TW567188B

TW567188B - A modified oligonucleotide, a method for amplifying a nucleic acid target sequence and a kit for carrying out a nucleic acid amplification reaction

Info

Publication number: TW567188B
Application number: TW087104213A
Authority: TW
Inventors: Stephen Gordon Will; Karen Kwok Ying Young
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1997-03-20
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2003-12-21
Also published as: NO322136B1; EP0866071A3; RU2159248C2; HUP9800581A2; ES2230631T3; KR100292997B1; PL325439A1; CN1065873C; HK1012192A1; BR9801878B1; HUP9800581A3; ATE280177T1; AU712448B2; CN1194270A; DE69827060T2; US6001611A; PL190142B1; CZ84198A3; CA2229766A1; BR9801878A

Description

567188 kl B7 五、發明説明（！）本發明係有關分子生物及核酸化學領域。更明確言之，其係有關改良核酸擴增反應收量之方法及試劑。因此本發明係應用在使用核酸擴增作用之任何領域上。本發明之聚合酶鏈反應（PCR)可於試管内擴增核酸序列。PCR已説明於美國專利案Nos. 4,683，195 ; 4,683,202及 4,965，188 ; Saiki等人，1985，Science 230: 1350-1354 ;慕里斯（Mullis)等人，1986, Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol· 5JL: 263-273 ;及慕里斯與法倫那（Faloona)，1987, Methods Enzymol. 15 5_: 335-350。PCR之發展與應用已詳細説明於文獻中。例如：一系列有關PCR之文獻已討論於 "PCR技術- DNA擴增法之原則與應用（PCR Technology-principles and applications for DNA amplification，1989 (H.A.艾利奇（Erlich)編輯），組約史塔頓出版社（Stockton Press); PCR方法：方法與應用（PCR protocols: A guide to methods and applications，1990 (M.A.英尼斯（Innis)等人編輯），聖地牙哥學院出版社（Academic Press);及PCR技巧 (PCR Stategies)，1995 (M.A·英尼斯等人編輯），聖地牙哥學院出版社。商業性刊物如：柏金艾瑪公司（Perkin Elmer， Norwalk, CT)出售之PCR試劑商品及公開之PCR法。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 自從核酸擴增法公開之後，各種以引子爲基礎之核酸擴增法已有説明，其包括（但未限於）：連接酶鏈反應 (LCR) ’ 吳與華勒斯（Wu and Wallace)，1989，Genomics 生: 560-569及巴拉尼（Barany)，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA M: 189-193);聚合酶連接酶鏈反應（巴拉尼，1991，PCR方 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 A7 B7 五、發明説明（2 ) 法與應用’ 1:5-16); Gap-LCR (PCT專利申請公告案No. W0 90/01069);修復鏈反應（歐洲專利申請公告案N〇. 439,182 A2)，3SR(柯瓦（Kwoh)等人，1989，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86： 1 173-1 177 ；高特里（Guatelli)等人，199〇,

Proc.Natl· Acad· Sci. USA ϋ: 1874-1878; PCT專利申請公告案 No· WO 92/0880A)及NASBA(美國專利案No. 5，130,238)。有關擴增系統之凋查可參見亞布姆森（Abramson)與邁爾斯 (Myers)，1993, Current Opinion in Biotechnology，4:4147。以引子爲基礎之擴增反應之專一性依引子雜交作用之專一性而定。在典型之擴增作用所採用之高溫下，引子僅與計畫中之目標序列雜交。然而，擴增反應混合物主要在室溫下集合，此溫度遠低於確保引子雜交專一性時所需之溫度。在此等較不嚴格之條件下，引子可能會非專一性地與其他僅邵份互補之核酸序列或其他引子結合，而開始合成不期望心延長產物，再沿著目標序列擴增。非專一性引子延長產物之擴增作用可與所需目標序列之擴增作用競爭，且會顯著降低所需序列之擴增效率。常見义一種非專一性擴增產物爲不依賴模板之擴增反應加工器，稱爲”引子二聚體"。引子二聚體爲一種雙股片段，其典型長度接近二個引子長度之總和，且當其中一個引子 < 長度超過另一個引子時，即會出現引子二聚體。所造成之連鎖效應爲形成不期望之模板，由於其長度短，因此會很有效地進行擴增。在反應開始之前減少形成引子延長產物時，即可降低非 ____ -5- 1紙張^^^國家標準(CNS ) M 規格(210^^^---—-^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

567188 A7 B7 五、發明説明（3 ) 專一性擴增作用。有一種稱爲”熱起動”法之方法，在反應混合物中保留一種或多種關鍵性試劑，直到溫度充份上升爲止，以提供必要之雜交專一性。依此方式，當反應條件無法確保專一性引子雜交作用時，反應混合物亦無法支持引子延長。手動之熱起動法中，當開始高溫培養步驟後打開反應官’並添加先前保留之試劑，此過程耗費人力，並提高反應混合物受污染之危險。或者，可使用熱敏感性材料，如·躐，來分隔或分開反應成份，如美國專利案N〇. 5,411，876 及周（Chou)等人，1992, Nucl Acids Res 拉⑺: 17 17-1723所述。此等方法中，高溫預反應培養使熱敏感性材料熔化，藉以使試劑混合。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁} 另一種在反應開始之前減少引子延長產物形成之方法則有賴DNA聚合酶專一性抗體對DNA聚合酶之熱可逆性抑制作用，如述於美國專利案No· 5,338,671。在集合反應混合物之前，由抗體與DNA聚合酶於室溫下之緩衝液中培養，使开;？成抗體-DNA聚合酶複合物。高溫預反應培養過程會使抗體抑制DNA聚合酶活性之作用不活化。此方法之缺點在於生產DNA聚合酶之專一抗體之成本高且耗時，尤其是大量生產時。此外，添加抗體至反應混合物中可能需要重新設計擴增反應。反應開始之前之延長產物之形成亦可藉由添加單股結合性蛋白質至反應中來抑制，其可與引子呈熱可逆性方式進行非共會鍵結，且藉由防止雜交作用來抑制引子延長。 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 A7 ------- B7 五、發明説明（4 ) 亦可採用美國專利案Ν〇· 5,418，149所述之方法，利用酵素降解反應開始之前所形成之延長產物，以減少非專一性擴增作用。新合成之延長產物之降解法爲添加dUTp與 UNG至反應混合物中，使反應混合物先於45_6〇Ό下培養後，才進行擴增反應。引子延長結果產生含尿嘧啶之 DNA，其續於預擴增條件下，利用UNG降解。此方法之缺點在於延長產物之降解作用會與延長產物之形成作用競爭，且非專一性引子延長產物之消除似乎較不完全。此方法之優點則爲來自前一個反應並形成雜質進入反應混合物中义含尿嘧哫DNA亦會降解，因此該方法亦藉由前述反應所擴增之核酸來減少PCR之污染問題。相關技藝專豕所習知之傳統分子生物與核酸化學之技術已詳細説明於文獻中。參見例如··山布魯克（Sambr〇〇k)等人，1989，分子選殖法-實驗室手册（M〇lecular c1〇ning-A Laboratory Manual)，紐約冷泉港，冷泉港實驗室（c〇ld Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor);寡核苷酸 a成法（M.J.盖特（Gait)編輯，1984);核酸雜交法（bd漢姆斯（Hames)與S.J·希金斯（Higgins)編輯，ι984);及一系列之’’酵素方法丨’（Methods in Enzymol〇gy)(學院出版公司 (Academic Press，Inc·)) 〇本發明提供經共價修飾之寡核嘗酸引子，用於試管内擴增核酸序列。採用本發明經修飾之引子時，相較於採用未修飾引子進行之擴增作用，可減少非專一性擴增作用，尤指引子二聚體之形成，及/或同時提高所需之目標產物收本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、一u 口 567188 A7 B7 五、發明説明（5 量 ° 本發明一方面係有關一‘種用於擴增核酸序列之寡核芬酸引子，其一般結構式如下：，· ______:— ________—........._________--- R R .

I I 5’-Si-]^一3' or 5’-Si-N-S2*"3 / 其中Si代表長約5至約5 0個核棼酸之第一個核苷酸序列；其中S2代表長1至3個核甞酸之第二個核甞酸序列；其中N代表含有含環外胺之嗔呤或p密症驗基之核嘗酸；其中R代表修飾基，其中r利用環外胺與N共價键結，且其中R之結構式如下：其中1^與R2分別代表氫，、Cl_ClG烷基、烷氧基、苯基、經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ς讀先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 木氧基、經取代之苯基、茶基、或經取代之茶基。燒基可分支或未分支。較佳具體實施例中，N爲經修飾之習知核：y：酸，此時n 爲經修飾之腺嘌吟核苷、胞嘧啶核芸、或鳥嘌呤核甞，且該修飾基部份係與腺嘌呤核甞、胞嘧啶核甞·、或鳥嘌呤核謀鹼基之環外胺共價附接。更佳具體實施例中，N爲經修 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4導格（210X 297公釐） 567188 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（ A7 —B7 6 飾之腺嘌呤核甞。. 、 a較佳具體實施例中，R爲2-萘甲基；爷基；或經取代之卞基。較佳之經取代之苄基之結構式爲：

Rs 其中R3代表C「C6分支或直鏈烷基，更佳爲c「C4分支或直鏈烷基、甲氧基、或硝基。較佳者，心附接在對位上。更佳具體實施例中，R爲芊基、對甲基爷基、對-第三丁基节基、對甲氧苄基或2」莕甲基。1 本發明另一方面係有關經對光不安定之共價附接之修飾基修飾之擴增引子，其會部份或完全抑制引子延長。對光不安4之你飾基可結合在環外胺（如上述經修飾之核芸酸）或結合在環氮上。一項具體實施例中，至少一個硝苄基附接3，-末端核苷酸之腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核替或胞嘧啶核菩鹼基之環外胺上。本發明另一方面爲一對或一組引子，其中至少一個引如上述經修飾。一項較佳，，具體實施例中，這一對引子中個成員或這一組引子中所有成員均經修飾。本I月另方面係有關擴增核酸之方法.，其包括採用發明經修飾之引子進，行擴增反應。本發明另一方面係有關擴增目標核酸之方法，其包括使用本發明對光不安定之經修飾引子進行擴增反應，其足以去除修飾基之光照射反應混合物，並使之形成引子本中以子延 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-9 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 五、發明説明（8 續”及”寡核芬酸”等名詞係指聚去氧核糖核誓酸（含 2-去氧-D-核糖）、聚核糖核甞酸（含核糖）、及任可其他 &式 < 聚核#酸’其m呤或,唉驗基或經修飾之嗓吟或嘧啶鹼基之n糖：y：。”核酸，，與，，寡核苷酸，，名詞之間之長度沒有區分，且此等名詞可交換使用。此等名詞僅指分子之級結構。因此，此等名詞包括雙股及單股DNA，及雙股及單股RN A。 π習知” 一詞係指天然存在於所述及聚核甞酸中之核酸鹼基、核4或核荅故。DNA之四種習知（或稱”主要”）之去氧核糖核苷酸含有嘌呤鹼基線嘌呤及鳥嘌呤，及嘧啶鹼基胞嘧啶及胸腺嘧啶。RNA之四種習知核糖核甞酸含有嘌呤鹼基嘌呤及鳥嘌呤，及嘧啶鹼基胞嘧啶及尿嘧啶。除了上述習知或常用鹼基外，許多種其他嘌呤及嘧啶衍生物（稱爲稀有或或次要鹼基）亦少量出現在某些核酸中。本文在核酸鹼基、核甞、或核茹酸中所採用”非習知，，一詞係指稀有或次要核酸鹼基、核苷、或核铝酸，及習知之鹼基、核答、或核甞酸之修飾物、衍生物或類似物，且包括具有經修飾之鹼基部份及/或經修飾之糖部份之合成之核芬酸（參見π寡核苷酸之共軛物之方法，分子生物法”（Pr〇t〇e〇ls f⑽

Oligonucleotide Conjugates，Methods in Molecular Biology，

Vol 26 (S.艾格拉瓦（Agrawal)編輯），紐澤西州特吐瓦市胡馬那出版社（Humana Press, Totowa，NJ，（1994));及”寡核苷酸與類似物，操作法，’（〇lig〇nucleotides and Analogues， A Pratical Approach)(牛津大學出版社，IRL(出版，ρ ·艾 -11 - 本紙張尺度適财關家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐)' "" '~~ ： ,----^11 衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T i-^i .Hi HI ϋ— · 567188 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（9 ) 克斯坦編輯（Fritz Eckstein，Ed·，IRL Press，Oxford University Press，Oxford)) o 寡核甞酸可依任何合適方法製備，包括例如：選殖及以限制酶切割適當序列，並採用如：那阮（Narang)等人， 1979，Meth. Enzymol.处：90-99之嶙酸三酯法；布朗（Brown) 等人，1979，Meth. Enzymol. 68.: 109 -1 5 1 之嶙酸二酉旨法；包克奇（Beaucage)等人，1981，Tetrahedron Lett. 22.: 1859-1862之二乙基亞胺基磷酸酯法；及美國專利案No. 4,45 8,066之固體擔體法進行直接化學合成法。有關合成法之概述説明於古德奇得（Goodhchild), 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165-187，該等文獻均已併爲本文之參考文獻。，’鹼基對”一詞相關技藝上亦稱爲”華生-克里克（Watson-Crick)鹼基對’’，係指雙DNA結構中之補鹼基對腺嘌呤-胸腺嘧啶與鳥嘌呤-胞嘧啶，RNA/DNA雜交分子中之腺嘌呤 -尿嘧啶及鳥嘌吟-胞嘧啶之習知之氫鍵結，及非習知之核甞酸對之類似键結。 ”雜交"一詞係指二個單股核酸因互補鹼基對形成之二倍體結構。雜交作用可出現在完全互補之核酸股之間或在’’ 實質上互補’’但含少部份不相配之核酸股之間。只有完全互補之核酸股雜交之條件稱爲π嚴格雜交條件’’或”序列專一性雜交條件π。實質上互補之穩定二倍體可在較不嚴格之雜交條件下達成；可耐受之不相配程度可藉由簡單調整雜交條件來控制。核酸技術之相關技藝專家們，可考量各 -12- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 567188 五、發明説明（10 ) 種=數實驗性決定二倍體安定性，此等變數包括例如：寡核芸酸之長度及鹼基對濃度。離子強度、及不相配之鹼基對發生率，此方法可遵循相關技藝所提供之指示（參見= 如：山布魯克（Sambrook)等人，1989，分子選殖法-實驗室手册，紐約冷泉港冷泉港實驗室，及威特姆（Wetn^)， 1991, Critical, Review in Biochem. and Mol. Biol. 26(3/4)· 227-259) 。 * ’’引子” 一詞係指在可合成與所誘發核酸互補之引子延長產物之條件下可作爲DNA合成起始點之寡核答酸，亦即該條件爲在四種不同核芸三磷酸及延長作用劑（例如：dna 聚合酶或逆轉綠酶）之存在下，於適當緩衝劑中，於合適溫度下。本文所採用”引子，，一詞係涵括受連接作用調節之擴增法所使用之寡核省:酸，其中一個寡核甞酸藉由連接於相鄰位置雜交之第二個寡核菩酸而延長。因此本文所採用 •’引子延長” 一詞係指個別之核苷三磷酸使用引子作爲DNa 合成法起始點之聚合作用及二個引子形成延長產物之連接作用。引子爲單股DNA較佳。引子之適當長度依引子之使用目的而定，但主要在6至5 0個核：y：酸之間。短的引子分子通常需要較低溫’以便與模板形成充份安定之雜交複合物。引子不需要反映模板核酸之正確序列，但必須足以與模板雜交。適合指定目標序列之擴增用之引子之設計係相關技藝習知者’且説明於本文所摘綠之文獻中。引子可再帶進其他特色，用於檢測或固定引子，但不改 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公楚） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 B7 五、發明説明（u ) 變引子之基本性質，亦即作爲DNA合成法之起始點。例如：引子可於5’-末端包含不會與目標核酸雜交但有助於選殖擴增產物之其他核酸序列。本文中稱此足以與模板互補之引子區域爲”雜交區，’。 n目標””目標序列”、”目標區”及”目標核酸”係指計畫擴增之核酸序列。本文所採用之引子若引子序列與目標序列之間之不相配數目少於引子序列與樣本中可能存在之非目標序列之間之不相配數目時，則稱此引子對目標序列具”專一性”。所選擇之雜交條件爲僅當所出現之不相配數目不超過引子序列與目標序列之間之不相配數目時，方可形成安定二倍體時之條件。在此等條件下，引子只可與目標序列形成安定二倍體。因此，在適當嚴格擴增條件下使用目標專一性引子時，可使含有目標引子結合位置之彼等目標序列進行專一性擴增。採用序列專一性擴增條件時，可使含有完全互補之引子結合位置之彼等目標序列進行專一性擴增。 •’非專一性擴增’’係指非目標序列之核酸序列之擴增，其係由引子與目標序列以外之序列雜交後，作爲引子延長作用之基質所致之結果。引子與目標序列之雜交係指”非專一性雜交”，且可發生在較低、較低之嚴格性、預擴增條件下。曰' 引子一聚體’’ 一同係指不依賴模板之非專一性擴增產物，其係由另一個引子作爲模板進行引子延長作用之妗果，雖然引子一聚體通常爲二個引子之連環物，亦即二聚 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·

、1T -14 -

567188 A7 五、發明説明（ B7 12 經濟部中央標準局員工消費合作社印製體，但亦可能出現-如 —個以上引子之連環物。本文一般採用 ’’引子二聚體M — —η卞叫果涵括不依賴模板所進行之非專一性擴增產物。 ' ’’反應混合物”一 —& Η係指含有進行特定反應所必要之試劑之溶液。’1擴增；5 _ % Α 、、、曰久應〜合物”係指含有進行擴增反應所必要之試劑之溶液，复± ”王要於合適緩衝劑中包含寡核嘗酸引子及DNA聚合酶蝼碴枝a 4逆接酶。” PCR反應混合物”主要於合適鑪衝劑中包含寡$ ^ 4 引子、熱安定性DNA聚合酶、 dNTP’s、及二價金凰 + 、"屬除離子。若反應混合物含有反應進行時所必要之所有4々免丨 ’武劑時，則稱此反應混合物完全，若僅含有。1W刀必要試劑肖，則對其不完全。相關技藝專家了解，爲了方标，A、儲存安定性，台了依用途調整成份濃 =，反應成份通常呈分開之溶液保存，各含有一部份總 2且万；&應〈前組合反應成份，形成完全之反應混卜相關技藝專家咸了解，反應成份係分開包裝由 ϋ ’且適用之市隹灰4 、 "套、、且商品可包含任何包含本發明經修飾引子之部份反應成份。星ϋ飾之 /發明之擴增引子係於引子3，·末端之四種㈣酸之一 ^附接-個基團進行修飾。_項具體實施例中，本發明經修飾引子由如下一般結構式之核酸序列組成： R R ,I I 5、S 丨 _N-3’-或 5，_m」，· 成合出共之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁〕 .衣

567188 A7 B7 五、發明説明（13 其中Si代表長約5至約5 〇個核芬酸之第一個核甞酸序列； “ * 其中S2代表長1至3個核替酸之第二個序列；其中N代表含有含環外胺之嘌呤或嘧啶鹼基之核甞酸；其中R代表修飾基，其中R利用環外胺與N共價結合，且其中R之結構式如下。如實例所不，當修飾在3,末端核铝酸時，修飾作用效果最大。因此引子最好包含經修飾之3,末端核苷酸。經修飾之核苷酸係.選自^等涉及與其互補核苷酸進行核苷酸之鹼基配對且其鹼基含有環外胺者。典型之引子爲僅含習知核甞酸之DNA。在·DNA中所見到之四種習知核苷酸鹼基中，腺嘌呤、鳥嘌呤與胞嘧啶含有涉及與互補鹼基進行鹼基配對之環外一級胺。本發明較佳方面，引子經由環外胺上附接單一修飾基來修飾，取代了胺基上二個氫之此氲原子右在未修飾之驗基上可能涉及驗基配對。含有經修飾之腺嘌呤、鳥嘌呤、及胞嘧啶鹼基之經修 I酸結構式分別示於下〇 , 人 <>請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.

、1T

消費合作社印製其中S代表糖部份，且R代表修飾基 -16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 567188

五、發明説明（）經濟部中央標準局員工消費合作社印製本發明不限於由習知之核甞酸組成之引子。任何核茌酸頌2物中，若鹼基部份含有涉及與互補鹼基進行鹼基配對、裒卜、、及胺時，則可如本文所述進行修飾。非習知核菩酸《實例包括：3_甲基腺嘌呤、7 -甲基鳥嘌呤、3 -甲基鳥嘌呤’ 5 -曱基胞嘧啶與5 _羥甲基嘧啶。由於修飾基取代了一個氫原子，因此限制經修飾之鹼基參與氫鍵結（能力。其餘氫原子則仍可參與氫鍵結。因此修飾基可影響雜交作用之動力學與熱動力學。許多修飾基應具有下列性質： 1 ·干擾，但不阻止經修飾之鹼基與互補之鹼基進行華生_ 克里克鹼基配對； 2 ·干擾，但不阻止經修飾之引子延長；及 3 ·谷4 &成經修飾之引子延長產物之互補股。修飾基於立體上干擾鹼基配對，因而干擾引子延長。因此，修飾基之物理性膨大會影響干擾雜交之程度。當雙股核酸中納入一個經修飾之腺嘌呤或胞嘧啶核甞酸時，修飾基會擠入主要間隙之中間空間内。結果，即使朿當大之修飾基亦會引起二倍體結構出現些微立體混亂。然而，合適之修飾基仍不致於一到阻止氫鍵結或阻止引子之3，·經基之酵素性延長。當經修飾之鳥嘌呤核苷酸納入雙股核酸中時，修飾基會擠入次要間隙中，留下之空間不足以容納龐大之修飾基。因此較小之修飾基較適合附接鳥嘌呤鹼基。用爲接續之擴增循環中之模板之引子延長產物含有經引子引進之經修飾驗基。修飾基之選擇係使模板中所含之經 -17- τ — I·----衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T I -- I I ! 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

567188 kl B7 五、發明説明（15 ) —--- 修飾驗基不會中止引子之延長作用或抑制引子之延長作用車又佳者，修飾基之性質不應導致突變，以免來自引子之模板再複製時喪失經修飾鹼基之特性。模板中經修飾驗基對引子延長作用之影響可依本文及相關技藝所提供之指不進行例行測試（參見例如：格南道斯基（Gniazd〇wski)血希拉（Cera)，1996, Chem· Rev. 96:619_634)。可滿足上逑性^之修飾基之R方適用於本發明方法。較佳修飾基之結構式如下·· ·

I

Ri~h~R2 其中R4r2分別代表氫、Cl_c6垸基、燒氧基、苯基、苯氧基:經取代之苯基、茶基、或經取代之祕。燒基可分支或爲直鏈。亦可使用較大燒基，至高達C.。一較佳具體實施例中.，R，2_茶甲基、爷基2°;或經取代之芊基。較佳之經取代之芊基之結構式如下··

經濟部中央標準局員工消費合作社印製其中R3代表CrC：6分支或直鏈燒基，爲分支或直鏈烷基更佳，或爲甲氧基，或硝基。〇1_〇4分支或直鏈烷基爲甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、異丁基、第三丁基’等等。曱基與弟二丁基馬較佳坑基。較佳者，以3附接在對位。，‘ « -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 567188 Λ7 Β7 16 五、發明説明（特別佳修飾基R如下所·示： ch[ 芊基對-第三丁基苄基- ch[ u0. 對-甲基芊基 1 NO,

鄰-硝基亨基 "XX) (<請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁；> 衣' 對-甲氧基苄基 2-莕甲基經濟部中央標準局員工消費合作社印製實例中已説明了許多特定修飾基。通常，相關技藝專家們於實驗上可依本文提供之指示，自上述化合物種類選出特別合適之修飾基。較佳者，於擴增反應中採用經修飾之引子於實驗上決定特定基團之適合性。成功之擴增作用表示經修飾之驗基不會完全抑制引子延長，且出現在衍生自引子之模板中之經修飾之驗基不會中止引子延長。引子一聚體之減少程度係依實例所述測定。具有對光不安定之倐飾之引.子本發明另一項具體實施例中，以一個或多個對光不安定之基團修飾引子’此寺基_可於反應已達到確保專一性之高溫反應條件後，經照光排除。由於修飾基已在引子延長之前排除，因此在排除基因之外，不需要延長經修飾之引 -19 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公嫠）、11 567188 kl B7 17 五、發明説明（子。本發明方法可使用之對光不安定之修飾基實例述於皮拉（Pillai)，1980，”有機合成中之光可脱保之保護基團 "(Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis1*, Synthesis: 1-26 o 較佳者’本發明之對光不安定之引子係於3，_末端核苷酸附接一個或二個鄰硝基苄基進行修飾：

經濟部中央標準局員工消費合作社印製引子之鹼基部份之環外一級胺上附接一個硝基苄基進^ 修飾後，所產生之二級胺中，若胺基可以旋轉，使其餘丨轉向互補鹼基時，則該二級胺仍可參與鹼基配對。如實^ 中所述，此等引子不論經uv光照射去除或未去除，均；用於擴增作用。 ) 在鹼基之環外胺之附接二個硝芊基而修飾之引子不可> 延長。該抑制作用據推斷係經修飾之鹼基沒有能力進行邊基配對所致，此乃因環外胺之二個氫均被龐大之硝m 置換而受阻。實例中説明擴增作用中使用帶有二個硝基1 基而修飾之引子之方法，其中反應混合物曝露至心; 一段充份時間，以排除硝基芊基，藉以延長引子。另一項具體實施例中，修飾基係附接環氮。因驗基之氮附接硝基爷基而修飾之引子則因經修飾之驗基益法射驗基配對而無法延長。經曝露到…而排除確基㈠ -20- 567188 hi B7 五、發明説明（18 後，即可延長引子。除非排除修飾基否則無法延長之對光不安定之上可用於丨，熱起動”式擴增作用。在土 ^ Η ^ F ^ 性預反應條件期間，引子延長作用會受抑制。反應經過㈣度上升至確保反應專一性之溫卢、田反應/皿圈。皿度時，万脱除引子之封端基經修飾之引子之合成色經修飾之引子之合成法係採用相關技藝上習知之標準化學方法進行。引進此等修飾基之方法可分成四種。 1. 修飾基可採用經修飾之㈣作爲DNA合成擔體而引進0 2. 修飾基可採用經修飾之核菩呈亞胺基磷酸醋形式引進。 3 ·修飾基可於DNA合成期間採用試劑引進（例如：當引進 DNA序列中時，以苄胺處理可轉化之亞胺酸酯）。 4.合成後之修飾作用。當與合成之DNA接觸時，修飾基可主反應性試劑引進。經濟部中央標準局員工消費合作社印製特足之經修飾之引子之合成法述於實例中。其他經修飾之引子可依類似方式，採用標準合成法合成。

較佳者，經修飾之引子可採用經衍化之控制孔玻璃（cpG) 合成擔體合成。衍化之dA CPG之一般合成反應圖示於圖 6。特定之修飾基可採用適當烷基_化物、芊基_化物、經取代之苄基li化物、甲莕基_化物、或經取代之甲莕基鹵化物等烷化劑添加。芊基·及對-第三丁基芊基_dA CPG 21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 567188 Λ7 B7

五、發明説明G 之合成法説明於實例1與2中，其係依圖6所示進行。環外胺基之烷化作用可採用類似葛里芬（Griffin)與李斯 (Reese), 1963’ Biochim· Acta 185-192所述之甲基化法進行。其他合成法説明於亞里特馬（Arit〇ma)等人，1995, j Chem. Soc. Perkin Trans. I： 1837-1849。採用經修飾之引子之擴增法本發明方法包括採用本發明經修飾之引子進行以引子爲基礎之擴增法。通常，經修飾之引子可替代含有相同核芸酸序列之未修飾之引子用於以引子爲基礎之擴增法，不需改變擴增反應條件。當然，相關技專家咸了解，有些反應中，反應條件宜經過例行之稍微再適量化。較佳具體實例中，本發明之經修飾之引子係用於聚合酶鏈反應（PCR)中。然而，本發明並不限於任何特定擴增系統。本發明之經修飾之引子可用於任何以引子爲基礎且可说开J成引子二聚體或非專一性擴增產物之擴增系統中。其實例包括上述文獻中所説明之擴增法。若發展出其他系統時，彼等系統可因操作本發明而受益。本發明之方法適合擴增DNA或RNA。例如：使用逆轉錄/ 聚合酶鏈反應（RT-PCR)之RNA擴增法係相關技藝習知且説明於美國專利案Nos· 5,322,770及5,3 10,652，邁爾斯（Myers) 與葛芬達（Gelfand)，1991，Biochemistry 姐(3 1): 7661-7666 ;楊（Young)等人，1993, j· Clin Mier〇bi〇1 R⑷： 882-886 及慕德（Mulder)等人，1994, J· Clin· Microbiol. 11(2): 292-300。 22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐）請先閱讀背面之注意幸項再頁經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 ΑΊ B7 五、發明説明（20 )

在以引子爲基礎之擴增法中，引子延長作用主要在加溫下，使用熱安定性酵素（如：熱安定性DNA聚合酶）進行。酵素自引子之3 ’端開始合成，向模板之5 f端方向進行，直到合成停止爲止。適用於擴增反應之純化之熱安定性DN A 聚合酶係相關技藝習知者，且包括（但不限於）：述於下列文獻之酵素：美國專利案No. 4,889,818 ;美國專利案No. 5,079,352 ;美國專利案No. 5,352,600 ;美國專利案 No.5,491,086 ; WO 91/09950 ; WO 92/03556 ； WO 92/06200 ; WO 92/06202 ; WO 92/09689 及美國專利案 N〇.5,210,036。有關熱安定性DNA聚合酶之概論述於艾柏森（Abramson)，1995，PCR法（PCR Strategies)，（M.A.英尼斯（Innis)等人），ρρ· 39-57，聖地牙哥學院出版社 (Academic Press, San Diego) 0 較佳具體實施例中，尤其用於擴增DNA時，依可逆性不活化酵素之用法所述，使用可逆性不活化酵素進行擴增，再於高溫反應條件下再活化，進而在反應開始之前，抑制引子延長，而減少非專一性擴增。一種可逆性不活化之熱安定性DNA聚合酶已由霍夫曼·拉洛奇（Hoffmann-La Roche) (紐澤西州那特里市（Nutley，NJ)發展及製造，且由柏金艾瑪公司（Perkin Elmer)(康乃狄克州諾瓦克市（Norwalk，CT)) 上市出售，其已説明於柏希（Birch)等人，1996，Nature 3 81 (6581): 445-446 。修飾基對酵素延長引子之能力之影響部份依所採用之特定酵素而定，一部份依所選擇之反應條件而定。例如：當 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）請閲讀背面之注意事項再頁經濟部中央標準局員工消費合作社印製經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 A7 五、發明説明（21 ) --- 使用Mn2+作爲二價陽離子（如某些RNA擴增法中）比使用 Mg2+時，mDNA聚合酶更能發揮作用。相關技蓺了解’例如上選擇合適之修飾基時’應考量酵素^反應條件。適合擴增反應之樣本製法係相關技藝習知者，且詳細説明於本文所摘錄之文獻中。所採用之特定方法並非本發明之重點。相關技藝專家們可由已知之樣本製法所採用之反應條件調整到最適合使用之程度。擴增之核酸之分析法係相關技藝習知者，且完全説明於本文所摘錄之文獻中。所採用之特定方法並非本發明之重點。相關技藝專家可根據用途選擇合適之分析法。分析擴增反應之較佳方法爲追踪反應混合物中雙股dna 之增加總量，如 HigUchi 等人，1992, Bi〇/Techn〇1〇gy 过: 413-417; Higuchi 等人，1993, Bi〇/Techn〇1〇gy u: 1〇26_ 1〇30;歐洲專利公告案！^〇3.512,334與64〇,828所述。本方法中，本文中稱爲”動態PCR”之雙股DNA檢測法體係依與雙股DNA結合之乙基溴（EtBr)及其他DNA結合標記物所提回之螢光度而定。擴增法係於標記物之存在下進行。由目標序列合成而增加之雙股DNA可使擴增過程中所追踪到之螢光度顯著提鬲。因此，該方法可追踪擴增反應之進度。在動態PCR中，所測得之螢光度隨其中所含由非專一性擴增法或目標序列之擴增法產生之雙股DNA總量而變化。追踪螢光度即可測得增加之雙股]〇1^八總量，但由目標序列擴增而增加之量則無法獨立測得非專一性擴增產物所提高 ---τ--·----衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T -I I I -i ___ -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐）

567188 A7 B7 五、發明説明（22 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I榮光度。本發明之經修飾之引子特別適用於動態pCR，因爲其不僅減少所形成之引子二聚體之量，而且延緩引子一聚體形成達可檢測之量。當目標序列已顯著增加後引子一聚體方延緩形成時，可以獨立追腙目標序列之擴增及使引子二聚體之干擾度降至最小。查組本發明亦有關套組，含適合操作本方法之成份之多容器單位’適用之套組包含引子，其中至少一個引子如上述經修飾，用於核酸擴增法，套組中其他視需要選用之成份包括例如：催化合成引子延長產物之試劑、核苷三磷酸受質、適當反應緩衝劑、及進行本方法之説明書。下文所示之本發明實例僅供説明用，且未限制本發明之範圍。相關技藝專家們由上文説明及下列實例中即可了解繼實例之後之申請專利範圍内有許多本發明之具體實施例0 實例1 經爷基修飾之引子之合成法經濟部中央標準局員工消費合作社印製經添加芊基而修飾之引子係由下文所述二種方法之一合成。採用N、芊基去氧腺嘌呤核苷控制化玻璃（CPG)起動 DNA合成法，合成3’末端鹼基經修飾之引子。採用N6-芊基去氧腺嘌呤核铝亞胺基磷酸酯合成内部鹼基經修飾之引子。實例中採用下列標準縮寫： DMAP 4-二甲胺基吡啶 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 567188 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Λ7 五、發明説明（23 ) DMF Ν，Ν·二甲基甲醯胺 TEA 三乙胺 EDC 1，乙基二甲基胺丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽 THF 四氫吱喃 DMT 二甲氧三苯甲基 LCAA-CPG 長鏈烷胺基控制孔玻璃 L纪-苄基去氧腺嘌呤核# CPG之合成法步驟1 : Ν6-苯甲醯基，基，5，-〇-DMT-2，-去氧腺嘌呤核棼之合成法添加吡啶（1 0亳升）至>^6_苯甲醯基-5，-〇-(4,4，-二甲氧三苯甲基）-2’-去氧腺嘌呤核甞（657毫克，1.〇毫莫耳，艾力奇化學公司（Aldrich Chemical Co·，Milwaukee，WI)，混合物眞空蒸發乾燥。重覆此過程。所得泡沫物溶於無水DMF( i 5 毫升；艾力奇化學公司）中，冷卻至5 X：。於氬大氣下添加氫化鈉（44毫克，K1毫莫耳，u當量，6〇0/〇油勻散液），於室溫下攪拌45分鐘。以2分鐘時間添加苄基溴（143微升’ 206毫克，ι·2毫莫耳，1·2當量；艾力奇化學公司），混合物於室溫下攪拌一夜。混合物眞空蒸發乾燥，殘質分佈於乙酸乙酯與水（各1〇毫升）之間，並萃取。水相以乙酸乙醋（1 0毫升）再萃取，合併之萃液經無水硫酸鎂脱水，過滤及蒸發。粗產物經矽膠（7 5克）管柱層析，使用甲醇、三乙胺一氣甲fe (3:0.5:9 6 · 5)純化。合併含產物之溶離份，蒸發乾燥，產生所期望之N6_苯甲醯基，N6_爷基，5，_〇_ DMT_2’_*氧腺嘌呤核站（41〇毫克，54%)。以NMR確認產 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（Cns ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -· 567188 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（24 物之結構。步驟2 :琥珀醯化作用添加吡啶（1 〇毫升）至N6-苯甲醯基，N6-芊基，5，_〇 DMT_2f-去氧腺嘌呤核甞（295毫克，〇·39毫莫耳）中，混人物於高度眞空下蒸發乾燥。重覆此步驟。共同添加新鮮無水吨淀（10毫升）與琥珀酸酐（2〇〇毫克，2毫莫耳，5·〇當量）與DMAP (24毫克），溶液於氬氣及室溫下攪拌一夜。於眞空下排除大量溶劑，殘質分佈在二氯甲烷（2〇毫升）與擰檬酸鈉溶液（20毫升，〇·ι μ，pH 5.0)之間，並萃取。水相以更^ 一軋甲’丨元（2 0愛升）萃取，合併之萃液經無水硫酸納脱水，過濾，及蒸發乾燥。產物經矽膠（4.5克）管柱層析，使用乙酸乙酯、三乙胺、二氣甲烷（32:1:67)純化，產生所需之3’-琥珀酸酯，N6-苯甲醯基-N6·芊基·3，_0·琥珀酸酯·5，·〇_ DMT-21·去氧腺嘌呤核铝（247毫克，74%)。步驟3 : CPG之衍化作用依下列方法製備經酸洗滌之CPG。取LCaa-CPG (1.0 克，LCA00500C，500Α，88.6莫耳/克；紐澤西洲費爾菲德市CPG公司（CPG Inc·，Fairfield，NJ)，定期與含二氣乙酸之二氣甲烷（2%，20毫升）於室溫下渦轉洗滌2〇分鐘。經酸洗滌之CPG經玻璃料過濾，以二氯甲烷洗滌，直到不含酸爲止。粉末同乾，於室溫下眞空乾燥一夜。依下列方法’使經修飾之核菩中間物與經酸洗滌之CpG 偶合。添加TEA (100微升）至含N6-苯甲醯基苄基_3，_琥 ί白酸酯-5’-0-DMT-2’-去氧腺嘌呤核苷（17〇毫克，〇·2毫莫耳） -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇χ297公釐） ---^---.----衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 A7 ____ B7 五、發明説明（25 ) (依上述製備）之二氣甲烷（10毫升）溶液中，溶液於氬氣下濃縮至約5毫升。依序添加dmAP (12毫克，^丨毫莫耳， 0.5‘里），丁丑八（1〇〇微升），£0(1!(384毫克，2.〇毫莫耳， 10當量）及來自上述步驟之經酸洗滌之CPG。添加無水吡淀（5毫升），混合物於室溫下密封振盪3天。眞空過遽 CPG，以異丙醇徹底洗滌，再以二氣甲烷洗滌，風乾後，眞空乾燥1小時。依下列方法爲衍化之CPG封端。添加封端A與封端b溶液 (各5毫升，乙酸酐/2,6-二甲基吡啶/THF與1〇〇/〇N_甲基咪唆之THF溶液；維琴尼亞州史特林市葛倫研究公司dNA合成試劑（Glen Research DNA synthesis reagents, Sterling VA))至乾燥之衍化之CpG中，混合物於室溫下振盛4小時。具空滤出CPG ’以異丙醇徹底洗務後，以二氣甲貌洗滌，風乾後，眞空乾燥一夜。 Π·反6-苄基去氧腺嘌呤核甞亞胺基磷酸酯之合成法依上述合成Ν6-苯甲醯基，Ν6-芊基5，-0-DMT-2，·去氧腺嗓呤核謀。添加二異丙基乙胺（350微升，270毫克，2.04毫莫耳，7.8 當量）與2 _氰乙基N，N-二異丙基氣亞胺基嶙酸酯（IQ毫克，0.68毫莫耳，2·6當量；威斯康辛州米瓦基市艾力奇化學公司）至Ν6-苯甲醯基，Ν6-芊基，5，-0-DMT-2’-去氧腺嗓呤核甞（196毫克，0.26毫莫耳）之無水THF(8亳升）溶液中，混合物於室溫及氬大氣下攪拌3 0分鐘。眞空排除溶劑，殘質分佈在碳酸氫鈉溶液（5%，20毫升）與乙酸乙醋 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.

、1T 567188 A7 B7 五、發明説明（26 ) (2 0毫升）之間。有機相以碳酸氫鹽溶液，水及飽和鹽水 (各2 0毫升）依序洗滌，經硫酸鋼脱水，過滤及蒸發。殘質經矽膠（4克）管柱層析，使用丙酮/己烷/TEA (34:65:0.7)純化，產生所需之亞胺基磷酸酯（248毫克，100%)。 HI. DNA合成法、純化法輿分析法取苄基衍化之腺嘌呤核：y： CPG (25毫克，1.0莫耳）移至空的合成管柱（維琴尼亞州史特林市葛倫研究公司）中，用於ABI 374 DNA合成儀（加州佛斯特市應用生物系統分部柏金艾瑪公司（Perkin Elmer，Applied Biosystems Division， Foster City，CA)中採用習知合成法及脱除保護之條件，製備寡核驻酸。粗DMT-DNA經標準DMT On/Off HPLC使用阮寧（Rainin)純DNA管柱，於阮寧HPLC系統（阮寧儀器公司，馬里蘭州沃本市（Rainin Instrument Co. Woburn，MA)) 上純化並轉化成5’_羥基-DNA。寡核甞酸係採用ABI毛細電泳系統（加州佛斯特市應用生物系統分部柏金艾瑪公司）或變性陰離子交換HPLC層析法，於Dionex Nucleopak管柱 (加州聖尼維爾市狄歐尼斯公司（Dionex Corp. Sunnyvale， CA))上分析。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 同樣地，採用未修飾之CPG及依上述合成之經修飾之亞胺基磷酸酯合成内部經修飾之引子。實例2 經第三丁基芊某絛飾之引子之合成法本實例説明3，-末端腺嘌呤核菩經對-第三丁基苄基修飾之引子之合成法。經修飾之引子之合成法基本上依實例1 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 A7 ____B7 五、發明説明（27 ) — " — - 户斤述，但改用N6-(對-第=丁基节基）去氧腺嗓吟核巷cpG 進行，衍化之CPG之合成法說明如下。步驟i : N6-苯甲酸基-N、對_第三丁基爷基）_5，七二甲氧三苯甲基）-2’-去氧腺嘌呤核棼之合成法添〜dmf (無水，10毫升）至N6-苯甲醯基巧，·〇_(4,4，_二甲氧三苯甲基）-2’_去氧腺嘌呤核苷（658毫克，1〇毫莫耳）中，並蒸發至乾。重覆此步驟。於氬大氣下添加新鮮DMF (丨〇毫升）。添加氫化納（44亳克，6〇%油中，1」毫莫耳），混合物於室溫下攪拌〇_5小時。滴加4_(第三丁基）芊基溴（272毫克，1.2毫莫耳），於1溫下攪拌一夜。眞空排除溶劑，殘質分佈在乙酸乙醋與水（各20亳升）之間。有機相以水洗滌 (3次，2 0毫升），經操水硫酸鎂脱水，過濾及蒸發至乾。粗產物經矽膠（100克）管柱層析，使用二氣甲烷：甲醇：二乙胺96.5:3:0.5純化，產生N6-苯甲醯基_N6·(對·第三丁基爷基）-5，-0-(4,4，·二甲氧三苯甲基）_2，去氧腺嗓吟核誓 (229毫克，28.5%)。步驟2 :琥珀醯化作用以含琥珀酸酐（135毫克，5當量）與DMAP (17毫克，〇·5 當量）之吡啶（1 〇毫升）溶液處理N6-苯甲醯基-N6-(對-第三丁基芊基）-5f-0-(4,4’-二甲氧三苯曱基）_2匕去氧腺嘌呤核：y： (217毫克，0.27毫莫耳）。依上述實例1所述操作及層析，產生N6-苯甲醯基- N6-(對·第三丁基芊基）_5»_〇_(4,4，-二甲氧三苯甲基）-2^去氧腺嘌吟核甞3，-〇_琥珀酸酯（199毫克， 82%) 〇 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（。灿）六4規格（210父297公麓） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) • · 訂 567188 A7 B7 五、發明説明（28 ) 步驟3 : CPG之衍化作用依實例1所述，以經酸洗滌之LCAA-CPG處理上述步驟2 之琥珀酸酯（180毫克，〇·2毫莫耳）。CPG經過封端處理及眞空乾燥，產生N6-苯甲醯基-N6-(對-第三丁基苄基）_5，-〇_ (4,4*-一甲氧二苯甲基）_2’-去氧腺嘌呤核苷，3，_〇_琥珀酸酯衍化之CPG (1.065克）。實例3 丝__甲基修飾之引子之合成法採用N -甲基dA CPG (22毫克，1微莫耳，維琴尼亞州史特林市葛倫研究公司）合成3’_末端腺嘌呤核菩經甲基修飾之引子。N_甲基d A CPG置入空的合成管柱中，根據標準合成條件製備引子及脱除保護。引子使用Dmt 〇n/〇ff HPLC法，依實例1述純化。實例4 對光不安定之經倐飾引子之合成1 本貫例説明3苯端腺嘌呤核茹經一或二個硝芊基修飾之引子（合成法。經修飾之引子基本上依實例1所述合成，但改用單硝苄基dA CPG或雙_硝芊基dA CPG進行。 I·單磧芊基化引子經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 採用N6-苯甲醯基_ N6_芊基-2，_去氧腺嘌呤核苷衍化之 CPG之一般合成法（見實例丨）來合成N6_苯甲醯基-N6—鄰-硝爷基-2f-去氧腺嘌呤核甞衍化之cPG，但其中改用鄰_硝爷基溴作爲烷化劑。CPG之後續步驟則與實例1相同，但增加保護中間物，以鋁箔紙包住反應瓶，防止光照之步驟。 -31 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) M規格（2丨〇>< 297公襲）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 A7 --------- B7 五、發明説明（29 ) 合成何化（CPG之後，依實例j所述合成引子，但採用 Nensorb Prep可棄式管柱（馬里蘭州波士頓市杜邦公司， NEN研先產口口生物技術系統（NEN Rese㈣^卩⑺仙…

Biotechnology Systems，Du P〇nt c〇·，Boston ΜΑ))，採用廒商所説明之方法進行固相萃取法分離。 II.雙-硝芊某化引早雙-硝苄基去氧腺嘌呤核芸CPG之合成法説明如下。合成衍化之CPG後，依單硝苄基引子所述之方法合成引子及純化° 步驟1 : 5’-0-DMT-N6-雙_鄰_硝芊基_2，_去氧腺嘌呤核苷取21-去氧腺嘌呤核苷單水合物（538毫克，2〇毫莫耳，威斯康辛州米瓦基市艾力奇化學公司）與無水吡啶（於眞空下蒸發乾燥（2次，1 〇毫升）。殘質溶於氬大氣下之無水dmf (10毫升，威斯康辛州米瓦基市艾力奇化學公司），添加氫化鈉（88毫克，2.2毫莫耳，ι·ι當量，60〇/〇油勻散液），於 1：溫下攪拌40分鐘。添加2-硝基芊基溴（71〇毫克，3·3毫莫耳，1.5當量），溶液於室溫下攪摔4小時。眞空蒸發排除DMF，殘質分佈於乙酸乙酯與水（各2 〇毫升）之間，以乙酸乙醋（2 0毫升）萃取水相，合併之萃液以水（2 〇毫升）洗務’經硫敝鍰脱水’過滤及蒸發，粗產物經碎膠管柱舞析 (50克，使用3% MeOH之CH2C12溶液）純化，產生2，_去氧· N6-雙-鄰硝爷基腺嗓吟核嘗（320毫克，30%)。添加無水吡啶（1 0毫升）至2，-去氧-N6-雙-鄰硝；基腺嗓呤核誓（200毫克，0.5 18毫莫耳）中，蒸發至乾。依序添加 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇><297公釐） „ · — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 -----B7 五、發明説明（3〇 ) p比咬（10毫升）、4,4，-二甲氧三苯甲基氯（900毫克，2.3毫莫耳4.5當量）及三乙胺（28〇毫克，2 76毫莫耳，4 〇當量），於室溫及氬大氣下攪拌5小時。加水（0.5毫升），攪拌2〇分鐘。混合物分佈於醚與水（各2 〇毫升）之間，水相以醚（2 〇毫升）再萃取一次。合併萃液，以水（2 0毫升）洗滌，經無水硫酸鈉脱水，過濾及蒸發。此物質經矽膠層析純化（4 克’使用0.7-2.5%甲醇之二氣甲烷溶液），產生5，-〇-DMT· N6-雙-鄰-硝芊基_2，-去氧腺嘌呤核苷（121毫克，33%)。步驟2 :琥珀醯化作用 5’-0-DMT-N6-雙-鄰-硝苄基_2’_去氧腺嘌呤核铱（121毫克’ 0.145毫莫耳）與無水吡啶（2次，3毫升）蒸發乾燥。添加峨呢（3毫升），琥珀酸酐（5 8毫克，〇.58毫莫耳，4當量）及DMAP (11毫克，觸媒量），溶液於室溫下攪拌3天。汶液眞空蒸發，殘質分佈在二氣甲烷（丨〇毫升）與擰檬酸鈉緩衝液（0·1 M pH 5.0，10毫升）之間。有機相經無水硫酸鈉脱水，過濾及蒸發至乾。粗產物經矽膠層析純化（2克，使用 EtOAc:CH2Cl2:TEA，32:67:1，1 〇毫升，然後使用 Me〇H: CH2C12 ’ 3:97 ’ 25毫升）’產生淺蒌泡沫狀物，5，_〇_DMT_ N -雙-鄰-硝卞基-21-去氧腺嘌呤核甞_3，-〇_琥珀酸酯（138毫克，99.5%)。步驟3 ·· CPG之衍化作用依實例1製備經酸洗滌之LCAA-CPG。依下列方法，使經修飾之核：y：中間物與經酸洗滌之cpG 偶合。於琥珀色玻璃瓶内，以TEA (16微升）處理5，_〇_ -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） Γ · 衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 Μ ---------Β7 五、發明説明（31 ) ----- 雙令硝m去氧“呤核f琥璃酸醋 (2 ’0.04毫莫耳），並蒸發。在此殘質中添加無水被笔升），TEA (2 微升），DMAD (2.4 毫克），EDC (76 曰一〇·04笔莫耳）及經酸洗滌之LCAA-CPG (200亳克），奶口物於ί衣繞式混合機上’於室溫下振们天。減壓過滤 CPG ’以異丙醇徹底洗滌，然後以二氣甲烷洗滌，風乾，眞空乾燥1小時。依實例1所述，爲衍化之CPG進行封端。實例5 遂飾之引子之擴增法-經修飾之核竑酸之位置影響爲了證實經修飾之引子對形成引子二聚體之影響，採用經修飾之引子及未修飾之引子比較mv-1 RNA之擴增作用。此外，爲了評估經修飾之核：y：酸之位置對減少引子二聚體之影響，採用三種不同上游經修飾之引子進行擴增，這三種引子之差異處僅在於經修飾驗基之位置。目標核酸基本上依慕德（Mulder)等人，1994, J· Clin· Microbiol. 32(2): 292-300所述，採用HIV_1 RNA轉綠載體合成HIV-1 RNA模板。引子採用未修飾及經修飾之引子進行擴增。未修飾之引子之核苷酸序列依5 ’至3，之方向，示於下文。上游引子RAR 1032MB (SEQ ID NOM)及下游引子 RAR 1033MB (SEQ ID NO: 2)擴增Π5個驗基對之產物’相當於Η1 V-1參考菌種 -34- 本紙張尺度適用中國國家^ CNS ) Α4規格（_ (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁) 衣· 訂 567188 kl B7 五、發明説明（32 ) HXB2 (基因銀行（GenBank)登錄號K03455)序列之核甞酸位置 2956至3130。 HIV-1擴增引子引子 Seq. ID No. 序歹1j RAR1032MB 1 C AATGAGAC ACC AGGAATTAGATATCAGTAC AA RAR1033MB 2 CCCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA 上述引子係指未修飾之引子。未修飾之引子於5 ’末端進行生物素基化。依實例1合成經修飾之引子，其係由與未修飾之引子相同之核站酸序列组成，但在3 ’末端位置或3 ’ 末端上游1個以3個核棼酸位置含有芊基化腺嘌呤核苷。引子之經修飾形式如下：引子經修飾之HIV-1擴增引子 Seq. Id. No. 經修飾之核棼酸位置 RAR1032MBA1 1 RAR1032MBA2 1 RAR1032MBA4 1 RAR1033MBA1 2 3’末端自3’末端起1個自31末端起3個 3’末端 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製擴增法於含下列試劑之100微升反應中進行擴增法 100套HI V 模板RNA， 50 mM 麥黃酮（pH 8.33)， 110 mM KOAc， 300 /^M^dATP > dCTP^dGTP ^ -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 567188 A7 B7 4 5 °C 4分鐘； 6 0 °C 2 0 分鐘；於9 4 °C變性4 5秒，於60 C接合/延長45秒； 6 0 °C 7分鐘； 1 0 °c，直接分析止（短期）經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（33 50//M dTTP 50〇eM dUTP， 50"M各引子， 3.5 mM Mn(OAc)2， 13 %甘油， 20單位Z05 DNA聚合酶*，及 2.0早位 UNG**。 *説明於美國專利案No. 5,455，170 **由霍夫曼-拉洛奇公司製備與發展，由康乃狄克州諾瓦克市柏金艾瑪公司出售。擴增溫度循環係於TC 480 DNA熱循環機（康乃狄兄州諾瓦克市柏金艾瑪公司）中，採用下列溫度形態進行：預反應培養逆轉錄 4 6次循環最終延長反應後保持擴增產物之檢測依下列方法，採用凝膠電泳法檢測擴增產物之存在。採用瓊脂糖凝膠（100毫升3% NuSieve與0.5% SeaChem)分離反應產物，使用 IX TBE (0.089 M Tris，0·089 Μ删酸，0.0025 M EDTA二鈉）作爲移動緩衝液。添加乙基溴（〇 5微克/毫升) 爲任何存在之DNA染色。於100伏特下進行電泳約1小時。 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---!---,-----衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -訂 567188 Α7 Β7 五、發明説明（34 ) 採用U V照射檢乙基溴染色之DN A色帶。結果凝膠電泳分析法之結果示於1。凝膠條上之編號相當於分別採用下表所示未修飾之引子與經修飾之引子之組合進行之擴增結果。相應於所需HIV產物之色帶在圖中以箭頭表示。凝膠中其他色帶則相應於非專一性擴增產物，特定言之，引子二聚體。引子 * 上游_下游 RAR1032MB RAR1033MB 1 RAR1032MBA1 RAR1033MB 2 RAR1032MBA2 RAR1033MB 3 RAR1032MBA4 RAR1033MB 4 RAR1032MB RAR1033MBA1 5 RAR1032MBA1 RAR1033MBA1 6 RAR1032MBA2 RAR1033MBA1 7 RAR1032MBA4 RAR1033MBA1 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由於引子二聚體之形成會與所需擴增產物之形成競爭，因此主要造成引子二聚體減少，同時增加所需產物之形成量。因此比較引子-二聚體形成量與使用未修飾之引子時之形成量，及比較所需目標物形成量與使用未修飾之引子時之形成量，即可了解經修飾引子之影響。由採用二種未修飾引子時之結果（凝膠條1號）與採用單 •37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 567188 A7 B7 五、發明説明（35 ) 丨 I —j--I%— I I -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一種3’_經修飾之引子時之結果（凝膠條2與5號）比較及與採用二種3，-經修飾之引子時之結果（凝膠條6號）比較，顯示使用一種或二種經修飾之引子時，得到較少引子二聚體。使用單一 3’_經修飾之引子進行擴增時，引子二聚體之減少情形稍有差異，此點仍賴該經修飾之引子而異。使用二種經修飾之引子時（凝膠條6號），引子二聚體形成減少程度最大且擴增之目標序列量顯著提高。比較凝膠條6至8號，即可了解經修飾之核:y：酸之位置影響。採用於3 ’末端核甞酸相鄰之核替酸處修飾之引子得到之引子二聚體減少量（凝膠條7號）與採用於3，末端核菩酸處修飾之引子得到之減少量（凝膠條6號）相同，而採用於 3 -末端核苷酸上游三個鹼基之核苷酸處修飾之引子所得到之改良效果（凝膠條8號）則稍差。實例6 —步擴增-經修飾之核甞酸位置乏影響馬了進一步證實經修飾之引子對引子二聚體之形成之影喜’基本上依上述，使用經修飾之引子與未修飾之引子擴經濟部中央標準局員工消費合作社印製増HCV RNA ’進行比較。採用三種下游經修飾之不同引子進订擴增，引子之相異處僅在於經修飾之鹼基位置。目標核酸採用HCV RNA轉錄載體，依楊（Young)等人，1993, J.

Clin· Microbiol· 31(4): 882-886所述，合成HCV RNA模板。引子 -38- 个、，.就度通用宁國國家標準（⑽）M規格（21〇>< 297公襲） 567188 A7 B7 五、發明説明（36 ) 採用未修飾及經修飾之引子進行擴增。未修飾之引子之核甞酸序列依5 '至3 ’之方向示於下文。上游引子ST280A (SEQ ID NO: 3)及下游引子 ST778AA (SEQ ID NO: 4)擴增 HCV基因組之5’_未轉錄區之240個鹼基對產物。引子

Seq Id No: HCV擴增引子 _核甞酸序列 ST280A 3 ST778AA 4

GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA 上述引子係指未修飾之引子。依實例1合成經修飾之引子，其係由與未修飾之引子相同之核棼酸序列組成，但於 3 ’末端位置或3 f末端上游一個或三個核苷酸位置含有一個苄基化腺嘌呤核苷。引子之經修飾形式示於下文。引子經修飾之HCV擴增引子 Seq Id No:_經修飾之核茫酸位置 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ST280ABA1 3 ST778AABA1 4 ST778AABA2 4 ST778AABA4 4 3’末端 3’末端自3’末端起1個核甞酸自3’末端起3個核甞酸擴增法與分析法基本上依實例3所述進行擴增，但改用100套HCV RNA模板。依實例3所述進行擴增產物之凝膠分析法。結果 -39 本紙張尺度適用中關家標準（CNS )以規格（21G><297公楚） 567188 ΑΊ B7 五、發明説明（37 ) 凝膠電泳分析法之結果示於圖2。凝膠條編號相當於分別使用下表所示之未修飾引子與經修飾引子之組合時之擴增結果。相應於所需HCV產物之色帶在圖中以箭頭表示。凝膠中其他色帶相應於非專一性擴增產物，特定言之引子二聚體。引子條帶上游下游 ST280A ST778AA 1 ST280A ST778AABA1 2 ST280A ST778AABA2 3 ST280ABA ST778AABA4 4 ST280ABA1 ST778AA 5 ST280ABA1 ST778AABA1 6 ST280ABA1 ST778AABA2 7 ST280ABA1 ST778AABA4 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由於引子二聚體之形成會與所需擴增產物之形成競爭，因此主要減少了引子二聚體，同時提高了所需產物之形成量。因此比較引子二聚體之形成量與使用未修飾之引子時之形成量及比較所需目標之形成量與使用未修飾之引子時之形成量，即可了解經修飾引子之影響。所得結果類似前述實例所述HIV擴增法所得結果，但在 HCV擴增法中，所需產物之增加程度比HIV擴增法中之增加程度顯著。由採用二種未修飾之引子之結果（凝膠條1號) -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 567188 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（38 ) 與採用單一 3’-經修飾之引子之結果（凝膠條2及5號）比較並與採用二種3’_經修飾之引子之結果（凝膠條6號）比較，顯示當採用一種或二種經修飾之引子時，可減少引子二聚體形成。採用二種經修飾之引子時（凝膠條6號），引子二聚體之減少程度最大，同時顯著提高擴增之目標序列量。如前述實例，當採用單一3，·經修飾之引子進行擴增時，引子二聚體之減少程度稍有差異，此點隨該經修飾之引子而異。比較凝膠條6至8號，即可了解經修飾核棼酸之位置之影響。當採用在3，-末端核甞酸（凝膠條6號）、與3，末端核替酸相鄰之核：y：酸（凝膠條7號）及3，末端核苷酸上游3個鹼基之核棼酸（凝膠條8號）等處修飾之引子時，得到基本上相同之結果。此等結果顯示，修飾基可附接引子之3，末端四個核棼酸中任一個。實例7 採用經修飾之引子之擴增法-修飾基之影響爲了進一步證實修飾基對引子二聚體形成之影響，及爲了證實其他引子修飾作用，採用經修飾之引子及未修飾之引子進行HCVRNA之擴增法，其中在引子中增加三種不同修飾基之一：苄基、硝芊基及甲基，進行修飾。採用二種不同方法分析擴增結果。其中一組比較實驗中，由反應產物進行凝膠電泳分析法，分析引子二聚體之含量。第二組比較實驗中，於擴增期間採用上述動態PCR 法追踪引子二聚體之形成。 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1' 567188 A7 B7 五、發明説明（39 ) 目標核酸採用HCV RNA轉錄載體，依楊（Young)等人，1993, J. Clin. Microbiol· 31(4): 882-886所述，合成HCV RNA模板。擴增引子採用未修飾及經修飾之引子進行擴增。經修飾之引子係由與未修飾之引子相同之核甞酸序列組成，但3 ’末端腺嘌呤核甞增加一個甲基、芊基或硝芊基進行修飾。依前述實例合成引子。所採用之引子説明如下：引子 Seq Id. No. 3’鹼基之修飾 ST280A 3 未修飾 ST280AMEA1 3 甲基 ST280ABA1 3 苄基 ST280ANBA1 3 硝爷基 S5778AA 4 未修飾 ST778AAMEA 4 甲基 ST778AABA1 4 芊基 ST778AANBA1 4 硝爷基擴增反應經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於含下列試劑之100微升溶液中進行擴增： 0，20 或200 套 HCV RNA模板 50 mM麥黃酮，pH 8.3 ; 110 mM KOAc ； -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 567188 Α7 Β7 五、發明説明（40 ) 3.5 mM Mn(OAc)2 ; 300 #I^dATP，dCTP，dGTP; 50γΜ dTTP ; 500 dUTP ; 250 nM各引子； 20 U rTth* ； 2U UNG* ;及 13%甘油。 *由霍夫曼-拉洛奇公司製造及發展，由康乃狄克州諾瓦克市之柏金艾瑪公司出售。各反應產物混合物之熱循環係於GeneAmp® PCR系統 9600熱循環機（康乃狄克州諾瓦克市柏金艾瑪公司）中，採用下列溫度形態進行。 4 5 〇C 4分鐘； 6 0 °C 2 4 分鐘；於9 0 °C變性3 0秒；於6 0°C接合/延長3 0秒； 6 0 °C 7分鐘； 4〇C 〇預反應培養逆轉錄 4 6次循環：經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 最終延長反應後保持擴增產物之檢測 A .凝膠電泳法依下列方法，由凝膠電泳法檢測其中所含之擴增產物。採用瓊脂糖凝膠（100毫升3% NuSieve，0.5% SeaChem，及 0.5微克 / 毫升乙基溴）及以 IX TBE (0.089 M Tris，0.089 Μ -43 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 567188 kl B7 五、發明説明（41 领月酸，0.0025 M EDTA二鈉）爲移動緩衝液。於1〇〇伏特下進行電泳約1小時。採用U V照射法檢視經乙基溴染色之 DNA色帶。 Β .動態PCR之檢測法上述動態PCR法中，添加一種嵌插染料如：乙基溴至 PCR中，當其嵌入雙股DNA中時，會產生更多之勞光。測定反應期間染料之螢光度’追踪擴增期間雙股DNA之增加量。由於動態PCR法僅測定雙股DNA總量之增加程度，因此未獨立測定非專一性擴增產物之形成。爲了測定引子二聚體在不依賴模板擴增下進行之非專一性擴增作用，未採用核酸模板即進行反應。此等無模板之反應中，所增加之任何雙股DNA均歸因於不依賴模板之非專一性擴增產物之形成。動態PCR反應條件如上述，但改添加乙基溴（濃度1克/毫升）至反應混合物中。依ΕΡ 640 828所述，測定反應混合物之螢光度來追踪反應。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -------.----衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 螢光度測定値經除以反應早期循環期間所得之初螢光度測定値而標準化，而循環之間之螢光度測定値則相當穩定。選用爲初螢光測定値之循環次數編號對所有要比較之反應均相同，因此所有測定値均代表相對於同一個反^循環之增加量。不目標之反應中之反應螢光度保持相當穩定，直到引子一聚體形成爲止。在大多數反應中，若進疒足夠之擴增循環時，引子二聚體最後會達可檢測之程度: 比較達引子二聚體形成時（若可能形成時）之所進行循^次 44 - 567188 A7 B7 五、發明説明（42 ) 數時，即可了解經修飾之引子之影響。結果凝膠電泳分析法之結果示於圖3。凝膠條之編號分別相應於採用未修飾引子及如下表三種不同經修飾引子及2〇〇套、20套或0套HCV RNA進行之擴增結果（自左至右之凝膠條編號：凝膠上半段爲凝膠條1至3 〇號；凝膠下半段爲凝膠條3 1-60號）。此外，分子量標記物出現於凝膠條1及 3 1號（Hae III分解之PhiX 174 RF DNA，馬里蘭州比佛利市新英格蘭生物實驗室（New England Biol abs，Beverly，MA)) 及凝膠條 3 0 與 6 0 號（Superladder-low，20 bp ladder，加州狄馬市金蘇拉公司（Gen Sura，Del Mar，CA))。圖中相應於所需之特定產物之色帶則以箭頭表示（〜230 bp)。凝膠中其他色帶則相應於非專一性擴增產物，特定言之引子二聚體。圖3所示擴增結果之凝膠條編號 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -一口經濟部中央標準局員工消費合作社印製模板引子條帶 200 未修飾 2-5 200 甲基化 6_9 200 苄基化 10-13 200 硝爷基化 14-17 20 未修飾 18-21 20 甲基化 22-25 20 爷基化 26-29 20 硝爷基化 32-35 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） A7 B7 五、發明説明（43 ) 0 未修飾 36-41 0 甲基化 42-47 0 亨基化 48-53 0 硝苄基化 54-59 567188 其結果證實，採用經修飾之引子擴增時，比採用未修飾之引子擴增時，產生更多量擴增之HCV核酸。此外，採用經修飾之引子擴增時，比採用未修飾之引子擴增時，減少了引子二聚體之量。在動態PCR分析法中，反應全程均追踪螢光度。所有反應中，檢測到螢光度提高後之螢光度提高速率均大約相同，此點中螢光度對循環次數作圖（未出示）後得到之曲線形狀可見。此點表示，一經修飾之引子不會顯著抑制初步擴增階段後各擴增步驟之效率。可以檢測到反應進行達螢光度提高之前之循環次數之間之顯著差異。爲了定量反應之間之差異，其結果以擴增循環進行到螢光度超過指定勞光度（AFL)時之次數表示。AFL選擇在接近螢光度底線，但高於所測定螢光度之隨機變動範圍，因此測定擴增之基因組生長期間之反應動態。後期循環中累積之擴增產物會抑制反應，最後則形成反應平頂期。動悲PCR之結果综合説明於下表。2 〇或2〇〇套目標模板擴增結果之各數値代表五次重覆擴增結果之平均値，但採用苄基化引子與20套目標模板進行之擴增結果除外，其代表四次重覆之平均値。不使用模板之擴增結果各數値^表八次重覆之平均値。採用节基化引子而未使用目標模板進行之八次重覆擴增 -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ----— ----—.----— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 A7 B7 五 '發明説明（44 ) 作用中，有二次在46個循環結束時仍未形成引子二聚體，其餘六次擴料用之平均値則代纟在形成引子^聚體之條件下之平均値。該有條件下得到之平均値由於已刪除部份數據，因此不能與其他數値比較。達到AFL時之循環次數引子 0 2 0 200 未修飾 3 5 36 34 甲基 39 3 8 36 硝苄基 43 40 3 7 芊基 (43*) 4 1 3 7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 1 · *2/8未形成引子二聚體該數據顯示，經修飾之引子顯然延緩了目標核酸之擴增，以致需延後數次循環方達到AFL。該延緩現象並不表不專一性擴增產物最終收量會減少。所有目標核酸之擴增作用均在實驗所採用之46次循環内達到平頂期，且由凝膠電泳分析法之相應數據可見，採用經修飾之引子可提高最終收量。該數據顯示，引子二聚體延緩形成之現象達此目標之擴增作用延緩之現象顯著。比較無模板之擴增作用及使用 200套模板之擴增作用時，最清楚地看出引子之優點。採用未修飾之引子時，螢光度提高至AFL時所需之循環次數僅比不使用模板之擴增作用延後一次循環，此表示目標之擴增作用將很難與引子二聚體之形成區分。反之，使用經修飾之引子時，由引子二聚體提高螢光度之現象至少延後 -47- $氏張尺度適用) M規格(21。;7 -- 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 567188 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（45) 循環，而採用苄基化引予時，若可能出現任何引子二聚時，亦至少延後六次循環。因此可檢測到目標擴增作用’並與引子二聚體之形成區分。比較典目標之擴增作用與2 〇套模板之擴增作用時，經修飾之引子依相同模式影響引子二聚體開始形成，比在目標擴增作用中更延後形成。採用未修飾之引子時，無法檢測到2 0套模板。採用硝苄基與苄基引子時，引子二聚體之形成充份延後，因此可在此系統中檢測到2 〇套模板。每次擴增循環追踪得到之螢光度數據（未出示）顯示，引子一聚體延緩形成足以在達到平頂期之4 6次循環内防止引子二聚體形成。因此，經修飾之引子似乎可以充份延緩引子二聚體形成，使目標得以完全擴增，且在引子二聚體形成1*達顯者程度之前停止反應。實例8 對光不安定之引子爲了説明對光不安定之經修飾之引子之用法，採用經修飾之引子與未修飾之引子進行HCV RNA之擴增作用。經修飾之引子係在3 ’末端腺嘌呤之環外胺附接一或二個硝；基而修飾。擴增作用引子依實例4述合成引子。所採用之引子説明如下。 -48 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -------.----— I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 567188 A7 B7 五、發明説明（46 ) 引子 Seq Id. No. 3'鹼基之修飾 ST280A 3 未修飾 15239 3 雙-硝芊基 15241 3 單-硝芊基 ST778AA 4 未修飾 15240 4 雙-硝苄基 15242 4 單-硝苄基擴增反應每對引子均採用一系列稀釋之添加目標濃度進行反應。二組反應各包括所有引子對之組合及添加之目標濃度，且各組反應中，各反應包含特定引子時及目標濃度，並進行二重覆。於含下列試劑之100微升反應中進行擴增： 0，10，102，103，104，或 105 套 HCV RNA 模板 5 5 mM麥黃酮， 90 mM KOAc， 3 mM Mn(OAc)2， 200 //M各dATP，dCTP，dGTP，dTTP， 200 //M dUTP， 250 nM各引子， 10 U rTth*，經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 U UNG*，及 8 %甘油。 *由霍夫曼-拉洛奇公司製造及發展，由康乃狄克州諾瓦克市柏金艾瑪公司出售。各反應混合物之熱循環係於GeneAmp PCR系統9600熱循 -49- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 567188 A7 五、發明説明（ 47 經濟部中央標準局員工消費合作社印製環機（康乃狄克州諾瓦克市柏金艾瑪公司）上度形態進行。 5 0 °C 5分鐘； 6 0°C3 0 分鐘； 9 5 °C 1分鐘；於9 5°C變性15秒，於6 0 C接合/延長2 〇秒；於9 0 °C變性1 5秒，於60°C接合/延長2〇秒； 7 2 °C 1 0 分鐘。反應全程採用磨光之反應試管蓋（康乃狄克州諾瓦克市柏金艾瑪公司）。待反應溫度提高至㈣進行逆轉錄步驟後，在熱循環機内之PCR盤上，取下加熱蓋，並在半數反應試管（重覆反應中之一組）上蓋上鋁箱。另—半則使用手持式U V燈（UVP型號UVM-57，加州聖加布里市uvp產品 (San Gabriel，CA))，以302 nm之光照射丨〇分鐘。再蓋上加熱蓋，繼續進行擴增。 1 口結果依上述，採用凝膠電泳法分析擴增結果。結果示於圖 4。各反應採用之引子及模板套數均示於凝膠上（套數以對數値表示）。凝膠中其他色帶則相應於非專一性擴增產物，特定言之引子二聚體。與UV照射之反應組比較，顯示使用經修可顯著減少引子二聚體，尤其在低套數時：飾…時’ 預反應培養逆轉錄作用初次變性 2次循環： 4 6次檐ί杲：最終延長 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）採用下列溫 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 567188 hi B7 P 111 * - -------------------------- 五、發明説明（48 ) ~ 與未照射之反應組比較時，顯示使用雙硝苄基引予可如所預料地完全抑制擴增作用。採用單硝苄基引子之擴增作用不僅產生產物，而且顯著減少引子二聚體，此點與前述實例仔到之結果一致。實例9 遂用對-第二丁基爷基修飾之引子之擴增作用本實例説明採用經對-第三丁基芊基修飾之引子進行之 HCV RNA之擴增作用。目標核酸採用HCV RNA轉錄載體，依楊等人，1993，j. CUn

Microbiol. 3 1(4): 882-886所述，合成HCV RNA模板。引子依上述實例2所述，採用所合成之經修飾之引子進行擴增。未修飾之引子之核茹酸序列依5，至3，之方向示於下文。所採用之引子爲上游引子ST280A ((SEQ ID NO: 3)與下游引子ST778AA ((SEQ ID NO: 4)之經修飾版本。引子之修飾型式如下：改良HCV擴增引子經濟部中央標準局員工消費合作社印製 I I— II > 1 is n I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ---Seq Id. No,_莲飾核甞酸之位置_ ST280ATBU 3 3’末端 ST778AATBU 4 3’末端擴增法與分析法於含下列試劑之1 〇〇微升反應中進行擴增： -51 - I紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（—— 567188 A7 B7五、發明説明（49 ) 20，5，2.5，2，或〇套HCV模板RNA 50 麥黃酮（pH 8.33)， 110 mM KOAc， 300 eN^dATP，dCTP^dGTP， 50//M dTTP， 50//M dUTP， 50 nM各引子， 3.5 mM Mn(OAc)2， 13 %甘油。 20單位r77/z DNA聚合酶，及 8.0單位 UNG* *由霍夫曼-拉洛奇公司製造與發展，且由康乃狄克州諾瓦克市柏金艾瑪公司出售。於TC480 DNA熱循環機（康乃狄克州諾瓦克市柏金艾瑪公司）上，採用下列溫度形態進行擴增溫度循環：預反應培養 UNG不活化逆轉綠作用 4 7次循環 ---衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4 5 °C 1 2 分鐘； 9 0 °C 3 0 # ； 6 0°C20 分鐘；於9 4 °C變性4 5秒；於60°C接合/延長7〇秒； 60 °C 7分鐘； l〇°C，直到分析爲止（短期）依上述，採用凝膠電泳法分析擴增產物。結果最終延長反應後保持 52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 567188 Μ Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（5〇 ) 於各目標模板數下進行擴增之重覆方式如下：使用20套目標模板進行擴增3次，使用5套目標模板進行擴增3次，使用2.5套目標模板進行擴增2次，使用2套目標模曰板^行擴增1次，在無目標模板下進行擴增2 3次。所有在有模板下之擴增作用均在凝膠上預期目標大小之位置出現單一色帶。沒有任何擴增作用產生引子二聚體或其他非專一性擴增產物。 ' 其結果可與上述實例6之結果比較，其中採用相同之引子序列擴增相同HCV目標。此等結果與實例6之結果比較下顯示，採用對_第三丁基苄基修飾之引子擴增時，比採用未修飾之引子進行相應之擴增時，具有顯著改良之效果。再進行其他實驗，採用上述實例5所述經對-第三丁基芊基修飾之引子擴增HIV-1 RNA。基本上依上述相同方式^ 增。如本文所述之HCV系統中，所有使用HIVq模板之擴增作用均在凝膠上預期目標大小位置出現單一色帶，且沒有任何擴增作用產生引子二聚體或其他非專一性擴增產物0 此等其他貫驗結果可與上述實例5之結果比較，其中均採用相同引子序列擴增同HIV目標。此等結果與上述實例 5 t結果比較後，顯示採用對_第三丁基芊基修飾之引子進行擴增時，比採用非修飾之引子進行相應擴增時，具有顯著改良之效果。 \ 〇 -53- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) ( 21〇X 297^tT 567188 B7 五、發明説明（51 ) 分枝菌DNA之擴增本實例説明採用未修飾及經修飾之引子進行分枝菌DNA 之擴增作用結果之比較。採用在3 ’末端核謀酸增加一個芊基而修飾之引子及在3 ’末端核甞酸增加一個對一第三丁基芊基而修飾之引子。採用未修飾之引子之反應基本上如特維里（Tevere)等人，1996，J. Clin. Microbiol. 34(4): 91 1-923 所述。採用已添加已知濃度之分枝菌DNA之痰樣本模擬臨床上感染之樣本。其他擴增作用則採用純化之分枝菌DNA 進行，並採用不含DNA之陰性對照組樣本。樣本製備取事先於顯微鏡下檢視及培養後證實不含分枝菌之痰樣本依CDC建議之方法，利用N-乙醯基-半胱胺酸-NaOH液化及去除雜質（肯特與庫比卡（Kent and Kubica)，1985，公共衛生分枝菌學III級實驗室指南，亞特蘭大疾病防治中心美國衛生與人類服務邵（Public Health Mycobacteriology-a guide for the level III laboratory, U.S. Department of Health and Human Services，Centers for Disease Control，Atlanta)，已併爲本文之參考文獻）。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 添加液化痰（10 0微升）至5 0 0微升呼吸樣本洗務試劑 (Respiratory Specimen Wash Reagent) (10 mM Tris-HCl? 1 mM EDTA，1% (v/v) Triton X-100, 〇.〇5〇/0 NaN3, pH 8.0)並於 12,500 x g下離心10分鐘。各沉澱塊再懸浮於100微升溶胞試劑（0.05 N NaOH，1% (v/v) Triton X-100，1 mM EDTA， 0·05%NaN3)，於6 0°C下培養4 5分鐘。溶胞液經l00微升中 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 567188 A7 B7五、發明説明（52 ) 和試劑（0·2 M Tris_HCl，8 mM MgCl2, 0.05% NaN3, pH 7.5) 中和。由2批各8 0毫升分開之痰溶胞液組合成痰溶胞液集合物。在8個痰溶胞液集合物（各160微升）中分別添加自培養之結核分枝桿菌中純化之1 5微升DNA母液（2套/微升，含於溶胞試劑與中和試劑之1:1混合物中）。含已知濃度之純分枝菌DNA(無痰）之樣本之製法爲添加 1 0微升DNA母液至100微升溶胞試劑與中和試劑之1:1混合物中。陰性對照組樣本（不含DNA)由100升溶胞試劑與100微升中和試劑之混合物組成。擴增引子採用由下列核铝酸序列組成之引子進行擴增： ml —Lr— —^1 ϋ# am mi· ϋϋ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 引子 KY18(SEQ ID NO: 5) KY436 (SEQ ID NO: 6) KY75 (SEQ ID NO: 7) 序列 5 丨-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3 丨 5，-TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA-，3, 5f-GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA-3f 經濟部中央標準局員工消費合作社印製擴增作用中，採用下列引子時，其3 ’末端鹼基附接指定之修飾基。所有經修飾之引子均依前述實例合成。所有引子均於5 ’末端經生物素基化。 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 567188 A7 Λ7 B7 五、發明説明（S3 ) 引子對引子序列修飾

A KY18 (SEQ ID NO: 5) KY75 (SEQ ID NO: 7) 未修飾未修飾

B KY436 (SEQ ID NO: 6) 苄基 KY75 (SEQ ID NO: 7) 苄基

C KY436 (SEQ ID NO: 6) KY75 (SEQ ID NO: 7) 對-第三丁基芊基對-第三丁基苄基 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 擴增作用各樣本採用未修飾之引子對KY18 (SEQ ID NO: 5)與KY75 (SEQ ID NO: 7)及引子對之修飾型KY436 (SEQ ID NO: 6)與 KY75 (SEQ ID NO: 7)進行擴增。於各含50微升上述三種樣本之一與50微升2X試劑混合物之1 00微升反應中進行擴增，其中含有下列試劑： 100 mM Tris-HCl5 pH 8.9 ； 500 nM各引子； 200 "M(各）dNTP (dATP，dCTP，dGTP，dUTP); 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 20% (v/v)甘油； 1 0 單位 AmpliTaq(* ; 6單位 AmpErase(*。 *由霍夫曼-拉洛奇公司製造與發展，且由柏金艾瑪公司 (康乃狄克州諾瓦克市）出售。 56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 567188 A7 B7 五、發明説明（54 於Gene Amp PCR系統9600熱循環機（康乃狄克州諾瓦克市柏金艾瑪公司）中，採用下列溫度形態進行各反應之熱循環：預反應培養次循環 4 1次循環最終延長 5 0 °C 5分鐘；於9 8 °C變性2 0秒於6 2 °C接合2 0秒於7 2 °C延長4 5秒於9 4 °C變性2 0秒於6 2 °C接合2 0秒於7 2 °C延長4 5秒 7 2 °C約1 2小時（一夜）。乙經濟部中央標準局員工消費合作社印製以增目示解經電泳法’通過2% Nusieve® 0.5%瓊脂糖凝膠後，以基溴染色，檢視擴增之產物。結果電冰分析法結果示於圖5。各樣本採用未修飾之引子（ A表不）及採用經修飾之引子（以，，b，，及”c”表示）進行擴，產物均於相鄰之凝膠條上移動。相當於所需之分枝菌” ‘序列〈色帶以箭頭表示。其他色帶相當於非專—性擴增產勿婕膠中最低的色帶相當於引子二聚體。以” Μ，，標之凝膠條含有分子量標記物（Phixm DNA之―m分物）〇本紙張尺細中國 -57- 567188 Μ -_____ Β7 五、發明説明（55 ) — ' 採用未修飾之引子擴增純化之分枝菌DNA時，會產生引子二聚體。採用經修飾之引子對可提高所需目標之含量，基本上亦減少形成可檢測到之引子二聚體。而採用未修飾之引子擴增純化之DNA之結果則相反，擴增反應中含有痰溶胞液時，會降低效率並增加非專一性擴增產物形成，如其中出現外來產物色帶所示。若痰溶液中含有顯著量人類DNA時，非專一性擴增產物增加之現象並不令人意外，此現象則不出現在純化之分枝菌dna之擴增作用結果中。採用經修飾之引子對於痰之存在下進行擴增之結果不但提鬲所需產物之產量，而且降低非專一性擴增作用。實例1 1 丝之引子之其他厶忐法於末场胞p密淀增加一個苄基而修飾之引子基本上依實例 1合成，但改用如下文所述製備iLCAA-CPG•連接N4_苄基 -5’-0-DMT-2’_去氧腺嘌呤核ty：。步驟1 : N 基-21-去氧胞p密淀核嘗之合成法經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 添加+胺（2 0 t升）至2’-去氧胞喊淀核菩酸鹽酸鹽（5.28 克，20毫莫耳，俄亥俄州克里夫蘭市美國生化公司（us. Bichemical Corp·，Cleveland，OH)中，混合物於氬氣下，於 150°C下加熱3小時。溶液眞空濃縮，產生粘稠黃色油，分佈於水（100毫升）與乙酸乙酯（100毫升）之間。水相以乙酸乙酯（100毫升）洗滌，並分相。水相眞空濃縮，產生黃色槳狀物（1 3克），經矽膠管柱層析，以15:1二氣甲烷：甲醇 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 567188 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明（56 ) 爲溶離液純化，產生所需產物（5.8克，915%)，爲無色漿狀物。步驟2 : N4·乙醯基，N4-芊基-2，-去氧胞嘧啶核荅之合成法取N4-芊基-2’-去氧胞嘧啶核甞（2.5克，7·9毫莫耳）溶於15 毫升無水二甲基甲酿胺（15毫升）中，添加乙酸奸（8克， 7 9亳莫耳，1 〇當量），混合物於室溫下攪拌一夜。眞空蒸發溶劑與過量乙酸酐。產物經矽膠管柱層析，使用2〇:1二氣甲烷：甲醇爲溶離液純化，產生標題化合物（1·3克， 48%)。該化合物爲高吸濕性，並除濕保存在_2〇Ό下。步驟3 : N4-乙醯基，Ν'苄基，5，_〇_DMT_2，_去氧胞嘧啶核^之合成法取N -乙si基，N4- +基·2’_去氧胞, < 核普（76毫克，〇·2 毫莫耳）溶於1毫升無水吡啶中，並添加DMT_C1 (122毫克，0.2毫莫耳，1.0當量）。反應混合物攪拌3小時。經 TLC分析顯示仍留下一些起始物，因此再添加一份DMT_C1 (61毫克，0.5當量），所得混合物再攪拌i小時，此時TLC 分析法顯示反應已完成。以1 5毫升鹽水溶液中止反應，水相以二氣甲烷（3 X 15毫升）萃取。合併之有機相以鹽水（2 X 1 5毫升）洗滌’經無水硫酸鎂脱水。蒸發溶劑，混合物經矽膠層析，使用50:1二氣甲烷：甲醇純化，產生N4_乙醯基，N4-苄基，5’-0-DMT-2，-去氧胞嘧啶核甞（96毫克，收率 65%) 0 步驟4 :琥珀醯化作用取N4-乙醞基，N4-苄基，5，-0-DMT-2，-去氧胞嘧啶核替 -59- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---_-------衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 567188 A7 B7 五、發明説明（57 ) (9 6毫克’ 0 · 13毫莫耳）溶於2毫升無水峨淀中。添加琥珀酸酐（100¾克，1.0亳莫耳）與二甲胺基吡啶（20毫克），所得混合物於室溫下攪拌3天。蒸發溶劑，殘質與甲苯（3 X 10笔升）共蒸發。添加氯仿（5 〇毫升）溶解殘質（採用音波處理法促進溶解）。氣仿層以鹽水（3 X 15毫升）及水（1 X 15毫升）洗;傺。有機層經無水硫酸鍰脱水。蒸發溶劑，產生丨〇 8 笔克純N4-乙醯基，苄基，5，-〇-DMT_2，_去氧胞嘧啶核甘-3’_〇-琥轴酸g旨（收率μ%)。步驟 5 : LCAA_CPG 連接 5，-0-DMT-N4_6 醯基，N4·芊基- 2’-去氧胞π密啶核菩-3，_〇_琥珀酸酯之製法活化之CPG之製法如下。以含三氣乙酸之二氣甲烷 (3% ’ 10 毫升）處理LCAA-CpG (1 〇克，lca〇〇5〇〇c，紐澤西州費爾菲德市CPG公司（CPG Inc.，Fairfield, NJ))，於旋轉洛發备上（旋轉蒸發器，瑞士佛勞威爾市布奇公司（Buchi，

Flawil，Switzerland)(無眞空）旋轉4小時。濾除溶劑，CPG 經9:1二乙胺：乙基二異丙胺（3 X 5毫升）、二氣甲燒（3 X 10¾升）及醚（3 X 10毫升）依序洗滌後，眞空乾燥。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經修飾之核：y：中間物與經酸洗滌之CPG之偶合法係依下列方法進行。添加N4·乙醯基，N4-芊基，5，_0-DMT-2，-去氧胞嘧啶核菩，-3’_0-琥珀酸酯（1〇8毫克，〇·ΐ3毫莫耳）（依上述方法製備）、二甲胺基吡啶（2 〇毫克）與5毫升無水吡啶至1克活化之LCAA-CPG中。反應混合物於旋轉蒸發器上 (典眞2 )旋轉3天。濾出上澄液，偶合之LCAA-CPG依序以p比淀（3 X 5毫升）、二氣甲烷（3 X 1 〇毫升）及醚洗滌後， -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公襲） 567188 ---- B7 五、發明説明（58 ) ^ 眞空乾燥。 LCAA-CPG 連接 N4-乙醯基，N4_芊基，5,_〇_DMi^ 胞嘧啶核甞-3，-0-琥珀酸酯之封端法依下列方法進行= 衍化之CPG中添加封心合試劑a(thf/二甲基p比唆/〜在 8.1.1，維琴尼亞州史特林市葛偷研究公司dna合成與B(1〇%N-甲基咪峻之™溶液，葛倫研究公司），反應) 混合物於旋轉蒸發器上(無眞空)旋轉一夜。溶液過濾，偶合之LCAA-CPG依序以峨唉（3 χ 5毫升）、二氣甲燒（3 χ 1〇毫升）、THF(3 Χ10毫升）及醚ux 1〇毫升）洗滌後，眞空乾燥。何化ILCAA-CPG之偶合容量之測定法係由5毫克產物經 3 %二氣乙酸之二氣甲烷溶液處理，並利用uv光譜測定二甲氧二苯甲基碳鏘離子之釋出量。連接lcaa_cpg之核荅酸衍生物量經測得爲19.5微莫耳/克。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 f準 ί標一家 -國一國中用適度尺一張紙格 |釐公 7 9 2 567188 A7 B7 五、發明説明（59 ) 序列列表 (1) 一般資料： ⑴申請人： (A) 姓名：F·霍夫曼·拉洛奇公司（F. HOFFMANN- LA，ROCHE AG) (B) 地址··葛儉奇街 124號(Grenzacherstrasse 124) (C) 市名：巴塞爾（Basel)

(D) 州名：B S (E) 國名：瑞士 (F) 郵遞區號（ZIP) : CH-4070 (G) 電話：061-688 25 1 1 (H) 電傳：061-688 13 95 (I) 電報：962292/.965542 hlr ch (ii) 發明名稱：經修飾之引子 (iii) 序列數：7個 (iv) 電腦閱讀形式： (A) 中介型：軟碟 (B) 電腦：蘋果（Apple Macintosh) (C) 操作系統：系統7.1 (Macintosh) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (D) 軟體：Word 5.1 (v) 先前申請案資料：申請案號：60-041127 申請曰期：1997年3月20曰 (2) SEQ ID NOM:之資料： -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） 567188 A7 B7 五、發明説明（60 ) (i) 序列特徵： (A) 長度：33個鹼基對 (B) 型態：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線型 (ii) 分子型態：DNA(基因組） (xi)序列説明：SEQ ID NO: 1: CAATGAGACA CCAGGAATTA GATATCAGTA CAA 33 (2) SEQ ID NO: 2之資料： (i)序列特徵： (A) 長度：3 2個鹼基對 (B) 型態：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線型 (Π)分子型態：DNA(基因組） (xi)序列説明：SEQ ID NO: 2: CCCTAAATCA GATCCTACAT ATAAGTCATC CA 32 (2) SEQ ID NO: 3之資料： (i) 序列特徵：經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (A) 長度：26個鹼基對 (B) 型態：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線型 (ii) 分子型態：DNA(基因組） -63- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 567188 A7 B7 五、發明説明（61 ) (xi)序列説明：SEQ ID NO: 3: GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTA 26 (2) SEQ ID NO: 4之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：28個鹼基對 (B) 型態：核酸 (C) 股型··單股 (D) 拓樸學：線型 (ii) 分子型態：DNA(基因組） (xi)序列説明：SEQ ID NO: 4: GCAAGCACCC TATCAGGCAG TACCACAA 28 (2) SEQ ID NO: 5之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：23個鹼基對 (B) 型態：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線型 (ii) 分子型態：DNA(基因組） (xi)序列説明：SEQ ID NO: 5: 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) CACATGCAAG TCGAACGGAA AGG 23 (2) SEQ ID NO: 6之資料： (i)序列特徵： (A) 長度：24個鹼基對 (B) 型態：核酸 -64- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 567188 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（62

(C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線型 (ii)分子型態：DNA(基因組） (xi)序列説明：SEQ ID NO: 6: TAACACATGC AAGTCGAACG GAAA (2) SEQ ID NO: 7之資料： (i) 序列特徵： (A) 長度：24個鹼基對 (B) 型態：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線型 (ii) 分子型態：DNA(基因組） (xi)序列説明：SEQ ID NO: 7: GCCCGTATCG CCCGCACGCT CACA 24 24 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 65 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims

56Tm- 公#8. 中文

13號專利申請案 ^ 也就鼻利範圍替換本(92年9月）C8 A8 B8 修正六、申請專利範圍 1· 一種如下通式之寡核茹酸 R R 5 / 2 5 / 其中Si代表長度5至50個核：y：酸之第一個核甞酸序列；其中S2代表長度介於1至3間之核甞酸之第二個核甞酸序列；其中N代表含有含環外胺之嘌呤或嘧啶鹼基之核甞酸；其中R係利用環外胺共價鍵結於N之基，係選自：节基、對甲基苄基、對-第三丁基苄基、鄰硝基芊基及二-硝基芊基所組成之群。 2. 根據申請專利範圍第丨項之寡核荅酸，其中n為腺嘌呤核荅。 3. —種擴增核酸目標序列之方法，其中該方法包括採用至少一種根據申請專利範圍第1項之寡核甞酸進行擴增反應。 4. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中該方法為聚合酶鏈反應。 5. —種用於進行核酸擴增反應之套組，其中該套組包括根據申請專利範圍第丨項之寡核荅酸。 O:\52\52l 19-920930 DOC 5 - . 本紙張尺度適用中國國家揉準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 567188

第87104213號專利申請案中文圖式修正頁(88年2月）

U=未修飾之引予甲基化引子芊基化引子 NB=硝苄基化引子 567188

圖4

未照射組 U=未修飾 ST778AA/ST280A B=雙-硝苄基 15239/15240 M=單硝芊基 15241/15242 '567188

二μ, 1,一

A B C Μ m

M tb DNA MABCABCABCABCMABCABCABCABCM ___:冊 __册 M=分子量標記物 A=使用KYI 8/KY75擴增 B=使用芊基_KY436/苄基-KY75擴增〇使用對-第三丁基苄基-ΚΥ436/對-第三丁基苄基-ΚΥ75擴增

〇 H i^sf^琥酸吡 Ί \ · 〇

N 、Ph N LCAA-CPG, EDC，吡啶 N6-衍化之dA-CPG DMTO