JP4527789B2 - 増加した標的特異的tmを持つ修飾オリゴヌクレオチドを用いた核酸配列の検出および増幅のための方法 - Google Patents
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Description
核酸ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドを生きている生物体内の遺伝子発現を修飾または阻害するための治療薬として用いることを目的とした方法で利用されてきた。そのような利用の例において、オリゴヌクレオチド”アンチセンス”剤は、ウイルスタンパク質または癌遺伝子のような障害性遺伝子産物をコードしているmRNA種を特異的に標的化することができる。例えば、Zamecnik and Stephenson,75 Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA),280−284(1978);Stephenson and Zamecnik,75 Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA),285−288(1978);およびTyllis,米国特許第5,023,243号を参照されたい。出願人は理論に縛られるのを望んでいるわけではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNA標的への結合により生じるRNA:DNA二重鎖はRNAse(ほとんどの細胞に存在するRNA分解酵素であり、RNA:DNA二重鎖に含まれているRNAに特異的である)の基質になるであろうと考えられている。このモデルに従うと、標的RNA分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより分解される。この一般戦略の変法も存在し、例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド上に酵素活性(いわゆるリボザイムと称されるRNAse活性のような)を与える構造を持っている。例えば、Goodchild、PCT公開第WO93/15194号を参照されたい。
本発明は核酸ハイブリダイゼーション技術を用いる診断法および組成物に関する。出願人は驚いたことに、相補的ヌクレオチド配列を持っている標的核酸への増加した結合親和性を持つ一つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドよりも速い速度で標的核酸へハイブリダイズするであろうことを発見した。本明細書に記載されている発明は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよび所望の核酸の捕捉および固定化のためのオリゴヌクレオチドとしてのそれらの使用を含む方法においての、オリゴヌクレオチド(全体的または部分的にそのように修飾されている)の使用に注意を引かれた。
定義
特に指示しない限り、以下の用語は本明細書を通して指示された意味を持っているであろう。
核酸ハイブリダイゼーションアッセイは検出が考えられている核酸を標的とする(即ち、実質的に相補的なヌクレオチド塩基配列を持っている)一つまたはそれ以上の核酸プローブを利用する。しばしば、プローブは、与えられたヌクレオチド配列を持つように合成的に作製されたオリゴヌクレオチド(約10から約100ヌクレオチドの間の長さを持つ一本鎖核酸)から成っているであろう。”実質的に相補的”とは、オリゴが適当な選択的条件下でその標的に結合し、水素結合した二重鎖を形成することを意味している。
さらに別の態様において、本発明は核酸増幅のために修飾オリゴヌクレオチドプライマー、プロモーター−プライマーおよび/またはスプライス鋳型を用いる方法、およびそのようなオリゴヌクレオチドから成る組成物を含んでおり、ここでオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション速度の増加を起こす少なくとも一つの修飾塩基のクラスターを含んでいる。
本発明により、非修飾類似体と比較して増加した標的特異的ハイブリダイゼーション動力学および結合親和性を持っている修飾オリゴヌクレオチドは種々のハイブリダイゼーションアッセイ試料加工方法論において使用されうるであろう。
相補的な標的に増加された速度でハイブリダイズすることができる修飾型オリゴヌクレオチドを、上記の標的捕獲法を含む核酸ハイブリダイゼーションを使用する試料処理法に使用してもよい。本明細書の観点から、そのような部分的に、または完全に修飾されたオリゴヌクレオチドを、これらの系においてハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは増幅オリゴヌクレオチドとして使用してもよいことは明白である。更に、核酸ハイブリダイゼーションを使用する不均一系アッセイにおいて、標的へのハイブリダイゼーション速度が増加された完全または部分的修飾型オリゴヌクレオチドを固定されたオリゴヌクレオチド、標的捕獲オリゴヌクレオチド、そして/または一個またはそれ以上のカップリングオリゴヌクレオチドとして使用してもよい。例えばそのような修飾を使用して全アッセイ時間を短縮するか、またはアッセイのハイブリダイゼーション段階を単一の温度で行ってもよい。それによって得られる臨床上でのアッセイの時間短縮および操作の簡便さの利点は当業者に明白であろう。
ヘルパーオリゴヌクレオチドはHogan(上記)に記載されている。一般にヘルパーオリゴヌクレオチドは標識されておらず、標識されたハイブリダイゼーションアッセイプローブと共に使用して、二次構造に関係しうる標的ヌクレオチド配列領域を「開裂(opening up)」し、その結果それらの領域が標識されたプローブとハイブリダイゼーションできるようにすることにより、標識されたプローブのTmおよびハイブリダイゼーション速度を増加する。
ここに記載される方法はまた、明らかに、そのような方法に使用するために特別に処方された診断キットを示唆する。これらのキットは、診断用の核酸ハイブリダイゼーションアッセイに使用されるべきオリゴヌクレオチドを一個またはそれ以上含有する。これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも一個は、他の点は同一であるオリゴヌクレオチドより速い速度で標的核酸領域にハイブリダイズするように設計された、少なくとも約4個の修飾型ヌクレオチドのクラスターを含有する。
従って、一個またはそれ以上の修飾型ヌクレオチド、好ましくは約4個またはそれ以上、より好ましくは約8個の修飾型ヌクレオチドのクラスターを有するプローブ分子を利用して、診断用核酸プローブおよびその標的核酸間の結合力およびハイブリダイゼーション速度の両方を向上するための方法を提供することが、本発明の目的である。好ましい態様では、修飾はリボフラノシル環の2’修飾を含有する。最も好ましい態様では、修飾は2’−O−メチル置換を含有する。
しかしながら、ここに開示する本発明の意図から逸脱することなく他の標識を本発明の方法および組成物に使用してもよいことは、本明細書の観点から当業者に明白である。
種々の量の2’−O−メチルヌクレオチドを含有する同一配列のオリゴヌクレオチドプローブを、それぞれ独立して、完全に相補的に合成した同じ長さのRNA標的とハイブリダイズさせた。プローブの配列はSEQ ID NO:1を有し、標的の配列はSEQ ID NO:2を有した。これらのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基配列は以下の通りである:
SEQ ID NO:1 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
SEQ ID NO:2 5'-ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGC-3'
以下に説明するように、2’−O−メチルヌクレオチドを含有しない(プローブA)、全て2’−O−メチルヌクレオチドを含有する(プローブB)、またはデオキシ−および2’−O−メチルヌクレオチドを組み合わせて含有する(プローブC、D、およびE)ように、プローブを合成した。プローブCは、リンカー結合部位のそれぞれの側に直接隣接する4個の連続したデオキシリボヌクレオチドを、そして他の全ての塩基に2’−O−メチルリボヌクレオチドを含有し;プローブDはリンカー結合部位のそれぞれの側に直接隣接する4個の連続した2’−O−メチルヌクレオチドを、そして他の全ての塩基にデオキシリボヌクレオチドを含有し;そして、プローブEはリンカー結合部位のそれぞれの側に直接隣接する8個の連続した2’−O−メチルヌクレオチドを、そして他の全ての塩基にデオキシリボヌクレオチドを含有する。それぞれのハイブリッドのTmは化学発光法および光学法の両方を使用して測定した。
化学発光法を使用して、RNA標的約1pmol、および上記のように“標準的な”アクリジニウムエステル(4−(2−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル)フェニル−10−メチルアクリジニウム9−カルボキシレートフルオロスルフォネート)で標識したそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ0.1pmolを、30μlのコハク酸リチウム緩衝液(1.5mM EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、1.5mM EGTA(エチレングリコール−ビス(β−アミノエチルエーテル)N,N,N’,N’−四酢酸)、310mM ラウリル硫酸リチウム、0.1M コハク酸リチウム(pH5.2))中で60℃、60分間、ハイブリダイズさせた。その後、得られた溶液をコハク酸リチウム緩衝液で500μlに希釈し、その50μlアリコートを種々の温度で7分間インキュベートした。次いでそれぞれの試料を氷上で更に7分間冷却した。190mM Na2B4O7(pH7.6)、7%(v/v)TRITONR X−100(ポリオキシエチレンp−t−オクチルフェノール)、および0.02%(w/v)ゼラチンを含有する溶液150μlを添加し、試料を60℃で10分間加熱して、ハイブリダイズしていないプローブ分子と結合したアクリジニウムエステルを加水分解した。それぞれの試料の残存する(ハイブリッド結合した)化学発光を、LEADERR 50 ルミノメーター(MGM Instruments社、Hamden、コネチカット州)を使用して、0.001M HNO3に溶解した0.1%(v/v)H2O2を含有する溶液を自動注入し、次いで0.5〜2秒後に200μlの1N NaOHを注入して測定した。生じた発光を2秒間隔で積分した。
光学法を使用して、一組の同一のオリゴヌクレオチドプローブをリンカーアームを有するように合成し、アクリジニウムエステルでは標識しなかった。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブ4マイクログラムを、200mM 水酸化
リチウム、3mM EDTA、3mM EGTA、17%(w/v)ラウリル硫酸リチウム、および190mM コハク酸(pH5.2)を含有するハイブリダイゼーション緩衝液30μl中で60℃、60分間加熱し、4μgの相補的なRNA標的とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに次いで、ハイブリダイゼーション緩衝液600μlを添加し、試料を二分し、マイクロTm分析アクセサリー(Micro Tm analysis accessory)を装備したBeckman DU640 分光光度計でそれぞれの試料画分の融解性を測定した。温度は、Tmに比べて10℃より多く低い、または高い温度では毎分1℃、その他の全ての温度では0.2℃間隔で毎分0.5℃ずつ変化させた。減色度(hypochromaticity)の変化をモニターし、温度の関数として記録した。結果を以下の表−1に示す。
3組の異なる長さおよび配列のオリゴヌクレオチドプローブを合成し、それぞれの組は同一の塩基配列のオリゴヌクレオチドを2個含有させた。プローブFの長さは17塩基で、チミン塩基およびアデニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。プローブGの長さは18塩基で、同様に、チミン塩基およびアデニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。プローブHの長さは20塩基で、チミン塩基およびグアニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。
この実施例では、プローブ:DNA標的に対する2’−修飾の効果を検討した。種々の量の2’−O−メチルヌクレオチドを含有するプローブIを同じ長さの完全に相補的なDNA標的にハイブリダイズさせ、生じたハイブリッドの融解性を上記の化学発光法で測定した。プローブIの長さは29塩基で、チミン塩基およびグアニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。
DNA、RNA、および2’−O−メチルヌクレオチド鎖を種々の組合せで含有するハイブリッドの相対的な安定度を比較するために、SEQ ID NO:1(上記の実施例1を参照すること)のアクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドプローブを、完全に相補的な塩基配列を有する合成標的にハイブリダイズさせた。100%リボヌクレオチド(RNA)、100%デオキシリボヌクレオチド(DNA)、または100% 2’−O−メチルヌクレオチドを含有するプローブおよび標的の組合せを表−5に示した。それぞれの試験したハイブリッドの化学発光または光学法のいずれかを使用して測定した融解性を以下の表−5に示す。表中の一より多いデータは独立した重複実験を示す。
実施例4に示すように、2’−O−メチル:RNAハイブリッドは2’−O−メチル:DNAハイブリッドよりかなり安定度が高い。この安定度の相違を診断アッセイに利用して同一配列を有する(しかしDNA中のチミンはRNA中ではウラシルに置き換わっている)DNA分子よりRNA分子を特異的に検出することができることを示すために、以下の実験を実施した。
ハイブリダイゼーション速度に対する2’−修飾型ヌクレオチドの効果を4つの異なる方法を用いて例証した。この実施例で使用したプローブ分子は上記のように標準的なアクリジニウムエステルで標識した。
これらのハイブリダイゼーション速度の比較を他のプローブおよび標的配列に拡大するため、上記の実施例2のプローブHを完全にデオキシまたは2’−O−メチルヌクレオチドのどちらかからなるように合成し、ヘルパープローブの存在下でrRNAにハイブリダイズさせた。実施例6(d)のようにCot分析を実施した。結果を以下の表−10に示す。
上記のように、核酸のハイブリダイゼーション速度は温度の上昇により加速される。しかしながら、特に診断アッセイおよび比較的短いオリゴヌクレオチド(約10〜約50塩基の長さ)を使用する核酸増幅法においては、この加速の利点は二本鎖型に対する温度上昇による不安定化効果によって相殺されうる。以下に示すように、ここに記載するように修飾したオリゴヌクレオチドによって提供される二本鎖の安定度の向上は、この不安定化効果を最小限にし、他に可能なものより高い温度でハイブリダイゼーションを行うことによって、ハイブリダイゼーション速度を更に増加することができる。従って、修飾型オリゴヌクレオチドおよびより高いハイブリダイゼーション温度により、ハイブリダイゼーション速度に対する協同効果が提供される。
また、ハイブリダイゼーション反応速度は、塩濃度の増加によっても加速される。以下の例は、2’−O−メチルヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度への様々な塩、例えばLiCl、の濃度の影響について説明している。完全に2’−O−メチルヌクレオチドからなる配列番号1のアクリジニウムエステル−標識プローブ(上記の実施例1を参照のこと)を、実施例6(d)に上記したように、80゜Cで同じ長さの正確に相補的なRNA標的にハイブリダイズさせ、そしてCot分析を行った。ハイブリダイゼーションは、2種類の異なる濃度のLiClで行われた。以下の表12に示したように、LiClの0.5から1.0Mへの塩濃度の増加は、ハイブリダイゼーション反応速度を2.9倍に強化した。
2’−修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度へのハイブリダイゼーション温度および塩濃度を同時に上昇させた影響を証明するために、以下の反応を行った。アクリジニウムエステル−標識DNAオリゴヌクレオチドおよび100%の2’−O−メチルヌクレオチドを持つアクリジニウムエステル−標識オリゴヌクレオチド(両方共、配列番号1)(上記実施例1を参照のこと)は、それぞれ別々に正確に相補的なRNA標的分子にハイブリダイズさせCot分析を行った。ハイブリダイゼーション条件は実施例6(d)に記載した条件に従った。ハイブリダイゼーション温度および塩濃度は以下の表13に示したとおりである。結果を以下に示す。
標識されたRNA、DNAおよび2’−O−メチル−含有オリゴヌクレオチドと完全に相補的なDNAおよびRNA標識との相対ハイブリダイゼーション速度を、個別的に測定した。速度の測定は、上の実施例6(c)または6(d)のいずれかに開示された方法に従って行った。標識されたオリゴヌクレオチドは配列番号1と同一の塩基配列を持つ(上記の実施例1を参照のこと)。結果を以下の表14に要約している。
Hogan(上記)に開示されたように、核酸、特に有意な量の二次構造を持つ核酸、へのいくつかのプローブのハイブリダイゼーションは、「ヘルパー」プローブと称される、さらなるプローブの使用によって促進される。唯一の例ではないが、高度の二次構造を持つ核酸の例として、リボソームRNA(rRNA)が挙げられる。ヘルパープローブは、標的領域を覆うであろう二次構造の崩壊を助けることができる。通常、ヘルパープローブは、プローブ標的配列の近くに位置するが、好ましくはそれとオーバーラップしない、配列領域を標的とする。実際には、ヘルパープローブは一般的には標識されておらず、通常、モル大過剰で用いられる。標識されたプローブハイブリダイゼーションへのヘルパープローブの使用の影響は、通常、Tm および標識プローブ:標的ハイブリッドのハイブリダイゼーション速度の増加として表される。
実施例12に記載の実験結果は、実施例12で同定された6つのヘルパーオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下のいずれかで、3つの別々の標識プローブを用いてもたらされた。本実施例では、完全にデオキシリボ−または2’−O−メチルヌクレオチドからなる実施例2のプローブFおよびHを、示されたヘルパープローブの存在下または非存在下で、標的rRNAにハイブリダイズさせた。ヘルパープローブには、上記実施例12のa、b、cおよびdを用いた。表17は、プローブAのDNAおよび2’−O−メチルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの特徴を示している。表18は、プローブHのDNAおよび2’−O−メチルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を示している。示された様々なヘルパープローブとヘルパープローブの組合せの存在下または非存在下で、それぞれの標識プローブを、試験した。
実施例13に示したデータは、2’−O−メチルオリゴヌクレオチドが、ヘルパープローブの非存在下で、rRNAのように高度に折り畳まれた構造のRNA標的にさえ、検出可能な範囲でハイブリダイズすることを示している。しかし、ヘルパープローブは、複雑な構造のRNAへの2’−O−メチルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを加速することができる。ヘルパープローブの効果をさらに綿密に試験するために、デオキシ−および2’−O−メチルオリゴヌクレオチドプローブを、ヘルパー細胞の存在下または非存在下、異なる温度で、rRNAにハイブリダイズさせた。表19は、上記実施例2のプローブFのヌクレオチド配列を持つアクリジニウムエステル標識のプローブおよび上記実施例12のヘルパープローブcおよびdを用いて行った研究を示している。表20は、配列番号1のヌクレオチド配列(上記実施例1を参照のこと)を持つアクリジニウムエステル−標識プローブおよびそれぞれ41および32の塩基を持つヘルパープローブgおよびhを用いて行った研究を示している。
診断用プローブ分子の性能特性への修飾オリゴヌクレオチドの影響をさらに証明するために、数多くのさらなる実験を行った。これらの実験は、HPATM検出アッセイを用いて出願人の選択した検出方法を基にした。一つのHPATMフォーマットに従って、化学発光アクリジニウムエステルをプローブに付着させ、プローブをアナライト(analyte) にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしなかったプローブに関連する化学発光を、ホウ酸バッファー中で短時間加水分解することによって選択的に破壊する。プローブ:アナライト分子は、このプロセスで崩壊されないので、ハイブリダイズしたプローブに残された化学ルミネセンスは、存在するアナライトを直接測定する。この適用では、プローブ−アナライトハイブリッド複合体としてよりもハイブリダイズしていない場合により速く加水分解される、そのようなアクリジニウムエステル標識プローブが好ましい。プローブおよびハイブリッドの加水分解は、擬一次反応であり、t1/2 値として特徴付けることができる。このt1/2 値は、プローブまたはハイブリッドのいずれかに付着したアクリジニウムエステルの50%の加水分解に要する時間であり、分で測定される。このように、大きな差別的加水分解(differential hydrolysis) (DH)率(t1/2[ハイブリッド]/t1/2[プローブ])を示すプローブが、非常に好ましい。
アクリジニウムエステルのDH動性を強めるためには修飾ヌクレオチドが標識付着部位の近くに位置しなければならないか否かを試験するために、アクリジニウムエステルリンカー部位と比較して異なる位置に2’−O−メチルヌクレオチドのクラスターを含む、配列番号1のアクリジニウムエステル−標識プローブを、相補的RNA標的とハイブリダイズさせた。2’−O−メチル置換を含むそのようなヌクレオチドを、下線によって以下に示している:
プローブM: 5’−GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−3’
プローブN: 5’−GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−3’
プローブO: 5’−GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−3’
プローブP: 5’−GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACCCAACAT−3’
以下の表22に示したように、アクリジニウムエステルリンカー部位のどちらかの側への4つの隣接する2’−O−メチルヌクレオチドは、アクリジニウムエステル−標識プローブのDH動性を、全体が2’−O−メチルヌクレオチドからなるプローブと同程度に充分に強化することを、測定は示している。表中の一つより多いデータ点は、独立的に行った重複実験を示している。
上記のように、それらのより高い熱安定性故に、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは未修飾のオリゴヌクレオチドより、より高い温度で標的核酸にハイブリダイズすることができる。そのようなより高い温度では、ハイブリダイゼーション速度は、その他の反応の速度と同様に、増加することが期待されるであろう。そのようなその他の反応の中に、アクリジニウムエステル標識の加水分解速度があげられる。出願人らの選択した検出方法は、上記の参照に記載され採用されているハイブリダイゼーション保護アッセイ(HPATM)を用いているため、ハイブリダイゼーション速度の増加によって授けられた診断アッセイへの恩恵が、このより高い温度でのハイブリッド−関連および非関連のアクリジニウムエステル標識のDH率の減少によってオフセットされるか否かを決定するために、以下の実験を行った。
検出可能な化学発光標識として標準アクリジニウムエステルを用いて、前述の実験を行った。標準アクリジニウムエステル以外の標識の差別的加水分解動向が、Tm −強化修飾ヌクレオチドによって強化されるか否かを試験するために、デオキシ−または2’−O−メチルヌクレオチドのいずれかを含む配列番号1のプローブを、標準アクリジニウムエステル、o−diBrアクリジニウムエステル、2−Meアクリジニウムエステル、ナフチル−アクリジニウムエステル、o−Fアクリジニウムエステル、2,7−ジイソプロピルアクリジニウムエステル、または1−および3−Meアクリジニウムエステルの混合物で、同じ様式で同じ位置を正確に標識し(上記実施例1を参照のこと)、そしてそれらのDH動向を試験した。
ハイブリダイゼーション反応速度論とプローブ配列内の2’−O−メチルヌクレオチドの数との間の関係を試験するために、配列番号1(上記実施例1を参照のこと)のアクリジニウムエステル標識プローブを合成した。これらの合成プローブは、AEリンカーの両側に増加した量の2’−O−メチル残基(2’−O−メチル残基の存在を下線で示す)を含んでいる:
プローブQ: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−3’
プローブR: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−3’
プローブS: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−3’
プローブT: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACCCAACAT−3’
プローブU: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−3’
プローブV: 5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−3’
結果を以下の表25に要約している。
プローブ:標的ハイブリッドのTm へのプローブの影響を一定量ずつ増加させる能力は、上記表25に示すように、それが密接に関係した配列と交差反応しないようにプローブの特異性を調整することができる。
核酸ハイブリダイゼーション技術の診断への応用における、本発明の組成物および方法の一般的有用性を説明するために、リボフラノシル部分への2’−修飾以外の修飾を持つオリゴヌクレオチドを構築したが、それは、その標的へのプローブの結合アフィニティーを増加させる原因ともなった。この実施例では、窒素含有塩基を修飾した2つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを合成した。具体的には、N−ジイソブチルアミノメチリデン−5−(1−プロピニル)−2’−デオキシシチジン;(シチジン類似体)および5−(1−プロピニル)−2’−デオキシウリジン)(チミジン類似体)。これらのヌクレオチド類似体は、例として、Glen Research(Sterling,VA)で市販されている。
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度へのプロピン基の影響を試験するために、実施例20のプロピン−標識プローブのRNAへのハイブリダイゼーション速度を、実施例6記載の方法に従って、Cot分析によって、試験した。以下の表27に要約するように、2つのプロピレン基を含むプローブ(プローブW)は、プロピン基を含まないプローブ(プローブX)と同じ速度でハイブリダイズしたが、これに対して、11のプロピン基を含むプローブ(プローブY)は、1.9倍より速くハイブリダイズした。
Claims (11)
- 試料中のRNA被検体の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の:
(a)ハイブリダイゼーションアッセイプローブ中に存在する標的結合領域が、RNA被検体中に存在する標的領域に安定してハイブリダイズするが、該試料中に存在する非被検体核酸にはハイブリダイズしない条件下で試料をハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させて、リボフラノシル部分に対して2’−O−メチル置換を含有するように修飾された少なくとも1つのリボヌクレオチドを含むプローブ:被検体ハイブリッドを形成する工程であって、該標的領域が構造的に折り畳まれている、工程;および
(b)該試料中の該RNA被検体の存在または不在の指標として該ハイブリッドが該試料中に存在するか否かを決定する工程
を含み;
該標的結合領域は、該リボフラノシル部分に対して2’−O−メチル置換を含有するように修飾された4リボヌクレオチドのクラスターを含み;そして
該標的領域に対する該プローブのハイブリダイゼーション速度は、同じ条件下で同一の長さおよび配列を有する未修飾形態の該標的結合領域を含む該プローブのハイブリダイゼーション速度よりも大きい
、方法。 - 前記決定する工程は、前記試料中の特定の群の微生物の存在または不在の指標を提供する、請求項1に記載の方法。
- 前記RNA被検体がrRNAである、請求項2に記載の方法。
- 前記決定する工程が前記試料中のウイルスの存在または不在の指標を提供する、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブの各ヌクレオチドが、リボフラノシル部分に対して2’−O−メチル置換を含有するように修飾されたリボヌクレオチドである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プローブは長さが17〜100塩基の間である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 前記プローブは標識を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的領域は、増幅法の産物に含まれる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増幅法は転写に基づいた増幅法である、請求項8に記載の方法。
- 前記試料に一つまたはそれ以上のヘルパープローブを提供する工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記未修飾形態の前記標的結合領域がデオキシヌクレオチドからなる、請求項1に記載の方法。
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