CZ84198A3 - Modifikované primery - Google Patents
Modifikované primery Download PDFInfo
- Publication number
- CZ84198A3 CZ84198A3 CZ98841A CZ84198A CZ84198A3 CZ 84198 A3 CZ84198 A3 CZ 84198A3 CZ 98841 A CZ98841 A CZ 98841A CZ 84198 A CZ84198 A CZ 84198A CZ 84198 A3 CZ84198 A3 CZ 84198A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- primers
- modified
- primer
- amplification
- reaction
- Prior art date
Links
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 214
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 213
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 54
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 14
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 102
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 51
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 46
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 45
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 45
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims description 43
- -1 phenoxy, substituted phenyl Chemical group 0.000 claims description 34
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 31
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 22
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 17
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 14
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 13
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 8
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 5
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 4
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 4
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 abstract description 63
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 376
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 71
- 239000002585 base Substances 0.000 description 68
- 239000000047 product Substances 0.000 description 68
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 52
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 45
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 42
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 30
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000006502 nitrobenzyl group Chemical group 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 14
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 14
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 125000006487 butyl benzyl group Chemical group 0.000 description 12
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 12
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 10
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 10
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 10
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 9
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 9
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 8
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 7
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 6
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Substances C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 5
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 5
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 4
- 230000035322 succinylation Effects 0.000 description 4
- 238000010613 succinylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 3
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 3
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 3
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 3
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HXBMIQJOSHZCFX-UHFFFAOYSA-N 1-(bromomethyl)-2-nitrobenzene Chemical group [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1CBr HXBMIQJOSHZCFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;6-amino-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 NOIRDLRUNWIUMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 3-methyladenine Chemical compound CN1C=NC(N)=C2N=CN=C12 FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWZSNBJODPRUAV-GZBFAFLISA-N 4-(benzylamino)-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(NCC=2C=CC=CC=2)C=C1 TWZSNBJODPRUAV-GZBFAFLISA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 2
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N chloroacetic acid Chemical compound OC(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 2
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 2
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJJQAQFECPHEIJ-FILYFMJVSA-N (2R,3S,5R)-5-(6-amino-6-benzyl-8H-purin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound N1=CN=C2N([C@@H]3O[C@H](CO)[C@@H](O)C3)CN=C2C1(N)CC1=CC=CC=C1 RJJQAQFECPHEIJ-FILYFMJVSA-N 0.000 description 1
- NIMQVHDXSYNJJX-BFHYXJOUSA-N (2r,3s,5r)-5-[6-(benzylamino)purin-9-yl]-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(NCC=3C=CC=CC=3)=C2N=C1 NIMQVHDXSYNJJX-BFHYXJOUSA-N 0.000 description 1
- AUYBSFAHQLKXSW-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloroethane;3-(ethyliminomethylideneamino)-n,n-dimethylpropan-1-amine;hydrochloride Chemical compound Cl.ClCCCl.CCN=C=NCCCN(C)C AUYBSFAHQLKXSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 OLXZPDWKRNYJJZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- XHBSBNYEHDQRCP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-methyl-3,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound O=C1NC(=N)N(C)C2=C1N=CN2 XHBSBNYEHDQRCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 3-[chloro-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(Cl)OCCC#N QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFKUHGONCHRHPE-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione;7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 FFKUHGONCHRHPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 206010073306 Exposure to radiation Diseases 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000008021 Nucleoside-Triphosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010075285 Nucleoside-Triphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- YSQLKSNQFQQIHO-VWIRTGDQSA-N [(2r,3s,5r)-5-[6-(benzylamino)purin-9-yl]-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxyphosphonamidous acid Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](COP(O)N)O[C@H]1N1C2=NC=NC(NCC=3C=CC=CC=3)=C2N=C1 YSQLKSNQFQQIHO-VWIRTGDQSA-N 0.000 description 1
- LTKCXZGFJFAPLY-OERIEOFYSA-N [1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2-oxopyrimidin-4-yl]azanium;chloride Chemical compound Cl.O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 LTKCXZGFJFAPLY-OERIEOFYSA-N 0.000 description 1
- SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N [amino(ethoxy)phosphanyl]oxyethane Chemical compound CCOP(N)OCC SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N benzyl bromide Chemical compound BrCC1=CC=CC=C1 AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001743 benzylic group Chemical group 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940106681 chloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000013581 critical reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- PEECTLLHENGOKU-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-4-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1.CN(C)C1=CC=NC=C1 PEECTLLHENGOKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N n-[9-[(2r,4s,5r)-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]purin-6-yl]benzamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OC[C@@H]1[C@@H](O)C[C@H](N2C3=NC=NC(NC(=O)C=4C=CC=CC=4)=C3N=C2)O1 LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 125000006503 p-nitrobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1[N+]([O-])=O)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229940083251 peripheral vasodilators purine derivative Drugs 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012987 post-synthetic modification Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 229940083082 pyrimidine derivative acting on arteriolar smooth muscle Drugs 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran thf Chemical compound C1CCOC1.C1CCOC1 WHRNULOCNSKMGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Paints Or Removers (AREA)
- Dental Preparations (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Předložený vynález se týká oblasti molekulární biologie a chemie nukleových kyselin. Zejména se týká způsobů a reagencií pro zvýšení výtěžku amplifikačních reakcí nukleových kyselin. Vynález má tudíž využití v kterékoli oblasti, ve které se používá amplifikace nukleových kyselin.
Dosavadní stav techniky
Vynález reakce polymerasového řetězce (PCR) umožnil in vitro amplifikaci sekvencí nukleových kyselin. PCR je popsána v US patentech č. 4 683 195, 4 683 202 a 4 965 188, Saiki a kol., 1985, Science 230:1350 - 1354, Mullis a kol., 1986, Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273, a Mullis a Faloona, 1987, Methods Enzymol. 155:335-350.
Vývoj a aplikace PCR jsou popsány rozsáhle v literatuře. Například oblast témat týkajících se PCR je diskutována v PCR Technology-Principles and Applications for DNA Amplifilsation, 1989 (ed. H.A.Erlich) Stockton Press, New York, PCR protokol: A.Guide to Methods and Applications, 1990, (ed. M.A.
i
Innis a kol.) Academie Press, San Diego, a PCR Strategies, 1995, (ed. M.A.Innis a kol.) Academie Press, San Diego. Obchodníci jako je Perkin Elmer (Norwalk, CT), prodávají PCR reagencie a publikují PCR protokoly.
Od původní publikace amplifikace nukleových kyselin byly popsány různé metody amplifikace nukleových kyselin na bázi primerů, zahrnující, ale bez omezení, Ligase Chain Reaction (LCR, Wu a Wallacae, 1989, Genomics 4:560-569 a • · · · • · • · ···
Barany, 1991, Proč.Nati.Acad.Sci.USA88:189-193), Polymerase Ligase Reaction (Barany,1991, PCR Methods and Applic. 1:5-16), Gap-LCR (PCT zveřejněná přihláška vynálezu č. WO 90/01069), Repair Chain Reaction (zveřejněná Evropská přihláška vynálezu č. 439,182 A2), 3SR (Kwoh a kol., 1989, Proč.Nati.Acad. Sci USA 86:1173-1177, Guatelli a kol., 190, Proč.Nati.Acad. Sci USA 87:1874-1878, PCT zveřejněná přihláška vynálezu č. WO 92/0880A) a NASBA (U.S.Patent č. 5 130 238). Přehled amplifikačních systémů je uveden v Abramson a Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47.
Specifičnost amplifikačních reakcí na bázi primerů závisí na specifičnosti hybridizace primeru. Za zvýšených teplot používaných při typické amplifikací primery hybridizují jen na určené cílové sekvence. Avšak amplifikační reakce směsí se typicky provádějí při teplotě místnosti, dost pod teplotou potřebnou k zajištění specifičnosti hybridizace primeru. Za takovýchto méně přísných podmínek se primery mohou vázat nespecificky na jiné jen zčásti komplementární sekvence nukleových kyselin nebo na jiné primery a iniciují syntézu nežádaných extenzních produktů, které mohou být amplifikovány spolu s cílovou sekvencí. Amplifikace nespecifických extenzních produktů primerů mohou soutěžit s amplifikací žádaných cílových sekvencí a mohou významně snížit účinnost amplifikace požadované sekvence.
Jeden často zjišťovaný typ nespecifického amplifikačního produktu je matricový nezávislý artefakt amplifikačních reakcí označovaný jako primerní dimer. Primerní dimer je dvouřetězcový fragment, jehož délka typicky odpovídá součtu délek dvou primerů a začne se vyskytovat, když jeden primer je protažen přes druhý primer.. Výsledná konkatenace tvoří nežádanou matrici, která vzhledem k své malé délce je účinně amplifikována.
• ·
Nespecifická amplifikace může být snížena snížením tvorby extenzních produktů primeru před začátkem reakce. Při jedné metodě označované jako protokol horký start, jedna nebo více kritických reagencií se udrží mimo reakční směs dokud se teplota dostatečně nezvýší, aby se zajistila nutná specifičnost hybridizace. Při tomto způsobu reakční směs nemůže podpořit extenzi primeru během doby, kdy reakční podmínky nezajišťují specifickou hybridizaci primeru.
Ruční metody horkého startu, při kterých se reakční trubice otevírají po počátečním vysokoteplotním inkubačním stupni a přidávají se chybějící reagencie, jsou pracovně náročné a vzrůstá riziko kontaminace reakční směsi. Alternativně může být použit tepelně citlivý materiál jako je vosk k separaci nebo maskovací reakční komponenty jak jsou popsány v US patentu č. 5 411 876, a Chou a kol., 1992, Nucl.Acic Res. 20 (7:1717-1723). Při těchto metodách vysoká teplota předreakční inkubace taví tepelně citlivý materiál, čímž se umožHuje smísení reagencií.
Další metodou snížení tvorby extenzních produktů primerů před začátkem reakce spočívá na tepelně reverzibilní inhibici DNA polymerasy specifickými protilátkami DNA polymerasy, jak je popsáno v US patentu číslo 5 338 671. Protilátky jsou inkubovány s DNA polymerasou v pufru při teplotě místnosti před sdružením reakční směsi, aby se umožnila tvorba komplexu protilátka-DNA polymerasa. Protilátková inhibice aktivity DNA polymerasy je inaktivována vysokou teplotou předreakční inkubace. Nevýhoda této metody je v tom, že produkce protilátek specifických k DNA polymerase je drahá a spotřebovává čas, zejména ve velkých množstvích. Dále pří sada protilátek k reakční směsi může vyžadovat předělání amplifikační reakce.
• ·
Tvorba extenzních produktů před zahájením reakce může být také inhibována přídavkem jednořetězcového vázacího proteinu do reakce, který se nekovalentně váže k primerům tepelně reversibilním způsobem a inhibuje extenzi primeru zábranou hybridizace.
Nespecifická amplifikace může být také snížena enzymaticky degradováním extenzních produktů vytvořených před zahájením reakce za použití metod popsaných v US patentu 5 418 149. Degradace nově syntetizovaných extenzních produktů se dosáhne začleněním dUTP a UNG do reakční směsi a inkubací reakční směsi při 45 až 60 °C před prováděním amplifikační reakce. Extenze primeru vede k formaci DNA obsahující uráčil, což se degraduje pomocí UNG za předamplifikačních podmínek.
Nevýhodou této metody je to, že degradace extenzního produktu soutěží s tvorbou extenzního produktu a eliminace nespecifického extenzního primerního produktu vede k pravděpodobnosti, že bude méně kompletní. fe^Výhoda této metody je to, že DNA obsahující uráčil zavedená do rakční směsi jako kontaminace z předchozí reakce se také degraduje a tak tato metoda také snižuje problém kontaminace PCR amplifikovanou nukleovou kyselinou z předcházejících reakcí.
Konvenční technologie molekulární biologie a chemie nukleových kyselin, které se používají v oboru, jsou zcela vysvětleny v literatuře. Viz například Sambrook a kol., 1989, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait, ed.1984), Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames a S.J.Higgins, eds. 1984) a řada Methods in Enzymology (Academie Press,Inc.).
• ·
Předložený vynález zajišťuje kovalentně modifikované oligonukleotidové primery pro amplifikaci sekvencí nukleových kyselin in vitro. Použití modifikovaných primerů tohoto vynálezu vede ke snížení nespecifické amplifikace zejména tvorby primerového dimeru a/nebo konkomitantnímu vzrůstu v oblasti určeného cíle ve vztahu k amplifikaci prováděné bez nemodifikovaných primerů.
Podstata vynálezu
Vynález se týká oligonukleotidového primerů pro amplifikaci sekvence nukleových kyselin, obecného vzorce
R R
5' - Sx - N - 3' nebo 5' - - N - S2 - 3' kde představuje první sekvenci nukleotidů mezi asi 5 až asi 50 nukleotidy v délce,
S2 představuje druhou sekvenci mezi jedním až 3 nukleotidy v délce,
N představuje nukleotid, takový, který obsahuje purinovou nebo pyrimidinovou bázi, která obsahuje exocyklický amin,
R představuje modifikátorovou skupinu, kde R je kovalentně vázána k N přes exocyklický amin a kde R má strukturu vzorce
R
I
R, - C - Ro
I
H kde Rj a R2 představují nezávisle vodík, C^-C^q alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, fenylovou skupinu, fenoxy skupinu, substituovanou fenylovou skupinu, naftylovou skupinu nebo substituovanou naftylovou skupinu. Alkylové skupiny mohou být rozvětvené nebo nerozvětvené..
Ve výhodném provedení N je modifikovaný konvenční nukleotid, v kterémžto případě N je modifikovaný adenosin, cytidin, nebo guanosin a modifikátorová skupina je kovalentně připojena k exocyklickému aminu adeninové, guaninové nebo cytosinové báze. Ve výhodnějším provedení N je modifikovaný adenosin.
Ve výhodném provedení R je 2-naftylmethylová skupina, benzylová skupina nebo substituovaná benzylová skupina. Výhodné substituované benzylové skupiny mají strukturu vzorce
kde
Rg představuje C^-Cg rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, výhodněji C^-C^ rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, methoxyskupinu nebo nitroskupinu. Výhodně je R^ připojen v para poloze.
Ve výhodnějším provedení je R benzyl, p-methylbenzyl, p-terc.butylbenzyl, p-methoxybenzyl, nebo 2-naftylmethylová skupina.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká amplifikačních primerů, které jsou modifikovány fotolabilním kovalentním připojením modifikátorové skupiny, která vede k parciální nebo úplné inhibici extenze primerů.
99 9 • ··· 9 999 9 9 ’ 9 9 · · 9 9 999* 9 999 99
9999 9 99'
999999 · 9 · · ·99
Fotolabilní modifikátor může být vázán bud k exocyklickému aminu jako u modifikovaných nukleotidů popsaných výše, nebo ke kruhovému dusíku. Při jednom provedení alespoň jedna nitrobenzylová skupina je připojena k exocyklickému aminu adeninové, guaninové nebo cytosinové báze terminálu 3' nukleotidu.
Dalším aspektem tohoto vynálezu je dvojice nebo sestava primerů, kde alespoň jeden z primerů je modifikován jak je výše popsáno. Při výhodném provedení oba členy páru primerů nebo všechny členy sestavy primerů jsou modifikovány.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká způsobu amplifikace nukleové kyseliny, který zahrnuje provedení amplifikační reakce za použití modifikovaných primerů tohoto vynálezu.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká způsobů pro amplifikaci cílové nukleové kyseliny, které zahrnují provádění amplifikační reakce za použití fotolabilních modifikovaných primerů tohoto vynálezu, přičemž reakční směs je ozářena zářením dostatečným k odstranění modifikátorové skupiny a umožnění tvorby příměrových extenzních produktů.
Při jednom provedení tohoto vynálezu se ozáření provádí jako oddělený stupeň před začátkem amplifikační reakce, ale potom, co reakční směs byla zahřáta na teplotu vyšší než asi 50 °C. V jiných provedeních je ozařovaí stupeň spojen s předběžným stupněm amplifikačního postupu jako je stupeň reversní transkripce v amplifikační reakci RNA nebo počáteční denaturační stupeň při amplifikační reakci DNA.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká kitů pro amplifikaci sekvencí nukleových kyselin in vitro, kteréžto kity zahrnují dvojici primerů, ve které alespoň jeden z primerů je modifikován jak je zde popsáno.
Kity tohoto vynálezu také mohou zahrnovat alespoň jednu amplifikační reagencií, například polymerasu nukleové kyseliny nebo ligasu, nukleosidtrifosfatasu a vhodné pufry.
Stručný popis výkresů
Obr.l ukazuje výsledky amplifikací HIV-1 RNA provedených za použití benzylovaných primerů, jak je popsáno v příkladu 5.
Obr. 2 znázorňuje výsledky amplifikací HCV RNA prováděné za použití benzylovaných primerů, jak je popsáno v příkladu 6.
Obr. 3 ukazuje výsledky amplifikací HCV RNA prováděných za použití primerů modifikovaných s jednou nebo třemi modifikátorovými skupinami, jak je popsáno v příkladu 7.
Obr. 4 ukazuje výsledky amplifikací HCV RNA provádě ných za použití fotolabilních modifikovaných primerů, jak je popsáno v příkladu 8.
Obr. 5 ukazuje výsledky amplifikací mykobakteriální DNA za použití primerů modifikovaných s benzylovou skupinou a primerů modifikovaných s p-terc.butylbenzylovou skupinou, jak je popsáno v příkladu 10.
Obr. 6 ukazuje obecné reakční schéma vhodné pro syntézu benzylem nebo substituovaným benzylem modifikovaného dA skla s řízenými póry (CPG).
Pro pomoc k porozumění vynálezu je dále definováno několik výrazů.
Výrazy nukleová kyselina a oligonukleotid se vztahují k polydeoxyribonukleotidům (obsahujícím 2-deoxy-D-ribosu)t k polyribonukleotidům (obsahujícím D-ribosu), a k jakémukoli jinému typu polynukleotidu, který je N glykosid purinové nebo pyrimidinové báze nebo modifikované purinové nebo pyrimidinové báze. Není uvažován žádný rozdíl v délce mezi výrazy nukleová kyselina a oligonukleotid a tyto výrazy budou používány zaměnitelně. Tyto výrazy se vztahují jen k primární struktuře molekuly. Tak tyto výrazy zahrnují dvouřetězcovou a jednořetězcovou DNA stejně jako dvouřetězcovou a jednořetězcovou RNA.
Výraz konvenční, v odkazu na báze nukleových kyselin, nukleosidy nebo nukleotidy se týká těch, které se vyskytují přirozeně v polynukleotidu, který je popisován. Čtyři konvenční (také nazývané jako hlavní) deoxyribonukleotidy DNA obsahují purinové báze adenin a guanin a pyrimidinové báze cytosin a thimin. Čtyři konvenční ribonukleotidy RNA obsahu jí purinové báze adenin a guanin a pyrimidinové báze uraeil a cytosin. Navíc k výše uvedeným konvenčním nebo běžným bázím existují jiné purinové a pyrimidinové deriváty nazývané vzácné nebo vedlejší báze, které se vyskytují v malých množstvích v některých nukleových kyselinách.
Jak je zde použit výraz nekonvenční s odkazem na báze nukleových kyselin, nukleosidy nebo nukleotidy, týká se vzácných neboli vedlejších bází nukleových kyselin, nukleosidů nebo nukleotidů a modifikací, derivací nebo analogů konvenčních bází nukleosidů nebo nukleotidů a zahrnuje syntetické nukleotidy mající části modifikované báze a/nebo části modifikovaného cukru (viz Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology, Vol. 26, (Sudhir Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, NJ, (1994)), a Oligonucleotides a Analogues, A Practical Approach (Fritz Eckstein, Ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford).
• ···« 44 4 4444 • 44 4 4 4 · · 4· • ··· · · · 4 4 ··· • 4 · 4 · 4444 · ··· 44 • 4 4 4 4 4 4· •44444 4 4 4 4 ·44
Oligonukleotidy mohou být připraveny jakoukoli vhodnou metodou včetně například klonování a restrikce vhodných sekvencí a přímé chemické syntézy metodou jako je fosfotriesterová metoda, Narang a kol., 1979, Meth.Enzymol.68:90-99, fosfodiesterová metoda, Brown a kol., 1979, Meth.Enzymol. 68:109-151, diethylfosforamiditová metoda, Beaucage a kol, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, a metoda tuhého nosiče z US patentu č. 4 458 066. Přehled syntézních metod je proveden v Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3):165-187, na což se tímto odkazuje.
Výraz párování bází, také označovaný v dosavadním stavu techniky jako Watson-Crickovo párování bází, se týká dobře známé vodíkové vazby komplementárních párů bází adeninthymin a guanin-cytosin v dvouřetězcové DNA struktuře, adenin-uracil a guanin-cytosin v RNA/DNA hybridní molekule a analogické vazby nekonvenčních nukleotidových párů.
Výraz hybridizace se týká tvorby dvojité struktury dvěma jednořetězcovými nukleovými kyselinami vlivem komplementárního párování bází. Hybridizace se může uskutečnit mezi zcela komplementárními řetězci nukleových kyselin nebo mezi v podstatě komplementárními řetězci nukleových kyselin, které obsahují menší oblasti chybného párování. Podmínky, za kterých jen plně komplementární řetězce nukleových kyselin buou hybridizovat, jsou označovány jako přímé hybridizační podmínky nebo sekvenčně specifické hybridizační podmínky.
Stabilní duplexy nebo v podstatě komplementárnáf sekvence mohou být dosaženy za méně přísných hybridizačních podmínek. Stupeň chybného párování, které je tolerováno, může být řízení vhodným nastavením hybridizačních podmínek. Odborníci v oboru technologie nukleových kyselin mohou určit empiricky stabilitu duplexu uvážením počtu proměnných včetně toto·· ·Φ·
například délky a koncentrace párů báze oligonukleotidů, iontové síly a výskytu chybných párů báze, podle návodu uvedeného v dosavadním stavu techniky (viz například Sambroock a kol., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York a Wetmur, 1991, Critical Review in Biochem. and Mol.Biol. 26(3/4):227-259).
Výraz primer se týká oligonukleotidu schopného působit jako bod iniciace DNA syntézy za podmínek, při kterých syntéza příměrového extenzního produktu komplementárního k řetězci nukleové kyseliny se vyvolá, to je jak v přítomnosti čtyř rozdílných nukleosidových trifosfátů, tak prostředku pro extenzi (například DNA polymerasy nebo reversní transkriptasy) ve vhodném kufru a při vhodné teplotě. Jak je zde použit, výraz primer je určen k zahrnutí oligonunkleotidů použitých v ligací zprostředkovaných amplifikačních procesech, ve kterých je jeden oligonukleotid extendován ligací na druhý oligonukleotid, který hybridizuje v přilehlé poloze.
Tak výraz extenze primerů jak je zde použit, se týká jak polymerižace individuálních nukleosidtrifosfatů užívajících primer jako bod iniciace DNA syntézy, tak ligace dvou primerů k vytvoření extendovaného produktu.
Primer je výhodně jednořetězcová DNA. Vhodná délka primerů závisí na uvažovaném použití primerů, ale typicky je v rozmezí od 6 do 50 nukleotidů. Krátké primerové molekuly obvykle vyžadují nižší teploty pro vytvoření dostatečně stabilních hybridních komplexů s matricí. Primer nereflektuje přesnou sekvenci matriční nukleové kyseliny, ale musí být dostatečně komplementární k hybridizaci s matricí. Návrh vhodných primerů pro amplifikaci dané cílové sekvence je dobře znám v dosavadním stavu techniky a popsán v zde citované literatuře.
• ·
- 12 • · e
Primery mohou začleňovat další rysy, které berou v úvahu detekci nebo imobilizaci primeru, ale nemění základní vlastnost primeru, totiž působení jako bod iniciace DNA syntézy. Například primery mohou obsahovat další sekvenci nukleové kyseliny na 5'konci, která nehybridizuje na cílovou nukleovou kyselinu, ale která usnadňuje klonování amplifikovaného produktu. Oblast primeru, která je dostatečně komplementární k matrici pro hybridizaci, se zde označuje jako hybridizační oblast.
Výrazycíl”, cílová sekvence, cílová oblast, a cílová neukleová kyselina se týkají oblasti nebo subsekvence nukleové kyseliny, která má být amplifikována.
Jak je zde použito, primer je specifický pro cílovou sekvenci, když počet chybných párů, přítomných mezi sekvencí primeru a cílovou sekvencí je menší než počet chybných párů přítomných mezi sekvencí primeru a necílovými sekvencemi, které mohou být přítomny ve vzorku. Hybridizační podmínky mohou být voleny takové, že se vytvoří jen stabilní duplexy, když počet chybných párů přítomných není větší než počet chybných párů přítomných mezi sekvencí primeru a cílovou sekvencí. Za takovýchto podmínek může primer vytvořit stabilní duplex jedině s cílovou sekvencí. Tak použití cílově specifických primerů za vhodných přísných amplifikačních podmínek umožbuje specifickou amplifikací těch cílových sekvencí, které obsahují cílová vazební místa primeru. Použití sekvenčně specifických amplifikačních podmínek umožhuje specifickou amplifikací těch cílových sekvencí, které obsahujeí přesně komplementární primerová vazební místa.
Výraz nespecifická amplifikace se týká amplifikace sekvencí nukleových kyselin jiných než je cílová sekvence, • · · · • · • · · · ♦ ··· • · ······ ···· · • · · · · · • · · · · · · která vzniká z primerů hybridizujících na sekvence jiné, než je cílová sekvence a pak slouží jako substrát pro extenzi primeru. Hybridizace primeru na necílovou sekvenci je označována jako nespecifická hybridizace a může se vyskytnout během nižší teploty, snížené přísnosti preamplifikačních podmínek.
Výraz příměrový dimer se týká na matrici nezávislého nespecifického amplifikačního produktu, který je výsledkem příměrových extenzí, kde další primer slouží jako matrice. Ačkoli primerový dimer se často ukazuje konkatamerem dvou primerů, to je dimerem, vyskytují se také konkatamery více než dvou primerů. Výraz primerový dimer je zde použit genericky, aby zahrnoval na matrici nezávislý nespecifický amplifikační produkt.
Výraz reakční směs se týká roztoku obsahujícího reagenty nutné k provedení uvedené reakce. Amplifikační reakční směs, která se týká roztoku obsahujícího reagenty nutné k provádění amplifikační reakce, typicky obsahuje oligonukleotidové primery a DNA polymerasu nebo ligasu ve vhodném pufru. PCR reakční směs” typicky obsahuje oligonukleotidové primery, termostabilní DNA polymerasu, dNTP, a kation dvojmocného kovu ve vhodném pufru. Reakční směs je zde označována jako kompletní, když obsahuje všechny reagenty nutné k umožnění rakce a nekompletní když obsahuje jen neúplnou sestavu nutných reagentů.
Odborníci v oboru vědí, že reakční složky se rutinně skladují jako oddělené roztoky, každý obsahující podsestavu celkových složek, z důvodů výhodnosti, stability skladování, nebo pro umožnění pro aplikaci závislého nastavení koncentrací složek a že složky jsou sdruženy před reakcí, aby se vytvořila kompletní reakční směs. Dále odborníci v oboru vědí, že reakční komponenty se balí odděleně pro obchod a že výhodné komerční kity mohou obsahovat jakoukoli podsestavu reakčních komponentů, která zahrnuje modifikované primery tohoto vynálezu.
• · ···· · ··· · ··· • · » · ······ ··· · · • · · * · · ♦ · ······ ·· · · · · ·
- 14 Modifikované primery
Amplifikační primery tohoto vynálezu jsou modifikovány kovalentním připojením skupiny k jednomu ze čtyř nukleotidů v 3' terminálním konci primerů.
Při jednom provedení modifikovaný primer tohoto vynálezu sestává ze sekvence nukleové kyseliny o obecné struktuře
R R
I I
5' -S^^-N-3' nebo 5' -S1 -N-S2~3', kde
Sj představuje první sekvenci nukleotidů mezi asi 5 až 50 nukleotidy v délce,
S2 představuje druhou sekvenci mezi 1 až 3 nukleotidy v délce,
N představuje nukleotid takový, který obsahuje purinovou nebo pyrimidinovou bázi, která obsahuje exocyklický amin,
R představuje modifikátorovou skupinu, kde R je kovalentně vázán k N přes exocyklický amin a kde R má dále popsanou strukturu.
Jak je ukázáno v příkladech provedení, účinek modifikace je maximalizován, když je modifikace na 3'terminálním nukleotidu. Tak výhodně primer obsahuje modifikovaný 3'terminální nukleotid.
Modifikovaný nukleotid je vybrán z těch, jejichž báze obsahuje exocyklický amin, který je zahrnut při párování bází nukleotidu s jeho komplementárním nukleotidem.
- 15 Typicky primery jsou DNA obsahující jen konvenční nukletidy. Ze čtyř konvenčních nukleotidových bází zjištěných v DNA adenin, guanin a cytosin obsahují exocyklický primární amin, který je zahrnut při párování bází s komplementární bází.
Ve výhodném aspektu tohoto vynálezu je primer modifikován připojením jedné modifikátorové skupiny k exocyklickému aminu substitucí za jeden ze dvou vodíků aminové skupiny, které v nemodifikované bázi jsou schopny být zahrnuty při párování bází. Struktury modifikovaných nukleotidů obsahujících modifikovanou adeninovou, guaninovou a cytosinovou bázi jsou znázorněny níže, kel &
S představuje cukernou část a
R představuje modifikátorovou skupinu.
Předložený vynález není omezen na primery sestávající z konvenčních nukleotidů. Jakýkoli nukleotidový analog, ve kterém část báze obsahuje exocyklický primární amin, který je začleněn při párování bází s komplementární bází, je modifikovatelný jak je zde popsáno. Příklady nekonvenčních nukleotidů zahrnují 3-methyladenin, 7-methylguanin, 3-methylganin,
5-methylcytosin a 5-hydroxymethylcytosin.
- 16 Modifikátorová skupina omezuje schopnost modifikované báze participovat při vodíkové vazbě, poněvadž modifikátor substituuje za jeden atom vodíku. Zbývající vodíkový atom může ještě participovat při vodíkové vazbě. Modifikátory mohou tudíž ovlivnit jak kinetiku, tak hydrodynamiku hybridizace. Různé modifikátorové skupiny jsou předvídány, které mají následující vlastnosti.
1. Interferují s, ale nezabránují, Watson-Crickovu párování bází modifikované báze s komplementární bází.
2. Interferují s, ale nezabránují extenzi modifikovaného primeru a
3. umožňují syntézu řetězce komplementárního k extenznímu produktu modifikovaného primeru.
Modifikátorová skupina stericky zasahuje do párování bází a tak do extenze primeru. Takto fyzikální objem modifikátoru ovlivňuje stupeň interference s hybridizací. Když je modifikovaný adenosinový nebo cytidinový nukletid začleněn do dvouřetězcové nukleové kyseliny, modifikátorová skupina se zasune do centrálního prostoru hlavní rýhy. Tudíž dokonce relativně velké modifikátorové skupiny by měly vyvolat malou sterickou poruchu duplexní struktury. Avšak vhodné modifikátory nejsou tak veliké tak, že vodíková vazba je znemožněna nebo enzymatická extenze 3'-hydroxylu primeru je znemožněna. Když je modifikovaný guanosinový nukleotid začleněn do dvouřetězcové nukleové kyseliny, modifikovaná skupina se zasune do vedlejší rýhy, která vytváří méně prostoru k akomodaci objemu modifikátorové skupiny. Tudíž menší modifikátorové skupiny mají přednost pro připojení k guaninové bázi.
• ♦ · · • ·
- 17 Příměrové extenzní produkty, které se užívají jako matrice v následujících amplifikačních cyklech, obsahují modifikovanou bázi zavedenou primerem. Modifikátorová skupina je volena tak, že přítomnost modifikované báze v matrici nevyvolá terminaci extenze primeru nebo inhibici extenze primeru. Výhodně povaha modifikátorové skupiny by neměla působit růst mutagenních událostí, čímž by se ztratila identita modifikované báze při replikaci od primeru odvozené matrice. Účinek modifikované báze v matrici na extenzi primeru mohou být rutinně testovány podle návodu zde uvedeného a známého v dosavadním stavu techniky (viz například Gniazdowski a Cera, 1996, Chem.Rem. 96:619-634).
Modifikované skupiny R, které splňují výše uvedené vlastnosti jsou vhodné pro použití při metodách tohoto vynálezu.
Výhodné modifikátorové skupiny mají strukturu
I
R. - C - R9
I
H kde R^ a R2 představují nezávisle vodík, Cl-C10 alkylovou skupinu, alkoxyskupinu, fenylovou skupinu, fenoxyskupinu, substituovanou fenylovou skupinu, naftylovou skupinu nebo substituovanou naftylovou skupinu.
Alkylová skupina může být rozvětvená nebo lineární. Větší alkylové skupiny až alespoň k mohou být také použity.
• · · · • · · ····· • · · · ·· ·· • · · • · · • · · · ·
Při výhodném provedení R je 2-naftylmethylová skupina, benzylová skupina nebo substituovaná benzylová skupina. Výhodné substituované benzylové skupiny mají strukturu kde Rg představuje C^-Cg rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, výhodněji C^-C^ rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, methoxyskupinu nebo nitroskupinu. C^-C^ rozvětvená nebo lineární alkylová skupina jsou methyl, ethyl, propyl, butyl, isopropyl, isobutyl, terc.butyl a podobně.
Methyl a terc.butyl jsou výhodnými alkylovými skupinami. Výhodně je R^ připojen v para poloze.
Zvlášř výhodné modifikátorové skupiny R jsou znázorněny dále:
benzyl p-methylbenzyl p-terc.butylbenzyl
N02 p-methoxybenzyl o-nitrobenzyl
2-naftylmethyl • · ·
9
9 9 9
9 99
999
9 9 99
99
99 9
Početné vhodné modifikátorové skupiny jsou popsány v příkladech provedení. Obecně empirická selekce příslušné vhodné modifikátorové skupiny ze třídy popsaných sloučenin může být provedena rutinně odborníky v oboru podle zde uvedeného návodu. Výhodně vhodnost příslušné skupiny je určena empiricky za použití modifikovaných primerů při amplifikační reakci. Úspěšná amplifikace indikuje jak to, že modifikovaná báze neinhibuje zcela extenzi primeru, tak, že přítomnost modifikované báze v odvozeném primerovém templátu nevyvolá terminaci extenze primeru. Redukce příměrového dimeru je určena jak je popsáno v příkladech provedení.
Primery s fotolabilní modifikací
V alternativním provedení vynálezu jsou primery modifikovány jednou nebo více fotolabilními skupinami, které mohou být odstraněny vystavením záření potom, kdy reakce dosáhla vysokoteplotních reakčních podmínek, které zajišťují specifičnost. Poněvadž modifikátor je odstraněn před extenzí primeru, modifikovaný primer nemusí být extendovatelný před odstraněním skupiny. Příklady fotolabilních modifikátorů, které mohou být použity při metodách tohoto vynálezu jsou popsány v Pillai, 1980, Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis, Synthesis: 1-26.
Výhodně jsou fotolabilní primery tohoto vynálezu modifikovány na 3' terminálu nukleotidu připojením jedné nebo dvou o-nitrobenzylových skupin:
U primerů modifikovaných připojením jedné nitrobenzylové skupiny k exocyklickému primárnímu aminu části báze, výsledný sekundární amin stále ještě může participovat při párování bází, jestliže je aminová skupina otočena tak, že zbývající vodík je orientován směrem k komplementární bázi. Jak je popsáno v příkladech, tyto primery mohou být použity při amplifikaci jak s nebo bez odstranění ozářením UV světlem.
Primery modifikované připojením dvou nitrobenzylových skupin k exocyklickému aminu báze nemohou být extendovány. Inhibice pravděpodobně vyplývá z nemožnosti modifikované báze podstoupit párování bází, které je vyloučeno, poněvadž oba vodíky exocyklického aminu jsou nahraženy objemnými nitrobenzylovými skupinami. Použití primerů modifikovaných dvěma nitrobenzylovými skupinami při amplifikaci, ve které reakční směs byla vystavana UV záření po dobu dostatečnou k odstranění nitrobenzylových skupin, čímž se umožní uskutečnění extenze primerů, je popsáno v příkladech provedení.
Při alternativním provedení se modifikátorová skupina připojí ke kruhovému dusíku. Primery modifikované připojením nitrobenzylové skupiny ke kruhovému dusíku báze nemohou být extendovány vlivem nemožnosti modifikované báze podstoupit párování bází. Odstranění nitrobenzylových skupin vystavením UV záření umožfíuje uskutečnění extenze primerů.
Použití fotolabilních primerů, které nemohou být extendovány, dokud se neodstraní modifikátorová skupina, v podstatě zajišřuje amplifikace horkého startu. Extenze primeru je inhibována během nespecifických předreakčních podmínek. Reakční směs je ozářena a primery deblokovány jen po zvýšení reakční teploty na teplotu, která zajišřuje specifičnost reakce.
♦ · 4 • · ·· 99 • 9 9
9 99 • 99 4 • 4
Syntéza modifikovaných primerů
Syntéza modifikovaných primerů se provádí za použití standardních chemických prostředků dobře známých v dosavadním stavu techniky. Metody zavádění těchto modifikátorů mohou být rozděleny do čtyř skupin.
1. Modifikátor může být zaveden použitím modifikovaného nukleosidu jako DNA syntézního nosiče.
2. Modifikátor může být zaveden použitím nukleosidu jako je fosforamidit.
3. Modifikátor může být zaveden použitím reagentu během DNA syntézy (například benzylaminové zpracování konvertibilního amiditu, když je začleněn do DNA sekvence).
4. Postsyntetická modifikace. Modifikátor může být zaveden jako reaktivní reagent, když je ve styku se syntetickou DNA.
Syntéza příslušných modifikovaných primerů je popsána v příkladech provedení. Další modifikované primery mohou být syntetizovány za použití standardních syntézních metod analogickým způsobem.
Výhodně jsou modifikované primery syntetizovány za použití syntézního nosiče, derivatizovaného skla s řízenými póry (CPG). Obecné reakční schéma pro syntézu derivatizovaného dA CPG je znázorněno v obr. 6. Příslušné modifikátorové skupiny mohou být pllidány použitím příslušného alkylhalogenidového, benzylhalogenidového, substituovaného benzylhalogenidového, methylnaftylhalogenidového nebo substituovaného methylnaftylhalogenidového alkylačního prostředku.
- 22 Syntézy benzyl- a p-terc.butylbenzyl-dA CPG se popisují v příkladech 1 až 2 sledujících schéma znázorněné v obr. 6.
Alkylace exocyklické aminoskupiny může být provedena použitím metod analogických k methylaci popsané v Griffin a Reese, 1963, Biochim.Acta 68:185-192. Další syntézní metody jsou popsány v Aritoma a kol., 1995, J.Chem.Soc.Perchim Trans. 1:1837-1849.
Amplifikace užívající modifikované primery
Způsoby tohoto vynálezu zahrnují provádění amplifikace na bázi primerů užívající modifikované primery tohoto vynálezu. Obecně modifikované primery mohou být substituovány za nemodifikované primery obsahující tytéž nukleotidové sekvence při amplifikaci na bázi primerů s žádnou změnou při reakčních podmínkách amplifikace. Ovšem odborník v oboru rozpozná, že rutinní malá reoptimizace reakčních podmínek může být při některých reakcích výhodná.
Při výhodném provedení modifikované primery tohoto vynálezu se používají při reakci polymerasového řetězce (PCR). Avšak vynález není omezen na nějaký vhodný araplifikační systém. Modifikované primery tohoto vynálezu mohou být použity v jakémkoli amplifikačním systému na bázi primerů, ve kterém může být vytvořen primerový dimer nebo nespecifický amplifikační produkt. Příklady zahrnují amplifikační metody popsané v odkazech výše uvedených. Jako jsou vyvinuty jiné systémy, tyto systémy se mohou vylepšit prováděním tohoto vynálezu.
Metody tohoto vynálezu jsou vhodné pro amplifikaci bučí DNA nebo RNA. Například amplifikace RNA užívající reversní transkripci/reakce polymerasového řetězce (RT-PCR) je dobře známa v dosavadním stavu techniky a popsána v US patentech * · • •to • · ·« · číslo 5 322 770 a 5 310 652, Myers a Gelfant, 1991, Biochemistry 30 (31):7661-7666, Young a kol., 1993, J.Clin.Microbiol. 31(4):882-886, a Mulder a kol. 1994, J.Clin.Microbiol. 32(2):292-300.
Při amplifikaci na bázi primerů se provádí extenze primeru typicky při zvýšené teplotě za použití termostabilního enzymu jako je termostabilní DNA polymerasa. Enzym iniciuje syntézu na 3'konci primerů a probíhá ve směru k 5'konci matrice, dokud syntéza nekončí. Čištěné termostabilní DNA polymerasy užitečné při amplifikačních reakcích jsou dobře známy ve stavu techniky, ale nejsou tím omezeny, enzymy popsané v US patentu č. 4 889 818, US patentu č. 5 079 352, US patentu č. 5 352 600, US patentu č. 5 491 086, WO 91/09950, WO 92/03556, WO 92/06200, WO 92/06202, WO 92/09689, a v US patentu číslo 5 210 036. Přehled termostabilních DNA polymeras je uveden v Abramson, 1995, v PCR Strategies, (Ed.M.A.Innis a kol.), str. 39-57, Academie Press, San Diego.
Při výhodném provedení, zejména pro amplifikaci DNA se amplifikace provádí za použití reversibilně inaktivovaného enzymu, jak je popsáno. Použití reversibilně inaktivovaného enzymu, který je reaktivován za vysokoteplotních reakčních podmínek, dále redukuje nespecifickou amplifikaci inhibicí extenze primerů před začátkem reakce. Reversibilní inaktivovaná termostabilní DNA polymerasa vyvinutá a vyráběná Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ) a prodávaná Perkin Elmer (Norwalk, CT), je popsána v Birch a kol., 1996, Nátuře, 381 (6581): 445-446.
Účinek modifikátorové skupiny na schopnost enzymu extendovat primer závislý zčásti na příslušném enzymu a zčásti na vybraných reakčních podmínkách. Například Tth DNA polyme2+ rasa je permisivnější, když Mn se použije jako dvojmocný ··· • ·· · ·· ··
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 99
999 9 9999 9 999 9 9
9 9 9 9 9 9
999999 99 9 99 99
- 24 2+ kation jako pri některých RNA amplifikacích, spíše než Mg Odborník v oboru ví, že při rutinní selekci vhodné modifikátorové skupiny budou brány v úvahu enzym a reakční podmínky.
Příkladné přípravné metody vhodné pro amplifikační reakce jsou dobře známy v dosavadním stavu techniky a plně popsány ve zde citované literatuře. Vhodná použitá metoda není kritickou částí tohoto vynálezu. Odborník v oboru může optimalizovat reakční podmínky pro použití známých příkladných přípravných metod.
Metody analyzování amplifikované nukleové kyseliny jsou dobře známy ve stavu techniky a plně jsou popsány ve zde citované literatuře. Příslušná použitá metoda není kritickou částí tohoto vynálezu. Odborník v oboru může vybrat vhodú nou analýzní metodu v závislosti na aplikaci.
Výhodná metoda pro analýzu amplifikační reakce je monitorování růstu celkového množství dvouřetězcové DNA v reakční směsi, jak je popsáno v Higuchi a kol., 1992, Bio/Technology 10:413-417, Higuchi a kol. 1993, Bio/Technology 11:1026-1030, Evropské patentové publikace č. 512 334 a 640 828. Při této metodě, označované zde jako kinetická PCR, detekce dvouřetězcové DNA spočívá na zvýšené fluorescenci, kterou ethidiumbromid (EtBr) a jiné DNA vazební značkovače vykazují když jsou vázány k dvouřetězcové DNA. Amplifikace se provádí v přítomnosti značkovače. Vzrůst dvouřetězcové DNA vyplývající ze syntézy cílových sekvencí, vede k zaznamenatelnému růstu fluorescence, který je monitorován během áplifikace. Tak tyto metody umožHují monitorování postupu amplifikační reakce.
V kinetické PCR, měřená fluorescence závisí na celkovém množství přítomné douřetězcové DNA, a€ vyplývající z ne«·*·· ·· · · · ·· ·· · · · · · · · · • ··· · · · · 9 · ·· « · 9 9 9 9999 9 999 · 9
9 9 9 9 9 9 9
999 999 99 9 99 99 specifické amplifikace nebo z amplifikace cílové sekvence. Monitorování fluorescence umožHuje měření vzrůstu celkového množství dvouřetězcové DNA, ale vzrůst vyplývající z amplifikace cílové sekvence není měřen nezávisle od vzrůstu vyplývajícího z nespecifického amplifikačního produktu.
Modifikované primery tohoto vynálezu jsou zvlášť užitečné při kinetické PCR, poněvadž nejen snižují množství vytvořeného primerového dimeru, ale také brzdí tvorbu zjistitelných množství primerového dimeru. Zpoždění tvorby primerového dimeru až po významném vzrůstu cílové sekvence umožňuje nezávislé monitorování amplifikace cílových sekvencí a minimalizuje interferenci od primerového dimeru.
Kity
Předložený vynález se také týká kitů (sestav), multikontejnerových jednotek zahrnujících užitečné komponenty pro provádění předloženého způsobu. Užitečné kity obsahují primery, z nichž alespoň jeden je modifikován jak je zde popsáno pro amplifikací nukleové kyseliny.
Jiné volitelné kompponenty kitu zahrnují například prostředek pro katalýzu syntézy extenzního produktu primeru, substrátové nukleosidové trifosfaty, vhodné reakční pufry a instrukce pro provádění tohoto způsobu.
···· • · 4 · · · · • 4 4 · · · · 4 · 4 • ··· · 4 · 4 · ··· • 4 · · 4 4··4 · 444 44 • · · · ·444
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Syntéza primerů modifikovaných benzylovou skupinou
Primery modifikované adicí benzylové skupiny byly syntetizovány jedním z dvou postupů, které jsou dále popsány. Primery modifikované na 3'terminálu báze, byly syntetizovány za použití N6-benzyldeoxyadenosin skla s řízenými póry (CPG) k iniciaci syntézy DNA. Primery modifikované v interní bázi byly syntetizovány za použití N^-benzyldeoxyadenosinfosforamiditu.
V tomto příkladu jsou používány následující standardní
| zkratky. | |
| DMAP | 4-dimethylaminopyridin |
| DMF | N,N-dimethylformamid |
| TEA | triethylamin |
| EDC | l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropylJkarbodiimidhydrochlorid |
| THF | tetrahydrofuran |
| DMT | 4,4'-dimedthoxytrityl |
| LCAA-CPG | alkylamino s dlouhým řetězcem sklo s řízenými póry. |
£
I. Syntéza N -benzyldeoxyadenosin CPG
Stupeň 1: Syntéza N®-benzoyl,N®-benzyl,5'-0-DMT-2'-deoxyadenosinu
Do H^-benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)2'-deoxyadenosinu (657 mg, 1,0 mmol, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), byl přidán pyridin (10 ml) a směs byla vysuHena odpařením za vakua.
- 27 To bylo opakováno. Výsledná pěna byla rozpuštěna v bezvodém DMF (15 ml, Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI) a ochlazena na 5 °C. Hydrid sodný (44 mg, 1,1 mmol, 1,1 ekv., 60%ní disperze v oleji) byl přidán pod argonovou atmosférou a míchán při teplotě místnosti po dobu 45 minut. Benzylbromid (143 mikrolitrů, 206 mg, 1,2 mmol, 1,2 ekv., Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) byl přidán během 2 minut a směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Směs byla vysušena odpařením za vakua a zbytek byl rozdělen mezi ethylacetat a vodu (každého 10 ml) a extrahován. Vodná fáze byla reextrahována ethylacetatem (10 ml) a sloučené extrakty byly vysušeny nad bezvodým síranem hořečnatým, zfiltrovány a odpařeny.
Surový produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (75 g) za použití methanolu, triethylaminu, methylenchloridu (3:0,5:96,5). Frakce obsahující produkt byly sloučeny a vysušeny odpařením, čímž se získal 6 6 očekávaný N -benzoyl,N -benzyl,5'-O-DMT-2'-deoxyadenosin (410 mg, 54 %). Struktura produktu byla potvrzena NMR.
Stupeň 2: Sukcinylace
Do N^-benzoyl-N^-benzyl-5'-O-DMT-2'-deoxyadenosinu (295 mg, 0,39 mmol) byl přidán pyridin (10 ml) a směs byla vysušena odpařením za vysokého vakua. Tento stupeň byl opakován. Byl přidán čerstvý bezvodý pyridin (10 ml) spolu s anhydridem kyseliny jantarové (200 ml, 2 mmol, 5,0 ekv.) a DMAP (24 mg) a roztok byl míchán pod argonovou atmosférou přes noc při teplotě místnosti. Objem rozpouštědla byl odstraněn za vakua a zbytek byl rozdělen mezi methylenchlorid (20 ml) a roztok citranu sodného (20 ml, 0,1 M, pH 5,0) a extrahován.
• 9 · «··· • · ··· ·
- 28 Vodná fáze byla extrahována dalším methylenchloridem (20 ml) a sloučené extrakty byly vysušeny nad bezvodým síranem sodným, zfiltrovány a vysušeny odpařením. Produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (4,5 g) za použití ethylacetatu, triethylaminu, methylenchloridu (32:1:67), čímž se
6 získal 3'-sukcinatester,N -benzoyl-N -benzyl-3'-O-sukcinat5'-0-DMT-2'-deoxyadenosin (247 mg), 74 %).
Stupeň 3: Derivatizace CPG
Kyselinou promyté CPG bylo připraveno následovně: LCAA-CPG (1,0 g, LCA 00500C, 50 nm, 88,6 mol/g, CPG lne., Faifield, NJ) bylo promyto dichloroctovou kyselinou v dichlormethanu (2%ní, 20 ml) periodickým vířením po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Kyselinou promyté CPG bylo zfiltrováno na skleněné fritě a promyto dichlormethanem až bylo bez kyseliny. Prášek byl vysušen na vzduchu, pak vysušena za vakua při teplotě místnosti přes noc.
Vazba modifikovaného nukleosidintermediatu ke kyselinou promytému CPG byla provedena následovně. Do roztoku N6-benzoylN^-benzyl-3'-0-sukcinat-5'-0-DMT-2'-deoxyadenosinu (170 mg, 0,2 mmol) připraveného jak je výše popsáno, v dichlormethanu (10 ml) byl přidán TEA (100 mikrolitrů) a roztok byl koncentrován na asi 5 ml pod atmosférou argonu. Postupně byly přidány DMAP (12 mg, 0,1 mmol, 0,5 ekv.), TEA (100 mikrolitrů), EDC (384 mg, 2,0 mmol, 10 ekv.) a kyselinou promyté CPG.
Byl přidán bezvodý pyridin (5 ml) a směs byla uzavřena a třepána 3 dny při teplotě místnosti. CPG bylo odfiltrováno za vakua a promyto důkladně isopropanolem, pak dichlormethanem, vysušeno vzduchem, pak za vakua po dobu 1 hodiny.
····
- 29 • Φ · φφ φ · · · • ··· · φ φ · • · · · · ···· · • · · · · • ΦΦ ··· ·· 9
ΦΦ ΦΦ • · ·· •· ·· • · 9 β9
99
ΦΦ··
Úprava čepičkou derivatizovaného CPG byla provedena následovně. Do suchého derivatizovaného CPG byly přidány roztoky Cap A a Cap B (každý 5 ml, acetanhydrid/2,6-lutidin/THF a 10%ní N-methylimidazol v THF, Glen Research DNA synthesis reagens, Sterling, VA) a směs byla třepána po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. CPG bylo zfiltrováno za vakua a promyto důkladně isopropanolem, pak dichlormethanem, vysušeno vzduchem a pak vysušeno za vakua přes noc.
II. Syntéza N -benzyldeoxyadenosinfosforamiditu
N -benzoyl,N -benzyl,5'-0-DMT-2'-deoxyadenosin byl syn-
6 tetizován jak je výše popsáno. Do N -benzoyl,N -benzyl,5'-0DMT-2'-deoxyadenosinu (196 mg, 0,26 mmol) v suchém THF (8 ml) byl přidán diisopropylethylamin (350 mikrol., 270 mg, 2,04 mmol, 7,8 ekv.) a 2-kyanethyl-N,N-diisopropylchlorfosforamidit (161 mg, 0,68 mmol, 2,6 ekv., Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI), a směs byla míchána po dobu 30 minut při teplotě místnosti pod argonovou atmosférou.Rozpouštědlo bylo odstraněno za vakua a zbytek byl rozdělen mezi roztok hydrogenuhličitanu sodného (5%ní, 20 ml) a ethylacetat (20 ml). Organická fáze byla promyta roztokem hydrogenuhličitanu, vodou a nasycenou solankou (každý 20 ml) popořadě, vysušena nad síranem sodným, zfiltrována a odpařena. Zbytek byl vyčištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (4 g) za použití směsi aceton/hexan/TEA (34:65:0,7), čímž se získal požadovaný fosforamidit (248 mg, 100 %).
• ·
III. Syntéza DNA, čištění a analýza
Benzylem derivatizovaný adenosin CPG (25 mg, 1,0 mol) byl převeden do prázdných syntézních kolon (Glen Research Sterling WA) a ty byly použity k přípravě oligonukleotidů na ABI 374 DNA syntetizéru (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) za použití konvenčních syntézních a deprotekčních podmínek. Surová DNC-DNA byla vyčištěna a převedena na 5'-hydroxy-DNA standardním DMT on/off HPLC za použití Rainin Pure DNA kolony na Rainin HPLC systému (Rainin Instrument Co., Woburn, MA) . Oligonukleotidy byly analyzovány za použití ABI kapilárního elektroforézního systému (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) nebo denaturační aniontoměnné HPLC ohromatografie na Dionex Nucleopak koloně (Dionex Corp., Sunivale, CA).
Podobně byla provedena syntéza interně modifikovaných primerů za použití nemodifikovaného CPG a modifikovaného fosforamiditu, jak je výše uvedeno.
Příklad 2
Syntéza primerů modifikovaných terc.butylbenzylskupinou
Předložený příklad popisuje syntézu primerů modifikovaných 3'terminálu adenosinu p-terc.butylbenzylovou skupinou. Modifikované primery byly syntetizovány v podstatě jak je g popsáno v příkladu 1, ale za použití N -(p-terc.butylbenzyl)deoxyadenosin CPG. Syntéza derivatizovaného CPG je popsána dále.
····· «·· ·· ·· ··· ··· ···· ···· · · · · · ··· • · · · · ···· · ··· · · • · · · · · · · ······ · · · · · · ·
Stupeň 1
Syntéza N^-benzoyl'N^- (p-terc.butylbenzyl) -5' -O- (4,4' -dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosinu
Do N -benzoyl-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosinu (658 mg, 1,0 mmol) byl přidán DMF (bezvodý, 10 ml) a odpařeno do sucha. To bylo opakováno. Čerstvý DMF (10 ml) byl přidán pod argonovou atmosférou. Byl přidán hydrid sodný (44 mg, 60%ní v oleji, 1,1 mmol) a směs byla míchána po dobu 0,5 hodin při teplotě místnosti. Po kapkách byl přidán 4-(terc.butylJbenzylbromid (272 mg, 1,2 mmol) a mícháno při teplotě místnosti přes noc. Rozpouštědlo bylo odstraněno za vakua a zbytek byl rozdělen mezi ethylacetat a vodu (20 ml každého). Organická fáze byla promyta vodou (třikrát, 20 ml), vysušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a odpařena do sucha. Surový produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (100 g), za použití směsi methylenchlorid:methanol: triethylamin 96,5:3:0,5, čímž se získal j®N -benzoyl-N -(pterc.butylbenzyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosin (229 mg, 28,5 %).
Stupeň 2
Sukcinylace
N^-benzoyl-Νθ-(p-terc.butylbenzyl)-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl) -2' -deoxyadenosin (217 mg, 0,27 mmol) byl zpracován s anhydridem kyseliny jantarové (135 mg, 5 ekv.) a DMAP (17 mg, 0,5 ekv.) v pyridinu (10 ml). Zpracování a chromatografie jak
6 je popsáno v příkladu 1 daly N -benzoyl-N -(p-terc.butylbenzyl )-5'-0-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosin, 3'-0sukcinat (199 mg, 82 %).
- 32 Stupeň 3: Derivatizace CPG
Sukcinat (180 mg, 0,2 mmol) ze stupně 2 byl zpracován s kyselinou promytým LCAA-CPG jak je popsáno v příkladu 1. CPG byl upraveno čepičkou a vakuově vysušeno, čímž se získal N^-benzoyl-Νθ-(p-terc.butylbenzyl)-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-deoxyadenosin, 3'-O-sukcinat derivatizovaný CPG, (1,065 g).
Příklad 3
Syntéza primerů modifikovaných methylovou skupinou
Primery modifikované v 3'terminálu adenosinu methylovou skupinou byly syntetizovány za použití N^-methyl dA CPG (22 mg, 1 mikrom., Glen Research, Sterling, WA). N^-methyl dA CPG byl umístěn v prázdné syntézní koloně a primery byly připraveny podle standardních podmínek syntézy a deprotekce. Primery byly vyčištěny za použití DMT on/off HPLC postupu jak je popsáno v příkladu 1.
Příklad 4
Syntéza fotolabilních modifikovaných primerů
Předložený vynález popisuje syntézu primerů modifikovaných na 3'terminálu adenosinu bučí jednou nebo dvěma nitrobenzylovými skupinami. Modifikované primery byly syntetizovány v podstatě jak je popsáno v příkladu 1, ale za použití bud mononitrobenzyl dA CPG nebo bisnitrobenzyl dA CPG.
I. Mononitrobenzylované primery
6
Obecná metoda pro syntézu N -benzoyl-N -benzyl-2'-deoxyadenosinem derivatizovaného CPG (viz příklad 1) byla aplikována na syntézu N -benzoyl-N -ortho-nitrobenzyl-2'-deoxyadenosinem derivatizovaného CPG substitucí ortho-nitrobenzylbromidu jako alkylačního prostředku. Následné stupně pro CPG byly identické jako ty, které jsou popsány v příkladu 1 s přídavkem, že meziprodukty byly chráněny od okolního světla zabalením reakčních baněk do hliníkové folie.
Podle syntézy derivatizovaného CPG byly primery syntetizovány jak je popsáno v příkladu 1, ale byly izolovány extrakcí na nerozpustném nosiči za použití Nensorb Prep prodávaných kolon (NEN Research Products Biotechnology Systems, Du Pont Company, Boston, NA) za použití protokolů popsaných výrobcem.
II. Bisnitrobenzylované primery
Bisnitrobenzyldeoxyadenosin CPG bylo syntetizováno jak je dále popsáno. Podle syntézy derivatizovaného CPG byly primery syntetizovány a čištěny, jak je popsáno pro mononitrobenzylové primery.
£
Stupeň 1: Syntéza 5'-O-DMT-N -bis-ortho-nitrobenzyl-2'-deoxyadenosinu
2-Deoxyadenosinmonohydrat (538 mg, 2,0 mmol, Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) byl vysušen odpařením s bezvodým pyridinem (2 x, 10 ml) za vakua. Zbytek byl rozpuštěn v bezvodém DMF (10 ml, Aldrich, Milwaukee, WI) pod argonovou atmosférou a byl přidán hydrid sodný (88 mg, 2,2 mmol, 1,1 ekv., 60%ní disperze v oleji) a mícháno po 40 minut při teplotě místnosti.
- 34 -. * φφφφ • φ ♦ · « φ φ · • · · · φ · · · φ · φ • · · ΦΦΦΦ·· ···· · • · · · φ φ · φφφ φφ φ φφ φφ
Byl přidán 2-nitrobenzylbromid (710 mg, 3,3 mmol, 1,5 ekv.) a roztok byl míchán po dobu 4 hodin při teplotě místnosti. DMF byl odstraněn odpařením za vakua a zbytek byl rozdělen mezi ethylacetat a vodu (20 ml každého). Vodná fáze byla extrahována ethylacetátem (20 ml) a sloučené extrakty byly promyty vodou (20 ml) a vysušeny nad síranem sodným, zfiltrovány a odpařeny. Surový produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (50 g, za použití 3%ního MeOH v CH2Cl2),p čímž se získal 2'-deoxy-N®-bis-ortho-nitrobenzyladenosin (320 mg, 30 %).
Do 2*-deoxy-N^-bis-ortho-nitrobenzyladenosinu (200 mg, 0,518 mmol) byl přidán bezvodý pyridin (10 ml) a odpařeno do sucha. Pyridin (10 ml) byl přidán, načež následoval přídavek 4,4'-dimethoxytritylchloridu (900 mg, 2,3 mmol, 4,5 ekv.) a triethylaminu (280 mg, 2,76 mmol, 4,0 ekv.) a směs míchána při teplotě místnosti pod argonovou atmosférou po dobu 5 hodin. Byla přidána voda (0,5 ml) a mícháno po dobu 20 minut. Směs byla rozdělena mezi ether a vodu (20 ml každého) a vodná fáze byla reextrahována etherem (20 ml). Extrakty byly sloučeny a promyty vodou (20 ml) a vysušeny nad bezvodým síranem sodným, zfiltrovány a odpařeny. Materiál byl vyčištěn chromatograf ií na silikagelu (4 g) za použití 0,7 až 2,0 5%ního methanolu v methylenchloridu), čímž se získal 5'-O-DMT-N^-bisortho-nitrobenzyl-2’-deoxyadenosin, (121 mg, 33 %).
Stupeň 2: Sukcinylace
5'-O-DMT-N^-bis-ortho-nitrobenzyl-2'-deoxyadenosin (121 mg, 0,145 mmol) byl vysušen odpařením s bezvodým pyridinem (2 x, ml). Pyridin (3 ml), anhydrid kyseliny jantarové (58 mg,
0,58 mmol, 4 ekv.) a DMAP (11 mg, katalytický) byly přidány a roztok byl míchán při teplotě místnosti po dobu 3 dnů.
• 9 9 9«9 ·« • · · 9 9 99
9 9 9 9 999
9 9 99999 · 9 9 9·9 • 9 9 9 9 99
99999* *9 9 *999
Roztok byl odpařen za vakua a zbytek byl rozdělen mezi methylenchlorid (10 ml) a sodnocitratový pufr (0,1 M, pH 5,0, 10 ml). Organická fáze byla vysušena nad bezvodým síranem sodným, zfiltrována a odpařena do sucha. Surový produkt byl vyčištěn chromatografií na silikagelu (2 g, za použití EtOAcsCE^CljJ :TEA, 32:67:1 10 ml, pak MeOHzCI^C^, 3:97, 25 ml), čímž se získala bleděžlutá pěna 5-0-DMT-N^-bis-ortho-nitrobenzyl-2deoxyadenosin-3'-O-sukcinatu (138 mg, 99,5 %).
Stupeň 3: Derivatizace CPG
Kyselinou promyté LCAA-CPG bylo připraveno jako v příkladu 1.
Spojení modifikovaného nukleosidového meziproduktu s kyselinou promytím CPG bylo provedeno následovně.
5'-O-DMT-N^-bis-ortho-nitrobenzyl-2'-adenosin-3 *-O-sukcinat (37 mg, 0,04 mmol) byl zpracován s TEA (16 (1) v jantarově zbarvené skleněné ampuli a odpařeno. K tomuto zbyteku byl přidán bezvodý pyridin (1,5 ml), TEA (2 mikrol.), DMAP (2,4 mg), EDC (76 mg, 0,04 mmol) a kyselinou promyté LCAA-CPG (200 mg) a směs byla třepána na oběhovém mixéru po dobu 3 dnů při teplotě místnosti. CPG bylo zfiltrováno za sníženého tlaku a promyto důkladně isopropanolem, pak methylenchloridem, vysušeno na vzduchu, pak vysušeno za vakua po dobu 1 hodiny.
Opatření čepičkou derivatizovaného CPG bylo provedeno jak je popsáno v příkladu 1.
Příklad 5
Amplifikace za použití efektu modifikovaných primerů pozice modifikovaného nukleotidu ····· ·· · « · ·· ·· · «·· ···« • ··· · ··· · ··· • · · · · ···« · ·«· · · • ···· · · · ······ ·· « ·· · ·
- 36 K demonstraci účinku modifikovaných primerů na tvorbu příměrového dimeru byla provedena srovnání amplifikací HIV-1 RNA za použití jak modifikovaných primerů tak nemodifikovaných primerů. Navíc k určení účinku pozice modifikovaného nukleotidu na snížení příměrového dimeru byly provedeny amplifikace užívající 3 různé protisměrně modifikované primery, které se lišily jen v lokaci modifikované báze.
Cílová neukleová kyselina
HIV-1 RNA matrice byly syntetizovány za použití HIV-1 RNA transkripčního vektoru v podstatě jak je popsáno v Mulder a kol., 1994, J.Clin.Microbiol. 32(2):292-300.
Primery
Amplifikace byly provedeny za použití jak nemodifikovaných tak modifikovaných primerů. Nukleotidové sekvence nemodifikovaných primerů jsou uvedeny níže, orientovány v 5'-3' směru. Protisměrný primer RAR1032MB (sekv.id.č.:1) a posměrný primer RAR1033MB (sekv.id.č.:2) amplifikují produkt 175 párových bází odpovídající nukleotidovým polohám 2956-3130 sekvence HIV-1 referenčního řetězce HXB2 (GenBank uložení Č.K03455).
HIV-1 amplifikačník primery primer sekv.id.č.
sekvence^
RAR1032MB
CAATGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAA
RAR1033MB 2
CCCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA
Výše uvedené určení primerů se týká nemodifikovaných primerů. Nemodifikované primery byly biotinylovány na 5' konci.
• ·«* ·· 9 9
9 9 9 9 99
9 9 9 9 99 9
9 9 9 9999 9 9 9 9 99
9 9 9 9 99
9 9999
Modifikované primery byly syntetizovány jak je popsáno v příkladu 1, čímž sestávaly ze stejných nukleotidových sekvencí jako nemodifikované primery, ale obsahovaly benzylovaný adenosin bud v terminální poloze 3' nebo v poloze jednoho nebo tří nukleotidů protisměrně od 3' konce. Modifikované formy primerů jsou zde určeny následovně:
Modifikované HIV-1 amplifikační primery primer sekv.id.č.
poloha modifikovaného nukleotidu
RAR1032MBA1 1
3' zakončení
RAR1032MNA2 1 od 3' zakončení
RAR1032MBA4 1 od 3' zakončení
RAR1033MBA1 2
3' zakončení
Amplifikace
Amplifikace byly provedeny ve 100 mikrolitrových reakcích obsahujících následující reagenty:
100 kopií HIV matrice RNA, mM tricinu (pH 8,33),
110 mM KOAc,
300 mikroM každého dATP, dCTP, a dGTP, mikroM dTTP,
500 mikroM dUTP, mikroM každého primeru,
3,5 mM Mn(OAc)·
13%ní glycerol.
X ) jednotek Z05 DNA polymerasy a
2,0 jednotky UNGxx) χ) Popsáno v US patentu č. 5 455 170 χχ) Vyráběno a vyvíjeno Hoffmann-La Roche a prodáváno Perkin Elmer, Norwalk, CT
Amplifikační teplotní cyklování bylo prováděno v TC480 DNA tepelném cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu.
Předreakční inkubace
Reversní transkripce cyklů:
Finální extenze Postreakční udržování °C po dobu 4 minut, °C po dobu 20 minut denaturace při 94 °C po dobu 45 sekund chlazení/extenze při 60 °C po dobu 45 sekund °C po dobu 7 minut, °C až do analýzy (po krátkou dobu).
Detekce amplifikovaného produktu
Přítomnost amplifikovaného produktu byla zjišřována gelovou elektroforézou následovně. Reakční produkt byl frakcionován za použití agarosového gelu (100 ml 3%ního NuSieve a 0,5%ního Sea Chem) a IX TBE (0,089 M Tris, 0,089 M kyseliny borité, 0,0025 M disodné EDTA) průběžný pufr, byly použity. Byl přidán ethidiumbromid (0,5 mikrogramů/ml) k zabarvení jakékoli přítomné DNA. Elektroforéza byla prováděna při 100 V po dobu asi 1 hodiny. Ethidiumbromidem zabarvené pásy DNA byly vizualizovány za použití UV záření.
- 39 ····
Výsledky
Výsledky gelové elektroforézní analýzy jsou znázorněny v obr.l. Čísla pruhů odpovídající každé z amplifikací za využití kombinací nemodifikovaných a modifikovaných primerů jsou znázorněny v následující tabulce. Pásy odpovídající žádanému HIV produktu jsou označeny v obr. šipkou. Ostatní pásy v gelu odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu, zejména příměrovému dimeru.
Pruh číslo
Primery
| protisměrný | posměrný | |
| RAR1032MB | RAR1033MB | 1 |
| RAR1032MBA1 | RAR1033MB | 2 |
| RAR1032MBA2 | RAR1033MB | 3 |
| RAR1032MBA4 | RAR1033MB | 4 |
| RAR1032MB | RAR1033MBA1 | 5 |
| RAR1032MBA1 | RAR1033MBA1 | 6 |
| RAR1032MBA2 | RAR1033MBA1 | 7 |
| RAR1032MBA4 | RAR1033MBA1 | 8 |
Poněvadž tvorba příměrového dimeru soutěží s tvorbou určeného amplifikačního produktu, snížení příměrového dimeru má typicky za následek průvodní vzrůst v množství vytvořeného žádaného produktu. Tak účinek modifikovaných primerů je vidět z porovnání množství vytvořeného příměrového dimeru ve vztahu k množství vytvořeného za použití nemodifikovaných primerů a ze srovnání množství určeného cílového produktu ve vztahu k množství vytvořenému za použití nemodifikovaných primerů .
Srovnání výsledků za použití dvou nemodifikovaných primerů (pruh 1) s výsledky za použití jednoho 3'-modifikovaného primerů (pruhy 2 a 5) as výsledky za použití dvou 3'-módi-
AAA A A • ·
AAA
A AAAA A • A
A A A • A AA fikovaných primerů (pruh 6) indikuje, že snížení primerového dimeru bylo získáno za použití jednoho nebo dvou modifikovaných primerů. Při amplifikacích užívajících jeden 3'-modifikovaný primer je vidět malý rozdíl ve snížení primerového dimeru, který závisí na tom, který to byl modifikovaný primer. Použití dvou modifikovaných primerů (6) mělo za následek jak největší snížení primerového dimeru tak zaznamenatelný růst množství amplifikované cílové sekvence.
Účinek polohy modifikovaného nukleotidu je zřejmý v porovnání pruhů 6 až 8. Snížení primerového dimeru získanéhpopóužitím primerů modifikovaného v nukleotidu přilehlém k 3'terminálu nukleotidu (pruh 7) bylo ekvivalentní snížení získanému použitím primerů modifikovaného v 3'terminálu nukleotidu (pruh 6), zatímco zlepšení získané použitím primerů modifikovaného v nukleotidu tři báze proti směru od 3'terminálu nukleotidu (pruh 8) bylo poněkud menší.
Příklad 6
Další amplifikace užívající modifikované primery
Účinek polohy modifikovaného nukleotidu
Pro další demonstraci účinku modifikovaných primerů na tvorbu primerového dimeru, byla provedena srovnání amplifikací HCV RNA užívajících jak modifikované primery tak nemodifikované primery v podstatě jak bylo výše popsáno. Amplifikace byly prováděny za použití tří různě modifikovaných posměrných primerů, které se lišily jen v lokaci modifikované báze.
- 41 Cílová nukleová kyselina
HCV RNA matrice byly syntetizovány za použití HCV RNA transkripčního vektoru, jak je popsáno v Young a kol., 1993,
J.Clin.Microbiol. 31(4):882-886.
Primery
Amplifikace byly prováděny za použití jak nemodifikovaných tak modifikovaných primerů. Nukleotidové sekvence nemodifikovaných primerů jsou uvedeny níže, orientovány v 5' až 3' směru. Protisměrný primer ST280A (sekv.id.č.: 3) a posměrný primer ST778AA (sekv.id.č.: 4) amplifikují produkt s 240 páry bází z 5'netranslatované oblasti HCV genomu.
HCV amplifikační primery
Primer sekv.id.č. nukleotidová sekvence
ST280H 3 GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA
ST778AA 4 GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA
Výše uvedená primerová určení se vztahují k nemodifikovaným primerům. Modifikované primery byly syntetizovány jak je popsáno v příkladu 1, kteréžto sestávají ze stejných nukleotidových sekvencí jako nemodifikované primery, ale obsahují benzylovaný adenosin na bučí 3'terminální poloze nebo v poloze 1 nebo 3 nukleotidy proti směru 3' zakončení. Modifikované formy primerů jsou označeny následovně:
Modifikované HCV amplifikační primery
Primer sekv.id.č.
poloha modifikovaného nukleotidu
ST280ABA1 3
3' zakončení
ST778AABA1 4
3' zakončení
ST778AABA2 4 od 3' zakončení
ST778AABA4 od 3' zakončení
Amplifikace a analýza
Amplifikace byly prováděny v podstatě jak je popsáno v příkladu 3, ale za použití 100 kopií HCV RNA matrice. Gelová analýza amplifikovaného produktu byla prováděna jak je popsáno v příkladu 3.
Výsledky
Výsledky gelové elektroforézní analýzy jsou uvedeny v obr. 2. Čísla pruhů odpovídající každé z amplifikací užívající kombinace nemodifikovaných a modifikovaných primerů jsou znázorněna v tabulce dále uvedené. Pásy odpovídající určenému HCV produktu jsou označeny v obr. šipkou. Ostatní pásy v gelu odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu a zejména primerovému dimeru.
Primery pruh číslo
| protisměrný | posměrný | |
| ST280A | ST778AA | 1 |
| ST280A | ST778AABA1 | 2 |
| ST280A | ST778AABA2 | 3 |
• · to to * to • toto· pokračování tabulky
Primery pruh číslo
| protisměrný | posměrný | |
| ST280ABA | ST778AABA4 | 4 |
| ST280ABA1 | ST778AA | 5 |
| ST280ABA1 | ST778AABA1 | 6 |
| ST280ABA1 | ST778AABA2 | 7 |
| ST280ABA1 | ST778AABA4 | 8 |
Poněvadž tvorba příměrového dimeru soutěží s tvorbou určeného amplifikačního produktu, snížení příměrového dimeru vede k typickému průvodnímu vzrůstu množství vytvořeného určeného produktu. Tak účinek modifikovaných primerů může být zřejmý jak ze srovnání množství vytvořeného příměrového dimeru ve vztahu k množství vytvořenému za použití nemodifikovaných primerů, tak ve srovnání množství vytvořeného určeného cílového produktu ve vztahu k množství vytvořenému za použití nemodifikovaných primerů.
Získané výsledky byly podobné výsledkům získaným z HIV amplifikaci popsaných v předcházejícím příkladu, ale při HCV amplifikacích byl vzrůst určeného produktu zjevnější než při HIV amplifikacích. Srovnání výsledků za použití dvou nemodifikovaných primerů (pruh 1) s výsledky za použití jednoho 3'-modifikovaného primerů (pruhy 2 a 5) as výsledky používajícími dva 3'-modifikované primery (pruh 6) indikuje!,! že snížení příměrového dimeru bylo získáno použitím bud jednoho nebo dvou modifikovaných primerů. Použití dvou modifikovaných primerů (pruh 6) mělo za následek u obou největší snížení příměrového dimeru spolu s význačným snížením množství amplifikované cílové sekvence. Jako v předcházejícím příkladu malý rozdíl ve snížení příměrového dimeru byl zřejmý u amplifikací používajících jeden 3'-modifikovaný primer, což záviselo na tom, který primer byl modifikován.
···· »· · »· ·· • · · · · · ·* • · · · · · · *··· • · · ····«· · · · 9· • · · · · · ♦ • · · · · * ♦ · · ·
Účinek polohy modifikovaného nukleotidu je vidět ze srovnání pruhů 6 až 8. V podstatě ekvivalentní výsledky byly získány použitím primerů modifikovaných v 3'terminálu nukleotidu (pruh 6), nukleotidu přilehlého k 3'terminálnímu nukleotidu (pruh 7) a nukleotidu 3 báze proti směru od 3'terminálního nukleotidu (pruh 8). Tyto výsledky ukazují, že modifikátorová skupina může být připojena ke kterémukoli za čtyř nukleotidů v 3'konci primeru.
Příklad 7
Amplifikace používající modifikované primery
Účinek modifikátorové skupiny
Pro další demonstraci účinku modifikovaných primerů na tvorbu příměrového dimeru a pro demonstraci alternativních modifikací primerů byla provedena srovnání amplifikací HCV RNA užívajících jak modifikované primery, tak nemodifikované primery, přičemž primery byly modifikovány adicí jedné ze tří různých modifikátorových skupin: benzyl, nitrobenzyl a methyl.
Amplifikační výsledky byly analyzovány dvěma rozdílnými metodami. Při jednom souboru srovnání byla přítomnost příměrového dimeru vyhodnocena gelovou elektroforézní analýzou reakčních produktů. V druhém souboru srovnání byla tvorba příměrového dimeru monitorována během amplifikace pomocí kinetických PCR metod výše popsaných.
Cílová nukleová kyselina
HCV RNA matrice byly syntetizovány za použití HCV RNA transkripčního vektoru, jak je popsáno v Youn a kol., 1993,
J.Clin.Microbiol. 31(4): 882-886.
Amplifikační primery
Amplifikace byly prováděny za použití jak nemodifikovaných tak modifikovaných primerů. Modifikované primery sestávaly ze stejných nukleotidových sekvencí jako nemodifikované primery, alea byly modifikovány v 3'terminálu adenosinu adicí methylové skupiny, benzylové skupiny nebo nitrobenzylové skupiny. Primery byly syntetizovány jak je popsáno v dřívějších příkladech. Označení pro použité primery je uvedeno níže.
Primer sekv.id.č.
modifikace 3' báze
ST280A nemodifikovaná
| ST280AMEA1 | 3 | methyl |
| ST280ABA1 | 3 | benzyl |
| ST280ANBA1 | 3 | nitrobenzyl |
| ST778AA | 4 | nemodifikovaná |
| ST778AAMEA | 4 | methyl |
| ST778AABA1 | 4 | benzyl |
| ST778AANBA1 | 4 | nitrobenzyl |
Amplifikační reakce
Amplifikace byly prováděny ve 100 mikrolitrových reakcích obsahujících následující reagenty:
0, 20 nebo 200 kopií HCV RNA matrice, mM tricinu, pH 8,3,
110 mM KOAc,
3,5 mM Mn (0Ac)2,
300 mikrom. každého dATP, dCTP, dGTP, mikrom. dTTP,
- 46 ···· ·· · • ··· •· » •♦ ······ ·· * • ·· • ♦ ·· • ····· • ·· ·· · ·· ·♦
I» · · · • · ·· > ··· · · • · · ·· ··
500 mikrom. dUTP,
250 nM každého primeru,
U rTthx),
2U UNGX), a % glycerolu.
2C ) vyrobeno a vyvinuto Hoffmann - La Roche a prodáváno Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Tepelné cyklování každé reakční směsi bylo prováděno v GeneAmp®PCR Systém 9600 tepelném cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu.
Předreakční inkubace reversní transkripce 46 cyklů:
finální extenze postreakční udržování °C po dobu 4 minut, °C po dobu 24 minut, denaturace při 94 °C po dobu 30 sekund, zchlazení/extenze při 60°C po dobu 30 sekund, °C po dobu 7 minut, °C.
Detekce amplifikovaného produktu
A. Gelová elektroforéza
Přítomnost amplifikovaného proudktu byla určena gelovou elektroforézou následovně. Reakční produkty byly frakcionovány za použití agarosového gelu (100 ml 3%ního NuSieve, 0,5%ního SeaChem, a 0,5 mikrog./ml ethidiumbromidu) a IX TBE (0,089 M tris, 0,089 M kyseliny borité, 0,0025 M disodné EDTA) průběžného pufru.
- 47 Elektroforéza byla prováděna při 100 V přibližně 1 hodinu. Ethidiumbromidem zbarvené pásy DNA byly vizualizovány pomocí UV ozáření.
B. Detekce kinetickou PCR
Při kinetických PCR metodách výše popsaných se přidává k PCR interkalační barvivo jako je ethidiumbromid, který fluoreskuje silněji, když je vmezeřen do dvouřetězcové DNA. Vzrůst dvouřetězcové DNA během amplifikace je monitorován měřením fluorescence barviva během reakce. Poněvadž kinetické PCR metody jen měří vzrůst celkového množství dvouřetězcové DNA, tvorba nespecifických amplifikačních produktů není měřena nezávisle. Aby se měření výskytu nespecifické amplifikace, vyplývající z příměrového dimeru provádělo nezávisle na matricové amplifikaci, byly reakce prováděny bez matriční nukleové kyseliny. Při takových bezmatričních reakcích jakýkoli vzrůst dvouřetězcové DNA je přisouditelný tvorbě matričně nezávislého nespecifického amplifikačního produktu.
Kinetické PCR reakční podmínky byly popsány výše s výjimkou toho, že ethidiumbromid byl přidáván do reakční směsi v koncentraci 1 mikrog./ml. Reakce byly monitorovány měřením fluorescence reakční směsi jak je popsáno v EP 640 828.
Fluorescenční měření byla normalizována oddělením počátečních fluorescenčních měření získaných během cyklu časně při reakci, zatímco flurescenční měření mezi cykly byla rea.lativně konstantní. Počet cyklu zvolený pro počáteční fluorescenční měření byl stejný pro všechny srovnávané reakce, takže všechna měření představuji vzrůsty ve vztahu k stejnému reakčnímu cyklu. Reakční fluorescence bezcílových reakcí zůstávaly relativně konstantní, pokud se netvořil primerový dimer.
- 48 Při většině reakcí, když se provede dost amplifikačních cyklů, primerový dimer se eventuelně stává detektabilním. Účinek modifikovaných primerů je zřejmý ze srovnání počtu cyklů prováděných, dokud se netvoří primerový dimer, pokud se vůbec tvoří.
Výsledky
Výsledky gelové elektroforézní analýzy jsou uvedeny v obr. 3. Čísla pruhů odpovídající každé z amplifikací užívajících nemodifikované a tři typy modifikovaných primerů a 200 kopií, 20 kopií nebo 0 kopií HCV RNA jsou uvedeny v následující tabulce (čísla pruhů jsou počítána od leva do prava: pruhy 1 až 30 jsou v horní polovině gelu, pruhy 31 až 60 jsou ve spodní polovině gelu). Navíc značkovače molekulové hmotnosti byly přítomny v pruzích 1 a 31 (Hae III digested Phi X 174 RF DNA, New England Biolabs, Beverly, MA)a v pruzích 30 a 60 (Super Ladder-Low, 20 bp ladder, Gen Sura, DelMar, CA). Pásy odpovídající určenému specifickému produktu jsou označeny v obr. 3 šipkou (asi 230 bp). Ostatní pásy v gelu odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu a zejména příměrovému dimeru.
Čísla pruhů amplifikačních výsledků uvedených v obr. 3
| Matrice | Primery | Pruhy |
| 200 | nemodifikovaný | 2-5 |
| 200 | methylovaný | 6-9 |
| 200 | benzylovaný | 10 - 13 |
| 200 | nitrobenzylovaný | 14 - 17 |
| 20 | nemodifikovaný | 18 - 21 |
| 20 | methylovaný | 22 - 25 |
| 20 | benzylovaný | 26 - 29 |
| 20 | nitrobenzylovaný | 32 - 35 |
• 9 · • ·
- 49 pokračování
| Matrice | Primery | Pruhy | |
| 0 | nemodifikovaný | 36 - 41 | |
| 0 | methylovaný | 42 - 47 | |
| 0 | benzylovaný | 48 - | - 53 |
| 0 | nitrobenzylovaný | 54 - | - 59 |
Výsledky ukazují, že amplifikace užívající modifikované primery vedla k většímu množství amplifikované HCV nukleové kyselině než amplifikace užívající nemodifikované primery. Navíc amplifikace užívající modifikované primery vedly ke snížení primerového dimeru ve vztahu k amplifikacím užívajícím nemodifikované primery.
Při kinetických PCR zkouškách byla monitorována fluorescence během reakce. Míra vzrůstu fluorescence po tom, kdy vzrůst fluorescence byl zjistitelný, byla přibližně stejná ve všech reakcích, jak je dokázáno tvarem křivky získané grafickým znázorněním fluorescence oproti počtu cyklů (neznázorněno). To ukazuje, že modifikované primery nezjistitelně inhibují účinnost každého amplifikačního stupně po počátečním stavu amplifikace. Reakce se významně lišily v počtu cyklů prováděných před zjistitelným růstem fluorescence.
Pro kvantifikaci rozdílů mezi reakcemi jsou výsledky vyjádřeny v podmínkách počtu amplifikačních cyklů provedených dokud fluorescence nepřekročila dohodnutou fluorescenční úroveň (AFL). AFL byla zvolena těsně u základní fluorescenční úrovně, ale nad oblastí nahodilých fluktuací u měřené fluorescence, takže reakčni kinetika byla měřena během geometrické růstové fáze amplifikace. Akumulace amplifikovaného produktu v pozdějších cyklech inhibuje reakci a event. vede k reakčnímu plato.
β · · · • ·
Kinetické PCR výsledky jsou shrnuty v následující tabulce. Každá hodnota pro amplifikace 20 nebo 200 kopií cílové matrice představuje průměr 5 replikačních amplifikaci s výjimkou amplifikaci užívajících benzylované primery a 20 kopií cílové látky, která představuje průměr čtyř replikátů. Každá hodnota pro amplifikace bez matrice představuje průměr 8 replikátů.
Dva mimo 8 replikátů amplifikaci užívající benzylované primery s žádným uvedeným cílem nevedly k formaci příměrového dimeru do konce 46 cyklů. Průměr zbývajících 6 amplifikaci je uveden, což reprezentuje průměr upravený na vytvořený příměrový dimer. Upravený průměr není srovnatelný s ostatními hodnotami, které jsou znázorněny vzhledem k vypuštěným údajům.
Cykly k dosažení AFL
Počet cílových kopií
| Primer | 0 | 20 | 200 |
| nemodifikovaný | 35 | 36 | 34 |
| methyl | 39 | 38 | 36 |
| nitrobenzyl | 43 | 40 | 37 |
| benzyl | 43x) | 41 | 37 |
| χ) 2/8 neukázaly | tvorbu příměrového | dimeru |
Údaje ukazují, že modifikované primery zjevně zpožčtují amplifikaci cílové nukleové kyseliny tak, že AFL se dosáhne několik cyklů později. Toto zdržení neodpovídá snížení koneč ného zisku specifického amplifikačního produktu. Všechny amplifikace cílové nukleové kyseliny, jak bylo zjištěno, dosahují plato v 46 cyklech použitých v experimentu a jak je zjevné z odpovídajících údajů z gelové elektroforézní analýzy, konečný výtěžek byl zvýšen použitím modifikovaných primerů.
• 4
Údaje ukazují, že zdržení v tvorbě příměrového dimeru bylo významně větší než zdržení v amplifikaci cílové látky. Výhodný efekt primerů je nejjasněji vidět ze srovnání hezcí-lových amplifikaci a amplifikaci 200 kopií matrice.
Při použití nemodifikovaných primerů se vzrůst fluorescence do AFL vyskytl jen jeden cyklus později při amplifikacích bez cíle, což indikuje, že amplifikace cílové by se obtížně odlišily od tvorby příměrového dimeru. V kontrastu s tím při použití modifikovaných primerů vzrůst fluorescence vlivem příměrového dimeru se vyskytl alespoň 3 cykly později a při užití benzylovaných primerů se vyskytl alespoň 6 cyklů později, když se vůbec vyskytl. Tak mohly být cílové amplifikace detekovány a odlišeny od tvorby příměrového dimeru.
Srovnání bezcílových amplifikaci a amplifikaci 20 kopií matrice ukazuje^! že účinek modifikovaných primerů vykazuje stejný model většího zdržení v nástupu příměrového dimeru než je zdržení v cílové amplifikaci. Při použití nemodifikovaných primerů, 20 kopií matrice nemohlo být detekováno. Použití nitrobenzylových a benzylových primerů vede ke zdržení tvorby příměrového dimeru, které je dostatečné tak, aby se umožnila detekce 20 kopií matrice v systému.
Údaje z monitorování fluorescence při každém amplifikačním cyklu (údaje nejsou znázorněny), indikují, že obecně zdržení v tvorbě příměrového dimeru je dostatečné k zábraně tvorby příměrového dimeru od dosažení plato úrovně během 46 cyklů. Takto se ukázalo, že modifikované primery zdržují tvorbu příměrového dimeru dostatečně tak, že amplifikace cílové látky může být dokončena a reakce zastavena před vytvořením významné úrovně příměrového dimeru.
- 52 • · • ·
Příklad 8
Fotolabilní primery
K demonstraci použití fotolabilních příměrových dimerů byly provedeny amplifikace HCV RNA za použití jak modifikovaných primerů tak nemodifikovaných primerů. Modifikované primery byly modifikovány připojením jedné ze dvou nitrobenzylových skupin k oxocyklickému aminu 3'terminálu adeninu.
Amplifikační primery
Primery byly syntetizovány jak je popsáno v příkladu 4. Označení pro použité primery je uvedeno dále.
Primer
Sekv.id.č.
modifikace 3' báze
ST280A
15239
15241
ST778AA
15240
15242 nemodifikovaný bisnitrobenzyl mononitrobenzyl nemodifikovaný bisnitrobenzyl mononitrobenzyl
Amplifikační reakce
Pro každý primerový pár byly provedeny reakce užívající zředovacích sérií vstupní cílové koncentrace.
panely reakcí, každý zahrnující všechny kombinace příměrového páru a vstupní cílové koncentrace, byly povedeny, a v každém reakčním panelu každá reakce obsahující daný primerový pár a cílovou koncentraci byly reakce provedeny dvojmo. Amplifikace byly prováděny v 100 mikrol. reakcích obsahujících následující reagenty:
• · · · · · • · ·
O, 10, 102, 10^, 10^ nebo 10^ kopií HCV RNA matrice, mM tricinu, mM KOAc, mM Mn(OAc)2,
200 mikroM každého dATP, dCTP, dGTP, dTTP,
200 mikroM dUTP,
250 nM každého primeru,
U rTthx),
U UNGX J, a % glycerolu.
Vyrobené a vyvinuté Hoffmann-La Roche a prodávané Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Tepelné cyklování každé reakční směsi bylo prováděno v GeneAmp PCR Systém 9600 tepelném cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu.
Předreakční inkubace reversní transkripce počáteční denaturace 2 cykly:
finální extenze °C po dobu 5 minut, °C po dobu 30 minut, °C po dobu 1 minuty, denaturace při 95 °C po dobu 15 sekund, ochlazení/extence při 60 °G po dobu 20 sekund, °C po dobu 10 minut
Leštěná reakční trubicová víčka (Perkin Elmer, Norwalk, CT) byla použita průběžně. Po tom, co reakční teplota byla zvýšena na 60 °C pro stupeň reversní transkripce, bylo zahřáté víčko odstraněno z PCR patra v bloku tepelného cyklovače a polovina reakčních trubek (jeden kompletní soubor duplikáto• · • ·· · · · · · ··· • · · ······ 9 · · * · • · · · · · · vých reakcí) byla pokryta aluminiovou fólií. Druhá polovina byla ozářena použitím ruční UV lampy emitující záření o vlnové délce 302 nm (UVP model UVM-57, UVP Products, San Gabriel, CA) po dobu 10 minut. Zahřátý obal byl odstraněn a amplifikace pokračovala.
Výsledky
Výsledky amplifikací byly analýzovány gelovou elektroforézou, jak je výše popsáno. Výsledky jsou uvedeny v obr. 4. Primery a počet matričních kopií použité v každé reakci jsou indikovány v gelu (log. počtu kopií je uveden). Pásy odpovídající určenému produktu jsou označeny v obr. 4. Ostatní pásy v gelu odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu, a to zejména příměrovému dimeru.
Srovnání UV ozářeného souboru reakcí ukazuje, že použití modifikovaných primerů vedlo k významnému snížení příměrového dimeru, zejména při nízkém počtu kopií.
Srovnání neozářeného souboru reakcí ukázalo, že použití bisnitrobenzylových primerů vedlo k úplné inhibici amplifikace, jak bylo očekáváno. Amplifikace používající mononitrobenzylové primery nejen daly produkt, ale vykázaly významné snížení příměrového dimeru, což je konzistentní s výsledky získanými v předešlém příkladu.
Příklad 9
Amplifikace užívající p-terc.butylbenzylem modifikované primery
Tento příklad popisuje amplifikací HCV RNA za použití primerů modifikovaných p-terc.butylbenzylovými skupinami.
- 55 Cílová nukleová kyselina
HCV RNA matrice byly syntetizovány za použití HCV RNA transkripčního vektoru jak je popsáno v Young a kol., 1993, J.Clin.Microbiol. 31(4):882-886.
Primery
Amplifikace byly prováděny za použití modifikovaných pri» merů syntetizovaných tak, jak je popsáno v příkladu 2. Nukleotidové sekvence nemodifikovaných primerů jsou uvedeny níže, orientovány v 5*-3* směru. Použité primery byly modifikované verze protisměrného primerů ST280A (sekv.id.č.:3) a posměrného primerů ST778AA (sekv.id.č.:4). Modifikované formy pimerů jsou zde vyznačeny následovně.
Modifikované HCV amplifikační primery
Primer sekv.id.č. poloha modifikovaného nukleotidu
ST280ATBU 3 3'zakončení
ST778AATBU 4 3'zakončení
Amplifikace a analýza
Amplifikace byly provedeny ve 100 mikrolitrových reakcích obsahujících následující reagenty:
20, 5, 2,5, 2 nebo 0 kopií HCV matrice RNA, mM tricinu (pH 8,33),
110 mM KOAc,
300 mikroM každého dATP, dCTP a dGTP, mikroM dTTP,
500 mikroM dUTP, nM každého primerů,
····
3,5 mM Μη (OAc^z % glycerolu, jednotek rTth DNA polymerasy a 8,0 jednotek UNGx).
X ) · z >
Vyrobeno a vyvinuto Hoffmann-La Roche a prodáváno Perkin
Elmer, Norwalk, CT.
Amplifikační teplotní cyklování bylo prováděno v TC480 DNA tepelném cyklovači (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu:
Předreakční inkubace UNG inaktivace reversní transkripce 47 cyklů:
finální extenze poreakční udržování °C po dobu 12 minut °C po dobu 30 sekund °C po dobu 20 minut denaturace při 94 °C po dobu 45sekund, ochlazení/extenze při °C po dobu 70 sekund °C po dobu 7 minut °C až do analýzy (po krátkou dobu).
Amplifikační produkty byly analýzovány gelovou elektroforézou, jak je výše popsáno.
Výsledky
Amplifikace prováděné u každého cílového matričního počtu byly replikovány následovně: 3 amplifikace byly prováděny za použití 20 kopií cílové matrice, 3 amplifikace byly prováděny za použití 5 kopií cílové matrice, 2 amplifikace byly prováděny za použití 2,5 kopií cílové matrice!I 1 amplifikace byla prováděna 2 kopií cílové matrice a 23 amplifikaci bylo prováděno bez přítomného cíle. Všechny matricové pozitivní amplifikace vedly k jednomu pásu na gelu očekávaného cílového stavu.
• 9 9 * ·· · ·· ·· ··· 9 9 9 9 9 99
999 9999 9 999
9999 9999 9 999 · • 9 9 9 9 9 99
999 999 99 9 9999
Žádná z amplifikací nevedla k bud příměrovému dimeru nebo jinému nespecifickému amplifikačnímu produktu.
Výsledky mohou být porovnány s výsledky v příkladu 6, kde stejné HCV cíle byly amplifikovány za použití stejných příměrových sekvencí. Srovnání těchto výsledků s výsledky v příkladu 6 ukazuje, že amplifikace za použití p-terc.butylbenzylem modifikovaných primerů byly významně lepší ve vztahu k odpovídajícím amplifikacím prováděným s nemodifikovanými primery.
Byly provedeny další experimenty, ve kterých HIV-1 RNA byla amplifikována za použití p-terc.butylbenzylmodifikovaných verzí priemrů popsaných v příkladu 5. Amplifikace byly prováděny v podstatě jak je výše popsáno. Jako u HCV systému, který je zde popsán, všechny HIV-1 matriční pozitivní amplifikace vedly k jenomu pásu na gelu očekávaného cílového stavu a žádná amplifikace nevedla k bud příměrovému dimeru nebo jinému nespecifickému amplifikačnímu produktu.
Tyto další výsledky mohou být srovnány s výsledky v příkladu 5, kde byl amplifikován stejný HIV cíl za použití stejných příměrových sekvencí. Srovnání těchto výsledků s výsledky příkladu 9 ukazuje, že amplifikace za použití p-terc.butylbenzylem modifikovaných primerů byly významně lepší ve vztahu k odpovídajícím amplifikacím prováděným s nemodifikovanými primery.
Příklad 10
Amplifikace mykobakteriální DNA
Tento příklad popisuje srovnání amplifikací mykobakteriální DNA prováděných za použití nemodifikovaných a modifikovaných primerů.
··
- 58 • ·«· ·♦ · • * · · »··· • · · · ♦ · · · ··· • 9 · ···»·« « *· t »
9 9 9 9 9 9
999 99 9 99 99
Jak primery modifikované adicí benzylové skupiny na 3'terminál nukleotidu, tak primery modifikované adicí p-terc.butylbenzylové skupiny na 3'terminál nukleotidu byly použity. Reakce za použití nemodifikovaných primerů byly v podstatě takové, jaké jsou popsány v Tevere a kol., 1996, J.Clin. Microbiol. 34(4):918-923. Amplifikace byly prováděny za použití vzorků sputa, do kterých byla přidána mykobakteriální DNA ve známé koncentraci do simulované infektovaných klinických vzorků. Další amplifikace byly prováděny za použití vyčištěné mykobakteriální DNA a za použití negativních kontrolních vzorků bez DNA.
Příprava vzorků
Vzorky sputa, které se dříve ukázaly být negativní na mykobakterie pomocí mikroskopie a kultivaceU byly zkapalněny a dekontaminovány pomocí N-acetylcistein-NaOH metody doporučené CDC (Kent a Hubica, 1985, Public.Health Mycobacteriology, - příručka pro úroveň III laboratoře, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control, Atlanta, na což se tímto odkazuje). Zkapalněné sputum (100 mikrol.) bylo přidáno do 500 mikrol. Respirátory Specimen Wash Reagents (10 mM tris-HCl, 1 mM EDTA, l%ní (obj./obj.) Triton X-100, 0,05%ní NaN^, pH 8,0) a odstřelováno po dobu 10 minut při 12 500.g. Každá peleta byla resuspendována v 100 mikrol. lýzního reagentu (0,05 N NaOH, l%ní (obj./obj.) Triton X-100, 1 mM EDTA, 0,05%ní NaN^) a inkubována po dobu 45 minut při teplotě 60°C. Lyzáty pak byly neutralizovány 100 mikrol. neutralizačního reagentu (0,2 M Tris-HCl, 8mM MgCl2, 0,05%ní NaN3, pH 7,5).
Sdružené lyzáty sputa byly vytvořeny sloučením 80 mikrol. každého ze dvou separátních lyzátů sputa. Do každého z 8 sdružených lyzátů sputa (160 mikrol. každého) bylo přidáno 15 mikrolitrů DNA základu (2 kopie/mikrol. v 1:1 směsi lýze a neutralizačních reagentů vyčištěného od kultivované M.tuberculosis.
···· ·. · >* ..
• · » · *«·· ··· · · · · · ··· • · · · ···· · ··· · · • · · · · · · ·»· ·· · «· ··
Příklady obsahující vyčištěnou mikobakteriální DNA (žádné sputum) ve známé koncentraci byly připraveny přídavkem 10 mikrolitrů DNA základu do 100 mikrolitrů 1:1 směsi lýzního reagentu a neutralizačního reagentu.
Negativní kontrolní vzorky (žádná DNA) sestávaly ze směsi 100 mikrolitrů lýzního reagentu a 100 mikrolitrů neutralizačního reagentu.
Amplifikační primery
Amplifikace byly prováděny za použití primerů sestávajících z následujících nukleotidových sekvencí:
Primery
KY18 (sekv.id.č.:5)
KY436 (sekv.id.č.:6)
KY75 (sekv.id.č.:7)
Sekvence
5'-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3'
5'-TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA-3'
5'-GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA-3'
Následující primerové páry obsahující indikovanou modifikátorovou skupinu připojenou k 3'terminálu báze, byly použity při amplifikacích. Všechny modifikované primery byly synterizovány jak je popsáno předešlých příkladech. Všechny primery byly biotinylovány na 5'konci.
Primerový pár
Primerové sekvence
KY18 (sekv.id.č.:5)
KY75 (sekv.id.č.:7)
KY436(sekv.id.č.:6)
KY75 (sekv.id.č.:7)
KY436(sekv.id.č.:6)
KY75 (sekv.id.č.:7)
Modifikace nemodifikované nemodifikované benzyl benzyl p-terc.butylbenzyl p-terc.butylbfenzy1
• · • to toto· · · to toto • · · to to ·· ···· · ··· ···· • ··· to · · ·· * ····« • ···· ··· ······ ·· to ····
Amplifikace
Pro každý vzorek byly provedeny amplifikace za použití nemodifikovaného příměrového páru KY18 (sekv.id.č.:5) a KY75 (sekv.id.č.:7), a modifikovaných forem příměrového páru KY436 (sekv.id.č.:6) a KY75 (sekv.id.č.:7).
Amplifikace byly prováděny ve 100 mikrolitrových reakcích, každé obsahující 50 mikrolitrů jednoho ze tří vzorků výše popsaných a 50 mikrolitrů 2 x směsi reagentů, která obsahuje následující reagenty:
100 mM tris-HCl, pH 8,9,
500 nM každého primerů,
200 mikroM každého dNTP, (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), % obj./obj. glycerolu
X ) jednotek Ampli Taq , X ) jednotek AmpErase
X )
Vyrobeno a vyvinuto Hoffmann-La Roche a prodáváno Perkin Elmer, Norwalk, CT).
Tepelné cyklování každé reakce bylo prováděno v GeneAmp PCR systém 9 600 tepelném cyklovačim (Perkin Elmer, Norwalk, CT) za použití následujícího teplotního profilu:
Předreakční inkubace cykly:
cyklů:
°C po dobu 5 minut denaturace při 98 °C po dobu 20 sekund, chlazení při 62 °C po dobu 20 sekund, extenze při 72 °C póidobu 45 sekund, denaturace při 94 °C po dobu 20 sekund, chlazení při 62 °C po dobu dobu 20 sekund
• · · · · · • · · · · · • · • · · · • · · extenze při 72 °C po dobu 45 sekund finální extenze °C po přibližně 12 hodin (přes noc).
Amplifikační produkty byly vizualizovány elektroforézou skrz 2%ní Nusieve 0,5%ní agarosový gel, načež následovalo zabarvení ethidiumbromidem.
Výsledky
Výsledky elektroforézní analýzy jsou znázorněny v obr. 5. Pro každý vzorec produkty z amplifikací prováděných s nemodifikovanými primery (označené A) a s nemodifikovanými primery (označené B a C) byly jednotlivé běhy uvedeny na přilehlých pruzích. Pásy odpovídající určené mykobakteriální cílové sekvenci jsou označeny šipkami. Jiné pásy odpovídají nespecifickému amplifikačnímu produktu, nejspodnější pásy v gelu odpovídají příměrovému dimeru. Pruhy označené M obsahují ukazatel molekulové hmotnosti (Hae III digestion of PhiX174 DNA).
Za použití nemodifikovaných primerů vedly amplifikace vyčištěné mykobakteriální DNA k tvorbě příměrového dimeru. Použití obou modifikovaných párů primerů zvýšilo množství určené cílové látky, která byla přítomna, a v podstatě eliminovalo tvorbu zjistitelného příměrového dimeru.
V kontrastu k amplifikaci vyčištěné DNA za použití nemodifikovaných primerů, přítomnost lyzátu sputa v amplifikační reakci snížila účinnost a zvýšila tvorbu nespecifického amplifikačního produktu, jak je vidět z přítomnosti vnějších pásů produktu. Vzrůst nespecifického amplifikačního produktu není překvapením daným tím, že lyzáty sputa obsahují významné množství lidské DNA, která není přítomna v amplifikacích vyčištěné mykobakteriální DNA. Použití obou modifikovaných příměrových párů při amplifikacích prováděných v přítomnosti sputa mělo za následek jak významný vzrůst množství vytvořeA AAA· AA A
AA A AAA A A A A
A A A A A A·· · AAA • A A A A AAAA A AAA A A
A AAAA AAA
A A A A A A · A A AA A A
- 62 ného určeného produktu, tak snížení nespecifické amplifikace.
Příklad 11
Další syntéza primerů modifikovaných benzylovou skupinou
Primery modifikované adicí benzylové skupiny na terminální citosin byly syntetizovány v podstatě jak je popsáno
4 v příkladu 1, ale za použiti LCAA-CPG vázáného N -acetyl,N benzyl-5'-O-DMT-2'-deoxycitidinu připraveného jak je dále popsáno.
v 4
Stupen 1: Syntéza N -benzyl-2'-deoxycitidinu
Do 2'-deoxycitidinhydrochloridu (5,28 g, 20 mmol, U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) byl přidán benzylamin (20 ml) a směs byla zahřívána při 150 °C po dobu 3 hodin pod argonovou atmosférou. Roztok byl koncentrován za vakua, čímž se získal viskózní žlutý olej,který byl rozdělen mezi vodu (100 ml) a ethylacetat (lOOml). Vodná fáze byla promyta ethylacetatem (100 ml) a oddělena. Vodná fáze byla koncentrována za vakua, čímž se získal žlutý sirup (13 g), který byl vyčištěn silikagelovou sloupcovou chromatografií směsí 15:1 methylenchlorid:methanol jako eluentu, čímž se získal požadovaný produkt (5,8 g, 91,5 %) jako bezbarvý sirup.
Stupeň 2: Syntéza N^-acetyl,N^-benzyl-2*-deoxycitidinu
N^-benzyl-2'-deoxycitidin (2,5 g, 7,9 mmol) byl rozpuštěn v 15 ml suchého dimethylformamidu (15 ml), byl přidán acetanhydrid (8 g, 79 mmol, 10 ekv.) a směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Rozpouštědlo a přebytek acetanhydridu byly odpařeny za vakua. Produkt byl vyčištěn sloupcovou chromatografií silikagelem za použití 20:1 methylenchlorid:methanol jako eluentu, čímž se získala nadepsaná sloučenina (1,3 g, 48 %).
• · • · ··
- 63 Sloučenina byla vysoce hygroskopická a byla uskladněna vysušená při -20 °C.
4
Stupeň 3: Syntéza N -acetyl,N -benzy1,5'-O-DMT-2'-deoxycitidinu
4
N -acetyl,N -benzyl-2 -deoxycitidin (76 mg, 0,2 mmol) byl rozpuštěn v 1 ml suchého pyridinu a byl přidán DMT-C1 ' (122 mg, 0,2 mmol, 1,0 ekv.). Reakční směs byla míchána po dobu 3 hodin. Analýza TLC ukázala určitý úbytek výchozího ma’ teriálu, takže dalš-í alikvot DMT-C1 (61 mg, 0,5 ekv.) byl přidán a výsledná směs byla míchána další hodinu, v kteréžto době analýza TLC ukázala, že reakce byla skončena. Reakční směs byla zchlazena 15 ml solanky a vodná fáze byla extrahována methylenchloridem (3.15 ml). Sloučená organická vrstva byla promyta solankou (2.15 ml) a vysušena nad bezvodým síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odpařeno a směs byla vyčištěna silikagelovou chromatogrfií za použití směsi 50:1 methy,44 lenchlorid:methanol, čímž se získal N -acetyl,N -benzyl, 5'-ODMT-2'-deoxycitidin (96 mg, 65%ní výtěžek).
Stupeň 4: Sukcinylace
N^-acetyl,Ν^-benzyl,5'-O-DMT-2'-deoxycitidin (96 mg, 0,13 mmol) byl rozpuštěn ve 2 ml suchého pyridinu. Byly přidány anhydrid kyseliny jantarové (100 mg, 1,0 mmol) a dimethylaminopyridin (20 mg) a výsledná směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 3 dnů. Rozpouštědlo bylo odpařeno a zbytek • byl spoluodpařen s toluenem (3.10 ml). Byl přidán chloroform (50 ml) k rozpuštění zbytku (byl použit ultrazvuk k nápomoci rozpouštění). Chloroformová vrstva byla promyta solankou (3.15 ml) a vodou (1.15 ml). Organická vrstva byla vysušena bezvodým síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odpal léno, čímž se získalo 108 mg čistého N^-acetyl,Ν^-benzyl,5*-O-DMT-2'deoxycitidin-3'-O-sukcinatu (97%ní výtěžek).
• · · · • 9 • · • · · · · · · · • · ······ ···· · • · · · · · • · · · · · ·
Stupeň 5: Příprava LCAA-CPG vázaného 5'-0-DMT-N^-acetyl,N^benzyl-2'-deoxycitidin-3'-O-sukcinatu
Aktivované CPG bylo připraveno následovně: LCAA-CPG (1,0 g, LCA00500C, CPGInc., Fairfield, NJ) bylo zpracováno s trichloroctovou kyselinou v methylenchloridu (3%ní, 10 ml) a bylo mícháno rotací na rotačním odpařovači (rotovapor, Buchi, Flawil, Švýcarsko) (žádné vakuum) po dobu 4 hodin. Rozépouštědlo bylo odfiltrováno a CPG bylo promyto směsí 9:1 triethylamin: :ethyldiisopropylamin (3.5 ml), methylenchloridem (3.10 ml) a etherem (3.10 ml), a to postupně a pak bylo vysušeno za vakua.
Spojení modifikovaného nukleosidového produktu s kyselinou promytým CPG bylo provedeno následovně.
4
K 1 g aktivovaného LCAA-CPG byl přidán N -acetyl,N benzyl, 5'-0-DMT-2'deoxycitidin, 3'-O-sukcinat (108 mg, 0,13 mmol, připravený jak je výše popsáno, dimethylaminopyridin (20 mg) a 5 ml suchého pyridinu. Reakční směs byla rotována na rotovaporu (žádné vakuum) po dobu 3dnů. Supernatant byl odfiltrován a propojené LCAA-CPG bylo promyto postupně pyridinem (3.5 ml), methylenchloridem (3.10 ml) a etherem (3.10 ml) a pak vysušeno ve vakuu.
v v v > 4 4
Opatření čepičkou LCAA-CPG vázaného s N -acetyl,N -benzyl, 5'-O-DMT-2'-deoxycitidin-3'-O-sukcinatu bylo provedeno následovně. K derivatizovanému CPG byl přidán čepičkovací směsný reagent A (THF/lutidin/ACyO 8:1:1 Glen Research DNA syntézní reagenty, Sterling, VA) a B (10%ní N-methylimidazol v THF, Glen Research) a reakční směs byla rotována na rotavaporu (žádné vakuum) přes noc. Roztok byl odfiltrován a vázané LCAA-CPG bylo promyto postupně pyridinem (3.5 ml), methlenchloridem (3.10 ml), THF (3.10 ml) a etherem (3.10 ml) a pak vys seno za vakua.
- 65 Vázací kapacita derivatizovaného LCAA-CPG byla určena zpracováním 5 mg produktu s 3%ní chloroctovou kyselinou v methylenchloridu a množství uvolněného dimethoxyltritylkarboniového iontu bylo změřeno UV spektroskopií. Množství nukleosidového derivátu vázaného k LCAA-CPG bylo stanoveno, že je
19,5 mikroM/g.
- 66 • 44 4 4 · ♦ · · 4 • · · · · 4 4 4 · 44 4 • · · · 444444 44444 • 4444444
444444 44 4 4444
Seznam sekvencí (1) Obecná informace:
(i) Přihlašovatel:
(A) Jméno: F. Hoffmann-La Roche AG (B) Ulice: Grenzacherstrasse 124 (C) Město: Basilej (D) Stát: BS (E) Země: Švýcarsko (F) Poštovní kód (ZIP): CH-4070 (G) Telefon: 061 - 688 25 11 (H) Telefax: 061 - 688 13 95 (I) Telex: 962292/965542 hlr ch (ii) Název vynálezu: Modifikované primery (iii) Počet sekvencí: 7 (iv) Počítačová čitelná forma:
(A) Druh media: Floppy disk (B) Počítač: Apple Macintosh (C) Operační systém: Systém 7.1 (Macintosh) (D) Software: Word 5.1 (v) Prioritní data přihlášky:
Číslo přihlášky: 60-041127
Datum podání: 20.03.97 (2) Informace pro sekv. id. č. 11 (i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 33 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina « ·
(C) Řetězcovítost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 1:
CAATGAGACA CCAGGAATTA GATATCAGTA CAA 33 (2) Informace pro sekv. id. č. 2:
(i) sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 32 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řětězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 2:
CCCTAAATCA GATCCTACAT ATAAGTCATC CA 32 (2) Informace pro sekv. id. č. 3;
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řětězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 3:
GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTA • ·· 9
9
- 68 (2) Informace pro sekv. id. č. 4:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 4:
GCAAGCACCC TATCAGGCAG TACCACAA 28 (2) Informace pro sekv. id. č. 5:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 23 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 5:
CACATGCAAG TCGAACGGAA AGG 23 (2) Informace pro sekv. id. č. 6:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 6:
TAACACATGC AAGTCGAACG GAAA (2) Informace pro sekv. id. č. 7:
(i) Sekvenční charakteristiky:
(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovítost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: sekv. id. č. 7:
GCCCGTATCG CCCGCACGCT CACA
- 70 • · ··· · · · « · ·« • · · · · · · · ·« • ··· · · · · ···· • · « · «·*··· · · · · · • · · « · « · · ······ «« · 4 ·· ·
Claims (11)
1.
Oligonukleotid obecné struktury
R
I
5' - - N - 3' nebo
R
I
5' -S1-N-S2-3' , kde představuje první sekvenci nukleotidů mezi asi 5 až asi 50 nukleotidy v délce,
S2 představuje druhou sekvenci mezi jedním až třemi nukleotidy v délce,
N představuje nuk/leotid takový, který obsahuje purinovou nebo pyrimidinovou bázi, která obsahuje exocyklický amin,
R představuje modifikátorovou skupinu, kde R je kovalentně vázán k N přes exocyklický amin a kde R má strukturu
Rl-C-R2 ,
H kde R1 a R2 představují nezávisle vodík, C1-C1Qalkylovou skupinu, alkoxyskupinu, fenylovou skupinu, fenoxyskupinu, substituovanou fenylovou skupinu, naftylovou skupinu nebo substituovanou naftylovou skupinu.
2. Oligonukleotid podle nároku 1, kde R je 2-naftyl- methylová skupina, benzylová skupina nebo substituovaná benzylová skupina.
• ·
3. Oligonukleotid podle nároku 1 nebo 2, kde R je sub- stituovaná benzylová skupina o struktuře kde R^ představuje C^-Cg rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, methoxyskupinu nebo nitroskupinu.
4. Oligonukleotid podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, kde R3 představuje C^-C^ rozvětvenou nebo lineární alkylovou skupinu, methoxyskupinu nebo nitroskupinu.
5. Oligonukleotid podle nároku 3 nebo 4, kde je připojen v para poloze.
6. Oligonukleotid podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, kde N je adenosin.
7. . Oligonukleotid podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde R je vybrán ze skupiny zahrnující benzyl, p-methylbenzyl, p-terc.butylbenzyl, p-methoxybenzyl, o-nitrobenzyl a 2-naftylmethyl.
8. Způsob amplifikace cílové sekvence nukleové kyseliny vyznačený tím, že se provede amplifikační reakce za použití) alespoň jednoho oligonukleotidu podle kteréhokoli z nároků
1 až 7.
9. Způsob podle nároku 8 vyznačený tím, že se použije reakce řetězce polymerasy.
• ·· ·
10. Sestava k provádění amplifikační reakce nukleové kyseliny vyznačená tím, že obsahuje oligonukleotid podle kteréhokoli z nároků 1 až 7.
11. Nové oligonukleotidy, postupy a sestavy v podstatě jak jsou zde popsány.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4112797P | 1997-03-20 | 1997-03-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ84198A3 true CZ84198A3 (cs) | 1998-10-14 |
| CZ291525B6 CZ291525B6 (cs) | 2003-03-12 |
Family
ID=21914898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1998841A CZ291525B6 (cs) | 1997-03-20 | 1998-03-19 | Modifikované primery |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6001611A (cs) |
| EP (1) | EP0866071B1 (cs) |
| JP (1) | JP2966389B2 (cs) |
| KR (1) | KR100292997B1 (cs) |
| CN (1) | CN1065873C (cs) |
| AT (1) | ATE280177T1 (cs) |
| AU (1) | AU712448B2 (cs) |
| BR (1) | BR9801878B1 (cs) |
| CA (1) | CA2229766C (cs) |
| CZ (1) | CZ291525B6 (cs) |
| DE (1) | DE69827060T2 (cs) |
| DK (1) | DK0866071T3 (cs) |
| ES (1) | ES2230631T3 (cs) |
| HK (1) | HK1012192A1 (cs) |
| HU (1) | HU223669B1 (cs) |
| IL (1) | IL123694A (cs) |
| NO (1) | NO322136B1 (cs) |
| PL (1) | PL190142B1 (cs) |
| RU (1) | RU2159248C2 (cs) |
| TW (1) | TW567188B (cs) |
| UA (1) | UA49843C2 (cs) |
Families Citing this family (183)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6200757B1 (en) * | 1999-01-19 | 2001-03-13 | Dade Behring Inc. | Method for controlling the extension of an oligonucleotide |
| US6509157B1 (en) * | 1999-11-05 | 2003-01-21 | Roche Molecular Systems, Inc | 3 blocked nucleic acid amplification primers |
| HUP0203386A3 (en) | 1999-11-17 | 2010-01-28 | Roche Diagnostics Gmbh | Magnetic glass particles, method for their preparation and uses thereof |
| US6747141B2 (en) | 1999-12-15 | 2004-06-08 | Gen-Probe Incorporated | Methods and compositions for detection of mycobacterium avium complex species |
| CA2389523C (en) * | 1999-12-17 | 2012-03-06 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium xenopi 16s ribosomal rna (rrna) or dna encoding 16s rrna in a biological sample |
| US6664081B2 (en) | 1999-12-17 | 2003-12-16 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species |
| US7205129B1 (en) * | 2000-02-28 | 2007-04-17 | Qiagen Gmbh | Method for reducing artifacts in nucleic acid amplification |
| WO2001075139A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-11 | Biolink Partners, Inc. | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization |
| US6548251B1 (en) * | 2000-09-05 | 2003-04-15 | Fidelity Systems, Inc. | Inhibition of molecular and biological processes using modified oligonucleotides |
| WO2002020845A2 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Thomas Jefferson University | Ultra yield amplification reaction |
| US9708358B2 (en) | 2000-10-06 | 2017-07-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
| DE60127162T2 (de) | 2000-10-06 | 2008-04-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massives Parallelverfahren zur Dekodierung von DNA und RNA |
| EP1201768B1 (en) * | 2000-10-25 | 2005-12-14 | Roche Diagnostics GmbH | Amplification using modified primers |
| AU2002314734B2 (en) * | 2001-03-30 | 2007-08-30 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | P450 single nucleotide polymorphism biochip analysis |
| US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US6905827B2 (en) | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
| WO2002101041A1 (fr) * | 2001-06-12 | 2002-12-19 | Takara Bio Inc. | Procede d'amplification de l'acide nucleique et procede de detection du polymorphisme des nucleotides a l'aide d'un analogue de nucleotide |
| WO2003020983A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-03-13 | Virginia Commonwealth University | Allele specific pcr for genotyping |
| US7297485B2 (en) * | 2001-10-15 | 2007-11-20 | Qiagen Gmbh | Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias |
| US6617137B2 (en) | 2001-10-15 | 2003-09-09 | Molecular Staging Inc. | Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions |
| US7211382B2 (en) * | 2002-04-09 | 2007-05-01 | Orchid Cellmark Inc. | Primer extension using modified nucleotides |
| WO2003102239A2 (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Secretary, Department Of Atomic Energy | Met/fret based method of target nucleic acid detection whereby the donor/acceptor moieties are on complementary strands |
| US7955795B2 (en) | 2003-06-06 | 2011-06-07 | Qiagen Gmbh | Method of whole genome amplification with reduced artifact production |
| US9487823B2 (en) | 2002-12-20 | 2016-11-08 | Qiagen Gmbh | Nucleic acid amplification |
| MXPA05010429A (es) | 2003-03-31 | 2005-11-04 | Hoffmann La Roche | Composiciones y metodos para detectar ciertos flavivirus que incluyen miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa. |
| WO2004094986A2 (en) | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| US7892745B2 (en) | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7517978B1 (en) | 2004-04-14 | 2009-04-14 | Applied Biosystems, Llc | Modified oligonucleotides and applications thereof |
| US7408051B2 (en) | 2004-04-14 | 2008-08-05 | Applera Corporation | Modified oligonucleotides and applications thereof |
| US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
| WO2006006722A1 (ja) | 2004-07-13 | 2006-01-19 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 細胞機能の調節方法 |
| US7645575B2 (en) | 2004-09-08 | 2010-01-12 | Xdx, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
| EP1809765A2 (en) * | 2004-11-04 | 2007-07-25 | Roche Diagnostics GmbH | Classification of acute myeloid leukemia |
| US7842794B2 (en) | 2004-12-17 | 2010-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reagents and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae |
| ATE454476T1 (de) * | 2005-04-14 | 2010-01-15 | Applied Biosystems Llc | 3'-modifizierte oligonukleotide mit pseudoisocytosin-nukleobasenderivaten sowie deren anwendungen als primer oder sonden |
| US20070072211A1 (en) | 2005-06-30 | 2007-03-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Asymmetric PCR coupled with post-PCR characterization for the identification of nucleic acids |
| US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| US10081839B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10083273B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| CN101517091B (zh) | 2006-06-01 | 2013-02-13 | 垂林克生物技术公司 | 用于核酸扩增的化学修饰的寡核苷酸引物 |
| EP2029780A4 (en) * | 2006-06-16 | 2010-03-31 | Pacific Biosciences California | CONTROLLED INITIATION OF A PRIMARY EXTENSION |
| US9045522B2 (en) | 2006-07-31 | 2015-06-02 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| WO2008016562A2 (en) * | 2006-07-31 | 2008-02-07 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| US7993832B2 (en) | 2006-08-14 | 2011-08-09 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
| WO2008140484A2 (en) | 2006-11-09 | 2008-11-20 | Xdx, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
| GB2457402B (en) | 2006-12-01 | 2011-10-19 | Univ Columbia | Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
| US7893227B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-02-22 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked nucleotides and nucleosides base modified with non-cleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
| US7897737B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-01 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked, nucleotides and nucleosides, base modified with photocleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
| US9938641B2 (en) | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| US7838235B2 (en) | 2007-03-28 | 2010-11-23 | Signal Diagnostics | System and method for high resolution analysis of nucleic acids to detect sequence variations |
| CN101842494B (zh) | 2007-07-03 | 2013-05-29 | 吉纳珀莱有限公司 | 用于改进的核酸扩增反应的嵌合引物 |
| ES2543684T3 (es) | 2007-08-06 | 2015-08-21 | Orion Genomics, Llc | Nuevos polimorfismos de un único nucleótido y combinaciones de polimorfismos nuevos y conocidos para determinar la expresión específica de alelo del gen IGF2 |
| CA2639416C (en) | 2007-09-11 | 2019-12-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Diagnostic test for susceptibility to b-raf kinase inhibitors |
| ES2460896T3 (es) * | 2007-10-04 | 2014-05-14 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Amplificación de ácido nucleico |
| US20100086914A1 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing |
| WO2009051807A1 (en) | 2007-10-19 | 2009-04-23 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis |
| DK2725107T3 (da) | 2007-10-19 | 2019-01-02 | Univ Columbia | DNA-sekventering med ikke-fluorescerende nukleotidreversible terminatorer og ddNTP'er modificeret med spaltbart mærke og nukleinsyre omfattende inosin med reversible terminatorer |
| DE102008005667A1 (de) | 2008-01-19 | 2009-07-30 | Olfert Landt | Basenmodifizierte Primeroligomere für die Multiplex-RT-PCR |
| JP5539325B2 (ja) | 2008-04-30 | 2014-07-02 | インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド | 修飾されたｒｎａ単量体を用いるｒｎアーゼｈを基礎とするアッセイ |
| US8911948B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| US9434988B2 (en) | 2008-04-30 | 2016-09-06 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| BRPI0915173B8 (pt) | 2008-06-11 | 2021-05-25 | Agilent Technologies Inc | compostos de nucleotídeos e nucleosídeos e método de sequenciamento de um ácido nucleico-alvo |
| CA3116156C (en) | 2008-08-04 | 2023-08-08 | Natera, Inc. | Methods for allele calling and ploidy calling |
| CN105200097A (zh) * | 2008-10-20 | 2015-12-30 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 改进的等位基因特异性扩增 |
| US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
| US8206929B2 (en) * | 2009-01-07 | 2012-06-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants |
| EP2955234A1 (en) | 2009-02-11 | 2015-12-16 | Orion Genomics, LLC | Combinations of polymorphisms for determining allele-specific expression of igf2 |
| US8409802B2 (en) | 2009-08-14 | 2013-04-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Format of probes to detect nucleic acid differences |
| WO2011041485A1 (en) | 2009-09-30 | 2011-04-07 | Gene Security Network, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US8614071B2 (en) | 2009-12-11 | 2013-12-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers |
| US9238832B2 (en) * | 2009-12-11 | 2016-01-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids |
| WO2011128096A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment |
| US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| EP2854057B1 (en) | 2010-05-18 | 2018-03-07 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive pre-natal ploidy calling |
| US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
| US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| ES2647612T3 (es) | 2010-06-04 | 2017-12-22 | Chronix Biomedical | Biomarcadores de ácidos nucleicos en circulación asociados al cáncer de próstata |
| WO2012038049A2 (en) | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers |
| US20120142908A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-07 | Berry And Associates, Inc. | Compounds for the synthetic introduction of n-alkyl nucleosides into dna oligonucleotides |
| RU2620959C2 (ru) | 2010-12-22 | 2017-05-30 | Натера, Инк. | Способы неинвазивного пренатального установления отцовства |
| US20120164641A1 (en) * | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and Compositions for Detecting Mutation in the Human Epidermal Growth Factor Receptor Gene |
| WO2012108920A1 (en) | 2011-02-09 | 2012-08-16 | Natera, Inc | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US9624539B2 (en) | 2011-05-23 | 2017-04-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA sequencing by synthesis using Raman and infrared spectroscopy detection |
| US9034581B2 (en) | 2011-05-26 | 2015-05-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Staphylococcus aureus |
| US20140303008A1 (en) | 2011-10-21 | 2014-10-09 | Chronix Biomedical | Colorectal cancer associated circulating nucleic acid biomarkers |
| ES2413566B1 (es) | 2011-12-14 | 2014-05-20 | Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud | Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y pronóstico de la hipoacusia neurosensorial. |
| US9115394B2 (en) | 2011-12-22 | 2015-08-25 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and reagents for reducing non-specific amplification |
| KR101545848B1 (ko) * | 2012-04-09 | 2015-08-21 | (주)바이오니아 | 핵산중합효소로 핵산을 검출하는데 사용되는 고민감도 핵산준비방법 |
| EP2861757B1 (en) | 2012-06-14 | 2019-11-06 | Life Technologies Corporation | Novel compositions, methods and kits for polymerase chain reaction (pcr) |
| US9982313B2 (en) | 2012-08-17 | 2018-05-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of herpes simplex virus 1 and 2 |
| EP2722399A1 (en) | 2012-10-18 | 2014-04-23 | Roche Diagniostics GmbH | Method for preventing high molecular weight products during amplification |
| US9382581B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-07-05 | Roche Molecular Systems, Inc. | Primers with modified phosphate and base in allele-specific PCR |
| WO2014093825A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Chronix Biomedical | Personalized biomarkers for cancer |
| US9828629B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid target identification by structure based probe cleavage |
| US10648026B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-05-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Raman cluster tagged molecules for biological imaging |
| PT3004388T (pt) | 2013-05-29 | 2019-01-29 | Chronix Biomedical | Deteção e quantificação de dna livre de células do dador na circulação de recetores de transplante de órgão |
| KR20180021234A (ko) | 2013-08-12 | 2018-02-28 | 제넨테크, 인크. | 보체-연관 상태의 치료를 위한 조성물 및 방법 |
| US10262755B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-04-16 | Natera, Inc. | Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments |
| US10577655B2 (en) | 2013-09-27 | 2020-03-03 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| WO2015048535A1 (en) | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Natera, Inc. | Prenatal diagnostic resting standards |
| ES2925313T3 (es) | 2013-10-09 | 2022-10-14 | Fluoresentric Inc | Método para la detección de secuencias de ácido nucleico diana |
| ES2705573T3 (es) | 2013-10-09 | 2019-03-26 | Hoffmann La Roche | Procedimientos y composiciones para detectar mutaciones en el gen EZH2 humano |
| EP3063272A2 (en) | 2013-10-30 | 2016-09-07 | Green Life Biotech, LLC | Pathogenesis quantification systems and treatment methods for citrus greening blight |
| US10072288B2 (en) | 2013-11-11 | 2018-09-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detecting single nucleotide polymorphism using overlapped primer and melting probe |
| US9637791B2 (en) | 2013-12-20 | 2017-05-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Multiplexed nucleic acid target identification by strucutre based probe cleavage |
| MX2016010237A (es) | 2014-02-08 | 2017-04-27 | Genentech Inc | Metodos de tratamiento de enfermedad de alzheimer. |
| CN109971852A (zh) | 2014-04-21 | 2019-07-05 | 纳特拉公司 | 检测染色体片段中的突变和倍性 |
| ES2791328T3 (es) | 2014-10-01 | 2020-11-03 | Chronix Biomedical | Métodos de cuantificación de ADN acelular |
| US9745618B2 (en) | 2014-11-19 | 2017-08-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Photoblocked probes and methods for sequential detection of nucleic acids |
| US9920381B2 (en) * | 2014-12-02 | 2018-03-20 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting MECC-containing methicillin-resistant Staphylococcus aureus |
| US9909169B2 (en) | 2014-12-17 | 2018-03-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression |
| US9618474B2 (en) | 2014-12-18 | 2017-04-11 | Edico Genome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| WO2016100049A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | Edico Genome Corporation | Chemically-sensitive field effect transistor |
| US10020300B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-07-10 | Agilome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US10006910B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-06-26 | Agilome, Inc. | Chemically-sensitive field effect transistors, systems, and methods for manufacturing and using the same |
| US9859394B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-02 | Agilome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US9857328B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-02 | Agilome, Inc. | Chemically-sensitive field effect transistors, systems and methods for manufacturing and using the same |
| CN107849603B (zh) | 2015-04-24 | 2022-01-28 | 阿提拉生物系统公司 | 利用有限核苷酸组成的引物扩增 |
| WO2016183106A1 (en) | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
| US9970062B2 (en) * | 2015-08-06 | 2018-05-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of mycobacterium tuberculosis |
| US9382582B1 (en) * | 2015-08-25 | 2016-07-05 | Tracy Hayden | Methods, compositions and kits for enriching for a minor template amplification product in a mixed template amplification reaction |
| EP3402880B1 (en) | 2016-01-15 | 2024-01-03 | Thermo Fisher Scientific Baltics UAB | Thermophilic dna polymerase mutants |
| WO2017153566A1 (en) | 2016-03-11 | 2017-09-14 | Roche Diagnostics Gmbh | Compositions and methods for detection of zika virus |
| WO2017169119A1 (ja) * | 2016-03-30 | 2017-10-05 | 大研医器株式会社 | 変異プライマーの設計方法 |
| JP6681804B2 (ja) * | 2016-03-30 | 2020-04-15 | 大研医器株式会社 | 変異プライマーの設計方法 |
| US10811539B2 (en) | 2016-05-16 | 2020-10-20 | Nanomedical Diagnostics, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US10934597B2 (en) * | 2016-05-27 | 2021-03-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of trichomonas vaginalis |
| JP7098536B2 (ja) | 2016-05-27 | 2022-07-11 | エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 膣トリコモナスの検出のための組成物及び方法 |
| US10612101B2 (en) | 2016-05-27 | 2020-04-07 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Mycoplasma genitalium |
| US20170356025A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-12-14 | Roche Molecular Systems, Inc. | Internal control probes for improving pcr assay performance |
| CN109642253A (zh) | 2016-08-02 | 2019-04-16 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于提高核酸的扩增和检测/定量的效率的辅助寡核苷酸 |
| WO2018067517A1 (en) | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
| US10793923B2 (en) | 2016-11-09 | 2020-10-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of BK virus |
| WO2018089942A1 (en) | 2016-11-10 | 2018-05-17 | Slipchip Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of chlamydia trachomatis |
| US20190284618A1 (en) | 2016-11-10 | 2019-09-19 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of neisseria gonorrhoeae |
| US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| US20190211377A1 (en) | 2016-12-22 | 2019-07-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Cobra probes to detect a marker for epidemic ribotypes of clostridium difficile |
| US10894976B2 (en) | 2017-02-21 | 2021-01-19 | Natera, Inc. | Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids |
| WO2019002178A1 (en) | 2017-06-26 | 2019-01-03 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | DNA MUTANTS THERMOPHILIC POLYMERASES |
| US10760137B2 (en) | 2017-07-18 | 2020-09-01 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Babesia |
| KR102380264B1 (ko) * | 2017-08-31 | 2022-03-29 | 주식회사 씨젠 | 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용한 구성요소의 성능 평가 |
| WO2019063661A1 (en) | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Roche Diagnostics Gmbh | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DETECTION OF TRICHOMONAS VAGINALIS |
| US20210032609A1 (en) | 2018-03-21 | 2021-02-04 | Roche Molecular Systems, Inc. | Dna polymerases for efficient and effective incorporation of methylated-dntps |
| JP2021520816A (ja) | 2018-04-14 | 2021-08-26 | ナテラ， インコーポレイテッド | 循環腫瘍ｄｎａの個別化された検出を用いる癌検出およびモニタリングの方法 |
| US10450616B1 (en) | 2018-05-09 | 2019-10-22 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis |
| US11332787B2 (en) | 2018-06-29 | 2022-05-17 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Methods and compositions for delivery of molecules and complexes to reaction sites |
| US11525159B2 (en) | 2018-07-03 | 2022-12-13 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
| EP3874064A1 (en) * | 2018-10-29 | 2021-09-08 | Cepheid | Exponential base-3 nucleic acid amplification with reduced amplification time using nested overlapping primers |
| JP7478734B2 (ja) | 2018-12-03 | 2024-05-07 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | カンジダ・アウリス（ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ）の検出のための組成物および方法 |
| KR102141312B1 (ko) * | 2019-04-19 | 2020-08-04 | 주식회사 제노헬릭스 | 짧은 RNA-primed 제노 센서 모듈 증폭 기반 짧은 RNA 탐지 기법 |
| JP2022531348A (ja) | 2019-05-02 | 2022-07-06 | エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 鎖分離温度に基づくＤＮＡに対してＲＮＡ標的の優先的／選択的増幅のためのｄＩＴＰの利用 |
| CN113795596A (zh) | 2019-05-07 | 2021-12-14 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测淋病奈瑟氏球菌的组合物和方法 |
| US20220251670A1 (en) | 2019-07-25 | 2022-08-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of epstein barr virus (ebv) |
| US10954572B2 (en) | 2019-07-25 | 2021-03-23 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Neisseria gonorrhoeae |
| CN114286866A (zh) | 2019-08-27 | 2022-04-05 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于扩增和检测包括从cccDNA转录的HBV RNA在内的乙型肝炎病毒RNA的组合物和方法 |
| US11441167B2 (en) | 2019-11-20 | 2022-09-13 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for rapid identification and phenotypic antimicrobial susceptibility testing of bacteria and fungi |
| US11891662B2 (en) | 2019-12-02 | 2024-02-06 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for amplification and detection of human beta actin |
| CN114867871A (zh) | 2019-12-27 | 2022-08-05 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的组合物和方法 |
| WO2021136752A1 (en) | 2019-12-31 | 2021-07-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Quantitative pcr screening of inducible prophage from bacterial isolates |
| EP4118239A1 (en) | 2020-03-09 | 2023-01-18 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2), influenza a and influenza b |
| EP4192982A2 (en) | 2020-08-06 | 2023-06-14 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for the detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-2), influenza a, and influenza b |
| JP2023552546A (ja) | 2020-12-04 | 2023-12-18 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | マラリアを検出するための組成物および方法 |
| US20220205020A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of bacteria and fungi associated with bacterial and candida vaginosis |
| WO2022167570A1 (en) | 2021-02-05 | 2022-08-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detection of human parainfluenza viruses 1-4 (hpiv 1-4) |
| US20220290221A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations |
| CN117858960A (zh) | 2021-05-06 | 2024-04-09 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于通过双靶标测定来检测丁型肝炎病毒的组合物和方法 |
| CN118202069A (zh) | 2021-11-05 | 2024-06-14 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测疟疾的组合物和方法 |
| WO2023089186A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting vana and/or vanb genes associated with multidrug resistance |
| WO2023104812A1 (en) | 2021-12-09 | 2023-06-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Mass based detection of pcr amplicons |
| WO2023109887A1 (zh) | 2021-12-15 | 2023-06-22 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 一种整合位点的检测方法 |
| WO2024003260A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting lymphogranuloma venereum (lgv) serovars of chlamydia trachomatis |
| WO2024018485A1 (en) * | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Haystackanalytics Private Limited | Methods and systems for detection and identification of pathogens and antibiotic resistance genes |
| WO2024042042A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting monkeypox virus |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| US5256549A (en) * | 1986-03-28 | 1993-10-26 | Chiron Corporation | Purification of synthetic oligomers |
| US5459255A (en) * | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
| DE69130800T2 (de) * | 1990-07-24 | 1999-09-16 | Hoffmann La Roche | Verringerung von nicht spezifischer amplifikation während einer (in vitro) nukleinsäure amplifikation unter verwendung von modifizierten nukleinsäure basen |
| US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| CA2159631A1 (en) * | 1993-03-30 | 1994-10-13 | Sanofi | Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them |
| US5599662A (en) * | 1995-02-17 | 1997-02-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
| US5837442A (en) * | 1995-11-29 | 1998-11-17 | Roche Molecular Systems, Inc. | Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid |
-
1998
- 1998-03-12 EP EP98104461A patent/EP0866071B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 AT AT98104461T patent/ATE280177T1/de active
- 1998-03-12 DE DE69827060T patent/DE69827060T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 DK DK98104461T patent/DK0866071T3/da active
- 1998-03-12 ES ES98104461T patent/ES2230631T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-13 AU AU58404/98A patent/AU712448B2/en not_active Expired
- 1998-03-16 IL IL12369498A patent/IL123694A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-03-16 HU HU9800581A patent/HU223669B1/hu active IP Right Grant
- 1998-03-16 US US09/039,866 patent/US6001611A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-18 CA CA002229766A patent/CA2229766C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-19 UA UA98031382A patent/UA49843C2/uk unknown
- 1998-03-19 RU RU98105786/04A patent/RU2159248C2/ru active
- 1998-03-19 PL PL98325439A patent/PL190142B1/pl unknown
- 1998-03-19 CZ CZ1998841A patent/CZ291525B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-19 CN CN98105627A patent/CN1065873C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-19 NO NO19981239A patent/NO322136B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-03-20 BR BRPI9801878-7A patent/BR9801878B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-03-20 KR KR1019980009644A patent/KR100292997B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-03-20 JP JP10090641A patent/JP2966389B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-03 TW TW087104213A patent/TW567188B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-12-15 HK HK98113390A patent/HK1012192A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ84198A3 (cs) | Modifikované primery | |
| JP3165431B2 (ja) | 増幅方法 | |
| EP0425563B1 (en) | Process for amplifying and detecting nucleic acid sequences | |
| CA2329135C (en) | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders | |
| US5965364A (en) | Method for selecting functional deoxyribonucleotide derivatives | |
| AU770217B2 (en) | Ligation assembly and detection of polynucleotides on solid-support | |
| US5744308A (en) | Chimera oligonucleotide and its utilization for obtaining transcripts of a nucleic acid | |
| JP4439735B2 (ja) | リボ核酸を標識化する方法、及びそれにより得られる標識済ｒｎａ断片 | |
| US5645987A (en) | Enzymatic synthesis of oligonucleotides | |
| WO2001053307A1 (en) | 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'→p5'phosphoramidates: their synthesis and use | |
| JP2013518598A (ja) | ランダム化配列を含むプライマー及び特異的プライマーを用いる核酸の等温増幅並びにその使用 | |
| AU648842B2 (en) | Enzymatic synthesis of oligonucleotides | |
| WO1998011120A1 (en) | A method of nucleic acid sequencing | |
| US20030162199A1 (en) | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization | |
| JP2017533733A (ja) | ハイブリダイゼーションプローブおよび方法 | |
| US5508179A (en) | Use of deoxyribose nicotinamide adenine dinucleotide to enhance the specificity of NAD+ -dependent ligation reactions | |
| MXPA98002007A (en) | Cebers modify |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20180319 |