ES2230631T3

ES2230631T3 - Cebadores modificados.

Info

Publication number: ES2230631T3
Application number: ES98104461T
Authority: ES
Inventors: Stephen Gordon Will
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-03-20
Filing date: 1998-03-12
Publication date: 2005-05-01
Anticipated expiration: 2018-03-12
Also published as: KR100292997B1; HUP9800581A2; AU5840498A; CZ84198A3; BR9801878B1; HK1012192A1; PL325439A1; CN1065873C; TW567188B; DE69827060D1; KR19980080494A; US6001611A; JPH10279593A; EP0866071B1; ATE280177T1; AU712448B2; CA2229766C; BR9801878A; DE69827060T2; IL123694A0

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A OLIGONUCLEOTIDOS MODIFICADOS PARA UTILIZACION EN LA AMPLIFICACION DE UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO. LAS AMPLIFICACIONES REALIZADAS EMPLEANDO LOS OLIGONUCLEOTIDOS MODIFICADOS, PRODUCEN UN PRODUCTO DE AMPLIFICACION MENOS INESPECIFICO, ESPECIALMENTE UN DIMERO CEBADOR Y EN UN MAYOR RENDIMIENTO CONCOMITANTE DEL PRODUCTO DE AMPLIFICACION REQUERIDO, COMPARADAS CON LAS AMPLIFICACIONES LLEVADAS A CABO UTILIZANDO COMO CEBADORES OLIGONUCLEOTIDOS NO MODIFICADOS.

Description

Cebadores modificados.

La presente invención, se refiere al sector de la biología molecular y a la química del ácido nucleico. De una forma más específica, ésta, se refiere a procedimientos y reactivos para mejorar el rendimiento productivo de las reacciones de amplificación del ácido nucleico. La invención, por lo tanto, tiene aplicaciones en cualquier sector, en el cual, se utilice la amplificación del ácido nucleico.

La invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), hizo posible la amplificación in vitro de secuencias del ácido nucleico. La PCR, se describe en los documentos de patente estadounidenses US n^{os} 4.683,195; 4.683.202; y 4.965.188. Saiki et al. 1985, Science 230: 1350-1354; Mullis et al., 1986, Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263-273; y Mullis y Faloona, 1987; Methods Enzymol: 155: 335-350. El desarrollo y la aplicación de la PCR, se describe extensivamente en la bibliografía correspondiente a la literatura especializada. Así, por ejemplo, una amplia gama de temas relacionados con la PCR, se describen en PCR Technology-principles and applications for DNA amplification (Tecnología de la PCR-principios y aplicaciones para la amplificación de DNA), 1989 (ed. H.A. Erlich) Stockson Press, New York; PCR Protocols: A guide for methods and applications (Una guía para métodos y aplicaciones), 1990 (ed. M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego; y PCR Strategies (Estrategias de PCR), 1995, (ed. M.A. Innis et al.), Academic Press, San Diego. Firmas comerciales, tales como Perking Elmer (Norwalk, CT), comercializan reactivos para la PCR y publican protocolos referentes a la PCR.

Desde las publicaciones originales de las amplificación del ácido nucleico, se han descrito varias amplificaciones de ácido nucleico, basadas en cebadores, incluyendo, pero no de una forma limitativa, a Ligasa Chain Reaction (Reacción en cadena de la Ligasa),(LCR, Wu and Vallace, 1989, Genomics 4: 560-569 y Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193); Polymerasa Ligasa Chain Reaction (Reacción en cadena de la Polimerasa Ligasa) (Barany, 1991), PCR Methods and Aplic. 1:5-16); Gap-LCR (publicación de solicitudes de patente internacional PCT nº WO 90/01069); Repair Chain Reaction (Publicación de la solicitud de patente europea EP-A-nº 439.182 A2), 3SR (Kwoh et al), 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177; Guatelli et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878; publicación de solicitud de patente internacional PCT nº WO 92/0880 A), y NASBA (Patente estadounidense US nº 5.130.238). Un estudio de los sistemas de amplificación, es el que se proporciona por parte de Abramson and Myers, 1993, Current Opinion, en Biotechnology, 4: 41-47.

La especificidad de las reacciones de amplificación basadas en cebadores, depende la especificidad de la hibridación de los cebadores. Bajo las elevadas temperaturas utilizadas en una amplificación típica, los cebadores, hibridan únicamente a la secuencia pretendida como diana. No obstante, las mezclas de reacciones de amplificación, se realizan a la temperatura ambiente, bien por debajo de la temperatura necesaria para asegurar la especificidad de la hibridación de cebadores. Bajo estas condiciones menos severas, los cebadores, pueden enlazarse de una forma no específica a otras secuencias de ácido nucleico, únicamente parcialmente complementarias, o a otros cebadores, e iniciar la síntesis de productos de extensión no deseados, los cuales pueden amplificarse conjuntamente con la secuencia diana. La amplificación de productos de extensión de amplificadores no deseados, puede completarse con la amplificación, de las secuencias diana deseadas y puede hacer decrecer de una forma significativa la eficacia de la amplificación de la secuencia deseada.

Un tipo de producto de amplificación, no específico, frecuentemente observado, es un artefacto independiente del molde de reacciones de amplificación, al cual se le hace referencia como "dímero cebador". El dímero cebador, es un fragmento de doble hebra, cuya longitud se encuentra, de una forma típica, cercana a la suma de dos longitudes de cebadores, y que parece ocurrir cuando, un cebador, se extiende más allá del otro cebador. La concatenación resultante, forma un molde no deseado, el cual, debido a su corta longitud, se amplifica de una forma eficiente.

La especificaciones no específicas, pueden reducirse procediendo a reducir la formación de los productos de extensión de cebadores, previamente al inicio de la reacción. En otro procedimiento, al cual se le hace referencia como un protocolo de "inicio en caliente", se procede a retener dos o más reactivos críticos, de la mezcla de la reacción, hasta que, la temperatura, haya aumentado lo suficiente como para proporcionar la necesaria especificidad de la hibridación. Así, de este modo, la mezcla de reacción, no puede soportar la extensión de cebadores, durante el tiempo en el que, las condiciones de reacción, no aseguren la hibridación específica de los cebadores.

Los procedimientos manuales del tipo "inicio en caliente", en los cuales, los tubos de reacción se abren después de la etapa de incubación inicial a alta temperatura, y en los que se añaden los reactivos que faltan, son de un trabajo intensivo e incrementan el riesgo de contaminación de la mezcla de reactivos. De una forma alternativa, puede utilizarse un material sensible al calor, tal como la cera, para separar o secuestrar los componentes de la reacción, tal y como se describe en la patente estadounidense U.S: nº 5.411.876, y Chou et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20(7): 1717-1723. En estos procedimientos, una incubación de pre-reacción de alta temperatura, funde el material sensible al calor, permitiendo, con ello, el que se mezclen los reactivos.

Otro procedimiento para reducir la formación de los productos de extensión de cebadores al inicio de la reacción, consiste en la inhibición reversible por calor de la DNA polimerasa, mediante anticuerpos DNA-polimierasa-específicos, tal y como se describe en la patente estadounidense U.S. nº 5.338.671. Los anticuerpos, se incuban con la DNA-polimerasa, en un tampón, a la temperatura ambiente, previamente a la reunión de la mezcla de reacción, con objeto de permitir la formación del complejo del anticuerpo de DNA-polimerasa. La inhibición anticuerpo de la actividad DNA-polimerasa, se inactiva mediante incubación de pre-reacción a alta temperatura. Una desventaja de este procedimiento, reside en el hecho de que, la producción de anticuerpos específica de la DNA-polimerasa, es cara, y necesita de mucho tiempo, especialmente, en grandes cantidades. Además de ello, la adición de anticuerpos a la mezcla de reacción, requiere el proceder a rediseñar la reacción de amplificación.

La formación de productos de extensión, previamente al inicio de la reacción, puede también inhibirse mediante la adición, a la reacción, de una proteína de enlace de hebra individual, con enlaces no covalentes a los cebadores, de una forma reversible por calor, e inhibe la extensión de cebadores, evitando la hibridación.

La amplificación no específica, puede también reducirse procediendo a degradar enzimáticamente los productos de reacción formados previamente al inicio de la reacción, utilizando los procedimientos descritos en la patente estadounidense U.S. nº 5.418.149. La degradación de los productos de extensión nuevamente sintetizados, se logra mediante la incorporación, en la mezcla de reacción, de UTP y UNG, e incubando la mezcal de reacción, a una temperatura de 45-60ºC, previamente a llevar a cabo la reacción de amplificación. La extensión de cebadores, tiene como resultado la formación de DNA que contiene uracilo, el cual se degrada mediante UNG, bajo las condiciones de la pre-amplificación. Una desventaja de este procedimiento, reside en el hecho de que, la degradación de los productos de extensión, compite con la formación de producto de extensión y la eliminación de producto de extensión de cebadores, no específico, será, probablemente, menos completa. Una ventaja de este procedimiento, reside en el hecho que, el DNA que contiene uracilo, introducido en la mezcla de reacción, como una contaminación de la reacción previa, se degrada también y, así, de esta forma, el procedimiento, reduce también el problema de contaminación de una PCR, mediante el ácido nucleico amplificado procedente de reacciones previas.

Las técnicas convencionales de biología molecular y de la química del ácido nucleico, las cuales se encuentran dentro de las técnicas habituales del arte especializado de esta técnica, se encuentran plenamente explicadas en la bibliografía especializada. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Clonación molecular - Un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Síntesis (Síntesis de oligonucleótidos) (M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hibridation (Hibridación del ácido nucleico) (B.D. Hames and S.J. Higgings. ed., 1984); y una serie, Methods in Enzymology (Procedimientos en enzymología) (Academic Press. Inc.).

La presente invención, proporciona cebadores oligonucleótidos covalentemente modificados, para la amplificación in vitro, de secuencias de ácido nucleico. La utilización de cebadores modificados de la invención, tiene como resultado una reducción de la amplificación no específica, especialmente, la formación de dímeros de cebadores, y/o el incremento concomitante en el rendimiento productivo de la diana pretendida, relativa a una amplificación llevada a cabo con cebadores no modificados.

En uno de sus aspectos, la invención, se refiere a un cebador oligonucleótido, para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, la cual tiene la estructura general:

5'---S_{1}---

\uelm{N}{\uelm{\para}{R}}

---3'---

\hskip0,5cm

o

\hskip0,5cm

5'---S_{1}---

\uelm{N}{\uelm{\para}{R}}

---S_{2}---3'

en donde, S_{1}, representa una primera secuencia de nucléotidos entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud;

en donde, S_{2}, representa una segunda secuencia entre uno y tres nucleótidos de longitud;

en donde, N, representa un nucleótido, el cual contiene una base de purina o pirimidina, la cual contiene una amina exocíclica;

en donde, R, representa un grupo modificador, en donde, R, está enlazado, de una forma covalente, a N, mediante una amina exocíclica, y en donde, R, tiene la estructura:

R_{1}---

\melm{H}{C}{\uelm{\para}{}}

---R_{2}

en donde, R_{1}y R_{2}, representan, de una forma independiente, un grupo alquilo C_{1}-C_{10}, un grupo alcoxi, un grupo fenilo, un grupo fenoxi, un grupo fenilo sustituido, un grupo naftilo, o un grupo naftilo sustituido. Los grupos alquilo, pueden ser ramificados o no ramificados.

En una forma preferida de presentación, N, es un nucleótido convencional modificado, en cuyo caso, N es una adenosina, histidina, o guanosina, y la porción del modificador, se encuentra covalentemente unida a la amina exocíclica de una base adenina, guanina, o citosina. En una forma de presentación más preferida, N, es una adenosina.

En una forma preferida de presentación, R es un grupo 2-naftilmetilo; un grupo bencilo; o un grupo bencilo sustituido. Los grupos bencilos sustituidos, preferidos, tienen la estructura:

1

en donde, R_{3}, representa un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, ramificado o lineal, de una forma más preferible, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, ramificado o lineal, un grupo metoxi, o un grupo nitro. De una forma preferible, R_{3}, se encuentra unido en la posición para.

En una forma más preferida de presentación, R, es un grupo bencilo, p-metilbencilo, p-tert.-butilbencilo, p-metoxibeniclo, o 2-naftilmetilo.

Otro aspecto de la invención, se refiere a la amplificación de cebadores, los cuales se modifican mediante la unión covalente foto-lábil de un grupo modificador, lo cual tiene como resultado un inhibición parcial o completa de la extensión de cebadores. El modificador foto-lábil, puede enlazarse, bien ya sea a la amina exocíclica, tal y como los nucleótidos modificados descritos anteriormente, arriba, o bien ya sea al anillo de nitrógeno. En una forma de presentación, por lo menos un grupo nitrobencilo, se encuentra unido a la amina exocíclicla de una base de adenina, guanina, o citosina del nucleótido del terminal 3'.

Otro aspecto de la invención, es un par de juegos de cebadores, en donde, por lo menos uno de los cebadores, se modifica de la forma que se indica anteriormente, arriba. En una forma preferida de presentación, ambos miembros de un par de cebadores, o todos los miembros de un juego de cebadores, se encuentran modificados.

Otro aspecto de la invención, se refiere a procedimientos para la amplificación de ácido nucleico, los cuales comprenden el llevar a cabo una reacción de amplificación, utilizando los cebadores modificados de la invención.

Otro aspecto de la invención, se refiere a un procedimientos para amplificar ácido nucleico diana, los cuales comprenden el llevar a cabo una reacción de amplificación, utilizando los cebadores foto-lábiles modificados de la invención, en donde, la mezcla de reacción, se irradia con una luz suficiente como para eliminar el grupo modificador y permitir la formación de productos de extensión de los cebadores. En una forma de presentación de la invención, la irradiación, se lleva a cabo en una etapa por separado, previamente al inicio de la reacción de amplificación, pero después de que la mezcla de reacción se haya calentado a una temperatura mayor de aproximadamente 50ºC. En otras formas de presentación, la etapa de irradiación, se combina con una etapa preliminar del procedimiento de amplificación, tal como la etapa de transcripción inversa de una reacción de amplificación de RNA, o la etapa inicial desnaturalización, en una reacción de amplificación de RNA.

Otro aspecto de la invención, se refiere a equipos, a modo de "kits" para la amplificación in vitro de secuencias de ácido nucleico, "kits" éstos los cuales comprenden un par de cebadores, en los cuales, por lo menos uno de los cebadores, se modifica de la forma que se ha descrito aquí. Estos equipos a modo de kits de la presente invención, pueden también incluir uno o más reactivos de amplificación, por ejemplo, una polimerasa o ligasa del ácido nucleico, trifosfatasa nucleósido, y tampones apropiados.

Descripción detallada de los dibujos

La figura 1, muestra los resultados de amplificación de HIV-1 RNA, llevada a cabo utilizando cebadores bencilados, tal y como de describe en el ejemplo 5.

La figura 2, muestra los resultados de amplificación de HCV RNA, llevada a cabo utilizando cebadores bencilados, tal y como de describe en el ejemplo 6.

La figura 3, muestra los resultados de amplificación de HCV RNA, llevada a cabo utilizando cebadores modificados con uno de tres grupos modificados, tal y como de describe en el ejemplo 7.

La figura 4, muestra los resultados de amplificación de HCV RNA, llevada a cabo utilizando cebadores modificados foto-lábiles, tal y como de describe en el ejemplo 8.

La figura 5, muestra los resultados de amplificación de DNA microbacteriana, llevada a cabo utilizando cebadores modificados con un grupo bencilo y cebadores modificados con un grupo p-tert.-butilbencilo, tal y como de describe en el ejemplo 10.

La figura 6, muestra un esquema general de reacción, apropiado para la síntesis de dA modificada con bencilo o bencilo sustituido, controlada por vidrio poroso (CPG).

Para ayudar en la comprensión de la invención, ha continuación, se facilita la definición de varios términos.

Los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido", se refieren a polidesoxirribonucleótidos (los cuales contienen 2-desoxi-D-ribosa), a polirribonucleótidos (los cuales contienen D-ribosa), y a cualquier otro tipo de polinucleótido, el cual sea un N glicósido de una base de purina o de pirimidina, o una base de purina modificada o pirimidina modificada. No existe una distinción pretendida en la longitud, entre los términos "ácido nucleico", y "oligonucleótido" y, estos términos, se utilizarán de una forma intercambiable. Estos términos, se refieren únicamente a la estructura primaria de la molécula. Así, de este modo, estos términos, incluyen al DNA de hebra individual, y al DNA de doble hebra, así como también al RNA de hebra individual y al RNA de doble hebra.

El término "convencional", en referencia a las bases de ácido nucleico, nucleósidos, o nucleótidos, se refiere a aquéllos que se encuentran de una forma natural en los polinucleótidos que se describen. Los cuatro desoxirribonucleótidos de DNA convencionales (también denominados mayores), contienen las bases de purina, adenina guanidina, y la bases de pirimidina, citosina y timina. Los cuatro ribonucleótidos convencionales de RNA, contienen las bases de purina, adenina guanidina, y la bases de pirimidina, citosina y uracilo. Adicionalmente a las convencionales o comunes, anteriormente mencionadas, arriba, en algunos ácidos nucleicos, se encuentra también un determinado número de otros derivados de purina y pirimidina, denominados bases raras o menores. Tal y como se utiliza aquí, en este documento, "no convencional", en referencia a las bases de ácido nucleico, nucleósidos, o nucleótidos, se refiere a bases raras o menores de ácido nucleico, nucleósidos, o nucleótidos, y modificaciones, derivaciones, o análogos de bases, nucleósidos y nucleótidos convencionales, e incluye a los nucleótidos sintéticos que tienen porciones de bases modificadas y/o porciones de azúcar modificadas (véase, a dicho efecto, Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methodes in Molecular Biology (Protocolos para conjugados Oligonucleótidos, Métodos en biología molecular, volumen 26 (Sudhir Agrawal, Ed. Humana Press, Totowa NJ (1994)); y Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach (Oligonucleótidos y análogos, una propuesta práctica) (Fritz Eckstein, Ed. IRL. Press, Oxford University Press, Oxford).

Los oligonucleótidos, pueden prepararse mediante cualquier tipo de procedimiento apropiado, incluyendo, por ejemplo, a la clonación y restricción de secuencias apropiadas y síntesis química directa, mediante un procedimiento tal como el correspondiente al procedimiento de del fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90-99; el procedimiento del fosfodiéster de Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109-151; el procedimiento de la dietilfosforamidita de Beacage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22,: 1859-1862, y el procedimiento del soporte sólido, de la patente estadounidense U.S. nº 4.458.066. Una revisión de los procedimientos de síntesis, es la que se proporciona por parte de Goodschild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(2); 165-187.

El término "apareamiento de bases" al cual se le hace también referencia, en el arte de esta técnica especializada, como "apareamiento de bases de Watson-Crick", se refiere al bien conocido enlace del hidrógeno de pares complementarios de bases adenina - timina y guanina - citosina, en una estructura de doble hebra, adenina - uracilo y

\hbox{guanina -}

citosina en una molécula híbrida de RNA/DNA, y al enlace de análogos, de pares de oligoncleótidos, no convencionales.

El término "hibridación", se refiere a la formación de una estructura dúplex, mediante dos ácidos nucleicos de hebra individual, debido al apareamiento de bases complementarias, La hibridación, puede acontecer entre hebras de ácido nucleico completamente complementarias, o entre hebras de ácido nucleico "substancialmente complementarias", las cuales contienen regiones menores de apareamientos fallidos. A las condiciones bajo las cuales hibridan únicamente hebras de ácido nucleico completamente complementarias, se les hace referencia como "condiciones rigurosas de hibridación" o "condiciones de hibridación específicas de una frecuencia". Pueden lograrse dúplex estables de secuencias substancialmente complementarias, bajo unas condiciones menos severas de hibridación; el grado de apareamiento fallido tolerado, puede controlarse mediante un ajuste apropiado de las condiciones de hibridación. Aquéllas personas especializadas en el arte de la tecnología del ácido nucleico, pueden determinar la estabilidad del dúplex empíricamente, considerando un número de variables, incluyendo, por ejemplo, la longitud de la concentración de pares de bases de los oligonucléotidos, resistencia iónica, y la incidencia de los pares de bases con apareamiento fallido, seguido del gobierno o control mediante la tecnología correspondiente a este arte de técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Clonación Molecular - Un manual de Laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,; y Wetmur, 1991, Critical Review in Biochem. Y Mol. Biol. 26(3/4): 227-259).

El término "cebador", se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como un punto de iniciación de la síntesis de DNA, bajo condiciones en las cuales, se induce la síntesis de un producto de extensión de un cebador, complementario a un ácido nucleico, a saber, bien ya sea en presencia de diferentes trifosfatos nucleósidos, y un agente para la extensión (por ejemplo, DNA polimerasa o transcriptasa inversa), en un tampón apropiado, y a una temperatura apropiada. Tal y como se utiliza aquí, en este documento, el término "cebador", se pretende que abarque a los oligonucleótidos utilizados para procesos de amplificación mediatizados por ligación, en los cuales, un oligonucleótido, se "extiende" mediante ligación a un segundo oligonucleótido, el cual hibrida en una posición adyacente. Así, de esta forma, el término "extensión de cebadores" tal y como se utiliza aquí, se refiere a ambas, la polimerización de trifosfatos nucleósidos, utilizando el cebador como punto de iniciación de la síntesis de DNA, y a la ligación de dos cebadores para formar un producto de extensión.

Un cebador, es preferiblemente un DNA de hebra individual. La longitud apropiada de un cebador, depende del uso pretendido del cebador, pero, típicamente, se encuentra comprendido dentro de unos márgenes que van de 6 a 50 nucleótidos. Las moléculas cortas de cebadores, requieren generalmente temperaturas más frías, con objeto de formar complejos suficientemente estables con el molde. Un cebador, necesita reflejar la secuencia exacta del ácido nucleico del molde, pero debe ser lo suficientemente complementaria como para hibridar con el molde. El diseño de cebadores apropiados para la amplificación de una determinada secuencia diana, es bien conocida en arte de la técnica especializada, y se encuentra descrita en la literatura correspondiente a la bibliografía especializada, citada aquí.

Los cebadores, pueden incorporar características adicionales, las cuales permiten la detección o inmovilización de un cebador, pero no alteran la propiedad básica del cebador, la de actuar como un punto de iniciación de la síntesis de DNA. Así, por ejemplo, los cebadores, pueden contener una secuencia adicional de ácido nucleico, en el extremo 5', la cual no hibrida al ácido nucleico diana, pero facilita la clonación del producto amplificado. A la región del cebador la cual es suficientemente complementaria al molde, para hibridar, se le hace aquí referencia como la región hibridante.

Los términos "diana", "secuencia diana", región diana'' y "ácido nucleico diana", se refieren a un región o subsecuencia de un ácido nucleico que debe amplificarse.

Tal y como se utiliza aquí, un cebador, es "específico" para una secuencia diana, si el número de apareamientos fallidos presentes entre la secuencia del cebador y la secuencia diana, es inferior al número de apareamientos fallidos entre la secuencia del cebador y las secuencias no dianas que pueden encontrarse presentes en la muestra. Pueden elegirse las condiciones de hibridación, bajo las cuales, se forman dúplex estables, únicamente si el número de apareamientos fallidos presentes, no es mayor que el número de apareamientos fallidos presentes entre la secuencia del cebador y la secuencia diana. Bajo estas condiciones, el cebador, puede formar un dúplex estable, únicamente con una secuencia diana. Así, de esta forma, la utilización de cebadores específicos de la diana, bajo las apropiadas condiciones severas, posibilita la amplificación específica de aquéllas secuencias diana, las cuales contienen los sitios diana de enlace de cebadores. La utilización de condiciones de amplificación de secuencias específicas de secuencias, posibilita la amplificación específica de aquéllas secuencias diana las cuales contienen los sitios diana de enlace de cebadores, exactamente complementarios.

El término "amplificación no específica", se refiere a la amplificación de secuencias de ácido nucleico, distintas que la secuencia diana, la cual resulta de la hibridación de cebadores, a otras secuencias distintas que la secuencia diana, y que sirven entonces como un substrato para la extensión de cebadores. La hibridación de un cebador a una secuencia no diana, se le hace referencia como "hibridación no específica", y puede acontecer durante las condiciones de pre-amplificación de reducida severidad, a bajas temperaturas.

El término "dímero cebador", se refiere a un producto de amplificación, no específico, independiente del molde, el cual resulta de la extensión de cebadores, en donde, otro cebador, sirve como un molde. A pesar de que el dímero cebador aparece frecuentemente como siendo un concatámero de dos cebadores, es decir, un dímero; aparecen también concatámeros de más de dos cebadores. El término "dímero cebador", se utiliza aquí, de una forma general, para abarcar un producto de amplificación, no específico, independiente del molde.

El término "mezcla de reacción", se refiere a una solución la cual contiene reactivos necesarios para llevar a cabo una determinada reacción. Una "mezcla de reacción de amplificación", la cual se refiere a una solución que contiene reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación, contiene típicamente cebadores de oligonucleótidos, y una DNA polimerasa o ligasa, en un tampón apropiado. Una mezcla de reacción de "PCR", contiene típicamente cebadores oligonucleótidos, una DNA polimerasa termoestable, dNTP's, y un catión de metal divalente, en un tampón apropiado. A una mezcla de reacción, se le hace referencia como completa, si ésta contiene todos los reactivos necesarios para capacitar la reacción, y se le hace referencia como incompleta, si ésta contiene únicamente un subjuego de los reactivos necesarios. Se entenderá el hecho, por parte de aquéllas personas especializadas en el arte de esta técnica especializada, de que, los componentes de la reacción, se almacenan, de una forma rutinaria, como soluciones separadas, conteniendo, cada una de ellas, un subjuego de los componentes totales, por razones de conveniencia, estabilidad de almacenaje, o para permitir un ajuste en dependencia de la aplicación de las concentraciones de los componentes y que, los componentes de la reacción, se combinan previamente a la reacción, con objeto de crear una mezcla de reacción completa. Además de ello, se entenderá el hecho, por parte de una persona especializada en este arte de la técnica, de que, los componentes de la reacción, se envasan por separado, para la comercialización y que, los equipos, a modo de "kits" comerciales, de utilidad, pueden contener un subjuego de los componentes de la reacción, los cuales incluyen los cebadores modificados de la invención.

Cebadores modificados

Los cebadores de amplificación de la invención, se modifican mediante el enlace covalente de un grupo, a uno de los cuatro nucleótidos, en el extremo 3' del cebador. En una forma de presentación, un cebador modificado de la invención, consiste en una secuencia de ácido nucleico, la cual tiene la estructura general:

5'---S_{1}---

\uelm{N}{\uelm{\para}{R}}

---3'---

\hskip0,5cm

o

\hskip0,5cm

5'--- S_{1}---

\uelm{N}{\uelm{\para}{R}}

---S_{2}---3'

en donde, R, representa un grupo modificador, en donde, R, está enlazado, de una forma covalente, a N, mediante una amina exocíclica, y en donde, R, tiene la estructura descrita posteriormente, más abajo.

Tal y como se muestra en los ejemplos, el efecto de la modificación, se maximiza cuando, la modificación, es el nucleótido del extremo 3'. Así, de una forma preferible, el cebador, consta de un nucleótido del extremo 3', modificado.

El nucleótido modificado, se selecciona entre aquéllos cuya base contiene una amina exocíclica, la cual se encuentra involucrada en el apareamiento de bases del nucleótido con su nucleótido complementario. De una forma típica, los cebadores, son DNA que contiene únicamente nucleótidos convencionales. De las cuatro bases de nucleótidos convencionales que se encuentran en el DNA, la adenina, la guanina, y la citosina, contienen una amina primaria exocíclica, la cual se encuentra involucrada en el apareamiento de bases con la base complementaria. En el aspecto preferido de la invención, el cebador, se modifica mediante la unión de un grupo modificador individual a la amina exocíclica, sustituyendo a uno o más hidrógenos del grupo amina, los cuales, en la base no modificada, son capaces de involucrarse en el apareamiento de bases. Las estructuras de los nucleótidos modificados, las cuales contienen una base modificada de adenina, guanina, y citosina, respectivamente, se muestran abajo, a continuación:

2

en donde, S, representa una porción de azúcar y, R, representa el grupo modificado.

La presente invención, no se limita a los cebadores consistentes en nucleótidos convencionales. Cualquier análogo de nucleótido, en el cual, la porción de la base, contiene un amina primaria exocíclica, la cual se encuentra involucrada en el apareamiento de bases que es una base complementaria, es modificable tal y como se describe aquí. Los ejemplos de nucleótido no convencionales, incluyen a las 3-metiladenina, 7-metilguanina, 3-metilguanina, 5-metilcitosina, y 5-hidroximetilcitosina.

El grupo modificador, limita la capacidad de la base modificada, para participar en el enlace de hidrógeno, debido al hecho de que, el modificador, sustituye a uno de los átomos de hidrógeno. El átomo de hidrógeno remanente, puede todavía, participar en el enlace de hidrógeno. Los modificadores, pueden por lo tanto incluir ambas, las cinética y la termodinámica de la hibridación. Se consideran un variedad de grupos modificadores, los cuales tienen las siguientes propiedades.

1. que interfieran con el apareamiento de bases de Watson - Crick, de la base modificada con la base complementaria, pero que no la impidan,

2. que interfieran con la extensión del cebador modificado, pero que no la impidan; y

3. que permitan la síntesis de una hebra complementaria al producto de extensión del cebador modificado.

El grupo modificador, interfiere estéricamente con el apareamiento de bases y, así, de este modo, con la extensión del cebador. Así de esta forma, la masa física del modificador, influye en el grado de interferencia con la hibridación. Cuando se incorpora un nucleótido modificado de adenosina o cistidina, en el ácido nucleido de doble hebra, el grupo modificador, sobresale hacia el interior del espacio central de la estría mayor. Como consecuencia de ello, incluso los grupos modificadores relativamente grandes, podrían provocar una pequeña perturbación estérica de la estructura del dúplex. No obstante, los modificadores apropiados, no son tan grandes como para que se evite el enlace del hidrógeno, o que se evite la extensión enzimática del hidroxilo 3' del cebador. Cuando el nucleótido de guanosina modificado se incorpora en un ácido nucleico de doble hebra, el grupo modificador, sobresale hacia el interior de la estría menor, lo cual proporciona menos espacio para acomodar la masa del grupo modificado. Consecuentemente, se prefieren los grupos modificadores más pequeños, para la unión a la base de guanina.

Los productos de extensión de cebadores los cuales se utilizan como moldes en los ciclos subsiguientes de amplificación, contienen la base modificada introducida mediante el cebador. El grupo modificador, se elige de tal forma que, la presencia de las base modificada en el molde, no provoca la terminación de la extensión de los cebadores, o la inhibición de las extensión de los cebadores. De una forma preferible, la naturaleza del grupo modificador, no debería dar lugar a eventos mutagénicos, en donde se pierda la identidad de la base modificada, en la replicación de un molde derivado de un cebador. El efecto de la base modificada, en el molde, en la extensión de cebadores, puede someterse a test de ensayo, de una forma rutinaria, siguiendo las directrices proporcionadas aquí, en este documento, y las proporcionadas en la tecnología correspondiente al arte especializado (véase, por ejemplo, Geniazdowski y Cera, 1996, Chem. Rev. 96: 619-634).

Los grupos modificadores, R, los cuales satisfacen las propiedades anteriormente mencionadas, son apropiados para su uso en los procedimientos de la presente invención. Los grupo modificadores preferidos, tienen la estructura:

R_{1}---

\melm{H}{C}{\uelm{\para}{}}

---R_{2}

en donde, R_{1} y R_{2}, representan, de una forma independiente, un grupo alquilo C_{1}-C_{10}, un grupo alcoxi, un grupo fenilo, un grupo fenoxi, un grupo fenilo sustituido, un grupo naftilo, o un grupo naftilo sustituido. Los grupos alquilo, pueden ser ramificados o lineales. Pueden también utilizarse grupos alquilo más grandes, de hasta C_{20}.

3

en donde, R_{3}, representa un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, ramificado o lineal, de una forma más preferible, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, ramificado o lineal, un grupo metoxi, o un grupo nitro. El grupo alquilo C_{1}-C_{4}, ramificado o lineal, es metilo, etilo, propilo, iso-propilo, iso-butilo, tert.-butilo, y por el estilo. El metilo y el tert.-butilo, son grupos alquilo preferidos. De una forma preferible, R_{3}, se encuentra unida a la posición para.

Los grupos modificadores R, particularmente preferidos, se muestran abajo, a continuación:

4

En los ejemplos, se describen un gran número de grupos modificadores. De una forma general, las selección empírica de un grupo modificador apropiado particular de la clase de compuestos descritos, puede llevarse a cabo de una forma rutinaria, por parte de una persona especializada en el arte de esta técnica, siguiendo las directrices proporcionadas aquí, en este documento. De una forma preferible, la idoneidad de un grupo particular, se determina empíricamente, utilizando los cebadores modificados en una reacción de amplificación. La amplificación exitosa, indica ambos criterios, que la base modificada no inhibe totalmente la extensión de los cebadores, y que la presencia de la base modificada en un molde derivado de un cebador, no provoca la terminación de la extensión de cebadores. La reducción de un dímero cebador, se determina tal y como se describe en los ejemplos.

Cebadores con una modificación foto-lábil

En una forma de presentación alternativa de la invención, los cebadores, se modifican con uno o más de los grupos foto-lábiles, los cuales pueden eliminarse mediante la exposición a la luz, después de que la reacción haya alcanzado las condiciones de alta temperatura de la reacción, las cuales aseguran su especificidad. Debido al hecho de que, el modificador, se elimina previamente a la extensión de cebadores, el cebador modificado, no necesita ser extensible, previamente a la eliminación del grupo. Ejemplos de modificadores foto-lábiles que pueden utilizarse en los procedimientos de la presente invención, se describen en Pillai, 1989, "Photoremovable Protecting Groups in Organic Síntesis", - Grupos protectores foto-eliminables, en Síntesis Orgánica -, Síntesis; 1-26.

De una forma preferible, los cebadores foto-lábiles de la invención, están modificados en el nucleótido del extremo 3', mediante la unión de uno o dos grupos o-nitrobencilo:

5

En los cebadores modificados mediante la unión de un grupo nitrobencilo individual, a la amina primaria exocíclica de una porción de base, la amina secundaria resultante, puede todavía participar en el apareamiento de bases, si el grupo amina se hace girar, de tal forma que, el hidrógeno remanente, se oriente hacia la base complementaria. Tal y como de describe en los ejemplos, estos cebadores, pueden utilizarse en la amplificación, con o sin eliminación con luz UV.

Los cebadores modificados mediante la unión de dos grupos nitrobencilo a la amina exocíclica de la base, no pueden extenderse. La inhibición, resulta, de una forma presumible, de la inhabilidad de la base modificada para experimentar apareamiento de bases, la cual queda excluida, debido al hecho de que, ambos hidrógenos de la amina exocíclica, se reemplazan por grupos nitrobencilos masivos. La utilización de los cebadores modificados con los dos grupos nitrobencilo, en una amplificación, en la cual, la mezcla de reacción se ha expuesto a la luz UV, durante un transcurso de tiempo suficiente como para eliminar los grupos bencilos, permitiendo con ello el que tenga lugar la extensión de cebadores, se describe en los ejemplos.

En un forma alternativa de presentación, el grupo modificador, es encuentra unido al nitrógeno del anillo. Los cebadores modificados mediante la unión de un grupo nitrobencilo al nitrógeno del anillo de la base, no pueden extenderse, debido a la incapacidad de la base modificada para experimentar apareamiento de bases. La eliminación de los grupos nitrobencilo, mediante la exposición a la luz ultravioleta, permite el que tenga lugar la extensión de cebadores.

La utilización de cebadores foto-lábiles, los cuales no pueden extenderse hasta que, el grupo modificador se elimine, proporcione esencialmente unas condiciones de pre-reacción. La reacción, se irradia y, los cebadores, se desbloquean hasta únicamente después de que la temperatura de reacción se haya elevado a la temperatura la cual asegura la especificidad de la reacción.

Síntesis de cebadores modificados

La síntesis de cebadores modificados, se lleva a cabo utilizando medios químicos standard, bien conocidos en el arte de la técnica especializada. Los procedimientos para la introducción de estos modificadores, puede dividirse en cuatro clases.

1. El modificador, puede introducirse mediante la utilización de nucleósido modificado, tal como un soporte de síntesis de DNA.

2. El modificador, puede introducirse mediante la utilización de un nucleósido modificado, tal como una fosforamidita.

3. El modificador, puede introducirse mediante la utilización de un reactivo, durante la síntesis de DNA, (por ejemplo, tratamiento de bencilamina de una amidita convertible, cuando se incorpora en una secuencia de DNA.

4. Modificación post-sintética. El modificador, puede introducirse como un reactivo de la reacción, cuando se contacta con DNA sintética.

La síntesis de cebadores particulares, se describe en los ejemplos. Los cebadores adicionalmente modificados, pueden sintetizarse utilizando procedimientos standard de síntesis, de un forma análoga.

De una forma preferible, los cebadores modificados, se sintetizan utilizando un soporte de síntesis, derivado, controlado por vidrio poroso controlado (CPG). Un esquema general de reacción, para la síntesis de dA CPG derivada, es el que se muestra en la figura 6. Pueden añadirse grupos modificados particulares, mediante la utilización del apropiado agente alquilante de haluro de alquilo, haluro de bencilo, haluro de bencilo sustituido, haluro de metilnaftilo, o haluro de metilnaftilo sustituido. La síntesis de la dA CPG de bencilo y de p-tert.-bencilo, se describe, en los ejemplos 1 y 2, seguido del esquema mostrado en la Figura 6.

La alquilación del grupo amino exocíclico, puede llevarse a cabo utilizando procedimientos análogos a la metilación descrita por parte de Griffin y Reese, 1963, Biochim. Acta 68: 185-192. Los procedimientos adicionales de síntesis, se describen en Aritoma et al. 1995. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1: 1837-1849.

Amplificación utilizando cebadores modificados

Los procedimientos de la presente invención, comprenden la realización de amplificación basada en cebadores, utilizando los cebadores modificados de la presente invención. De una forma general, los cebadores modificados, pueden sustituirse por cebadores no modificados, los cuales contienen la misma secuencia nucleótida, en una amplificación basada en cebadores, sin ningún cambio en las condiciones de la reacción de amplificación. Por supuesto, una persona especializada en el arte de la técnica, reconocerá el hecho de que, la re-optimización menor de rutina de la condiciones de la reacción, pueden ser beneficiosas, en algunas reacciones.

En una forma preferida de presentación, los cebadores modificados de la presente invención, se utilizan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). No obstante, la invención, no se limita a ningún sistema particular de amplificación. Los cebadores modificados de la presente invención, pueden utilizarse en cualquier sistema de amplificación a base de cebadores, en el cual, pueden formarse dímeros de cebadores o productos no específicos de la amplificación. Los ejemplos, incluyen a los procedimientos de amplificación descritos en las referencias citadas anteriormente, arriba, en este documento. A medida que se van desarrollando otros sistemas, dichos sistemas, pueden beneficiarse de la práctica de esta invención.

Los procedimientos de la presente invención, son apropiados para la amplificación de, bien ya se DNA o bien ya sea RNA. Así, por ejemplo, la amplificación del RNA, en la que se utiliza una transcripción inversa/reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), es bien conocida en el arte especializado, y se describe en las patentes estadounidenses U.S. n^{os} 5.322.770 y 5.310.652, Myers and Gelfand, 1991, Biochemistry 30(31):7661-7666, Young et al., 1993, J.Clin. Microbiol. 31 (4): 882-886, y Mulder et al., 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2): 292-300.

En la amplificación a base se cebadores, la extensión de cebadores, se lleva a cabo, de una forma típica, a una temperatura elevada, utilizando una enzima termoestable, tal como la DNA polimerasa. La enzima, inicia la síntesis en el extremo 3' del cebador, y procede en la dirección hacia el extremo 5' del molde, hasta que se haya terminado la síntesis. Las DNA polimerasas termoestables, purificadas, de utilidad en las reacciones de amplificación, son bien conocidas en el arte especializado de la técnica, e incluyen, aunque de no de una forma limitada a ellas, a las enzimas descritas en la patente (estadounidense) U.S. nº 4.889.818; la patente U.S. nº 5.079.352; la patente U.S. nº 5.352.600; la patente U.S. nº 5.491.086; y los documentos internacionales de patente WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO 92/06202; WO 92/09689; y la patente estadounidense U.S. nº 5.210.036. Una revisión de las DNA polimerasas termoestables, se proporcionan en Abramson, 1995, en PCR Strategies, - Estrategias de PCR -, (ed. M.A. Innis et al.), páginas 39-57, Academic Press. San Diego.

En una forma preferida de presentación, particularmente, para la amplificación de DNA, la amplificación, se lleva a cabo utilizando una enzima reversiblemente inactivada, tal y como se describe en La utilización de un enzima reversiblemente inactivada, la cual se reactiva bajo las condiciones de alta temperatura, y reduce adicionalmente la amplificación no específica, mediante la inhibición de la extensión de cebadores, previamente al inicio de la reacción. Una DNA polimerasa termoestable, reversiblemente inactivada, desarrollada por parte de la firma Hoffmann - La Roche (Nutley, NJ), y comercializada por parte de la firma Perking Elmer (Norwalk, CT), se describe en Birch et al., 1996, Nature 381 (6581): 445-446.

El efecto del grupo modificador, en la capacidad de la enzima, para extender el cebador, depende, en parte, de la enzima particular utilizada y, en parte, de las condiciones de reacción seleccionadas. Así, por ejemplo, La Tth DNA polimerasa, es más permisiva cuando se utiliza Mn^{2+}, como el guión divalente, como en algunas amplificaciones de RNA, en lugar de Mg^{2+}. Una persona especializada en el arte de la técnica, reconocerá el hecho de que, en la selección de rutina, de un grupo modificador apropiado, se considerará la enzima y las condiciones de reacción.

Los procedimientos de preparación de muestras para las reacciones de amplificación, son bien conocidas en el arte de la técnica especializada, en la bibliografía aquí citada. El procedimiento particular utilizado, no es una parte crítica de la presente invención. Una persona especializada en el arte de esta técnica, puede optimizar las condiciones de reacción, para su uso con los conocidos procedimientos de preparación de muestras.

Los procedimientos de análisis de ácidos nucleicos amplificados, son bien conocidos en el arte de la técnica especializada, y se describen enteramente en la bibliografía aquí citada. El procedimiento particular utilizado, no es una parte crítica de la presente invención. Una persona especializada en el arte de esta técnica, puede seleccionar un procedimiento de análisis apropiado, en dependencia de la aplicación.

Un procedimiento preferido para analizar una amplificación de reacción, es mediante el control del incremento de la cantidad total de DNA de doble hebra, en la mezcla de reacción, tal y como se describe en Higuchi et al. 1992, Bio/Technology 10: 413-417; Higuchi et al., 1993, Bio/Technology 11: 1026-1030: Publicaciones de Patentes Europeas n^{os} 512.334 y 640.828. En este procedimiento, al cual se le hace referencia como "PCR cinética", la detección de la DNA de doble hebra, se basa en la fluorescencia incrementada que exhiben el bromuro de etidio (EtBr) y otros marcadores de enlace de DNA, cuando se unen a DNA de doble hebra. La amplificación, se lleva a cabo en presencia de un marcador. El incremento del DNA de doble hebra, resultante de la síntesis de secuencias diana, tiene como resultado un incremento detectable de la fluorescencia, el cual se controla durante la amplificación. Así, de este modo, los procedimientos, posibilitan el control del progreso de una reacción de amplificación.

En una PCR cinética, la fluorescencia medida, depende de la cantidad total de DNA de doble hebra presente, cuando resulta de una amplificación no específica, o de una amplificación con la secuencia diana. El control de la fluorescencia, permite la medición del incremento de la cantidad total de DNA de doble hebra, pero, el incremento resultante de la amplificación de la secuencia diana, no se mide de una forma independiente del incremento resultante de un producto de amplificación, no específico. Los cebadores modificados de la presente invención, son particularmente de utilidad en la PCR cinética, debido al hecho de que, éstos, no únicamente reducen la cantidad de dímero cebador formado, sino que también retardan la formación de cantidades detectables de dímero cebador. Un retardo en la formación de dímeros, hasta después de que haya acontecido un significante incremento en la secuencia diana, capacita el control independiente de la amplificación de secuencias específicas DINA, y minimiza la interferencia del dímero cebador.

Equipos a modo de "kits"

La presente invención, se refiere también a equipos a modo de "kits", unidades multi-recipientes que comprenden componentes de utilidad para la práctica del presente procedimiento. Un equipo a modo de "kit", de utilidad, contiene cebadores, encontrándose, por lo menos uno de ellos, modificado tal y como se describe aquí, para la amplificación del ácido nucleico. Otros componentes ópticos del equipo a modo de "kit", incluye, por ejemplo, un agente para catalizar la síntesis de los productos de extensión de cebadores, los nucleósidos trifosfatos de substrato, apropiados tampones de reacción, e instrucciones para realizar el presente procedimiento.

Los ejemplos de la presente invención, los cuales se presentan abajo, a continuación, se proporcionan únicamente para propósitos ilustrativos, y no para limitar la invención. A raíz de la lectura del texto precedente, y de los ejemplos que se facilitan a continuación, resultarán evidentes, para aquellas personas comúnmente especializadas en este arte de la técnica, numerosas formas de presentación de la presente invención, las cuales caen dentro del ámbito de las reivindicaciones que siguen a los ejemplos.

Ejemplo 1 Síntesis de cebadores modificados con un grupo bencilo

Los cebadores modificados mediante la adición de un grupo bencilo, se sintetizaron mediante uno de los procedimientos que se describen posteriormente, abajo. Se procedió a sintetizar los cebadores modificados en la base del extremo 3', utilizando Vidrio de Poro controlado (CPG) con N^{6}-bencildesoxiadenosina, para iniciar la síntesis del DNA. Los cebadores modificados en una base interna, se sintetizaron utilizando N^{6}-bencildosoxiadenosina fosforamidita.

En los ejemplos, se utilizan las siguientes abreviaciones

DMAP	4-dimetilaminopiridina
DMF	N,N'-dimetilformamida
TEA	Trietanolamina
EDC	hidroxicloruro de 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)-carbodiimida
THF	Tetrahidrofurano
DMT	4,4'-dimetoxitritilo
I.CAA-CPG	Vidrio de poro controlado, con alquiloamino de cadena larga.

Síntesis de CPG N^{6}-bencildesoxiadenosina

Etapa 1

Síntesis de N^{6}-benzoil, n^{6}-bencil, 5'-O-DMT-2'-desosoxiadenosina

Se procedió a añadir piridina (10 ml), a N^{6}-benzoil-5'-O-(4,4'-dimetoxitritril)-2'-desoxiadenosina (657 mg, 1,0 mmol; Aldrich Chemical Co., Milwaukke, WI) y, la mezcla, se secó mediante evaporación, bajo la acción del vacío. Se repitió la operación. La espuma resultante, se disolvió en DMF anhidra (15 ml; Aldrich Chemicals CO, Milwaukee, WI), y se enfrió a una temperatura de 5ºC. Se procedió a añadir hidruro sódico (44 mg, 1,1 mmol, 1,1 equivalentes, dispersión en aceite al 66%), bajo una atmósfera de argón, y se agitó a la temperatura ambiente, durante un transcurso de tiempo de 45 minutos. Se añadió bromuro de bencilo (143 \mul, 206 mg, 1,2 mml, 1,2 equivalentes; Aldrich Chemicals Co., Milwaukee, WI), en un transcurso de tiempo de 2 minutos y, la mezcla, se agitó durante el transcurso de toda la noche, a la temperatura ambiente. La mezcla, se secó por evaporación, bajo la acción del vacío y, el residuo, se repartió entre acetato de etilo y agua (10 ml cada uno), y se extrajo. La fase acuosa, se reextrajo con acetato de etilo y (10 ml) y, los extractos combinados, se secaron sobre sulfato magnésico anhidro, se filtraron y se evaporaron. El producto crudo, se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice (75 g), utilizando metanol, trietilamina, cloruro de metileno (3: 0,5: 96,5). Las fracciones que contenían el producto, se combinaron y secaron, mediante evaporación, para proporcionar la N^{6}-benzoil, n^{6}-bencil, 5'-O-DMT-2'-desosoxiadenosina (410 mg, 54%) esperada. La estructura del producto, se confirmó mediante MMR.

Etapa 2

Succinilación

Se procedió a añadir piridina (10 ml), a la N^{6}-benzoil, N^{6}-bencil-5'-O-DMT-2'-desoxiadenosina (295 mg, 0,39 mmol) y, la mezcla, se secó mediante evaporación, bajo la acción del vacío. Se repitió la operación. Se añadió piridina anhidra fresca (10 ml), conjuntamente con anhídrido succínico (200 mg, 2 mmol, 5,0 equivalentes) y DMAP (24 mg) y, la solución, se agitó bajo atmósfera de argón, durante el transcurso de toda la noche, a la temperatura ambiente. Se procedió a eliminar la masa del disolvente, bajo la acción de vacío y, el residuo, se repartió entre cloruro de metileno (20 ml) y solución de citrato sódico (20 ml, 0,1 M, pH 5,0) y se extrajo. La fase acuosa, se extrajo con más cloruro de metileno (20 ml) y, los extractos combinados, se secaron sobre sulfato sulfato sódico anhidro, se filtraron, y se secaron mediante evaporación. El producto, se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice (4,5 g), utilizando acetato de etilo, trietilamina, cloruro de metileno (32: 1: 67), para proporcionar el 3'-succinato éster esperado, N^{6}-benzoil-N^{6}-bencil-3'-O-succinato-5'-O-DMT-2'-desoxiadenosina (247 mg, 74%).

Etapa 3

Derivación de CPG

Se procedió a preparar CPG lavado con ácido, de la siguiente forma: Se procedió a lavar LCAA - CPG (1,0 g, LCA00500C, 500 anstrom, 8,6 (mol/g; CPG Inc., Fairfield, NJ), con ácido dicloroacético en diclorometano (2%, 20 ml), procediendo a hacerlo girar periódicamente, durante un transcurso de tiempo de 20 minutos, a la temperatura ambiente. El CPG lavado con ácido, se filtro en una frita de vidrio, y se lavó con diclorometano, hasta que se encontrara libre de ácido. Se procedió a secar la materia en forma de polvo, con aire y, a continuación, se secó a la temperatura ambiente, bajo la acción de vacío, durante el transcurso de toda la noche.

El acoplamiento de nucleósido modificado intermedio al CPG lavado con ácido, se realizó de la siguiente forma: Se procedió a añadir TEA (100 \mul), a una solución de N^{6}-benzoil-N^{6}-bencil-3'-O-succinato-5'-O-DMT-2'-desoxiadenosina (170 mg, 0,2 mmol), preparada de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba, en diclorometano (10 ml) y, la solución, se concentró a aproximadamente 5 ml, bajo atmósfera de argón. Se procedió a añadir, en forma secuencial, DMAP (12 mg, 0,1 mmol, 0,5 equivalentes), TEA (10 \mul), EDC (384 mg, 2,0 mmol, 10 equivalentes), y el CPG lavado con ácido, de arriba. Se añadió piridina anhidra (5 ml) y, la mezcla, se selló y se agitó durante tres días, a la temperatura ambiente. El CPG, se filtró, bajo la acción del vacío y se lavó extensamente, con isopropanol y, a continuación, con diclorometano, se secó con aire y, después, se secó bajo la acción del vacío, durante un transcurso de tiempo de 1 hora.

El bloqueo del extremo de terminal, con formación de casquete, del CPG derivado, se realizó de la siguiente forma: Al CPG-derivado, se le añadieron las soluciones Cap A y Cap B (5 ml cada una, anhídrido acético/2,6-Lutidina/THF y 10% N-metilamidazol en THF; Glen Research DNA synthesis, Saterling, VA) y, la mezcla, se agitó durante un transcurso de tiempo de 4 horas, a la temperatura ambiente. El CPG, se filtró bajo la acción del vacío, y se lavó extensamente, con isopropanol, a continuación con diclorometano, aire seco y, después, se secó bajo la acción del vacío, durante el transcurso de toda la noche.

II Síntesis de la N^{6}-bencil-desoxiadenonosina fosforamidita

Se procedió a sintetizar la N^{6}-benzoil, N^{6}-bencil,-5'-O-DMT-2'-desoxiadenosina, de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba.

Se procedió a añadir, a la N^{6}-benzoil-5'-O-DMT-2'-desoxiadenosina (196 mg, 0,26 mmol), en THF (8 ml), diisopropiletilamina (350 \mul, 270 mg, 2,04 mmol, 7,8 equivalentes) y 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamidita (161 mg, 0,68 mmol, 2,6 equivalentes; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) y, la mezcla, se agitó durante un tiempo de 30 minutos, a la temperatura ambiente, bajo una atmósfera de argón. La mezcla, se secó, bajo la acción del vacío y, el residuo, se repartió entre bicarbonato sódico (5%, 20 ml) y acetato de etilo (20 ml). La fase orgánica, se lavó con la solución de bicarbonato, agua, y salmuera saturada (20 ml cada uno), de forma secuencial, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se evaporó. El residuo, se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice (4 g), utilizando acetona/hexano/TEA (34: 65: 0,7), para proporcionar la fosforamidita deseada (248 mg, 100%).

III Síntesis del DNA, purificación y análisis

Se procedió a transferir CPG adenosina, derivada con bencilo (25 mg, 1,0 (mol), al interior de columnas de síntesis vacías (Glen Research, Sterling, VA) y, éstas, se utilizaron para fabricar oligonucleótidos sobre un sintetizador de DNA del tipo ABI 374 DNA shyntesizer (Perking Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, Ca), utilizando síntesis convencional y condiciones de desprotección. Se procedió a purificar el DMT-DNA, y se convirtió en el 5'-hidroxi-DNA, mediante HPLC con/sin conexión de DMT, a intervalos, (DMT On/Off HPLC) del tipo standard, utilizando una columna de purificación del tipo Rainin Pure -DNA column, en un sistema de HPLC Rainin (Rainin Instrument Co, Woburn, MA). Los oligonucleótidos, se analizaron utilizando un sistema de capilaridad ABI, de electroforesis (Perking Elmer, Applied Biosystems Division, en una columna del tipo Dionex Nucleopak (Dionex Corp. Sunnyvale, CA).

De una forma similar, se procedió a llevar a cabo la síntesis de cebadores internamente modificados, utilizando un CPG no modificado, y la fosforamidita sintetizada, de la forma anteriormente descrita, arriba.

Ejemplo 2 Síntesis de cebadores modificados con un grupo tert.-butil-bencilo

El presente ejemplo, describe la síntesis de cebadores modificados en el extremo 3' de la adenosina, con un grupo p-tert.-butilbencilo. Los cebadores modificados, se sintetizaron esencialmente de la forma descrita en el Ejemplo 1, pero utilizando N^{6}-(p-tert.-butilbencil)desoxiadenosina CPG. La síntesis del CPG derivado, se describe abajo, a continuación.

Etapa 1

Síntesis de la N^{6}-benzoil-N^{6}-bencil-(p-tert.-butilbencil)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina

Se procedió a añadir DMF (anhidra, 10 ml), a la N^{6}-benzoil-5'-O-(4,4'dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (658 mg, 1,0 mmol), y se evaporó hasta secado. Se procedió a repetir la operación. Se añadió DMF fresca (10 ml), bajo atmósfera de argón. Se añadió hidruro sódico (44 mg, 60% en aceite), 1,1 mmol) y, la mezcla, se agitó durante un tiempo de 0,5 horas, a la temperatura ambiente. Se añadió bromuro de (tert.-butil)bencilo (272 mg, 1,2 mmol), por goteo, y se agitó a la temperatura ambiente, durante el transcurso de toda la noche. El disolvente, se eliminó bajo la acción de vacío y, el residuo, se repartió entre acetato de etilo y agua (20 ml cada uno). La fase orgánica, se secó con agua (3 veces, 20 ml), se secó sobre sulfato magnésico anhidro, se filtró, y se evaporó hasta secado. El producto crudo, se purificó mediante cromatografía de columna, sobre gel de sílice (100 g), utilizando cloruro de metileno : metanol : trietilamina 96,5: 5,3 : 0,5, para proporcionar la N^{6}-benzoil-N^{6}-(p-tert.-butilbencil)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (229 mg, 28,5%).

Etapa 2

Succinilación

Se procedió a tratar la N^{6}-benzoil-N^{6}-(p-tert.-butilbencil)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (217 mg, 0,27 mmol), con anhídrido succínico (125 mg, 5 equivalentes) y DMAp (17 mg, 0,5 equivalentes), en piridina (10 ml). La preparación y la cromatografía, tal y como se describen en el Ejemplo 1, anteriormente descrito, arriba, proporcionaron el 3'-O-succinato de N^{6}-benzoil-N^{6}-(p-tert.-butilbencil)-5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (199 mg, 82%).

Etapa 3

Derivación de CPG

El succinato (180 mg, 0,2 mmol) de la etapa 2, anterior, se trató con el LCAA-CPG lavado con ácido, tal y como se describe en el Ejemplo 1. El CPG, se bloqueó en el extremo de terminal, con formación de casquete, y se secó al vacío, para proporcionar el CPG derivado de 3'-O-succionato de N^{6}-benzoil-N^{6}-(p-tert.-butilbencil)-5'-O(4,4'dimetoxitritil)-2'-desoxiadenosina (1,065 g).

Ejemplo 3 Síntesis de cebadores modificados con un grupo metilo

Se sintetizaron cebadores modificados en la adenosina del extremo 3' adenosina, con un grupo metilo, utilizando un N^{6}-metil dA CPG (22 mg, 1 \mumol, Glen Research, Sterling VA). El N^{6}-metil dA CPG, se emplazó en un columna de síntesis vacía, y se fabricaron cebadores, según condiciones de standard de síntesis y desprotección. Los cebadores, se purificaron utilizando HPLC con/sin conexión de DMT, a intervalos (DMT On/Off HPLC), de la forma descrita en el Ejemplo 1.

Ejemplo 4 Síntesis de cebadores foto-lábiles modificados

El presente ejemplo, describe la síntesis de cebadores modificados en la adenosina del extremo 3' con bien ya sea uno, o bien ya sea dos grupos nitrobencilo. Los cebadores modificados, se sintetizaron esencialmente de la forma que se describe en el ejemplo 1, pero utilizando, bien ya sea un mononitrobencil dA CPG o bien ya sea un bis-nitrobencil dA CPG.

1. Cebadores mononitrobencilados

El procedimiento general para la síntesis de CPG derivados de N^{6}-benzoil-N^{6}-bencil-2'-desoxiadenosina (véase el Ejemplo 1), se aplicó a la síntesis de CPG derivada de N^{6}-benzoil-N^{6}-ortonitrobencil-2'-desoxidenosina, mediante la sustitución de bromuro de orto-nitrobencilo, como agente alquilante. Las etapas subsiguientes, para el CPG, fueron idénticas a las descritas en el Ejemplo 1, excepto en cuanto al hecho de que, adicionalmente, los intermediarios, se protegieron de la luz ambiente, envolviendo los matraces de reacción en folio de aluminio.

Siguiendo la síntesis de CPG derivado, los cebadores, se sintetizaron al y como se describe en el Ejemplo 1, pero se aislaron mediante extracción de fases sólida, utilizando columnas prescindibles Nensorb Prep (NEN Research Products Biotechnology Systems, Du Pont Co, Boston MA), utilizando los protocolos de la forma que se describen por parte del fabricante.

II. Cebadores bis-nitrobencilados

Se procedió a sintetizar bis-nitrobenzil-desoxiadenosina CPG, tal y como se describe posteriormente, abajo. A continuación de la síntesis del CPG derivado, los cebadores, se sintetizaron y se purificaron tal y como se describe para los cebadores de mononitrobencilo.

Etapa 1

Síntesis de la 5'-O-DMT-N^{6}-bis-orto-nitrobencil-2'-desoxiadenosina

Se procedió a secar monohidrato de 2'-desoxiadenosina (538 mg, 2,0 mmol, Aldrich Chemical, Milkaukee, WI), con piridina anhidra (2 veces, 10 ml), bajo la acción de vacío. El residuo, se disolvió en DMF anhidra (10 ml, Aldrich, Milwaukee, WI), bajo atmósfera de argón, y se añadió hidruro de sodio (88 mg, 2,2 mmol, 1,1 equivalentes, 60%, dispersión en aceite), y se agitó durante un transcurso de tiempo de 40 minutos, a la temperatura ambiente. Se procedió a añadir bromuro de 2-nitrobencilo (710 mg, 3,3 mmol, 1,5 equivalentes) y, la solución, se agitó durante un tiempo de 4 horas, a la temperatura ambiente. Se procedió a eliminar la DMF por evaporación, bajo la acción de vacío y, el residuo, se repartió entre acetato de etilo y agua (20 ml cada uno). La fase acuosa, se extrajo con acetato de etilo (20 ml) y, los extractos combinados, se lavaron con agua (20 ml) y se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se evaporaron. El producto crudo, se purificó mediante cromatografía de columna sobre gel de sílice (50 g, utilizando 3% MeOH en CH_{2}Cl_{2}), para proporcionar 2'-desoxi-N^{6}-bis-orto-nitrobenciladenosina (30 mg, 30%).

Se procedió a añadir piridina anhidra (10 ml) a la 2'-desoxi-N^{6}-bis-orto-nitrobenciladenosina (200 mg, 0,518 mmol), y se evaporó hasta secado. Se añadió piridina (10 ml, seguido de cloruro de 4-4'-dimetoxitritilo (900 mg, 2,3 mmol, 4,5 equivalentes) y trietilamina (280, mg, 2,76 mmol, 4,0 equivalentes) y se agitó a la temperatura ambiente, bajo una atmósfera de argón, durante un tiempo de 5 horas. Se añadió agua (0,5 ml), y se agitó durante 20 minutos). La mezcla, se repartió entre éter y agua (20 ml cada una) y, la fase acuosa, se reextrajo con éter (20 ml). Los extractos, se combinaron y se lavaron con agua (20 ml), y se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron y se evaporaron. El material, se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice (4 g, utilizando 0,7-2,5% metanol en cloruro de metileno) para proporcionar 5'-O-DMT-N^{6}-bis-orto-nitrobencil-2'-desoxiadenosina (121 mg, 33%).

Etapa 2

Succinilación

Se procedió a secar 5'-O-DMT-N^{6}-bis-orto-nitrobencil-2'-desoxiadenosina (121 mg, 0,141 mmol), por evaporación, con piridina anhidra (2 veces, 3 ml). Se añadió piridina (3 ml), anhídrido succínico (58 mg, 0,58 mml, 4 equivalentes) y DMAP (11 mg, catalítica) y, la solución, se agitó a la temperatura ambiente, durante un transcurso de tiempo de 3 días. La solución, se evaporó en vacío y, el residuo, se distribuyó entre cloruro de metileno (10 ml) y tampón de citrato sódico (0,1 M, pH 5,0, 10 ml). La fase orgánica, se secó sobre sulfato sódico anhídrido, se filtró, y se evaporó hasta secado. El producto crudo, se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (2 g, utilizando EtOAc: CH_{2}Cl_{2}: TEA, 32.67,1, 10 ml y, a continuación, MeOH:CH_{2}Cl_{2}, 3: 97: 25 ml), para proporcionar una espuma amarilla, de tonalidad pálida, consistente en el 3'-O-succinato de 5'-O-DMT-N^{6}-bis-orto-nitrobencil-2'-desoxiadenosina (138 mg, 99,5%).

Etapa 3

Derivación del CPG

El acoplamiento del nucleósido intermediario modificado al CPG lavado con ácido, se realizó de la siguiente forma. Se trató 3'-O-succinato de 5'-O-DMT-N^{6}-bis-orto-nitrobencil-2'-desoxiadenosina (37 mg, 0,04 mmol), con TEA (16 (l) en vial de vidrio coloreado en color ámbar, y se evaporó. A este residuo, se le añadió piridina anhidra (1,5 ml), TEA (2 \mul), DMAP (2,4 mg), EDC (76 mg, 0,04 mmol) y LCCC-CPG (200 mg), lavado con ácido y, la mezcla, se agitó en un mezclador orbital, durante un transcurso de tiempo de tres días, a la temperatura ambiente. Se procedió a filtrar el CPG, bajo la acción de presión reducida, y se lavó extensamente con isopropanol y, a continuación, con cloruro de metileno, se secó con aire, y después, se secó bajo la acción de vacío, durante 1 hora.

El bloqueo del extremo de terminal, con formación de casquete, del CPG derivado, se realizó tal y como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 5 Amplificación, utilizando cebadores modificados Efecto de posición de nucleótidos modificados

Con objeto de demostrar el efecto de los cebadores modificados en la formulación de dímero cebador, se procedió a llevar a cabo comparaciones de amplificación de HIV-1 RNA, utilizando ambos, cebadores modificados y cebadores no modificados. Adicionalmente a ello, con objeto de valorar el efecto de la posición del nucleótido modificado, en la reducción del dímero cebador, se procedió a llevar a cabo amplificaciones, utilizando tres cebadores diferentes, modificado corriente arriba, los cuales diferían únicamente en la localización de la base modificada.

Ácido nucleico diana

Se sintetizaron moldes de HIV-1 RNA, utilizando un vector de transcripción de HIV-1 RNA, esencialmente, tal y como se describe en Mulder et al., 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2): 292-300.

Cebadores

Se procedió a llevar a cabo amplificaciones, utilizando ambos, cebadores no modificados y cebadores modificados. Las secuencias nucleótidas de cebadores no modificados, se muestran posteriormente, abajo, orientadas en la dirección 5' a 3'. El cebador corriente arriba RAR 1032MB (SEQ ID NO: 1) y el cebador corriente abajo RAR1033MB (SEQ ID NO: 2), amplifican un producto de 175 pares de bases, correspondientes a las posiciones nucleótidas 2956 a 3130, de la secuencia de la cepa de referencia HXB2 del HIV-1 (nº de acceso al GenBank - banco de genes -: nº K03455).

Cebadores de amplificación de HIV-1

Cebador	SEQ ID NO	Secuencia
RAR1032MB	1	CAATGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAA
RAR1033MB	2	CCCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA

Las designaciones de los cebadores anteriores, de arriba, se refieren a los cebadores no modificados. Los cebadores modificados, se sintetizaron tal y como se describe en el ejemplo 1, consistiendo, estos cebadores, en las mismas secuencias de nucleótidos que las de los cebadores modificados, pero que contienen una adenosina bencilada, bien ya sea en la posición del extremo 3', o bien ya sea en una posición uno o más nucleótidos corriente arriba del extremo 3'. Las formas modificadas de los cebadores, se designan aquí de la siguiente forma:

Cebadores modificados de amplificación de HIV-1

Cebador	SEQ ID NO	Posición del nucleótido modificado
RAR1032MBA1	1	extremo 3'
RAR1033MBA2	1	1 del extremo 3'
RAR1032MBA4	1	3 del extremo 3'
RAR1033MBA1	2	extremo 3'

Amplificación

Se procedió a llevar a cabo amplificaciones, en reacciones de 100 \mul, utilizando los siguientes reactivos:

100 copias de cebador de RNA de HIV

50 mM tricina (pH, 8,33),

110 mM KOAc,

300 \muM de cada uno de los dATC, dCTP, y dGTP

50 \muM dTTP

500 \muM dUTP

50 \muM de cada uno de los cebadores,

3,5 mM Mn(OAc)_{2},

13% glicerol,

20 unidades de Z05 DBA polimerasa*, y

20 unidades de UNG**.

* descrita en la patente estadounidense US nº 5.455.170

** fabricado y desarrollado por Hoffmann - La Roche, y comercializado por Perking Elmer, Norwalk, CT.

La ciclación de la temperatura de la amplificación, se realizó en un ciclador térmico de DNA del tipo TC480 DNA thermal cicler (Perking Elmer, Norwalk, CT), utilizando el siguiente perfil de temperatura:

Incubación de recirculación:	45^{o}C durante 4 minutos;
Transcripción inversa:	60^{o}C, durante 30 minutos;
46 ciclos:	desnaturalización a 95^{o}C durante 45 segundos, reasociación/extensión,
	a 60^{o}C, durante 45 segundos
Extensión final:	60^{o}C, durante 7 minutos
Retención post-reacción:	10^{o}C, hasta análisis (durante corto tiempo).

Detección del producto de amplificación

La presencia de producto amplificado, se detectó mediante electroforesis en gel, de la siguiente forma. Se procedió a fraccionar productos de reacción, utilizando un gel de agarosa (100 ml de NusSieve al 3% y SeaChem al 0,5%), y se utilizó tampón corriente de IX TBE (0,089 M Tris, 0,089 M ácido bórico, 0,0025 M EDTA disódico. Se procedió a añadir bromuro de etidio (0,5 \mug/ml), con objeto de marcar con color cualquier DNA presente. Se procedió a llevar a cabo electroforesis, a 100 volt, durante un transcurso de tiempo de aproximadamente 1 hora. Las bandas de DNA, marcadas de color de tinción con bromuro de etidio, se visualizaron utilizando radiación UV.

Resultados

Los resultados de análisis de electroforesis en gel, se ven en la figura 1. Los números de ruta, corresponden a cada una de las amplificaciones, utilizando combinaciones de cebadores modificados e inmodificados, tal y como se ve en la tabla que se facilita posteriormente, abajo. Las bandas correspondientes al producto de HIV pretendido, se indican en la figura, mediante una flecha. Las otras bandas, en el gel, corresponden a amplificaciones no específicas y, de una forma particular, dímeros cebadores.

\hskip3,5cm Cebadores		N^{o} de ruta

Corriente arriba	Corriente abajo
RAR1032MB	RAR1033MB	1
RAR1032MBA1	RAR1033MB	2
RAR1032MBA2	RAR1033MB	3
RAR1032MBA4	RAR1033MB	4
RAR1032MB	RAR1033MBA1	5
RAR1032MBA1	RAR1033MBA1	6
RAR1032MBA2	RAR1033MBA1	7
RAR1032MBA4	RAR1033MBA1	8

Debido al hecho de que, la formación de dímero cebador, compite con la formación del producto de amplificación pretendido, una reducción en el dímero cebador tiene como resultado, de una forma típica, un incremento concomitante en la cantidad de producto pretendido formado. Así, de este modo, el efecto de los cebadores modificados, puede verse procediendo a comparar la cantidad de dímero cebador formado, con relación a la cantidad formada utilizando cebadores inmodificados, y comparando la cantidad de la diana formada, con relación a la cantidad formada utilizando cebadores inmodificados.

Una comparación de los resultados, utilizando dos cebadores inmodificados (es decir, no modificados) (ruta 1), con los resultados utilizando un cebador 3'-modificado individual (rutas 2 y 5) y los resultados utilizando dos cebadores 3'-modificados (ruta 6), indica el hecho de que, se obtuvo un decrecimiento de dímero cebador, utilizando, bien ya sea uno o bien ya se dos cebadores modificados. En amplificaciones en las que se utiliza un cebador 3'-modificado, se observó una pequeña diferencia en la reducción de dímero cebador, la cual dependía de cuál de los cebadores Se había modificado. La utilización de dos cebadores (ruta 6), dio como resultado, en ambos, el mayor decrecimiento en dímero cebador, y un incremento detectable en la cantidad de secuencia diana amplificada.

Se ve el efecto de la posición del nucleótido modificado, en comparación con las rutas 6-8. La reducción de dímero cebador obtenida utilizando un cebador modificado en el nucleósido contiguo al nucleótido del extremo 3' (nucleótido 3'-terminal) (ruta 7), era equivalente al obtenido utilizando el cebador modificado en el nucleótido del extremo 3', (ruta 79, mientras que, la mejora obtenida utilizando un cebador modificado en las tres bases del nucleótido, corriente arriba del nucleótido del extremo 3' (ruta 8), era ligeramente inferior.

Ejemplo 6 Amplificación adicional utilizando cebadores modificados Efecto de la posición de nucleótido modificado

Con objeto de demostrar adicionalmente el efecto de los cebadores modificados, en la formación de dímero cebador, se procedió a realizar comparaciones de la amplificación de HCV RNA, utilizando ambos, cebadores modificados y cebadores inmodificados, esencialmente, de la forma que se describe anteriormente, arriba. Las amplificaciones, se realizaron utilizando tres cebadores modificados, corriente arriba y, los cuales diferían únicamente en la localización de la base modificada.

Ácido nucleico diana

Se procedió a sintetizar moldes de HCV RNA, utilizando un vector de transcripción HCV RNA, tal y como se describe por parte de Young et al. 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4): 882-886.

Cebadores

Se procedió a llevar a cabo amplificaciones, utilizando ambos, cebadores no modificados y cebadores modificados. Las secuencias nucleótidas de cebadores no modificados, se muestran posteriormente, abajo, orientadas en la dirección 5' a 3'. El cebador corriente arriba ST280A (SEQ ID NO: 3) y el cebador corriente abajo ST778AA (SEQ ID NO: 4), amplifican un producto de 240 pares de bases, de una región no trasladada 5', del genoma del HCV.

Cebadores de amplificación de HIV-1

Cebador	SEQ ID NO	Secuencia del nucleótido
ST280A	3	GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA
ST778AA	4	GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA

Cebadores modificados de amplificación de HCV

Cebador	SEQ ID NO	Posición del nucleótido modificado
ST280ABA1	3	extremo 3'
ST778AABA1	4	extremo 3'
ST778AABA2	4	1 del extremo 3'
ST778AABA4	4	3 del extremo 3'

Amplificación y análisis

Se procedió a llevar a cabo amplificaciones, esencialmente, de la forma que se describe en el ejemplo 3, pero utilizando 100 copias del molde HCV RNA. Se llevó a cabo un análisis en gel, del producto amplificado, tal y como se describe en el ejemplo 3.

Resultados

Los resultados de análisis de electroforesis en gel, se ven en la figura 2. Los números de ruta, corresponden a cada una de las amplificaciones, utilizando combinaciones de cebadores modificados e inmodificados, tal y como se ve en la tabla que se facilita posteriormente, abajo. Las bandas correspondientes al producto de HCV pretendido, se indican en la figura, mediante una flecha. Las otras bandas, en el gel, corresponden a amplificaciones no específicas y, de una forma particular, dímeros cebadores.

\hskip3,5cm Cebadores		N^{o} de ruta

Corriente arriba	Corriente abajo
ST280A	ST778AA	1
ST280A	ST778AABA1	2
ST280A	ST778AABA2	3
ST280ABA	ST778AABA4	4
ST280ABA1	ST778AA	5
ST280ABA1	ST778AABA1	6
ST280ABA1	ST778AABA2	7
ST280ABA1	ST778AABA4	8

Los resultados obtenidos, eran similares a los obtenidos a partir de las amplificaciones de HIV descritas en el ejemplo anterior, pero, en las amplificaciones de HCV, el incremento, en el producto pretendido, era más evidente que en las amplificaciones de HIV. Una comparación de los resultados, utilizando dos cebadores inmodificados (es decir, no modificados) (ruta 1), con los resultados utilizando un cebador 3'-modificado (rutas 2 y 5) y los resultados utilizando dos cebadores 3'-modificados (ruta 6), indica el hecho de que, se obtuvo un decrecimiento de dímero cebador, utilizando, bien ya sea en uno o bien ya sea en dos cebadores modificados. La utilización de dos cebadores modificados (ruta 6), dio como resultado, en ambos, el mayor decrecimiento en dímero cebador, conjuntamente con un significante incremento en la cantidad de secuencia diana amplificada. Tal y como en el ejemplo anterior, se observó una pequeña diferencia en la reducción de dímero cebador, utilizando un cebador individual 3'-modificado, dependiendo del cual, se modificó el cebador.

Se ve el efecto de la posición del nucleótido modificado, en comparación con las rutas 6-8. Esencialmente, se obtuvieron resultados equivalentes utilizando cebadores modificados en el nucleótido del extremo 3' (nucleótido 3'-terminal) (ruta 6), nucleótido contiguo al nucleótido del extremo 3' (ruta 7) y, el nucleótido tres bases corriente arriba del nucleótido del extremo 3' (ruta 8), era ligeramente inferior.

Ejemplo 7

Estos resultados, indican el hecho de que, el grupo modificador, puede encontrarse unido a cualquiera de los nucleótidos, en el extremo 3' del cebador.

Amplificación utilizando cebadores modificados Efecto del grupo modificador

Con objeto de demostrar adicionalmente el efecto de los cebadores modificados en la formación de dímero cebador, y para demostrar modificaciones alternativas de cebadores, se procedió a llevar a cabo amplificaciones de HCV RNA, utilizando ambos tipos de cebadores, es decir, cebadores modificados y cebadores no modificados, en donde, los cebadores, se modificaron mediante la adición de unos o tres diferentes grupos modificadores: grupos bencilo, nitrobencilo, y metilo.

Los resultados de la amplificación, se analizaron mediante dos métodos diferentes: En un juego de comparaciones, se procedió a ensayar la presencia de dímero cebador, mediante análisis electroforésico de los productos de reacción. En un segundo juego de comparaciones, se procedió a controlar la formación de dímero cebador, durante la amplificación, utilizando los procedimientos de PCR cinética descritos anteriormente, arriba.

Ácido nucleico diana

Amplificación de cebadores

Se procedió a llevar a cabo amplificaciones, utilizando ambos, cebadores no modificados y cebadores modificados. Los cebadores modificados, consistían en las mismas secuencias nucleótidas que los cebadores no modificados, pero, se modificaron en la adenosina del extremo 3' (adenosina 3'-terminal), mediante la adición de un grupo metilo, un grupo bencilo, o un grupo nitrobencilo. Los cebadores, se sintetizaron tal y como se describe en los ejemplos previos, Las designaciones de los cebadores utilizados, se muestran abajo, a continuación.

Cebador	SEQ ID NO	Modificación de la base 3'
ST280A	3	no modificada
ST280AMEA1	3	metilo
ST280ABA1	3	bencilo
ST280ANBA1	3	nitrobencilo

ST778AA	4	no modificada
ST778AAMEA	4	metilo
ST778AABA1	4	bencilo
ST778AANBA1	4	nitrobencilo

Reacciones de amplificación

0,20 ó 200 copias de molde de HCV RNA

50 mM tricina, pH, 8,3;

110 mM KoAc;

3,5 mM Mn(Oac)_{2};

300 \muM de cada uno de los dATC, dCTP, y dGTP;

50 \muM dTTP;

500 \muM dUTP;

250 \muM de cada uno de los cebadores;

10 U rTth*

2U UNG*

13% Glicerol,

13% glicerol,

* fabricado y desarrollado por Hoffmann - La Roche, y comercializado por Perking Elmer, Norwalk, CT.

La ciclación térmica de la amplificación, se realizó en un ciclador térmico del tipo GeneAmp® PCR Systhem 9600 thermal cycler (Perking Elmer, Norwalk, CT), utilizando el siguiente perfil de temperatura:

\vskip1.000000\baselineskip

Incubación de recirculación:	45^{o}C durante 4 minutos;
Transcripción inversa:	60^{o}C, durante 30 minutos;
46 ciclos:	desnaturalización a 94^{o}C durante 30 segundos, reasociación/extensión,
	a 60^{o}C, durante 30 segundos
Extensión final:	60^{o}C, durante 7 minutos
Retención post-reacción:	4^{o}C.

Detección del producto de amplificación A Electroforesis en gel

La presencia de producto amplificado, se detectó mediante electroforesis en gel, de la siguiente forma. Se procedió a fraccionar productos de reacción, utilizando un gel de agarosa (100 ml de NuSieve al 3%, SeaChem al 0,5%, y 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio): y tampón corriente de IX TBE (0,089 M Tris, 0,089 M ácido bórico, 0,0025 M EDTA disódico. Se procedió a llevar a cabo electroforesis, a 100 volt, durante un transcurso de tiempo de aproximadamente 1 hora. Las bandas de DNA, marcadas de color de tinción con bromuro de etidio, se visualizaron utilizando radiación UV.

B Detección mediante PCR cinética

En los procedimientos de PCR cinética descrita anteriormente, arriba, se procedió a intercalar un colorante de intercalación, tal como el bromuro de etidio, el cual tiene una fluorescencia más fuerte cuando, al intercalarse en un DNA de doble hebra, se añade a la PCR. El incremento en DNA de doble hebra, durante la amplificación, se controla mediante métodos de fluorescencia del colorante, durante la reacción. Debido a los procedimientos de PCR cinética, únicamente miden un incremento en la cantidad total de DNA de doble hebra, la formación de producto no específico de ampliación, no se mide de una forma independiente. Con objeto de medir la aparición de amplificaciones no específicas resultantes de dímero cebador, independiente de la amplificación de cebadores, se llevaron a cabo reacciones sin ácido nucleico molde. En tales reacciones exentas de moldes, cualquier incremento en DNA de doble hebra, es atribuible a la formación de producto no específico de amplificación, no independiente del
molde.

Las condiciones de reacción de PCR, son como se describen anteriormente, arriba, excepto en cuanto al hecho de que se añadió bromuro de etidio, a la mezcla de reacción, a una concentración de 1 (g/ml). Las reacciones, se controlaron procediendo a medir la fluorescencia de la mezcla de reacción, tal y como se describe en la patente europea EP 640 828.

Las mediciones de reacción, se normalizaron procediendo a dividir la medición de la fluorescencia inicial obtenida durante un ciclo, temprano, en la reacción, mientras que, las mediciones de fluorescencia entre ciclos, eran relativamente constantes. El número de ciclos elegido para la medición de la fluorescencia inicial, era la misma para todas las reacciones comparadas, de tal forma que, todas las mediciones, representan incrementos relativos al mismo ciclo de reacción. La fluorescencia de la reacción, en reacciones exentas de diana, permanecieron relativamente constantes hasta que se formó dímero cebador. En la mayoría de las reacciones, si llevan a cabo suficientes ciclos de amplificación, el dímero cebador, se convierte en detectable. El efecto de los cebadores modificados, pude verse a partir de una comparación del número de ciclos llevados a cabo, hasta que se haya formado el dímero cebador, si es que se
realiza.

Resultados

Los resultados de la electroforesis en gel, se ven en la figura 3. Los números de ruta correspondientes a cada una de las amplificaciones, la cuales utilizan los grupos no modificados y los tres grupos de cebadores modificados y 200 copias, 20 copias o 0 copias de HCV RNA, se muestran en la tabla que se facilita abajo, a continuación, (números de ruta, se cuentan de izquierda a derecha; las rutas 1-30, se encuentran en la poción superior del gel; las rutas 31-60, se encuentran en la porción del fondo del gel. Adicionalmente a ello, los marcadores de los pesos moleculares, se encontraban presentes en las rutas 1 y 31 (Hae III disgested Phix 174 RF DNA, New England Bioloabs. Beverly, MA), y en las rutas 30 y 60 (Superladder-low [escala inferior], 30 bp lader [escala de 20 pb], bGen Saura, Del-Mar, CA.). Las bandas correspondientes a los productos específicos pretendidos, se indican en la figura, mediante una flecha (\sim230 pb). Las otras bandas, en el gel, corresponden a los productos de amplificación, no específicos y, en particular, a dímero cebador.

Números de ruta de los resultados de amplificación mostrados en la figura 3

\vskip1.000000\baselineskip

6

Los resultados, demuestran el hecho de que, la amplificación en las que se utilizan cebadores modificados, tienen como resultado una cantidad mayor de ácido nucleico HCV amplificado, que las amplificaciones que utilizan los cebadores no modificados. Adicionalmente a ello, la amplificación en la que se utilizan los cebadores modificados, dio como resultado una reducción de dímero cebador, relativo a la amplificación utilizando los cebadores no modificados.

En los ensayos de PCR cinética, la fluorescencia, se gobernó a través de la totalidad de la reacción. La tasa de incremento de la fluorescencia después del incremento en fluorescencia, el cual era detectable, fue aproximadamente el mismo en todas las reacciones, tal y como se evidencia mediante la forma de la curva obtenida procediendo a hacer un registro gráfico de la fluorescencia con respecto al número de ciclos (no mostrado). Esto indica el hecho de que, los cebadores modificados, inhiben la eficacia de cada etapa de amplificación, después de la etapa inicial de amplificación. La reacciones, diferían de una forma significativa en el número de ciclos llevados a cabo, antes de que fuera detectable un incremento en la fluorescencia.

Con objeto de cuantificar la calidad de las diferencias entre las reacciones, los resultados se expresan en términos del número de ciclos de amplificación llevados a cabo, hasta que la fluorescencia excediera de un nivel arbitrario de fluorescencia (AFL). El AFL, se eligió a un valor próximo al nivel de fluorescencia de la línea de base, pero por encima de los márgenes de las fluctuaciones aleatorias en la fluorescencia medida, de tal forma que, la cinética de reacción, se midió durante la fase de crecimiento geométrico de la amplificación. La acumulación del producto de amplificación, en los ciclos más tardíos, inhibe la reacción y conduce eventualmente a una meseta de reacción.

La PCR cinética, se resume en la tabla que se facilita abajo, a continuación. Cada valor, para las amplificaciones de 20 ó 200 copias de molde diana, representa un valor medio de cinco amplificaciones de replicación, con la excepción de amplificaciones en las que se utilizan cebadores bencilados y 20 copias de diana, lo cual representa una media de cuatro replicados. Cada valor, para las amplificaciones sin molde, representan una media de ocho replicados.

Dos, entre los ocho replicados de amplificaciones en los que se utilizó cebadores bencilados, sin diana presente, no dieron como resultado la formación de dímero cebador, al final de los 46 ciclos. Se muestra la media de las seis amplificaciones restantes, la cual representa un valor medio, condicionado en el dímero cebador que se muestra. La media condicional, no es comparable a los otros valores mostrados, debido a los datos suprimidos.

Ciclos de cada AFL Número de copias diana

7

Los datos, indican el hecho de que, los cebadores modificados, retardan, de una forma aparente, la amplificación, de ácido nucleico diana, de tal forma que, la AFL, de alcanza algunos ciclos más tarde. El retraso, no correspondía a una reducción en el rendimiento final del producto de amplificación específico. Se observó que, todas las amplificaciones de ácido nucleico, alcanzaban la meseta dentro de los 46 ciclos, utilizados en el experimento y, tal y como se evidencia mediante los correspondientes datos procedentes del análisis de electroforesis en gel, el rendimiento productivo final, se incrementó, al utilizar los cebadores modificados.

Los datos, indican el hecho de que, el retardo en la formación de dímero cebador, era significativamente más grande que el retardo en la amplificación de la diana. El efecto beneficioso de los cebadores, se ve de una forma más clara, comparando amplificaciones exentas de diana, y amplificaciones con 200 copias de molde. Utilizando cebadores no modificados, el incremento en fluorescencia, al valor de AFL, acontecía únicamente un ciclo más tarde, en amplificaciones sin diana, lo cual indicaba el hecho de que, la amplificación de la diana, sería difícil de distinguir, de la formación de dímero cebador. Como contraste de ello, utilizando cebadores modificados, el incremento de la fluorescencia, debido al dímero cebador, acontecía por lo menos tres ciclos más tarde y, utilizando los cebadores bencilados, acontecía por lo menos 6 ciclos más tarde, si es que ésta acontecía. Así, de esta forma, pudo detectarse la amplificación diana, y distinguirse de la formación de dímero cebador.

Comparando la amplificación exenta de diana, y las amplificaciones con 20 copias de cebador, el efecto de los cebadores modificados, mostraba el mismo patrón de un mayor retraso en la iniciación del dímero cebador, que el retraso en la amplificación de la diana. Utilizando cebadores inmodificados, no se pudieron detectar 20 copias de molde. Utilizando los cebadores de nitrobencilo y de bencilo, la formación de dímero cebador, se retrasó de una forma suficiente, como para capacitar la detección de 20 copias de molde, en este sistema.

Los datos procedentes del control de la fluorescencia, en cada ciclo de amplificación (datos no mostrados), indican el hecho de que, de una forma general, el retraso en la formación de dímero cebador, era suficiente como para evitar el que, la formación de dímero cebador, alcanzara un nivel de meseta, de 46 ciclos. Así, de esta forma, los cebadores modificados, parecían retrasar la formación de dímero cebador, de una forma suficiente, de tal forma que, la amplificación de la diana, pudiera completarse y, la reacción, se parara antes de que se formara un nivel significativo de dímero cebador.

Ejemplo 8 Cebadores foto-lábiles

Para demostrar el uso de modificadores foto-lábiles, se procedió a llevar a cabo amplificaciones de HCV RNA, utilizando ambos tipos de cebadores, cebadores modificados y cebadores inmodificados. Los cebadores modificados, se modificaron mediante la unión de uno o dos grupos nitrobencilo a la amina exocíclica de la adenina 3'-terminal (adenina del extremo 3').

Amplificación de cebadores

Se procedió a sintetizar cebadores, de la forma que se describe en el ejemplo 4. Las designaciones para los cebadores, utilizados, se muestran abajo, a continuación

\vskip1.000000\baselineskip

Cebador	SEQ ID NO	Modificación de la base 3'
ST280A	3	no modificada
15239	3	bis-nitrobencilo
15241	3	mononitrobencilo

ST778AA	4	no modificada
15240	4	bi-nitrobencilo
15242	4	mononitrobencilo

Reacciones de amplificación

Se procedió a llevar a cabo amplificaciones, para cada par de cebadores, utilizando una serie de diluciones de concentración de entrada de diana. Se realizaron dos paneles de reacción, incluyendo cada uno de ellos, todas las combinaciones de par de cebadores, y concentraciones de diana de entrada y, en cada panel de reacción, se procedió a realizar cada reacción por duplicado, conteniendo cada reacción un par de cebadores dado y concentración dada de diana. Las amplificaciones, se llevaron a cabo en reacciones de 100 \mul, las cuales contenían los siguientes reactivos:

0, 10, 10^{2}, 10^{3}, 10^{4}, o 10^{5} copias de molde de HCV RNA

55 mM tricina,

90 mM KOAc,

3 mM Mn(OAc)_{2},

200 \muM de cada uno de los dATC, dCTP, y dGTP;

200 \muM dUTP,

250 \muM de cada uno de los cebadores;

10 U rTth*,

2U UNG* y

8% Glicerol,

Incubación de pre-reacción:	50^{o}C durante 5 minutos;
Transcripción inversa:	60^{o}C, durante 30 minutos;
Desnaturalización inversa:	95^{o}C, durante 1 minuto;
2 ciclos:	desnaturalización a 95^{o}C durante 15 segundos, reasociación/extensión,
	a 60^{o}C, durante 20 segundos;
46 ciclos:	desnaturalización a 90^{o}C durante 15 segundos, reasociación/extensión,
	a 60^{o}C, durante 20 segundos;
Extensión final:	72^{o}C, durante 10 minutos

Se utilizaron tapones de tubos de reacción, pulidos (Perking Elmer, Norwalk, CT), desde el principio hasta el final. Después de que, la temperatura de reacción, hubiera alcanzado los 60ºC, para la etapa de transcripición inversa, se procedió a retirar la tapa calentada, de la bandeja de la PCR, en el bloque del ciclador térmico y, la mitad de los tubos de reacción (un juego completo de reacciones por duplicado), se cubrieron con folio de aluminio. La otra mitad, se iluminó, utilizando una lámpara UV de sostenimiento manual, la cual emitía a 302 nm (modelo de UVP, UVM-57, de la firma UVP Products, San Gabriel, CA), durante un transcurso de tiempo de diez minutos. La tapa calentada, se reemplazó, y se continuó la amplificación.

Resultados

Los resultados de la amplificación, se analizaron mediante electroforesis en gel, tal y como se describe anteriormente, arriba. Los resultados, se ven en la figura 4. El número de copias de los cebadores y moldes utilizados en cada reacción, se indican en el gel (log. del número de copias mostrado). Las bandas correspondientes al producto pretendido, se indican en la figura. Las otras bandas en el gel, corresponden al producto no específico de amplificación y, de una forma particular, dímero cebador.

Una comparación del juego de reacciones irradiado con radiaciones UV, muestra que, el uso de los cebadores modificados, tiene como resultado un significativo decrecimiento de los dímeros cebadores, especialmente, a reducidos números de copias.

Una comparación del juego no irradiado de reacciones, muestra que, el uso de cebadores de bisnitrobencilo, tiene como resultado una inhibición completa de la amplificación, tal y como se esperaba. Las amplificaciones en las que se utilizan cebadores de mononitrobencilo, no únicamente proporcionan el producto, sino que, además, exhiben un significante decrecimiento en dímero cebador, lo cual es consistente con los resultados obtenidos en los ejemplos previos.

Ejemplo 9 Amplificación, utilizando cebadores modificados con p-tert-butilbencilo

Este ejemplo, describe la amplificación de HCV RNA, utilizando cebadores modificados con grupos p-tert.-butilbencilo.

Ácido nucleico diana

Se procedió a sintetizar moldes de HCV RNA, utilizando un vector de transcripción de HCV RNA, tal y como se describe por parte de Young et al. 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4): 882-886.

Cebadores

Se procedió a llevar a cabo amplificaciones, utilizando cebadores modificados, tal y como se describe en el Ejemplo 2, anteriormente facilitado, arriba. Las secuencias nucleótidas de los cebadores no modificados, se muestran posteriormente, abajo, orientadas en la dirección 5' a 3'. Los cebadores utilizados, eran versiones modificadas del cebador corriente arriba ST280A (SEQ ID NO: 3) y del cebador corriente abajo ST778AA (SEQ ID NO: 4). Las formas modificadas de los cebadores, se designan abajo, a continuación, de la forma que sigue:

Cebadores de amplificación de HCV, modificados

Cebador	SEQ ID NO	Posición del nucleótido modificado
ST280ATBU	3	extremo 3'
ST778AATBU	4	extremo 3'

Amplificación y análisis

Las amplificaciones, se llevaron a cabo en reacciones de 100 \mul, las cuales contenían los siguientes reactivos:

20, 5, 2,5, 2 ó 0 copias de molde HCV RNA

55 mM tricina (pH 8,33),

110 mM KOAc,

300 \muM de cada uno de los dATC, dCTP, y dGTP;

50 \muM dTTP,

500 \muM de dUTP,

50 \muM de cada uno de los cebadores,

3,5 mM de Mn(Oac)_{2},

13% Glicerol,

20 unidades de rTrh DNA polimerasa, y

8,0 unidades de UNG*

La ciclación térmica de la amplificación, se realizó en un ciclador térmico para DNA, del tipo TC480 DNA thermal cycler (Perking Elmer, Norwalk, CT), utilizando el siguiente perfil de temperatura:

Incubación de pre-reacción:	45^{o}C durante 12 minutos;
Inactivación UNG	90^{o}C durante 30 segundos
Transcripción inversa:	60^{o}C durante 20 minutos;
47 ciclos:	desnaturalización a 94^{o}C durante 45 segundos, reasociación/extensión,
	a 60^{o}C, durante 70 segundos;
Extensión final:	60^{o}C, durante 7 minutos
Retención de post-reacción:	10^{o}C, hasta análisis (durante un corto transcurso de tiempo)

Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel, tal y como se describe anteriormente, arriba.

Resultados

Las amplificaciones llevadas a cabo en cada número de moldes diana, se replicaron de la siguiente forma: Se procedió a llevar a cabo 3 amplificaciones, utilizando 20 copias de molde diana, se realizaron 3 amplificaciones utilizando 5 copias de molde diana, se realizaron 3 amplificaciones utilizando 2,5 copias de molde diana, se realizó una amplificación utilizando 2 copias de molde diana, y se realizaron 23 amplificaciones sin ninguna diana presente. Todas las amplificaciones positivas de moldes, tuvieron como resultado una banda individual, en el gel, de la medida de diana esperada. Ninguna de las amplificaciones, dio como resultado bien ya fuera un dímero cebador o bien ya fuere otro producto no específico de amplificación.

Los resultados, pueden compararse con aquéllos del ejemplo 6, anteriormente facilitados, arriba, en donde, se amplificó la misma diana de HCV, utilizando las mismas secuencias de cebadores. Una comparación de estos resultados, con los del ejemplo 6, indican el hecho de que, las amplificaciones en las que se utilizan cebadores modificados con p-tert.-butilbencilo, se encontraban significativamente mejoradas, con relación a las correspondientes amplificaciones llevadas a cabo con cebadores no modificados.

Se procedió a llevar a cabo experimentos adicionales, en los cuales, la HIV-1 RNA, se amplificó utilizando versiones de los cebadores p-tert.-butilbencil-modificados, descritos en el ejemplo 5 que se facilita anteriormente, arriba. Las amplificaciones, se llevaron a cabo, esencialmente, de la forma que describe anteriormente, arriba. Tal y como en el sistema de HCV descrito aquí, todas las amplificaciones positivas de moldes de HIV-1, dieron como resultado una banda individual en el gel, del esperado tamaño de diana y, ninguna de las amplificaciones, dio como resultado bien ya fuera dímeros cebadores, u otros productos de amplificación, no específicos.

Los resultados, pueden compararse con aquéllos del ejemplo 5, anteriormente facilitados, arriba, en donde, se amplificó la misma diana de HIV, utilizando las mismas secuencias de cebadores. Una comparación de estos resultados, con los del ejemplo 5, anterior, indican el hecho de que, las amplificaciones en las que se utilizan cebadores modificados con p-tert.-butilbencilo, se encontraban significativamente mejoradas, con relación a las correspondientes amplificaciones llevadas a cabo con cebadores no modificados.

Ejemplo 10 Amplificación de DNA microbacteriano

Este ejemplo, describe una comparación de amplificaciones de DNA microbiana llevado a cabo utilizando cebadores modificados e inmodificados. Se utilizaron ambos cebadores, modificados mediante la adición de un grupo bencilo al nucleótido terminal 3', y cebadores modificados mediante la adición de un grupo p-tert.-butilbencilo, al nucleótido terminal 3'. La reacciones en las que se utilizan cebadores inmodificados, eran esencialmente tal y como se describen en Tevere et al. 1996, J. Clin. Micobriol. 34 (4): 918:923. Se llevaron a cabo las amplificaciones, utilizando muestras de esputo, en el interior de la cuales, se añadió DNA microbacteriano, en una concentración conocida, a muestras clínicas mímicas infectadas. Se procedió a utilizar amplificaciones, utilizando DNA microbacteriano, y utilizando muestras de control exentas de DNA.

Preparación de las muestras

Se procedió a licuar especímenes de esputo, los cuales mostraban que eran negativos, para microbacterias, mediante microscopía y cultivo, y se descontaminaron mediante el procedimiento de N-actil-cisteína-NaOH, recomendado por parte de la CDC (Kent y Kubica, 1985, Public Health Mycrobacteriology, a guide for the level III laboratory, - Microbacteriología de la salud pública -, US Departament of Health and Human Services, Centers for Diseasa Control, Alanta, - Departamento de los EEUU, de servicios de la salud y servicios humanos, Centros para el control de las enfermedades, Atlanta -.

Se procedió a añadir esputo licuado (100 \mul), a 500 \mul de Reactivo de lavado del Espécimen Respiratorio (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, 1% (volumen / volumen) Triton X - 100, 0,05% NaN_{3}, pH 8,0), y se centrifugó durante un tiempo de 10 minutos, a 12.500 x g. Cada gránulo, se resuspendió en 100 \mul de reactivo de lisis (0,05 N NaOH, 1% (volumen / volumen) Triton X - 100, 1 mM EDTA, 0,05% NaN_{3}) y se incubó, durante un tiempo de 45 minutos, a una temperatura de 60ºC. Los lisados, se desnaturalizaron con 100 \mul de reactivo de neutralización (0,2 M Tris - HCl), 8 mM MgCl_{2}, 0,05 NaH_{3}, pH 7,5).

Se generaron lisados de esputo asociados, procediendo a combinar 80 \mul de cada uno de los lisados de esputo por separado. A cada uno de los lisados de esputo asociados (160 \mul de cada uno de ellos), se le añadieron 15 \mul de un pie de DNA (2 copias/\mul, en una mezcla de lisis de 1:1, y neutralización de reactivos), purificados a partir de M. tuberculosis cultivado.

Se procedió a preparar muestras que contenían DNA microbacteriana purificada (no esputo), en una concentración conocida, mediante la adición de 10 \mul de pie de DNA, a 100 \mul de una mezcla de reactivo de lisis y reactivo de neutralización 1:1.

Las muestras negativas de control (no DNA), consistían en una mezcla de 100 \mul de reactivo de lisis, y 100 \mul de reactivos de neutralización.

Cebadores de amplificación

Se procedió a llevar a cabo amplificaciones, utilizando cebadores consistentes en las siguientes secuencias nucleótidas:

Cebadores	Secuencia
KY18 (SEQ ID NO: 5)	5'-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3'
KY436 (SEQ ID NO: 6)	5'-TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA-'3'
KY45 (SEQ ID NO: 7)	5'-GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA-3'

Los siguientes pares de cebadores, los cuales contienen el grupo modificado indicado, unido a la base terminal 3', se utilizaron en la amplificación. Todos los cebadores modificados, se sintetizaron tal y como se describe en los ejemplos anteriores. Todos los cebadores, se biotinilizaron en el extremo 5'.

Par de cebadores	Secuencias del cebador	Modificación
A	KY18 (SEQ ID NO: 5)	inmodificado
	KY75 (SEQ ID NO: 7)	inmodificado

B	KY436 (SEQ ID NO: 6)	bencilo
	KY75 (SEQ ID NO: 7)	bencilo

C	KY436 (SEQ ID NO: 6)	p-tert.-butil-bencilo
	KY75 (SEQ ID NO: 7)	p-tert.-butil-bencilo

Amplificaciones

Para cada muestra, se llevaron a cabo amplificaciones, utilizando el par de cebadores no modificados KY18 (SEQ ID NO: 5) y KY75 (SEQ ID NO: 7), y las formas modificadas del par de cebadores KY436 (SEQ ID NO: 6) y KY75 (SEQ ID NO: 7).

Las amplificaciones, se llevaron a cabo en reacciones de 100 \mul, las cuales contenían, cada una de ellas, 50 \mul de una de las tres muestras descritas anteriormente, arriba, y 50 \mul de una mezcla reactiva 2X, que contenían los siguientes reactivos:

100 mM Tris-HCl, pH 8,9;

500 nM de cada cebador;

200 \muM de (cada uno) (dNTP, dATC, dCTP, dGTP, DutP);

20% (volumen / volumen) Glicerol,

20 unidades de rTrh DNA polimerasa;

10 unidades de AmpliTaq*

6 unidades de Amperase*

* fabricado y desarrollado por Hoffmann - La Roche, y comercializado por Perking Elmer, (Norwalk, CT).

La ciclación térmica de la amplificación, se realizó en un ciclador térmico de PCR, del tipo GeneAmp systeme 9600 thermal cycler (Perking Elmer, Norwalk, CT), utilizando el siguiente perfil de temperatura:

Incubación de pre-reacción:	50^{o}C durante 5 minutos;
2 ciclos:	desnaturalización a 98^{o}C durante 20 segundos, reasociación a a 62^{o}C,
	durante 20 segundos; extensión, a 72^{o}C, durante 45 segundos;
41 ciclos:	desnaturalización a 94^{o}C durante 20 segundos, reasociación a 62^{o}C,
	durante 20 segundos; extensión, a 72^{o}C, durante 45 segundos;
Extensión final:	72^{o}C, durante 12 horas (toda la noche)

Los productos de amplificación se visualizaron, mediante 2% Nusieve®, gel de agorasa al 5%, seguido de marcado de color con bromuro de etidio.

Resultados

Los resultados del análisis de electroforesis, se muestran en la figura 5. Para cada muestra, los productos de amplificaciones realizadas con cebadores no modificados (indicados como "A"), y con cebadores modificados (indicados como "B" y "C"), se llevaron a cabo en rutas contiguas. Las bandas correspondientes a la secuencia diana microbacteriana pretendida, se indican con flechas. Otras bandas, corresponden a productos no específicos de amplificación; las bandas más bajas, en el gel, corresponden a dímero cebador. Las rutas marcadas con "M", contienen un marcador de peso molecular (Digestión Hae III de PhiX174 DNA).

Utilizando los cebadores no modificados, las amplificaciones de DNA microbacteriano purificado, dieron como resultado la formación de dímero cebador. La utilización de cualquiera de los dos cebadores modificados, incrementaba la cantidad de la diana pretendida presente, y eliminaba esencialmente la formación de dímero cebador detectable.

Como contraste a la amplificación de DNA purificado, utilizando los cebadores no modificados, la presencia de lisado de esputo, en la reacción de amplificación, reducía la eficacia e incrementaba la de producto de amplificación, no específico, tal y como se muestra mediante la presencia de bandas extrañas de productos. El incremento de producto de amplificación no específico, no es sorprendente, debido al hecho de que, los lisados de esputo, contienen una significante cantidad de DNA humano. La utilización de cualquiera de los dos pares de cebadores modificados, en amplificaciones llevadas a cabo en presencia de esputo, dieron como resultado, tanto a un significativo incremento e la cantidad de producto generado pretendido, como a la reducción de amplificación no específica.

Ejemplo 11 Síntesis adicional de cebadores modificados con un grupo bencilo

Se procedió a sintetizar cebadores modificados mediante la adición de un grupo bencilo, a una citosina terminal, esencialmente, de la forma que se describe en el ejemplo 1, pero utilizando una N^{4}-acetil, N^{4}-bencil-5'-O-DMT-2'-desoxicitidina acoplada a LCAA-CPG, preparada de la forma que se describe posteriormente, a continuación.

Etapa 1

Síntesis de la N^{4}-bencil-2'-desoxicitidina

Se procedió a añadir bencilamina (20 ml), a hidrocloruro de 2'-desoxicitidina (5,28 g, 20 mmol, U.S. Biochemical Corp. Cleveland, OH) y, la mezcla, se calentó a una temperatura de 150ºC, durante 3 horas, bajo una atmósfera de argón. La solución, se concentró bajo la acción de vacío, para proporcionar un aceite amarillo, viscoso, el cual se distribuyó entre agua (100 ml) y acetato de etilo (100 ml). Las fase acuosa, se lavó con acetato de etilo (100 ml) y se separó. La fase acuosa, se concentró bajo la acción de vacío, para proporcionar un jarabe de color amarillo (13 g), el cual se purificó mediante cromatografía de gel de sílice, con un eluyente consistente en cloruro de metileno : metanol, 15: 1, para proporcionar el producto deseado (5,8 g, 91,5%), como un jarabe incoloro.

Etapa 2

Síntesis de la N^{4}-acetil, N^{4}-bencil-2'-desoxicitidina

Se procedió a disolver N^{4}-bencil-2'-desoxicitidina (2,5 g, 7,9 mmol), en 15 ml de dimetilformamida seca (15 ml), se añadió anhídrido acético (8 g, 79 mmol, 10 equivalentes) y, la mezcla, se agitó durante el transcurso de toda la noche, a la temperatura ambiente. El disolvente y el exceso de anhídrido acético, se evaporaron bajo la acción de vacío. El producto, se purificó mediante cromatografía de columna, con gel de sílice, utilizando, como eluyente, cloruro de metileno : metanol 20 : 1, para proporcionar el compuesto del epígrafe (1,3 g, 48%). El compuesto, era altamente higroscópico, y se almacenó, seco, a una temperatura de -20ºC.

Etapa 3

Síntesis de la N^{4}-acetil, N^{4}-bencil, 5'-O-DMT-2'-desoxicitidina

Se procedió a disolver N^{4}-acetil, N^{4}-bencil-2'-desoxicitidina (76 mg, 0,2 mmol), en 1 ml de piridina seca, y se añadió DMT-Cl (122 mg, 0,2 mmol, 1,0 equivalentes). La mezcla de reacción, se agitó durante 3 horas. El análisis de TLC, mostró que algo del material de partida, había permanecido, de forma que, se procedió a añadir un alícuoto adicional de DMT-Cl (61 mg, 0,5 equivalentes) y, la mezcla resultante, se agitó durante otra hora, después de cuyo transcurso de tiempo, el análisis de TLC, mostró el hecho de que, la reacción, se había completado. La reacción, se extinguió con 15 ml de solución de salmuera y, la fase acuosa, se extrajo con cloruro de metileno (3 X 15 ml). La capa orgánica combinada, se lavó con salmuera (2 x 15 ml) y se secó sobre sulfato magnésico anhidro. El disolvente, se evaporó y, la mezcla, se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, utilizando cloruro de metileno: metanol, 50: 1, para proporcionar N^{4}-acetil, N^{4}-bencil,5'-O-DMT-2'-desoxicitidina (96 mg, 65% de rendimiento productivo).

Etapa 4

Succinilación

Se procedió a disolver la N^{4}-acetil, N^{4}-bencil, 5'-O-DMT-2'-desoxicitidina (96 mg, 0,13 mmol), en 2 ml de piridina seca. Se añadió anhídrido succínico (100 mg, 1,0 mmol) y dimetilaminopiridina (20 mg) y, la mezcla resultante, se agitó a la temperatura ambiente, durante tres días. Se procedió a evaporar el disolvente y, el residuo, se co-evaporó con tolueno (3 X 10 ml). Se añadió cloroformo (50 ml), con objeto de disolver el residuo (se utilizó un tratamiento de sonificación por ultrasonidos, con objeto de ayudar en la disolución). La capa de cloroformo se lavó con salmuera (3 X 15 ml) y agua (1 x 15 ml). La capa orgánica, se secó con sulfato magnésico anhidro. El disolvente, se evaporó, con objeto de proporcionar 108 mg de 3'-O-succinato de N^{4}-acetil, N^{4}-bencil, 5'-O-DMT-2'-desoxicitidina (97% de rendimiento productivo).

Etapa 5

Preparación de 3'-O-succinato N^{4}-acetil, N^{4}-bencil-5'-O-DMT-2'-desoxicitidina acoplado a LCAA-CPG

El CPG activado, se preparó de la siguiente forma: Se procedió a tratar LCAA-CPG (1,0 g, LCA00500C, CPG Inc, Fairfield, NJ), con ácido tricloroacético, en cloruro de metileno (3%, 10 ml) y se mezcló mediante rotación, en un evaporador rotatorio (rotovapor, Buchi, Flawil, Swizerland) (sin vacío), durante 4 horas. Se procedió a filtrar el disolvente y, el CPG, se lavó con trietilamina: etildiisopropilamina (3 X 5 ml), cloruro de metileno (3 X 10 ml) y éter (3 X 10 ml), consecutivamente y, a continuación, se secó bajo la acción de vacío.

El acoplamiento del intermediario nucleósido modificado, al CPG lavado con ácido, se realizó de la siguiente forma. A 1 gramo de LCAA-CPG activado, se le añadió 3'-O-succionato de N^{4}-acetil, N^{4}-bencil-5'-O-DMT-2'-desoxicitidina (108 mmol, 0,13 mmol), preparado de la forma que se ha descrito anteriormente, arriba, dimetilaminopiridina (20 mg), y 5 ml de piridina seca. La mezcla de reacción, se sometió a rotación, en un rotavapor (sin vacío), durante tres días. El sobrenadante, se filtró y, el LCAA-CPG acoplado, se lavó, de una forma secuencial, con piridina (3 X 5 ml), cloruro de metileno (3 x 10 ml), y éter (3 x 10 ml) y, a continuación, se secó al vacío.

El bloqueo del extremo de terminal, con formación de casquete, del 3'-O-succionato de N^{4}-acetil, N^{4}-bencil-5'-O-DMT-2'-desoxicitidina acoplado a LCAA-CPG, se realizo de la siguiente forma: Al CPG derivado, se le añadió un reactivo de mezcla de bloqueo con formación de casquete, A (Capping mix reagent) (THF/Lutidine/Ac_{2}O 8:1:1, Glen Research DNA synthesis reagents, Sterling, VA) y B (10% N-metilimidazol en THF, Glen Research), y la mezcla de reacción, se puso en rotación con un rotavapor (sin vacío), durante el transcurso de toda la noche. La solución, se filtró y, el LCAA-CPG acoplado, se lavó, de una forma secuencial, con piridina (3 X 5 ml), cloruro de metileno (3 x 10 ml), THF (3 x 10 ml) y éter (3 x 10 ml) y, a continuación, se secó al vacío.

La capacidad de acoplamiento del LCAA-CPG derivado, se determinó procediendo a tratar 5 mg del producto, con 3% ácido tricloroacético en cloruro de metileno y, la cantidad de ión dimetoxietilcarbonio liberada, se midió mediante espectografía UV. La cantidad de nucleósido derivado acoplado al LCAA-CPG, se determinó que era de un valor de 19,5 \mumol/g.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE

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(A): NOMBRE: F. HOFFMANN - LA ROCHE AG

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Grenzacherstrasse 124

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(C): CIUDAD: Basle

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: BS

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(E): PAÍS: Suiza

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH - 4070

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(G): TELÉFONO: 061-688 25 11

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: 061-688 13 95

\vskip0.500000\baselineskip

(I): TELEX: 962292/965542 hlr ch

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN : Cebadores modificados

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA DE LECTURA DE LA COMPUTADORA:

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(A): TIPO DE MEDIO: disco Floppy

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(B): COMPUTADORA: Appel Macintosh

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: Sistema 7.1 (Macintosh)

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: Word 5.1

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FECHA DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE SOLICITUD: 60-041127

\vskip0.800000\baselineskip

: FECHA DE REGISTRO: 20. 03. 97

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAATGAGACA CCAGGAATTA GATATCAGTA CAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCTAAATCA GATCCTACAT ATAAGTCATC CA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAAGCACCC TATCAGGCAG TACCACAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACATGCAAG TCGAACGGAA AGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAACACATGC AAGTCGAACG GAAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA : DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ IND NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCGTATCG CCCGCACGCT CACA

\hfill

Claims

1. Un oligonucleótido, el cual tiene la estructura general:

5'---S_{1}---

\uelm{N}{\uelm{\para}{R}}

---3'---

\hskip0,5cm

o

\hskip0,5cm

5'---S_{1}---

\uelm{N}{\uelm{\para}{R}}

---S_{2}---3'

en donde, S_{1}, representa una primera secuencia de nucleótidos entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 nucleótidos de longitud;

R_{1}---

\melm{H}{C}{\uelm{\para}{}}

---R_{2}

en donde, R_{1} y R_{2}, representan, de una forma independiente, un grupo alquilo C_{1}-C_{10}, un grupo alcoxi, un grupo fenilo, un grupo fenoxi, un grupo fenilo sustituido, un grupo naftilo, o un grupo naftilo sustituido.

2. Un oligonucleótido, según la reivindicación 1, en donde, R, es un grupo 2-naftilmetilo; un grupo bencilo; o un grupo bencilo sustituido.

3. Un oligonucleótido, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde, R, es un grupo bencilo sustituido, el cual tiene la estructura:

8

en donde, R_{3}, representa un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, ramificado o lineal, de una forma más preferible, un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, ramificado o lineal, un grupo metoxi, o un grupo nitro.

4. Un oligonucleótido, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde, R_{3}, representa un grupo alquilo C_{1}-C_{4}, ramificado o lineal, un grupo metoxi, o un grupo nitro.

5. Un oligonucleótido, según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde, R_{3}, se encuentra unido en la posición para.

6. Un oligonucleótido, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde, N, es A, G o C.

7. Un oligonucleótido, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde, N, es adenosina.

8. Un oligonucleótido, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde, R, se selecciona de entre el grupo consistente en bencilo, p-metilbencilo, p-tert.-butilbencilo, p-metoxibencilo, o-nitrobencilo y 2-naftilmetilo.

9. Un procedimiento para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, en donde, el citado procedimiento, comprende el llevar a cabo una reacción de amplificación, utilizando por lo menos un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Un procedimiento, según la reivindicación 8, en donde, el citado procedimiento, es la reacción en cadena de la polimerasa.

11. Un equipo, a modo de "kit", para realizar una reacción de amplificación del ácido nucleico, en donde, el citado equipo a modo de "kit", comprende un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.