KR100292997B1 - 개질된프라이머 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 핵산 서열 증폭에 사용하기 위한 개질된 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 프라이머로서 개질된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실행한 증폭은 비개질된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실행한 증폭에 비하여 비특이적 증폭 생성물, 특히 프라이머 이량체가 덜 생성되고, 부수적으로 목적하는 증폭 생성물의 수율이 보다 증가하였다.
Description
본 발명은 분자 생물학 및 핵산 화학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 핵산 증폭 반응의 수율을 개선시키기 위한 방법 및 시약에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 핵산 증폭을 사용하여 임의의 분야에 응용된다.
본 발명의 폴라머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)은 헥산 서열의 시험관내 증폭을 가능하게 하였다. PCR은 미국 특허 제4,683,195호, 미국 특허 제4,683,202호 및 미국 특허 제4,965,188호; 사이키(Saiki) 등의 문헌 [Science 230:1350-1354]; 물리스(Mullis) 등의 문헌[Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986)]; 및 물리스 및 팔루나(Faloona)의 문헌[Methods Enzymol. 155:335-350 (1987)]에 기술되어 있다. PCR의 개발 및 응용은 문헌에서 폭넓게 기술되어 있다. 예를 들어, 다양한 PCR-관련 논제가 문헌[PCR Technology-principles and applications for DNA amplification, 1989, 얼리치(H.A.Erlich) 편집, Stockton Press, New York; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, 이니스(M. A. Innis) 등 편집, Academic Press, San Diego; 및 PCR Strategies, 1995, 이니스 등 편집, Academic Press, San Diego]에 논의되어 있다. 퍼킨 엘머(Perkin Elmer, 미국 코넥티컷주 노웍 소재)와 같은 판매상이 PCR 시약을 판매하고 있으며 PCR 프로토콜을 출판하고 있다.
핵산 증폭에 관한 최초의 출판 이후로, 리가제 연쇄 반응(Ligase Chain Reaction; LCR)(우(Wu) 및 왈리스(Wallace)의 문헌[Genomics 4: 560-569 (1989)] 및 바라니(Barany)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193 (1991)]), 폴리머라제 리가제 연쇄 반응(바라니의 문헌[PCR Methods and Applic. 1:5-16 (1991)]), 갭(Gap)-LCR(PCT 특허 공개 공보 제WO 90/01069호), 회복 연쇄 반응(Repair Chain Reaction)(유럽 특허 공개 공보 제439,182 A2호), 3SR(콰(Kwoh) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177 (1989)], 과텔리(Guatelli) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878 (1990)], PCT 특허 공개 공보 제WO 92/0880A호); 및 NASBA(미국 특허 제5,130,238호)를 비롯한(이에 한정되지는 않는다) 다양한 프라이머-기제의 핵산 증폭 방법이 기술되어 있다. 증폭 시스템에 대한 조사는 아브램선(Abramson) 및 마이어스(Myers)의 문헌[Current Opinion in Biotechnology 4:41-47 (1993)]에 제공되어 있다.
프라이머-기제 증폭 반응의 특이성은 프라이머 하이브리드화(hybridization)의 특이성에 좌우된다. 전형적인 증폭에 사용되는 고온에서 프라이머는 의도한 표적 서열에만 하이브리드화한다. 그러나, 증폭 반응 혼합물은 전형적으로 프라이머 하이브리드화의 특이성을 보장하는데 필요한 온도보다 훨씬 낮은 실온에서 회합된다(assemble). 이러한 덜 엄격한 조건하에서, 상기 프라이머는 단지 부분적으로만 상보적인 다른 핵산 서열 또는 다른 프라이머에 비특이적으로 결합하여, 목적하지 않은 연장 생성물의 합성을 개시할 수 있고, 이는 표적 서열과 함께 증폭될 수 있다. 비특이적 프라이머 연장 생성물의 증폭은 목적하는 표적 서열의 증폭과 경쟁할 수 있어서 목적하는 서열의 증폭 효율을 상당히 감소시킬 수 있다.
비특이적 증폭 생성물의 종종 관찰되는 형태중 하나는 “프라이머 이량체”로서 불리는, 주형에 의존하지 않는 증폭 반응물이다. 프라이머 이량체는 그 길이가 전형적으로 두 프라이머 길이의 합에 가까운 이중사슬 분절이며, 한 프라이머가 다른 프라이머로 연장될 때 발생하는 것으로 보인다. 이렇게 생성된 연결물은 짧은 길이로 인해 효과적으로 증폭되는 목적하지 않은 주형을 형성한다.
비특이적 증폭은, 반응을 시작하기 전에 프라이머 연장 생성물의 형성을 감소시킴으로써 감소될 수 있다. “고온 출발(hot-start)” 프로토콜로 지칭되는 한가지 방법은, 필요한 하이브리드화의 특이성을 제공하는데 충분한 온도에 도달하기전 까지는 반응 혼합물에 1종 이상의 중요학 시약을 제공하지 않는 것이다. 이러한 방법에서, 반응 조건이 특이적 프라이머 하이브리드화를 보장하지 않는 기간 동안은, 반응 혼합물이 프라이머를 더욱더 연장시킬 수 없다.
초기 고온 항온처리 단계후에 반응관을 개방하여 결여되어 있는 시약을 첨가하는 수동 고온 출발 방법은, 노동 집약적이고 반응 혼합물을 오염시킬 위험이 커진다. 다르게는 반응 성분들을 분리 또는 격리시키기 위해서 감온성 물질(예: 왁스)을 사용할 수 있다(미국 특허 제5,411,876호 및 추(Chou) 등의 문헌[Nucl. Acids Res. 20(7):1717-1723 (1992)]에 기술되어 있는 바와 같음). 이러한 방법에서, 고온의 반응 전 항온처리에 의해 감온성 물질이 용융되고, 이로써 시약을 혼합한다.
반응을 시작하기 전에 프라이머 연장 생성물의 형성을 감소시키는 다른 방법은, 미국 특허 제5,338,671호에 기술한 바와 같이 DNA 폴리모라제-특이적 항체에 의해 DNA 폴리머라제를 열-가역적으로 억제시키는 것이다. 항체-DNA 폴리머라제 착체를 형성하기 위해서는 반응 혼합물이 회합하기 전에 실온의 완충액에서 DNA 폴리머라제와 함께 항체를 항온처리한다. DNA 폴리머라제 활성의 항체 억제는 고온의 반응전 항온처리에 의해 불활성된다. 이러한 방법의 단점은 DNA 폴리머라제에 특이적인 항체를 제조하는 것이 비용이 많이 들고, 시간 소모적(특히 대량일 때)이라는 점이다. 게다가, 항체를 반응 혼합물에 첨가하는 것은 증폭 반응의 재디자인을 필요로 할 수도 있다.
또한 반응 시작전에 연장 생성물의 형성은 단일사슬 결합성 단백질을 반응물에 첨가함으로써 억제시킬 수 있으며, 이 단일사슬 결합성 단백질은 열-가역적 방법으로 프라이머에 비-공유결합되고 하이브리드화를 억제함으로써 프라이머 연장을 억제시킨다.
또한 미국 특허 제5,418,149호에서 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 반응 시작 전에 형성된 연장 생성물을 효소적으로 분해함으로써 비특이적 증폭을 감소시킬 수 있다. 새로 합성된 연장 생성물의 분해는, 반응 혼합물에 dUTP 및 UNG를 혼입시키고, 증폭 반응을 실행하기 전에 반응 혼합물을 45 내지 60℃로 항온처리함으로써 이루어진다. 프라이머가 연장되면 우라실-함유 DNA가 형성되지만, 이것은 증폭전 조건하에서 UNG에 의해 분해된다. 이러한 방법의 단점은 연장 생성물의 분해가 연장 생성물의 형성과 경쟁하여 비특이적 프라이머 연장 생성물을 완전히 제거하지 못한다는 점이다. 이러한 방법의 이점은 선행 반응으로부터의 오염물로서 반응 혼합물에 혼입된 우라실-함유 DNA도 또한 분해된다는 점이고, 따라서 이 방법은 또한 선행 반응에서 증폭된 핵산에 의한 PCR의 오염 문제를 감소시킨다는 점이다.
당분야의 숙련자에게 분자 생물학 및 핵산 화학의 종래의 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다(샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis, 가이트(M.J. Gait) 편집 (1984)]; 문헌[Nucleic Acid Hybridization(헤임스(B.D. Hames) 및 히긴스(S. J. Higgins) 편집) (1984)]; 및 시리즈인 문헌[Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.)] 참고).
본 발명은 핵산 서열의 시험관내 증폭을 위한 공유결합에 의해 개질된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제공하는 것이다. 본 발명의 개질된 프라이머를 사용하여, 비개질된 프라이머로 실행된 증폭에 비해 비특이적 증폭, 특히 프라이머 이량체 형성을 감소시키고/감소시키거나 부수적으로 목적하는 표적의 수율을 증가시키고자 하는 것이다.
제1도는 실시예 5에서 기술하는 바와 같이, 벤질화된 프라이머를 사용하여 실행한 HIV-1 RNA의 증폭 결과이다.
제2도는 실시예 6에서 기술하는 바와 같이, 벤지롸된 프라이머를 사용하여 실행한 HCV RNA의 증폭 결과이다.
제3도는 실시예 7에서 기술하는 바와 같이, 3가지 개질기중 하나로 개질된 프라이머를 사용하여 실행한 HCV RNA의 증폭 결과이다.
제4도는 실시예 8에서 기술하는 바와 같이, 광-불안정한 개질된 프라이머를 사용하여 실행한 HCV RNA의 증폭 결과이다.
제5도는 실시예 10에서 기술하는 바와 같이, 벤질기로 개질된 프라이머 및 p-3급-부틸벤질기로 개질된 프라이머를 사용하여 실행한 마이코박테리아(mycobacteria) DNA의 증폭 결과이다.
제6도는 벤질-개질된 또는 치환된 벤질-개질된 dA 조절 다공질 유리(controlled pore glass; CPG)를 합성하는데 적당한 일반적인 반응식을 나타낸다.
한가지 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 1a 또는 화학식 1b의 구조를 갖는, 핵산 서열의 증폭을 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 관한 것이다:
[화학식 1a]
[화학식 1b]
상기 식에서, S1은 길이가 뉴클레오타이드 약 5 내지 약 50개인 뉴클레오타이드의 제1서열을 나타내고; S2는 길이가 뉴클레오타이드 1 내지 3개인 제2서열을 나타내고; N은 고리외(exocyclic) 아민을 함유하는 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기를 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내고; R은 개질기를 나타내는 것으로, 고리외 아민에 의해 N에 공유결합되며, 이때 R은 하기 화학식 2의 구조를 갖는다.
[화학식 2]
상기 식에서, R1및 R2는 독립적으로 수소, C1-C10알킬기, 페닐기, 페녹시기, 치환된 페닐기, 나프틸기 또는 치환된 나프틸기를 나타낸다. 알킬기는 분지쇄 또는 비분지쇄일 수 있다.
바람직한 양태에서, N은 개질된 종래의 뉴클레오타이드로, 이러한 경우 N은 개질된 아데노신, 시티딘 또는 구아노신이고, 개질제 잔기는 아데닌, 구아닌 또는 시토신 염기의 고리외 아민에 공유결합된다. 보다 바람직한 양태에서는 N은 개질된 아데노신이다.
바람직한 양태에서, R은 2-나프틸메틸 기; 벤질기; 또는 치환된 벤질기이다. 바람직한 치환된 벤질기는 하기 화학식 3의 구조를 갖는다:
[화학식 3]
상기 식에서, R3은 C1-C6분지형 또는 선형 알킬기이고, 보다 바람직하게는 C1-C4분지형 또는 선형 알킬기, 메톡시기 또는 니트로기이다. R3이 파라 위치에 결합되는 것이 바람직하다.
보다 바람직한 양태에서, R은 벤질, p-메틸벤질, p-3급-부틸벤질, p-메톡시벤질 또는 2-나프틸메틸기이다.
본 발명의 또다른 양상은 개질기가 광-불안정한 공유 결합에 의해 개질된 증폭 프라이머에 관한 것으로, 이는 프라이머 연장을 부분적으로 또는 완전히 억제시킨다. 광-불안정 개질제는 고리외 아민(전술한 개질된 뉴클레오타이드에서와 같음) 또는 고리의 질소에 결합될 수도 있다. 한가지 양태에서는, 하나 이상의 니트로 벤질기가 3′-말단 뉴클레오타이드의 아데노신, 구아닌 또는 시토신 염기의 고리외 아민에 결합된다.
본 발명의 다른 양상은 하나 이상의 프라이머가 전술한 바와 같이 개질된 한 쌍의 프라이머 또는 한 세트의 프라이머이다. 바람직한 양태는, 한쌍의 프라이머의 두 프라이머 모두 또는 한 세트의 프라이머의 모든 프라이머가 개질되는 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 개질된 프라이머를 사용하여 증폭 반응을 실행함을 포함하는 핵산의 증폭 방법이다.
본 발명의 또다른 양상은 본 발명의 광-불안정한 개질된 프라이머를 사용하여 증폭 반응을 실행함을 포함하는 표적 핵산의 증폭 방법에 관한 것으로, 여기서 반응 혼합물은 개질기를 제거하기에 충분한 광선으로 조사되어, 프라이머 연장 생성물을 형성하게 된다. 본 발명의 한가지 양태에서, 조사 과정은 증폭 반응을 시작하기 전, 반응 혼합물이 약 50℃ 보다 높은 온도로 가열된 후에 개별적인 단계로서 실행된다. 다른 양태에서, 조사 단계는 RNA 증폭 반응에 있어서의 역전사 단계 또는 DNA 증폭 반응중의 초기 변성 단계와 같은 증폭 공정의 예비 단계와 조합된다.
본 발명의 다른 양상은 핵산 서열의 시험관내 증폭을 위한 키트에 관한 것으로, 이 키트는 한쌍의 프라이머중 하나 이상이 전술한 바와 같이 개질된 한 쌍의 프라이머를 포함한다. 또한 본 발명의 키트는 1종 이상의 증폭제(예: 핵산 폴리머라제 또는 리가제), 뉴클레오사이드 트리포스파타제 및 적당한 완충액을 포함할 수 있다.
본 발명의 이해를 돕기 위해서, 다수의 용어를 하기와 같이 정의한다.
“핵산” 및 “올리고뉴클레오타이드”는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(2-데옥시-D-리보즈 함유); 폴리리보뉴클레와이드(D-리보즈 함유); 및 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 개질된 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N 글리코사이드인 그밖의 임의의 유형의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. “핵산” 및 “올리고뉴클레오타이드”라는 용어를 길이면에서 구별하여 사용하지 않으며, 이들 용어는 상호 교환적으로 사용될 것이다. 이러한 용어는 단지 분자의 1차 구조만을 지칭하는 것이다. 따라서, 이러한 용어는 이중사슬 및 단일사슬 DNA 뿐만 아니라 이중사슬 및 단일사슬 RNA를 포함한다.
핵산 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 관한여 “통상적인”이라는 용어는 기술된 폴리뉴클레오타이드에 자연적으로 존재하는 것을 지칭한다. DNA의 4가지의 통상적인(“주된”을 의미하기도 함) 데옥시리보뉴클레오타이드는 퓨린계 염기인 아데닌과 구아닌 및 피리미딘계 염기인 시토신과 티민을 함유한다. RNA의 4가지의 통상적인 리보뉴클레오타이드는 퓨린계 염기인 아데닌과 구아닌 및 피리미딘계 염기인 시토신과 우라실을 함유한다. 상기 통상적 또는 일반적인 염기 외에, 다수의 다른 퓨린 및 피리미딘 유도체, 소위 말하는 희소 또는 소수 염기가 일부 핵산에 소량으로 존재한다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 핵산 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 관하여 “비통상적인”이라는 용어는 희소 또는 소수의 핵산염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드; 및 통상적인 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드의 개질체, 유도체 또는 유사체를 지칭하는 것이고, 개질된 염기 잔기 및/또는 개질된 당 잔기를 갖는 합성 뉴클레오타이드를 포함한다(문헌[Protocols for Oligonucletide Conjugates, Methods in Molecular Biology, Vol 26, (아그라월(Sudhir Agrawal) 편집, 미국 뉴저지주 토토와 소재의 휴마나 프레스(Humana Press), (1994)); 및 Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach(엑스타인(Fritz Eckstein), IRL 프레스, 영국 옥스포드 소재의 옥스포드 유니버서티 프레스(Oxford University Press))] 참고).
올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 클로닝 및 적당한 서열의 제한 방법; 및 나랑(Narang) 등의 문헌[Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979)]에 기술된 포스포트리에스테르 방법; 브라운(Brown) 등의 문헌[Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979)]에 기술된 포스포디에스테르 방법; 보케이지(Beaucage) 등의 문헌[Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)]에 기술된 디에틸포스포라미다이트 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고형물 지지 방법과 같이 직접적인 화학 합성을 비롯한 임의의 적당한 방법에 의해 제조될 수 있다. 합성 방법에 대한 개론은 본원에서 참조로 인용되고 있는 굿칠드(Goodchild)의 문헌[Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187 (1990)]에 제공되어 있다.
당분야에서 “왓슨-크릭 염기 짝짓기(Wastson-Crick base pairing)”로 지칭되는 “염기 짝짓기”라는 용어는, 이중사슬 DNA 구조에서의 아데닌-티민 및 구아닌-시토신 결합, RNA/DNA 하이브리드 분자에서의 아데닌-우라실 및 구아닌-시토신 결합, 및 비통상적인 뉴클레오타이드 쌍에서의 유사한 결합의 잘 공지되어 있는 상보적인 염기쌍의 수소결합을 지칭하는 것이다.
“하이브리드화”라는 용어는 상보적인 염기 짝짓기로 인해 두개의 단일나선의 핵산이 이중 구조를 형성하는 것을 지칭한다. 하이브리드화는 완전히 상보적인 핵산사슬 사이에서 발생할 수 있거나 또는 소수의 부적합(mismatch) 영역을 함유하는 “실질적으로 상보적인” 핵산 사슬 사이에서 발생할 수 있다. 완전히 상보적인 핵산 사슬만 하이브리드화하는 조건을 “엄격한 하이브리드화 조건” 또는 “서열-특이적 하이브리드화 조건”이라고 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열의 안정한 이중사슬은 보다 덜 엄격한 하이브리드화 조건하에서 수득될 수 있으며, 하이브리드화 조건을 적절하게 제어하면 허용가능한 부적합 정도를 제어할 수 있다. 핵산 기술 분야의 숙련자라면 당 분야에 제공된 지침에 따라 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 염기쌍의 농도; 이온 강도 및 부적합 염기쌍의 발생률을 비롯한(이에 한정되지 않음) 다수의 변수를 고려하여 이중 구조의 안정성을 경험적으로 결정할 수 있다:(샘브룩 등의 문헌[Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)] 및 웨트머(Wetmur)의 문헌[Critical Review in Biochem. and Mol. Biol. 26(3/4):227-259 (1991)] 참고).
“프라이머”라는 용어는 핵산 사슬에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성을 유도하는 조건하에(즉, 적당한 완충액 및 적합한 온도에서 4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 연장제(예: DNA 폴리머라제 또는 역전사효소)의 존재하에) DNA 합성의 개시 지점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 지칭하는 것이다. 본원에서 사용되는 “프라이머”라는 용어는 연결(ligation)-매개된 증폭 방법에서 사용되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 이때 하나의 올리고뉴클레오타이드는 인접한 위치에서 하이브리드화되는 제2의 뉴클레오타이드와 연결에 의해 “연장”된다. 따라서, 본원에서 사용하는 “프라이머 연장”이라는 용어는 DNA 합성의 개시 지점으로서 프라이머를 사용하여 개별적인 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 중합하는 것과 두 프라이머를 연결하여 연장된 생성물을 형성하는 것 모두를 지칭한다.
바람직하게는 프라이머는 단일사슬의 DNA이다. 프라이머의 적당한 길이는 프라이머가 사용되는 용도에 좌우되지만, 전형적으로는 6 내지 50개의 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 충분히 안정한 하이브리드 착체를 형성하기 위해 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머는 주형 핵산의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만, 주형과 하이브리드화하기 위해서는 충분히 상보적이어야 한다. 주어진 표적 서열의 증폭을 위해 적절한 프라이머를 디자인하는 것은 당분야에 잘 공지되어 있고 본원에서 인용하는 문헌에 기술되어 있다.
프라이머는 프라이머를 감지하거나 또는 고정시킬 수 있지만 프라이머의 기본적인 특성, 즉 DNA 합성의 개시 지점으로서 작용하는 특성은 변화시키지는 않는 추가적인 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 표적 핵산에 하이브리드화되지는 않지만 증폭된 생성물의 클로닝을 용이하게 하는 추가적인 핵산 서열을 5′ 말단에 함유할 수도 있다. 하이브리드화되는 주형에 충분히 상보적인 프라이머의 영역을 본원에서는 하이브리드화 영역으로 지칭한다.
“표적”, “표적 서열”, “표적 영역” 및 “표적 핵산”이라는 용어는 증폭될 핵산 영역 또는 서열을 지칭한다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 프라이머 서열과 표적 서열간에 존재하는 부적합 수가 프라이머 서열과 샘플내에 존재할 수도 있는 비-표적 서열간에 존재하는 부적합 수보다 적은 프라이머는 표적 서열에 대해 “특이”한 것이다. 존재하는 부적합 수가 프라이머 서열과 표적 서열간에 존재하는 부적합 수보다 많지 않은 경우에만 안정한 이중 구조를 형성할 수 있는 조건이 하이브리드화 조건으로 선택될 수 있다. 이러한 조건하에서, 프라이머는 표적 서열과만 안정한 이중 구조를 형성할 수 있다. 따라서, 적당하게 엄격한 증폭 조건하에서 표적-특이적 프라이머를 사용하면, 서열-특이적 증폭 조건을 사용하면, 정확하게 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 서열을 특이적으로 증폭시킬 수 있다.
“비특이적 증폭”이라는 용어는 표적 서열 이외의 핵산 서열에 프라이머가 하이브리드화되어, 프라이머 연장의 기질로서 작용함으로써 일어나는 표적 서열 이외의 핵산 서열의 증폭을 지칭하는 것이다. 비-표적 서열에 프라이머가 하이브리드화되는 것은 “비특이적 하이브리드화”로 지칭되고, 이것은 보다 낮은 온도의 덜 엄격한 증폭전 조건하에서 발생할 수 있다.
“프라이머 이랑체”라는 용어는 주형-비의존적인 비특이적 증폭 생성물을 지칭하는 것으로, 이것은 다른 프라이머가 주형으로 작용한 프라이머 연장된 결과이다. 프라이머 이량체는 종종 2개의 프라이머의 콘캐터머(concatamer), 즉 이량체로 보이지만, 2개보다 많은 프라이머의 콘캐터머도 생성된다. “프라이머 이량체”라는 용어는 본원에서 일반적으로 주형-비의존적인 비특이적 증폭 생성물을 포함하도록 사용된다.
“반응 혼합물”이라는 용어는 주어진 반응을 실행하는데 필요한 시약을 함유하는 용액을 지칭힌다. “증폭 반응 혼합물”은 증폭 반응을 실행하는데 필요한 시약을 함유하는 용액을 지칭하는 것으로, 전형적으로 적당한 완충액에 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 DNA 폴리머라제 또는 리가제를 함유한다. “PCR 반응 혼합물”은 전형적으로 적절한 완충액에 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 열안정성 DNA 폴리머라제, dNTP 및 2가의 금속 양이온을 함유한다. 반응 혼합물은 반응에 필요한 모든 시약을 함유하는 경우 완전하다고 지칭하고, 필요한 시약의 단지 일부만을 함유하는 경우 불완전하다고 지칭한다. 당분야의 숙련자라면, 편리함, 저장 안정성의 이유로 또는 성분의 농도를 용도에 따라 조절하기 위하여, 일반적으로 반응 성분들을 각각 전체 성분중 일부를 함유하는 개별적인 용액으로 저장한다는 사실과 완전한 반응 혼합물을 생성하기 위해 반응 전에 반응 성분들을 배합한다는 사실을 이해할 수 있을 것이다. 게다가, 당분야의 숙련자라면 반응 성분이 시판을 위해 개별적으로 포장되어 있다는 사실과 유용한 시판중이 키트는 본 발명의 개질된 프라이머를 포함하는 임의의 반응 성분 부분집합을 함유할 수도 있음을 이해할 것이다.
[개질된 프라이머]
본 발명의 증폭 프라이머는 프라이머의 3′-말단에 있는 4가지 뉴클레오타이드중 하나에 개질기를 공유 결합시켜 개질시킨다. 한가지 양태에서, 본 발명의 개질된 프라이머는 하기 화학식 1a 또는 화학식 1b의 구조를 갖는 핵산 서열로 구성된다:
[화학식 1a]
[화학식 1b]
상기 식에서, S1은 길이가 뉴클레오타이드 약 5 내지 약 50개인 뉴클레오타이드의 제1서열을 나타내고; S2는 길이가 뉴클레오타이드 1 내지 3개인 제2서열을 나타내고; N은 고리외 아민을 함유하는 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기를 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내고; R은 개질기를 나타내는 것으로, 고리외 아민에 의해 N에 공유결합되며, 이때 R은 상기 화학식 2의 구조를 갖는다.
실시예에서 제시하는 바와 같이, 3′-말단 뉴클레오타이드를 개질시키는 경우 개질의 효과는 극대화된다. 따라서, 3′-말단 개질된 뉴클레오타이드를 함유하는 프라이머가 바람직하다.
개질되는 뉴클레오타이드는 그의 염기가 상보적인 뉴클레오타이드와의 뉴클레오타이드 염기 짝짓기에 관련되는 고리외 아민을 함유하는 것중에서 선택된다. 전형적으로, 프라이머는 통상적인 뉴클레오타이드만을 함유하는 DNA이다. DNA에 전형적으로, 프라이머는 통상적인 뉴클레오타이드만을 함유하는 DNA이다. DNA에서 발견되는 4가지의 통상적인 뉴클레오타이드중 아데닌, 구아닌 및 시토신은 고리외 1급 아민을 함유하고, 이 아민은 상보적인 염기와의 염기 짝짓기에 관련된다. 본 발명의 바람직한 양상으로, 고리외 아민에 하나의 개질기를 결합시켜 아민기의 두 수소(비개질된 염기에서는 염기 짝짓기에 관련될 수 있음)중 하나를 치환시킴으로써 프라이머를 개질시킨다. 개질된 아데닌, 구아닌 및 시토신 염기를 함유하는 개질된 뉴클레오타이드의 구조는 각각 다음과 같다:
상기 식에서, S는 당 잔기를 나타내고, R은 개질기를 나타낸다.
본 발명은, 통상적인 뉴클레오타이드로 구성된 프라이머로 한정되는 것은 아니다. 염기 잔기가 상보적인 염기와의 염기 짝짓기에 관련되는 고리외 1급 아민을 함유하는 뉴클레오타이드 유사체는 어느 것이나 전술한 바와 같이 개질가능하다. 비통상적인 뉴클레오타이드의 예로는 3-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 3-메틸구아닌, 5-메틸 시토신 및 5-하이드록시메틸 시토신을 들 수 있다.
개질기가 한개의 수소원자를 치환하기 때문에, 개질기는 수소 결합에 참여하는 개질된 염기의 능력을 제한한다. 나머지 수소 원자는 여전히 수소 결합에 참여할 수 있다. 따라서 개질제는 하이브리드화 반응의 동역학 및 열역학 모두에 영향을 미칠 수 있다. 다음 특성을 갖는 다양한 개질기를 계획한다:
1. 상보적인 염기와 개질된 염기의 왓슨-크릭 염기 짝짓기를 간섭하지만 방해하지는 않고,
2. 개질된 프라이머의 연장을 간섭하지만 방해하지는 않고,
3. 개질된 프라이머의 연장 생성물에 상보적인 사슬을 합성하게 한다.
개질기는 염기 짝짓기를 입체적으로 간섭하여 프라이머의 연장을 간섭한다. 따라서, 개질제의 물리적인 부피는 하이브리드화의 간섭에 영향을 미친다. 개질된 아데노신 또는 시티딘 뉴클레오타이드를 이중사슬 핵산에 도입하는 경우, 개질기는 큰 골(major groove)의 중앙 공간으로 돌출된다. 그 결과, 비교적 큰 개질기라도 이중 구조의 입체 구조를 거의 교란시키지 않는다. 그러나, 적합한 개질제는 수소 결합을 방해하거나 또는 프라이머의 3′-하이드록실의 효소적 연장을 방해할 만큼 거대하지는 않다. 개질된 구아노신 뉴클레오타이드가 이중사슬 핵산에 도입되는 경우, 개질기는 개질기의 부피를 수용하기에는 작은 공간을 제공하는 작은 골(minor groove)쪽으로 돌출된다. 결과적으로, 구아닌 염기에 결합되기 위해서는 보다 작은 개질기가 바람직하다.
후속적인 증폭 주기에서 주형으로 사용될 수 있는 프라이머 연장 생성물은 프라이머에 의해 도입된 개질된 염기를 함유한다. 개질기는 주형내에 개질된 염기가 존재하여 프라이머 연장을 종결시키거나 또는 프라이머 연장을 억제시키지 않도록 선택된다. 바람직하게는, 개질기의 성질은 돌연변이를 일으키지 않아서, 개질된 염기의 고유의 성질이 프라이머 유도된 주형의 복제시 상실되어야만 한다. 프라이머 연장에 대한 주형내 개질된 염기의 효과는 본원 및 당분야에 제공된 다음 지침에 따라 일반적으로 시험될 수 있다(예를 들어, 니아즈도우스키(Gniazdowski) 및 세라(Cera)의 문헌[Chem. Rev. 96:619-634 (1996)] 참고).
상기 특성을 만족시키는 개질기 R은 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당하다. 바람직한 개질기는 하기 화학식 2의 구조를 갖는다:
[화학식 2]
상기 식에서, R1및 R2는 독립적으로 수소, C1-C10알킬기, 알콕시기, 페닐기, 페녹시기, 치환된 페닐기, 나프틸기 또는 치환된 나프틸기를 나타낸다. 알킬기는 분지쇄 또는 선형일 수도 있다. 보다 큰 알킬기인 C20이하의 알킬기를 사용할 수도 있다.
바람직한 양태에서, R은 2-나프틸메틸기; 벤질기; 또는 치환된 벤질기이다. 바람직한 치환된 벤질기는 하기 화학식 3의 구조를 갖는다:
[화학식 3]
상기 식에서, R3은 C1-C6분지형 또는 선형 알킬기이고, 보다 바람직하게는 C1-C4분지형 또는 선형 알킬기, 메톡시기 또는 니트로기이다. C1-C4분지형 또는 선형 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소-프로필, 이소-부틸, 3급-부틸 등이다. 메틸 및 3급-부틸이 바람직한 알킬기이다. 바람직하게는, R3은 파라 위치에 결합된다.
특히 바람직한 개질기 R은 다음과 같다:
다수의 특정한 개질기는 실시예에 기술되어 있다. 일반적으로, 당분야의 숙련자들은 보통 본원에서 제공하고 있는 지침에 따라, 기술되어 있는 일련의 화합물 중에서 적합한 특정 개질기를 경험적으로 선택할 수 있다. 특정 기가 적합한지의 여부는 증폭 반응에서 개질된 프라이머를 사용함으로써 경험적으로 결정하는 것이 바람직하다. 성공적인 증폭이란 개질된 염기가 프라이머 연장을 완전히 억제하지 않고, 프라이머 유도된 주형에서 개질된 염기의 존재로 인해 프라이머 연장이 종결되지 않음을 나타낸다. 프라이머 이량체의 감소는 실시예에서 기술하는 바와 같이 측정된다.
[광-불안정한 개질된 프라이머]
본 발명의 선택적인 양태에서, 프라이머는 1종 이상의 광-불안정한 기로 개질되며, 이때 광-불안정한 기는 반응이 특이성을 보장하는 고온의 반응 조건에 도달한 후, 광선에 노출시켜 제거할 수 있다. 프라이머 연장전에 개질기가 제거되기 때문에, 개질된 프라이머가 개질기를 제거하기 전에 연장성일 필요는 없다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 광-불안정한 개질기의 예는 필라이(Pillai)의 문헌[“Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis”, Synthesis: 1-26 (1980)]에 기술되어 있다.
본 발명의 광-불안정성 프라이머는 3′-말단 뉴클레오타이드에서 일반식의 하나 또는 두개의 o-니트로벤질기를 결합시켜 개질시키는 것이 바람직하다.
하나의 니트로벤질기를 염기 잔기중 고리외 1급 아민에 결합시켜 개질된 프라이머에서, 생성된 2급 아민은 나머지 수소가 상보적인 염기를 향하여 배향되도록 아민기가 회전되는 경우, 여전히 염기 짝짓기에 참여할 수 있다. 실시예에서 기술한 바와 같이, 이러한 프라이머는 UV 광선으로 조사시켜 제거하거나 또는 제거하지 않은 채 증폭에서 사용될 수 있다.
두개의 니트로벤질기가 염기의 고리외 아민에 결합되어 개질된 프라이머는 연장될 수 없다. 고리외 아미의 두 수소가 거대한 니트로벤질기로 대체되기 때문에 개질된 염기는 염기 짝짓기를 할 수 없고, 따라서 프라이머 연장이 억제되는 것으로 추측된다. 증폭 과정에 두개의 니트로벤질기로 개질된 프라이머를 사용하는 것은 실시예에 기술되어 있으며, 이 증폭 과정에서 반응 혼합물은 니트로벤질기가 제거되기에 충분한 시간 동안 UV 광선에 노출된 다음 프라이머 연장이 이루어졌다.
선택적인 양태에서, 개질기는 고리 질소에 결합된다. 염기의 고리 질소에 니트로벤질기가 결합하여 개질된 프라이머는 개질된 염기가 염기 짝짓기를 할 수 없기 때문에 연장될 수 없다. UV 광선에 노출시켜 니트로벤질기를 제거하면 프라이머 연장이 일어난다.
개질기가 제거되어야 비로소 연장될 수 있는 광-불안정한 프라이머를 사용하면 근본적으로 “고온-출발”의 증폭이 제공된다. 프라이머 연장은 비특이적 반응전 조건에서는 억제된다. 반응 온도가 반응 특이성을 보장하는 온도까지 승온된 후에만 반응물을 조사시켜 프라이머를 탈보호시킨다.
[개질된 프라이머의 합성]
개질된 프라이머를 합성하는 것은 당분야에 널리 공지되어 있는 표준 화학 방법을 사용하여 실행한다. 이러한 개질제를 도입시키는 방법은 4가지 종류로 나눠진다.
1. DNA 합성 지지체로서 개질된 뉴클레오타이드를 사용하여 개질제를 도입할 수 있다.
2. 포스포르아미다이트로서 개질된 뉴클레오타이드를 사용하여 개질제를 도입할 수 있다.
3. DNA 합성중에 시약을 사용하여 개질제를 도입할 수 있다(예: DNA 서열에 도입되는 경우 변환가능한 아미다이트를 벤질아민 처리함).
4. 합성 DNA와 접촉할 때 반응성 시약으로 개질제를 도입할 수 있다(합성후 개질).
개질된 특정 프라이머의 합성은 실시예에 기술되어 있다. 추가의 개질된 프라이머는 유사 방법으로 표준 합성 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
개질된 프라이머는 유도화된 조절 다공질 유리(CPG) 합성 지지체를 사용하여 합성하는것이 바람직하다. 유도화된 dA CPG를 합성하는 일반적인 반응식을 제6도에 제시하였다. 특정한 개질기는 적당한 알킬-할라이드, 벤질-할라이드, 치환된 벤질 할라이드, 메틸나프틸-할라이드 또는 치환된 메틸나프틸-할라이드 알킬화제를 사용하여 첨가할 수 있다. 실시예 1 및 실시예 2에 기술된 벤질- 및 p-3급-부틸벤질-dA CPG의 합성은 제6도에 제시된 반응식에 따른다.
고리외 아민기를 알킬화시키는 것은 그리핀(Griffin) 및 리즈(Reese)의 문헌[Biochim. Acta 68:185-192 (1963)]에 기술되어 있는 메틸화와 유사한 방법을 사용하여 실행할 수 있다. 추가의 합성 방법은 아리토마(Aritoma) 등의 문헌[J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1:1837-1849 (1995)]에 기술되어 있다.
[개질된 프라이머의 증폭]
본 발명의 방법은 본 발명의 개질된 프라이머를 사용하여 프라이머-기제의 증폭을 실행함을 포함한다. 일반적으로, 개질된 프라이머는 프라이머-기제의 증폭 과정에서 증폭 반응 조건의 어떠한 변화없이도 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비개질된 프라이머와 대체될 수 있다. 물론, 당분야의 숙련자라면 일부 반응에서는 반응 조건을 일상적으로 사소하게 다시 최적화시키는 것이 이롭다는 것을 인식할 것이다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 개질된 프라이머는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 사용된다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정한 증폭 시스템에 제한되지는 않는다. 본 발명의 개질된 프라이머는 프라이머 이량체 또는 비특이적 증폭 생성물을 형성할 수 있는 임의의 프라이머-기제의 증폭 시스템에 사용될 수 있다 .실시예는 앞에서 인용한 참고문헌에 기술된 증폭 방법을 포함한다. 다른 시스템이 개발되면 그들 시스템도 본 발명을 실시하여 이익을 얻을 것이다.
본 발명의 방법은 DNA 및 RNA의 증폭에 적합하다. 예를 들어, 역전사/폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하는 RNA의 증폭은 당분야에 공지되어 있으며, 미국 특허 제5,322,770호 및 미국 특허 제5,310,652호 및 마이어스(Myers)와 겔판드(Gelfand)의 문헌[biochemistry 30(31):7661-7666 (1991)] 영(Young) 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 31(4):882-886 (1993)] 및 멀더(Mulder) 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 32(3):292-300 (1994)]에 기술되어 있다.
프라이머-기제의 증폭에서, 프라이머 연장은 전형적으로 열안정성 DNA 폴리머라제와 같이 열안정성 효소를 사용하여 고온에서 실행된다. 이 효소는 프라이머의 3′-말단에서 합성을 개시하고 합성이 종결될 때까지 주형의 5′-말단을 향하여 진행한다. 증폭 반응에서 유용한 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제는 당분야에 널리 공지되어 있으며, 미국 특허 제4,889,818호; 미국 특허 제5,079,352호; 미국 특허 제5,352,600호; 미국 특허 제5,491,086호; 제WO 91/09950호; 제WO 92/03556호; 제WO 92/06200호; 제WO 92/06202호; WO 제92/09689호 및 미국 특허 제5,210,036호에 기술되어 있는 효소를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 열안정성 DNA 폴리머라제에 대한 개론은 아브램선의 문헌[PCR Strategies (이니스 편집), pp 39-57, Academic Press, 미국 샌디에고 소재 (1995)]에서 제공하고 있다.
특히 DNA 증폭을 위한 바람직한 양태에서, 증폭은 가역적으로 불활성화된 효소를 사용하여 실행된다. 고온의 반응 조건에서 재활성화되는 가역적으로 불활성화된 효소를 사용하면, 반응 시작전에 프라이머 연장을 억제시킴으로써 비특이적 증폭을 추가로 감소시킨다. 호프만-라 롯슈(Hoffmann-La Roche)(미국 뉴저지주 너틀리 소재)에서 개발하여 제조하고, 퍼킨 엘머(미국 코넥티컷주 노웍 소재)에서 판매하는 가역적으로 불활성된 열안정성 DNA 폴리머라제는 버치(Birch) 등의 문헌[Nature, 381(6581):445-446 (1996)]에 기술되어 있다.
효소의 프라이머 연장 능력에 대한 개질기의 영향은, 부분적으로는 사용되는 특정 효소에 좌우되고, 부분적으로는 선택된 반응 조건에 좌우된다. 예를 들어, Tth DNA 폴리머라제는 일부 RNA 증폭에서와 같이 2가 양이온으로서 Mg2+보다 Mn2+가 사용되는 경우 보다 복제가 용이하다. 숙련자라면 적합한 개질기를 선택할 때, 효소 및 반응 조건을 고려해야함을 인식할 것이다.
증폭 반응에 적합한 샘플의 제조 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 인용된 문헌에 충분히 기술되어 있다. 사용되는 특정 방법은 본 발명에서 중요하지 않다. 당분야의 숙련자라면 공지된 샘플 제조 방법에 사용하기 위해 반응 조건을 최적화시킬 수 있다.
증폭된 핵산의 분석법은 당분야에 널리 공지되어 있고 본원에 인용된 문헌에 충분히 기술되어 있다. 사용되는 특정 방법은 본 발명에서 중요하지 않다. 당분야의 숙련자라면 용도에 따라 적당한 분석법을 선택할 수 있다.
증폭 반응을 분석하기에 바람직한 방법은 히구치(Higuchi) 등의 문헌[Bio/Technology 10:413-417 (1992)]; 히구치 등의 문헌[Bio/Technology 11:1026-1030 (1993)]; 유럽 특허 공개 공보 제512,334호 및 유럽 특허 공개 공보 제640,828호에 기술하고 있는 바와 같이, 반응 혼합물내의 이중사슬 DNA의 총량을 증가를 모니터하는 것이다. 본원에서 “동역학적 PCR”로 지칭되는 본 방법에서, 이중사슬 DNA의 검출은 이중사슬 DNA와 결합될 때 에티디움 브로마이드(EtBr) 및 다른 DNA 결합 표식이 나타내는 증가된 형광에 의존한다. 증폭은 표식의 존재하에 실행된다. 표적 서열의 합성의 결과로 이중사슬 DNA가 증가하면, 형광도 감지할 수 있게 증가하며, 이것을 증폭 과정동안 모니터한다. 따라서, 본 방법에 의해 증폭 반응의 진행을 모니터할 수 있다.
동역학적 PCR에서, 측정된 형광은 비특이적 증폭의 결과든지 또는 표적 서열의 증폭의 결과든지 존재하는 이중사슬 DNA의 총량에 의존한다. 형광을 모니터하면 이중사슬 DNA의 총량의 증가를 측정할 수 있으나, 표적 서열의 증폭으로 인한 증가분을 비특이적 증폭 생성물로 인한 증가분과 무관하게 측정하지는 못한다. 본 발명의 개질된 프라이머는 형성된 프라이머 이량체의 양을 감소시킬 뿐만 아니라 감지할 만한 양의 프라이머 이량체의 형성을 지연시키기 때문에 동역학적 PCR에서 특히 유용하다. 표적 서열이 상당히 증가할 때까지 프라이머 이량체의 형성이 지연되면, 표적 서열의 증폭을 독립적으로 모니터할 수 있고, 프라이머 이량체로 인한 간섭을 최소화할 수 있다.
[키트]
본 발명은 또한 키트, 즉 본 방법을 실시하는데 있어서 유용한 구성요소를 포함하는 다용기 장치에 관한 것이다. 유용한 키트는 핵산 증폭을 위한 프라이머, 즉 그중 1종 이상이 전술한 바와 같이 개질된 프라이머를 함유한다. 키트의 다른 선택적인 구성요소로는, 예를 들어 프라이머 연장 생성물의 합성을 촉진시키는 시약, 기질인 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 적당한 반응 완충액 및 본 방법을 실행할 수 있는 기기를 들 수 있다.
하기에 제시된 본 발명의 실시예는 본 발명의 목적을 설명하기 위해 제공된 것으로, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 당분야의 숙련자는 본 명세서와 하기의 실시예를 읽어보면, 실시예 다음의 청구의 범위에 속하는 본 발명의 다수의 양태를 알 수 있을 것이다.
[실시예 1]
[벤질기로 개질된 프라이머의 합성]
벤질기를 첨가하여 개질된 프라이머는 하기에서 기술할 두 방법 중 하나의 방법으로 합성되었다. 3′-말단 염기에서 개질된 프라이머는 DNA 합성을 개시하기 위해서 N6-벤질데옥시아데노신 조절 다공질 유리(CPG)를 사용하여 합성하였다. 내부 염기가 개질된 프라이머는 N6-벤질데옥시아데노신 포스포르아미다이트를 사용하여 합성하였다.
다음의 표준 약자를 실시예에서 사용하였다:
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘;
DMF: N,N-디메틸포름아미드;
TEA: 트리에틸아민;
EDC: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드;
THF: 테트라하이드로푸란;
DMT: 4,4′-디메톡시트리틸;
LCAA-CPG: 장쇄 알킬 아미노 조절 다공질 유리.
[I. N6-벤질데옥시아데노신 CPG의 합성]
[제1단계: N6-벤조일,N6-벤질-5′-O-DMT-2′데옥시아데노신의 합성]
N6-벤조일-5′-O(4,4′-디메톡시트리틸)-2′-데옥시아데노신(657㎎, 1.0m㏖; 미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리치 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Co.))에 피리딘(10㎖)을 첨가하고, 혼합물을 진공하에서 증발시켜 건조시켰다. 이것을 되풀이하였다. 생성된 발포체를 무수 DMF(15㎖; 미국 위스콘신주 밀워키 소개의 알드리히 케미탈 캄파니)에 용해시키고, 5℃까지 냉각시켰다. 수소화 나트륨(44㎎, 1.1m㏖, 1.1 당량. 오일내의 60% 분산액)을 아르곤 분위기에서 첨가하고, 45분 동안 실온에서 교반시켰다. 벤질 브로마이드(143㎕, 206㎎, 1.2m㏖, 1.2 당량; 미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리히 케미칼 캄파니)를 2분동안 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 진공하에서 증발시켜 건조시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에(각각 10㎖씩) 분배시켜 추출하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(10㎖)로 다시 추출시키고, 추출액을 모아 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고 여과시킨 다음 증발시켰다. 조질의 생성물을 메탄올, 트리에틸아민, 메틸렌 클로라이드(3:0.5:96.5)를 사용하여 실리카 겔(75g)에서 컬럼 크로마토그래피하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 모아 증발에 의해 건조시키고, 예상된 N6-벤조일,N6-벤질-5′-O-DMT-2′-데옥시아데노신(410㎎, 54%)을 수득하였다. 생성물의 구조는 NMR로 확인하였다.
[제2단계: 숙시닐화]
N6-벤조일,N6-벤질-5′-O-DMT-2′-데옥시아데노신(295㎎, 0.39m㏖)에 피리딘(10㎖)을 첨가하고, 고 진공하에서 증발시켜 혼합물을 건조시켰다. 이 단계를 되풀이하였다. 추가의 무수 피리딘(10㎖)을 숙신산 무수물(200㎎, 2m㏖, 5.0 당량) 및 DMAP(24㎎)와 함께 첨가하고, 이 용액을 실온에서 밤새 아르곤 분위기에서 교반하였다. 진공하에서 대부분의 용매를 제거하고, 잔류물을 메틸렌 클로라이드(20㎖)와 나트륨 시트레이트 용액(20㎖, 0.1M, pH 5.0) 사이에 분배시켜 추출하였다. 수성 상을 보다 많은 메틸렌 클로라이드(20㎖)로 추출하고, 추출액을 모아 무수 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과한 다음 증발에 의해 건조시켰다. 생성물을 에틸 아세테이트, 트리에틸아민, 메틸렌 클로라이드(32:1:67)를 사용하여 실리카 겔(4.5g)에서 컬럼 크로마토그래피하여 정제하여, 예상된 3′-숙시네이트 에스테르, 즉 N6-벤조일,N6-벤질-3′-숙시네이트-5′-O-DMT-2′-데옥시아데노신(247㎎, 74%)을 수득하였다.
[제3단계: CPG의 유도화]
산으로 세척한 CPG는 다음과 같이 제조하였다. LCAA-CPG(1g, LCA00500C, 500Å, 88.6㏖/g; 미국 뉴저지주 페어필드 소재의 CPG 인코포레이티드))를 실온에서 20분동안 주지적으로 저으면서 디클로메탄내 디클로로아세트산(2%, 20㎖)으로 세척하였다. 산으로 세척한 CPG를 유리 프리트(frit)로 여과하고, 산이 없어질 때까지 디클로로메탄으로 세척하였다. 이렇게 생성된 분말을 공기 건조시키고, 그 다음 실온에서 밤새 진공하에서 건조시켰다.
개질된 뉴클레오사이드 중간체를 산으로 세척한 CPG에 결합시키는 것은 다음과 실행하였다. 디클로로메탄(10㎖)내의 전술한 바와 같이 제조된 N6-벤조일,N6-벤질-3′-숙시네이트-5′-O-DMT-2′-데옥시아데노신(170㎎, 0.2m㏖)에 TEA(100㎕)를 첨가하고, 이 용액을 아르곤 분위기에서 약 5㎖가 될 때까지 농축시켰다. DMAP(12㎎, 0.1m㏖, 0.5 당량),TEA(100㎕), EDC(384㎎, 2.0m㏖, 10 당량) 및 상기의 산으로 세척한 CPG를 순서대로 첨가하였다. 무수 피리딘(5㎖)을 첨가하고, 혼합물을 봉한 다음 실온에서 3일 동안 교반하였다. 진공하에서 CPG를 여거하고, 이소프로판올에 이어서 디클로로메탄으로 광범위하게 세척하고, 공기 건조시킨 다음 1시간 동안 진공하에서 건조시켰다.
유도화된 CPG의 캡핑(capping)을 다음과 같이 실행하였다. 건조 유도화된 CPG에 Cap A 및 Cap B 용액(각각 5㎖, 아세트산 무수물/2,6-루티딘/THF 및 THF내 10% N-메틸이미다졸; 미국 버지니아주 스털링 소재의 글렌 리서치(Glen Research)의 DNA 합성 시약)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 진공하에서 CPG를 여거하고, 이소프로판올에 이어서 디클로로메탄으로 광범위하게 세척하고, 공기 건조시킨 다음 진공하에서 건조시켰다.
[II. N6-벤질 데옥시아데노신 포스포르아미다이트의 합성]
N6-벤조일,N6-벤질-5′-O-DMT-2′-데옥시아데노신을 전술한 바와 같이 합성하였다.
무수 THF(8㎖)내 N6-벤조일,N6-벤질-5′-O-DMT-2′-데옥시아데노신(196㎎, 0.26m㏖)에 디이소프로필에틸아민(350㎕, 270㎎, 2.04m㏖, 7.8 당량) 및 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트(161㎎, 0.68m㏖, 2.6 당량; 미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리히 케미칼 캄파니)를 첨가하고 혼합물을 아르곤 분위기에서 실온에서 30분동안 교반하였다. 진공하에서 용매를 제거하고 잔류물을 중탄산나트륨 용액(5%, 20㎖)과 에틸 아세테이트(20㎖) 사이에 분배시켰다. 유기 상을 중탄산나트륨 용액, 물에 이어서 포화 염수로 세척하고(각각 20㎖씩), 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켰다. 잔류물을 아세톤/핵산/TEA(34:65:0.7)를 사용하여 실리카 겔(4g)에서 컬럼 크로마토그래피하여 정제하여, 목적하는 포스포르아미다이트(248㎎, 100%)를 수득하였다.
[III. DNA 합성, 정제 및 분석]
벤질 유도화된 아데노신 CPG(25㎎, 1.0㏖)를 비어있는 합성 컬럼(미국 버지니아주 스털링 소재의 글렌 리서치)으로 옮기고, 통상적인 합성 및 탈보호 조건을 사용하여 ABI 374 DNA 합성기(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 퍼킨 엘머, 어플라이드 바이오시스템즈 디비젼(Applied Biosystems Division))에서 올리고뉴클레오타이드를 제조하는데 사용하였다. 조질의 DMT-DNA를 정제하여, 이것을 레이닌(Rainin) HPLC 시스템(미국 매사츄세츠주 우번 소재의 레이닌 인스트루먼트캄파니(Rainin Instrument Co.))에서 레이닌 퓨어-DNA 컬럼(Rainin Pure-DNA Column)을 사용하여 표준 DMT 온/오프(On/Off) HPLC에 의해 5′-하이드록시-DNA로 전환시켰다. 올리고뉴클레오타이드를 ABI 모세관 전기영동 시스템(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 퍼킨 엘머, 어플라이드 바이오시스템즈 디비젼)을 사용하거나 또는 다이오넥스 뉴클레오팩 컬럼(Dionex Nucleopak column)(미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 다이오넥스 코포레이션(Dionex Corp.))에서 변성 음이온-교환 HPLC 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다.
유사하게, 내부 개질된 프라이머의 합성은 비개질된 CPG를 사용하여 실행하였고, 개질된 포스포르아미다이트는 전술한 바와 같이 합성하였다.
[실시예 2]
[t-부틸-벤질기로 개질된 프라이머의 합성]
본 실시예는 3′-말단 아데노신에서 p-3급부틸벤질기로 개질된 프라이머의 합성을 기술한다. 개질된 프라이머는 N6-(p-3급-부틸벤질)데옥시아데노신 CPG를 사용하는 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 1에서 기술한 바와 같이 합성되었다. 유도화된 CPG의 합성은 다음과 같다.
[제1단계: N6-벤조일-N6-(p-3급-부틸벤질)-5′-O-(4,4′-디메톡시트리틸)-2′-데옥시아데노신의 합성]
N6-벤조일-5′-O-(4,4′-디메톡시트리틸)-2′-데옥시아데노신(658㎎, 1.0m㏖)에 DMF(무수물, 10㎖)를 첨가하고, 건조될 때까지 증발시켰다. 이것을 되풀이하였다. 추가의 DMF(10㎖)를 아르곤 분위기에서 첨가하였다. 수소화 나트륨(44㎎, 1.1m㏖, 오일내의 60% 분산액)을 첨가하고, 이 혼합물을 0.5 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 4-(3급-부틸)벤질 브로마이드(272㎎, 1.2mmole)를 적가시키고 밤새 실온에서 교반하였다. 진공하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이와 물 사이에(각각 20㎖씩) 분배시켜 추출하였다. 유기 상을 물로 세척하고(3회, 20㎖), 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고 여과시킨 다음, 건조될 때까지 증발시켰다. 조질의 생성물을 메틸렌 클로라이드/메탄올/트리에틸아민(96.5:3:0.5)을 사용하여 실리카 겔(100g)에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, N6-벤조일,N6-(p-3급-부틸벤질)-5′-O-(4,4′-디메톡시트리틸)-2′-데옥시아데노신(229㎎, 28.5%)을 수득하였다.
[제2단계; 숙시날화]
N6-벤조일,N6-(p-3급-부틸벤질)-5′-O-(4,4′-디메톡시트리틸)-2′-데옥시아데노신(217㎎, 0.27m㏖)을 피리딘(10㎖)내 숙신산 무수물(135㎎, 5 당량) 및 DMAP(17㎎, 0.5 당량)으로 처리하였다. 상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이 후처리하고, 크로마토그래피하여, N6-벤조일,N6-(p-3급-부틸벤질)-5′-O-(4,4′-디메톡시트리틸)-2′-데옥시아데노신, 3′-O-숙시네이트(199㎎, 82%)를 수득하였다.
[제3단계: CPG의 유도화]
상기 제2단계로부터 수득한 숙시네이트(180㎎, 0.2m㏖)를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 산으로 세척한 LCAA-CPG로 처리하였다. CPG를 캡핑하고 진공건조시켜, N6-벤조일,N6-(p-3급-부틸벤질)-5′-O-(4,4′-디메톡시트리틸)-2′-데옥시아데노신, 3′-O-숙시네이트 유도화된 CPG(1.065g)를 수득하였다.
[실시예 3]
[메틸기로 개질된 프라이머의 합성]
3′-말단 아데노신에서 메틸기로 개질된 프라이머를 N6-메틸 dA CPG(22㎎, 1μmole, 미국 버지니아주 스털링 소재의 글렌 리서치)를 사용하여 합성하였다. N6-메틸 dA CPG를 비어있는 컬럼에 넣고, 합성 및 탈보호의 표준 조건에 따라 프라이머를 제조하였다. 프라이머를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 DMT 온/오프 HPLC 방법을 사용하여 정제하였다.
[실시예 4]
[광-불안정한 개질된 프라이머의 합성]
본 실시예는 3′-말단 아데노신에서 1개 또는 2개의 니트로벤질기로 개질된 프라이머의 합성을 기술한다. 개질된 프라이머는 모노니트로벤질 dA CPG 또는 비스니트로벤질 dA CPG를 사용한 것을 제외하고는, 본질적으로는 실시예 1에서 기술한 바와 같이 합성하였다.
[I. 모노니트로벤질화된 프라이머]
N6-벤조일,N6-벤질-2′-데옥시아데노신 유도화된 CPG(실시예 1 참고)의 일반적인 합성법을, 알킬화제로서 오르토-니트로벤질브로마이드의 치환에 의해 N6-벤조일,N6-오르토-니트로벤질-2′데옥시아데노신 유도화된 CPG 합성에 적용하였다. CPG를 위한 후속 단계는 실시예 1에서 기술한 바와 동일하지만, 그외에 알루미늄 호일로 반응 플라스크를 감싸서 주위 광선으로부터 중간체를 보호한다.
유도화된 CPG를 합성한 다음, 프라이머를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 합성하였고, 제조자가 기술한 프로토콜을 사용하여 넨소브 프레프(Nensorb Prep) 일회용 컬럼(미국 매사츄세츠주 보스톤 소재의 듀퐁 캄파티(Du Pont Co.), NEN 리서치 프러덕츠 바이오테크놀로지 시스템즈(NEN Research Produnts Biochnology Systems))을 사용하여 고상 추출에 의해 프라이머를 단리하였다.
[II. 비스니트로벤질화된 프라이머]
비스니트로벤질 데옥시아데노신 CPG를 전술한 바와 같이 합성하였다. 유도화된 CPG를 합성한 다음, 모노니트로벤질 프라이머에 대해 기술한 바와 같이 프라이머를 합성하고 정제하였다.
[제1단계: 5′-O-DMT-N6-비스-오르토-니트로벤질-2′-데옥시아데노신의 합성]
진공하에서 2′-데옥시아데노신 일수화물(538㎎, 2.0m㏖, 미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리히 케미칼)을 무수 피리딘(2회, 10㎖)으로 증발시켜 건조시켰다. 잔류물을 아르곤 분위기에서 무수 DMF(10㎖, 미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리히)에 용해시키고, 수소화 나트륨(88㎎, 2.2m㏖, 1.1 당량, 오일내 60%의 분산액)을 첨가하고, 실온에서 40분동안 교반하였다. 2-니트로벤질 브로마이드(710㎎, 3.3m㏖, 1.5 당량)를 첨가하고, 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 진공하에서 DMF를 증발시켜 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에(각각 20㎖) 분배시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트(20㎖)로 추출시키고, 추출액을 모아 물(20㎖)로 세척하고, 황산 마그네슘으로 건조시키고, 여과한 다음 증발시켰다. 조질의 생성물을 실리카 겔(50g, CH2CH2내 3% MeOH 사용)에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 2′-데옥시-N6-비스-오르토-니트로벤질아데노신(320㎎, 30%)을 수득하였다.
2′-데옥시-N6-비스-오르토-니트로벤질아데노신(200㎎, 0.518m㏖)에 무수 피리딘(10㎖)을 첨가하고 건조될 때까지 증발시켰다. 피리딘(10㎖)을 첨가하고, 그 다음 4,4′-디메톡시트리틸 클로라이드(900㎎, 2.3m㏖, 4.5 당량) 및 트리에틸아민(280㎎, 2.76m㏖, 4.0 당량)을 첨가한 다음, 5시간 동안 아르곤 분위기의 실온에서 교반하였다. 물(0.5㎖)을 첨가하고 20분 동안 교반하였다. 혼합물을 에테르 및 물(각각 20㎖)에 분배시키고, 수성 상을 에테르(20㎖)로 다시 추출하였다. 추출액을 모아 물(20㎖)로세척하고 무수 황산 나트륨을 건조시킨 다음, 여과하고 증발시켰다. 이렇게 얻어진 물질을 실리카 겔(4g, 메틸 클로라이드내 0.7 내지 2.5%의 메탄올)에서 크로마토그래피로 정제하여, 5′-O-DMT-N6-비스-오르토-니트로벤질-2′-데옥시아데노신(121㎎, 33%)을 수득하였다.
[제2단계: 숙시닐화]
5′-O-DMT-N6-비스-오르토-니트로벤질-2′-데옥시아데노신(121㎎, 0.145m㏖)을 무수 피리딘(2회, 3㎖)과 함꼐 증발시켜 건조시켰다. 피리딘(3㎖), 숙신산 무수물(58㎎, 0.58m㏖, 4 당량) 및 DMAP(11㎎, 촉매)를 첨가하고, 용액을 3일 동안 실온에서 교반하였다. 진공하에서 용액을 증발시키고, 잔류물을 메틸렌 클로라이드(10㎖) 및 나트륨 시트레이트 완충액(0.1M, pH 5.0, 10㎖) 사이에 분배시켰다. 유기 상을 무수 황산 나트륨으로 건조시키고 여과한 다음, 건조될 때까지 증발시켰다. 조질의 생성물을 실리카 겔(2g, EtOAc/CH2CH2/TEAA(32:67:1) 10㎖에 이어서 MeOH/CH2CH2(3:97) 25㎖를 사용)에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 연황색 발포체로서 5′-O-DMT-N6-비스-오르토-니트로벤질-2′-데옥시아데노신-3′-O-숙시네이트(138㎎, 99.5%)를 수득하였다.
[제3단계: CPG의 유도화]
산으로 세척한 LCAA-CPG를 실시예 1에서와 같이 제조하였다.
개질된 뉴클레오사이드 중간체를 산으로 세척한 CPG에 결합시키는 것은 다음과 같이 실행하였다. 5′-O-DMT-N6-비스-오르토-니트로벤질-2′-데옥시아데노신-3′-O-숙시네이트(37㎎, 0.04m㏖)를 호박색 유리 바이알(vial)중에서 TEA(16ℓ)로 처리하고 증발시켰다. 이 잔류물에 무수 피리딘(1.5㎖), TEA(2㎕), DMAP(2.4㎎), EDC(76㎎, 0.04m㏖) 및 산으로 세척한 LCAA-CPG(200㎎)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3일 동안 회전 혼합기로 교반하였다. CPG를 감압하에서 여거하고, 이소프로탄올에 이어서 메틸렌 클로라이드로 광범위하게 세척하고, 공기 건조시킨 다음, 1시간 동안 진공하에서 건조시켰다.
유도화된 CPG의 캡핑은 실시예 1에서 기술한 바와 같이 실행하였다.
[실시예 5]
[개질된 프라이머를 사용하는 증폭-개질된 뉴클레오타이드의 위치의 영향]
프라이머 이량체의 형성에 대한 개질된 프라이머의 영향을 설명하기 위해서, 개질된 프라이머 및 비개질된 프라이머 둘다를 사용하여 HIV-1 RNA의 증폭에 대해 비교해 보았다. 추가로, 프라이머 이량체의 감소에 대한 개질된 뉴클레오타이드의 위치의 영향을 평가하기 위해서 3가지의 상이한 업스트림(upstream) 개질된 프라이머, 즉 단지 개질된 염기의 위치가 상이한 프라이머를 사용하여 증폭을 실행하였다.
[표적 핵산]
HIV-1 RNA 주형은 본질적으로는 멀더 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 32(2);292-300 (1984)]에서 기술한 바와 같이 HIV-1 RNA 전사 벡터를 사용하여 합성하였다.
[프라이머]
개질된 프라이머 및 비개질된 프라이머를 사용하여 증폭을 실행하였다. 비개질된 프라이머의 뉴클레오타이드 서열을 5′에서 3′의 방향으로 하기 표 1에 나타내었다. 업스트림 프라이머 RAR1032MB(서열 식별 번호 : 1) 및 다운스트림(downstream) 프라이머 RAR1033 MB(서열 식별 번호 : 2)는 HIV-1 참고 균주 HXB2(유전자 은행(Genebank) 기탁 번호 제K03455호)의 서열중 위치가 뉴클레오타이드 위치 2956번부터 3130번에 해당하는 175개의 염기쌍 생성물을 증폭시킨다.
[표 1]
[HIV-1 증폭 프라이머]
상기 프라이머 표시는 비개질된 프라이머를 지칭하는 것이다. 비개질된 프라이머는 5′-말단에 바이오틴화되어 있다. 비개질된 프라이머와 동일한 뉴클레오타이드 서열로 구성된 개질된 프라이머는 실시예 1에서 기술하는 바와 같이 합성되었으며, 3′-말단 위치 또는 3′-말단으로부터 업스트림으로 1번째 또는 3번째 뉴클레오타이드에 벤질화된 아데노신을 함유하고 있다. 프라이머의 개질된 형태는 하기 표 2와 같이 표기된다.
[표 2]
[개질된 HIV-1 증폭 프라이머]
[증폭]
증폭은 하기 시약을 함유하는 100㎖의 반응물에서 실행하였다:
100 카피(copy)의 HIV 주형 RNA,
50mM의 트리신(pH 8.33),
110mM의 KOAc,
300μM 씩의 dATP, dCTP 및 dGTP,
50μM의 dTTP,
500μM의 dUTP,
50μM의 각각의 프라이머,
3.5mM의 Mn(OAc)2,
13%의 글리세롤,
20 유니트의 Z05 DNA 폴리머라제*및
2.0 유니트의 UNG**.
*미국 특허 제5,455,170호에 개시되어 있음
**호프만-라 롯슈에서 개발하여 제조하고, 퍼킨 엘머(미국 코넥티컷주 노웍 소재)에서 판매함.
하기의 온도 분포를 사용하여 TC480 DNA 열 순환기(미국 코넥티컷주 노웍 소재의 퍼킨 엘머)에서 증폭 온도 순환을 수행하였다.
반응전 항온처리; 45℃에서 4분동안;
역전사: 60℃에서 20분동안;
46 주기: 94℃에서 45초 동안 변성, 60℃에서 45초 동안 어닐링(annealing)/연장;
최종 연장: 60℃에서 7분 동안;
반응 후 유지: 10℃에서 분석할 때까지(짧은 시간).
[증폭된 생성물의 검출]
증폭된 생성물의 존재는 다음과 같은 겔 전기영동으로 검출하였다. 반응 생성물을 아가로즈 겔(100㎖, 3%의 뉴시브(NuSieve) 및 0.5%의 시켐(SeaChem))을 사용하여 분별화하고, 1X TBE(0.089 M 트리스, 0.089 M 붕산, 0.0025 M 이나트륨 EDTA) 이동(running) 완충액을 사용하였다. 존재하는 임의의 DNA를 염색시키기 위해서 에티디움 브로마이드(0.5㎍/㎖)를 첨가하였다. 전기영동은 약 1시간 동안 100 볼트에서 실행하였다. DNA의 에티디움 브로마이드-염색된 밴드를 UV 조사에 의해 가시화시켰다.
[결과]
겔 전기영동 분석의 결과를 제1도에 제시하였다. 비개질된 프라이머와 개질된 프라이머의 조합물을 사용한 증폭에 각각 해당하는 레인의 번호를 하기 표 3에 제시하였다. 목적하는 HIV 생성물에 해당하는 밴드는 제1도에서 화살표로 표시하였다. 겔내의 다른 밴드는 비특이적 증폭 생성물 및 특히 프라이머 이량체에 해당된다.
[표 3]
프라이머 이량체의 형성은 목적하는 증폭 생성물의 형성과 경쟁하기 때문에 전형적으로 프라이머 이량체를 감소시키면 그에 따라 목적하는 생성물의 형성량이 증가한다. 따라서, 개질된 프라이머의 영향은 비개질된 프라이머를 사용하여 형성된 프라이머 이량체의 형성량과, 개질된 프라이머를 사용하여 형성된 프라이머 이량체의 형성량을 비교하고, 비개질된 프라이머를 사용하여 형성된 목적하는 표적의 양과, 개질된 프라이머를 사용하여 형성된 목적하는 표적의 양을 비교함으로써 확인할 수 있다.
2개의 비개질된 프라이머를 사용한 결과(1번 레인)를 하나의 3′-개질된 프라이머를 사용한 결과(2번 레인 및 5번 레인) 및 2개의 3′-개질된 프라이머를 사용한 결과(6번 레인)와 비교하면, 1개 또는 2개의 개질된 프라이머를 사용하는 경우 프러머 이량체가 감소함을 알 수 있다. 하나의 3′-개질된 프라이머를 사용하여 증폭시키는 경우, 어느 프라이머가 개질되었는지에 따라 프라이머 이량체의 감소되는 정도에 작은 차이를 보였다. 2개의 개질된 프라이머를 사용하는 경우(6번 레인), 프라이머 이량체가 크게 감소하였고 증폭된 표적 서열의 양도 크게 증가하였다.
개질된 뉴클레오타이드 위치의 효과는 6번 레인 내지 8번 레인을 비교하여 확인하였다. 3′-말단 뉴클레오타이드에 인접한 뉴클레오타이드에서 개질된 프라이머(7번 레인)를 사용하여 얻은 프라이머 이량체의 감소 정도는 3′-말단 뉴클레오타이드(6번 레인)에서 개질된 프라이머를 사용하여 얻은 결과에 상당했으나, 3′-말단 뉴클레오타이드로부터 업스트림으로 3번째 염기에서 개질된 프라이머(8번 레인)를 사용한 경우 개선 정도가 약간 낮았다.
[실시예 6]
[개질된 프라이머를 사용한 추가의 증폭-개질된 뉴클레오타이드 위치의 영향]
프라이머 이량체의 형성에 대한 개질된 프라이머의 영향을 추가로 설명하기 위해서, 본질적으로는 전술한 바와 같이, 개질된 프라이머 및 비개질된 프라이머 둘다를 사용하여 HCV RNA의 증폭을 비교하였다. 3가지의 상이한 개질된 다운스트림 프라이머, 즉 단지 개질된 염기 위치가 상이한 프라이머를 사용하여 증폭을 실행하였다.
[표적 핵산]
HCV RNA 주형은 영 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 31(4): 882-886(1993)]에서 기술한 바와 같이 HCV RNA 전사 벡터를 사용하여 합성하였다.
[프라이머]
증폭은 비개질된 프라이머 및 개질된 프라이머 둘다를 사용하여 실행하였다. 비개질된 프라이머의 뉴클레오타이드 서열을 5′에서 3′의 방향으로 하기 표 4에 나타내었다. 업스트림 프라이머 ST280A(서열 식별 변호 : 3) 및 다운스트림 프라이머 ST778AA(서열 식별 번호 : 4)는 HCV 게놈의 5′ 비번역 영역으로부터 240개의 염기쌍 생성물을 증폭시킨다.
[표 4]
[HCV 증폭 프라이머]
상기 프라이머 표시는 비개질된 프라이머를 지칭한 것이다. 비개질된 프라이머와 동일한 뉴클레오타이드 서열로 구성된 개질된 프라이머는 실시예 1에서 기술하는 바와 같이 합성되었으며, 3′-말단 위치 또는 3′-말단으로부터 업스트림으로 1번째 또는 3번쩨 뉴클레오타이드 위치에 벤질화된 아데노신을 함유하고 있다. 프라이머의 개질된 형태는 하기 표 5와 같이 표시된다.
[표 5]
[개질된 HCV 증폭 프라이머]
[증폭 및 분석]
증폭은 본질적으로는 100카피의 HCV RNA 주형을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 3에서 기술한 바와 같이 실행되었다. 증폭된 생성물의 겔 분석은 실시예 3에서 기술한 바와 같이 실행되었다.
[결과]
겔 전기영동 분석의 결과를 제2도에서 제시하였다. 비개질된 프라이머와 개질된 프라이머의 조합물을 사용한 증폭에 각각 해당하는 레인의 번호를 하기 표 6에 제시하였다. 목적하는 HCV 생성물에 해당하는 밴드는 제2도에서 화살표로 표시하였다. 겔내의 다른 밴드는 비특이적 증폭 생성물 및 특히 프라이머 이량체에 해당된다.
[표 6]
프라이머 이량체의 형성은 목적하는 증폭 생성물의 형성과 경쟁하기 때문에, 전형적으로 프라이머 이량체를 감소시키면 그에 따라 목적하는 생성물의 형성량이 부수적으로 증가한다. 따라서, 개질된 프라이머의 영향은 비개질된 프라이머를 사용하여 형성된 프라이머 이량체의 형성량과, 개질된 프라이머를 사용하여 형성된 프라이머 이량체의 형성량을 비교하고, 비개질된 프라이머를 사용하여 형성된 목적하는 표적의 양과 개질된 프라이머를 사용하여 형성된 목적하는 표적의 양을 비교함으로써 확인할 수 있다.
얻어진 결과는 선행 실시예에서 기술된 HIV 증폭에서 얻어진 결과와 유사하였으나, HCV 증폭의 경우, 목적하는 생성물의 증가가 HIV 증폭의 경우보다 현저히 나타났다. 2개의 비개질된 프라이머를 사용한 결과(1번 레인)를 하나의 3′-개질된 프라이머를 사용한 결과(2번 레인 및 5번 레인) 및 2개의 3′-개질된 프라이머를 사용한 결과(6번 레인)와 비교하면, 1개 또는 2개의 개질된 프라이머를 사용하는 경우 프라이머 이량체가 감소함을 알 수 있다. 2개의 개질된 프라이머를 사용하는 경우(6번 레인), 프라이머 이량체가 크게 감소하였고 증폭된 표적의 양도 크게 증가하였다. 선행 실시예에서와 같이, 어느 프라이머가 개질되었는지에 따라 하나의 3′-개질된 프라이머를 사용하여 증폭시키는 경우, 프라이머 이량체의 감소되는 정도에 작은 차이를 보였다.
개질된 뉴클레오타이드 위치의 영향은 6번 레인 내지 8번 레인을 비교하여 확인하였다. 3′-말단 뉴클레오타이드에서 개질된 프라이머(6번 레인), 3′-말단 뉴클레오타이드에 인접한 뉴클레오타이드에서 개질된 프라이머(7번 레인) 및 3′-말단 뉴클레오타이드로부터 업스트림으로 3번째 염기인 뉴클레오타이드에서 개질된 프라이머(8번 레인)를 사용한 경우, 본질적으로 동등한 결과를 얻었다. 이러한 결과는 개질기가 프라이머의 3′말단에서 4개의 뉴클레오타이드중 어느 것에나 결합할 수 있음을 나타낸다.
[실시예 7]
[개질된 프라이머를 사용한 증폭-개질기의 영향]
프라이머 이량체의 형성에 대한 개질된 프라이머의 영향을 추가로 설명하고, 또다른 프라이머 개질을 설명하기 위해서, 3가지의 상이한 개질기(벤질, 니트로벤질 및 메틸기)중 한가지를 첨가함으로써 개질된 개질된 프라이머 및 비개질된 프라이머를 사용하여 HCV RNA의 증폭을 비교하였다.
증폭 결과는 2가지의 상이한 방법으로 분석하였다. 한 비교 세트에서는 반응 생성물의 겔 전기영동 분석에 의해 프라이머 이량체의 존재를 분석하였다. 다른 비교 세트에서는 전술했던 동역학적 PCR 방법을 사용하여, 증폭 과정 동안의 프라이머 이량체의 형성을 모니터하였다.
[표적 핵산]
HCV RNA 주형은 영 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 31(4): 882-886(1993)]에서 기술한 바와 같이 HCV RNA 전사 벡터를 사용하여 합성하였다.
[증폭 프라이머]
개질된 프라이머 및 비개질된 프라이머를 사용하여 증폭을 실행하였다. 개질된 프라이머는 비개질된 프라이머와 동일한 뉴클레오타이드 서열로 구성되지만, 3′-말단 아데노신에 메틸기, 벤질기 또는 니트로벤질기를 첨가하여 개질시켰다. 프라이머는 선행 실시예에서 기술한 바와 같이 합성하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 7과 같이 표시된다.
[표 7]
[증폭 반응]
증폭은 하기 시약을 함유하는 100㎖의 반응물에서 실행하였다:
0, 20 또는 200카피의 HCV RNA 주형
50mM의 트리신(pH 8.3),
110mM의 KOAc,
3.5mM의 Mn(OAc)2,
300μM씩의 dATP, dCTP 및 dGTP,
50μM의 dTTP,
500μM의 dUTP,
250nM의 각각의 프라이머,
20유니트의 rTth*,
2유니트의 UNG*및
13%의 글리세롤.
*호프만-라 롯슈에서 개발하여 제조하고, 퍼킨 엘머(미국 코넥티컷주 노웍 소재)에서 판매함.
하기의 온도 분포를 사용하여 진앰프(GeneAmp(등록상표)) PCR 시스템 9600 열 순환기(미국 코넥티컷주 노웍 소재의 퍼킨 엘머)에서 각 반응 혼합물을 열순환시켰다:
반응전 항온처리; 45℃에서 4분동안;
역전사: 60℃에서 24분동안;
46 주기: 94℃에서 30초 동안 변성, 60℃에서 30초 동안 어닐링/연장;
최종 연장: 60℃에서 7분 동안;
반응 후 유지; 4℃에서.
[증폭 생성물의 검출]
[A. 전기영동]
증폭된 생성물의 존재는 다음과 같은 겔 전기영동에 의해 검출하였다. 반응 생성물을 아가로즈 겔(100㎖, 3%의 뉴시브, 0.5%의 시켐 및 0.5㎍/㎖의 에티디움 브로마이드) 및 1X TBE(0.089 M 트리스, 0.089 M 붕산, 0.0025 M 이나트륨 EDTA) 이동 완충액을 사용하여 분별화하였다. 전기영동은 약 1시간 동안 100 볼트에서 실행되었다. DNA의 에티디윰 브로마이드-염색된 밴드를 UV 조사에 의해 가시화시켰다.
[B. 동역학적 PCR에 의한 검출]
전술한 동역학적 PCR 방법에서, 이중사슬 DNA에 삽입되면 보다 강한 형광을 보이는 에티디움 브로마이드와 같은 삽입 염료를 PCR에 첨가한다. 증폭 과정 동안 염료의 형광을 측정함으로써 증폭 과정 동안 이중사슬 DNA의 증가를 모니터한다. 동역학적 PCR 방법은 단지 이중사슬 DNA의 총량의 증가를 측정하는 것이기 때문에, 비특이적 증폭의 형성이 독립적으로 측정되지는 않는다. 주형 증폭과 무관한, 프라이머-이량체로부터 일어나는 비특이적 증폭의 발생을 측정하기 위해서, 핵산 주형 없이 반응을 실행하였다. 이러한 주형이 없는 반응에서, 이중사슬 DNA가 증가하는 것은 주형-비의존성 비특이적 증폭 생성물에 의한 것이다.
동역학적 PCR 반응 조건은 반응 혼합물에 에티디움 브로마이드를 1g/㎖의 농도로 첨가하는 것을 제외하면, 전술한 바와 같다. 반응은 유럽 특허 제640 828호에서 기술된 바와 같이 반응 혼합물의 형광을 측정하여 모니터하였다.
형광 측정치는 반응 초기의 주기 동안 얻은 초기 형광 측정치로 나누어서 정규화하였고, 주기 사이의 형광 측정치는 비교적 일정하였다. 초기 형광 측정을 위해 선택된 주기 번호는 비교된 모든 반응에서 동일하여, 모든 측정치가 동일한 반응 주기에 대한 상대적인 증가를 나타낸다. 프라이머 이량체가 형성될 때까지 표적이 없는 반응에서의 반응 형광은 비교적 일정하게 유지된다. 대부분의 반응에서, 충분한 증폭 주기가 실행되면, 프라이머 이량체는 결국 감지가능하게 된다. 개절된 프라이머의 영향은 적어도 프라이머 이량체가 형성될 때까지 실행된 주기의 횟수를 비교함으로써 알 수 있다.
[결과]
겔 전기영동의 결과를 제3도에 나타내었다. 비개질된 프라이머 및 3가지 유형의 개질된 프라이머를 사용하고, 200 카피, 20 카피 또는 0 카피의 HCV RNA를 사용하여 각각 증폭시킨 것에 해당하는 레인의 번호를 하기 표 8에 제시하였다(레인의 번호는 왼쪽에서 오른쪽으로 매긴다: 1번 레인 내지 30번 레인은 겔의 상반부에 있으며; 31번 레인 내지 60번 레인은 겔의 하반부에 있다). 또한, 분자량 마커(marker)는 1번 레인과 31번 레인(Hae III 분해된 PhiX 174 RF DNA; 미국 메사츄세츠주 베벌리 소재의 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)), 및 30번 레인과 60번 레인(슈퍼 래더 로우(Superladder-low), 20bp 래더; 미국 캘리포니아주 델마르 소재의 진슈라(GenSura))에 존재한다. 목적하는 특이적 생성물에 해당하는 밴드(~230bp)는 제3도에 화살표로 표시되어 있다. 겔내의 다른 밴드는 비특이적 증폭 결과, 특히 프라이머 이량체에 해당한다.
[표 8]
[제3도에 나타낸 증폭 결과의 레인 번호]
이 결과는 개질된 프라이머를 사용하여 증폭시킨 경우가 비개질된 프라이머를 사용하여 증폭시킨 경우보다 증폭된 HCV 핵산의 양이 많음을 나타낸다. 또한, 개질된 프라이머를 사용하여 증폭시킨 경우는 비개질된 프라이머를 사용하여 증폭시킨 경우에 비해 프라이머 이량체의 양이 감소하였다.
동역학적 PCR 분석에서, 전체 반응에 걸쳐 형광을 모니터하였다. 형광 증가가 감지된 후의 형광 증가율은 형광 대 주기 번호를 플로팅하여 얻어진 곡선(제시하지 않음)의 모양으로 알 수 있듯이 모든 반응에서 거의 동일하였다. 이것은 개질된 프라이머가 초기 증폭 단계후에 각각의 증폭 단계의 효율을 감지할만큼 억제하지는 않음을 나타낸다. 반응은 형광의 증가가 감지되기 전에 실행된 주기 횟수에 있어서 상당히 상이하였다.
반응간의 차이 정도를 정량화하기 위해서, 형광이임의의 형광 세기(arbitrary fluorescence level; AFL)를 초과할 때까지 실행된 증폭 주기 횟수로써 결과를 나타내었다. AFL은 기준선 형광 세기에 근접하지만, 측정된 형광내에서 불규칙적으로 변동하는 범위 보다는 높은 값으로 선택하여, 증폭이 기하학적으로 증대되는 동안 반응 동역학을 측정하였다. 나중의 주기에서는 증폭된 생성물이 축적되어 반응을 억제하고, 결국에는 반응 정체기에 들어선다.
동역학적 PCR의 결과를 하기 표 9에 요약하였다. 20 또는 200 카피의 표적 주형의 증폭에 대한 각각의 수치는 벤질화된 프라이머와 20 카피의 표적을 사용한 증폭외에는 5회의 반복 증폭의 평균치로 나타냈으며, 벤질화된 프라이머와 20 카피의 표적을 사용한 증폭은 4회 반복의 평균치를 나타내었다. 주형 없이 증폭시킨 경우의 각각의 수치는 8회 반복의 평균치로 나타내었다.
표적없이 벤질화된 프라이머를 사용한 증폭의 8회 반복중 2회는 46 주기를 끝내도 프라이머 이량체가 형성되지 않는 결과를 나타냈다. 따라서 나머지 6회의 증폭의 평균치를 나타냈으며, 이것은 형성된 프라이머 이량체에 대한 조건부 평균치이다. 이러한 조건부 평균치는 삭제된 데이타 때문에 제시된 다른 측정치와 비교할 수 없다.
[표 9]
[AFL에 도달하는 주기]
상기 데이타를 통해 개질된 프라이머가 분명히 표적 핵산의 증폭을 지연시켜 수회의 주기 후에 AFL에 도달함을 알 수 있다. 이러한 지연이 특이적 증폭 생성물의 최종 수율의 감소를 가져오는 것은 아니다. 표적 핵산에 대한 모든 증폭은 실험에 사용된 46 주기이내에 정체기에 도달하는 것으로 관찰되었으며, 겔 전기영동 분석의 상응하는 데이타로부터 알 수 있듯이 개질된 프라이머를 사용하는 경우 최종 수율이 증가하였다.
상기 데이타는 프라이머 이량체의 형성의 지연되는 것은 표적의 증폭이 지연되는 것 보다 상당히 큼을 나타낸다. 프라이머의 유리한 영향은 표적이 없는 증폭과 200 카피의 주형의 증폭을 비교하면 가장 명확하게 나타난다. 비개질된 프라이머를 사용하는 경우, 형광이 AFL까지 증가하는 것은 표적이 없는 경우보다 1주기 후에 나타나며, 이것은 표적의 증폭이 프라이머 이량체 형성과 구별하기가 힘들다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 개질된 프라이머를 사용하는 경우, 프라이머 이량체로 인한 형광의 증가는 적어도 3주기 후에 나타났고, 벤질화된 프라이머를 사용하는 경우 적어도 6주기 후에 나타났다. 따라서, 표적 증폭을 감지할 수 있고, 표적 증폭을 프라이머 이량체의 형성과 구별할 수 있었다.
표적이 없는 증폭 및 20 카피의 주형의 증폭을 비교하면, 개질된 프라이머의 영향은 표적 증폭을 지연시키는 것보다 프라이머 이량체의 개시를 보다 크게 지연시키는 동일한 패턴을 나타냈다. 비개질된 프라이머를 사용하는 경우, 20 카피의 주형을 검출할 수 없었다. 니트로벤질 및 벤질 프라이머를 사용하는 경우, 이러한 시스템에서 충분히 프라이머 이량체의 형성을 지연시켜 20 카피의 주형을 검출할 수 있었다.
각각의 증폭 주기에서의 형광을 모니터하여 얻은 데이타(데이타는 제시하지 않음)에 의하면, 일반적으로 프라이머 이량체 형성의 지연은 프라이머 이량체 형성이 46 주기이내에 정체기에 도달하지 않도록 하기에 충분하였다. 따라서, 개질된 프라이머는 프라이머 이량체가 상당량 형성되기 전에 표적의 증폭을 완료시키고 반응을 중지시키기에 충분하게 프라이머 이량체의 형성을 지연시키는 것으로 나타났다.
[실시예 8]
[광-불안정한 프라이머]
개질된 광-불안정한 프라이머의 사용을 설명하기 위해서, 개질된 프라이머 및 비개질된 프라이머 둘다를 사용하여 HCV RNA 증폭을 실행하였다. 개질된 프라이머는 3′-말단 아데닌의 고리외 아민에 1개 또는 2개의 니트로벤질기를 결합시켜 개질하였다.
[증폭 프라이머]
프라이머는 실시예 4에서 기술한 바와 같이 합성하였다. 사용된 프라이머는 표 10과 같이 표시하였다.
[표 10]
[증폭 반응]
각각의 프라이머 쌍에 대해, 투입 표적 농도의 희석된 시리즈를 사용하여 반응을 실행하였다. 프라이머 쌍 및 투입 표적 농도의 조합을 각각 포함하는 2조의 반응을 실행하였고, 각 반응 조에서, 주어진 프라이머 쌍 및 표적 농도를 함유하는 각각의 반응을 2회씩 실행하였다. 증폭은 하기 시약을 함유하는 100㎖의 반응물에서 실행하였다:
0, 10, 102, 103, 104또는 105카피의 HCV RNA 주형,
56mM의 트리신,
90mM의 KOAc,
3mM의 Mn(OAc)2,
200μM 씩의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP,
200μM의 dUTP,
250nM의 각각의 프라이머,
10유니트의 rTth*,
2유니트의 UNG*및
8%의 글리세롤.
*호프만-라 롯슈에서 개발하여 제조하고, 퍼킨 엘머(미국 코넥티컷주 노웍 소재)에서 판매함.
하기의 온도 분포를 사용하여 진앰프 PCR 시스템 9600 열 순환기(미국 코넥티컷주 노웍 소재의 퍼킨 엘머)에서 각 반응 혼합물을 열순환시켰다:
반응전 항온처리; 50℃에서 5분동안;
역전사: 60℃에서 30분동안;
초기 변성: 95℃에서 1분동안;
2 주기: 195℃에서 5초동안 변성, 60℃에서 20초 동안 어닐링/연장;
46 주기: 90℃에서 15초 동안 변성, 60℃에서 20초 동안 어닐링/연장;
최종 연장: 72℃에서 10분 동안.
전체 반응에 걸쳐 폴리싱(polishing)된 반응 시험관 캡(미국 코넥티컷주 노웍 소제의 퍼킨 엘머)을 사용하였다. 역전사 단계에서 반응 온도를 60℃까지 올린 후, 열 순환기의 구역내의 PCR 트레이에서 가열된 뚜껑을 제거하고, 반응 시험관중 반을 알루미늄 호일로 차폐하였다(두번의 반응중 한번은 전부 호일로 차폐함). 나머지 반은 302㎚에서 빛을 방출하는 수동 UV 램프(UVP 모델 UVP-57; 미국 캘리포니아주 샌 가브리엘 소재의 UVP 프러덕츠(UVP Products))를 사용하여 10분 동안 조사시켰다. 가열된 차폐물을 제거하고 증폭을 계속하였다.
[결과]
증폭 결과를 전술한 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 그 결과를 제4도에 제시하였다. 각 반응에서 사용된 프라이머 및 주형 카피 수(카피 수는 로그값으로 나타냄)를 겔에 나타내었다. 목적하는 생성물에 해당하는 밴드를 제4도에 표시하였다. 겔의 다른 밴드는 비특이적 증폭 생성물, 특히 프라이머 이량체에 해당한다.
UV-조사된 반응 세트를 비교하면, 개질된 프라이머를 사용하는 경우 프라이머 이량체가 상당히 감소함을 나타냈고, 특히 적은 카피수에서 프라이머 이량체가 상당히 감소함을 나타냈다.
비-조사된 반응 세트를 비교하면, 비스니트로벤질 프라이머를 사용하는 경우 예상한 바와 같이 증폭이 완전히 억제되는 결과를 보였다. 모노니트로벤질 프라이머를 사용하는 증폭의 경우, 생성물만을 수득하였을 뿐만 아니라 프라이머 이량체가 상당히 감소함을 보였고, 이것은 선행 실시예에서 얻어진 결과와 일치하는 결과이다.
[실시예 9]
[p-3급-부틸벤질-개질된 프라이머의 증폭]
본 실시예는 p-3급-부틸벤질기로 개질된 프라이머를 사용하는 ㅗHCV RNA의 증폭을 기술한다.
[표적 핵산]
HCV RNA 주형은 영 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 31(4): 882-886(1993)]에서 기술한 바와 같이 HCV RNA 전사 벡터를 사용하여 합성하였다.
[프라이머]
증폭은 상기 실시예 2에서 기술하고 있는 바와 같이 개질된 프라이머를 사용하여 실행하였다. 비개질된 프라이머의 뉴클레오타이드 서열을 5′에서 3′의 방향으로 하기 표 11에 나타내었다. 업스트림 프라이머 ST280A(서열 식별 번호 : 3) 및 다운스트림 프라이머 ST778AA(서열 식별 번호 : 4)의 개질된 영역을 갖는 프라이머를 사용하였다. 프라이머의 개질된 형태를 하기 표 11과 같이 표시하였다.
[표 11]
개질된 HCV 증폭 프라이머
[증폭 및 분석]
증폭은 하기 시약을 함유하는 100㎖의 반응물에서 실행하였다:
20, 5, 2.5, 2 또는 0 카피의 HCV 주형 RNA,
50mM의 트리신(pH 8.33),
110mM의 KOAc,
300μM씩의 dATP, dCTP 및 dGTP,
50μM의 dTTP,
500μM의 dUTP,
50nM의 각각의 프라이머,
3.5mM의 Mn(OAc)2,
13%의 글리세롤,
20유니트의 Tth DNA 폴리머라제*및
8.0유니트의 UNG*.
*호프만-라 롯슈에서 개발하여 제조하고, 퍼킨 엘머(미국 코넥티컷주 노웍 소재)에서 판매함.
하기의 온도 분포를 사용하여 TC480 DNA 열 순환기(미국 코넥티컷주 노웍 소재의 퍼킨 엘머)에서 증폭 온도를 순환시켰다:
반응전 항온처리; 45℃에서 12분동안;
UNG 불활성화: 90℃에서 30초 동안;
역전사: 60℃에서 20분동안;
47 주기: 94℃에서 45초 동안 변성, 60℃에서 70초 동안 어닐링/연장;
최종 연장: 60℃에서 7분 동안;
반응 후 유지; 10℃에서 분석할 때까지(짧은 시간).
증폭 생성물은 전술한 바와 같이 겔 전기영동으로 분석하였다.
[결과]
다음과 같이 각각의 카피의 주형에서 증폭을 반복하였다: 20카피의 표적 주형을 사용하여 3회의 증폭을 실행하였고, 5카피의 표적 주형을 사용하여 3회의 증폭을 실행하였고, 2.5카피의 표적 주형을 사용하여 2회의 증폭을 실행하였고, 2카피의 표적 주형을 사용하여 1회 증폭을 실행하였고, 표적이 없이 23회 증폭을 실행하였다. 모든 주형의 양성 증폭은 예상된 표적 크기의 겔에 단일 밴드로 나타났다. 프라이머 이량체 또는 다른 비특이적 증폭 생성물을 발생시키는 어떠한 증폭도 일어나지 않았다.
이 결과는 상기 실시예 6의 결과와 비교할 수 있으며, 이때 동일한 HCV 표적은 동일한 프라이머 서열을 사용하여 증폭되었다. 이러한 결과를 실시예 6의 결과와 비교하면, p-3급-부틸벤질-개질된 프라이머를 사용한 증폭은 비개질된 프라이머를 사용하여 실행된 상응하는 증폭에 비해 상당히 개선됨을 알 수 있다.
상기 실시예 5에 기술된 p-3급-부틸벤질-개질된 프라이머를 사용하여 HIV-1 RNA의 증폭시키는 추가적인 실험을 실행하였다. 증폭은 본질적으로 전술한 바와 동일하게 실행되었다. 전술한 HCV 시스템에서와 같이, 모든 HIV-1 주형 양성 증폭은 예상된 표적 크기의 겔상에서 단일 밴드로 나타났고, 프라이머 이량체 또는 다른 비특이적 증폭 생성물을 발생시키는 어떠한 증폭도 발생하지 않았다.
이러한 추가적인 결과는 동일한 HIV 표적을 동일한 프라이머 서열을 사용하여 증폭시킨 실시예 5의 결과와 비교할 수 있다. 상기 실시예 5의 이러한 결과와 비교하면, p-3급-부틸벤질-개질된 프라이머를 사용한 증폭은 비개질된 프라이머를 사용하여 실행된 상응는 증폭에 비해 상당히 개선됨을 알 수 있다.
[실시예 10]
[마이코박테리아 DNA의 증폭]
본 실시예는 비개질된 프라이머 및 개질된 프라이머를 사용하여 마이코박테리아 DNA의 증폭을 비교한 것을 기술하고 있다. 벤질기를 3′-말단 뉴클레오타드에 첨가하여 개질한 프라이머 및 p-3급-부틸벤질기를 3′-말단 뉴클레오타이드에 첨가하여 개질한 프라이어 둘다를 사용하였다. 비개질된 프라이머를 사용한 반응은 본질적으로 테베레(Tevere) 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 34(4): 918-923(1996)]에서 기술한 바와 같다. 마이코박테리아 DNA를 공지된 농도로 모방 감염된 임상 샘플에 첨가한 담(痰) 샘플을 사용하여 증폭을 실행하였다. 정제된 마이코박테리아 DNA 및 DNA가 없는 음성 대조 샘플을 사용하여 추가적인 증폭을 실행하였다.
[샘플의 제조]
현미경 검사에 의해 마이코박테리아에 대해 이미 음성을 보인 담 표본 및 항온처리물을 액화시키고, CDC(켄트(Kent) 및 쿠비카(Kubica), Public Health Mycobacteriology-a guide for the level III labaoratory, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control, Athlanta, (1985); 본원에서 참고로 인용함)가 추천한 N-아세틸-시스테인-NaOH 방법으로 오염 제거시켰다. 액화된 담(100㎕)을 호흡기 표본 세척 시약(Respiratory Specimen Wash Reagent; 10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, 1%(v/v)의 트리톤 X-100, 0.05%의 NaN3, pH 8.0)에 첨가하고, 12,500 x g에서 10분동안 원심분리시켰다. 각각의 펠렛트를 100㎕의 용해시약(0.05N NaOH, 1% (v/v)의 트리톤 X-100, 1mM EDTA, 0.05%의 NaN3)에 다시 현탁시키고, 60℃에서 45분 동안 항온처리하였다. 그 다음 용해물을 100㎕의 중화 시약(0.2M 트리스-HCl, 8mM MgCl2, 0.05%의 NaN3, pH 7.5)으로 중화시켰다.
두가지 개별적인 담 용해물을 각각 80㎕씩 합하여 담 용해물을 수집하였다. 8가지의 수집된 각각의 담 용해물(각각 160㎕)에 항온처리된 M. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)로부터 정제된 DNA 스톡 15㎕(용해 시약과 중화 시약의 1:1 혼합물 1㎕ 당 2카피)를 첨가하였다.
정제된 마이코박테리아 DNA(담이 없음)를 공지된 농도로 함유하는 샘플은 10㎕의 DNA 스톡을 용해 시약과 중화 시약의 1:1 혼합물 100㎕에 첨가하여 제조하였다.
음성 대조 샘플(DNA가 없음)은 100㎕의 용해 시약 및 100㎕의 중화 시약의 혼합물로 구성된다.
[증폭 프라이머]
하기 표 12의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 증폭을 실행하였다.
[표 12]
3′-말단 염기에 결합된 지정된 개질기를 함유하는 하기 프라이머 쌍을 증폭에 사용하였다. 모든 개질된 프라이머는 선행 실시예에서 기술하는 것과 같이 합성되었다. 모든 프라이머는 5′말단에서 바이오틴화되었다.
[표 13]
[증폭]
각각의 샘플에 대해서, 비개질된 프라이머 쌍(KT18 (서열 식별 번호: 5)과 KY75 (서열 식별 번호: 7)) 및 개질된 프라이머 쌍(KY436) (서열 식별 번호: 6)과 KY75 (서열 식별 번호: 7))을 사용하여 증폭을 실행하였다.
증폭은 하기 시약을 함유하는 100㎖의 반응물에서 실행하였고, 각각은 전술한 3가지 샘플 중의 하나를 50㎕로 함유하고, 2X 시약 혼합물을 50㎕로 함유하였다:
100mM의 트리스-HCl, pH 8.9;
500nM의 각각의 프라이머;
200μM 씩의 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dUTP);
20%(v/v)의 글리세롤;
10 유니트의 앰플리타크*(AmpliTaq);
6 유니트의 앰프이레이즈*(AmpErase);
*호프만-라 롯슈에서 개발하여 제조하고, 퍼킨 엘머(미국 코넥티컷주 노웍 소재)에서 판매함.
하기의 온도 분포를 사용하여 진앰프 PCR 시스템 9600 열 순환기(미국 코넥티컷주 노웍 소재의 퍼킨 엘머)에서 열순환을 수행하였다.
반응전 항온처리; 50℃에서 5분동안;
2 주기: 98℃에서 20초 동안 변성,
62℃에서 20초 동안 어닐링,
72℃에서 45초 동안 연장;
41 주기: 94℃에서 20초 동안 변성,
62℃에서 20초 동안 어닐링,
72℃에서 45초 동안 연장;
최종 연장: 72℃에서 12시간 동안(밤새).
증폭된 생성물의 존재는 2%의 뉴시브, 0.5% 아가로즈 겔로 전기영동시킨 다음, 에티디늄 브로하이드를 염색시켜 가시화시켰다.
[결과]
전기영동의 분석 결과를 제5도에 나타내었다. 각각의 샘플에 있어서, 비개질된 프라이머로 실행된 증폭의 생성물(“A”로 표시) 및 개질된 프라이머로 실행된 증폭의 생성물(“B” 및 “C”로 표시함)을 인접한 레인에서 전기영동시켰다. 목적하는 마이코박테리아 표적 서열에 해당하는 밴드를 화살표로 표시하였다. 다른 밴드는 비특이적 개질 생성물로서, 겔의 가장 아래에 있는 밴드가 프라이머 이량체에 해당하는 것이다. “M”으로 표시한 레인은 분자량 마커(Hae III 분해된 PhiX 174 DNA)를 함유한다.
비개질된 프라이머를 사용하는 경우, 정제된 마이코박테리아 DNA를 증폭시키면 프라이머 이량체가 형성되었다. 개질된 프라이머 쌍을 사용하면, 목적하는 표적의 존재량이 증가하였고, 본질적으로 감지할만한 프라이머 이량체의 형성이 제거되었다.
정제된 DNA의 증폭과는 대조적으로, 비개질된 프라이머를 사용하는 경우, 증폭 반응에 담 용해물의 존재하면 이질적인 생성물 밴드가 나타나는 것에서 알 수 있듯이, 효율이 감소되고 비특이적 증폭 생성물의 형성이 증가되었다. 담 용해물이 정제된 마이코박테리아 DNA의 증폭에는 존재하지 않는 상당량의 인간 DNA를 함유하는 경우, 비특이적 증폭 생성물이 증가되는 것은 놀라운 것이 아니다. 담의 존재하에 실행된 증폭에 개질된 프라이머 쌍을 사용하면 목적하는 생성물의 발생량이 상당히 증가하고, 비특이적 증폭이 감소되는 결과가 나타났다.
[실시예 11]
[벤질기로 개질된 프라이머의 추가 합성]
말단 시토신에 벤질기를 첨가하여 개질한 프라이머를 본질적으로는 실시예 1에서 기술한 방법으로 합성하였으나, 하기에서 기술하는 바와 같이 제조한 LCAA-CPG-연결된 N4-아세틸,N4-벤질-5′-O-DMT-2′-데옥시시티딘을 사용하였다.
[제1단계: N4-벤질-2′-데옥시시티딘의 합성]
2′-데옥시시티딘 하이드로클로라이드(5.28g, 20m㏖, 미국 오하이오주 클리블랜드 소재의 유 에스 바이오케미칼 코포레이션(U.S. Biochemical Corp.))에 벤질아민(20㎖)을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기에서 3시간 동안 150℃에서 가열하였다. 진공하에서 용액을 농축시켜 점섬의 황색 오일을 수득하였고, 이것을 물(100㎖)과 에틸 아세테이트(100㎖) 사이에 분배시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트(100㎖)로 세척하여 분리시켰다. 수성 상을 진공하에서 농축시켜 황색 시럽(13g)을 수득하고, 이것을 용리액으로서 메틸렌 클로라이드와 메탄올(15:1)을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색의 시럽으로서 목적하는 생성물(5.8g, 91.5%)의 수득하였다.
[제2단계: N4-아세틸,N4-벤질-2′-데옥시시티딘의 합성]
N4-벤질-2′-데옥시시티딘(2.5g, 7.9m㏖)을 무수 디메틸포름아마이드(15㎖)에 용해시키고, 아세트산 무수물(8g, 79m㏖, 10 당량)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매 및 과량의 아세트산 무수물을 진공하에서 증발시켰다. 생성물을 용리액으로서 메틸렌 클로라이드와 메탄올(20:1)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 표제 화합물(1.3g, 48%)을 수득하였다. 화합물은 매우 흡습성이어서 -20℃에서 건조상태로 보관하였다.
[제3단계: N4-아세틸,N4-벤질-5′-O-DMT-2′-데옥시시티딘의 합성]
N4-아세틸,N4-벤질-2′-데옥시시티딘(76㎎, 0.2m㏖)을 1㎖의 무수 피리딘에 용해시키고, DMT-Cl(122㎎, 0.2m㏖, 1.0 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. TLC 분석에 의하면 일부 출발 물질이 남아 있어서, 추가량의 DMT-Cl(61㎎, 0.5 당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 추가로 1시간 동안 교반한 다음, TLC 분석에 의해 반응이 완료됨을 확인하였다. 15㎖의 염수 용액으로 반응을 종결시키고, 수성 상을 메틸렌 클로라이드(3 x 15㎖)로 추출하였다. 유기 층을 모아 염수(2 x 15㎖)로 세척하고, 무수 황산 마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 용리액으로서 메틸렌 클로라이드와 메탄올(50:1)을 사용하여 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, N4-아세틸,N4-벤질-5′-O-DMT-2′-데옥시시티딘(96㎎, 65% 수율)을 수득하였다.
[제4단계: 숙시닐화]
N4-아세틸,N4-벤질-5′-O-DMT-2′-데옥시시티딘(96㎎, 0.13m㏖)을 2㎖의 무수 피리딘에 용해시켰다. 숙신산 무수물(200㎎, 1.0m㏖)및 디메틸아미노 피리딘(20㎎)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 3일 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔류물을 톨루엔(3 x 10㎖)으로 동시증류시켰다. 클로로포름(50㎖)을 첨가하여 잔류물을 용해시켰다(용해를 돕기 위해 초음파 파쇄법을 사용함). 클로로포름 층을 염수(3 x 15㎖)로 세척하고, 물(1 x 15㎖)로 세척하였다. 유기 층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 증발시켜, 108㎎의 순수한 N4-아세틸,N4-벤질-5′-O-DMT-2′-데옥시시티딘-3′-O-숙시네이트(97%의 수율)를 수득하였다.
[제5단계: LCAA-CPG 연결된 5′-O-DMT-N4-아세틸,N4-벤질-2′-데옥시시티딘-3′-O-숙시네이트의 제조]
활성화된 CPG를 다음과 같이 제조하였다. LCAA-CPG(1.0g, LCA00500C; 미국 뉴저지 주 페어필드 소재의 CPG 인코포레이티드)를 메틸렌 클로라이드내 트리클로로아세트산(3%, 10㎖)으로 처리하고, 4시간 동안 회전 증발기(로타베이퍼(rotavapor); 스위스 플라월 소재의 부치(Buchi))(진공은 아님)에서 회전시켜 혼합하였다. 용매를 여거하고, CPG를 트리에틸아민와 에틸디이소프로필아민(9:1)(3 x 5㎖)으로 세척하고, 메틸렌 클로라이드(3 x 10㎖) 및 에테르(3 x 10㎖)로 계속 세척하고, 진공하에서 건조시켰다.
산으로 세척한 CPG에 개질된 뉴클레오사이드 중간체를 결합시키는 것은 다음과 같이 실행하였다. 전술한 바와 같이 제조한 1g의 활성화된 LCAA-CPG에 N4-아세틸,N4-벤질-5′-O-DMT-데옥시시티딘, -3′-O-숙시네이트(108㎎, 0.13m㏖), 디메틸아미노피리딘(20㎎) 및 5㎖의 무수 피리딘을 첨가하였다. 반응 혼합물을 로타베이퍼(진공이 아님)에서 3일 동안 회전시켰다. 상청액을 여거하고, 결합된 LCAA-CPF를 피리딘(3 x 5㎖), 메틸렌 클로라이드(3 x 10㎖) 및 에테르(3 x 10㎖)로 계속해서 세척하고, 진공하에서 건조시켰다.
N4-아세틸,N4-벤질-5′-O-DMT-2′-데옥시시티딘-3′-O-숙시네이트에 결합된 LCAA-CPG를 캡핑시키는 것은 다음과 같이 실행하였다. 유도된 CPG에 캡핑 혼합 시약 A(THF/루티딘/Ac2O=8:1:1, 미국 비지니아주 스털링 소재의 글렌 러서치) 및 캡핑 혼합 시약 B(THF내의 10%의 N-메틸이미다졸, 글렌 리서치)를 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 로타베이퍼(진공이 아님)에서 회전시켰다. 용액을 여거하고, 연결된 LCAA-CPG를 피리딘(3 x 5㎖), 메틸렌 클로라이드(3 x 10㎖), THF(3 x 10㎖) 및 에테르(3 x 10㎖)로 계속 세척하고, 그 다음 진공하에서 건조시켰다.
유도화된 LCAA-CPF의 결합 용량은, 메틸렌 클로라이드내 3%의 트리클로로아세트산으로 5㎎의 생성물을 처리하여 결정하고, 방출된 디메톡실트리틸 카보늄 이온의 양은 UV 분광분석법으로 측정하였다. LCAA-CPG에 결합된 뉴클레오사이드의 양은 19.5μ㏖/g인 것으로 결정되었다.
[서열 목록]
서열들에 관한 일반 정보
출원인:
명칭: 에프 호프만-라 롯슈 아크티엔게젤샤프트
가: 그렌짜헤르스트라세 124
시: 바즐
주: BS
국가: 스위스
우편 번호(ZIP): 체하-4070
전화: 061-688 25 11
팩스: 061-688 13 95
텔렉스: 962292/965543 hlr ch
발명의 명칭: 개질된 프라이머
서열의 갯수: 7
컴퓨터 판독 형태:
매체 유형: 플로피 디스크
컴퓨터: 애플 매킨토시
운용 시스템: 시스템 7.1(매킨토시)
소프트 웨어: 워드 5.1
선출원 정보:
출원 번호: 60-041127
출원일: 1997년 3월 20일
1. 서열 식별 번호 1에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 33 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA(게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 1:
[서열 1]
CAATGAGACA CCAGGAATTA GATATCAGTA CAA
2. 서열 식별 번호 2에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 32 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA(게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 2:
[서열 2]
CCCTAAATCA GATCCTACAT ATAAGTCATC CA
3. 서열 식별 번호 3에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 26 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA(게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 3:
[서열 3]
GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTA
4. 서열 식별 번호 4에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 28 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA(게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 4:
[서열 4]
GCAAGCACCC TATCAGGCAG TACCACAA
5. 서열 식별 번호 5에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 23 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA(게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 5:
[서열 5]
CACATGCAAG TCGAACGGAA AGG
6. 서열 식별 번호 6에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 24 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA(게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 6:
[서열 6]
TAACACATGC AAGTCGAACG GAAA
7. 서열 식별 번호 7에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 24 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA(게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 7:
[서열 7]
GCCCGTATCG CCCGCACGCT CACA
본 발명에 의하면, 프라이머로서 개질된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실행한 증폭의 경우 비개질된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실행한 증폭과 비교하여 비특이적 증폭 생성물, 특히 프라이머 이량체가 덜 생성되고, 목적하는 증폭 생성물의 수율이 보다 증가하였다.
Claims (10)
- 하기 화학식 1a 또는 화학식 1b의 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드:[화학식 1a][화학식 1b]상기 식에서, S1은 길이가 뉴클레오타이드 약 5 내지 약 50개인 뉴클레오타이드의 제1서열을 나타내고; S2는 길이가 뉴클레오타이드 1 내지 3개인 제2서열을 나타내고; N은 상보적인 뉴클레오타이드와 뉴클레오타이드의 염기 짝짓기에 관련되는 고리외(exocyclic) 아민을 함유하는 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기를 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내고; R은 개질기를 나타내는 것으로, 고리외 아민을 통해 N에 공유결합되며, 이때 R은 하기 화학식 2의 구조를 갖는다.[화학식 2]상기 식에서, R1및 R2는 독립적으로 수소, C1-C10알킬기, 알콕시기, 페닐기, 페녹시기, 치환된 페닐기, 나프틸기 또는 치환된 나프틸기를 나타낸다.
- 제1항에 있어서, R이 2-나프틸메틸기, 벤질기 또는 치환된 벤질기인 올리고뉴클레오타이드.
- 제1 또는 제2항에 있어서, R이 하기 화학식 3의 구조를 갖는 치환된 벤질기 올리고뉴클레오타이드:[화학식 3]상기 식에서, R3은 C1-C6분지형 또는 선형 알킬기, 메톡시기 또는 니트로기이다.
- 제3에 있어서, R3이 C1-C6분지형 또는 선형 알킬기, 메톡시기 또는 니트로기를 나타내는 올리고뉴클레오타이드.
- 제3에 있어서, R3이 파라 위치에 결합되는 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, N이 아데노신인 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, R이 벤질, p-메틸벤질, p-3급-부틸벤질, p-메톡시벤질, o-니트로벤질 및 2-나프틸메틸로 구성된 그룹에서 선택되는 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 또는 제2항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 증폭 반응을 실행함을 포함하는, 핵산 표적 서열의 증폭 방법.
- 제8항에 있어서, 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산 증폭 반응을 실행하기 위한 키트.
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