CZ291525B6 - Modifikované primery - Google Patents

Abstract

Modifikovan oligonukleotidy pro pou it p°i amplifikaci sekvence nukleov²ch kyselin. Amplifikace prov d n za pou it modifikovan²ch oligonukleotid vedou k menÜ mu mno stv nespecifick ho amplifika n ho produktu, zejm na primerov ho dimeru a k pr vodn mu v tÜ mu v²t ku ur en ho amplifika n ho produktu ve srovn n s amplifikacemi prov d n²mi za pou it nemodifikovan²ch oligonukleotid jako primer .\

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká oblasti molekulární biologie a chemie nukleových kyselin. Zejména se týká způsobů a eagencií pro zvýšení výtěžku amplifikačních reakcí nukleových kyselin. Vynález má tudíž využití v kterékoli oblasti, ve které se používá amplifikace nukleových kyselin.

Dosavadní stav techniky

Vynález reakce polymerázového řetězce (PCR) umožnil in vitro amplifikaci sekvencí nukleových kyselin. PCR je popsána v US patentech č. 4 683 195, 4 683 202 a 4 965 188, Saiki a kol., 1985, Science 230:1350 - 1354, Mullis a kol., 1986, Cold Springs Harbor Sympl. Quant. Biol, 51:263273, a Mullis a Faloona, 1987, Methods Enzymoí. 155:335-350.

Vývoj a amplikace PCR jsou popsány rozsáhle v literatuře. Například oblast témat týkajících se PCR je diskutována v PCR Technology-Principles and Applications for DNA Amplifications, 1989 (ed. H. A. Erlich) Stockton Press, New York, PCR protokol: A. Guide to Methods and Applications, 1990, (ed. M.A. Innis a kol.) Academie Press, San Diego, a PCR Strategies, 1995, (ed. M.A. Innis a kol.) Academie Press, San Diego. Obchodníci jako je Perkin Elmer (Norvvalk, CT), prodávají PCR reagencie a publikují PCR protokoly.

Od původní publikace amplifikace nukleových kyselin byly popsány různé metody amplifikace nukleových kyselin na bázi primerů, zahrnující, ale bez omezení, Ligase Chain Reaction (LCR, Wu a Wallacae, 1989, Genomics 4:560-569 a Barany, 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA88:189193), Polymerase Ligase Reacton (Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1:5-16), Gap-LCR (PCT zveřejněná přihláška vynálezu č. WO 90/01 069), Repair Chain Reaction (zveřejněná Evropská přihláška vynálezu EP č. 439 182 A2), 3SR (Kwoh a kol., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci USA 86:1173-1177, Guatelli a kol., 190, Proč. Nati Acad. Sci USA 87:1874-1878, PCT zveřejněná přihláška vynálezu č. WO 92/0 880 A) a NASBA (US patent č. 5 130 238). Přehled amplifikačních systémů je uveden v Abramson a Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47.

Specifičnost amplifikačních reakcí na bázi primerů závisí na specifičnosti hybridizace primerů. Za zvýšených teplot používaných při typické amplifikaci primery hybridizují jen na určené cílové sekvence. Avšak amplifikační reakce směsí se typicky provádějí při teplotě místnosti, dost pod teplotou potřebnou k zajištění specifičnosti hybridizace primerů. Za takovýchto méně přísných podmínek se primery mohou vázat nespecificky na jiné jen zčásti komplementární sekvence nukleových kyselin nebo na jiné primery a iniciují syntézu nežádaných extenzních produktů, které mohou být amplifikovány spolu s cílovou sekvencí. Amplifikace nespecifických extenzních produktů primerů mohou soutěžit s amplifikaci žádaných sekvencí a mohou významně snížit účinnost amplifikace požadované sekvence.

Jeden často zjišťovaný typ nespecifického amplifikačního produktu je matricový nezávislý artefakt amplifikačních reakcí označovaný jako „primemí dimer“. Primemí dimer je dvouřetězcový fragment, jehož délka typicky odpovídá součtu délek dvou primerů a začne se vyskytovat, když jeden primer je protažen přes druhý primer. Výsledná konkatenace tvoří nežádoucí matrici, která vzhledem k své malé délce je účinně amplifikována.

Nespecifická amplifikace může být snížena snížením tvorby extenzních produktů primerů před začátkem reakce. Při jedné metodě označované jako protokol „horký start“, jedna nebo více kritických reagencií se udrží mimo reakční směs dokud se teplota dostatečně nezvýší, aby se zajistila nutná pecofičnost hybridizace. Při tomto způsobu reakční směs nemůže podpořit extenzi primeru během doby, kdy reakční podmínky nezajišťují specifickou hybridizaci primeru.

Ruční metody horkého startu, při kterých se reakční trubice otevírají po počátečním vysokoteplotním inkubačním stupni a přidávají se chybějící reagencie, jsou pracovně náročné a vzrůstá riziko kontaminace reakční směsi. Alternativně může být použit tepelně citlivý materiál jako je vosk k separaci nebo maskovací reakční komponent} jak jsou popsány v US patentu č.

411 876, a Chou a kol., 1992, Nucl. Acic Res. 20 (7:1717-1723). Při těchto metodách vysoká teplota předreakční inkubace taví tepelně citlivý materiál, čímž se umožňuje smísení reagencií.

Další metodou snížení tvorby extenzních produktů primerů před začátkem reakce spočívá v tepelně reverzibilní inhibici DNA polymerázy specifickými protilátkami DNA polymerázy, jak je popsáno v US patentu číslo 5 338 671. Protilátky jsou inkubovány sDNA polymerázou v pufru při teplotě místnosti před sdružením reakční směsi, aby se umožnila tvorba komplexu protilátka-DNA polymeráza. Protilátkové inhibice aktivita DNA polymerázy je inaktivována vysokou teplotou předreakční inkubace. Nevýhoda této metody je v tom, že produkce protilátek specifických k DNA polymeráze je drahá a spotřebovává čas, zejména ve velkých množstvích. Dále přísada protilátek k reakční směsi může vyžadovat předělání amplifikační reakce.

Tvorba extenzních produktů před zahájením reakce může být také inhibována přídavkem jednořetězcového vázacího proteinu do reakce, který se nekovalentně váže k primerům tepelně reverzibilním způsobem a inhibuje extenzi primeru zábranou hybridizace.

Nespecifická amplifikace může být také snížena enzymaticky degradováním extenzních produktů vytvořených před zahájením reakce za použití metod popsaných v US patentu 5 418 149. Degradace nově syntetizovaných extenzích produktů se dosáhne začleněním dUTP a UNG do reakční směsi a inkubací reakční směsi při 45 až 60 °C před prováděním amplifikační reakce. Extenze primeru vede k formaci DNA obsahující uráčil, což se degraduje pomocí UNG za předamplifikačních podmínek.

Nevýhodou této metody je to, že degradace extenzního produktu soutěží s tvorbou extenzního produktu a eliminace nespecifického extenzního primemího produktu vede k pravděpodobnosti, že bude méně kompletní. Výhoda této metody je to, že DNA obsahující uráčil zavedená do reakční směsi jako kontaminace z předchozí reakce se také degraduje a tak tato metoda také snižuje problém kontaminace PCR amplifikovanou nukleovou kyselinou z předcházejících reakcí.

Konvenční technologie molekulární biologie a chemie nukleových kyselin, které se používají v oboru, jsou zcela vysvětleny v literatuře. Viz například Sambrook a kol., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Oligonukcleotide Synthesis (M.J. Gait, ed. 1984), Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames a S. J. Higgins, eds.

1984) a řada methods in Enzymology (Academie Press, lne.).

Předložený vynález zajišťuje kovalentně modifikované oligonukleotidové primery pro amplifikaci sekvencí nukleových kyselin in vitro. Použití modifikovaných primerů tohoto vynálezu vede ke snížení nespecifické amplifikace zejména tvorby příměrového dimeru a/nebo konkomitantnímu vzrůstu v oblasti určeného cíle ve vztahu k amplifikaci prováděné bez nemodifikovaných primerů.

Podstata vynálezu

Vynález se týká oligonukleotidového primeru pro amplifikaci sekvence nukleových kyselin, obecného vzorce

-2CZ 291525 B6

R R

5'-Si-N-3' nebo 5'-S!-NS₂-3' kde Si představuje první sekvenci nukleotidů mezi 5 až 50 nukleotidy v délce,

S₂ představuje druhou sekvenci mezi jedním až 3 nukleotidy v délce,

N představuje nukleotid, takový, který obsahuje purinovou nebo pyrimidinovou bázi, která obsahuje exocyklický amin,

R představuje modifikátorovou skupinu, kde R je kovalentně vázána k N přes exocyklický amin a kde R má strukturu vzorce

Ri-C-R₂

I

H kde Ri a R₂ představují nezávisle vodík, Ci-Ci₀ alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, fenylovou skupinu, fenoxyskupinu, substituovanou fenylovou skupinu, naftylovou skupinu nebo substituovanou naftylovou skupinu. Alkylové skupiny mohou být rozvětvené nebo nerozvětvené.

Ve výhodném provedení N je modifikovaný konvenční nukleotid, v kterémžto případě N je modifikovaný adenosid, cytidin, nebo guanosin a modifíkátorová skupina je kovalentně připojena k exocyklickému aminu adeninové, guaninové nebo cytosinové báze. Ve výhodnějším provedení N je modifikovaný adenosin.

Ve výhodném provedení R je 2-naftylmethylová skupina, benzylová skupina nebo substituovaná benzylová skupina. Výhodné substituované benzylové skupiny mají strukturu vzorce

kde

R₃ představuje C_t-C6 rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, výhodněji C(-C₄ rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, methoxyskupinu nebo nitroskupinu. Výhodně je R₃ připojena v para poloze.

Ve výhodnějším provedení je R benzyl, p-methylbenzyl, p-terc.butylbenzyl, p-methoxybenzyl, nebo 2-naftylmethylová skupina.

Další aspekt tohoto vynález se týká amplifikačních primerů, které jsou modifikovány fotolabilním kovalentním připojením modirikátorové skupiny, která vede k parciální nebo úplné inhibici extenze primerů.

Fotolabilní modifikátor může být vázán buď k exocyklickému aminu jako u modifikovaných nukleotidů popsaných výše, nebo ke kruhovému dusíku. Při jednom provedení alespoň jedna nitrobenzylová skupina je připojena k exocyklickému aminu adeninové, guaninové nebo cytosinové báze terminálu 3' nukleotidu.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je dvojice nebo sestava primerů, kde alespoň jeden z primerů je modifikován jak je výše popsáno. Při výhodném provedení oba členy páru primerů nebo všechny členy sestavy primerů jsou modifikovány.

Další aspekt tohoto vynálezu se týká způsobu amplifikace nukleové kyseliny, který zahrnuje provedení amplifikační reakce za použití mofikovaných primerů tohoto vynálezu.

Další aspekt tohoto vynálezu se týká způsobů pro amplifíkaci cílové nukleové kyseliny, které zahrnují provádění amplifikační reakce za použití fotolabilních modifikovaných primerů tohoto vynálezu, přičemž reakční směs je ozářena zářením dostatečným k odstranění modifikátorové skupiny a umožnění tvorby příměrových extenzních produktů.

Při jednom provedení tohoto vynálezu se ozáření provádí jako oddělený stupeň před začátkem amplifikační reakce, ale potom, co reakční směs byla zahřáta na teplotu vyšší než asi 50 °C. V jiných provedeních je ozařovací stupeň spojen s předběžným stupněm amplifíkačního postupu jako je stupeň reverzní transkripce v amplifikační reakci RNA nebo počáteční denaturační stupeň při amplifikační reakci DNA.

Další aspekt tohoto vynálezu se týká kitů pro amplifíkaci sekvencí nukleových kyselin in vitro, kteréžto kity zahrnují dvojici primerů, ve které alespoň jeden z primerů je modifikován jak je zde popsáno.

Kity tohoto vynálezu také mohou zahrnovat alespoň jednu amplifikační reagencii, například polymerázu nukleové kyseliny nebo ligázu, nukleotidtrifosfatázu a vhodné pufry.

Stručný popis výkresů

Obr. 1 ukazuje výsledky amplifíkaci HIV-1 RNA provedených za použití benzylovaných primerů, jak je popsáno v příkladu 5.

Obr. 2 znázorňuje výsledky amplifíkaci HCV RNA prováděné za použití benzylovaných primerů, jak je popsáno v příkladu 6.

Obr. 3 ukazuje výsledky amplifíkaci HCV RNA prováděných za použití primerů modifikovaných s jednou nebo třemi modifíkátorovými skupinami, jak je popsána v příkladu 7.

Obr. 4 ukazuje výsledky amplifíkaci HCV RNA prováděných za použití fotolabilních modifikovaných primerů, jak je popsáno v příkladu 8.

Obr. 5 ukazuje výsledky amplifíkaci mykobakteriální DNA za použití primerů modifikovaných s benzylovou skupinou a primerů modifikovaných s p-terc.butylbenzylovou skupinou, jak je popsáno v příkladu 10.

Obr. 6 ukazuje obecné reakční schéma vhodné pro syntézu benzylem nebo substituovaným benzylem modifikovaného dA skla s řízenými póry (CPG).

Pro pomoc k porozumění vynálezu je dále definováno několik výrazů.

-4CZ 291525 B6

Výrazy „nukleová kyselina“ a „oligonukleotid“ se vztahují k polydeoxyribonukleotidům (obsahujícím 2-deoxy-D-ribózu), k polyribonukleotidům (obsahujícím D-ribózu), a kjakémukoli jinému typu polynukleotidu, který je N-glykosid purinové nebo pyrimidinové báze nebo modifikované purinové nebo pyrimidinové báze. Není žádný rozdíl v délce mezi výrazy „nukleová kyselina“ a „oligonukleotid“ a tyto výrazy budou používány zaměnitelně. Tyto výrazy se vztahují jen k primární struktuře molekuly. Tak tyto výrazy zahrnují dvouřetězcovou a jednořetězcovou DNA stejně jako dvouřetězcovou a jednořetězcovou RNA.

Výraz „konvenční“, v odkazu na báze nukleových kyselin, nukleosidy nebo nukleotidy se týká těch, které se vyskytují přirozeně v polynukleotidu, který je popisován. Čtyři konvenční (také vyzývané jako hlavní) deoxyribonukleotidy DNA obsahují purinové báze adenin aguanin a pyrimidinové báze cytosin a thymin. Čtyři konvenční ribonukleotidy RNA obsahují purinové báze adenin a guanin a pyrimidinové báze urasil a cytosin. Navíc k výše uvedeným konvenčním nebo běžným bázím existují jiné purinové a pyrimidinové deriváty nazývané vzácné nebo vedlejší báze, které se vyskytují v malých množstvích v některých nukleových kyselinách.

Použitý výraz „nekonvenční“ s odkazem na bází nukleových kyselin, nukleosidy, nebo nukleotidy se týká vzácných neboli vedlejších bází nukleových kyselin, nukleosidů nebo nukleotidů a modifikací, derivací nebo analogů konvenčních bází nukleosidů nebo nukleotidů a zahrnuje syntetické nukleotidy mající části modifikované báze a/nebo části modifikovaného cukru (viz Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology, Vol. 26, (Sudhir Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, NJ, (1994)), a Oligonukcleotide a Analogues, A Practical Approach (Fritz Eckstein, Ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford).

Oligonukleotidy mohou být připraveny jakoukoli vhodnou metodou včetně například klonování a restrikce vhodných sekvencí a přímé chemické syntézy metodou jako je fosfotriesterová metoda, Narang a kol., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99, fosfodiesterová metoda, Brown a kol., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151, diethylfosforamiditová metoda, Beaucage a kol., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, a metoda tuhého nosiče z US patentu č. 4 458 066. Přehled syntézních metod je proveden v Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187, na což se tímto odkazuje.

Výraz „párování bází“, také označovaný v dosavadním stavu techniky jako „Watson-Crickovo párování bází“, se týká dobře známé vodíkové vazby komplementárních párů bází adeninthymin a guanin-cytosin v dvouřetězcové DNA struktuře, adenin-uracil a guanin-cytosin a RNA/DNA hybridní molekula a analogické vazby nekonvenčních nukleotidových párů.

Výraz „hybridizace“ se týká tvorby dvojité struktury dvěma jednořetězcovými nukleovými kyselinami vlivem komplementárního párování bází. Hybridizace se může uskutečnit mezi zcela komplementárními řetězci nukleových kyselin nebo mezi „v podstatě komplementárními“ řetězci nukleových kyselin, které obsahují menší oblasti chybného párování. Podmínky, za kterých jen plně komplementární řetězce nukleových kyselin budou hybridizovat, jsou označovány jako „přímé hybridizační podmínky“ nebo „sekvenční specifické hybridizační podmínky“.

Stabilní duplexy nebo v podstatě komplementární sekvence mohou být dosaženy za méně přísných hybridizačních podmínek. Stupeň chybného párování, které je tolerováno, může být řízen vhodným nastavením hybridizačních podmínek. Odborníci v oboru technologie nukleových kyselin mohou určit empiricky stabilitu duplexu uvážením počtu prováděných včetně například délky a koncentrace párů báze oligonukleotidů, iontové síly a výskytu chybných párů báze, podle návodu uvedeného v dosavadním stavu techniky (viz například Sambroock a kol., 1989, Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York a Wetmur, 1991, Critical Review in Biochem. And Mol. Biol. 26(3/4): 227-259).

Výraz „primer“ se týká oligonukleotidu schopného působit jako bod iniciace DNA syntézy za podmínek, při kterých syntéza příměrového extenzního produktu komplementárního k řetězci

-5CZ 291525 B6 nukleové kyseliny se vyvolá, to je jak v přítomnosti čtyř rozdílných nukleosidových trifosfátů, tak prostředku pro extenzi (například DNA polymerázy nebo reverzní transkriptázy) ve vhodném pufru a při vhodné teplotě. Jak je zde použit, výraz „primer’· je určen k zahrnutí oligonukleotidů použitých v ligací zprostředkovaných amplifikačních procesech, ve kterých je jeden oligonukleotid „extendován“ ligací na druhý oligonukleotid, který hybridizuje v přilehlé poloze. Tak výraz „extenze primerů“ jak je zde použit, se týká jak polymerizace individuálních nukleosidtrifosfátů užívajících primer jako bod iniciace DNA syntézy, tak ligace dvou primerů k vytvoření extendovaného produktu.

Primer je výhodně jednořetězcová DNA. Vhodná délka primerů závisí na uvažovaném použití primerů, ale typicky je v rozmezí od 6 do 50 nukleotidů. Krátké příměrové molekuly obvykle vyžadují nižší teploty pro vytvoření dostatečně stabilních hybridních komplexů s matricí. Primer nereflektuje přesnou sekvenci matriční nukleové kyseliny, ale musí být dostatečně komplementární k hybridizací s matricí. Návrh vhodných primerů pro amplifikaci dané cílové sekvence je dobře znám v dosavadním stavu techniky a popsán v zde citované literatuře.

Primery mohou začleňovat další rysy, které berou v úvahu detekci nebo imobilizaci primerů, ale nemění základní vlastnost primem, totiž působení jako bod iniciace DNA syntézy. Například primery mohou obsahovat další sekvenci nukleové kyseliny na 5'konci, která nehybridizuje na cílovou nukleovou kyselinu, ale která usnadňuje klonování amplifikovaného produktu. Oblast primerů, která je dostatečně komplementární k matrici pro hybridizací, se zde označuje jako hybridizační oblast.

Výrazy „cíl“, „cílová sekvence“, „cílová oblast“, a „cílová nukleová kyselina“ se týkají oblasti nebo subsekvence nukleové kyseliny, která má být amplifikována.

Jak je zde použito, primer je „specifický“ pro cílovou sekvenci, když počet chybných párů, přítomných mezi sekvencí primem a cílovou sekvencí je menší než počet chybných párů přítomných mezi sekvencí primem a necílovými sekvencemi, které mohou být přítomny ve vzorku. Hybridizační podmínky mohou být voleny takové, že se vytvoří jen stabilní duplexy, když počet chybných párů přítomných není větší než počet chybných párů přítomných mezi sekvencí primerů a cílovou sekvencí. Za takovýchto podmínek může primer vytvořit stabilní duplex jedině s cílovou sekvencí. Tak použití cílově specifických primerů za vhodných přísných amplifikačních podmínek umožňuje specifickou amplifikaci těch cílových sekvencí, které obsahují cílová vazební místa primem. Použití sekvenčně specifických amplifikačních podmínek umožňuje specifickou amplifikaci těch cílových sekvencí, které obsahují přesně komplementární primerová vazební místa.

Výraz „nespecifická amplifíkace“ se týká amplifíkace sekvencí nukleových kyselin jiných než je cílová sekvence, která vzniká z primerů hybridizujících na sekvence jiné, než je cílová sekvence a pak slouží jako substrát pro extenzi primem. Hybridizace primem na necílovou sekvenci je označována jako „nespecifická hybridizace“ a může se vyskytnout během nižší teploty, snížené přísnosti preamplifíkačních podmínek.

Výraz „příměrový dimer“ se týká na matrici nezávislého nespecifického amplifíkačního produktu, který je výsledkem příměrových extenzí, kde další primer slouží jako matrice. Ačkoli příměrový dimer se často ukazuje konkatamerem dvou primem, to je dimerem, vyskytují se také konkatamery více než dvou primerů. Výraz „příměrový dimer“ je zde použit genericky, aby zahrnoval na matrici nezávislý nespecifický amplifikační produkt.

Výraz „reakční směs“ se týká roztoku obsahujícího reagenty nutné k provedení uvedené reakce. „Amplifikační reakční směs“, která se týká roztoku obsahujícího reagenty nutné k provádění amplifikační reakce, typicky obsahuje oligonukleotidové primery s DNA polymerázu nebo ligázu ve vhodném pufru. „PCR reakční směs“ typicky obsahuje oligonukleotidové primery, termostabilní DNA polymerázy, dNTP, a kation dvojmocného kovu ve vhodném pufru. Reakční směs

-6CZ 291525 B6 je zde označována jako kompletní, když obsahuje všechny reagenty nutné k umožnění reakce a nekompletní, když obsahuje jen neúplnou sestavu nutných reagentů.

Odborníci v oboru vědí, že reakční složky se rutinně skladují jako oddělené roztoky, každý obsahující podsestavu celkových složek, z důvodů výhodnosti, stability, skladování nebo pro umožnění pro aplikaci závislého nastavení koncentrací složek a že složky jsou sdruženy před reakcí, aby se vytvořila kompletní reakční směs. Dále odborníci v oboru vědí, že reakční komponenty se balí odděleně pro obchod a že výhodné komerční kity mohou obsahovat jakoukoli podsestavu reakčních komponentů, která zahrnuje modifikované primery tohoto vynálezu.

Modifikované primery

Amplifikační primery tohoto vynálezu jsou modifikovány kovalentním připojením skupiny k jednomu ze čtyř nukleotidů v 3'terminálním konci příměru.

Při jednom provedení modifikovaný primer tohoto vynálezu sestává ze sekvence nukleové kyseliny o obecné struktuře

R R

I I

5'-S,-N-3' nebo 5'- S_t-N-S₂ - 3', kde představuje první sekvenci nukleotidů mezi 5 až 50 nukleotidy v délce,

5₂ představuje druhou sekvenci mezi 1 až 3 nukleotidy v délce,

N představuje nukleotid takový, který obsahuje purinovou nebo pyrimidinovou bázi, která obsahuje exocyklický amin,

R představuje modifikátorovou skupinu, kde R je kovalentně vázán k N přes exocyklický amin a kde R má dále popsanou strukturu.

Jak je ukázáno v příkladech provedení, účinek modifikace je maximalizován, když je modifikace na 3'terminálním nukleotidu. Tak výhodně primer obsahuje modifikovaný 3'terminální nukleotid.

Modifikovaný nukleotid je vybrán z těch, jejichž báze obsahuje exocyklický amin, který je zahrnut při párování bází nukleotidu s jeho komplementárním nukleotidem.

Typicky primery jsou DNA obsahující jen konvenční nukleotidy. Ze čtyř konvenčních nukleotidových bází zajištěných v DNA adenin, guanin a cytosin obsahují exocyklický primární amin, který je zahrnut při párování bází s komplementární bází.

Ve výhodném aspektu tohoto vynálezu je primer modifikován připojením jedné modifíkátorové skupiny k exocyklickému aminu substitucí za jeden ze dvou vodíků aminové skupiny, které v nemodifikované bázi jsou schopny být zahrnuty při párování bází. Struktury modifikovaných nukleotidů obsahujících modifikovanou adeninovou, guaninovou a cytosinovou bází jsou znázorněny níže, kde

S představuje cukernou část a

R představuje modifikátorovou skupinu.

Předložený vynález není omezen na primery sestávající z konvenčních nukleotidů. Jakými nukleotidový analog, ve kterém část báze obsahuje exocyklický primární amin, který je začleněn při párování bází s komplementární bází, je modifikovaný jak je zde popsáno. Příklady nekonvenčních nukleotidů zahrnují 3-methyladenin, 7-methylguanin, 3-methylguanin, 5-methylcytosin a 5-hydroxymethylcytosin.

Modifikátorová skupina omezuje schopnost modifikované báze participovat při vodíkové vazbě, poněvadž modifikátor substituuje za jeden atom vodíku. Zbývající vodíkový atom může ještě participovat při vodíkové vazbě. Modifikátory mohou tudíž ovlivnit jak kinetiku, tak hydrodynamiku hybridizace. Různé modifikátorové skupiny jsou předvídány, které mají následující vlastnosti.

1. Interferují s, ale nezabraňují, Watson-Crickovu párování bází modifikované báze s komplementární bází.

2. Interferují s, ale nezabraňují, extenzi modifikovaného primeru a

3. umožňují syntézu řetězce komplementárního kextenznímu produktu modifikovaného primeru.

Modifikátorová skupina stericky zasahuje do párování bází a tak do extenze primeru. Takto fyzikální objem modifíkátoru ovlivňuje stupeň interference s hybridizaci. Když je modifikovaný adenosinový nebo cytidinový nukleotid začleněn do dvouřetězcové nukleové kyseliny, modifikátorová skupina se zasune do centrálního prostoru hlavní rýhy. Tudíž dokonce sterickou poruchu duplexní struktury. Avšak vhodné modifikátory nejsou tak veliké, že vodíková vazba je znemožněna nebo enzymatická extenze 3'-hydroxylu primeru je znemožněna. Když je modifikovaný guanosinový nukleotid začleněn do dvouřetězcové nukleové kyseliny, modifikovaná skupina se zasune do vedlejší rýhy, která vytváří méně prostoru k akomodaci objemu modifikátorové skupiny. Tudíž menší modifikátorové skupiny mají přednost pro připojení ke guaninové bázi.

Primerové extenzní produkty, které se užívají jako matrice v následujících amplifikačních cyklech, obsahují modifikovanou bází zavedenou primerem. Modifikátorová skupina je volena tak, že přítomnost modifikované báze v matrici vyvolá terminaci extenze primeru nebo inhibici extenze primeru. Výhodně povaha modifikátorové skupiny by neměla působit růst mutagenních událostí, čímž by se ztratila identita modifikované báze při replikaci od primeru odvozené matrice. Účinky modifikované báze v matrici na extenzi primeru mohou být rutinně testovány podle návodu zde uvedeného a známého v dosavadním stavu techniky (viz např. Gniazdowski a Cera, 1996, Chem. Rem. 96:619-634).

-8CZ 291525 B6

Modifikované skupiny R, které splňují výše uvedené vlastnosti jsou vhodné pro použití při metodách tohoto vynálezu. Výhodné modifikátorové skupiny mají strukturu

I

R_t -C-R₂

I

H kde R, a R₂ představují nezávisle vodík, Cj-Cio alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, fenylovou skupinu, fenoxyskupinu, substituovanou fenylovou skupinu, naftylovou skupinu nebo substituovanou naftylovou skupinu.

Alkylová skupina může být rozvětvená nebo lineární. Větší alkylové skupiny až alespoň k C₂₀ mohou být také použity.

Při výhodném provedení R je 2-naftylmethylová skupina, benzylová skupina nebo substituovaná benzylová skupina. Výhodné substituované benzylové skupiny mají strukturu

kde R₃ představuje C_t-C6 rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, výhodněji C1-C4 rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, methoxyskupinu nebo nitroskupinu. C1-C4 rozvětvená nebo lineární alkylová skupina jsou methyl, ethyl, propyl, butyl, izopropyl, izobutyl, terc.butyl a podobně. Methyl a terc.butyl jsou výhodnými alkylovými skupinami. Výhodně je R₃ připojen v para poloze.

Zvlášť výhodné modifikátorové skupiny R jsou znázorněny dále:

benzyl p-methylbenzyl

p-methoxybenzyl o-nitrobenzyl

2-naftylmethyl

Početné vhodné modifikátorové skupiny jsou popsány v příkladech provedení. Obecně empirická selekce příslušné vhodné modifikátorové skupiny ze třídy popsaných sloučenin může být provedena rutinně odborníky v oboru podle zde uvedeného návodu. Výhodně vhodnost příslušné

-9CZ 291525 B6 skupiny je určena empiricky za použití modifikovaných primerů při amplifikační reakci. Úspěšná amplifikace indukuje jak to, že modifikovaná báze neinhibuje zcela extenzi primerů, tak i to, že přítomnost modifikované báze v odvozeném příměrovém templátu nevyvolá terminaci extenze primerů. Redukce příměrového dimeru je určena jak je popsáno v příkladech provedení.

Primery s fotolabilní modifikací

V alternativním provedení vynálezu jsou primery modifikovány jednou nebo více fotolabilními skupinami, které mohou být odstraněny vystavením zářením potom, kdy reakce dosáhla vysokoteplotních reakčních podmínek, které zajišťují specifičnost. Poněvadž modifikátor je odstraněn před extenzí primerů, modifikovaný primer nemusí být extendovatelný před odstraněním skupiny. Příklady fotolabilních modifikátorů, které mohou být použity při metodách tohoto vynálezu jsou popsány v Pillai, 190, „Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis“ Synthesis: 1—26.

Výhodně jsou fotolabilní primery tohoto vynálezu modifikovány na 3' terminálu nukleotidu připojením jedné nebo dvou o-nitrobenzylových skupin:

no₂

U primerů modifikovaných připojením jedné nitrobenzylové skupiny k exocyklickému primárnímu aminu části báze, výsledný sekundární amin stále ještě může participovat při párování bází, jestliže je aminová skupina otočena tak, že zbývající vodík je orientován směrem ke komplementární bázi. Jak je popsáno v příkladech, tyto primery mohou být použity při amplifikací jak s nebo bez odstranění ozářením UV světlem.

Primery modifikované připojením dvou nitrobenzylových skupin k exocyklickému aminu báze nemohou být extendovány. Inhibice pravděpodobně vyplývá z nemožnosti modifikované báze podstoupit párování bází, které je vyloučeno, poněvadž oba vodíky exocyklického aminu jsou nahraženy objemnými nitrobenzylovými skupinami. Použití primerů modifikovaných dvěma nitrobenzylovými skupinami při amplifikací, ve které reakční směs byla vystavena UV záření po dobu dostatečnou k odstranění nitrobenzylových skupin, čímž se umožní uskutečnění extenze primerů, je popsáno v příkladech provedení.

Při alternativním provedení se modifikátorová skupina připojí ke kruhovému dusíku. Primery modifikované připojením nitrobenzylové skupiny ke kruhovému dusíku báze nemohou být extendovány vlivem nemožnosti modifikované báze podstoupit párování bází. Odstranění nitrobenzylových skupin vystavením UV záření umožňuje uskutečnění extenze primerů.

Použití fotolabilních primerů, které nemohou být extendovány, dokud se neodstraní modifikátorová skupina, v podstatě zajišťuje během nespecifických předreakčních podmínek. Reakční směs je ozářena a primery deblokovány jen po zvýšení reakční teploty na teplotu, která zajišťuje specifičnost reakce.

Syntéza modifikovaných primerů

Syntéza modifikovaných primerů se provádí za použití standardních chemických prostředků dobře známých v dosavadním stavu techniky. Metody zavádění těchto modifikátorů mohou být rozděleny do čtyř skupin.

-10CZ 291525 B6

1. Modifikátor může být zaveden použitím modifikovaného nukleosidu jako DNA syntézního nosiče.

2. Modifikátor může být zaveden použitím nukleosidu jako je fosforamidit.

3. Modifikátor může být zaveden použitím reagentu během DNA syntézy (například benzylaminové zpracování konvertibilního amiditu, když je začleněn do DNA sekvence).

4. Postsyntetická modifikace. Modifikátor může být zaveden jako reaktivní reagent, když je ve styku se syntetickou DNA.

Syntéza příslušných modifikovaných primerů je popsána v příkladech provedení. Další modifikované primery mohou být syntetizovány za použití standardních syntézních metod analogickým způsobem.

Výhodně jsou modifikované primery syntetizovány za použití syntézního nosiče, derivatizovaného skla s řízenými póry (CPG). Obecné reakční schéma pro syntézu derivatizovaného dA CPG je znázorněno na obr. 6. Příslušné modifikátorové skupiny mohou být přidány použitím příslušného alkylhalogenidového, benzylhalogenidového, substituovaného benzylhalogenidového, methylnaftylhalogenidového nebo substituovaného methylnaftylhalogenidového alkylačního prostředku. Syntézy benzyl a p-terc.butylbenzyl-dA CPG se popisují v příkladech 1 až 2 sledujících schéma znázorněné na obr. 6.

Alkylace exocyklické aminoskupiny může být provedena použití metod analogických k methylaci popsaného vGriffin a jsou popsány vAritoma a kol., 1995, J. Chem. Soc. Perchim Trans. 1:1837-1849.

Amplifikace užívající modifikované primery

Způsoby tohoto vynálezu zahrnují provádění amplifikace na bázi primerů užívající modifikované primery podle tohoto vynálezu. Obecně modifikované primery mohou být nahraženy za nemodifikované primery obsahující tytéž nukleotidové sekvence při amplifikaci na bázi primerů bez změny reakčních podmínek amplifikace. Ovšem odborník v oboru rozpozná, že rutinní malá reoptimizace reakčních podmínek může být při některých reakcích výhodná.

Při výhodném provedení se modifikované primery podle tohoto vynálezu používají při reakcí polymerázového řetězce (CPR). Avšak vynález není omezen na nějaký vhodný amplifikační systém. Modifikované primery podle tohoto vynálezu mohou být použity v jakémkoli amplifikačním systému na bázi primerů, ve kterém může být vytvořen příměrový dimer nebo nespecifický amplifikační produkt. Příklady zahrnují amplifikační metody popsané v odkazech výše uvedených Jako jsou vyvinuty jiné systémy, tyto systémy se mohou vylepšit prováděním tohoto vynálezu.

Metody podle tohoto vynálezu jsou vhodné pro amplifikaci buď DNA nebo RNA. Například amplifikace RNA užívající reverzní transkripci/reakce polymerázového řetězce (RT-PCR) je dobře známa v dosavadním stavu techniky a popsána v US patentech číslo 5 322 770 a 5 310 652, Myers a Gelfant, 1991, Biochemistry 30 (31 ):7661-7666, Young a kol., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4): 882-886, a Mulder a kol. 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2):292-300.

Při amplifikaci na bázi primeru se provádí extenze primeru typicky při zvýšené teplotě za použití termostabilního enzymu jako je termostabilní DNA polymeráza. Enzym iniciuje syntézu na 3' konci primeru a probíhá ve směru k 5' konci matrice, dokud syntéza nekončí. Čištěné termostabilní DNA polymerázy užitečné při amplifikačních reakcích jsou dobře známy ve stavu techniky, ale nejsou tím omezeny, enzymy popsané v US patentu č. 4 889 818, US patentu č. 5 079 352, US patentu č. 5 352 600, US patentu č. 5 491 086, WO 91/09 950, WO 92/03 556,

-11CZ 291525,B6

WO 92/06 200, WO 92/06 202, WO 92/09 689, a v US patentu číslo 5 210 036. Přehled termostabilních DNA polymeráz je uveden v Abromson, 1995, v PCR Strategies, (ED. M. A. Innis a kol.), str. 39-57, Academie Press, San Diego.

Při výhodném provedení, zejména pro amplifikaci DNA se amplifikace provádí za použití revezibilně inaktivovaného enzymu, jak je popsáno. Použití reverzibilně inaktivovaného enzymu, který je reaktivován za vysokoteplotních reakčních podmínek, dále redukuje nespecifickou amplifikaci inhibici extenze primeru před začátku reakce. Reverzibilní inaktivovaná termostabilní DNA polymeráza vyvinutá a vyráběná Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ) a prodávaná Perkin Elmer (Norwalk, CT), je popsána v Birch a kol., 1996, Nátuře, 381 (6581): 445-446.

Účinek modifíkátorové skupiny na schopnost enzymu extendovat primer je závislý zčásti na příslušném enzymu a zčásti na vybraných reakčních podmínkách, na příklad Tth DNA polymeráza je permisivnější, když Mn²⁺ se použije jako dvojmocný kation jako při některých RNA amplifikacích, spíše než Mg²⁺. Odborník v oboru ví, že při rutinní selekci vhodné modifíkátorové skupiny budou brány v úvahu enzym a reakční podmínky.

Příkladné přípravné metody vhodné pro amplifikační reakce jsou dobře známy v dosavadním stavu techniky a plně popsány ve zde citované literatuře. Vhodná použití metoda není kritickou částí tohoto vynálezu. Odborník v oboru může optimalizovat reakční podmínky pro použití známých příkladných přípravných metod.

Metody analyzování amplifíkované nukleové kyseliny jsou dobře známy ve stavu techniky a plně jsou popsány ve zde citované literatuře. Příslušná použitá metoda není kritickou částí tohoto vynálezu. Odborník v oboru může vybrat vhodnou analýzní metodu v závislosti na aplikaci.

Výhodná metoda pro analýzu amplifikační reakce je monitorování růstu celkového množství dvouřetězcové DNA v reakční směsi, jak je popsáno v Higuchi a kol., 1992, Bio/Technologicy 10:413-417, Higuchi a kol. 1993, Bio/Technology 11:1026-1030, Evropské patentové publikace č. 512 334 a 640 828. Při této metodě, označované zde jako „kinetická PCR“ detekce dvouřetězcové DNA spočívá na zvýšené fluorescenci, kterou ethidiumbromid (EtBr) a jiné DNA vazební značkovače vykazují když jsou vázány k dvouřetězcové DNA. Amplifikace se provádí v přítomnosti značkovače. Vzrůst dvouřetězcové DNA, vyplývající ze syntézy cílových sekvencí, vede k zaznamenatelnému růstu fluorescence, který je monitorován během amplifikace. Tak tyto metody umožňují monitorování postupu amplifikační reakce.

V kinetické PCR, měřená fluorescence závidí na celkovém množství přítomné douřetězcové DNA, ať vyplývající z nespecifické amplifikace nebo z amplifikace cílové sekvence. Monitorování fluorescence umožňuje měření vzrůstu celkového množství dvouřetězcové DNA, ale vzrůst vyplývající z amplifikace cílové sekvence není měřen nezávisle od vzrůstu vyplývajícího z nespecifického amplifikačního produktu.

Modifikované primery tohoto vynálezu jsou zvlášť užitečné při kinetické PCR, poněvadž nejen snižují množství vytvořeného příměrového dimeru, ale také brzdí tvorbu zjistitelných množství příměrového dimeru. Zpoždění tvorby příměrového dimeru až po významném vzrůstu cílové sekvence umožňuje nezávislé monitorování amplifikace cílových sekvencí a minimalizuje interferenci od příměrového dimeru.

Kity

Předložený vynález se také týká kitů (sestav), multikontejnerových jednotek zahrnujících užitečné komponenty pro provádění předloženého způsobu. Užitečné kity obsahují primery, z nichž alespoň jeden je modifikován, jak je zde popsáno, pro amplifikaci nukleové kyseliny.

-12CZ 291525.B6

Jiné volitelné komponenty kitu zahrnují například prostředek pro katalýzu syntézy extenzního produktu primeru, substrátové nukleosidové trifosfáty, vhodné reakční pufry a instrukce pro provádění tohoto způsobu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza příměrů modifikovaných benzylovou skupinou

Primery modifikované adicí benzylové skupiny byly syntetizovány jedním z dvou postupů, které jsou dále popsány. Primery modifikované na 3'terminálu báze, byly syntetizovány za použití N⁶-benzyldeoxyadenosin skla s řízenými póiy (CPG) k iniciaci syntézy DNA. Primery modifikované v interní bázi byly syntetizovány za použití N⁶-benzyldeoxyadenosinfosforamiditu.

V tomto příkladu jsou používány následující standardní zkratky:

DMAP 4-dimethylaminopyridin

DMF N,N-dimethylformamid

TEA triethylamin

EDC l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidhydrochlorid

THF tetrahydrofuran

DMT 4,4'-dimethoxytrityl

LCAA-CPG sklo s póry s řízenými alkylamino dlouhým řetězcem

I. Syntéza N⁶-benzyldeoxyadenosin CPG

Stupeň 1: Syntéza N⁶-benzoyl, N⁶-benzyl, 5'-O-DMT-2'-deoxyadenosinu

Do N⁶-benzoyl-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyacenosinu (657 mg, 1,0 mmol, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), byl přidán pyridin (10 ml) a směs byla vysušena odpařením za vakua.

To bylo opakováno. Výsledná pěna byla rozpuštěna v bezvodém DMF (15 ml, Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI) a ochlazena na 5 °C. Hydrid sodný (44 mg, 1,1 mmol, 1,1 ekv., 60%ní disperze voleji) byl přidán pod argonovou atmosférou a míchán při teplotě místnosti po dobu 45 minut. Benzylbromid (143 mikrolitrů, 206 mg, 1,2 mmol, 1,2 ekv., Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) byl přidán během 2 minut a směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Směs byla vysušena odpařením za vakua a zbytek byl rozdělen mezi ethylacetát a vodu (každého 10 ml) a extrahován. Vodná fáze byla reextrahována ethylacetátem (10 ml) a sloučené extraktory byly vysušeny nad bezvodým síranem hořečnatým, zfiltrovány a odpařeny.

Surový produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (75 g) za použití methanolu, triethylaminu, methylenchloridu (3:0,5:96,5). Frakce obsahující produkt byly sloučeny a vysušeny odpařením, čímž se získal očekávaný N⁶-benzoyl-N⁶-benzyl-5'-O-DMT-2'deoxyadenosin (410 mg, 54 %). Struktura produktu byla potvrzena NMR.

Stupeň 2: Sukcinylace

Do N⁶-benzoyl-N⁶-benzyl-5'-O-DMT-2'-deoxyadenosinu (295 mg, 0,39 mmol) byl přidán pyridin (10 ml) a směs byla vysušena odpařením za vysokého vakua. Tento stupeň byl opakován. Byl přidán čerstvý bezvodý pyridin (10 ml) spolu sanhydridem kyseliny jantarové (200 ml,

-13CZ 291525 B6 mmol, 5,0 ekv.) a DMAP (24 mg) a roztok byl míchán pod argonovou atmosférou přes noc při teplotě místnosti. Objem rozpouštědla byl odstraněn za vakua a zbytek byl rozdělen mezi methylenchlorid (20 ml) a roztok citranu sodného (20 ml, 0,1 M, pH 5,0) a extrahován.

Vodná fáze byla extrahována dalším methylenchloridem (20 ml) a sloučené extrakty byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným, zfiltrovány a vysušeny odpařením. Produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (4,5 g) za použití ethylacetátu, triethylaminu, methylenchloridu (32:1:67), čímž se získal 3'-sukcinátester N⁶-benzoyl-N⁶-benzyl-3'-O-sukcinát-5'-ODMT-2'-deoxyadenosin (247 mg, 74 %).

Stupeň 3: Derivatizace CPG

Kyselinou promyté CPG bylo připraveno následně: LCAA-CPG (1,0 g, LCA 00500C, 50 nm, 88,6 mol/g, CPG lne., Failfield, NJ) bylo promyto dichloroctovou kyselinou v dichlormethanu (2%ní, 20 ml) periodickým vířením po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Kyselinou promyté CPG bylo zfiltrováno na skleněné fritě a promyto dichlormethanem až bylo bez kyseliny. Prášek byl vysušen na vzduchu, pak vysušen za vakua při teplotě místnosti přes noc.

Vazba modifikovaného nukleosidintermediátu ke kyselinou promytému CPG byla provedena následovně. Do roztoku N⁶-benzoyl-N⁶-benzyl-3'-0-sukcinát-5'-0-DMT-2'-deoxyadenosinu (170 mg, 0,2 mmol) připraveného jak je výše popsáno, v dichlormethanu (10 ml) byl přidán TWA (100 mikrolitrů) a roztok byl koncentrován na asi 5 ml pod atmosférou argonu. Postupně byly přidány DMAP (12 mg, 0,1 mmol, 0,5 ekv.), TEA (100 mikrolitů), ECC (384 g, 2,0 mmol, 10 ekv.) a kyselinou promyté CPG. Byl přidán bezvodý pyridin (5 ml) a směs byla uzavřena a třepána 3 dny při teplotě místnosti. CPG bylo odfiltrováno za vakua a promyto důkladně izopropanolem, pak dichlormethanem, vysušeno vzduchem, pak za vakua po dobu 1 hodiny.

Úprava čepičkou derivatizovaného CPG byla provedena následovně. Do suchého derivatizovaného CPG byly přidány roztoky Cap A a Cap B (každý 5 ml, acetanhydrid/2,6-lutidin/THF a 10%ní N-methylimidazol v THF, Glen Research DNA synthesis reagens, Sterling, VA) a směs byla třepána po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. CPG bylo zfiltrováno za vaku a promyto důkladně izopropanolem, pak dichlormethanem, vysušeno vzduchem a pak vysušeno za vakua přes noc.

II. Syntéza N⁶-benzyldeoxyadenosinfosforamiditu

N⁶-benzoyl-N⁶-benzyl-5'-O-DMT-2'-deoxyadenosin byl syntetizován jak je výše popsáno. Do N⁶-benzoyl-N⁶-benzyl-5'-O-DMT-2'-deoxyadenosinu (196 mg, 0,26 mmol) v suchém THF (8 ml) byl přidán diizopropylethylamin (350 mikrol., 270 mg, 2,04 mmol, 7,8 ekv.) a 2kyanethyl-N,N-diizopropylchlorfosforamidit (161 mg, 0,68 mmol, 2,6 ekv., Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI), a směs byla míchána po dobu 30 minut při teplotě místnosti pod argonovou atmosférou. Rozpouštědlo bylo odstraněno za vaku a zbytek byl rozdělen mezi roztok hydrogenuhličitanu sodného (5%ní, 20 ml) á ethylacetát (20 ml). Organická fáze byla promyta roztokem hydrogenuhličitanu, vodou a nasycenou solankou (každý 20 ml) popořadě, vysušena nad síranem sodným, zfiltrována a odpařena. Zbytek byl vyčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (4 g) za použití směsi aceton/hexan/TEA (34:65:0,7), čímž se získal požadovaný fosforamidit (248 mg, 100 %).

III. Syntéza DNA, čištění a analýza

Benzylem derivatizovaný adenosin CPG (25 mg, 1,0 mol) byl převeden do prázdných syntézních kolon (Glen Research Sterling WA) a ty byly použity k přípravě oligonukleotidů na ABI 374 DNA syntetizéru (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) za použití konvenčních syntézních a deprotekčních podmínek. Surová DNC-DNA byla vyčištěna a

-14CZ 291525 B6 převedena na 5'-hydroxy-DNA standardním DMT on/off HPLC za použití Rainin Pure - DNA kolony na Rainin HPLC systému (Rainin Instrument CO., Wobum, MA). Oligonukleotidy byla analyzovány za použití ABI kapilárního elektroforézního systému (Perkin Elmer, Applied

Biosystems Division, Foster City, CA) nebo denaturační aniontoměnné HPLC chromatografie na

Dionex Nukleopac koloně (Dionex Corp., Sunivale, CA).

Podobně byla provedena syntéza interně modifikovaných primerů za použití nemodifikovaného CPG a modifikovaného fosforamiditu, jak je výše uvedeno.

Příklad 2

Syntéza primerů modifikovaných terc.butylbenzylskupinou

Předložený příklad popisuje syntézu primerů modifikovaných na 3'terminálu adenosinu pterc.butylbenzyovou skupinou. Modifikované primery byly syntetizovány v podstatě jak je popsáno v příkladu 1, ale za použití N⁶-(p-terc.butylbenzyl)deoxyadenosin CPG. Syntézy derivatizovaného CPG je popsána dále.

Stupeň 1: Syntéza N⁶-benzoyl-N⁶-(p-terc.butylbenzyl)-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosinu

Do N⁶-benzoyl-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosinu (658 mg, 1,0 mmol) byl přidán DMF (bezvodý, 10 ml) a odpařeno do sucha. To bylo opakováno. Čerstvý DMF (10 ml) byl přidán pod argonovou atmosférou. Byl přidán hydrid sodný (44 mg, 60%ní v oleji, 1,1 mmol) a směs byla míchána po dobu 0,5 hodiny při teplotě místnosti. Po kapkách byl přidán 4-(tercbutyl)benzylbromid (272 mg, 1,2 mmol) a mícháno při teplotě místnosti přes noc. Rozpouštědlo bylo odstraněno za vakua a zbytek byl rozdělen mezi ethylacetát a vodu (20 ml každého). Organická fáze byla promyta vodou (třikrát, 20 ml), vysušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a odpařena do sucha. Surový produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (100 g), za použití směsi methylenchlorid:methanol:triethylamin 96,5:3:0,5, čímž se získal N⁶-benzoyl-N⁶-(p-terc.butylbenzyl)-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosin (229 mg, 28,5 %).

Stupeň 2: Sukcinylace

N⁶-benzoyl-N⁶-(p-terc.butylbenzyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityI)-2'-deoxyadenosin (217 mg, 0,27 mmol) byl zpracován s anhydridem kyseliny jantarové (135 mg, 5 ekv.) a DMAP (17 mg, 0,5 ekv.) v pyridinu (10 ml). Zpracování a chromatografie jak je popsáno v příkladu 1 daly N⁶benzoyl-N⁶-(p-terc.butylbenzyl)-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosin, 3'-O-sukcinát (199 mg, 82 %).

Stupeň 3: Derivatizace CPG

Sukcinát (180 mg, 0,2 mmol) ze stupně 2 byl zpracován s kyselinou promytým LCAA-CPG jak je popsáno v příkladu 1. CPG byl upraveno čepičkou a vakuově vysušeno, čímž se získal N⁶-benzoyl-N⁶-(p-terc.butylbenzyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl}-2'-deoxyadenosin, 3'-O-sukcinát derivatizovaný CPG, (1,065 g).

-15CZ 291525.B6

Příklad 3

Syntéza primeru modifikovaných methylovou skupinou

Primery modifikované v 3'terminálu adenosinu methylovou skupinou byly syntetizovány za použití N⁶-methyl dA CPG (22 mg, 1 mikron., Glen Research, Sterling, WA). N⁶-methyl dA CPG byl umístěn v prázdné syntézní koloně a primery byly připraveny podle standardních podmínek syntézy a deprotekce. Primery byly vyčištěny za použití DMT on/off HPLC postupu jak je popsáno v příkladu 1.

Příklad 4

Syntéza fotolabilních modifikovaných primerů

Předložený vynález popisuje syntézu primerů modifikovaných na 3'terminálu adenosinu buď jednou nebo dvěma nitrobenzylovými skupinami. Modifikované primery byly syntetizovány v podstatě jak je popsáno v příkladu 1, ale za použití buď mononitrobenzyl dA CPG nebo bisnitrobenzyl dA CPG.

I. Mononitrobenzylované primery

Obecná metoda pro syntézu N⁶-benzoyl-N⁶-benzyl-2'-deoxyadenosinem derivatizovaného CPG (viz příklad 1) byla aplikována na syntézu N⁶-benzoyl-N⁶-ortho-nitrobenzyl-2'-deoxyadenosinem derivatizovaného CPG substitucí ortho-nitrobenzylbromidu jako alkylačního prostředku. Následné stupně pro CPG byly identické jako ty, které jsou popsány v příkladu 1 s přídavkem, za meziprodukty byly chráněny od okolního světla zabalením reakčních baněk do hliníkové fólie.

Podle syntézy derivatizovaného CPG byly primery syntetizovány jak je popsáno v příkladu 1, ale byly izolovány extrakcí na nerozpustném nosiči za použití Nensorb Prep prodávaných kolon (NEN Research Products Biotechnology Systems, Du Pont Company, Boston, NA) za použití protokolů opsaných výrobcem.

II. Bisnitrobenzylované primery

Bisnitrobenzyldeoxyadenosin CPG bylo syntetizováno jak je dále popsáno. Podle syntézy derivatizovaného CPG byly primery syntetizovány a čištěny, jak je popsáno pro mononitrobenzylové primery.

Stupeň 1: Syntéza 5'-O-DMT-N⁶-bis-ortho-nitrobenzyl-2'-deoxyadenosinu

2-Deoxyadenosinmonohydrát (538 mg, 2,0 mmol, Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) byl vysušen s bezvodým pyridinem (2x10 ml) za vakua. Zbytek byl rozpuštěn v bezvodém DMF (10 ml, Aldrich, Milwaukee, WI) pod argonovou atmosférou a byl přidán hydrid sodný (88 mg, 2,2 mmol, 1,1 ekv., 60%ní disperze voleji) a mícháno po 40 minut při teplotě místnosti. Byl přidán 2-nitrobenzylbromid (710 mg, 3,3 mmol, 1,5 ekv.) a roztok byl míchán po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. DMF byl odstraněn odpařením za vakua a zbytek byl rozdělen mezi ethylacetát a vodu (20 ml každého). Vodná fáze byla extrahována ethylacetátem (20 ml) a sloučené extraktory byly promyty vodou (20 ml) a vysušeny nad síranem sodným, zfiltrovány a odpařeny. Surový produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (50 g, za použití 3%ního MeOH v CH2CI2), čímž se získal 2'-deoxy-N⁶-bis-ortho-nitrobenzyladenosin (320 mg, 30 %).

-16CZ 291525.B6

Do 2'-deoxy-N⁶-bis-ortho-nitrobenzyladenosinu (200 mg, 0,518 mmol) byl přidán bezvodý pyridin (10 ml) a odpařeno do sucha. Pyridin (10 ml) byl přidán, načež následoval přídavek 4,4'dimethoxytritylchloridu (900 mg, 2,3 mmol, 4,5 ekv.) a triethylaminu (280 mg, 2,76 mmol, 4,0 ekv.) a směs míchána při teplotě místnosti pod argonovou atmosférou po dobu 5 hodin. Byla přidána voda (0,5 ml) a mícháno po dobu 20 minut. Směs byla rozdělena mezi ether a vodu (20 ml každého) a vodná fáze byla reextrahována etherem (20 ml). Extrakty byly sloučeny a promyty vodou (20 ml) a vysušeny nad bezvodým síranem sodným, zfiltrovány a odpařeny. Materiál byl vyčištěn chromatografií na silikagelu (4 g, za použití 0,7 až 2,0 5%ního methanolu v methylenchloridu), čímž se získal 5'-0-DMT-N⁶-bis-ortho-nitrobenzyl-2'-deoxyadenosin, (121 mg, 33 %).

Stupeň 2: Suke inyláce

5'-0-DMT-N⁶-bis-ortho-nitrobenzyl-2'-deoxyadenosin (121 mg, 0,145 mmol) byl vysušen odpařením s bezvodým pyridinem (2 x, 3 ml). Pyridin (3 ml), anhydrid kyseliny jantarové (58 mg, 0,58 mmol, 4 ekv.) a DMAP (11 mg, katalytický) byly přidány a roztok byl míchán při teplotě místnosti po dobu 3 dnů.

Roztok byl odpařen za vakua a zbytek byl rozdělen mezi methylenchlorid (10 ml) a sodnocitrátový pufr (0,1 M, pH 5,0, 10 ml). Organická fáze byla vysušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a odpařena do sucha. Surový produkt byl vyčištěn chromatografií na silikagelu (2 g, za použití EtOAc:CH₂Cl₂:TEA, 32:67:1 10 ml, pak MeOH:CH₂Cl₂, 3:97, 25 ml), čímž se získala bleděžlutá pěna 5-O-DMT-N⁶-bis-ortho-nitrobenzyl-2-deoxyadenosin-3'-Osukcinátu (138 mg, 99,5 %).

Stupeň 3: Derivatizace DPG

Kyselinou promyté LCAA-CPG bylo připraveno jak v příkladu 1.

Spojení modifikovaného nukleosidového meziproduktu s kyselinou promytým CPG bylo provedeno následovně. 5'-0-DMT-N⁶-bis-ortho-nitrobenzyl-2'-adenosin-3'-0-sukcinát (37 mg, 0,04 mmol) byl zpracován sTEA (16(1) v jantarově zbarvené skleněné ampuli a odpařen. K tomuto zbytku byl přidán bezvodý pyridin (1,5 ml), TEA (2 mikrol.), DMAP (2,4 mg), EDC (76 mg, 0,04 mmol) a kyselinou promyté LCAA-CPG (200 mg) a směs byla třepána na oběhovém mixéru po dobu 3 dnů při teplotě místnosti. CPG bylo zfiltrováno za sníženého tlaku a promyto důkladně izopropanolem, pak methylenchloridem, vysušeno na vzduchu, pak vysušeno za vakua po dobu 1 hodiny.

Opatření čepičkou derivatizovaného CPG bylo provedeno jak je popsáno v příkladu 1.

Příklad 5

Amplifíkace za použití efektu modifikovaných primerů pomocí modifikovaného nukleotidu

K demonstraci účinku modifikovaných primerů na tvorbu příměrového dimeru byla provedena srovnání amplifikací HIV-1 RNA za použití jak modifikovaných primerů tak nemodifikovaných primerů. Navíc k určení účinku pomocí modifikovaného nukleotidu na snížení příměrového dimeru byly provedeny amplifíkace užívající 3 různé protisměrně modifikované primery, které se lišily jen v lokaci modifikované báze.

Cílová nukleová kyselina

HIV-1 RNA matrice byly syntetizovány za použití HIV-1 RNA transkripčního vektoru v podstatě jak je popsáno v Mulder a kol., 1994, J. Clin. Microbiol. 32(2):292:300.

-17CZ 291525 B6

Primery

Amplifikace byly provedeny za použití jak nemodifikovaných tak modifikovaných primerů. Nukleotidové sekvence nemodifikovaných primerů jsou uvedeny níže, orientovány v 5'-3'směru. Protisměrný primer RAR1032MB (sekv. id. č.:l) a podměmý primer RAR1033MB (sekv. id. č.:2) amplifikují produkt 175 párových bází odpovídajících nukleotidovým polohám 29563130 sekvence HIV-1 referenčního řetězce HXB2 (GenBank uložení č. K.03455).

H1V-1 amplifikační primer primer sekv. id. č.

sekvence

RAR 1032MB RAR1033MB

CAATGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAA

CCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA

Výše uvedené určení primerů se týká nemodifikovaných primerů. Nemodifikované primery byly biotinylovány na 5' konci.

Modifikované primery byly syntetizovány jak je popsáno v příkladu 1, čímž sestávaly ze stejných nukleotidových sekvencí jako nemodifikované primery, ale obsahovaly benzylovaný adenosin buď v terminální poloze 3' nebo v poloze jednoho nebo tří nukleotidů protisměrně od 3' konce. Modifikované formy primerů jsou zde určeny následovně:

Modifikované HIV-1 amplifikační primery primer

RAR1032MBA1

RAR1033MNA2

RAR1032MBA4

RAR1033MBA1 sekv. id. č. poloha modifikovaného nukleotidu

3' zakončení

1 od 3'zakončení

3 do 3'zakončení

3' zakončení

Amplifikace

Amplifikace byly provedeny ve 100 mikrolitrových reakcích obsahujících následující reagenty:

100 kopií HIV matrice RNA, mm tricinu (pH 8,33),

110 mm KOAc,

300 mikroM každého dATP, dCTP, a dGTP, mikroM dTTP,

500 mikroM dUTP, mikroM každého primerů,

3,5 mm Mn (OAc)₂,

13%ní glycerol.

jednotek ZO5 DNA polymerázy*) a

2,0 jednotky UNG**)

*) Popsáno v US patentu č. 5 455 170 **) Vyráběno a vyvíjeno Hoffmann-La Roche a prodáváno Perkin Elmer, Norwalk, CT

Amplifikační teplotní cyklování bylo prováděno vTC480 DNA tepelného cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu.

-18CZ 291525 ,B6

Předreakční inkubace	45 °C po dobu 4 minut
Reverzní transkripce 46 cyklů:	60 °C po dobu 20 minut denaturace při 94 °C po dobu 45 sekund chlazení/extenze při 60 °C po dobu 45 sekund
Finální extenze Postreakční udržování	60 °C po dobu 7 minut, 10 °C až do analýzy (po krátkou dobu).

Detekce amplifikovaného produktu

Přítomnost amplifikovaného produktu byla zjišťována gelovou elektroforézou následně. Reakční produkt byl francionován za použití agarózového gelu (100 ml 3%ního NuSieve a 0,5%ního Sea Chem) a IX TBE (0,089 M Tris, 0,089 M kyseliny borité, 0,0025 M disodné EDTA) průběžný pufr, byly použity. Byl přidán ethidiumbromid (0,5 mikrogramů/ml) k zabarvení jakékoli přítomné DNA. Elektroforéza byla prováděna při 100 V po dobu asi 1 hodiny. Ethidiumbromidem zabarvené pásy DNA byly vizualizovány za použití UV záření.

Výsledky

Výsledky gelové elektroforézní analýzy jsou znázorněn na obr. 1. Čísla pruhů odpovídající každé z amplifikací za využití kombinací nemodifikovaných a modifikovaných primerů jsou znázorněny v následující tabulce. Pásy odpovídající žádanému HIV produktu jsou označeny na obr. šipkou. Ostatní pásy v gelu odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu, zejména příměrovému dimeru.

Primery	Pruh číslo
Protisměrný	posměmý
RAR1032MB	RAR1033MB	1
RAR1032MBA1	RAR1033MB	2
RAR1032MBA2	RAR1033MB	3
RAR1032MBA4	RAR1033MB	4
RAR1032MB	RAR1033MBA1	5
RAR1032MBA1	RAR1033MBA1	6
RAR1032MBA2	RAR1033MBA1	7
RAR1032MBA4	RAR1033MBA1	8

Poněvadž tvorba příměrového dimeru soutěží s tvorbou určeného amplifikačního produktu, snížení příměrového dimeru má typicky za následek průvodní vzrůst v množství vytvořeného žádaného produktu. Tak účinek modifikovaných primerů je vidět z porovnání množství vytvořeného příměrového dimeru ve vztahu k množství vytvořeného za použití nemodifikovaných primerů a ze srovnání množství určeného cílového produktu ve vztahu k množství vytvořeného za použití nemodifikovaných primerů.

Srovnání výsledků za použití dvou nemodifikovaných primerů (pruh 1) s výsledky za použití jednoho 3'-modifikovaného primeru (pruhy 2 a 5) a s výsledky za použití dvou 3'-modifikovaných primerů (pruh 6) indikuje, že snížení příměrového dimeru bylo získáno za použití jednoho nebo dvou modifikovaných primerů. Při amplifikacích užívajících jeden 3'modifikovaný primer je vidět malý rozdíl ve snížení příměrového dimeru, který závisí na tom, který to byl modifikovaný primer. Použití dvou modifikovaných primerů (6) mělo za následek jak největší snížení příměrového dimeru tak zaznamenatelný růst množství amplifikované cílové sekvence.

Účinek polohy modifikovaného nukleotidu je zřejmý v porovnání pruhů 6 až 8. Snížení příměrového dimeru získaného použitím primeru modifikovaného v nukleotidu přilehlém k 3'terminálu nukleotidu (pruh 7) bylo ekvivalentní snížení získaného použitím primeru modifikovaného

-19CZ 291525 B6 v 3'terminálu nukleotidu (pruh 6), zatímco zlepšení získaného použití primeru modifikovaného v nukleotidu při báze proti směru od 3'terminálu nukleotidu (pruh 8) bylo poněkud menší.

Příklad 6

Další amplifikace užívající modifikované primery

Účinek polohy modifikovaného nukleotidu

Pro další demonstraci účinku modifikovaných primerů na tvorbu příměrového dimerů byla provedena srovnání amplifíkaci HCV RNA užívajících jak modifikované primery tak nemodifikované primery v podstatě jak bylo výše popsáno. Amplifikace byly prováděny za použití tří různě modifikovaných posměmých primerů, které se lišily jen v lokaci modifikované báze.

Cílová nukleová kyselina

HCV RNA matrice byly syntetizovány za použití HCV RNA transkripčního vektoru, jak je popsáno v Young a kol., 1993, J. Clin. Microbio. 31 (4):882-886.

Primery

Amplifikace byly prováděny za použití jak nemodifikovaných tak modifikovaných primerů. Nukleotidové sekvence nemodifikovaných primerů jsou uvedeny níže, orientovány v 5' až 3' směru. Protisměrný primer ST280A (sekv. id. č.: 3) a posměmý primer ST778AA (sekv. id. č.: 4) amplifikují produkt s 240 páry bází z 5'netranslatované oblasti HCV genomu.

HCV amplifikační primery

Primer sekv. id. č. nukleotidová sekvence

ST280H ST778AA

GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA

GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA

Výše uvedená primerová určení se vztahují k nemodifikovaným primerům. Modifikované primery byly syntetizovány jak je popsáno v příkladu 1, kteréžto sestávají ze stejných nukleotidových sekvencí jako nemodifikované primery, ale obsahují benzylovaný adenosin na buď 3'terminální polohy nebo v poloze 1 nebo 3 nukleotidy proti směru 3' zakončení. Modifikované formy primerů jsou označeny následovně:

Modifikované HCV amplifikační primery

Primer

ST280ABA1

ST778AABA1

ST778AABA2

ST778AABA4 sekv.id.č. poloha modifikovaného nukleotidu

3'zakončení

3'zakončení

1 od 3' zakončení

3 do 3'zakončení

Amplifikace a analýza

Amplifikace byly prováděny v podstatě jak je popsáno v příkladu 3, ale za použití 100 kopií HCV RNA matrice. Gelová analýza amplifíkovaného produktu byla prováděna jak je popsáno v příkladu 3.

-20CZ 291525.B6

Výsledky

Výsledky gelové elektroforézní analýzy jsou uvedeny na obr. 2. Čísla pruhů odpovídající každé z amplifikaci užívající kombinace nemodifikovaných a modifikovaných primerů jsou znázorněna v tabulce dále uvedené. Pásy odpovídající určenému HCV produktu jsou značeny na obr. šipkou. Ostatní pásy v gelu odpovídající nespecifickému amplifikačním produktu a zejména příměrovému dimeru.

Primery	pruh číslo
protisměrný	posměmý
ST280A	ST778AA	1
ST280A	ST778AABA1	2
ST280A	ST778AABA2	3
ST280ABA	ST778AABA4	4
ST280ABA1	ST778AA	5
ST280ABA1	ST778AABA1	6
ST280ABA1	ST778AABA2	7
ST280ABA1	ST778AABA4	8

Poněvadž tvorba příměrového dimeru soutěží s tvorbou určeného amplifikačního produktu, snížení příměrového dimeru vede k typickému průvodnímu vzrůstu množství vytvořeného určeného produktu. Tak účinek modifikovaných primerů může být zřejmý jak ze srovnání množství vytvořeného příměrového dimeru ve vztahu k množství vytvořenému za použití nemodifikovaných primerů, tak ve srovnání množství vytvořeného určeného cílového produktu ve vztahu k množství vytvořenému za použití nemodifikovaných primerů.

Získané výsledky byly podobné výsledkům získaných z HIV amplifikaci popsaných v předcházejícím příkladu, ale při HCV amplifikacích byl vzrůst určeného produktu zjevnější než při HIV amplifikacích. Srovnání výsledků za použití dvou nemodifikovaných primerů (pruh 1) s výsledky za použití jednoho 3'-modifikovaného primerů (pruhy 2 a 5) a s výsledky používajícími dva 3'modifikované primery (pruh 6) indikuje, že snížení příměrového dimeru bylo získáno použitím buď jednoho nebo dvou modifikovaných primerů. Použití dvou modifikovaných primerů (pruh 6) mělo za následek u obou největší snížení příměrového dimeru spolu s význačným zvýšením množství amplifikované cílové sekvence. Jako v předcházejícím příkladu malý rozdíl ve snížení příměrového dimeru byl zřejmý u amplifikaci používajících jeden 3'-modifikovaný primer, což záviselo na tom, který primer byl modifikován.

Účinek polohy modifikovaného nukleotidu je vidět ze srovnání pruhů 6 až 8. V podstatě ekvivalentní výsledky byly získány použitím primerů modifikovaných v 3'terminálu nukleotidu (pruh 6), nukleotidu přilehlého k 3'terminálnímu nukleotidu (pruh 7) a nukleotidu 3 báze proti směru od 3'terminálního nukleotidu (pruh 8)’ Tyto výsledky ukazují, že modifikátorová skupina může být připojena ke kterémukoli ze čtyř nukleotidů v 3'konci primerů.

Příklad 7

Amplifikace používající modifikované primery

Účinek modifikátorové skupiny

Pro další demonstraci účinku modifikovaných primerů na tvorbu příměrového dimeru a pro demonstraci alternativních modifikací primerů byla provedena srovnání amplifikaci HCV RNA

-21CZ 291525.B6 užívajících jak modifikované primery, tak nemodifikované primery, přičemž primery byly modifikovány adicí jedné ze tří různých modifikátorových skupin: benzyl, nitrobenzyl a methyl.

Amplifikační výsledky byly analyzovány dvěma rozdílnými metodami. Při jednom souboru srovnání byla přítomnost příměrového dimeru vyhodnocena gelovou elektroforézní analýzou reakčních produktů. V druhém souboru srovnání byla tvorba příměrového dimeru monitorována během amplifikace pomocí kinetických PCR metod výše popsaných.

Cílová nukleová kyselina

HCV RNA matrice byly syntetizovány za použití HCV RNA transkripčního vektoru, jak je popsáno v Yung a kol., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4): 882-886.

Amplifikační primery

Amplifikace byly prováděny za použití jak nemodifikovaných tak modifikovaných primerů. Modifikované primery sestávaly ze stejných nukleotidových sekvencí jako nemodifikované primeiy, ale byly modifikovány v 3'terminálu adenosinu adicí methylové skupiny, benzylové skupiny nebo nitrobenzylové skupiny. Primery byly syntetizovány jak je popsáno v dřívějších

příkladech. Označení pro použití primery je uvedeno níže.
Primer	sekv. id. č.	modifikace 3' báze
ST280A	3	nemodifikovaná
ST280AMEA1	3	methyl
ST280ABA1	3	benzyl
ST280ANBA1	3	nitrobenzyl
ST778AA	4	nemodifikovaná
ST778AAMEA	4	methyl
ST778AABA1	4	benzyl
ST778AANBA1	4	nitrobenzyl
Amplifikační reakce

Amplifikace byly prováděny ve 100 mikrolitrových reakcích obsahujících následující reagenty: 0,20 nebo 200 kopií HCV RNA matrice, mm tricinu, pH 8,3,

110 mm KOAc,

3,5 mm Mn (OAc)₂,

300 mikrom. každý dATP, dCTP, dGTP, mikrom. dTTP,

500 mikrom, dUTP,

250 mm každého primeru,

U rTth^x)

UNG^X), a % glycerolu.

^x) vyrobeno a vyvinuto Hoffmann - La Roche a prodáváno Perkin Elmer, Norwalk, CT.

Tepelné cyklování každé reakční směsi bylo prováděno v GeneAmp^R PCR Systém 9600 tepelném cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu.

-22CZ 291525,B6

Předreakční inkubace reverzní transkripce 46 cyklů:

°C po dobu 4 minut, °C po dobu 24 minut, finální extenze postreakční udržování denaturace při 94 °C po dobu 30 sekund, zchlazení/extenze při 60 °C po dobu 30 sekund, °C po dobu 7 minut, °C

Detekce amplifikovaného produktu

A. Gelová elektroforéza

Přítomnost amplifikovaného produktu byla určena gelovou elektroforézou následovně. Reakční produkty byly frakcionovány za použití agarózového gelu (100 ml 3%ního NuSieve, 0,5%ního SeaChem, a 0,5 mikrog./ml ethidiumbromidu) a IX TBE (0,089 M tris, 0,089 M kyseliny borité, 0,0025 M disodné EDTA) průběžného pufru.

Elektroforéza byla prováděna pri 100 V přibližně 1 hodinu. Ethidiumbromidem zbarvené pásy DNA byly vizualizovány pomocí UV ozáření.

B. Detekce kinetickou PCR

Při kinetických PCR metodách výše popsaných se přidává k PCR interkalační barvivo jako je ethidiumbromid, který fluoreskuje silněji, když je vmezeřen do dvouřetězcové DNA. Vzrůst dvouřetězcové DNA během amplifikace je monitorován měřením fluorescence barviva během reakce. Poněvadž kinetické PCR metody jen měří vzrůst celkového množství dvouřetězcové DNA, tvorba nespecifických amplifikačních produktů není měřena nezávisle. Aby se měření výskytu nespecifické amplifikace, vyplývající z příměrového dimeru provádělo nezávisle na matricové amplifikaci, byly reakce prováděny bez matriční nukleové kyseliny. Při takových bezmatričních reakcích jakýkoli vzrůst dvouřetězcové DNA je přisouditelný tvorbě matričně nezávislého nespecifického amplifikačního produktu.

Kinetické PCR reakční podmínky byly popsány výše s výjimkou toho, že ethidiumbromid byl přidáván do reakční směsi v koncentraci 1 mikrog./ml. Reakce byly monitorovány měřením fluorescence reakční směsi jak je popsáno v EP 640 828.

Fluorescenční měření byla normalizována oddělením počátečních fluorescenčních měření získaných během cyklu časně při reakci, zatímco fluorescenční měření mezi cykly byla relativně konstantní. Počet cyklů zvolený pro počáteční fluorescenční měření byl stejný pro všechny srovnávané reakce, takže všechna měření představují vzrůsty ve vztahu k stejnému reakčnímu cyklu. Reakční fluorescence bezcílových reakcí zůstávaly relativně konstantní, pokud se netvořil primerový dimer. Při většině reakcí, když se provede dost amplifikačních cyklů, primerový dimer se eventuálně stává detektabilním. Účinek modifikovaných primerů je zřejmý ze srovnání počtu cyklů prováděných, dokud se netvoří primerový dimer, pokud se vůbec tvoří.

Výsledky

Výsledky gelové elektroforézní analýzy jsou uvedeny na obr. 3. Čísla pruhů odpovídající každé z amplifikaci užívajících nemodifikované a tři typy modifikovaných primerů a 200 kopií, 20 kopií nebo 0 kopií HCV RNA jsou uvedeny v následující tabulce (čísla pruhů jsou počítána odleva doprava: pruhy 1 až 30 jsou v homí polovině gelu, pruhy 31 až 60 jsou ve spodní polovině gelu). Navíc značkovače molekulové hmotnosti byly přítomny v pruzích 1 a 31 (Hae III digested Phi X 174 RF DNA, New England Biolabs, Beverly, MA) a v pruzích 30 a 60 (Super LadderLow, 20 bp ladder, Gen Sura, Del Mar, CA). Pásy odpovídající určenému specifickému produktu

-23CZ 291525 B6 jsou označeny na obr. 3 šipkou (asi 230 bp). Ostatní pásy v gelu odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu a zejména příměrovému dimeru.

Čísla pruhů amplifíkačních výsledků uvedených na obr. 3

Matrice	Primery	Pruhy
200	nemodifikovaný	2-5
200	methylovaný	6-9
200	benzylovaný	10-13
200	nitrobenzylovaný	14-17
20	nemodifikovaný	18-21
20	methylovaný	22-25
20	benzylovaný	26-29
20	nitrobenzylovaný	32-35
0	nemodifikovaný	36-41
0	methylovaný	42-47
0	benzylovaný	48-53
0	nitrobenzylovaný	54-59

Výsledky ukazují, že amplifikace užívající modifikované primery vedla k většímu množství amplifikované HCV nukleové kyseliny než amplifikace užívající nemodifikované primery. Navíc amplifikace užívající modifikované primery vedly ke snížení příměrového dimeru ve vztahu io k amplifikacím užívajícím nemodifikované primery.

Při kinetických PCR zkouškách byla monitorována fluorescence během reakce. Míra vzrůstu fluorescence potom, kdy vzrůst fluorescence byl zjistitelný, byla přibližně stejná ve všech reakcích, jak je dokázáno tvarem křivky získané grafickým znázorněním fluorescence oproti 15 počtu cyklů (neznázoměno). To ukazuje, že modifikované primery nezjistitelně inhibují účinnost každého amplifikačního stupně po počátečním stavu amplifikace. Reakce se významně lišily v počtu cyklů prováděných před zjistitelným růstem fluorescence.

Pro kvantifikaci rozdílů mezi reakcemi jsou výsledky vyjádřeny v podmínkách počtu 20 amplifíkačních cyklů provedených dokud fluorescence nepřekročila dohodnutou fluorescenční úroveň (AFL). AFL byla zvolena těsně u základní fluorescenční úrovně, ale nad oblastí nahodilých fluktuací u měřené fluorescence, takže reakční kinetika byla měřena během geometrické růstové fáze amplifikace. Akumulace amplifikovaného produktu v pozdějších cyklech inhibuje reakci a event. vede k reakčnímu plato.

Kinetické PCR výsledky jsou shrnuty v následující tabulce. Každá hodnota pro amplifikace 20 nebo 200 kopií cílové matrice představuje průměr 5 replikačních amplifikaci s výjimkou amplifíkací užívajících benzylované primery a 20 kopií cílové látky, která představuje průměr Čtyř replikátů. Každá hodnota pro amplifikace bez matrice představuje průměr 8 replikátů.

Dva mimo 8 replikátů amplifikaci užívající benzylované primery s žádným uvedeným cílem nevedly k formaci příměrového dimeru do konce 46 cyklů. Průměr zbývajících 6 amplifikaci je uveden, což reprezentuje průměr upravený na vytvořený primerový dimer. Upravený průměr není srovnatelný s ostatním hodnotami, které jsou znázorněny vzhledem k vypuštěným údajům.

-24CZ 291525.B6

Cykly k dosažení AFL

Primer	0	Počet cílových kopií 20	200
nemodifikovaný	35	36	34
methyl	39	38	36
nitrobenzyl	43	40	37
benzyl	43x)	41	37

^x) 2/8 neukázaly tvorbu příměrového dimeru

Údaje ukazují, že modifikované primery zjevně zpožďují amplifikaci cílové nukleové kyseliny tak, že AFL se dosáhne několik cyklů později. Toto zdržení neodpovídá snížení konečného zisku specifického amplifikačního produktu. Všechny amplifikace cílové nukleové kyseliny, jak bylo zjištěno, dosahují plato v 46 cyklech použitých v experimentu a jak je zjevné zodpovídajících údajů z gelové elektroforézní analýzy, konečný výtěžek byl zvýšen použitím modifikovaných primerů.

Údaje ukazují, že zdržení v tvorbě příměrového dimeru bylo významné větší než zdržení v amplifikaci cílové látky. Výhodný efekt primerů je nejjasněji vidět ze srovnání bezcílových amplifikaci a amplifikaci 200 kopií matrice. Při použití nemodifikovaných primerů se vzrůst fluorescence do AFI, vyskytl je jeden cyklus později při amplifikacícli bez cíle, což indikuje, že amplifikace cílové by se obtížně odlišily od tvorby příměrového dimeru. V kontrastu s tím při použití modifikovaných primerů vzrůst fluorescence vlivem příměrového dimeru se vyskytl alespoň 3 cykly později a při užití benzylovaných primerů se vyskytl alespoň 6 cyklů později, když se vůbec vyskytl. Tak mohly být cílové amplifikace detekovány a odlišeny od tvorby příměrového dimeru.

Srovnání bezcílových amplifikaci a amplifikaci 20 kopií matrice ukazuje, že účinek modifikovaných primerů vykazuje stejný model většího zdržení v nástupu příměrového dimeru než je zdržení v cílové amplifikaci. Při použití nemodifikovaných primerů, 20 kopií matrice nemohlo být deletováno. Použití nitrobenzylových a benzylových primerů vede ke zdržení tvorby příměrového dimeru, které je dostatečné tak, aby se umožnila detekce 20 kopií matrice v systému.

Údaje z monitorování fluorescence při každém amplifikačním cyklu (údaje nejsou znázorněny), indikují, že obecně zdržení v tvorbě příměrového dimeru je dostatečné k zábraně tvorby příměrového dimeru od dosažení plato úrovně během 46 cyklů. Takto se ukázalo, že modifikované primery zdržují tvorbu příměrového dimeru dostatečně tak, že amplifikace cílové látky může být dokončena a reakce zastavena před vytvořením významné úrovně příměrového dimeru.

Příklad 8

Fotolabilní primery

K. demonstraci použití fotolabilních příměrových dimerů byly provedeny amplifikace HCV RNA za použití jak modifikovaných primerů tak nemodifikovaných primerů. Modifikované primery byly modifikovány připojením jedné ze dvou nitrobenzylových skupin k oxocyklickému aminu 3'terminálu adeninu.

-25CZ 291525 B6

Amplifikační primery

Primery byly syntetizovány jak je popsáno v příkladu 4. Označení pro použité primery je uvedeno dále.

Primer	Sekv. id. č. modifikace 3' báze
ST280A 15239 15241 ST778AA 15240 15242	3 nemodifikovaný 3 bisnitrobenzyl 3 mononitrobenzyl 4 nemodifikovaný 4 bisnitrobenzyl 4 mononitrobenzyl

Amplifikační reakce

Pro každý primerový pár byly provedeny reakce užívající zřeďovacích sérií vstupní cílové koncentrace. 2 panely reakcí, každý zahrnující všechny kombinace příměrového páru a vstupní cílové koncentrace, byly provedeny, a v každém reakčním panelu každá reakce obsahující daný primerový pár a cílovou koncentraci, byly reakce provedeny dvojmo. Amplifíkace byly prováděny v 100 mikrol. reakcích obsahujících následující reagenty:

0,10,10², ΙΟ³,10⁴ nebo 10⁵ kopií HCV RNA matrice, mm tricinu, mm KOAc, mm Mn (OAc)₂,

200 mikroM každého dATP, dCTP, dGTP, dTTP,

200 mikroM dUTP,

250 nM každého primerů,

10UrTth^x),

U UNG^X), a % glycerolu.

^x) Vyrobené a vyvinuté Hoffmann-La Roche a prodávané Perkin Elmer, Norwalk, CT.

Tepelné cyklování každé reakční směsi bylo prováděno v GeneAmp PCR Systém 9600 tepelném cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu.

Předreakční inkubace reverzní transkripce počáteční denaturace 2 cykly:	50 °C po dobu 5 minut, 60 °C po dobu 30 minut, 95 °C po dobu 1 minuty, denaturace při 95 °C po dobu 15 sekund, ochlazení/extence při 60 °C po dobu 20 sekund,
finální extenze	72 °C po dobu 10 minut.

Leštěná reakční trubicová víčka (Perkin Elmer, Norwalk, CT) byla použita průběžně. Poté, co reakční teplota byla zvýšena na 60 °C pro stupeň reverzní transkripce, bylo zahřáté víčko odstraněno z PCR patra v bloku tepelného cyklovače a polovina reakčních trubek (jeden kompletní soubor duplikátorových reakcí) byla pokryta aluminiovou fólií. Druhá polovina byla ozářena použitím ruční UV lampy emitující záření o vlnové délce 302 nm (UVP model UVM57, UVP Products, San Gabriel, CA) po dobu 10 minut. Zahřátý obal byl odstraněn a amplifíkace pokračovala.

-26CZ 291525 B6

Výsledky

Výsledky amplifikací byly analyzovány gelovou elekroforézou, jak je výše popsáno. Výsledky jsou uvedeny na obr. 4. Primery a počet matričních kopií použité v každé reakci jsou indikovány v gelu (log. počtu kopií je uveden). Pásy odpovídající určenému produktu jsou označeny na obr. 4. Ostatní pásy v gelu odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu, a to zejména příměrovému dimeru.

Srovnání UV ozářeného souboru reakcí ukazuje, že použití modifikovaných primerů vedlo k významnému snížení příměrového dimeru, zejména při nízkém počtu kopií.

Srovnání neozářeného souboru reakcí ukázalo, že použití bisnitrobenzylových primerů vedlo k úplné inhibici amplifikace, jak bylo očekáváno. Amplifikace používající mononitrobenzylové primery nejen daly produkt, ale vykázaly významné snížení příměrového dimeru, což je konzistentní s výsledky získanými v předešlém příkladu.

Příklad 9

Amplifikace užívající p-terc.butylbenzylem modifikované primery

Tento příklad popisuje amplifikací HCV RNA za použití primerů modifikovaných j>terc.butylbenzylovými skupinami.

Cílová nukleová kyselina

HCV RNA matrice byly syntetizovány za použití HCV RNA transkripčního vektoru jak je popsáno v Young a kol., 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4):882-886.

Primery

Amplifikace byly prováděny za použití modifikovaných primerů syntetizovaných tak, jak je popsáno v příkladu 2. Nukleotidové sekvence nemodifikovaných primerů jsou uvedeny níže, orientovány v 5'—3' směru. Použité primery byly modifikované verze protisměrného primerů ST280A (sekv. id. č.: 3) a posměmého primerů ST778A (sekv. id. č.: 4). Modifikované formy primerů jsou zde vyznačeny následovně.

Modifikované HCV amplifíkační primery

Primer

ST280ATBU ST778AATBU sekv. id. č. poloha modifikovaného nukleotidu

3'zakončení

3'zakončení

Amplifikace a analýza

Amplifikace byly provedeny ve 100 mikrolitrových reakcích obsahujících následující reagenty:

20, 5,2,5,2 nebo 0 kopií HCV matrice RNA, mm tricinu (pH 8,33),

110 mm KOAc,

300 mikroM každého dATP, dCTP a dGTP, mikroM dTTP,

500 mikroM dUTP,

-27CZ 291525 B6 nM každého primerů,

3.5 mm Mn (OAc)₂13 % glycerolu, jednotek rTtH DNA polymerázy a

8.0 jednotek UNG^x).

^x) Vyrobeno a vyvinuto Hoffmann-La Roche a prodáváno Perkin Elmer, Norwalk, CT.

Amplifikační teplota cyklování bylo prováděno v TC480 DNA tepelném cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu:

Předreakční inkubace UNG inaktivace reverzní transkripce 47 cyklů:	45 °C po dobu 12 minut 90 °C po dobu 30 sekund 60 °C po dobu 20 minut denaturace při 94 °C po dobu 45 sekund, ochlazení/extenze při 60 °C po dobu 70 sekund
finální extenze poreakční udržování	60 °C po dobu 7 minut 10 °C až do analýzy (po krátkou dobu).

Amplifikační produkty byly analyzovány gelovou elektroforézou, jak je výše popsáno. Výsledky

Amplifikace prováděné u každého cílového matričního počtu byly replikovány následovně: 3 amplifikace byla prováděny za použití 20 kopií cílové matrice, 3 amplifikace byly prováděny za použití 5 kopií cílové matrice, 2 amplifikace byly prováděny za použití 2,5 kopií cílové matrice, 1 amplifikace byla prováděna za použití 2 kopií cílové matrice a 23 amplifikaci bylo prováděno bez přítomného cíle. Všechny matricové pozitivní amplifikace vedly k jednomu pásu na gelu očekávaného cílového stavu. Žádná z amplifikaci nevedla k buď příměrovému dimeru nebo jinému nespecifickému ampolifikačnímu produktu.

Výsledky mohou být porovnány s výsledky v příkladu 6, kde stejné HCV cíle byly amplifikovány za použití stejných příměrových sekvencí. Srovnání těchto výsledků s výsledky v příkladu 6 ukazuje, že amplifikace za použití p-terc.butylbenzylem modifikovaných primerů byly významně lepší ve vztahu k odpovídajícím amplifikacím prováděným s nemodifikovanými primery.

Byly provedeny další experimenty, ve kterých HIV-1 RNA byla amplifikována za použití p-terc.butylbenzylmodifikovaných verzí primerů popsaných v příkladu 5. Amplifikace byly prováděny v podstatě jak je výše popsáno. Jak u HCV systému, který je zde popsán, všechny HIV-1 matriční pozitivní amplifikace vedly k jednomu pásu na gelu očekávaného cílového stavu a žádná amplifikace nevedla k buď příměrovému dimeru nebo jinému nespecifickému amplifikačnímu produktu.

Tyto další výsledky mohou být srovnány s výsledky v příkladu 5, kde byl amplifikován stejný HIV cíl za použití stejných příměrových sekvencí. Srovnání těchto výsledků s výsledky příkladu 9 ukazuje, že amplifikace za použití p-terc.butylbenzyl modifikovaných primerů byly významně lepší ve vztahu k odpovídajícím amplifikacím prováděným s nemodifikovanými primery.

-28CZ 291525 B6

Příklad 10

Amplifikace mykobakteriální DNA

Tento příklad popisuje srovnání amplifikaci mykobakteriální DNA prováděných za použití nemodifikovaných a modifikovaných primerů.

Jak primery modifikované adicí benzylové skupiny na 3'terminál nukleotidu, tak primery modifikované adicí p-terc.butylbenzylové skupiny na 3'terminál nukleotidu byly použity. Reakce za použití nemodifikovaných primerů byly v podstatě takové, jaké jsou popsány v Tevere a kol., 1996, J. Clin. Microbiol. 34(4): 918-923. Amplifikace byly prováděny za použití vzorků sputa, do kterých byla přidána mykobakteriální DNA ve známé koncentraci do simulované infektovaných klinických vzorků. Další amplifikace byly prováděny za použití vyčištěné mykobakteriální DNA a za použití negativních kontrolních vzorků bez DNA.

Příprava vzorků

Vzorky sputa, které se dříve ukázaly být negativní na mykrobakterie pomocí mikroskopie a kultivace, byl zkapalněny a dekontaminovány pomocí N-acetylcistein-NaOH metody doporučené CDC (Kent a Hubica, 1985, Publ. Health Mycobacteriology, - příručka pro úroveň III laboratoře, U.S. Departmen of Health and Human Services, Centers for Disease Control, Atlanta, na což se tímto odkazuje). Zkapalněné sputum (lOOmikrol) bylo přidáno do 500 mikrol. Respirátory Specimen Wash Reagents (10 mm tris-HCl, 1 mm EDTA, l%ní (obj./obj.) Triton X-100, 0,05%ní NaN₃, pH 8,0) a odsřeďováno po dobu 10 minut při 12 500 g. Každá peleta byla resuspendována v 100 mikrol. lýzního reagentu (0,05 N NaOH, l%ní (obj./obj.) Triton X-100, 1 mm EDTA, 0,05%ní NaN₃) a inkubována po dobu 45 minut při teplotě 60 °C. Lyzáty pak byly neutralizovány lOOmikrol. neutralizačního reagentu (0,2 M Tris-HCl, 8mM mgCl₂, 0,05%ní NaN₃, pH 7,5).

Sdružené lyzáty sputa byly vytvořeny sloučením 80 mikrol. každého ze dvou separátních lyzátů sputa. Do každého z 8 sdružených lyzátů sputa (160 mikrol. každého) bylo přidáno 15 mikrolitrů DNA základu (2 kopie/mikrol. v 1:1 směsi lýze a neutralizačních reagentů vyčištěného od kultivované M. tuberculosis.

Příklady obsahující vyčištěnou mykobakteriální DNA (žádné sputum) ve známé koncentraci byly připraveny přídavkem 10 mikrolitrů DNA základu do 100 mikrolitrů 1:1 směsi lýzního reagentu a neutralizačního reagentu.

Negativní kontrolní vzorky (žádná DNA) sestávaly ze směsi 100 mikrolitrů neutralizačního reagentu.

Amplifikační primery

Amplifikace byly prováděny za použití primerů sestávajících z následujících nukleotidových sekvencí:

Primery

KY18(sekv. id.č.:5) KY438 (sekv. id. č. 6) KY75 (sekv. id. č.: 7)

Sekvence 5'-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3' 5'-TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA-3' 5'-GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA-3'

-29CZ 291525 B6

Následující příměrové páry obsahující indikovanou modifikátorovou skupinu připojenou k 3'terminálu báze, byly použity při amplifíkacích. Všechny modifikované primery byly syntetizovány jak je popsáno v předešlých příkladech. Všechny primery byly biotinylovány na 5'konci.

Příměrový pár

A

B

C

Amplifikace

Příměrové sekvence

KY18 (sekv. id. č.: 5)

ΚΎ75 (sekv. id. č.: 7)

KY436 (sekv. id. č. 6)

KY75 (sekv. id. č. 7)

KY436 (sekv. id. č.: 6)

KY75 (sekv. id. č.: 7)

Modifikace nemodifikované nemodifikované benzyl benzyl p-terc.butylbenzyl p-terc.butylbenzyl

Pro každý vzorek byly provedeny amplifikaci za použití nemodifikovaného příměrového páru KY18 (sekv. id. č.: 5) a KY75 (sekv. id. č.: 7), a modifikovaných forem příměrového páru

K.Y436 (sekv. id. č.: 6) a KY75 (sekv. id. č.: 7).

Amplifikace byly prováděny ve 100 mikrolitrových reakcích, každé obsahující 50 mikrolitrů jednoho ze tří vzorků výše popsaných a 50 mikrolitrů 2 x směsi reagentů, která obsahuje následující reagenty:

100 mm tris-HCl, pH 8,9,

500 nM každého primeru,

200 mikroM každého dNTP, (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), % obj./obj. giycerólu) j ednotek Ampl i Taq^x), jednotek AmpErase^x).

^x) Vyrobeno a vyvinuto Hoffmann-La Roche a prodáváno Perkin Elmer, Norwalk, CT).

Tepelné cyklování každé reakce bylo prováděno v GeneAmp PCR systém 9 600 tepelném cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu:

Předreakční inkubace 2 cykly:	50 °C po dobu 5 minut denaturace při 98 °C po dobu 20 sekund, chlazení při 62 °C po dobu 20 sekund, extenze při 72 °C po dobu 45 sekund.
41 cyklů:	denaturace při 94 °C po dobu 20 sekund, chlazení při 62 °C po dobu 20 sekund extenze při 72 °C po dobu 45 sekund,
finální extenze	72 °C po přibližně 12 hodin (přes noc).

Amplifikační produkty byly vizualizovány elektroforézou skrz 2%ní Nusieve^(R), 0,5%ní agarózový gel, načež následovalo zabarvení ethidiumbromidem.

Výsledky

Výsledky elektroforézní analýzy jsou znázorněny na obr. 5. Pro každý vzorec produkty z amplifikaci prováděných s nemodifikovanými primery (označené „A“) a s nemodifikovanými primery (označené „B“ a „C“) byly jednotlivé běhy uvedeny na přilehlých pruzích. Pásy odpovídající určené mykobakteriální cílové sekvenci jsou označeny šipkami. Jiné pásy odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu, nejspodnější pásy v gelu odpovídají příměrovému

-30CZ 291525 B6 dimeru. Pruhy označené „M“ obsahují ukazatel molekulové hmotnosti (Hae III digestion of

PhiX174DNA).

Za použití nemodifikovaných příměrů vedly amplifikace vyčištěné mykobakteriální DNA k tvorbě příměrového dimeru. Použití obou modifikovaných párů primerů zvýšilo množství určené cílové látky, která byla přítomna, a v podstatě eliminovalo tvorbu zjistitelného příměrového dimeru.

V kontrastu k amplifikaci vyčištěné DNA za použití nemodifikovaných primerů, přítomnost lyzátu sputa v amplifikační reakci snížila účinnost lyzátu sputa v amplifikační reakci snížila účinnost a zvýšila tvorbu nespecifického amplifikačního produktu, jak je vidět z přítomnosti vnějších pásů produktu. Vzrůst nespecifického amplifikačního produktu není překvapením daným tím, že lyzáty sputa obsahují významné množství lidské DNA, která není přítomna v amplifikacích vyčištěné mykobakteriální DNA. Použití obou modifikovaných příměrových párů při amplifikacích prováděných v přítomnosti sputa mělo za následek jak významný vzrůst množství vytvořeného určeného produktu, tak snížení nespecifické amplifikace.

Příklad 11

Další syntéza primerů modifikovaných benzylovou skupinou

Primery modifikované adicí benzylové skupiny na terminální citosin byly syntetizovány v podstatě jak je popsáno v příkladu 1, ale za použití LCAA-CPG vázaného N⁴-acetyl-N⁴-benzyl-5'O-DMT-2'-deoxycitidinu připraveného jak je dále popsáno.

Stupeň 1: Syntéza N⁴-benzyl-2'-deoxycitidinu

Do 2'-deoxycitidinhydrochloridu (5,28 g, 20 mmol, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) byl přidán benzylamin (20 ml) a směs byla zahřívána při 150 °C po dobu 3 hodin pod argonovou atmosférou. Roztok byl koncentrován za vakua, čímž se získal viskózní žlutý olej, který byl rozdělen mezi vodu (100 ml) a ethylacetát (100 ml). Vodná fáze byla promyta ethylacetátem (100 ml) a oddělena. Vodná fáze byla koncentrována za vakua, čímž se získal žlutý sirup (13 g), který byl vyčištěn silikagelovou sloupcovou chromatografii směsí 15:1 methylenchlorid:methanol jako eluentu, čímž se získal požadovaný produkt (5,8 g, 91,5 %) jako bezbarvý sirup.

Stupeň 2: Syntéza N⁴-acetyl-N⁴-benzyl-2'-deoxycitidinu

N⁴-benzyl-2'-deoxycitidin (2,5 g, 7,9mmol) byl rozpuštěn v 15 ml suchého dimethylformamidu (15 ml), byl přidán acetanhydrid (8 g, 79 mmol, 10 ekv.) a směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Rozpouštědlo a přebytek acetanhydridu byly odpařeny za vakua. Produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografii silikagelem za použití 20:1 methylenchlorid:methanol jako eluentu, čímž se získala nadepsaná sloučenina (1,3 g, 48%). Sloučenina byla vysoce hygroskopická a byla uskladněna vysušená při -20 °C.

Stupeň 3: Syntéza N⁴-acety-N⁴-benzyI-5'-O-DMT-2'-deoxycitidinu

N⁴-acetyl-N⁴-benzyl-2'-deoxycitidin (76 mg, 0,2 mmol) byl rozpuštěn v 1 ml suchého pyridinu a byl přidán DMT-C1 (122 mg, 0,2 mmol, 1,0 ekv.). Reakční směs byla míchána po dobu 3 hodin. Analýza TLC ukázala určitý úbytek výchozího materiálu, takže další alikvot DMT-C1 (61 mg, 0,5 ekv.) byl přidán a výsledná směs byla míchána další hodinu, v kteréžto době analýza TLC ukázala, že reakce byla skončena. Reakční směs byla zchlazena 15 ml solanky a vodná fáze byla extrahována methylenchloridem (3,15 ml). Sloučenina organická vrstva byla promyta solankou (2,15 ml) a vysušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odpařeno

-31CZ 291525 ,B6 nad bezvodým síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odpařeno a směs byla vyčištěna silikagelovou chromatografií za použití 50:1 methylenchlorid:methanol, čímž se získal N⁴-acetyl-N⁴benzyl-5'-0-DMT-2'-deoxycitidin (96 mg, 65%ní výtěžek).

Stupeň 4: Sukcinylace

N⁴-acetyl-N⁴-benzyl-5'-O-DMT-2'-deoxycitidin (96 mg, 0,13 mmol) byl rozpuštěn ve 2 ml suchého pyridinu. Byly přidány anhydrid kyseliny jantarové (100 mg, 1,0 mmol) a dimethylaminopyridin (20 mg) a výsledná směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 3 dnů. Rozpouštědlo bylo odpařeno a zbytek byl spoluodpařen s toluenem (3,10 ml). Byl přidán chloroform (50 ml) k rozpuštění zbytku (byl použit ultrazvuk k nápomoci rozpouštění). Chloroformová vrstva byla promyta solankou (3,15 ml) a vodou (1,15 ml). Organická vrstva byla vysušena bezvodým síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo dopařeno, čímž se získalo 108 mg čistého N⁴-acetyl-N⁴-benzyl-5'-0-DMT-2'-deoxycitidin-3'-0-sukcinamitu (97%ní výtěžek).

Stupeň 5: Příprava LCAA-CPG vázaného 5'-O-DMT-N⁴-acetyl-N⁴-benzyl-2'-deoxycitidin3'-O-sukcinátu

Aktivované CPG bylo připraveno následovně: LCAA-CPG (1,0 g, LCA00500C, CPGInc., Fairfíeld, NJ) bylo zpracováno s trichloroctovou kyselinou v methylenchloridu (3%ní, 10 ml) a bylo mícháno rotací na rotačním odpařovači (rotovapor, Buchu, Flawil, Švýcarsko) (žádné vakuum) po dobu 4 hodin. Rozpouštědlo bylo odfiltrováno a CPG bylo promyto směsí 9:1 triethylamin:ethyldiizopropylamin (3,5 ml), methylenchloridem (3,10 ml) a etherem (3,10 ml), a to postupně a pak bylo vysušeno za vakua.

Spojení modifikovaného nukleosidového produktu s kyselinou promytým CPG bylo provedeno následovně. K. 1 g aktivovaného LCAA-CPG byl přidán N⁴-acetyl-N⁴benzyi-5'-O-DMT-2'deoxycitidin-3'-0-sukcinát (108 mg, 0,13 mrnol, připravený jak je výše popsáno, dimelhylaminopyridin (20 mg) a 5 ml suchého pyridinu. Reakční směs byla rotována na rotovaporu (žádné vakuum) po dobu 3 dnů. Supematant byl odfiltrován a propojené LCAA-CPG bylo promyto postupně pyridinem (3,5 ml), methylenchloridem (3,10 ml) a etherem (3,10 ml) a pak vysušeno ve vakuu.

Opatření čepičkou LCAA-CPG vázaného s N⁴-acetyl-N⁴-benzyl-5'-O-DMT-2'-deoxycitidin3'-O-sukcinátu bylo provedeno následovně. K derivatizovanému CPG byl přidán čepičkovací směsný reagent A (THF/lutidin/AC₂O 8:1:1 Glen Research DNA syntézní reagenty, Sterling, VA) a B (10%ní N-methylimidazol v THF, Glen Research) a reakční směs byla rotována na rotavaporu (žádné vakuum) přes noc. Roztok byl odfiltrován a vázané LCAA-CPG bylo promyto postupně pyridinem (3,5 ml), methylenchloridem (3,10 ml), THF (3,10 ml) a etherem (3,10 ml) a pak vysušeno za vakua.

Vázací kapacita derivatizovaného LCAA-CPG byla určena zpracováním 5 mg produktu s 3%ní chloroctovou kyselinou v methylenchloridu a množství uvolněného dimethoxyltritylkarboniového iontu bylo změřeno UV spektroskopií. Množství nukleosidového derivátu vázaného k LCAAA-CPG bylo stanoveno v hodnotě 19,5 mikroM/g.

Seznam sekvencí (1) Obecná informace:

(i) Přihlašovatel:

(A) Jméno: F. Hoffmann-La Roche AG (B) Ulice: Grenzachestrasse 124 (C) Město: Basilej (D) Stát: BS

-32CZ 291525 B6 (E) Země; Švýcarsko (F) Poštovní kód (ZIP): CH-4070 (G) Telefon: 0601 -688 25 11 (H) Telefax: 0601 -688 13 95 (I) Telex: 962292/965542 hlr ch (ii) Název vynálezu: Modifikované primery (iii) Počet sekvencí: 7 (iv) Počítačová čitelná forma:

(A) Druh média: Floppy disk (B) Počítač: Apple Macintosh (C) Operační systém: Systém 7.1 (Macintosh) (D) Software: Word 5.1 (v) Prioritní data přihlášky:

Číslo přihlášky: 60—041127

Datum podání: 20.03.97 (2) Informace pro sekv. id. Č. 1:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 33 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 1:

CAATGAGACA CCAGGAATTA GATATCAGTA CAA 33 (2) Informace pro sekv. id. č. 2:

(i) sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 32 párů bází (B) Typ: nukleová ky selina (C) Řetězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 2:

CCCTAAATCA GATCCTACAT ATAAGTCATC CA 32 (2) Informace pro sekv. id. č. 3:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 3:

GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTA 26 (2) Informace pro sekv. id. č. 4:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 4:

GCAAGCACC TATCAGGCAG TACCACAA 28

-33CZ 291525 B6 (2) Informace pro sekv. id. č. 5:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 23 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 5:

CACATGCAAG TCGAACGGAA AGG 23 (2) Informace pro sekv. id. č. 6:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 6:

TAACACATGC AAGTCGAACG GAAA 24 (2) Informace pro sekv. id. č. 7:

(i) Sekvenční charakteristiky:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Retězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 7:

GCCCGTATCG CCCGAACGCT CACA24

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Oligonukleotid obecné struktury

   RR

   II

   5'-S,-N-3' nebo 5'-Si -N-S₂-3', kde

   51 představuje první sekvenci nukleotidů mezi 5 až 50 nukleotidy v délce,

   5₂ představuje druhou sekvenci mezi jedním až třemi nukleotidy v délce,

   N představuje nukleotid takový, který obsahuje purinovou nebo pyrimidinovou bázi, která obsahuje exocyklický amin,

   R představuje modifikátorovou skupinu, kde R je kovalentně vázán k N přes exocyklický amin a kde R má strukturu

   -34CZ 291525.B6

   Ri - C-R₂ kde

   Ri a R₂ představují nezávisle vodík, C|-Ci₀alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, fenylovou skupinu, fenoxyskupinu, substituovanou fenylovou skupinu, naftylovou skupinu nebo substituovanou naftylovou skupinu.
2. 2. Oligonukleotid podle nároku 1, kde R je 2-naftylmethy!ová skupina, benzylová skupina nebo substituovaná benzylová skupina.
3. 3. Oligonukleotid podle nároku 1 nebo 2, kde R je substituovaná benzylová skupina o struktuře kde R₃ představuje Cj-C₆ rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, methoxyskupinu nebo nitroskupinu.
4. 4. Oligonukleotid podle nároku 3, kde R₃ představuje CrCd rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, methoxyskupinu nebo nitroskupinu.
5. 5. Oligonukleotid podle nároku 3 nebo 4, kde R₃ je připojen v para poloze.
6. 6. Oligonukleotid podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, kde N je adenosin.
7. 7. Oligonukleotid podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde R je vybrán ze skupiny zahrnující benzyl, p-methylbenzyl, p-terc.butylbenzyl, p-methoxybenzyl. o-nitrobenzyl a 2-naftylmethyl.
8. 8. Způsob amplifikace cílové sekvence nukleové kyseliny, vyznačený tím, že se provede amplifikační reakce za použití alespoň jednoho oligonukleotidů podle kteréhokoli z nároků 1 až 7.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že se použije reakce polymerázového řetězce.
10. 10. Sestava kprovádění amplifikační reakce nukleové kyseliny, vyznačená tím, že obsahuje oligonukleotid podle kteréhokoli z nároků 1 až 7.