JPH10279593A - 修飾されたプライマー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来の変性されていないプライマーを用いて
の核酸の増幅は、収率が低く、且つプライマーダイマー
のような汚染物の生成を伴う。 【解決手段】 本発明の変性されたオリゴヌクレオチド
プライマーの使用による増幅は、意図された標的物の収
率を高め、且つ汚染物の形成をも低める。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は分子生物学及び核酸
化学の分野に関する。より詳しくは、本発明は核酸増幅
反応の収率を改良するための方法及び試薬に関する。従
って、本発明は、核酸増幅が用いられるいづれの分野に
も適用される。

【０００２】

【従来の技術】ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の発明
は、核酸配列のインビトロ増幅を可能にした。ＰＣＲ
は、アメリカ特許第４，６８３，１９５号；第４，６８
３，２０２号；及び第４，９６５，１８８号；Saiki な
ど., 1985, Science 230 : 1350-1354; Mullis など.,
1986, Cold Springs Harbor Symp.Quant.Biol. 51: 26
3-273; 及びMullis and Faloona, 1987, Methods Enzy
mol. 155 : 335-350 に記載される。

【０００３】ＰＣＲの開発及び適用は、文献に広範に記
載されている。たとえば、一連のＰＣＲ−関連トピック
スが、PCR Technology-principles and applications f
or DNA amplification, 1989, (ed. H.A.Erlich) Stock
ton Press, New York; PCR Protocols: A guide to met
hods and applications, 1990, (ed. M.A.Innis など.)
Academic Press, San Diego；並びに PCR Strategies,
1995, (ed. M.A. Innisなど）に論じられている。業
者、たとえばPerkin Elmer (Norwalk, CT)は、ＰＣＲ試
薬を市販し、そしてＰＣＲプロトコールを公開してい
る。

【０００４】核酸増幅の最初の公開以来、次のような種
々のプライマーに基づく核酸増幅法が記載されて来た
（但し、それらのみには限定されない）：Ligase Chain
Reaction (LCR, Wu and Wallace, 1989, Genomics
４: 560-569 及びBarany, 1991,Proc.Natl.Acad.Sci. U
SA 88: 189-193); Polymerase Ligase Chain Reaction
(Barany, 1991, PCR Methods and Applic. １: 5-16);
Gap-LCR（ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９０／０１０６
９）；Repair Chain Reaction （ヨーロッパ特許出願番
号第４３９，１８２Ａ２号）、3SR (Kwoh など., 1989,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86: 1173-1177; Guatelli
など., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87: 1874-
1878; ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９２／０８８０Ａ）、
及びNASBA （アメリカ特許第５，１３０，２３８号）。
増幅システムの調査は、Abramson and Myers, 1993, Cu
rrent Opinion in Biotechnology 4: 41-47 に提供され
る。

【０００５】プライマーに基づく増幅反応の特異性は、
プライマーハイブリダイゼーションの特異性に依存す
る。典型的な増幅に使用される高温下で、プライマーは
意図された標的配列に対してのみハイブリダイズする。
しかしながら、増幅反応混合物は典型的には、室温で、
すなわちプライマーハイブリダイゼーション特異性を確
保するために必要とされる温度よりも十分に低い温度で
アセンブルされる。そのような低い緊縮条件下で、プラ
イマーは、他の単に部分的に相補的な核酸配列に対し
て、又は他のプライマーに対して非特異的に結合し、そ
して標的配列と共に増幅され得る不所望の延長生成物の
合成を開始せしめる。非特異的プライマー延長生成物の
増幅は、所望する標的配列の増幅と競争することがで
き、そして所望の配列の増幅の効率を有意に低めること
ができる。

【０００６】１つの頻繁に観察されるタイプの非特異的
増幅生成物は、“プライマーダイマー”として言及され
る、増幅反応の鋳型非依存性人工産物である。プライマ
ーダイマーは、二本鎖フラグメントであり、その長さは
典型的には、２つのプライマーの長さの合計に接近し、
そして１つのプライマーが他のプライマーを超えて延長
される場合に生じると思われる。その得られる連鎖は、
その短い長さのために、効果的に増幅される不所望の鋳
型を形成する。

【０００７】非特異的増幅は、反応の開始の前、プライ
マー延長生成物の形成を減じることによって減じられ得
る。“ホット−スタート”プロトコールとして言及され
る１つの方法においては、必要なハイブリダイゼーショ
ン特異性を提供するのに十分に温度が高められるまで、
１又は複数の決定的な試薬が反応混合物に与えずにおか
れる。この態様において、反応混合物は、反応条件が特
異的プライマーハイブリダイゼーションを保証しない時
間の間は、プライマー延長を支持することはできない。

【０００８】反応管が、初期の高温インキュベーション
段階の後に開放され、そして欠失している試薬が添加さ
れる手動ホット−スタート方法は、労力を要し、そして
反応混合物の汚染の危険性を高める。他方では、感温性
材料、たとえばワックスが、アメリカ特許第５，４１
１，８７６号及びChouなど., 1992, Nucl.Acids Res.20
(7): 1717-1723 に記載されるように、反応成分を分離
し、又は隔離するために使用され得る。それらの方法に
おいては、高温予備反応インキュベーションが感温性材
料を溶融し、それにより、試薬の混合を可能にする。

【０００９】反応の開始の前、プライマー延長生成物の
形成を減じるもう１つの方法は、アメリカ特許第５，３
３８，６７１号に記載されるように、ＤＮＡポリメラー
ゼ特異的抗体によるＤＮＡポリメラーゼの熱可逆的阻害
に依存する。抗体は、抗体−ＤＮＡポリメラーゼ複合体
の形成を可能にするために、反応混合物のアセンブリー
の前、室温で緩衝液中でＤＮＡポリメラーゼと共にイン
キュベートされる。ＤＮＡポリメラーゼ活性の抗体阻害
は、高温予備反応インキュベーションにより不活性化さ
れる。この方法の欠点は、ＤＮＡポリメラーゼに対して
特異的な抗体の製造が高価であり、そして特に多量の製
造の場合、時間の浪費であることである。さらに、反応
混合物への抗体の添加は、増幅反応の改良を必要とす
る。

【００１０】反応の開始の前での延長生成物の形成はま
た、熱可逆的態様でプライマーに非共有結合し、そして
ハイブリダイゼーションを妨げることによってプライマ
ー延長を阻害する、一本鎖結合タンパク質の反応への添
加によっても阻害され得る。非特異的増幅または、アメ
リカ特許第５，４１８，１４９号に記載される方法を用
いて、反応の開始の前に形成される延長生成物を酵素的
に分解することによっても減じられ得る。新しく合成さ
れた延長生成物の分解は、反応混合物中にｄＵＴＰ及び
ＵＮＧを導入し、そして増幅反応を実施する前、４５〜
６０℃で反応混合物をインキュベートすることによって
達成される。

【００１１】プライマー延長は、予備増幅条件下でＵＮ
Ｇにより分解されるウラシル含有ＤＮＡの形成をもたら
す。この方法の欠点は、延長生成物の分解が延長生成物
の形成と競争し、そして非特異的プライマー延長生成物
の排除がたぶん不完全であることである。この方法の利
点は、前の反応からの汚染物として反応混合物中に導入
されるウラシル含有ＤＮＡがまた分解され、そして従っ
て、その方法はまた、前の反応からの増幅された核酸に
よるＰＣＲの汚染の問題を減じることである。

【００１２】当業者の範囲内である、分子生物学及び核
酸化学の従来の技法は、文献において十分に説明されて
いる。たとえば、Sambrookなど., 1989, Molecular Clo
ning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labor
atory, Cold Spring Harbor,New York; Oligonucleotid
e Synthesis (M.J.Gait, ed., 1984); Nucleic AcidHyb
ridization (B.D.Hames and S.J.Higgins, eds., 198
4); 及び一連のMethods in Enzymology (Academic Pres
s, Inc.)を参照のこと。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、核酸配列の
インビトロ増幅のための共有結合により変性されたオリ
ゴヌクレオチドプライマーを供給する。本発明の修飾さ
れたプライマーの使用は、非特異的増幅、特にプライマ
ーダイマー形成の低下、及び／又は修飾されていないプ
ライマーにより実施される増幅に対して意図された標的
物の収量の同時上昇をもたらす。

【００１４】

【課題を解決するための手段】１つの観点において、本
発明は、下記一般構造式：

【化４】

【００１５】〔式中、Ｓ₁ は約５〜約５０個のヌクレオ
チドの長さの第１配列を表わし；Ｓ₂ は１〜３個のヌク
レオチドの長さの第２配列を表わし；Ｎは環外アミンを
含む、プリン又はピリミジン塩基を含むヌクレオチドを
表わし；Ｒはモディファイアー基を表わし、ここでＲは
前記環外アミンを通してＮに共有結合され、そしてＲは
下記構造式：

【００１６】

【化５】

【００１７】（ここで、Ｒ₁ 及びＲ₂ は独立して、水
素、Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル基、アルコキシ基、フェニル
基、フェノキシ基、置換されたフェニル基、ナフチル基
又は置換されたナフチル基を表わす）を有する〕を有す
る、核酸配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライ
マーに関する。アルキル基は枝分れでも又は枝分れでな
くても良い。好ましい態様において、Ｎは修飾された常
用のヌクレオチドであり、この場合、Ｎは修飾されたア
デノシン、シチジン又はグアノシンでありそしてモディ
ファイアー成分はアデニン、グアニン又はシトシン塩基
の環外アミンに共有結合される。より好ましい態様にお
いて、Ｎは修飾されたアデノシンである。好ましい態様
において、Ｒは２−ナフチルメチル基；ベンジル基；又
は置換されたベンジル基である。好ましい置換されたベ
ンジル基は、下記構造式：

【００１８】

【化６】

【００１９】〔式中、Ｒ₃ はＣ₁ −Ｃ₆ の枝分れ鎖又は
直鎖アルキル基、より好ましくはＣ₁−Ｃ₄ の枝分れ鎖
又は直鎖アルキル基、メトキシ基又はニトロ基である〕
を有する。好ましくは、Ｒ₃ はパラ位に結合している。
より好ましい態様においては、Ｒはベンジル、ｐ−メチ
ルベンジル、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル、ｐ−メト
キシベンジル又は２−ナフチルメチル基である。

【００２０】本発明のもう１つの観点は、プライマー延
長の部分的又は完全な阻害をもたらすモディファイアー
基の光不安定共有結合により修飾された増幅プライマー
に関する。光不安定モディファイアーは、上記修飾され
たヌクレオチドにおけるように環外アミン、又は環窒素
のいづれかに結合され得る。１つの態様において、少な
くとも１個のニトロベンジル基が、３′−末端ヌクレオ
チドのアデニン、グアニン又はシトシン塩基の環外アミ
ンに結合される。

【００２１】本発明のもう１つの観点は、一対又は一組
のプライマーであり、ここで前記プライマーの少なくと
も１つは上記のようにして修飾されている。好ましい態
様においては、一対のプライマーの両メンバー又は一組
のプライマーのすべてのメンバーが修飾される。本発明
のもう１つの観点は、本発明の修飾されたプライマーを
用いて増幅反応を実施することを含んで成る、核酸の増
幅方法に関する。

【００２２】本発明のもう１つの観点は、本発明の光不
安定性の修飾されたプライマーを用いて増幅反応を実施
することを含んで成る、標的核酸を増幅するための方法
に関し、ここで前記反応混合物は、モディファイアー基
を除去し、そしてプライマー延長生成物の形成を可能に
するのに十分な光により照射される。本発明の１つの態
様においては、前記照射は、増幅反応の開始の前、但し
反応混合物が約５０℃以上の温度に加熱された後、別の
段階として実施される。他の態様においては、照射段階
は、増幅工程の予備段階、たとえばＲＮＡ増幅反応の逆
転写段階、又はＤＮＡ増幅反応における初期変性段階と
共に組合わされる。

【００２３】本発明のもう１つの観点は、プライマー対
の少なくとも１つが本明細書に記載されるようにして修
飾されている一対のプライマーを含んで成る、核酸配列
のインビトロ増幅のためのキットに関する。本発明のキ
ットはまた、１又は複数の増幅試薬、たとえば核酸ポリ
メラーゼ又はリガーゼ、ヌクレオシド三リン酸、及び適
切な緩衝液を含むことができる。

【００２４】本発明の理解を助けるために、いくつかの
用語が下記に定義される。用語“核酸”及び“オリゴヌ
クレオチド”とは、ポリデオキシリボヌクレオチド（２
−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオ
チド（Ｄ−リボースを含む）、及びプリン又はピリミジ
ン塩基又は修飾されたプリン又はピリミジン塩基のＮ−
グリコシドであるいづれか他のタイプのポリヌクレオチ
ドを意味する。用語“核酸”と“オリゴヌクレオチド”
との間に長さの意図された区別は存在せず、そしてそれ
らの用語は交換可能に使用されるであろう。従って、そ
れらの用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖
及び一本鎖ＲＮＡを包含する。

【００２５】核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチド
に関する用語“常用の”又は“従来の”とは、記載され
るポリヌクレオチドにおいて天然で存在するものを意味
する。ＤＮＡの４種の従来の（主要なとしても言及され
る）デオキシリボヌクレオチドは、プリン塩基アデニン
及びグアニン、及びピリミジン塩基シトシン及びチミジ
ンを含む。ＲＮＡの４種の従来のリボヌクレオチドは、
プリン塩基アデニン及びグアニン、並びにピリミジン塩
基シトシン及びウラシルを含む。上記従来の又は通常の
塩基の他に、まれな又はマイナーな塩基と呼ばれる多く
の他のプリン及びピリミジン誘導体が、いくつかの核酸
において少量で存在する。

【００２６】本明細書において使用される場合、核酸塩
基、ヌクレオシド又はヌクレオチドに関しての用語“異
例な”とは、まれな又はマイナーな核酸塩基、ヌクレオ
シド又はヌクレオチド、及び従来の塩基、ヌクレオシド
又はヌクレオチドの変性体、誘導体又は類似体を意味
し、そして修飾された塩基成分及び／又は修飾された糖
成分を有する合成ヌクレオチドを包含する（Protocols
for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecul
ar Biology, Vol.26, (Sudhir Agrawal, Ed., Humana P
ress, Totowa, NJ, (1994)); 及びOligonucleotides a
nd Analogues, APractical Approach (Fritz Eckstein,
Ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford)
を参照のこと）。

【００２７】オリゴヌクレオチドは、適切な配列のクロ
ーニング及び制限酵素処理、及び直接的な化学合成を包
含するいづれかの適切な方法、たとえばNarangなど., 1
979,Meth.Enzymol. 68: 90-99 のホスホトリエステル
法；Brown など., 1979, Meth.Enzymol. 68: 109-151
のホスホジエステル法；Beaucageなど., 1981 Tetrahed
ron Lett. 22: 1859-1862 のジエチルホスホラミジット
法；及びアメリカ特許第４，４５８，０６６号の固体支
持体法により調製され得る。合成法のレビューは、Good
child, 1990, Bioconjugate Chemistry １(3): 165-187
（引用により本明細書に組込まれる）に提供される。

【００２８】“ワトソン−クリック塩基対合”として当
業界においても言及される用語“塩基の対合”とは、二
本鎖ＤＮＡ構造における相補的塩基対アデニン−チミン
及びグアニン−シトシンの良く知られた水素結合、ＲＮ
Ａ／ＤＮＡハイブリッド分子におけるアデニン−ウラシ
ル及びグアニン−シトシンの良く知られた水素結合、及
び異例なヌクレオチド対の類似する結合を意味する。

【００２９】用語“ハイブリダイゼーション”とは、相
補的塩基対合による、２本の一本鎖核酸による重複構造
（duplex structure）の形成を意味する。ハイブリダイ
ゼーションは、十分な相補的核酸鎖間で、又はミスマッ
チのマイナーな領域を含む“実質的に相補的な”核酸鎖
間で生じることができる。十分な相補的核酸鎖のみがハ
イブリダイズするであろう条件は、“緊縮ハイブリダイ
ゼーション条件”又は“配列−特異的ハイブリダイゼー
ション条件”として言及される。

【００３０】実質的に相補的な配列の適切な重複体（du
plex）は、低い緊縮条件下で達成され得；耐えられるミ
スマッチの程度はハイブリダイゼーション条件の適切な
調節により調整され得る。核酸技術の当業者は、技術的
に提供されるガイドに従って、多くの変数、たとえばオ
リゴヌクレオチドの長さ及び塩基対濃度、イオン強度、
及びミスマッチされた塩基対の発生率を実験的に考慮し
て重複体安定性（duplex stability) を決定することが
できる（たとえば、Sambrookなど., 1989, Molecular C
loning-A Laboratory Manual, Cold Spring Horbor Lab
oratory, ColdSpring Harbor, New York; 及びWetmur,
1991, Critical Review in Biochem.and Mol.Biol. 26
(3/4): 227-259 を参照のこと）。

【００３１】用語“プライマー”とは、核酸鎖に対して
相補的なプライマー延長生成物の合成が誘発される条件
下で、すなわち適切な緩衝液における４種の異なったヌ
クレオシド三リン酸及び延長のための剤（たとえばＤＮ
Ａポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下で及び適切な
温度で、ＤＮＡ合成の開始の点として作用することがで
きるオリゴヌクレオチドを意味する。本明細書において
使用される場合、用語“プライマー”は、連結（liyati
on）介在の増幅工程に使用されるオリゴヌクレオチドを
包含するよう意図され、ここで１つのオリゴヌクレオチ
ドは隣接する位置でハイブリダイズする第２のオリゴヌ
クレオチドへの連結により“拡張される”。従って、用
語“プライマー延長”とは、本明細書において使用され
る場合、ＤＮＡ合成の開始の点としてプライマーを用い
ての個々のヌクレオシド三リン酸の重合、及び拡張され
た生成物を形成するために２つのプライマーの連結を言
及する。

【００３２】プライマーは好ましくは、一本鎖ＤＮＡで
ある。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図さ
れた使用に依存するが、しかし典型的には６〜５０個の
ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般
的に、鋳型と共に十分に安定したハイブリッド複合体を
形成するために、より低い温度を必要とする。プライマ
ーは鋳型核酸の正確な配列に影響を及ぼす必要はない
が、しかし鋳型とハイブリダイズするために十分に相補
的であるべきである。与えられた標的配列の増幅のため
の適切なプライマーの企画は、当業界において良く知ら
れており、そして本明細書に引用される文献に記載され
る。

【００３３】プライマーは、ＤＮＡ合成の開始の点とし
て作用するプライマーの検出又は固定を可能にするが、
しかし前記プライマーの基本的性質を変えない追加の特
徴を組込むことができる。たとえば、プライマーは、標
的核酸にハイブリダイズしないが、しかし増幅された生
成物のクローニングを促進する５′−末端に追加の核酸
配列を含むことができる。ハイブリダイズする鋳型に対
して十分に相補的であるプライマーの領域は、ハイブリ
ダイズする領域として本明細書において言及される。用
語“標的物”、“標的配列”、“標的領域”、及び“標
的核酸”とは、増幅されるべき核酸の領域又は配列を意
味する。

【００３４】本明細書で使用される場合、プライマー配
列と標的配列との間に存在するミスマッチの数がプライ
マー配列とサンプルに存在するかも知れない非標的配列
との間に存在するミスマッチの数よりも少ない場合、プ
ライマーは標的配列に対して“特異的”である。安定し
た複合体が、存在するミスマッチの数がプライマー配列
と標的配列との間に存在するミスマッチの数よりも多く
ない場合のみ形成されるハイブリダイゼーション条件が
選択され得る。そのような条件下で、プライマーは標的
配列とのみ安定した複合体を形成することができる。従
って、適切に緊縮した増幅条件下での標的特異的プライ
マーの使用は、標的プライマー結合部位を含むそれらの
標的配列の特異的増幅を可能にする。配列特異的増幅条
件の使用は、正確に相補的なプライマー結合部位を含む
それらの標的配列の特異的増幅を可能にする。

【００３５】用語“非特異的増幅”とは、標的配列以外
の配列に対してハイブリダイズし、そして次に、プライ
マー延長のための基質として作用するプライマーに起因
する標的配列以外の核酸配列の増幅を言及する。非標的
配列へのプライマーのハイブリダイゼーションは、“非
特異的ハイブリダイゼーション”として言及され、そし
て低温で減じられた緊縮性の予備増幅状態の間、生じる
ことができる。

【００３６】用語“プライマーダイマー”とは、もう１
つのプライマーが鋳型として作用するプライマー延長に
起因する鋳型−非依存性非特異的増幅生成物を意味す
る。プライマーダイマーはときおり、２つのプライマー
のコンカテマー、すなわちダイマーであるように思える
が、２つよりも多くのプライマーのコンカテマーもまた
生じる。用語“プライマーダイマー”とは、一般的に本
明細書においては、鋳型−非依存性非特異的増幅生成物
を包含するよう使用される。

【００３７】用語“反応混合物”とは、与えられた反応
を実施するのに必要な試薬を含む溶液を意味する。増幅
反応を実施するのに必要な試薬を含む溶液として言及さ
れる“増幅反応混合物”は典型的には、適切な緩衝液
中、オリゴヌクレオチドプライマー及びＤＮＡポリメラ
ーゼ又はリガーゼを含む。“ＰＣＲ反応混合物”は典型
的には、適切な緩衝液中、オリゴヌクレオチドプライマ
ー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及び二価
の金属カチオンを含む。反応混合物は、それが反応を可
能にするために必要なすべての試薬を含む場合、完全と
して言及され、そしてそれがサブセットの必要な試薬の
みを含む場合、不完全として言及される。

【００３８】反応成分が、便利さ、貯蔵安定性のため
に、又は成分濃度の適用−依存性調節を可能にするため
に、サブセットの全成分をそれぞれ含む別々の溶液とし
て通常貯蔵され、そして反応成分が完全な反応混合物を
作り出すために反応の前に組合されることは、当業者に
より理解されるであろう。さらに、反応成分が商品化の
ために別々に包装され、そして有用な商業用キットが本
発明の修飾されたプライマーを含むいづれかのサブセッ
トの反応成分を含むことができることは、当業者により
理解されるであろう。

【００３９】修飾されたプライマー 本発明の増幅プライマーは、そのプライマーの３′−末
端で４種のヌクレオチドのうち１つへの基の共有結合に
より修飾される。１つの態様においては、本発明の修飾
されたプライマーは、下記一般構造式：

【００４０】

【化７】

【００４１】〔式中、Ｓ₁ は約５〜約５０個のヌクレオ
チドの長さの第１配列を表わし；Ｓ₂ は１〜３個のヌク
レオチドの長さの第２配列を表わし；Ｎは環外アミンを
含む、プリン又はピリミジン塩基を含むヌクレオチドを
表わし；Ｒはモディファイアー基を表わし、ここでＲは
前記環外アミンを通してＮに共有結合され、そしてＲは
下記構造式を有する〕を有する核酸配列から成る。例に
示されるように、修飾の効果は、その修飾が３′−末端
ヌクレオチドに対してである場合、最大化される。従っ
て、好ましくは、プライマーは修飾された３′−末端ヌ
クレオチドを含む。

【００４２】修飾されたヌクレオチドは、塩基がその相
補的ヌクレオチドとのヌクレオチドの塩基対合に関与す
る環外アミンを含むものから選択される。典型的には、
プライマーは、従来のヌクレオチドのみを含むＤＮＡで
ある。ＤＮＡに見出される４種の従来のヌクレオチド塩
基のうち、アデニン、グアニン及びシトシンは、相補的
塩基との塩基対合に関与する環外の第一アミンを含む。
本発明の好ましい態様においては、プライマーは、環外
アミンへの単一のモディファイアー基の結合により、す
なわち修飾されていない塩基においては塩基対合に関与
することができる、アミン基の２つの水素原子の１つを
置換することによって修飾される。それぞれ、修飾され
たアデニン、グアニン及びシトシン塩基を含む修飾され
たヌクレオチドの構造は、下記に示される：

【００４３】

【化８】

【００４４】ここで、Ｓは糖成分を表わし、そしてＲは
モディファイアー基を表わす。本発明は、従来のヌクレ
オチドから成るプライマーに限定されない。塩基成分が
相補的塩基との塩基対合に関与する環外第一アミンを含
むいづれかのヌクレオチド類似体は、本明細書に記載さ
れるように修飾可能である。異例なヌクレオチドの例と
して、３−メチルアデニン、７−メチルグアニン、３−
メチルグアニン、５−メチルシトシン及び５−ヒドロキ
シメチルシトシンを挙げることができる。

【００４５】モディファイアー基は、そのモディファイ
アー基が１つの水素原子を置換するので、修飾された塩
基が水素結合形成に関与する能力を制限する。残る水素
原子はまだ、水素結合形成に関与することができる。従
って、モディファイアーは、ハイブリダイゼーションの
動力学及び熱力学の両者に影響を及ぼすことができる。
次の性質を有する種々のモディファイアー基が想定され
る： １．相補的塩基と修飾された塩基とのワトソン−クリッ
ク塩基対合を妨害するが、しかし回避せず； ２．修飾されたプライマーの拡張を妨害するが、しかし
回避せず；そして ３．修飾されたプライマーの延長生成物に対して相補的
な鎖の合成を可能にする。

【００４６】モディファイアー基は、塩基対合形成を及
び従って、プライマー延長を立体的に妨害する。従っ
て、モディファイアーの物理的容量がハイブリダイゼー
ションの妨害の程度に影響を及ぼす。修飾されたアデノ
シン又はシチジンヌクレオチドが二本鎖核酸中に組込ま
れる場合、モディファイアー基は主要溝の中央空間中に
突出する。従って、比較的大きなモディファイアー基で
さえ、複合構造体の立体不安定性をほとんど引き起こさ
ない。しかしながら、適切なモディファイアーは、水素
結合が妨げられ、又はプライマーの３′−ヒドロキシル
の酵素的拡張が妨げられるほど大きくない。修飾された
グアノシンヌクレオチドが二本鎖核酸中に組込まれる場
合、モディファイアー基がマイナーな溝中に突出し、こ
れがモディファイアー基の大部分を収容する空間をほと
んど提供しない。従って、より小さなモディファイアー
基が、グアニン塩基への結合のためには好ましい。

【００４７】続く増幅サイクルにおいて鋳型として使用
されるプライマー延長生成物は、プライマーにより導入
される修飾された塩基を含む。鋳型における修飾された
塩基の存在がプライマー延長の終結、又はプライマー延
長の阻害を引き起こさないようなモディファイアー基が
選択される。好ましくは、モディファイアー基の性質
は、突然変異誘発現象を生ぜしめるべきではなく、それ
により、修飾された塩基の同一性がプライマー誘導鋳型
の複製に対して効果を及ぼさない。プライマー延長に対
する鋳型における修飾された塩基の効果は、本明細書及
び当業界において提供されるガイドに従って、通常試験
され得る（たとえば、Gniazdowski and Cera, 1996, Ch
em.Rev. 96: 619-634 を参照のこと）。上記性質を満た
すモディファイアー基Ｒは、本発明の方法への使用のた
めに適切である。好ましいモディファイアー基は、下記
構造式：

【００４８】

【化９】

【００４９】〔式中、Ｒ₁ 及びＲ₂ は独立して、水素原
子、Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル基、アルコキシ基、フェニル
基、フェノキシ基、置換されたフェニル基、ナフチル
基、又は置換されたナフチル基を表わす〕を有する。ア
ルキル基は、枝分れ鎖でも又は直鎖でもあり得る。少な
くともＣ₂₀までの大きなアルキル基もまた、使用され得
る。好ましい態様において、Ｒは２−ナフチルメチル
基；ベンジル基；又は置換されたベンジル基である。好
ましい置換されたベンジル基は、下記構造式：

【００５０】

【化１０】

【００５１】〔式中、Ｒ₃ はＣ₁ −Ｃ₆ の枝分れ鎖又は
直鎖アルキル基、より好ましくは、Ｃ₁ −Ｃ₄ の枝分れ
鎖又は直鎖アルキル基、メトキシ基又はニトロ基を表わ
す〕を有する。Ｃ₁ −Ｃ₄ の枝分れ鎖又は直鎖アルキル
基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピ
ル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル及び同様のものであ
る。メチル及びｔｅｒｔ−ブチルは、好ましいアルキル
基である。好ましくは、Ｒ₃ は、パラ位置で結合され
る。特に好ましいモディファイアー基Ｒは、下記に示さ
れる：

【００５２】

【化１１】

【００５３】多くの特定のモディファイアー基が実施例
に記載されている。一般的に、記載される化合物の種類
からの特に適切なモディファイアー基の経験的な選択
は、本明細書に提供されるガイドに従って、当業者によ
り通常、実施され得る。好ましくは、特定の基の適合性
は、増幅反応において修飾されたプライマーを用いるこ
とによって経験的に決定される。好結果をもたらす増幅
は、修飾された塩基がプライマー延長をまったく阻害せ
ず、そしてプライマー誘導鋳型における修飾された塩基
がプライマー延長の終結を引き起こさないことを示す。
プライマーダイマーの低下は、例に記載されるようにし
て決定される。

【００５４】光不安定変性を有するプライマー 本発明の他の態様においては、プライマーは、反応が特
異性を確かめる高温反応条件を達成した後、光への暴露
により除去され得る１又は複数の光不安定基により修飾
される。モディファイアーはプライマー延長の前に除去
されるので、修飾されたプライマーは、その基の除去の
前、拡張できる必要はない。本発明の方法に使用され得
る光不安定モディファイアーの例は、Pillai, 1980, "P
hotoremovable Protecting Groups in Organic Synthes
is", Synthesis: 1-26に記載される。好ましくは、本発
明の光不安定プライマーは、次の１又は２つのｏ−ニト
ロベンジル基の結合により３′−末端ヌクレオチドにお
いて修飾される：

【００５５】

【化１２】

【００５６】塩基成分の環外第一アミンへの単一のニト
ロベンジル基の結合により修飾されたプライマーにおい
ては、得られる第二アミンは、残る水素原子が相補的塩
基の方に配向されるようアミン基が回転される場合、塩
基対合化にまだ関与することができる。実施例に記載さ
れるように、それらのプライマーは、ＵＶ光による照射
による除去を伴って又は伴わないで増幅において使用さ
れ得る。

【００５７】塩基の環外アミンへの２つのニトロベンジ
ル基の結合により修飾されたプライマーは、延長され得
ない。この阻害はたぶん、環外アミンの両水素原子が多
くのニトロベンジル基により置換されるので排除され
る、塩基対合化を受ける修飾された塩基の無能性に起因
する。反応混合物がニトロベンジル基を除去するのに十
分な時間、ＵＶ光に暴露され、それによりプライマー延
長の発生を可能にする増幅への２つのニトロベンジル基
により修飾されたプライマーの使用は、実施例に記載さ
れている。

【００５８】他の態様において、モディファイアー基は
環窒素に結合される。塩基の環窒素へのニトロベンジル
基の結合により修飾されたプライマーは、塩基対合形成
を受ける修飾された塩基の無能性のために拡張され得な
い。ＵＶ光への暴露によるニトロベンジル基の除去は、
プライマー延長の発生を可能にする。モディファイアー
基が除去されるまで、拡張され得ない光不安定プライマ
ーの使用は、実質的に“ホット−スタート”増幅を提供
する。プライマー延長は、非特異的な予備反応状態の
間、阻害される。反応が照射され、そしてプライマー
は、反応温度が反応特異性を確保する温度に高められた
後でのみ、ブロック解除される。

【００５９】修飾されたプライマーの合成 修飾されたプライマーの合成は、当業界において良く知
られている標準の化学的手段を用いて実施される。それ
らのモディファイアーの導入のための方法は次の４つの
種類に分けられ得る： １．モディファイアーがＤＮＡ合成支持体としての修飾
されたヌクレオチドの使用により導入され得る。 ２．モディファイアーがホスホラミジットとしての修飾
されたヌクレオチドの使用により導入され得る。 ３．モディファイアーが、ＤＮＡ合成の間、試薬の使用
により導入され得る。（たとえば、ＤＮＡ配列中に組込
まれる場合、転換できるアミジットのベンジルアミン処
理）。 ４．後−合成変性。モディファイアーが、合成ＤＮＡに
より接触される場合、反応性試薬として導入され得る。

【００６０】特定の修飾されたプライマーの合成は実施
例に記載されている。追加の修飾されたプライマーは、
類似する態様における標準的合成法を用いて合成され得
る。好ましくは、修飾されたプライマーは、誘導体化さ
れた、調節された多孔性ガラス（ＣＰＧ）合成支持体を
用いて合成される。誘導体化されたｄＡ ＣＰＧの合成
のための一般的な反応スケムは、図６に示される。特定
のモディファイアー基は、適切なアルキル−ハロゲン化
物、ベンジル−ハロゲン化物、置換されたベンジルハロ
ゲン化物、メチルナフチル−ハロゲン化物又は置換され
たメチルナフチル−ハロゲン化物アルキル化剤の使用に
より付加され得る。ベンジル−及びｐ−ｔｅｒｔ−ブチ
ルベンジル−ｄＡ ＣＰＧの合成は、例１及び２に記載
されており、そして図６に示されるスケムに従がう。

【００６１】環外アミノ基のアルキル化は、Griffin an
d Reese, 1963, Biochim.Acta 68:185-192 に記載され
るメチル化に類似する方法を用いて実施され得る。追加
の合成法は、Aritoma など., 1995, J.Chem.Soc.Perkin
Trans. １: 1837-1849 に記載される。

【００６２】修飾されたプライマーを用いての増幅 本発明の方法は、本発明の修飾されたプライマーを用い
てプライマーに基づく増幅を実施することを含んで成
る。一般的に、修飾されたプライマーが、増幅反応条件
下で変化を伴わないで、プライマーに基づく増幅におけ
る同じヌクレオチド配列を含む修飾されていないプライ
マーにより置換され得る。もちろん、当業者は、反応状
態の通常のマイナーな再最適化がいくつかの反応におい
て有益であり得ることを認識するであろう。

【００６３】好ましい態様においては、本発明の修飾さ
れたプライマーがポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）におい
て使用される。しかしながら、本発明は、いづれかの特
定の増幅システムに制限されない。本発明の修飾された
プライマーは、プライマーダイマー又は非特異的増幅生
成物が形成され得るいづれかのプライマーに基づく増幅
システムにおいて使用され得る。例としては、上記に引
用される文献に記載される増幅方法を挙げることができ
る。他のシステムが開発されるにつれて、それらのシス
テムは本発明の実施のためになり得る。

【００６４】本発明の方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡのいづ
れかの増幅のために適切である。たとえば、逆転写／ポ
リメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてのＲＮＡの
増幅は、当業界において良く知られており、そしてアメ
リカ特許第５，３２２，７７０号及び第５，３１０，６
５２号、Myers and Gelfand, 1991, Biochemistry 30(3
1): 7661-7666, Young など., 1993, J.Clin.Microbio
l. 31 (4): 882-886及びMulderなど., 1994, J.Clin.M
icrobiol. 32 (2): 292-300 に記載されている。

【００６５】プライマーに基づく増幅においては、プラ
イマー延長は典型的には、熱安定性酵素、たとえば熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて高温で実施される。酵
素は、プライマーの３′−末端での合成を開始せしめ、
そして合成が終結するまで、鋳型の５′−末端の方向に
進行する。増幅反応に有用な精製された熱安定性ＤＮＡ
ポリメラーゼは、当業界において良く知られており、そ
してアメリカ特許第４，８８９，８１８号；第５，０７
９，３５２号；第５，３５２，６００号；第５，４９
１，０８６号；ＷＯ９１／０９９５０；ＷＯ９２／０３
５５６；ＷＯ９２／０６２００；ＷＯ９２／０６２０
２；ＷＯ９２／０９６８９；及びアメリカ特許第５，２
１０，０３６号に記載される酵素を包含するが、但しそ
れらだけには限定されない。熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼのレビューは、Abramson, 1995, PCR Strategies, (e
d. M.A.Innisなど.), pp39-57, Academic Press, San D
iegoに提供されている。

【００６６】好ましい態様において、特にＤＮＡの増幅
のためには、増幅は上記のように可逆的に不活性化され
た酵素を用いて実施される。高温反応条件下で再活性化
される可逆的に不活性化された酵素の使用はさらに、反
応の開始の前、プライマー延長を阻害することによって
非特異的増幅を減じる。Hoffmann-La Roche (Nutley,NJ
）により開発、製造され、そしてPerkin Elmer (Norwa
lk, CT ）により市販される、可逆的に不活性化された
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Birch など.,1996, Na
ture 381 (6581): 445-446 に記載されている。

【００６７】プライマーを拡張する酵素の能力に対する
モディファイアー基の効果は、一部、その使用される特
定の酵素、及び一部、その選択される反応条件に依存す
る。たとえば、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼは、あるＲ
ＮＡ増幅におけるように、Ｍｇ²⁺よりもむしろＭｎ²⁺が
二価カチオンとして使用される場合、より許容される。
当業者は、適切なモディファイアー基の通常の選択にお
いて、酵素及び反応条件が考慮されるであろうことを認
識するであろう。

【００６８】増幅反応のために適切なサンプル調製方法
は、当業界において良く知られており、そして本明細書
に引用される文献に十分に記載される。その使用される
特定の方法は、本発明の決定的な部分ではない。当業者
は、既知のサンプル調製方法による使用のための反応条
件を最適化することができる。増幅された核酸を分析す
るための方法は、当業界において良く知られており、そ
して本明細書に引用される文献に十分に記載される。そ
の使用される特定の方法は、本発明の決定的な部分では
ない。当業者は、その用途に依存して、適切な分析方法
を選択することができる。

【００６９】増幅反応を分析するための好ましい方法
は、Higuchi など., 1992, Bio/Technology 10: 413-41
7; Higuchiなど., 1993, Bio/Technology 11: 1026-103
0; ヨーロッパ特許出願公開第５１２，３３４号及び第
６４０，８２８号に記載されるように、反応混合物にお
ける二本鎖ＤＮＡの合計量の上昇をモニターすることに
よってである。“運動ＰＣＲ”として言及されるこの方
法においては、二本鎖ＤＮＡの検出は、臭化エチジウム
（ＥｔＢｒ）及び他のＤＮＡ結合ラベルが、二本鎖ＤＮ
Ａに結合される場合に示す高められた螢光に依存する。
増幅は、ラベルの存在下で実施される。標的配列の合成
に起因する二本鎖ＤＮＡの上昇は、増幅の間モニターさ
れる、螢光の検出できる上昇をもたらす。従って、前記
方法は、増幅反応の進行をモニターリングを可能にす
る。

【００７０】カイネティックＰＣＲにおいては、測定さ
れた螢光は、非特異的増幅に又は標的配列の増幅に起因
したとしてもいづれにせよ、存在する二本鎖ＤＮＡの合
計量に依存する。螢光のモニターリングは、二本鎖ＤＮ
Ａの合計量の上昇の測定を可能にするが、しかし標的配
列の増幅に起因する上昇は非特異的増幅生成物に起因す
る上昇とは無関係には測定されない。本発明の修飾され
たプライマーは、それらが形成されるプライマーダイマ
ーの量を減じるのみならず、また検出できる量のプライ
マーダイマーの形成を遅延せしめるので、運動ＰＣＲに
おいて特に有用である。標的配列の有意な上昇が生じた
後までのプライマーダイマー形成の遅延は、標的配列の
増幅の独立したモニターリングを可能にし、そしてプラ
イマーダイマーからの妨害を最少にする。

【００７１】キット 本発明はまた、本発明を実施するための有用な成分を含
んで成るキット、すなわち複数容器単位にも関する。有
用なキットは、核酸増幅のためのプライマーを含み、こ
の少なくとも１つは本明細書に記載されているように修
飾されている。キットの他の任意の成分は、たとえばプ
ライマー延長生成物の合成を触媒する剤、基質ヌクレオ
チド三リン酸、適切な反応緩衝液、及び本発明の方法を
実施するための説明書を包含する。下記に示される本発
明の例は、例示目的のためにのみ提供され、そして本発
明の範囲を制限するものではない。請求の範囲内の本発
明の多くの態様は、前述のもの及び続く例を読むことか
ら当業者に明らかになるであろう。

【００７２】

【実施例】例１．ベンジル基により修飾されたプライマーの合成 ベンジル基の付加により修飾されたプライマーを、下記
２種の方法の１つにより合成した。３′−末端塩基で修
飾されたプライマーを、Ｎ⁶ −ベンジルデオキシアデノ
シン調節多孔性ガラス（ＣＰＧ）を用いて合成し、ＤＮ
Ａ合成を開始せしめた。内部塩基で修飾されたプライマ
ーを、Ｎ⁶ −ベンジルデオキシアデノシンホスホラミジ
ットを用いて合成した。

【００７３】次の標準略語を例に使用する： ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド ＴＥＡ：トリエチルアミン ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩 ＴＨＦ：テトラヒドロフラン ＤＭＴ：４，４′−ジメトキシトリチル ＬＣＡＡ−ＣＰＧ：長鎖アルキルアミノ調節多孔性ガラ
ス

【００７４】Ｉ．Ｎ⁶ −ベンジルデオキシアデノシンＣ
ＰＧの合成 段階１：Ｎ⁶ −ベンゾイル、Ｎ⁶ −ベンジル、５′−Ｏ
−ＤＭＴ−２′−デオキシアデノシンの合成 Ｎ⁶ −ベンゾイル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシ
トリチル）−２′−デオキシアデノシン（６５７mg、
１．０ｍモル；Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI
）に、ピリジン（１０ml）を添加し、そしてその混合
物を真空下での蒸発により乾燥せしめた。これをくり返
した。

【００７５】得られる発泡体を、無水ＤＭＦ（１５ml；
Aldrich Chemical Co., Milwaukee,WI ）に溶解し、そ
して５℃に冷却した。水素化ナトリウム（４４mg、１．
１ｍモル、１．１当量、油中、６０％分散液）をアルゴ
ン雰囲気下で添加し、そして４５分間、室温で撹拌し
た。ベンジルブロミド（１４３μｌ、２０６mg、１．２
ｍモル、１．２当量；Aldrich Chemical Co., Milwauke
e, WI ）を２分間にわたって添加し、そしてその混合物
を室温で一晩撹拌した。その混合物を真空下での蒸発に
より乾燥せしめそして残留物を酢酸エチルと水（それぞ
れ１０ml）との間に分け、そして抽出した。

【００７６】水性相を酢酸エチル（１０ml）により再抽
出し、そして組合された抽出物を無水硫酸マグネシウム
上で乾燥せしめ、濾過し、そして蒸発した。粗生成物
を、メタノール、トリエチルアミン、塩化メチレン
（３：０．５：９６．５）を用いて、シリカゲル（７５
ｇ）上でのカラムクロマトグラフィーにより精製した。
生成物を含む画分を組合し、そして蒸発により乾燥せし
め、予測されるＮ⁶ −ベンゾイル、Ｎ⁶ −ベンジル、
５′−Ｏ−ＤＭＴ−２′−デオキシアデノシン（４１０
mg、５４％）を得た。生成物の構造をＮＭＲにより確認
した。

【００７７】段階２：スクシニル化 Ｎ⁶ −ベンゾイル，Ｎ⁶ −ベンジル，５′−Ｏ−ＤＭＴ
−２′−デオキシアデノシン（２９５mg、０．３９ｍモ
ル）に、ピリジン（１０ml）を添加し、そしてその混合
物を高い真空下での蒸発により乾燥せしめた。この段階
をくり返した。新鮮な無水ピリジン（１０ml）を、無水
琥珀酸（２００mg、２ｍモル、５．０当量）及びＤＭＡ
Ｐ（２４mg）と共に添加し、そしてその溶液を室温で一
晩、アルゴン雰囲気下で撹拌した。

【００７８】多量の溶媒を真空下で除去し、そして残留
物を塩化メチレン（２０ml）とクエン酸ナトリウム溶液
（２０ml、０．１Ｍ、pH５．０）との間に分け、そして
抽出した。水性相をさらに塩化メチレン（２０ml）によ
り抽出し、そして組合された抽出物を無水硫酸ナトリウ
ム上で乾燥せしめ、濾過し、そして蒸発により乾燥せし
めた。生成物を、酢酸エチル、トリエチルアミン、塩化
メチレン（３２：１：６７）を用いて、シリカゲル
（４．５ｇ）上でのカラムクロマトグラフィーにより精
製し、予測される３′−スクシネートエステル、Ｎ⁶ −
ベンゾイル−Ｎ⁶ −ベンジル−３′−Ｏ−スクシネート
−５′−Ｏ−ＤＭＴ−２′−デオキシアデノシン（２４
７mg、７４％）を得た。

【００７９】段階３：ＣＰＧの誘導体化 酸洗浄されたＣＰＧを次のようにして調製した。ＬＣＡ
Ａ−ＣＰＧ（１．０ｇ、ＬＣＡ００５００Ｃ、５００オ
ングストローム、８８．６モル／ｇ；CPG Inc., Fairfi
eld, NJ ）を、室温で２０分間にわたって、定期的にか
きまぜながら、ジクロロメタン（２％、２０ml）中、ジ
クロロ酢酸により洗浄した。酸洗浄されたＣＰＧをガラ
スフリット上で濾過し、そして酢が遊離するまで、ジク
ロロメタンにより洗浄した。粉末を空気乾燥せしめ、次
に室温で一晩、真空下で乾燥せしめた。

【００８０】酸洗浄されたＣＰＧへの修飾されたヌクレ
オシド中間体の結合化を、次のようにして行なった。ジ
クロロメタン（１０ml）中、上記のようにして調製され
たＮ⁶ −ベンゾイル−Ｎ⁶ −ベンジル−３′−Ｏ−スク
シネート−５′−Ｏ−ＤＭＴ−２′−デオキシアデノシ
ン（１７０mg、０．２ｍモル）の溶液に、ＴＥＡ（１０
０μｌ）を添加し、そしてその溶液をアルゴン雰囲気下
で約５mlに濃縮した。ＤＭＡＰ（１２mg、０．１ｍモ
ル、０．５当量）、ＴＥＡ（１００μｌ）、ＥＤＣ（３
８４mg、２．０ｍモル、１０当量）及び上記からの酸洗
浄されたＣＰＧを、次々と添加した。無水ピリジン（５
ml）を添加し、そしてその混合物を密封し、そして室温
で３日間、振盪した。ＣＰＧを真空下で濾過し、そして
イソプロパノール、次にジクロロメタンにより広範に洗
浄し、空気乾燥せしめ、次に真空下で１時間、乾燥せし
めた。

【００８１】誘導体化されたＣＰＧのキャッピングを次
のようにして行なった。乾燥誘導体化されたＣＰＧに、
Ｃａｐ Ａ及びＣａｐ Ｂ溶液（それぞれ５ml、無水酢
酸／２，６−ルチジン／ＴＨＦ及びＴＨＦ中、１０％
Ｎ−メチルイミダゾール；Glen Research DNA synthesi
s reagents, Sterling, VA）を添加し、そしてその混合
物を室温で４時間、振盪した。ＣＰＧを真空下で濾過
し、そしてイソプロパノール、次にジクロロメタンによ
り広範に洗浄し、空気乾燥せしめ、次に真空下で一晩、
乾燥せしめた。

【００８２】II．Ｎ⁶ −ベンジルデオキシアデノシンホ
スホラミジットの合成 Ｎ⁶ −ベンゾイル，Ｎ⁶ −ベンジル，５′−Ｏ−ＤＭＴ
−２′−デオキシアデノシンを、上記のように合成し
た。無水ＴＨＦ（８ml）中、Ｎ⁶ −ベンゾイル、Ｎ⁶ −
ベンジル、５′−Ｏ−ＤＭＴ−２′−デオキシアデノシ
ン（１９６mg、０．２６ｍモル）に、ジイソプロピルエ
チルアミン（３５０μｌ、２７０mg、２．０４ｍモル、
７．８当量）及び２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロ
ピルクロロホスホラミジット（１６１mg、０．６８ｍモ
ル、２．６当量；Aldrich Chemical Co., Milwaukee, W
I ）を添加し、そしてその混合物を室温で３０分間、ア
ルゴン雰囲気下で撹拌した。

【００８３】溶媒を真空下で除去し、そして残留物を炭
酸水素ナトリウム（５％、２０ml）と酢酸エチル（２０
ml）との間に分けた。有機相を、炭酸水素溶液、水及び
飽和ブライン（それぞれ２０ml）により次々に洗浄し、
硫酸ナトリウム上で乾燥せしめ、濾過し、そして蒸発し
た。残留物を、アセトン／ヘキサン／ＴＥＡ（３４：６
５：０．７）を用いて、シリカゲル（４ｇ）上でのカラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、所望するホスホラ
ミジット（２４８mg、１００％）を得た。

【００８４】III ．ＤＮＡ合成、精製及び分析 ベンジル誘導体化されたアデノシンＣＰＧ（２５mg、
１．０モル）を、空の合成カラム（Glen Research, Ste
rling, VA ）中に移し、そしてそれらを；従来の合成及
び保護解除条件を用いてＡＢＩ３Ｄ４ＤＮＡ合成機（Pe
rkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster Ci
ty, CA）上でオリゴヌクレオチドを製造するために使用
した。粗ＤＭＴ−ＤＮＡを精製し、そしてRainin HPLC
システム（Rainin Instrument Co., Woburn, MA ）上で
Rainin Pure-DNA カラムを用いて、標準のDMT On／Off
HPLCにより５′−ヒドロキシ−ＤＮＡに転換した。

【００８５】オリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ細管電気泳
動システム（Perkin Elmer, Applied Biosystems Divis
ion, Foster City, CA）を用いて、又はDionex Nucleop
akカラム（Dionex Corp, Sunnyvale, CA）上での変性ア
ニオン交換ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより分析し
た。同様にして、内部修飾されたプライマーの合成を、
修飾されていないＣＰＧ、及び上記のようにして合成さ
れた、修飾されたホスホラミジットを用いて実施した。

【００８６】例２．ｔ−ブチル−ベンジル基により修飾
されたプライマーの合成 この例は、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル基により３′
末端アデノシンで修飾されたプライマーの合成を記載す
る。この修飾されたプライマーを例１に実質的に記載さ
れるようにして合成したが、但し、Ｎ⁶ −（ｐ−ｔｅｒ
ｔ−ブチルベンジル）デオキシアデノシンＣＰＧを用い
た。誘導体化されたＣＰＧの合成は下記に記載される。

【００８７】段階１：Ｎ⁶ −ベンゾイル−Ｎ⁶ −（ｐ−
ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）−５′−Ｏ−（４，４′−
ジメトキシトリチル）−２′−デオキシアデノシンの合
成 Ｎ⁶ −ベンゾイル−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシ
トリチル）−２′−デオキシアデノシン（６５８mg、
１．０ｍモル）に、ＤＭＦ（無水、１０ml）を添加し、
そして蒸発乾燥せしめた。これをくり返した。新鮮なＤ
ＭＦ（１０ml）をアルゴン雰囲気下で添加した。水素化
ナトリウム（４４mg、油中６０％、１．１ｍモル）を添
加し、そしてその混合物を室温で０．５時間、撹拌し
た。４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ベンジルブロミド（２７
２mg、１．２ｍモル）を滴下し、そして室温で一晩、撹
拌した。

【００８８】溶媒を真空下で除去し、そして残留物を酢
酸エチルと水（それぞれ２０ml）との間に分けた。有機
相を水（３度、２０ml）により洗浄し、無水硫酸マグネ
シウム上で乾燥せしめ、濾過し、そして蒸発乾燥せしめ
た。粗生成物中、塩化メチレン：メタノール：トリエチ
ルアミン（９６．５：３：０．５）を用いてシリカゲル
上でのカラムクロマトグラフィーにより精製し、Ｎ⁶ −
ベンゾイル−Ｎ⁶ −（ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）
−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′
−デオキシアデノシン（２２９mg、２８．５％）を得
た。

【００８９】段階２：スクシニル化 Ｎ⁶ −ベンゾイル−Ｎ⁶ −（ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベン
ジル）−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）
−２′−デオキシアデノシン（２１７mg、０．２７ｍモ
ル）を、ピリジン（１０ml）中、無水琥珀酸（１３５m
g、５当量）及びＤＭＡＰ（１７mg、０．５当量）によ
り処理した。上記例１に記載のようにして処理し、そし
てクロマトグラフィー処理し、Ｎ⁶ −ベンゾイル−Ｎ⁶
−（ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）−５′−Ｏ−
（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシア
デノシン、３′−Ｏ−スクシネート（１９９mg、８２
％）を得た。

【００９０】段階３：ＣＰＧの誘導体化 上記段階２からのスクシネート（１８０mg、０．２ｍモ
ル）を、例１に記載されるようにして、酸洗浄されたＬ
ＣＡＡ−ＣＰＧにより処理した。ＣＰＧをキャップし、
そして真空乾燥せしめ、Ｎ⁶ −ベンゾイル−Ｎ⁶ −（ｐ
−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル）−５′−Ｏ−（４，４′
−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシアデノシン、
３′−Ｏ−スクシネート誘導体化ＣＧＰ（１．０６５
ｇ）を得た。

【００９１】例３．メチル基により修飾されたプライマ
ーの合成 メチル基により３′末端アデノシンで修飾されたプライ
マーを、Ｎ⁶ −メチルｄＡ ＣＰＧ（２２mg、１μモ
ル、Glen Research, Sterling, VA ）を用いて合成し
た。Ｎ⁶ −メチルｄＡ ＣＰＧを空の合成カラムに配置
し、そしてプライマーを、合成及び保護解除の標準条件
に従って製造した。プライマーを、例１に記載されるよ
うなDMT On／Off HPLC方法を用いて精製した。

【００９２】例４．光不安定性変性プライマーの合成 この例は、１又は複数のニトロベンジル基により３′末
端アデノシンで修飾されたプライマーの合成を記載す
る。修飾されたプライマーを、例１に実質的に記載され
るようにして合成したが、但し、モノニトロベンジルｄ
Ａ ＣＰＧ又はビス−ニトロベンジルｄＡ ＣＰＧのい
づれかを用いた。

【００９３】Ｉ．モノニトロベンジル化されたプライマ
ー Ｎ⁶ −ベンゾイル−Ｎ⁶ −ベンジル−２′−デオキシア
デノシン誘導体化ＣＰＧ（例１を参照のこと）の合成の
ための一般的な方法を、アルキル化剤としてのオルト−
ニトロベンジルブロミドの置換により、Ｎ⁶ −ベンゾイ
ル−Ｎ⁶ −オルト−ニトロベンジル−２′−デオキシア
デノシン誘導体化ＣＰＧの合成に適用した。ＣＰＧにつ
いての続く段階は、例１に記載される段階と同一である
が、但し、さらに、中間体をアルミ箔に反応フラスコを
包装することにより周囲光から保護した。

【００９４】誘導体化されたＣＰＧの合成に続いて、プ
ライマーを例１に記載のようにして合成したが、但し、
製造業者により記載されるようなプロトコールを用い
て、Nensorb Prep使い捨てカラム（NEN Research Produ
cts Biotechnology Systems, Du Pont Co, Boston MA）
による固相抽出により単離した。

【００９５】II．ビス−ニトロベンジル化されたプライ
マー ビス−ニトロベンジルデオキシアデノシンＣＰＧを下記
のようにして合成した。誘導体化されたＣＰＧの合成に
続いて、プライマーを、モノニトロベンジルプライマー
について記載されるようにして、合成し、そして精製し
た。

【００９６】段階１：５′−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ⁶ −ビス−
オルト−ニトロベンジル−２′−デオキシアデノシンの
合成 ２′−デオキシアデノシン−水和物（５３８mg、２．０
ｍモル、Aldrich Chemical, Milwaukee, WI ）を無水ピ
リジン（２度、１０ml）により洗浄し、そして真空下で
蒸発乾燥せしめた。残留物をアルゴン雰囲気下で無水Ｄ
ＭＦ（１０ml、Aldrich, Milwaukee, WI）に溶解し、そ
して水素化ナトリウム（８８mg、２．２ｍモル、１．１
当量、油中、６０％分散液）を添加し、そして室温で４
０分間、撹拌した。

【００９７】２−ニトロベンジルブロミド（７１０mg、
３．３ｍモル、１．５当量）を添加し、そしてその溶液
を室温で４時間、撹拌した。ＤＭＦを真空下での蒸発に
より除去し、そして残留物を酢酸エチルと水（それぞれ
２０ml）との間に分けた。水性相を酢酸エチル（２０m
l）により抽出し、そして組合された抽出物を水（２０m
l）により洗浄し、そして硫酸マグネシウム上で乾燥せ
しめ、濾過し、そして蒸発した。粗生成物を、シリカゲ
ル（５０ｇ、ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 中、３％ ＭｅＯＨを用い
て）上でのカラムクロマトグラフィーにより精製し、
２′−デオキシ−Ｎ⁶−ビス−オルト−ニトロベンジル
アデノシン（３２０mg、３０％）を得た。

【００９８】２′−デオキシ−Ｎ⁶ −ビス−オルト−ニ
トロベンジルアデノシン（２００mg、０．５１８ｍモ
ル）に、無水ピリジン（１０ml）を添加し、そして蒸発
乾燥せしめた。ピリジン（１０ml）、続いて４，４′−
ジメトキシトリチルクロリド（９００mg、２．３ｍモ
ル、４．５当量）及びトリエチルアミン（２８０mg、
２．７６ｍモル、４．０当量）を添加し、そして室温で
５時間アルゴン雰囲気下で撹拌した。水（０．５ml）を
添加し、そして２０分間、撹拌した。

【００９９】その混合物を、エーテルと水（それぞれ２
０ml）との間に分け、そして水性相をエーテル（２０m
l）により再抽出した。抽出物を組合し、そして水（２
０ml）により洗浄し、そして無水硫酸ナトリウム上で乾
燥せしめ、濾過し、そして蒸発せしめた。生成物をシリ
カゲル（４ｇ、塩化メチレン中、０．７〜２．５％メタ
ノールを用いて）上でクロマトグラフィーにより精製
し、５′−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ⁶ −ビス−オルト−ニトロベ
ンジル−２′−デオキシアデノシン（１２１mg、３３
％）を得た。

【０１００】段階２：スクシニル化 ５′−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ⁶ −ビス−オルト−ニトロベンジ
ル−２′−デオキシアデノシン（１２１mg、０．１４５
ｍモル）を、無水ピリジン（２度、３ml）による蒸発に
より乾燥せしめた。ピリジン（３ml）、無水琥珀酸（５
８mg、０．５８ｍモル、４当量）及びＤＭＡＰ（１１m
g、触媒）を添加し、そしてその溶液を室温で３日間、
撹拌せしめた。

【０１０１】その溶液を真空下で蒸発し、そして残留物
を、塩化メチレン（１０ml）とクエン酸ナトリウム緩衝
液（０．１Ｍ、pH５．０、１０ml）との間に分けた。有
機相を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥せしめ、濾過し、
そして蒸発乾燥せしめた。粗生成物を、シリカゲル上で
クロマトグラフィーにより精製し（２ｇ、ＥｔＯＡｃ：
ＣＨ₂ Ｃｌ₂ ：ＴＥＡ、３２：６７：１（１０ml）、次
にＭｅＯＨ：ＣＨ₂ Ｃｌ₂ 、３：９７、２５mlを用い
る）、淡黄色の発泡体５′−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ⁶ −ビス−
オルソ−ニトロ−ニトロベンジル−２′−デオキシアデ
ノシン−３′−Ｏ−スクシネート（１３８mg、９９．５
％）を得た。

【０１０２】段階３：ＣＰＧの誘導体化 酸洗浄されたＬＣＡＡ−ＣＰＧを例１におけるようにし
て調製した。酸洗浄されたＣＰＧへの修飾されたヌクレ
オシド中間体の結合化を、次のようにして行なった。
５′−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ⁶ −ビス−オルト−ニトロベンジ
ル−２′−デオキシアデノシン−３′−Ｏ−スクシネー
ト（３７mg、０．０４ｍモル）を、琥珀色のガラスバイ
アルにおいてＴＥＡ（１６ml）により処理し、そして蒸
発した。

【０１０３】この残留物に、無水ピリジン（１．５m
l）、ＴＥＡ（２ml）、ＤＭＡＰ（２．４mg）、ＥＤＣ
（７６mg、０．０４ｍモル）及び酸洗浄されたＬＣＡＡ
−ＣＰＧ（２００mg）を添加し、そしてその混合物を室
温で３日間、オービタルミキサー上で振盪した。ＣＰＧ
を減圧下で濾過し、そしてイソプロパノール、次に塩化
メチレンにより広範に洗浄し、空気乾燥せしめ、次に真
空下で１時間、乾燥せしめた。誘導体化されたＣＰＧの
キャッピングを、例１に記載のようにして実施した。

【０１０４】例５．修飾されたプライマーを用いての増
幅−修飾されたヌクレオチドの位置の効果 プライマーダイマーの形成に対する修飾されたプライマ
ーの効果を示すために、修飾されたプライマー及び修飾
されていないプライマーの両者を用いて、ＨＩＶ−１
ＲＮＡの増幅の比較を行なった。さらに、プライマーダ
イマーの低下に対する修飾されたヌクレオチドの位置の
効果を評価するために、増幅を、修飾された塩基の位置
においてのみ異なる、３種の異なった上流の修飾された
プライマーを用いて行なった。

【０１０５】標的核酸 ＨＩＶ−１ ＲＮＡ鋳型を、Mulderなど., 1994, J.Cli
n.Microbiol. 32 (2):292-300に実質的に記載されるよ
うにしてＨＩＶ−１ ＲＮＡ転写ベクターを用いて合成
した。

【０１０６】プライマー 増幅を、修飾されていないプライマー及び修飾されたプ
ライマーの両者を用いて実施した。修飾されていないプ
ライマーのヌクレオチド配列は下記に示されており、こ
こでそれらは５′側から３′側の方向に配向されてい
る。上流プライマーＲＡＲ１０３２ＭＢ（配列番号１）
及び下流プライマーＲＡＲ１０３３ＭＢ（配列番号２）
は、ＨＩＶ−１対照株ＨＸＢ２（Gen Bank受託番号Ｋ０
３４５５）のヌクレオチド位置２９５６〜３１３０に対
応する１７５塩基対生成物を増幅する。

【０１０７】

【表１】

【０１０８】上記プライマーは、修飾されていないプラ
イマーを言及する。修飾されていないプライマーを５′
端でビオチニル化した。修飾されていないプライマーと
同じヌクレオチド配列から成るが、しかし３′末端位置
で、又はその３′末端位置の１又は３個のヌクレオチド
上流位置でベンジル化されたアデノシンを含む修飾され
たプライマーを、例１に記載のようにして合成した。プ
ライマーの修飾された形は次のように本明細書において
命名される：

【０１０９】

【表２】

【０１１０】増幅 増幅を、次の試薬を含む１００μｌの反応において行な
った：１００コピーのＨＩＶ鋳型ＲＮＡ、５０mMのトリ
シン（pH８．３３）、１１０mMのＫＯＡｃ、それぞれ３
００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、５０μＭ
のｄＴＴＰ、５００μＭのｄＵＴＰ、５０μＭの個々の
プライマー、３．５mMのＭｎ（ＯＡｃ）₂ 、１３％グリ
セロール、２０単位のＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼ^* 、
及び２０単位のＵＮＧ^**。^* ：アメリカ特許第５，４５５，１７０号に記載され
る。^** ：Hoffmann-La Roche により製造開発され、そしてPe
rkin Elmer, Norwalk, CT により市販される。

【０１１１】増幅温度循環を、次の温度プロフィールを
用いて、ＴＣ４８０ ＤＮＡ熱サイクラー（Perkin Elm
er, Norwalk, CT ）において実施した： 予備反応インキュベーション：４５℃で４分間 逆転写：６０℃で２０分間 ４６サイクル：９４℃で４５秒間の変性、６０℃で４５
秒間のアニーリング／延長 最終延長：６０℃で７分間 後−反応維持：分析まで１０℃（短時間）

【０１１２】増幅された生成物の検出 増幅された生成物の存在を次の通りにゲル電気泳動によ
り検出した。反応生成物を、アガロースゲル（３％ Ｎ
ｕＳｉｅｖｅ及び０．５％ ＳｅａＣｈｅｍの溶液１０
０ml）及び１×ＴＢＥ（０．０８９Ｍのトリス、０．０
８９Ｍの硼酸、０．００２５Ｍの二ナトリウムＥＤＴ
Ａ）ランニング緩衝液を用いて分別した。臭化エチジウ
ム（０．５μｇ／ml）を添加し、存在するＤＮＡを染色
した。電気泳動を約１時間１００ボルトで行なった。Ｄ
ＮＡの臭化エチジウム−染色バンドを、ＵＶ照射を用い
て可視化した。

【０１１３】結果 ゲル電気泳動分析の結果は図１に見られる。修飾されて
いないプライマー及び修飾されたプライマーの組合せを
用いての個々の増幅に対応するレーン番号が下記に示さ
れる。意図されるＨＩＶ生成物に対応するバンドは矢印
により図に示される。ゲル中の他のバンドは、非特異的
増幅生成物及び特に、プライマーダイマーに対応する。

【０１１４】

【表３】

【０１１５】プライマーダイマーの形成は意図された増
幅生成物の形成と競争するので、プライマーダイマーの
低下は典型的には、形成される意図された生成物の量の
同時上昇をもたらす。従って、修飾されたプライマーの
効果は、修飾されていないプライマーを用いて形成され
る量に対する形成されるプライマーダイマーの量を比較
することにより、及び修飾されていないプライマーを用
いて形成される量に対する形成される意図される標的物
の量を比較することにより見出され得る。

【０１１６】単一の３′−修飾されたプライマーを用い
ての結果（レーン２及び５）及び２種の３′−修飾され
たプライマーを用いての結果（レーン６）に対する２種
の修飾されていないプライマーを用いての結果（レーン
１）の比較は、プライマーダイマーの低下が、１又は２
種の修飾されたプライマーを用いて得られたことを示唆
する。単一の３′−修飾されたプライマーを用いての増
幅においては、プライマーの変性に依存する、プライマ
ーダイマーの低下における小さな差異が見出された。２
種の修飾されたプライマー（レーン６）の使用は、プラ
イマーダイマーの最大の低下及び増幅された標的配列の
量の検出できる上昇をもたらす。

【０１１７】修飾されたヌクレオチドの位置の効果は、
レーン６〜８の比較に見出される。３′末端ヌクレオチ
ドに隣接するヌクレオチドで修飾されたプライマーを用
いて得られたプライマーダイマーの低下（レーン７）
は、３′末端ヌクレオチドで修飾されたプライマーを用
いて得られたプライマーダイマーの低下に等しく、そし
て３′末端ヌクレオチドの３個の塩基の上流のヌクレオ
チドで修飾されたプライマーを用いて得られた改良性
（レーン８）はわずかに低かった。

【０１１８】例６．修飾されたプライマーを用いての追
加の増幅−修飾されたヌクレオチドの位置の効果 プライマーダイマーの形成に対する修飾されたプライマ
ーの効果をさらに示すために、実質的に上記のようにし
て修飾されたプライマー及び修飾されていないプライマ
ーの両者を用いて、ＨＣＶ ＲＮＡの増幅の比較を行な
った。増幅は、修飾された塩基の位置においてのみ異な
る３種の異なった修飾された下流プライマーを用いて行
なわれた。

【０１１９】標的核酸 ＨＣＶ ＲＮＡ鋳型を、Young など., 1993, J.Clim.Mi
crobiol. 31 (4): 882-886に記載されるようなＨＣＶ
ＲＮＡ転写ベクターを用いて合成した。プライマー 増幅を、修飾されていないプライマー及び修飾されたプ
ライマーの両者を用いて実施した。修飾されていないプ
ライマーのヌクレオチド配列は下記に示されており、こ
こでそれらは５′側から３′側の方向に配向されてい
る。上流プライマーＳＴ２８０Ａ（配列番号３）及び下
流プライマーＳＴ７７８ＡＡ（配列番号４）は、ＨＣＶ
ゲノムの５′未翻訳領域からの２４０個の塩基対生成物
を増幅する。

【０１２０】

【表４】

【０１２１】上記プライマーは、修飾されていないプラ
イマーを言及する。修飾されていないプライマーと同じ
ヌクレオチド配列から成るが、しかし３′末端位置で、
又はその３′末端位置の１又は３個のヌクレオチド上流
位置でベンジル化されたアデノシンを含む修飾されたプ
ライマーを、例１に記載のようにして合成した。プライ
マーの修飾された形は次のように本明細書において命名
される：

【０１２２】

【表５】

【０１２３】増幅及び分析 増幅を例３に実質的に記載されるようにして実施した。
但し、１００コピーのＨＣＶ ＲＮＡ鋳型を用いた。増
幅された生成物のゲル分析を、例３に記載のようにして
行なった。

【０１２４】結果 ゲル電気泳動分析の結果は図２に見られる。修飾されて
いないプライマー及び修飾されたプライマーの組合せを
用いての個々の増幅に対応するレーン番号が下記に示さ
れる。意図されるＨＣＶ生成物に対応するバンドは矢印
により図に示される。ゲル中の他のバンドは、非特異的
増幅生成物及び特に、プライマーダイマーに対応する。

【０１２５】

【表６】

【０１２６】プライマーダイマーの形成は意図された増
幅生成物の形成と競争するので、プライマーダイマーの
低下は典型的には、形成される意図された生成物の量の
同時上昇をもたらす。従って、修飾されたプライマーの
効果は、修飾されていないプライマーを用いて形成され
る量に対する形成されるプライマーダイマーの量を比較
することにより、及び修飾されていないプライマーを用
いて形成される量に対する形成される意図される標的物
の量を比較することにより見出され得る。

【０１２７】得られる結果は、前の例に記載されるＨＩ
Ｖ増幅から得られたそれらの結果に類似するが、しかし
ＨＣＶ増幅においては、意図された生成物の上昇は、Ｈ
ＩＶ増幅におけるよりも、より明白であった。単一の
３′−修飾されたプライマーを用いての結果（レーン２
及び５）及び２種の３′−修飾されたプライマーを用い
ての結果（レーン６）に対する２種の修飾されていない
プライマーを用いての結果（レーン１）の比較は、プラ
イマーダイマーの低下が、１又は２種の修飾されたプラ
イマーを用いて得られたことを示唆する。２種の修飾さ
れたプライマー（レーン６）の使用は、プライマーダイ
マーの最大の低下及び増幅された標的配列の量の有意な
上昇をもたらす。前記の例におけると同様に、どのプラ
イマーが修飾されたかに依存する単一の３′−末端修飾
プライマーを用いる増幅において、プライマーダイマー
の減少の小さな差が見られた。

【０１２８】修飾されたヌクレオチドの位置の効果は、
レーン６へ８の比較に見出される。３′末端ヌクレオチ
ド（レーン６）、３′末端ヌクレオチドに隣接するヌク
レオチド（レーン７）及び３′末端ヌクレオチドの３塩
基上流のヌクレオチド（レーン８）で修飾されたプライ
マーを用いて得られた結果は、実質的に同一であった。
それらの結果は、モディファイアー基がプライマーの
３′端で４個のヌクレオチドのいづれかに結合され得る
ことを示唆する。

【０１２９】例７．修飾されたプライマーを用いての増
幅−モディファイアー基の効果 プライマーダイマーの形成に対する修飾されたプライマ
ーの効果をさらに示すために、及び他のプライマー変性
を示すために、修飾されたプライマー及び修飾されてい
ないプライマーの両者を用いてのＨＣＶ ＲＮＡの増幅
の比較を行ない、ここで前記プライマーは、３種の異な
ったモディファイアー基：ベンジル、ニトロベンジル及
びメチル基のうち１つの基の付加により修飾された。増
幅結果は、２種の異なった方法により分析された。一組
の比較においては、プライマーダイマーの存在を、反応
生成物のゲル電気泳動分析によりアッセイした。第２組
の比較においては、プライマーダイマーの形成を、上記
の動力ＰＣＲ法を用いて増幅の間モニターした。

【０１３０】標的核酸 ＨＣＶ ＲＮＡ鋳型を、Young など., 1993, J.Clin.Mi
crobiol. 31 (4): 882-886に記載されるようにＨＣＶ
ＲＮＡ転写ベクターを用いて合成した。増幅プライマー 増幅を、修飾されていないプライマー及び修飾されたプ
ライマーの両者を用いて実施した。修飾されたプライマ
ーは、修飾されていないプライマーと同じヌクレオチド
配列から成るが、しかしメチル基、ベンジル基又はニト
ロベンジル基の付加により３′末端アデノシンで修飾さ
れた。プライマーは、前の例に記載されるようにして合
成された。使用されるプライマーの名称は下記に示され
る。

【０１３１】

【表７】

【０１３２】増幅反応 増幅を次の試薬を含む１００μｌ反応において実施し
た：０，２０、又は２００コピーのＨＣＶ ＲＮＡ鋳
型、５０mMのトリシン、pH８．３、１１０mMのＫＯＡ
ｃ、３．５mMのＭｎ（ＯＡｃ）₂ 、３００μＭの個々の
ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、５０μＭのｄＴＴＰ、
５００μＭのｄＵＴＰ、２５０nMの個々のプライマー、
２０ＵのｒＴｔｈ^* 、２ＵのＵＮＧ^* 、及び１３％グリ
セロール^* ：Hoffmann-La Roche により製造開発され、そしてPe
rkin Elmer, Norwalk, CT により市販されている。

【０１３３】個々の反応混合物の熱循環を、次の温度プ
ロフィールを用いて、Gene Amp（登録商標）PCR System
9600 熱サイクラー（Perkin Elmer, Norwalk, CT ）に
おいて実施した： 予備反応インキュベーション：４５℃で４分間 逆転写：６０℃で２４分間 ４６サイクル：９４℃で３０秒間の変性、６０℃で３０
秒間のアニーリング／延長 最終拡張：６０℃で７分間 後−反応維持：４℃

【０１３４】増幅された生成物の検出 Ａ．ゲル電気泳動 修飾された生成物の存在を、次のようにしてゲル電気泳
動により検出した。反応生成物を、アガロースゲル（３
％ ＮｕＳｉｅｖｅ、０．５％ ＳｅａＣｈｅｍ及び
０．５μｇ／mlの臭化エチジウムの溶液１００ml）及び
１×ＴＢＥ（０．０８９Ｍのトリス、０．０８９Ｍの硼
酸、０．００２５Ｍの二ナトリウムＥＤＴＡ）ランニン
グ緩衝液を用いて分別した。電気泳動を約１時間、１０
０ボルトで行なった。ＤＮＡの臭化エチジウム−染色バ
ンドを、ＵＶ照射を用いて可視化した。

【０１３５】Ｂ．動力ＰＣＲによる検出 上記の動力ＰＣＲ法においては、入り込む色素、例え
ば、二本鎖ＤＮＡ中に入り込まれる場合、より強く螢光
を発する臭化エチジウムがＰＣＲに添加される。増幅の
間、二本鎖ＤＮＡにおけるその上昇を、反応の間、色素
の螢光を測定することによってモニターした。動力ＰＣ
Ｒ法は二本鎖ＤＮＡの合計量の上昇を単に測定するの
で、非特異的増幅生成物の形成は独立しては測定されな
い。

【０１３６】鋳型増幅に無関係なプライマーダイマーに
起因する非特異的増幅の発生を測定するために、反応
を、鋳型核酸を伴わないで実施した。そのような鋳型−
フリーの反応においては、二本鎖ＤＮＡにおけるいづれ
かの上昇は、鋳型には無関係の非特異的増幅生成物の形
成に帰する。カイネティックＰＣＲ反応条件は上記の通
りであるが、但し、臭化エチジウムが１mg／mlの濃度で
反応混合物に添加された。反応は、ヨーロッパ特許第６
４０８２８号に記載されるように反応混合物の螢光を測
定することによってモニターされた。

【０１３７】螢光測定を、サイクル間の螢光測定は比較
的一定に保ちながら、反応における初期サイクルの間に
得られた初期螢光測定により割り算することによって標
準化した。初期螢光測定のために選択されるサイクル数
は、比較されるすべての反応のために同じであり、その
結果、すべての測定は、同じ反応サイクルに関する上昇
を表わす。標的物フリーの反応における反応螢光は、プ
ライマーダイマーが形成するまで、比較的一定して存続
した。ほとんどの反応において、十分な増幅サイクルが
実施される場合、プライマーダイマーは結果的に、検出
可能になる。修飾されたプライマーの効果は、プライマ
ーダイマーが形成されるまで実施されるサイクルの数の
比較から見出され得る。

【０１３８】結果 ゲル電気泳動分析の結果は、図３に示される。修飾され
ていないプライマー及び３種のタイプの修飾されたプラ
イマー及び２００コピー、２０コピー、又は０コピーの
ＨＣＶ ＲＮＡを用いての個々の増幅に対応するレーン
番号が下記に示される（レーン番号は、左側から右側に
数えられる：レーン１〜３０がゲルの上部半分に存在
し；レーン３１〜６０がゲルの下部半分に存在する）。
さらに、分子量マーカーが、レーン１及び３１（Ｈａｅ
III 消化されたPhix174RF DNA, NewEngland Bioloabs,
Beverly, MA）及びレーン３０及び６０（Superladder-l
ow,20bp ladder, Gen Sura, Del Mar, CA ）に存在し
た。意図される特定の生成物に対応するバンドは、矢印
により図に示される（約２３０bp）。ゲルにおける他の
バンドは、非特異的増幅生成物及び特に、プライマーダ
イマーに対応する。

【０１３９】

【表８】

【０１４０】結果は、修飾されたプライマーを用いての
増幅が、修飾されていないプライマーを用いての増幅よ
りも、より多く量の増幅されたＨＣＶ核酸をもたらすこ
とを示す。さらに、修飾されたプライマーを用いての増
幅は、修飾されていないプライマーを用いての増幅に対
してプライマーダイマーの低下をもたらした。動力ＰＣ
Ｒアッセイにおいては、螢光が反応を通してモニターさ
れた。螢光の上昇が検出できた後の螢光の上昇速度は、
螢光対サイクル数のプロットにより得られる曲線（示さ
れていない）の形状により明らかにされるように、すべ
ての反応においてほぼ同じであった。これは、修飾され
たプライマーが、増幅の初期段階の後、個々の増幅段階
の効率を検出できるほど阻害しないことを示す。反応
は、螢光の上昇が検出できた後に実施されるサイクルの
数において有意に異なった。

【０１４１】反応間の差異を定量化するために、結果
を、螢光が任意の螢光レベル（ＡＦＬ）を越えるまで実
施される増幅サイクルの数で表わす。基線螢光レベルに
近いが、しかし測定された螢光におけるランダム変動の
範囲以上のＡＦＬが選択され、その結果、その反応動力
学は、増幅の幾何学的成長相の間に測定された。後期サ
イクルにおける増幅された生成物の蓄積は、反応を阻害
し、そして結果的に、反応プラトーを導びく。

【０１４２】動力ＰＣＲ結果は下記に要約されている。
標的鋳型の２０又は２００コピーの増幅についての個々
の値は、５個の複製体増幅の平均を示すが、但し、ベン
ジル化されたプライマー及び標的物の２０コピーを用い
ての増幅についての値は４個の複製体の平均を示す。鋳
型を伴わないでの増幅についての個々の値は、８個の複
製体の平均を表わす。存在する標的物を伴わないで、ベ
ンジル化されたプライマーを用いての増幅の８個の複製
体のうち２の複製体は、４６サイクルの最後までプライ
マーダイマー形成をもたらさなかった。残る６個の増幅
の平均が示され、これは形成されるプライマーダイマー
に基づいて条件づけられた平均を表わす。この条件づけ
された平均は、欠失されたデータのために示される他の
値には匹敵しない。

【０１４３】

【表９】

【０１４４】データは、修飾されたプライマーが、ＡＦ
Ｌが後でいくつかのサイクルに達成されるように標的核
酸の増幅を明らかに遅延することを示す。この遅延は、
特定の増幅生成物の最終収量の低下に対応しなかった。
標的核酸のすべての増幅は、実験に使用される４６サイ
クル内でプラトーに達することが観察され、そしてゲル
電気泳動分析からのその対応するデータにより明らかな
ように、最終収量は、修飾されたプライマーを用いて高
められた。

【０１４５】データは、プライマーダイマーの形成の遅
延が標的物の増幅における遅延よりも有意に強いことを
示す。プライマーの有益な効果は、標的物フリーの増幅
及び２００コピーの鋳型の増幅を比較することにより最
とも明確に見出される。修飾されていないプライマーを
用いる場合、ＡＦＬへの螢光の上昇は、標的物を伴わな
い増幅において１サイクル後でのみ生じ、これは標的物
の増幅がプライマーダイマーの形成を区別するのに困難
であることを示す。対照的に、修飾されたプライマーを
用いる場合、プライマーダイマーによる螢光の上昇は、
少なくとも３サイクル後で生じ、そしてベンジル化され
たプライマーを用いる場合、少なくとも６サイクル後で
生じた。従って、標的物増幅は、プライマーダイマーの
形成から検出され、そして区別され得た。

【０１４６】標的物フリーの増幅及び２０コピーの鋳型
の増幅を比較する場合、修飾されたプライマーの効果
は、標的物増幅における遅延よりもプライマーダイマー
の開始におけるより大きな遅延の同じパターンを示し
た。修飾されていないプライマーを用いる場合、２０コ
ピーの鋳型が検出され得なかった。ニトロベンジル及び
ベンジルプライマーを用いる場合、プライマーダイマー
の形成は、このシステムにおいて２０コピーの鋳型の検
出を可能にするために十分に遅延された。

【０１４７】個々の増幅サイクルでの螢光をモニターす
ることからのデータ（データは示されていない）は、一
般的に、プライマーダイマー形成における遅延が４６サ
イクル以内にプラトーレベルに達することからプライマ
ーダイマー形成を妨げるのに十分であったことを示し
た。従って、修飾されたプライマーは、標的物の増幅が
完結され、そして反応が、有意なレベルのプライマーダ
イマーが形成される前に停止され得るようプライマーダ
イマーの形成を有意に遅延するように見えた。

【０１４８】例８．光不安定性プライマー 光不安定性変性プライマーの使用を示すために、ＨＣＶ
ＲＮＡの増幅を、修飾されたプライマー及び修飾され
ていないプライマーの両者を用いて実施した。修飾され
たプライマーを、３′端アデニンの環外アミンへの１又
は２つのニトロベンジル基の結合により変性した。増幅プライマー プライマーは例４に記載のようにして合成された。使用
されるプライマーについての命名は下記に示される。

【０１４９】

【表１０】

【０１５０】増幅反応 個々のプライマー対のために、反応を、一連の入力標的
物濃度の希釈溶液を用いて行なった。プライマー対及び
入力標的物濃度のすべての組合せを個々に含む２つの反
応パネルを実施し、そして個々の反応パネル内では、与
えられたプライマー対及び標的物濃度を含む個々の反応
を２重反復して行なった。増幅を、次の試薬を含む１０
０μｌの反応において行なった：

【０１５１】０，１０，１０² ，１０³ ，１０⁴ 又は１
０⁵ コピーのＨＣＶ ＲＮＡ鋳型、５５mMのトリシン、
９０mMのＫＯＡｃ、３mMのＭｎ（ＯＡｃ）₂ 、２００μ
Ｍの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、
２００μＭのｄＵＴＰ、２５０nMの個々のプライマー、
１０ＵのｒＴｔｈ^* 、２ＵのＵＮＧ^* 、及び８％グリセ
ロール。^* ：Hoffmann-La Roche により製造開発され、そしてPe
rkin Elmer, Norwalk, CT により市販されている。

【０１５２】個々の反応混合物の熱循環を、次の温度プ
ロフィールを用いて、Gene Amp PCRSystem 9600熱サイ
クラー（Perkin Elmer, Norwalk, CT ）において行なっ
た： 予備反応インキュベーション：５０℃で５分間 逆転写：６０℃で３０分間 初期変性：９５℃で１分間 ２サイクル：９５℃で１５秒間の変性、６０℃で２０秒
間のアニーリング／延長 ４６サイクル：９０℃で１５秒間の変性、６０℃で２０
秒間のアニーリング／延長 最終延長：７２℃で１０分間

【０１５３】みがかれた反応管キャップ（Perkin Elme
r, Norwalk, CT ）を使用した。反応温度が逆転写段階
のために６０℃に上げられた後、加熱されたフタを熱サ
イクルのブロックにおけるＰＣＲトレーから除去し、そ
して反応管の半分（一組の完全な重複反応）をアルミ箔
により被覆した。他の半分を、３０２nmで発光する、手
で保持されるＵＶランプ（ＵＶＰモデルUVM-57, UVP Pr
oducts, San Gabriel, CA ）を用いて１０分間、照射し
た。加熱されたカバーを置換し、そして増幅を続けた。

【０１５４】結果 増幅の結果を、上記のようにしてゲル電気泳動により分
析した。その結果は図４に見出される。個々の反応に使
用されるプライマー及び鋳型コピー数は、ゲルに示され
る（コピー数の対数が示される）。意図された生成物に
対応するバンドは図に示される。ゲルにおける他のバン
ドは、非特異的増幅生成物及び特にプライマーダイマー
に対応する。ＵＶ照射された組の反応の比較は、修飾さ
れたプライマーの使用が特に低いコピー数で、プライマ
ーダイマーの有意な低下をもたらしたことを示す。ＵＶ
照射されていない組の反応の比較は、ビスニトロベンジ
ルプライマーの使用が、予測されるように増幅の完全な
阻害をもたらしたことを示す。モノニトロベンジルプラ
イマーを用いる増幅は、前の例において得られる結果と
一致する生成物を生成するのみならず、またプライマー
ダイマーの有意な低下を示した。

【０１５５】例９．ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル−修
飾されたプライマーを用いての増幅 この例は、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル基により修飾
されたプライマーを用いてのＨＣＶ ＲＮＡの増幅を記
載する。標的核酸 ＨＣＶ ＲＮＡ鋳型を、Young など., 1993, J.Clin.Mi
crobiol. 31 (4): 882-886に記載されるようにＨＣＶ
ＲＮＡ転写を用いて合成した。

【０１５６】プライマー 増幅を、上記例２に記載されるようにして合成された変
性プライマーを用いて行なった。修飾されていないプラ
イマーのヌクレオチド配列を下記に示し、ここでそれら
は５′側から３′側の方向に配向される。使用されるプ
ライマーは、上流プライマーＳＴ２８０Ａ（配列番号
３）及び下流プライマーＳＴ７７８ＡＡ（配列番号４）
の修飾されたバージョンであった。プライマーの修飾さ
れた形が次のように本明細書において命名される：

【０１５７】

【表１１】

【０１５８】増幅及び分析 増幅を、次の試薬を含む１００μｌ反応において実施し
た：２０，５，２．５，２又は０コピーのＨＣＶ鋳型Ｒ
ＮＡ、５０mMのトリシン（pH８．３３）、１１０mMのＫ
ＯＡｃ、３００μＭの個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄ
ＧＴＰ、５０μＭのｄＴＴＰ、５００μＭのｄＵＴＰ、
５０nMの個々のプライマー、３．５mMのＭｎ（ＯＡｃ）
₂ 、１３％グリセロール、２０単位のｒＴｔｈ ＤＮＡ
ポリメラーゼ、及び８．０単位のＵＮＧ^* 。^* ：Hoffmann-La Roche により製造開発され、そしてPe
rkin Elmer, Norwalk, CT により市販される。

【０１５９】増幅温度循環を、次の温度プロフィールを
用いて、ＴＣ４８０ ＤＮＡ熱サイクラー（Perkin Elm
er, Norwalk, CT ）において行なった： 予備反応インキュベーション：４５℃で１２分間 ＵＮＧ不活性化：９０℃で３０秒間 逆転写：６０℃で２０分間 ４７サイクル：９４℃で４５秒間の変性、６０℃で７０
秒間のアニーリング／延長 最終拡張：６０℃で７分間 後−反応維持：分析まで１０℃（短時間） 増幅生成物を、上記のようにしてゲル電気泳動により分
析した。

【０１６０】結果 個々の標的鋳型数で行なわれた増幅を次のようにして複
製した。３回の増幅を２０コピーの標的鋳型を用いて行
ない、３回の増幅を５コピーの標的鋳型を用いて行な
い、２回の増幅を２．５コピーの標的鋳型を用いて行な
い、１回の増幅を２コピーの標的鋳型を用いて行ない、
そして２３回の増幅を存在する標的物を伴わないで行な
った。すべての鋳型陽性増幅は、ゲル上での予測される
標的サイズの単一バンドをもたらした。増幅は、プライ
マーダイマー又は他の非特異的増幅生成物のいづれもも
たらさなかった。

【０１６１】結果を、上記例６における結果と比較し、
ここで同じＨＣＶ標的物が同じプライマー配列を用いて
増幅された。例６における結果に対するそれらの結果の
比較は、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル修飾されたプラ
イマーを用いての増幅が修飾されていないプライマーに
より実施されたその対応する増幅に対して有意に改良さ
れたことを示す。ＨＩＶ−１ ＲＮＡが上記の例５に記
載されるプライマーのｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル修
飾されたバージョンを用いて増幅される追加の実験を行
なった。増幅を実質的に上記のようにして行なった。本
明細書に記載されるＨＣＶシステムに関しては、すべて
のＨＩＶ−１鋳型陽性増幅がゲル上での予測される標的
サイズの単一バンドをもたらし、そして増幅は、プライ
マーダイマー又は他の非特異的増幅生成物のいずれもも
たらさなかった。

【０１６２】それらの追加の結果を、例５における結果
と比較し、ここで同じＨＩＶ標的物を同じプライマー配
列を用いて増幅した。上記例５における結果に対するそ
れらの結果の比較は、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル修
飾されたプライマーを用いての増幅が修飾されていない
プライマーにより実施されるその対応する増幅に対して
有意に改良されたことを示す。

【０１６３】例１０．マイコバクテリウムＤＮＡの増幅 この例は、修飾されていないプライマー及び修飾された
プライマーを用いて実施されるマイコバクテリウムＤＮ
Ａの増幅の比較を記載する。３′末端ヌクレオチドへの
ベンジル基の付加により修飾されたプライマー及び３′
末端ヌクレオチドへのｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル基
の付加により修飾されたプライマーの両者を用いた。修
飾されていないプライマーを用いての反応は、Tevereな
ど., 1996, J.Clin.Microbiol. 34 (4): 918-923に実質
的に記載される通りであった。増幅を、マイコバクテリ
アＤＮＡが模擬の感染された臨床サンプルに既知の濃度
で添加されている唾液サンプルを用いて行なった。追加
の増幅を、精製されたマイコバクテリアＤＮＡを用い
て、及びＤＮＡフリーの陰性対照サンプルを用いて行な
った。

【０１６４】サンプルの調製 顕微鏡によりマイコバクテリアウムについて陰性である
ことが前もって示されている唾液検体及び培養物を、液
化し、そしてＣＤＣ（Kent and Kubica, 1985,Public H
ealth Mycobacteriology-a guide for the level III l
aboratory, U.S.Department of Health and Human Serv
ices, Centers for Disease Control,Atlanta 、引用に
より本明細書に組込まれる）により推薦されるＮ−アセ
チル−システイン−ＮａＯＨ法により汚染除去した。

【０１６５】液化された唾液（１００μｌ）を、５００
μｌのRespiratory Specimen WashReagent （１０mMの
トリス−ＨＣｌ、１mMのＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）のＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０５％のＮａＮ₃ 、pH
８．０）に添加し、そして１２，５００×ｇで１０分
間、遠心分離した。個々のペレットを、１００μｌの溶
解試薬（０．０５ＮのＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ）のＴｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００、１mMのＥＤＴＡ、０．０５％の
ＮａＮ₃ ）に再懸濁し、そして６０℃で４５分間インキ
ュベートした。次に、溶解物を、１００μｌの中和試薬
（０．２Ｍのトリス−ＨＣｌ、８mMのＭｇＣｌ₂ 、０．
０５％のＮａＮ₃ 、pH７．５）により中和した。

【０１６６】プールされた唾液溶解物を、それぞれ８０
μｌの２種の別々の唾液溶解物を組合すことによって生
成した。８種のプールされた唾液溶解物（それぞれ１６
０μｌ）の個々に、培養されたＭ．ツベルキロシス（M.
tuberculosis ）から精製されたＤＮＡ原液（溶解試薬
及び中和試薬の１：１混合物１μｌ当たり２つのコピ
ー）１５μｌを添加した。既知濃度で精製されたマイコ
バクテリアＤＮＡを含むサンプル（唾液ではない）を、
溶解試薬及び中和試薬の１：１混合物１００μｌにＤＮ
Ａ原液１０μｌを添加することによって調製した。負の
対照サンプル（ＤＮＡを含まない）は、溶解試薬１００
μｌ及び中和試薬１００μｌの混合物から成る。

【０１６７】増幅プライマー 増幅を、次のヌクレオチド配列から成るプライマーを用
いて行なった：

【０１６８】

【表１２】

【０１６９】３′末端塩基に結合される示されたモディ
ファイアー基を含む次のプライマー対を、増幅に使用し
た。すべての修飾されたプライマーは、前の例に記載さ
れるようにして合成された。すべてのプライマーは、
５′末端でビオチニル化された。

【０１７０】

【表１３】

【０１７１】増幅 個々のサンプルのために、増幅を、修飾されていないプ
ライマー対、ＫＹ１８（配列番号５）及びＫＹ７５（配
列番号７）、及び修飾された形のプライマー対、ＫＹ４
３６（配列番号６）及びＫＹ７５（配列番号７）を用い
て行なった。増幅を１００μｌ反応において行ない、こ
こで個々の反応は、上記３種のサンプルの１つ５０μｌ
及び次の試薬を含む２×試薬混合物を５０μｌを含む：
１００mMのトリス−ＨＣｌ、pH８．９、５００nMの個々
のプライマー、２００μＭの個々のｄＮＴＰ（ｄＡＴ
Ｐ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＵＴＰ）、２０％（ｖ／
ｖ）のグリセロール、１０単位のＡｍｐｌｉ Ｔａ
ｑ^* 、６単位のＡｍｐＥｒａｓｅ^* 。^* ：Hoffmann-La Roche により製造開発され、そしてPe
rkin Elmer, Norwalk, CT により市販されている。

【０１７２】個々の反応の熱循環を、次の温度プロフィ
ールを用いて、GeneAmp PCR システム9600熱サイクラー
（Perkin Elmer, Norwalk, CT ）において実施した： 予備反応インキュベーション：５０℃で５分間 ２サイクル：９８℃で２０秒間の変性、６２℃で２０秒
間のアニーリング、７２℃で４５秒間の拡張 ４１サイクル：９４℃で２０秒間の変性、６２℃で２０
秒間のアニーリング、７２℃で４５秒間の拡張 最終拡張：７２℃で約１２時間（一晩） 増幅生成物を、２％ Ｎｕｓｉｅｖｅ（登録商標）０．
５％アガロースゲルを通しての電気泳動、続く臭化エチ
ジウム染色により可視化した。

【０１７３】結果 電気泳動分析の結果は図５に示される。個々のサンプル
のために、修飾されていないプライマー（“Ａ”で示さ
れる）及び修飾されたプライマー（“Ｂ”及び“Ｃ”で
示される）により実施された増幅からの生成物を、隣接
するレーン上で電気泳動せしめた。意図されるマイコバ
クテリア標的配列に対応するバンドを矢印により示す。
他のバンドは非特異的増幅生成物に対応し；ゲルにおけ
る最とも低いバンドはプライマーダイマーに対応する。
“Ｍ”で示されたレーンは、分子量マーカー（Phix174
DNA のＨａｅIII 消化）を含む。

【０１７４】修飾されていないプライマーを用いる場
合、精製されたマイコバクテリアＤＮＡの増幅はプライ
マーダイマーの形成をもたらした。いづれかの修飾され
たプライマー対の使用は、存在する意図される標的物の
量を高め、そして検出できるプライマーダイマーの形成
を実質的に排除した。

【０１７５】精製されたＤＮＡの増幅と対照して、修飾
されていないプライマーを用いる場合、増幅反応におけ
る唾液溶解物の存在は、外来の生成物バンドの存在によ
り示されるように、効率を低め、そして非特異的増幅生
成物の形成を高めた。非特異的増幅生成物の上昇は、唾
液溶解物が、精製されたマイコバクテリアＤＮＡの増幅
に存在しない、有意な量のヒトＤＮＡを含む場合、驚き
にあたいしない。唾液の存在下で実施される増幅への修
飾されたプライマー対のいづれかの使用は、生成される
意図された生成物の量の有意な上昇及び非特異的増幅の
低下の両者をもたらした。

【０１７６】例１１．ベンジル基により修飾されたプラ
イマーの追加の合成 末端シトシンへのベンジル基の付加により修飾されたプ
ライマーを、例１に実質的に記載のようにして合成した
が、しかし下記のようにして調製されたＬＣＡＡ−ＣＰ
Ｇ−結合のＮ⁴ −アセチル、Ｎ⁴ −ベンジル−５′−Ｏ
−ＤＭＴ−２′−デオキシシチジンを用いた。

【０１７７】段階１：Ｎ⁴ −ベンジル−２′−デオキシ
シチジンの合成 ２′−デオキシシチジン塩酸塩（５．２８ｇ、２０ｍモ
ル、U.S.BiochemicalCorp., Cleveland, OH）に、ベン
ジルアミン（２０ml）を添加し、そしてその混合物を１
５０℃で３時間、アルゴン雰囲気下で加熱した。その溶
液を真空下で濃縮し、粘性の黄色の油状物を得、これを
水（１００ml）と酢酸エチル（１００ml）との間に分け
た。水性相を酢酸エチル（１００ml）により洗浄し、そ
して分離した。水性相を真空下で濃縮し、黄色のシロッ
プ状物（１３ｇ）を得、これを溶離剤として１５：１の
塩化メチレン：メタノールを用いてシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーにより精製し、無色のシロップ状物と
して所望する生成物（５．８ｇ、９１．５％）を得た。

【０１７８】段階２：Ｎ⁴ −アセチル、Ｎ⁴ −ベンジル
−２′−デオキシシチジンの合成 Ｎ⁴ −ベンジル−２′−デオキシシチジン（２．５ｇ、
７．９ｍモル）を、無水ジメチルホルムアミド（１５m
l）に溶解し、無水酢酸（８ｇ、７９ｍモル、１０当
量）を添加し、そしてその混合物を室温で一晩、撹拌し
た。溶媒及び過剰の無水酢酸を真空下で蒸発した。生成
物を、溶離剤として２０：１の塩化メチレン：メタノー
ルを用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによ
り精製し、標記化合物（１．３ｇ、４８％）を得た。化
合物は高い吸湿性であり、そして−２０℃で貯蔵乾燥せ
しめた。

【０１７９】段階３：Ｎ⁴ −アセチル、Ｎ⁴ −ベンジ
ル、５′−Ｏ−ＤＭＴ−２′−デオキシシチジンの合成 Ｎ⁴ −アセチル、Ｎ⁴ −ベンジル−２′−デオキシシチ
ジン（７６mg、０．２ｍモル）を、無水ピリジン１mlに
溶解し、そしてＤＭＴ−Ｃ１（１２２mg、０．２ｍモ
ル、１．０当量）を添加した。その反応混合物を３時
間、撹拌した。ＴＬＣの分析は、いくらかの出発材料が
残存することを示し、その結果、さらなるアリコートの
ＤＭＴ−Ｃ１（６１mg、０．５当量）を添加し、そして
得られる混合物をさらに１時間、撹拌し、この時点で、
ＴＬＣによる分析は、反応が完全であることを示した。

【０１８０】反応を１５mlのブライン溶液により急冷
し、そして水性相を塩化メチレン（３×１５ml）により
抽出した。組合された有機層をブライン（２×１５ml）
により洗浄し、そして無水硫酸マグネシウム上で乾燥せ
しめた。溶媒を蒸発し、そして混合物を、５０：１の塩
化メチレン：メタノールを用いて、シリカゲルカラムク
ロマトグラフィーにより精製し、Ｎ⁴ −アセチル、Ｎ⁴
−ベンジル、５′−Ｏ−ＤＭＴ−２′−デオキシシチジ
ン（９６mg、６５％の収率）を得た。

【０１８１】段階４：スクシニル化 Ｎ⁴ −アセチル、Ｎ⁴ −ベンジル、５′−Ｏ−ＤＭＴ−
２′−デオキシシチジン（９６mg、０．１３ｍモル）
を、無水ピリジン２mlに溶解した。無水琥珀酸（１００
mg、１．０ｍモル）及びジメチルアミノピリジン（２０
mg）を添加し、そして得られる混合物を室温で３日間、
撹拌した。溶媒を蒸発し、そして残留物をトルエン（３
×１０ml）と共に同時蒸発した。クロロホルム（５０m
l）を添加し、残留物を溶解した（音波処理を用いて、
溶解を助けた）。クロロホルム層をブライン（３×１５
ml）及び水（１×１５ml）により洗浄した。有機層を無
水硫酸マグネシウム上で乾燥せしめた。溶媒を蒸発し、
１０８mg（９７％の収率）の純粋なＮ⁴ −アセチル、Ｎ
⁴ −ベンジル、５′−Ｏ−ＤＭＴ−２′−デオキシシチ
ジン−３′−Ｏ−スクシネートを得た。

【０１８２】段階５：ＬＣＡＡ−ＣＰＧ結合の５′−Ｏ
−ＤＭＴ−Ｎ⁴ −アセチル、Ｎ⁴ −ベンジル−２′−デ
オキシシチジン−３′−Ｏ−スクシネートの調製 活性化されたＣＰＧを次のようにして調製した。ＬＣＡ
Ａ−ＣＰＧ（１．０ｇ、LCA00500C, CPG Inc., Fairfie
ld, NJ）を、塩化メチレン（３％、１０ml）中、トリク
ロロ酢酸により処理し、そして回転蒸発機（rotovapor,
Buchi, Flawil, Switzerland ）上での４時間の回転に
より混合した（真空ではない）。溶媒を濾過し、そして
ＣＰＧを、９：１のトリエチルアミン：エチルジイソプ
ロピルアン（３×５ml）、塩化メチレン（３×１０ml）
及びエーテル（３×１０ml）により連続的に洗浄し、次
に真空下で乾燥せしめた。

【０１８３】酸洗浄されたＣＰＧへの修飾されたヌクレ
オシド中間体の結合化を次のようにして行なった。１ｇ
の活性化されたＬＣＡＡ−ＣＰＧに、上記のようにして
調製されたＮ⁴ −アセチル、Ｎ⁴ −ベンジル、５′−Ｏ
−ＤＭＴ−２′−デオキシシチジン、３′−Ｏ−スクシ
ネート（１０８mg、０．１３ｍモル）、ジメチルアミノ
ピリジン（２０mg）及び無水ピリジン（５ml）を添加し
た。その反応混合物をｒｏｔａｖａｐｏｒ（真空ではな
い）上で３日間、回転せしめた。上清液を濾過し、そし
て結合されたＬＣＡＡ−ＣＰＧを、ピリジン（３×５m
l）、塩化メチレン（３×１０ml）及びエーテル（３×
１０ml）により連続的に洗浄し、そして次に真空下で乾
燥せしめた。

【０１８４】Ｎ⁴ −アセチル、Ｎ⁴ −ベンジル、５′−
Ｏ−ＤＭＴ−２′−デオキシシチジン−３′−Ｏ−スク
シネートにより連結されたＬＣＡＡ−ＣＰＧのキャッピ
ングを、次のようにして実施した。誘導体化されたＣＰ
Ｇに、キャッピングミックス試薬Ａ（ＴＨＦ／ルチジン
／Ａｃ₂ Ｏ（８：１：１）、Glen Research DNA 合成試
薬、Sterling, VA）及びＢ（ＴＨＦ中、１０％ Ｎ−メ
チルイミダゾール、Glen Research ）を添加し、そして
その反応混合物をｒｏｔａｖａｐｏｒ（真空ではない）
上で一晩、回転せしめた。溶液を濾過し、そして結合さ
れたＬＣＡＡ−ＣＰＧを、ピリジン（３×５ml）、塩化
メチレン（３×１０ml）、ＴＨＦ（３×１０ml）及びエ
ーテル（３×１０ml）により連続的に洗浄し、そして次
に、真空下で乾燥せしめた。

【０１８５】誘導体化されたＬＣＡＡ−ＣＰＧの結合能
力を、塩化メチレン中、３％トリクロロ酢酸により生成
物５mgを処理することによって決定し、そして開放され
たジメトキシトリチルカルボニウムイオンの量をＵＶ分
光計により測定した。ＬＣＡＡ−ＣＰＧに連結されるヌ
クレオチド誘導体の量は、１９．５μモル／ｇであるこ
とを決定した。

【配列表】

（２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号：１： CAATGAGACA CCAGGAATTA GATATCAGTA CAA 33 （２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３２個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号：２： CCCTAAATCA GATCCTACAT ATAAGTCATC CA 32 （２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号：３： GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTA 26 （２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号：４： GCAAGCACCC TATCAGGCAG TACCACAA 28 （２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号：５： CACATGCAAG TCGAACGGAA AGG 23 （２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号：６： TAACACATGC AAGTCGAACG GAAA 24 （２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号：７： GCCCGTATCG CCCGCACGCT CACA 24

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ベンジル化されたプライマーを用いて
実施されたＨＩＶ−１ ＲＮＡの増幅の結果を示す。

【図２】図２は、ベンジル化されたプライマーを用いて
実施されたＨＣＶ ＲＮＡの増幅の結果を示す。

【図３】図３は、３種のモディファイアー基の１つによ
り修飾されたプライマーを用いて実施されたＨＣＶ Ｒ
ＮＡの増幅の結果を示す。

【図４】図４は、光不安定性の修飾されたプライマーを
用いて実施されたＨＣＶ ＲＮＡの増幅の結果を示す。

【図５】図５は、ベンジル基により修飾されたプライマ
ー及びｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル基により修飾され
たプライマーを用いてのマイクロバクテリアＤＮＡの増
幅の結果を示す。

【図６】図６は、ベンジル−又は置換されたベンジル−
修飾されたｄＡ調節の多孔性ガラス（ＣＰＧ）の合成の
ために適切な一般的反応スケムを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 カレン クォク イン ヤン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94583, サン ラモン，ブランスウィック コート 9943

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般構造式： 【化１】 〔式中、Ｓ₁ は約５個〜約５０個のヌクレオチドの長さ
   の第１配列を表わし；Ｓ₂ は１〜３個のヌクレオチドの
   長さの第２配列を表わし；Ｎは環外アミンを含む、プリ
   ン又はピリミジン塩基を含むヌクレオチドを表わし；Ｒ
   はモディファイアー基を表わし、ここでＲは前記環外ア
   ミンを通してＮに共有結合され、そしてＲは下記構造
   式： 【化２】 （ここで、Ｒ₁ 及びＲ₂ は独立して、水素、Ｃ₁ −Ｃ₁₀
   アルキル基、アルコキシ基、フェニル基、フェノキシ
   基、置換されたフェニル基、ナフチル基又は置換された
   ナフチル基を表わす）を有する〕を有するオリゴヌクレ
   オチド。
2. 【請求項２】 前記Ｒが２−ナフチルメチル基；ベンジ
   ル基；又は置換されたベンジル基である請求項１記載の
   オリゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】 前記Ｒが下記構造式： 【化３】 〔式中、Ｒ₃ はＣ₁ −Ｃ₆ の枝分れ鎖又は直鎖アルキル
   基、メトキシ基又はニトロ基を表わす〕を有する置換さ
   れたベンジル基である請求項１又は２記載のオリゴヌク
   レオチド。
4. 【請求項４】 前記Ｒ₃ がＣ₁ −Ｃ₄ の枝分れ鎖又は直
   鎖アルキル基、メトキシ基又はニトロ基を表わす請求項
   １〜３のいづれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
5. 【請求項５】 前記Ｒ₃ がパラ位置に結合されている請
   求項３又は４記載のオリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】 前記Ｎがアデノシンである請求項１〜５
   のいづれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
7. 【請求項７】 前記Ｒがベンジル、ｐ−メチルベンジ
   ル、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルベンジル、ｐ−メトキシベン
   ジル、ｏ−ニトロベンジル及び２−ナフチルメチルから
   成る群から選択される請求項１〜６のいづれか１項記載
   のオリゴヌクレオチド。
8. 【請求項８】 核酸標的配列を増幅するための方法であ
   って、請求項１〜７のいづれか１項記載の少なくとも１
   つのオリゴヌクレオチドを用いて増幅反応を実施するこ
   とを含んで成る方法。
9. 【請求項９】 ポリメラーゼ鎖反応である請求項８記載
   の方法。
10. 【請求項１０】 核酸増幅反応を実施するためのキット
    であって、請求項１〜７のいづれか１項記載のオリゴヌ
    クレオチドを含んで成るキット。