímero cebador, la
cual dependía de cuál de los cebadores Se había modificado. La
utilización de dos cebadores (ruta 6), dio como resultado, en ambos,
el mayor decrecimiento en dímero cebador, y un incremento detectable
en la cantidad de secuencia diana amplificada.
Se ve el efecto de la posición del nucleótido
modificado, en comparación con las rutas 6-8. La
reducción de dímero cebador obtenida utilizando un cebador
modificado en el nucleósido contiguo al nucleótido del extremo 3'
(nucleótido 3'-terminal) (ruta 7), era equivalente
al obtenido utilizando el cebador modificado en el nucleótido del
extremo 3', (ruta 79, mientras que, la mejora obtenida utilizando un
cebador modificado en las tres bases del nucleótido, corriente
arriba del nucleótido del extremo 3' (ruta 8), era ligeramente
inferior.
Con objeto de demostrar adicionalmente el efecto
de los cebadores modificados, en la formación de dímero cebador, se
procedió a realizar comparaciones de la amplificación de HCV RNA,
utilizando ambos, cebadores modificados y cebadores inmodificados,
esencialmente, de la forma que se describe anteriormente, arriba.
Las amplificaciones, se realizaron utilizando tres cebadores
modificados, corriente arriba y, los cuales diferían únicamente en
la localización de la base modificada.
Se procedió a sintetizar moldes de HCV RNA,
utilizando un vector de transcripción HCV RNA, tal y como se
describe por parte de Young et al. 1993, J. Clin. Microbiol.
31(4): 882-886.
Se procedió a llevar a cabo amplificaciones,
utilizando ambos, cebadores no modificados y cebadores modificados.
Las secuencias nucleótidas de cebadores no modificados, se muestran
posteriormente, abajo, orientadas en la dirección 5' a 3'. El
cebador corriente arriba ST280A (SEQ ID NO: 3) y el cebador
corriente abajo ST778AA (SEQ ID NO: 4), amplifican un producto de
240 pares de bases, de una región no trasladada 5', del genoma del
HCV.
Cebador | SEQ ID NO | Secuencia del nucleótido |
ST280A | 3 | GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA |
ST778AA | 4 | GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA |
Las designaciones de los cebadores anteriores, de
arriba, se refieren a los cebadores no modificados. Los cebadores
modificados, se sintetizaron tal y como se describe en el ejemplo 1,
consistiendo, estos cebadores, en las mismas secuencias de
nucleótidos que las de los cebadores modificados, pero que contienen
una adenosina bencilada, bien ya sea en la posición del extremo 3',
o bien ya sea en una posición uno o más nucleótidos corriente arriba
del extremo 3'. Las formas modificadas de los cebadores, se designan
aquí de la siguiente forma:
Cebador | SEQ ID NO | Posición del nucleótido modificado |
ST280ABA1 | 3 | extremo 3' |
ST778AABA1 | 4 | extremo 3' |
ST778AABA2 | 4 | 1 del extremo 3' |
ST778AABA4 | 4 | 3 del extremo 3' |
Se procedió a llevar a cabo amplificaciones,
esencialmente, de la forma que se describe en el ejemplo 3, pero
utilizando 100 copias del molde HCV RNA. Se llevó a cabo un análisis
en gel, del producto amplificado, tal y como se describe en el
ejemplo 3.
Los resultados de análisis de electroforesis en
gel, se ven en la figura 2. Los números de ruta, corresponden a cada
una de las amplificaciones, utilizando combinaciones de cebadores
modificados e inmodificados, tal y como se ve en la tabla que se
facilita posteriormente, abajo. Las bandas correspondientes al
producto de HCV pretendido, se indican en la figura, mediante una
flecha. Las otras bandas, en el gel, corresponden a amplificaciones
no específicas y, de una forma particular, dímeros cebadores.
\hskip3,5cm Cebadores | N^{o} de ruta | |
Corriente arriba | Corriente abajo | |
ST280A | ST778AA | 1 |
ST280A | ST778AABA1 | 2 |
ST280A | ST778AABA2 | 3 |
ST280ABA | ST778AABA4 | 4 |
ST280ABA1 | ST778AA | 5 |
ST280ABA1 | ST778AABA1 | 6 |
ST280ABA1 | ST778AABA2 | 7 |
ST280ABA1 | ST778AABA4 | 8 |
Debido al hecho de que, la formación de dímero
cebador, compite con la formación del producto de amplificación
pretendido, una reducción en el dímero cebador tiene como resultado,
de una forma típica, un incremento concomitante en la cantidad de
producto pretendido formado. Así, de este modo, el efecto de los
cebadores modificados, puede verse procediendo a comparar la
cantidad de dímero cebador formado, con relación a la cantidad
formada utilizando cebadores inmodificados, y comparando la cantidad
de la diana formada, con relación a la cantidad formada utilizando
cebadores inmodificados.
Los resultados obtenidos, eran similares a los
obtenidos a partir de las amplificaciones de HIV descritas en el
ejemplo anterior, pero, en las amplificaciones de HCV, el
incremento, en el producto pretendido, era más evidente que en las
amplificaciones de HIV. Una comparación de los resultados,
utilizando dos cebadores inmodificados (es decir, no modificados)
(ruta 1), con los resultados utilizando un cebador
3'-modificado (rutas 2 y 5) y los resultados
utilizando dos cebadores 3'-modificados (ruta 6),
indica el hecho de que, se obtuvo un decrecimiento de dímero
cebador, utilizando, bien ya sea en uno o bien ya sea en dos
cebadores modificados. La utilización de dos cebadores modificados
(ruta 6), dio como resultado, en ambos, el mayor decrecimiento en
dímero cebador, conjuntamente con un significante incremento en la
cantidad de secuencia diana amplificada. Tal y como en el ejemplo
anterior, se observó una pequeña diferencia en la reducción de
dímero cebador, utilizando un cebador individual
3'-modificado, dependiendo del cual, se modificó el
cebador.
Se ve el efecto de la posición del nucleótido
modificado, en comparación con las rutas 6-8.
Esencialmente, se obtuvieron resultados equivalentes utilizando
cebadores modificados en el nucleótido del extremo 3' (nucleótido
3'-terminal) (ruta 6), nucleótido contiguo al
nucleótido del extremo 3' (ruta 7) y, el nucleótido tres bases
corriente arriba del nucleótido del extremo 3' (ruta 8), era
ligeramente inferior.
Estos resultados, indican el hecho de que, el
grupo modificador, puede encontrarse unido a cualquiera de los
nucleótidos, en el extremo 3' del cebador.
Con objeto de demostrar adicionalmente el efecto
de los cebadores modificados en la formación de dímero cebador, y
para demostrar modificaciones alternativas de cebadores, se procedió
a llevar a cabo amplificaciones de HCV RNA, utilizando ambos tipos
de cebadores, es decir, cebadores modificados y cebadores no
modificados, en donde, los cebadores, se modificaron mediante la
adición de unos o tres diferentes grupos modificadores: grupos
bencilo, nitrobencilo, y metilo.
Los resultados de la amplificación, se analizaron
mediante dos métodos diferentes: En un juego de comparaciones, se
procedió a ensayar la presencia de dímero cebador, mediante análisis
electroforésico de los productos de reacción. En un segundo juego de
comparaciones, se procedió a controlar la formación de dímero
cebador, durante la amplificación, utilizando los procedimientos de
PCR cinética descritos anteriormente, arriba.
Se procedió a sintetizar moldes de HCV RNA,
utilizando un vector de transcripción HCV RNA, tal y como se
describe por parte de Young et al. 1993, J. Clin. Microbiol.
31(4): 882-886.
Se procedió a llevar a cabo amplificaciones,
utilizando ambos, cebadores no modificados y cebadores modificados.
Los cebadores modificados, consistían en las mismas secuencias
nucleótidas que los cebadores no modificados, pero, se modificaron
en la adenosina del extremo 3' (adenosina
3'-terminal), mediante la adición de un grupo
metilo, un grupo bencilo, o un grupo nitrobencilo. Los cebadores, se
sintetizaron tal y como se describe en los ejemplos previos, Las
designaciones de los cebadores utilizados, se muestran abajo, a
continuación.
Cebador | SEQ ID NO | Modificación de la base 3' |
ST280A | 3 | no modificada |
ST280AMEA1 | 3 | metilo |
ST280ABA1 | 3 | bencilo |
ST280ANBA1 | 3 | nitrobencilo |
ST778AA | 4 | no modificada |
ST778AAMEA | 4 | metilo |
ST778AABA1 | 4 | bencilo |
ST778AANBA1 | 4 | nitrobencilo |
Se procedió a llevar a cabo amplificaciones, en
reacciones de 100 \mul, utilizando los siguientes reactivos:
0,20 ó 200 copias de molde de HCV RNA
50 mM tricina, pH, 8,3;
110 mM KoAc;
3,5 mM Mn(Oac)_{2};
300 \muM de cada uno de los dATC, dCTP, y
dGTP;
50 \muM dTTP;
500 \muM dUTP;
250 \muM de cada uno de los cebadores;
10 U rTth*
2U UNG*
13% Glicerol,
13% glicerol,
* fabricado y desarrollado por Hoffmann - La
Roche, y comercializado por Perking Elmer, Norwalk, CT.
La ciclación térmica de la amplificación, se
realizó en un ciclador térmico del tipo GeneAmp® PCR Systhem 9600
thermal cycler (Perking Elmer, Norwalk, CT), utilizando el siguiente
perfil de temperatura:
\vskip1.000000\baselineskip
Incubación de recirculación: | 45^{o}C durante 4 minutos; |
Transcripción inversa: | 60^{o}C, durante 30 minutos; |
46 ciclos: | desnaturalización a 94^{o}C durante 30 segundos, reasociación/extensión, |
a 60^{o}C, durante 30 segundos | |
Extensión final: | 60^{o}C, durante 7 minutos |
Retención post-reacción: | 4^{o}C. |
La presencia de producto amplificado, se detectó
mediante electroforesis en gel, de la siguiente forma. Se procedió a
fraccionar productos de reacción, utilizando un gel de agarosa (100
ml de NuSieve al 3%, SeaChem al 0,5%, y 0,5 \mug/ml de bromuro de
etidio): y tampón corriente de IX TBE (0,089 M Tris, 0,089 M ácido
bórico, 0,0025 M EDTA disódico. Se procedió a llevar a cabo
electroforesis, a 100 volt, durante un transcurso de tiempo de
aproximadamente 1 hora. Las bandas de DNA, marcadas de color de
tinción con bromuro de etidio, se visualizaron utilizando radiación
UV.
En los procedimientos de PCR cinética descrita
anteriormente, arriba, se procedió a intercalar un colorante de
intercalación, tal como el bromuro de etidio, el cual tiene una
fluorescencia más fuerte cuando, al intercalarse en un DNA de doble
hebra, se añade a la PCR. El incremento en DNA de doble hebra,
durante la amplificación, se controla mediante métodos de
fluorescencia del colorante, durante la reacción. Debido a los
procedimientos de PCR cinética, únicamente miden un incremento en la
cantidad total de DNA de doble hebra, la formación de producto no
específico de ampliación, no se mide de una forma independiente. Con
objeto de medir la aparición de amplificaciones no específicas
resultantes de dímero cebador, independiente de la amplificación de
cebadores, se llevaron a cabo reacciones sin ácido nucleico molde.
En tales reacciones exentas de moldes, cualquier incremento en DNA
de doble hebra, es atribuible a la formación de producto no
específico de amplificación, no independiente del
molde.
molde.
Las condiciones de reacción de PCR, son como se
describen anteriormente, arriba, excepto en cuanto al hecho de que
se añadió bromuro de etidio, a la mezcla de reacción, a una
concentración de 1 (g/ml). Las reacciones, se controlaron
procediendo a medir la fluorescencia de la mezcla de reacción, tal y
como se describe en la patente europea EP 640 828.
Las mediciones de reacción, se normalizaron
procediendo a dividir la medición de la fluorescencia inicial
obtenida durante un ciclo, temprano, en la reacción, mientras que,
las mediciones de fluorescencia entre ciclos, eran relativamente
constantes. El número de ciclos elegido para la medición de la
fluorescencia inicial, era la misma para todas las reacciones
comparadas, de tal forma que, todas las mediciones, representan
incrementos relativos al mismo ciclo de reacción. La fluorescencia
de la reacción, en reacciones exentas de diana, permanecieron
relativamente constantes hasta que se formó dímero cebador. En la
mayoría de las reacciones, si llevan a cabo suficientes ciclos de
amplificación, el dímero cebador, se convierte en detectable. El
efecto de los cebadores modificados, pude verse a partir de una
comparación del número de ciclos llevados a cabo, hasta que se haya
formado el dímero cebador, si es que se
realiza.
realiza.
Los resultados de la electroforesis en gel, se
ven en la figura 3. Los números de ruta correspondientes a cada una
de las amplificaciones, la cuales utilizan los grupos no modificados
y los tres grupos de cebadores modificados y 200 copias, 20 copias o
0 copias de HCV RNA, se muestran en la tabla que se facilita abajo,
a continuación, (números de ruta, se cuentan de izquierda a derecha;
las rutas 1-30, se encuentran en la poción superior
del gel; las rutas 31-60, se encuentran en la
porción del fondo del gel. Adicionalmente a ello, los marcadores de
los pesos moleculares, se encontraban presentes en las rutas 1 y 31
(Hae III disgested Phix 174 RF DNA, New England Bioloabs. Beverly,
MA), y en las rutas 30 y 60 (Superladder-low [escala
inferior], 30 bp lader [escala de 20 pb], bGen Saura,
Del-Mar, CA.). Las bandas correspondientes a los
productos específicos pretendidos, se indican en la figura, mediante
una flecha (\sim230 pb). Las otras bandas, en el gel, corresponden
a los productos de amplificación, no específicos y, en particular, a
dímero cebador.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados, demuestran el hecho de que, la
amplificación en las que se utilizan cebadores modificados, tienen
como resultado una cantidad mayor de ácido nucleico HCV amplificado,
que las amplificaciones que utilizan los cebadores no modificados.
Adicionalmente a ello, la amplificación en la que se utilizan los
cebadores modificados, dio como resultado una reducción de dímero
cebador, relativo a la amplificación utilizando los cebadores no
modificados.
En los ensayos de PCR cinética, la fluorescencia,
se gobernó a través de la totalidad de la reacción. La tasa de
incremento de la fluorescencia después del incremento en
fluorescencia, el cual era detectable, fue aproximadamente el mismo
en todas las reacciones, tal y como se evidencia mediante la forma
de la curva obtenida procediendo a hacer un registro gráfico de la
fluorescencia con respecto al número de ciclos (no mostrado). Esto
indica el hecho de que, los cebadores modificados, inhiben la
eficacia de cada etapa de amplificación, después de la etapa inicial
de amplificación. La reacciones, diferían de una forma significativa
en el número de ciclos llevados a cabo, antes de que fuera
detectable un incremento en la fluorescencia.
Con objeto de cuantificar la calidad de las
diferencias entre las reacciones, los resultados se expresan en
términos del número de ciclos de amplificación llevados a cabo,
hasta que la fluorescencia excediera de un nivel arbitrario de
fluorescencia (AFL). El AFL, se eligió a un valor próximo al nivel
de fluorescencia de la línea de base, pero por encima de los
márgenes de las fluctuaciones aleatorias en la fluorescencia medida,
de tal forma que, la cinética de reacción, se midió durante la fase
de crecimiento geométrico de la amplificación. La acumulación del
producto de amplificación, en los ciclos más tardíos, inhibe la
reacción y conduce eventualmente a una meseta de reacción.
La PCR cinética, se resume en la tabla que se
facilita abajo, a continuación. Cada valor, para las amplificaciones
de 20 ó 200 copias de molde diana, representa un valor medio de
cinco amplificaciones de replicación, con la excepción de
amplificaciones en las que se utilizan cebadores bencilados y 20
copias de diana, lo cual representa una media de cuatro replicados.
Cada valor, para las amplificaciones sin molde, representan una
media de ocho replicados.
Dos, entre los ocho replicados de amplificaciones
en los que se utilizó cebadores bencilados, sin diana presente, no
dieron como resultado la formación de dímero cebador, al final de
los 46 ciclos. Se muestra la media de las seis amplificaciones
restantes, la cual representa un valor medio, condicionado en el
dímero cebador que se muestra. La media condicional, no es
comparable a los otros valores mostrados, debido a los datos
suprimidos.
Los datos, indican el hecho de que, los cebadores
modificados, retardan, de una forma aparente, la amplificación, de
ácido nucleico diana, de tal forma que, la AFL, de alcanza algunos
ciclos más tarde. El retraso, no correspondía a una reducción en el
rendimiento final del producto de amplificación específico. Se
observó que, todas las amplificaciones de ácido nucleico, alcanzaban
la meseta dentro de los 46 ciclos, utilizados en el experimento y,
tal y como se evidencia mediante los correspondientes datos
procedentes del análisis de electroforesis en gel, el rendimiento
productivo final, se incrementó, al utilizar los cebadores
modificados.
Los datos, indican el hecho de que, el retardo en
la formación de dímero cebador, era significativamente más grande
que el retardo en la amplificación de la diana. El efecto
beneficioso de los cebadores, se ve de una forma más clara,
comparando amplificaciones exentas de diana, y amplificaciones con
200 copias de molde. Utilizando cebadores no modificados, el
incremento en fluorescencia, al valor de AFL, acontecía únicamente
un ciclo más tarde, en amplificaciones sin diana, lo cual indicaba
el hecho de que, la amplificación de la diana, sería difícil de
distinguir, de la formación de dímero cebador. Como contraste de
ello, utilizando cebadores modificados, el incremento de la
fluorescencia, debido al dímero cebador, acontecía por lo menos tres
ciclos más tarde y, utilizando los cebadores bencilados, acontecía
por lo menos 6 ciclos más tarde, si es que ésta acontecía. Así, de
esta forma, pudo detectarse la amplificación diana, y distinguirse
de la formación de dímero cebador.
Comparando la amplificación exenta de diana, y
las amplificaciones con 20 copias de cebador, el efecto de los
cebadores modificados, mostraba el mismo patrón de un mayor retraso
en la iniciación del dímero cebador, que el retraso en la
amplificación de la diana. Utilizando cebadores inmodificados, no se
pudieron detectar 20 copias de molde. Utilizando los cebadores de
nitrobencilo y de bencilo, la formación de dímero cebador, se
retrasó de una forma suficiente, como para capacitar la detección de
20 copias de molde, en este sistema.
Los datos procedentes del control de la
fluorescencia, en cada ciclo de amplificación (datos no mostrados),
indican el hecho de que, de una forma general, el retraso en la
formación de dímero cebador, era suficiente como para evitar el que,
la formación de dímero cebador, alcanzara un nivel de meseta, de 46
ciclos. Así, de esta forma, los cebadores modificados, parecían
retrasar la formación de dímero cebador, de una forma suficiente, de
tal forma que, la amplificación de la diana, pudiera completarse y,
la reacción, se parara antes de que se formara un nivel
significativo de dímero cebador.
Para demostrar el uso de modificadores
foto-lábiles, se procedió a llevar a cabo
amplificaciones de HCV RNA, utilizando ambos tipos de cebadores,
cebadores modificados y cebadores inmodificados. Los cebadores
modificados, se modificaron mediante la unión de uno o dos grupos
nitrobencilo a la amina exocíclica de la adenina
3'-terminal (adenina del extremo 3').
Se procedió a sintetizar cebadores, de la forma
que se describe en el ejemplo 4. Las designaciones para los
cebadores, utilizados, se muestran abajo, a continuación
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador | SEQ ID NO | Modificación de la base 3' |
ST280A | 3 | no modificada |
15239 | 3 | bis-nitrobencilo |
15241 | 3 | mononitrobencilo |
ST778AA | 4 | no modificada |
15240 | 4 | bi-nitrobencilo |
15242 | 4 | mononitrobencilo |
Se procedió a llevar a cabo amplificaciones, para
cada par de cebadores, utilizando una serie de diluciones de
concentración de entrada de diana. Se realizaron dos paneles de
reacción, incluyendo cada uno de ellos, todas las combinaciones de
par de cebadores, y concentraciones de diana de entrada y, en cada
panel de reacción, se procedió a realizar cada reacción por
duplicado, conteniendo cada reacción un par de cebadores dado y
concentración dada de diana. Las amplificaciones, se llevaron a cabo
en reacciones de 100 \mul, las cuales contenían los siguientes
reactivos:
0, 10, 10^{2}, 10^{3}, 10^{4}, o 10^{5}
copias de molde de HCV RNA
55 mM tricina,
90 mM KOAc,
3 mM Mn(OAc)_{2},
200 \muM de cada uno de los dATC, dCTP, y
dGTP;
200 \muM dUTP,
250 \muM de cada uno de los cebadores;
10 U rTth*,
2U UNG* y
8% Glicerol,
* fabricado y desarrollado por Hoffmann - La
Roche, y comercializado por Perking Elmer, Norwalk, CT.
La ciclación térmica de la amplificación, se
realizó en un ciclador térmico del tipo GeneAmp® PCR Systhem 9600
thermal cycler (Perking Elmer, Norwalk, CT), utilizando el siguiente
perfil de temperatura:
Incubación de pre-reacción: | 50^{o}C durante 5 minutos; |
Transcripción inversa: | 60^{o}C, durante 30 minutos; |
Desnaturalización inversa: | 95^{o}C, durante 1 minuto; |
2 ciclos: | desnaturalización a 95^{o}C durante 15 segundos, reasociación/extensión, |
a 60^{o}C, durante 20 segundos; | |
46 ciclos: | desnaturalización a 90^{o}C durante 15 segundos, reasociación/extensión, |
a 60^{o}C, durante 20 segundos; | |
Extensión final: | 72^{o}C, durante 10 minutos |
Se utilizaron tapones de tubos de reacción,
pulidos (Perking Elmer, Norwalk, CT), desde el principio hasta el
final. Después de que, la temperatura de reacción, hubiera alcanzado
los 60ºC, para la etapa de transcripición inversa, se procedió a
retirar la tapa calentada, de la bandeja de la PCR, en el bloque del
ciclador térmico y, la mitad de los tubos de reacción (un juego
completo de reacciones por duplicado), se cubrieron con folio de
aluminio. La otra mitad, se iluminó, utilizando una lámpara UV de
sostenimiento manual, la cual emitía a 302 nm (modelo de UVP,
UVM-57, de la firma UVP Products, San Gabriel, CA),
durante un transcurso de tiempo de diez minutos. La tapa calentada,
se reemplazó, y se continuó la amplificación.
Los resultados de la amplificación, se analizaron
mediante electroforesis en gel, tal y como se describe
anteriormente, arriba. Los resultados, se ven en la figura 4. El
número de copias de los cebadores y moldes utilizados en cada
reacción, se indican en el gel (log. del número de copias mostrado).
Las bandas correspondientes al producto pretendido, se indican en la
figura. Las otras bandas en el gel, corresponden al producto no
específico de amplificación y, de una forma particular, dímero
cebador.
Una comparación del juego de reacciones irradiado
con radiaciones UV, muestra que, el uso de los cebadores
modificados, tiene como resultado un significativo decrecimiento de
los dímeros cebadores, especialmente, a reducidos números de
copias.
Una comparación del juego no irradiado de
reacciones, muestra que, el uso de cebadores de bisnitrobencilo,
tiene como resultado una inhibición completa de la amplificación,
tal y como se esperaba. Las amplificaciones en las que se utilizan
cebadores de mononitrobencilo, no únicamente proporcionan el
producto, sino que, además, exhiben un significante decrecimiento en
dímero cebador, lo cual es consistente con los resultados obtenidos
en los ejemplos previos.
Este ejemplo, describe la amplificación de HCV
RNA, utilizando cebadores modificados con grupos
p-tert.-butilbencilo.
Se procedió a sintetizar moldes de HCV RNA,
utilizando un vector de transcripción de HCV RNA, tal y como se
describe por parte de Young et al. 1993, J. Clin. Microbiol.
31(4): 882-886.
Se procedió a llevar a cabo amplificaciones,
utilizando cebadores modificados, tal y como se describe en el
Ejemplo 2, anteriormente facilitado, arriba. Las secuencias
nucleótidas de los cebadores no modificados, se muestran
posteriormente, abajo, orientadas en la dirección 5' a 3'. Los
cebadores utilizados, eran versiones modificadas del cebador
corriente arriba ST280A (SEQ ID NO: 3) y del cebador corriente abajo
ST778AA (SEQ ID NO: 4). Las formas modificadas de los cebadores, se
designan abajo, a continuación, de la forma que sigue:
Cebador | SEQ ID NO | Posición del nucleótido modificado |
ST280ATBU | 3 | extremo 3' |
ST778AATBU | 4 | extremo 3' |
Las amplificaciones, se llevaron a cabo en
reacciones de 100 \mul, las cuales contenían los siguientes
reactivos:
20, 5, 2,5, 2 ó 0 copias de molde HCV RNA
55 mM tricina (pH 8,33),
110 mM KOAc,
300 \muM de cada uno de los dATC, dCTP, y
dGTP;
50 \muM dTTP,
500 \muM de dUTP,
50 \muM de cada uno de los cebadores,
3,5 mM de Mn(Oac)_{2},
13% Glicerol,
20 unidades de rTrh DNA polimerasa, y
8,0 unidades de UNG*
* fabricado y desarrollado por Hoffmann - La
Roche, y comercializado por Perking Elmer, Norwalk, CT.
La ciclación térmica de la amplificación, se
realizó en un ciclador térmico para DNA, del tipo TC480 DNA thermal
cycler (Perking Elmer, Norwalk, CT), utilizando el siguiente perfil
de temperatura:
Incubación de pre-reacción: | 45^{o}C durante 12 minutos; |
Inactivación UNG | 90^{o}C durante 30 segundos |
Transcripción inversa: | 60^{o}C durante 20 minutos; |
47 ciclos: | desnaturalización a 94^{o}C durante 45 segundos, reasociación/extensión, |
a 60^{o}C, durante 70 segundos; | |
Extensión final: | 60^{o}C, durante 7 minutos |
Retención de post-reacción: | 10^{o}C, hasta análisis (durante un corto transcurso de tiempo) |
Los productos de amplificación se analizaron
mediante electroforesis en gel, tal y como se describe
anteriormente, arriba.
Las amplificaciones llevadas a cabo en cada
número de moldes diana, se replicaron de la siguiente forma: Se
procedió a llevar a cabo 3 amplificaciones, utilizando 20 copias de
molde diana, se realizaron 3 amplificaciones utilizando 5 copias de
molde diana, se realizaron 3 amplificaciones utilizando 2,5 copias
de molde diana, se realizó una amplificación utilizando 2 copias de
molde diana, y se realizaron 23 amplificaciones sin ninguna diana
presente. Todas las amplificaciones positivas de moldes, tuvieron
como resultado una banda individual, en el gel, de la medida de
diana esperada. Ninguna de las amplificaciones, dio como resultado
bien ya fuera un dímero cebador o bien ya fuere otro producto no
específico de amplificación.
Los resultados, pueden compararse con aquéllos
del ejemplo 6, anteriormente facilitados, arriba, en donde, se
amplificó la misma diana de HCV, utilizando las mismas secuencias de
cebadores. Una comparación de estos resultados, con los del ejemplo
6, indican el hecho de que, las amplificaciones en las que se
utilizan cebadores modificados con
p-tert.-butilbencilo, se encontraban
significativamente mejoradas, con relación a las correspondientes
amplificaciones llevadas a cabo con cebadores no modificados.
Se procedió a llevar a cabo experimentos
adicionales, en los cuales, la HIV-1 RNA, se
amplificó utilizando versiones de los cebadores
p-tert.-butilbencil-modificados,
descritos en el ejemplo 5 que se facilita anteriormente, arriba. Las
amplificaciones, se llevaron a cabo, esencialmente, de la forma que
describe anteriormente, arriba. Tal y como en el sistema de HCV
descrito aquí, todas las amplificaciones positivas de moldes de
HIV-1, dieron como resultado una banda individual en
el gel, del esperado tamaño de diana y, ninguna de las
amplificaciones, dio como resultado bien ya fuera dímeros cebadores,
u otros productos de amplificación, no específicos.
Los resultados, pueden compararse con aquéllos
del ejemplo 5, anteriormente facilitados, arriba, en donde, se
amplificó la misma diana de HIV, utilizando las mismas secuencias de
cebadores. Una comparación de estos resultados, con los del ejemplo
5, anterior, indican el hecho de que, las amplificaciones en las que
se utilizan cebadores modificados con
p-tert.-butilbencilo, se encontraban
significativamente mejoradas, con relación a las correspondientes
amplificaciones llevadas a cabo con cebadores no modificados.
Este ejemplo, describe una comparación de
amplificaciones de DNA microbiana llevado a cabo utilizando
cebadores modificados e inmodificados. Se utilizaron ambos
cebadores, modificados mediante la adición de un grupo bencilo al
nucleótido terminal 3', y cebadores modificados mediante la adición
de un grupo p-tert.-butilbencilo, al nucleótido
terminal 3'. La reacciones en las que se utilizan cebadores
inmodificados, eran esencialmente tal y como se describen en Tevere
et al. 1996, J. Clin. Micobriol. 34 (4): 918:923. Se llevaron
a cabo las amplificaciones, utilizando muestras de esputo, en el
interior de la cuales, se añadió DNA microbacteriano, en una
concentración conocida, a muestras clínicas mímicas infectadas. Se
procedió a utilizar amplificaciones, utilizando DNA microbacteriano,
y utilizando muestras de control exentas de DNA.
Se procedió a licuar especímenes de esputo, los
cuales mostraban que eran negativos, para microbacterias, mediante
microscopía y cultivo, y se descontaminaron mediante el
procedimiento de
N-actil-cisteína-NaOH,
recomendado por parte de la CDC (Kent y Kubica, 1985, Public Health
Mycrobacteriology, a guide for the level III laboratory, -
Microbacteriología de la salud pública -, US Departament of Health
and Human Services, Centers for Diseasa Control, Alanta, -
Departamento de los EEUU, de servicios de la salud y servicios
humanos, Centros para el control de las enfermedades, Atlanta -.
Se procedió a añadir esputo licuado (100 \mul),
a 500 \mul de Reactivo de lavado del Espécimen Respiratorio (10
mM Tris HCl, 1 mM EDTA, 1% (volumen / volumen) Triton X - 100, 0,05%
NaN_{3}, pH 8,0), y se centrifugó durante un tiempo de 10 minutos,
a 12.500 x g. Cada gránulo, se resuspendió en 100 \mul de reactivo
de lisis (0,05 N NaOH, 1% (volumen / volumen) Triton X - 100, 1 mM
EDTA, 0,05% NaN_{3}) y se incubó, durante un tiempo de 45 minutos,
a una temperatura de 60ºC. Los lisados, se desnaturalizaron con 100
\mul de reactivo de neutralización (0,2 M Tris - HCl), 8 mM
MgCl_{2}, 0,05 NaH_{3}, pH 7,5).
Se generaron lisados de esputo asociados,
procediendo a combinar 80 \mul de cada uno de los lisados de
esputo por separado. A cada uno de los lisados de esputo asociados
(160 \mul de cada uno de ellos), se le añadieron 15 \mul de un
pie de DNA (2 copias/\mul, en una mezcla de lisis de 1:1, y
neutralización de reactivos), purificados a partir de M.
tuberculosis cultivado.
Se procedió a preparar muestras que contenían
DNA microbacteriana purificada (no esputo), en una concentración
conocida, mediante la adición de 10 \mul de pie de DNA, a 100
\mul de una mezcla de reactivo de lisis y reactivo de
neutralización 1:1.
Las muestras negativas de control (no DNA),
consistían en una mezcla de 100 \mul de reactivo de lisis, y 100
\mul de reactivos de neutralización.
Se procedió a llevar a cabo amplificaciones,
utilizando cebadores consistentes en las siguientes secuencias
nucleótidas:
Cebadores | Secuencia |
KY18 (SEQ ID NO: 5) | 5'-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3' |
KY436 (SEQ ID NO: 6) | 5'-TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA-'3' |
KY45 (SEQ ID NO: 7) | 5'-GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA-3' |
Los siguientes pares de cebadores, los cuales
contienen el grupo modificado indicado, unido a la base terminal 3',
se utilizaron en la amplificación. Todos los cebadores modificados,
se sintetizaron tal y como se describe en los ejemplos anteriores.
Todos los cebadores, se biotinilizaron en el extremo 5'.
Par de cebadores | Secuencias del cebador | Modificación |
A | KY18 (SEQ ID NO: 5) | inmodificado |
KY75 (SEQ ID NO: 7) | inmodificado | |
B | KY436 (SEQ ID NO: 6) | bencilo |
KY75 (SEQ ID NO: 7) | bencilo | |
C | KY436 (SEQ ID NO: 6) | p-tert.-butil-bencilo |
KY75 (SEQ ID NO: 7) | p-tert.-butil-bencilo |
Para cada muestra, se llevaron a cabo
amplificaciones, utilizando el par de cebadores no modificados KY18
(SEQ ID NO: 5) y KY75 (SEQ ID NO: 7), y las formas modificadas del
par de cebadores KY436 (SEQ ID NO: 6) y KY75 (SEQ ID NO: 7).
Las amplificaciones, se llevaron a cabo en
reacciones de 100 \mul, las cuales contenían, cada una de ellas,
50 \mul de una de las tres muestras descritas anteriormente,
arriba, y 50 \mul de una mezcla reactiva 2X, que contenían los
siguientes reactivos:
100 mM Tris-HCl, pH 8,9;
500 nM de cada cebador;
200 \muM de (cada uno) (dNTP, dATC, dCTP, dGTP,
DutP);
20% (volumen / volumen) Glicerol,
20 unidades de rTrh DNA polimerasa;
10 unidades de AmpliTaq*
6 unidades de Amperase*
* fabricado y desarrollado por Hoffmann - La
Roche, y comercializado por Perking Elmer, (Norwalk, CT).
La ciclación térmica de la amplificación, se
realizó en un ciclador térmico de PCR, del tipo GeneAmp systeme 9600
thermal cycler (Perking Elmer, Norwalk, CT), utilizando el siguiente
perfil de temperatura:
Incubación de pre-reacción: | 50^{o}C durante 5 minutos; |
2 ciclos: | desnaturalización a 98^{o}C durante 20 segundos, reasociación a a 62^{o}C, |
durante 20 segundos; extensión, a 72^{o}C, durante 45 segundos; | |
41 ciclos: | desnaturalización a 94^{o}C durante 20 segundos, reasociación a 62^{o}C, |
durante 20 segundos; extensión, a 72^{o}C, durante 45 segundos; | |
Extensión final: | 72^{o}C, durante 12 horas (toda la noche) |
Los productos de amplificación se visualizaron,
mediante 2% Nusieve®, gel de agorasa al 5%, seguido de marcado de
color con bromuro de etidio.
Los resultados del análisis de electroforesis, se
muestran en la figura 5. Para cada muestra, los productos de
amplificaciones realizadas con cebadores no modificados (indicados
como "A"), y con cebadores modificados (indicados como "B"
y "C"), se llevaron a cabo en rutas contiguas. Las bandas
correspondientes a la secuencia diana microbacteriana pretendida, se
indican con flechas. Otras bandas, corresponden a productos no
específicos de amplificación; las bandas más bajas, en el gel,
corresponden a dímero cebador. Las rutas marcadas con "M",
contienen un marcador de peso molecular (Digestión Hae III de
PhiX174 DNA).
Utilizando los cebadores no modificados, las
amplificaciones de DNA microbacteriano purificado, dieron como
resultado la formación de dímero cebador. La utilización de
cualquiera de los dos cebadores modificados, incrementaba la
cantidad de la diana pretendida presente, y eliminaba esencialmente
la formación de dímero cebador detectable.
Como contraste a la amplificación de DNA
purificado, utilizando los cebadores no modificados, la presencia de
lisado de esputo, en la reacción de amplificación, reducía la
eficacia e incrementaba la de producto de amplificación, no
específico, tal y como se muestra mediante la presencia de bandas
extrañas de productos. El incremento de producto de amplificación no
específico, no es sorprendente, debido al hecho de que, los lisados
de esputo, contienen una significante cantidad de DNA humano. La
utilización de cualquiera de los dos pares de cebadores modificados,
en amplificaciones llevadas a cabo en presencia de esputo, dieron
como resultado, tanto a un significativo incremento e la cantidad de
producto generado pretendido, como a la reducción de amplificación
no específica.
Se procedió a sintetizar cebadores modificados
mediante la adición de un grupo bencilo, a una citosina terminal,
esencialmente, de la forma que se describe en el ejemplo 1, pero
utilizando una N^{4}-acetil,
N^{4}-bencil-5'-O-DMT-2'-desoxicitidina
acoplada a LCAA-CPG, preparada de la forma que se
describe posteriormente, a continuación.
Etapa
1
Se procedió a añadir bencilamina (20 ml), a
hidrocloruro de 2'-desoxicitidina (5,28 g, 20 mmol,
U.S. Biochemical Corp. Cleveland, OH) y, la mezcla, se calentó a una
temperatura de 150ºC, durante 3 horas, bajo una atmósfera de argón.
La solución, se concentró bajo la acción de vacío, para proporcionar
un aceite amarillo, viscoso, el cual se distribuyó entre agua (100
ml) y acetato de etilo (100 ml). Las fase acuosa, se lavó con
acetato de etilo (100 ml) y se separó. La fase acuosa, se concentró
bajo la acción de vacío, para proporcionar un jarabe de color
amarillo (13 g), el cual se purificó mediante cromatografía de gel
de sílice, con un eluyente consistente en cloruro de metileno :
metanol, 15: 1, para proporcionar el producto deseado (5,8 g,
91,5%), como un jarabe incoloro.
Etapa
2
Se procedió a disolver
N^{4}-bencil-2'-desoxicitidina
(2,5 g, 7,9 mmol), en 15 ml de dimetilformamida seca (15 ml), se
añadió anhídrido acético (8 g, 79 mmol, 10 equivalentes) y, la
mezcla, se agitó durante el transcurso de toda la noche, a la
temperatura ambiente. El disolvente y el exceso de anhídrido
acético, se evaporaron bajo la acción de vacío. El producto, se
purificó mediante cromatografía de columna, con gel de sílice,
utilizando, como eluyente, cloruro de metileno : metanol 20 : 1,
para proporcionar el compuesto del epígrafe (1,3 g, 48%). El
compuesto, era altamente higroscópico, y se almacenó, seco, a una
temperatura de -20ºC.
Etapa
3
Se procedió a disolver
N^{4}-acetil,
N^{4}-bencil-2'-desoxicitidina
(76 mg, 0,2 mmol), en 1 ml de piridina seca, y se añadió
DMT-Cl (122 mg, 0,2 mmol, 1,0 equivalentes). La
mezcla de reacción, se agitó durante 3 horas. El análisis de TLC,
mostró que algo del material de partida, había permanecido, de forma
que, se procedió a añadir un alícuoto adicional de
DMT-Cl (61 mg, 0,5 equivalentes) y, la mezcla
resultante, se agitó durante otra hora, después de cuyo transcurso
de tiempo, el análisis de TLC, mostró el hecho de que, la reacción,
se había completado. La reacción, se extinguió con 15 ml de solución
de salmuera y, la fase acuosa, se extrajo con cloruro de metileno (3
X 15 ml). La capa orgánica combinada, se lavó con salmuera (2 x 15
ml) y se secó sobre sulfato magnésico anhidro. El disolvente, se
evaporó y, la mezcla, se purificó mediante cromatografía en gel de
sílice, utilizando cloruro de metileno: metanol, 50: 1, para
proporcionar N^{4}-acetil,
N^{4}-bencil,5'-O-DMT-2'-desoxicitidina
(96 mg, 65% de rendimiento productivo).
Etapa
4
Se procedió a disolver la
N^{4}-acetil, N^{4}-bencil,
5'-O-DMT-2'-desoxicitidina
(96 mg, 0,13 mmol), en 2 ml de piridina seca. Se añadió anhídrido
succínico (100 mg, 1,0 mmol) y dimetilaminopiridina (20 mg) y, la
mezcla resultante, se agitó a la temperatura ambiente, durante tres
días. Se procedió a evaporar el disolvente y, el residuo, se
co-evaporó con tolueno (3 X 10 ml). Se añadió
cloroformo (50 ml), con objeto de disolver el residuo (se utilizó un
tratamiento de sonificación por ultrasonidos, con objeto de ayudar
en la disolución). La capa de cloroformo se lavó con salmuera (3 X
15 ml) y agua (1 x 15 ml). La capa orgánica, se secó con sulfato
magnésico anhidro. El disolvente, se evaporó, con objeto de
proporcionar 108 mg de
3'-O-succinato de
N^{4}-acetil, N^{4}-bencil,
5'-O-DMT-2'-desoxicitidina
(97% de rendimiento productivo).
Etapa
5
El CPG activado, se preparó de la siguiente
forma: Se procedió a tratar LCAA-CPG (1,0 g,
LCA00500C, CPG Inc, Fairfield, NJ), con ácido tricloroacético, en
cloruro de metileno (3%, 10 ml) y se mezcló mediante rotación, en un
evaporador rotatorio (rotovapor, Buchi, Flawil, Swizerland) (sin
vacío), durante 4 horas. Se procedió a filtrar el disolvente y, el
CPG, se lavó con trietilamina: etildiisopropilamina (3 X 5 ml),
cloruro de metileno (3 X 10 ml) y éter (3 X 10 ml), consecutivamente
y, a continuación, se secó bajo la acción de vacío.
El acoplamiento del intermediario nucleósido
modificado, al CPG lavado con ácido, se realizó de la siguiente
forma. A 1 gramo de LCAA-CPG activado, se le añadió
3'-O-succionato de
N^{4}-acetil,
N^{4}-bencil-5'-O-DMT-2'-desoxicitidina
(108 mmol, 0,13 mmol), preparado de la forma que se ha descrito
anteriormente, arriba, dimetilaminopiridina (20 mg), y 5 ml de
piridina seca. La mezcla de reacción, se sometió a rotación, en un
rotavapor (sin vacío), durante tres días. El sobrenadante, se filtró
y, el LCAA-CPG acoplado, se lavó, de una forma
secuencial, con piridina (3 X 5 ml), cloruro de metileno (3 x 10
ml), y éter (3 x 10 ml) y, a continuación, se secó al vacío.
El bloqueo del extremo de terminal, con formación
de casquete, del 3'-O-succionato de
N^{4}-acetil,
N^{4}-bencil-5'-O-DMT-2'-desoxicitidina
acoplado a LCAA-CPG, se realizo de la siguiente
forma: Al CPG derivado, se le añadió un reactivo de mezcla de
bloqueo con formación de casquete, A (Capping mix reagent)
(THF/Lutidine/Ac_{2}O 8:1:1, Glen Research DNA synthesis reagents,
Sterling, VA) y B (10% N-metilimidazol en THF, Glen
Research), y la mezcla de reacción, se puso en rotación con un
rotavapor (sin vacío), durante el transcurso de toda la noche. La
solución, se filtró y, el LCAA-CPG acoplado, se
lavó, de una forma secuencial, con piridina (3 X 5 ml), cloruro de
metileno (3 x 10 ml), THF (3 x 10 ml) y éter (3 x 10 ml) y, a
continuación, se secó al vacío.
La capacidad de acoplamiento del
LCAA-CPG derivado, se determinó procediendo a tratar
5 mg del producto, con 3% ácido tricloroacético en cloruro de
metileno y, la cantidad de ión dimetoxietilcarbonio liberada, se
midió mediante espectografía UV. La cantidad de nucleósido derivado
acoplado al LCAA-CPG, se determinó que era de un
valor de 19,5 \mumol/g.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: F. HOFFMANN - LA ROCHE AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Grenzacherstrasse 124
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: BS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH - 4070
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 061-688 25 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 061-688 13 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 962292/965542 hlr ch
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN : Cebadores modificados
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA DE LA COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco Floppy
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- COMPUTADORA: Appel Macintosh
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Sistema 7.1 (Macintosh)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Word 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: 60-041127
\vskip0.800000\baselineskip
- FECHA DE REGISTRO: 20. 03. 97
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATGAGACA CCAGGAATTA GATATCAGTA CAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCTAAATCA GATCCTACAT ATAAGTCATC CA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAAGCACCC TATCAGGCAG TACCACAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACATGCAAG TCGAACGGAA AGG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAACACATGC AAGTCGAACG GAAA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCCGTATCG CCCGCACGCT CACA
\hfill
Claims (11)
1. Un oligonucleótido, el cual tiene la
estructura general:
5'---S_{1}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{R}}---3'---
\hskip0,5cmo
\hskip0,5cm5'---S_{1}---
\uelm{N}{\uelm{\para}{R}}---S_{2}---3'
en donde, S_{1}, representa una
primera secuencia de nucleótidos entre aproximadamente 5 y
aproximadamente 50 nucleótidos de
longitud;
en donde, S_{2}, representa una segunda
secuencia entre uno y tres nucleótidos de longitud;
en donde, N, representa un nucleótido, el cual
contiene una base de purina o pirimidina, la cual contiene una amina
exocíclica;
en donde, R, representa un grupo modificador, en
donde, R, está enlazado, de una forma covalente, a N, mediante una
amina exocíclica, y en donde, R, tiene la estructura:
R_{1}---
\melm{H}{C}{\uelm{\para}{}}---R_{2}
en donde, R_{1} y R_{2},
representan, de una forma independiente, un grupo alquilo
C_{1}-C_{10}, un grupo alcoxi, un grupo fenilo,
un grupo fenoxi, un grupo fenilo sustituido, un grupo naftilo, o un
grupo naftilo
sustituido.
2. Un oligonucleótido, según la reivindicación 1,
en donde, R, es un grupo 2-naftilmetilo; un grupo
bencilo; o un grupo bencilo sustituido.
3. Un oligonucleótido, según la reivindicación 1
o la reivindicación 2, en donde, R, es un grupo bencilo sustituido,
el cual tiene la estructura:
en donde, R_{3}, representa un
grupo alquilo C_{1}-C_{6}, ramificado o lineal,
de una forma más preferible, un grupo alquilo
C_{1}-C_{4}, ramificado o lineal, un grupo
metoxi, o un grupo
nitro.
4. Un oligonucleótido, según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, en donde, R_{3},
representa un grupo alquilo C_{1}-C_{4},
ramificado o lineal, un grupo metoxi, o un grupo nitro.
5. Un oligonucleótido, según la reivindicación 3
o la reivindicación 4, en donde, R_{3}, se encuentra unido en la
posición para.
6. Un oligonucleótido, según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-5, en donde, N, es A, G o
C.
7. Un oligonucleótido, según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-6, en donde, N, es
adenosina.
8. Un oligonucleótido, según una cualquiera de
las reivindicaciones 1-7, en donde, R, se selecciona
de entre el grupo consistente en bencilo,
p-metilbencilo,
p-tert.-butilbencilo,
p-metoxibencilo, o-nitrobencilo y
2-naftilmetilo.
9. Un procedimiento para la amplificación de una
secuencia de ácido nucleico, en donde, el citado procedimiento,
comprende el llevar a cabo una reacción de amplificación, utilizando
por lo menos un oligonucleótido según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-8.
10. Un procedimiento, según la reivindicación 8,
en donde, el citado procedimiento, es la reacción en cadena de la
polimerasa.
11. Un equipo, a modo de "kit", para
realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico, en donde,
el citado equipo a modo de "kit", comprende un oligonucleótido
según una cualquiera de las reivindicaciones
1-8.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US4112797P | 1997-03-20 | 1997-03-20 | |
US41127P | 1997-03-20 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2230631T3 true ES2230631T3 (es) | 2005-05-01 |
Family
ID=21914898
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES98104461T Expired - Lifetime ES2230631T3 (es) | 1997-03-20 | 1998-03-12 | Cebadores modificados. |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6001611A (es) |
EP (1) | EP0866071B1 (es) |
JP (1) | JP2966389B2 (es) |
KR (1) | KR100292997B1 (es) |
CN (1) | CN1065873C (es) |
AT (1) | ATE280177T1 (es) |
AU (1) | AU712448B2 (es) |
BR (1) | BR9801878B1 (es) |
CA (1) | CA2229766C (es) |
CZ (1) | CZ291525B6 (es) |
DE (1) | DE69827060T2 (es) |
DK (1) | DK0866071T3 (es) |
ES (1) | ES2230631T3 (es) |
HK (1) | HK1012192A1 (es) |
HU (1) | HU223669B1 (es) |
IL (1) | IL123694A (es) |
NO (1) | NO322136B1 (es) |
PL (1) | PL190142B1 (es) |
RU (1) | RU2159248C2 (es) |
TW (1) | TW567188B (es) |
UA (1) | UA49843C2 (es) |
Families Citing this family (188)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6200757B1 (en) * | 1999-01-19 | 2001-03-13 | Dade Behring Inc. | Method for controlling the extension of an oligonucleotide |
US6509157B1 (en) * | 1999-11-05 | 2003-01-21 | Roche Molecular Systems, Inc | 3 blocked nucleic acid amplification primers |
PT1232502E (pt) | 1999-11-17 | 2006-05-31 | Roche Diagnostics Gmbh | Particulas de vidro magneticas, metodo para a sua preparacao e suas utilizacoes |
JP2003516765A (ja) | 1999-12-15 | 2003-05-20 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 鳥型結核菌(Mycobacteriumavium)複合体種の検出のための方法および組成物 |
EP1242633B1 (en) * | 1999-12-17 | 2011-01-12 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species |
US6664081B2 (en) * | 1999-12-17 | 2003-12-16 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species |
US7205129B1 (en) | 2000-02-28 | 2007-04-17 | Qiagen Gmbh | Method for reducing artifacts in nucleic acid amplification |
AU2001253129A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-15 | Biolink Partners, Inc. | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization |
US6548251B1 (en) * | 2000-09-05 | 2003-04-15 | Fidelity Systems, Inc. | Inhibition of molecular and biological processes using modified oligonucleotides |
WO2002020845A2 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Thomas Jefferson University | Ultra yield amplification reaction |
ATE356222T1 (de) | 2000-10-06 | 2007-03-15 | Univ Columbia | Massives parallelverfahren zur dekodierung von dna und rna |
US9708358B2 (en) | 2000-10-06 | 2017-07-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
ES2254306T3 (es) * | 2000-10-25 | 2006-06-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Amplificacion usando cebadores modificados. |
EP1373574A4 (en) * | 2001-03-30 | 2007-01-03 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | P450 single nucleotide BIOCHIPs ANALYSIS |
US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
US6905827B2 (en) | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
WO2002101041A1 (fr) * | 2001-06-12 | 2002-12-19 | Takara Bio Inc. | Procede d'amplification de l'acide nucleique et procede de detection du polymorphisme des nucleotides a l'aide d'un analogue de nucleotide |
WO2003020983A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-03-13 | Virginia Commonwealth University | Allele specific pcr for genotyping |
US6617137B2 (en) | 2001-10-15 | 2003-09-09 | Molecular Staging Inc. | Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions |
US7297485B2 (en) * | 2001-10-15 | 2007-11-20 | Qiagen Gmbh | Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias |
US7211382B2 (en) * | 2002-04-09 | 2007-05-01 | Orchid Cellmark Inc. | Primer extension using modified nucleotides |
EP1509624A2 (en) * | 2002-05-31 | 2005-03-02 | Secretary, Department Of Atomic Energy | Met/fret based method of target nucleic acid detection whereby the donor/acceptor moieties are on complementary strands |
US7955795B2 (en) | 2003-06-06 | 2011-06-07 | Qiagen Gmbh | Method of whole genome amplification with reduced artifact production |
US9487823B2 (en) | 2002-12-20 | 2016-11-08 | Qiagen Gmbh | Nucleic acid amplification |
MXPA05010429A (es) * | 2003-03-31 | 2005-11-04 | Hoffmann La Roche | Composiciones y metodos para detectar ciertos flavivirus que incluyen miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa. |
US7820030B2 (en) | 2003-04-16 | 2010-10-26 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
US7892745B2 (en) | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
US7517978B1 (en) | 2004-04-14 | 2009-04-14 | Applied Biosystems, Llc | Modified oligonucleotides and applications thereof |
US7408051B2 (en) | 2004-04-14 | 2008-08-05 | Applera Corporation | Modified oligonucleotides and applications thereof |
US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
US20090232771A1 (en) | 2004-07-13 | 2009-09-17 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Method of controlling cell functions |
US7645575B2 (en) | 2004-09-08 | 2010-01-12 | Xdx, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
US20090118132A1 (en) * | 2004-11-04 | 2009-05-07 | Roche Molecular Systems, Inc. | Classification of Acute Myeloid Leukemia |
US7842794B2 (en) | 2004-12-17 | 2010-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reagents and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae |
EP1902142B1 (en) * | 2005-04-14 | 2010-01-06 | Applied Biosystems, LLC | 3'modified oligonucleotides containing pseudoisocytosine nucleobase derivatives and applications thereof as primers or probes |
US20070072211A1 (en) | 2005-06-30 | 2007-03-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Asymmetric PCR coupled with post-PCR characterization for the identification of nucleic acids |
US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
US10081839B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
US10083273B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
JP5558811B2 (ja) * | 2006-06-01 | 2014-07-23 | トリリンク バイオテクノロジーズ | 核酸増幅のための化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドプライマー |
WO2007147110A2 (en) * | 2006-06-16 | 2007-12-21 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Controlled initiation of primer extension |
US9045522B2 (en) | 2006-07-31 | 2015-06-02 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
CN106566855B (zh) * | 2006-07-31 | 2021-11-09 | 苏州新海生物科技股份有限公司 | 使用可逆修饰寡核苷酸扩增核酸 |
WO2008021431A2 (en) | 2006-08-14 | 2008-02-21 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
EP2102367A2 (en) | 2006-11-09 | 2009-09-23 | XDX, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
US7883869B2 (en) | 2006-12-01 | 2011-02-08 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
US7897737B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-01 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked, nucleotides and nucleosides, base modified with photocleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
US7893227B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-02-22 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked nucleotides and nucleosides base modified with non-cleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
US9938641B2 (en) | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
EP2140033B1 (en) | 2007-03-28 | 2012-10-10 | Signal Diagnostics | System and method for high resolution analysis of nucleic acids to detect sequence variations |
ES2647237T3 (es) | 2007-07-03 | 2017-12-20 | Genaphora Ltd. | Cebadores quiméricos para reacciones de amplificación de ácidos nucleicos mejoradas |
EP2185726B1 (en) | 2007-08-06 | 2014-01-08 | Orion Genomics, LLC | Novel single nucleotide polymorphisms and combinations of novel and known polymorphisms for determining the allele-specific expression of the igf2 gene |
CA2639416C (en) | 2007-09-11 | 2019-12-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Diagnostic test for susceptibility to b-raf kinase inhibitors |
EP2207896B1 (en) * | 2007-10-04 | 2014-01-29 | Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation | Nucleic acid amplification |
US20100086914A1 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing |
US20110014611A1 (en) | 2007-10-19 | 2011-01-20 | Jingyue Ju | Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequences by synthesis |
US9115163B2 (en) | 2007-10-19 | 2015-08-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA sequence with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified nucleotide terminators |
DE102008005667A1 (de) | 2008-01-19 | 2009-07-30 | Olfert Landt | Basenmodifizierte Primeroligomere für die Multiplex-RT-PCR |
US8911948B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
AU2009242546B2 (en) | 2008-04-30 | 2015-01-22 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers |
MX2010013678A (es) | 2008-06-11 | 2011-02-24 | Lasergen Inc | Nucleotidos y nucleosidos y metodos para su uso en secuenciacion de adn. |
ES2620431T3 (es) | 2008-08-04 | 2017-06-28 | Natera, Inc. | Métodos para la determinación de alelos y de ploidía |
CN102186996A (zh) * | 2008-10-20 | 2011-09-14 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 改进的等位基因特异性扩增 |
US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
US8206929B2 (en) * | 2009-01-07 | 2012-06-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants |
ES2544265T3 (es) | 2009-02-11 | 2015-08-28 | Orion Genomics, Llc | Combinaciones de polimorfismos para determinar la expresión específica de alelo de IGF2 |
US8409802B2 (en) | 2009-08-14 | 2013-04-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Format of probes to detect nucleic acid differences |
WO2011041485A1 (en) | 2009-09-30 | 2011-04-07 | Gene Security Network, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US8614071B2 (en) * | 2009-12-11 | 2013-12-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers |
US9238832B2 (en) | 2009-12-11 | 2016-01-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids |
WO2011128096A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment |
EP2854058A3 (en) | 2010-05-18 | 2015-10-28 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive pre-natal ploidy calling |
US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
PL2576837T3 (pl) | 2010-06-04 | 2018-04-30 | Chronix Biomedical | Krążeniowe biomarkery typu kwasu nukleinowego związane z rakiem prostaty |
WO2012038049A2 (en) | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers |
WO2012075005A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-07 | Berry & Associates, Inc. | Compounds for the synthetic introduction of n-alkyl nucleosides into dna oligonucleotides |
US20120164641A1 (en) * | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and Compositions for Detecting Mutation in the Human Epidermal Growth Factor Receptor Gene |
JP6328934B2 (ja) | 2010-12-22 | 2018-05-23 | ナテラ, インコーポレイテッド | 非侵襲性出生前親子鑑定法 |
JP6153874B2 (ja) | 2011-02-09 | 2017-06-28 | ナテラ, インコーポレイテッド | 非侵襲的出生前倍数性呼び出しのための方法 |
WO2012135053A2 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers |
US9624539B2 (en) | 2011-05-23 | 2017-04-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA sequencing by synthesis using Raman and infrared spectroscopy detection |
US9034581B2 (en) * | 2011-05-26 | 2015-05-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Staphylococcus aureus |
EP2768985B1 (en) | 2011-10-21 | 2019-03-20 | Chronix Biomedical | Colorectal cancer associated circulating nucleic acid biomarkers |
ES2413566B1 (es) | 2011-12-14 | 2014-05-20 | Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud | Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y pronóstico de la hipoacusia neurosensorial. |
US9115394B2 (en) | 2011-12-22 | 2015-08-25 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and reagents for reducing non-specific amplification |
KR101545848B1 (ko) * | 2012-04-09 | 2015-08-21 | (주)바이오니아 | 핵산중합효소로 핵산을 검출하는데 사용되는 고민감도 핵산준비방법 |
KR102264617B1 (ko) | 2012-06-14 | 2021-06-14 | 라이프 테크놀로지스 코포레이션 | 폴리머라제 연쇄 반응 (pcr)을 위한 신규 조성물, 방법 및 키트 |
US9982313B2 (en) | 2012-08-17 | 2018-05-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of herpes simplex virus 1 and 2 |
EP2722399A1 (en) | 2012-10-18 | 2014-04-23 | Roche Diagniostics GmbH | Method for preventing high molecular weight products during amplification |
US9382581B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-07-05 | Roche Molecular Systems, Inc. | Primers with modified phosphate and base in allele-specific PCR |
WO2014093825A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Chronix Biomedical | Personalized biomarkers for cancer |
US9828629B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid target identification by structure based probe cleavage |
WO2014144883A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Raman cluster tagged molecules for biological imaging |
DK3004388T4 (da) | 2013-05-29 | 2023-08-28 | Chronix Biomedical | Påvisning og kvantificering af cellefrit dna fra donor i kredsløbet hos organtransplantatmodtagere |
MX2016001854A (es) | 2013-08-12 | 2016-09-06 | Genentech Inc | Composiciones y metodo para tratar condiciones asociadas con el complemento. |
US10262755B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-04-16 | Natera, Inc. | Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments |
US10577655B2 (en) | 2013-09-27 | 2020-03-03 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
WO2015048535A1 (en) | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Natera, Inc. | Prenatal diagnostic resting standards |
EP3055422B1 (en) | 2013-10-09 | 2018-11-14 | Roche Diagnostics GmbH | Methods and compositions for detecting a mutation in the human ezh2 gene |
US10370707B2 (en) | 2013-10-09 | 2019-08-06 | Fluoresentric, Inc. | Multiplex probes |
US10351918B2 (en) | 2013-10-30 | 2019-07-16 | Green Life Biotech, Llc | Pathogenesis quantification systems and treatment methods for citrus greening blight |
US10072288B2 (en) | 2013-11-11 | 2018-09-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detecting single nucleotide polymorphism using overlapped primer and melting probe |
US9637791B2 (en) | 2013-12-20 | 2017-05-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Multiplexed nucleic acid target identification by strucutre based probe cleavage |
CA2938731A1 (en) | 2014-02-08 | 2015-08-13 | Genentech, Inc. | Methods of treating alzheimer's disease |
EP3561075A1 (en) | 2014-04-21 | 2019-10-30 | Natera, Inc. | Detecting mutations in tumour biopsies and cell-free samples |
EP3201361B1 (en) | 2014-10-01 | 2020-02-12 | Chronix Biomedical | Methods of quantifying cell-free dna |
US9745618B2 (en) | 2014-11-19 | 2017-08-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Photoblocked probes and methods for sequential detection of nucleic acids |
US9920381B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-03-20 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting MECC-containing methicillin-resistant Staphylococcus aureus |
US9909169B2 (en) | 2014-12-17 | 2018-03-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression |
US9618474B2 (en) | 2014-12-18 | 2017-04-11 | Edico Genome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
US10429342B2 (en) | 2014-12-18 | 2019-10-01 | Edico Genome Corporation | Chemically-sensitive field effect transistor |
US9857328B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-02 | Agilome, Inc. | Chemically-sensitive field effect transistors, systems and methods for manufacturing and using the same |
US10006910B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-06-26 | Agilome, Inc. | Chemically-sensitive field effect transistors, systems, and methods for manufacturing and using the same |
US10020300B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-07-10 | Agilome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
US9859394B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-02 | Agilome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
CN114250274A (zh) | 2015-04-24 | 2022-03-29 | 阿提拉生物系统公司 | 利用有限核苷酸组成的引物扩增 |
EP3294906B1 (en) | 2015-05-11 | 2024-07-10 | Natera, Inc. | Methods for determining ploidy |
US9970062B2 (en) * | 2015-08-06 | 2018-05-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of mycobacterium tuberculosis |
US9382582B1 (en) * | 2015-08-25 | 2016-07-05 | Tracy Hayden | Methods, compositions and kits for enriching for a minor template amplification product in a mixed template amplification reaction |
EP3402880B1 (en) | 2016-01-15 | 2024-01-03 | Thermo Fisher Scientific Baltics UAB | Thermophilic dna polymerase mutants |
JP6962927B2 (ja) | 2016-03-11 | 2021-11-05 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | ジカウイルス検出用組成物および方法 |
JP6681804B2 (ja) * | 2016-03-30 | 2020-04-15 | 大研医器株式会社 | 変異プライマーの設計方法 |
WO2017169119A1 (ja) * | 2016-03-30 | 2017-10-05 | 大研医器株式会社 | 変異プライマーの設計方法 |
WO2017201081A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-11-23 | Agilome, Inc. | Graphene fet devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
US10612101B2 (en) | 2016-05-27 | 2020-04-07 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Mycoplasma genitalium |
US10934597B2 (en) * | 2016-05-27 | 2021-03-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of trichomonas vaginalis |
ES2874259T3 (es) | 2016-05-27 | 2021-11-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Composiciones y procedimientos para la detección de Trichomonas vaginalis |
US20170356025A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-12-14 | Roche Molecular Systems, Inc. | Internal control probes for improving pcr assay performance |
WO2018024562A1 (en) | 2016-08-02 | 2018-02-08 | Roche Diagnostics Gmbh | Helper oligonucleotide for improving efficiency of amplification and detection/quantitation of nucleic acids |
WO2018067517A1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
US10793923B2 (en) | 2016-11-09 | 2020-10-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of BK virus |
WO2018089942A1 (en) | 2016-11-10 | 2018-05-17 | Slipchip Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of chlamydia trachomatis |
CN110225919A (zh) | 2016-11-10 | 2019-09-10 | 达丽斯生物医学公司 | 用于扩增和检测淋病奈瑟氏菌的多核苷酸 |
US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
US20190211377A1 (en) | 2016-12-22 | 2019-07-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Cobra probes to detect a marker for epidemic ribotypes of clostridium difficile |
EP3585889A1 (en) | 2017-02-21 | 2020-01-01 | Natera, Inc. | Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids |
US11618891B2 (en) | 2017-06-26 | 2023-04-04 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Thermophilic DNA polymerase mutants |
US10760137B2 (en) * | 2017-07-18 | 2020-09-01 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Babesia |
KR102380264B1 (ko) * | 2017-08-31 | 2022-03-29 | 주식회사 씨젠 | 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용한 구성요소의 성능 평가 |
WO2019063661A1 (en) | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Roche Diagnostics Gmbh | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DETECTION OF TRICHOMONAS VAGINALIS |
JP2021506342A (ja) | 2017-12-14 | 2021-02-22 | ティーエーアイ ダイアグノスティックス インコーポレイテッドTai Diagnostics,Inc. | 移植のための移植片適合性の評価 |
WO2019180137A1 (en) | 2018-03-21 | 2019-09-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dna polymerases for efficient and effective incorporation of methylated-dntps |
CA3090426A1 (en) | 2018-04-14 | 2019-10-17 | Natera, Inc. | Methods for cancer detection and monitoring by means of personalized detection of circulating tumor dna |
US10450616B1 (en) | 2018-05-09 | 2019-10-22 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis |
US11332787B2 (en) | 2018-06-29 | 2022-05-17 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for delivery of molecules and complexes to reaction sites |
US11525159B2 (en) | 2018-07-03 | 2022-12-13 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
CN113227398A (zh) * | 2018-10-29 | 2021-08-06 | 塞弗德公司 | 在减少的扩增时间下使用巢式重叠引物的指数基数-3核酸扩增 |
EP3891302A1 (en) | 2018-12-03 | 2021-10-13 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for detection of candida auris |
KR102141312B1 (ko) * | 2019-04-19 | 2020-08-04 | 주식회사 제노헬릭스 | 짧은 RNA-primed 제노 센서 모듈 증폭 기반 짧은 RNA 탐지 기법 |
WO2020221915A1 (en) | 2019-05-02 | 2020-11-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | UTILIZATION OF dITP FOR PREFERENTIAL/SELECTIVE AMPLIFICATION OF RNA VERSUS DNA TARGETS BASED ON STRAND-SEPARATION TEMPERATURE |
WO2020225231A1 (en) | 2019-05-07 | 2020-11-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detection of neisseria gonorroheae |
US20220251670A1 (en) | 2019-07-25 | 2022-08-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of epstein barr virus (ebv) |
US10954572B2 (en) | 2019-07-25 | 2021-03-23 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Neisseria gonorrhoeae |
JP2022546443A (ja) | 2019-08-27 | 2022-11-04 | エフ.ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | cccDNAから転写されたHBV RNAを含む、B型肝炎ウイルスRNAの増幅および検出のための組成物および方法 |
US11441167B2 (en) | 2019-11-20 | 2022-09-13 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for rapid identification and phenotypic antimicrobial susceptibility testing of bacteria and fungi |
US11891662B2 (en) | 2019-12-02 | 2024-02-06 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for amplification and detection of human beta actin |
CN114867871A (zh) | 2019-12-27 | 2022-08-05 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的组合物和方法 |
WO2021136752A1 (en) | 2019-12-31 | 2021-07-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Quantitative pcr screening of inducible prophage from bacterial isolates |
EP4118239A1 (en) | 2020-03-09 | 2023-01-18 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2), influenza a and influenza b |
US20220042117A1 (en) | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF INFLUENZA A, INFLUENZA B, AND SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-CoV-2) |
CN116615563A (zh) | 2020-12-04 | 2023-08-18 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测疟疾的组合物和方法 |
US20220205020A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of bacteria and fungi associated with bacterial and candida vaginosis |
US20240124946A1 (en) | 2021-02-05 | 2024-04-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of human parainfluenza viruses 1-4 (hpiv 1-4) |
US20220290221A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations |
US20240240273A1 (en) | 2021-05-06 | 2024-07-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and Methods for Detecting Hepatitis Delta Virus by a Dual-Target Assay |
EP4426865A1 (en) | 2021-11-05 | 2024-09-11 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for detection of malaria |
WO2023089186A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting vana and/or vanb genes associated with multidrug resistance |
WO2023104812A1 (en) | 2021-12-09 | 2023-06-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Mass based detection of pcr amplicons |
WO2023109887A1 (zh) | 2021-12-15 | 2023-06-22 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 一种整合位点的检测方法 |
WO2024003260A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting lymphogranuloma venereum (lgv) serovars of chlamydia trachomatis |
WO2024018485A1 (en) * | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Haystackanalytics Private Limited | Methods and systems for detection and identification of pathogens and antibiotic resistance genes |
WO2024042042A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting monkeypox virus |
WO2024141442A1 (en) | 2022-12-25 | 2024-07-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting carbapenem resistant acinetobacter calcoaceticus-baumannii (crab) |
WO2024141476A1 (en) | 2022-12-28 | 2024-07-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Digital pcr assay designs for multiple hepatitis b virus gene targets and non-extendable blocker oligonucleotides therefor |
WO2024175749A1 (en) | 2023-02-25 | 2024-08-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for candida species detection |
WO2024184165A1 (en) | 2023-03-03 | 2024-09-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for the detection of group b streptococcus ( streptococcus agalactiae) and clindamycin resistance gene determinants |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
US5256549A (en) * | 1986-03-28 | 1993-10-26 | Chiron Corporation | Purification of synthetic oligomers |
US5459255A (en) * | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
ATE176002T1 (de) * | 1990-07-24 | 1999-02-15 | Hoffmann La Roche | Verringerung von nicht spezifischer amplifikation während einer (in vitro) nukleinsäure amplifikation unter verwendung von modifizierten nukleinsäure basen |
US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
DK0691968T3 (da) * | 1993-03-30 | 1998-02-23 | Sanofi Sa | Acykliske nukleosid-analoge og oligonukleotidsekvenser indeholdende disse |
US5599662A (en) * | 1995-02-17 | 1997-02-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
US5837442A (en) * | 1995-11-29 | 1998-11-17 | Roche Molecular Systems, Inc. | Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid |
-
1998
- 1998-03-12 ES ES98104461T patent/ES2230631T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 EP EP98104461A patent/EP0866071B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 AT AT98104461T patent/ATE280177T1/de active
- 1998-03-12 DK DK98104461T patent/DK0866071T3/da active
- 1998-03-12 DE DE69827060T patent/DE69827060T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-13 AU AU58404/98A patent/AU712448B2/en not_active Expired
- 1998-03-16 IL IL12369498A patent/IL123694A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-03-16 HU HU9800581A patent/HU223669B1/hu active IP Right Grant
- 1998-03-16 US US09/039,866 patent/US6001611A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-18 CA CA002229766A patent/CA2229766C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-19 UA UA98031382A patent/UA49843C2/uk unknown
- 1998-03-19 CZ CZ1998841A patent/CZ291525B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-19 NO NO19981239A patent/NO322136B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-03-19 RU RU98105786/04A patent/RU2159248C2/ru active
- 1998-03-19 PL PL98325439A patent/PL190142B1/pl unknown
- 1998-03-19 CN CN98105627A patent/CN1065873C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-20 KR KR1019980009644A patent/KR100292997B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-03-20 JP JP10090641A patent/JP2966389B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-20 BR BRPI9801878-7A patent/BR9801878B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 TW TW087104213A patent/TW567188B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-12-15 HK HK98113390A patent/HK1012192A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2230631T3 (es) | Cebadores modificados. | |
ES2879686T3 (es) | Composiciones y métodos para sintetizar ARN con caperuza 5' | |
US7556923B1 (en) | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders | |
US8465921B2 (en) | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders | |
US7319148B2 (en) | Combinatorial production of nucleotide and nucleoside (XiTP) analogues | |
ES2302701T3 (es) | N3'-p5' tiofosforamidatos oligonucleotidicos: su sintesis y uso. | |
US7144995B2 (en) | Fluorescent nitrogenous base and nucleosides incorporating same | |
ES2214319T3 (es) | Metodos y composiciones para la amplificacion isotermica lineal de secuencias de polinucleotidos. | |
Williams et al. | Selective strand scission by intercalating drugs at DNA bulges | |
JPH06509945A (ja) | 酵素媒介三本鎖形成のための架橋性オリゴヌクレオチド | |
Tomikawa et al. | Synthetic Nucleosides and Nucleotides. 40. Selective Inhibition of Eukaryotic DNA Polymerase α by 9-(β-D-Arabinofuranosyl)-2-(p-n-butylanilino) adenine 5′-Triphosphate (BuAaraATP) and Its 2′-Up Azido Analog: Synthesis and Enzymatic Evaluations | |
JP4211948B2 (ja) | 標的核酸配列の増幅方法 | |
Wu | Molecular engineering of novel nucleotide analogues for DNA sequencing by synthesis | |
MXPA98002007A (es) | Cebadores modificados | |
Noronha | Synthesis Physicochemical and Biological Studies on Oligonucleotides Containing D-arabinose | |
Chen | Potential therapeutics for multiple myeloma and leukemia: The effects of C8-modified adenosine analogs on nucleic acid biochemistry |