KR19980080494A - 개질된 프라이머 - Google Patents
개질된 프라이머 Download PDFInfo
- Publication number
- KR19980080494A KR19980080494A KR1019980009644A KR19980009644A KR19980080494A KR 19980080494 A KR19980080494 A KR 19980080494A KR 1019980009644 A KR1019980009644 A KR 1019980009644A KR 19980009644 A KR19980009644 A KR 19980009644A KR 19980080494 A KR19980080494 A KR 19980080494A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- primer
- amplification
- modified
- group
- primers
- Prior art date
Links
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 214
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 211
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 56
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 23
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 105
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 69
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 54
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 42
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 42
- -1 2-naphthylmethyl group Chemical group 0.000 claims description 37
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 33
- 239000003607 modifier Substances 0.000 claims description 28
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 26
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 23
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 14
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 11
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 11
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 9
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 6
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 4
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 4
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 4
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000951 phenoxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(O*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 abstract description 66
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 398
- 239000000047 product Substances 0.000 description 68
- 239000002585 base Substances 0.000 description 66
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 66
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 52
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 42
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 33
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 28
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 28
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 24
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 15
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 125000006502 nitrobenzyl group Chemical group 0.000 description 15
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 14
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 13
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 11
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 10
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 9
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 9
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 9
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 7
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 7
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 7
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 7
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 6
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=N1 OISVCGZHLKNMSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 5
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 5
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 4
- WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N benzylamine Chemical compound NCC1=CC=CC=C1 WGQKYBSKWIADBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 4
- 230000035322 succinylation Effects 0.000 description 4
- 238000010613 succinylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 4
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 4
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TWZSNBJODPRUAV-GZBFAFLISA-N 4-(benzylamino)-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(NCC=2C=CC=CC=2)C=C1 TWZSNBJODPRUAV-GZBFAFLISA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 3
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 3
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 3-methyladenine Chemical compound CN1C=NC(N)=C2N=CN=C12 FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 2
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N chloromethane Chemical compound ClC NEHMKBQYUWJMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N methamphetamine hydrochloride Chemical compound Cl.CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 TWXDDNPPQUTEOV-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylpyridin-2-amine Chemical compound CN(C)C1=CC=CC=N1 PSHKMPUSSFXUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N n-[9-[(2r,4s,5r)-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]purin-6-yl]benzamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OC[C@@H]1[C@@H](O)C[C@H](N2C3=NC=NC(NC(=O)C=4C=CC=CC=4)=C3N=C2)O1 LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M phenylmercury acetate Chemical compound CC(=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- WZJWHIMNXWKNTO-VWZUFWLJSA-N (2r,3s,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol;hydrate Chemical compound O.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 WZJWHIMNXWKNTO-VWZUFWLJSA-N 0.000 description 1
- VZXTWGWHSMCWGA-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC=NC(N)=N1 VZXTWGWHSMCWGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JIGQDVLEFZZETB-UHFFFAOYSA-N 1-(2-nitrophenyl)-2-phenylethane-1,2-dione Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1C(=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 JIGQDVLEFZZETB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXBMIQJOSHZCFX-UHFFFAOYSA-N 1-(bromomethyl)-2-nitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1CBr HXBMIQJOSHZCFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QZNQSIHCDAGZIA-UHFFFAOYSA-N 1-(bromomethyl)-4-tert-butylbenzene Chemical compound CC(C)(C)C1=CC=C(CBr)C=C1 QZNQSIHCDAGZIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XHBSBNYEHDQRCP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-methyl-3,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound O=C1NC(=N)N(C)C2=C1N=CN2 XHBSBNYEHDQRCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2,6-diethylphenyl)-n-(methoxymethyl)acetamide;2,6-dinitro-n,n-dipropyl-4-(trifluoromethyl)aniline Chemical compound CCC1=CC=CC(CC)=C1N(COC)C(=O)CCl.CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-5-methylpyridine Natural products CC1=CC=C(C)N=C1 XWKFPIODWVPXLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 3-[chloro-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(Cl)OCCC#N QWTBDIBOOIAZEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFKUHGONCHRHPE-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione;7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 FFKUHGONCHRHPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MUSVHUYMGWQEPJ-OJIKYCEASA-N C(C)(C)(C)C1=CC=C(CC2(C3=NCN([C@H]4C[C@H](O)[C@@H](COC(C5=CC=C(C=C5)OC)(C5=CC=C(C=C5)OC)C5=CC=CC=C5)O4)C3=NC=N2)N)C=C1 Chemical compound C(C)(C)(C)C1=CC=C(CC2(C3=NCN([C@H]4C[C@H](O)[C@@H](COC(C5=CC=C(C=C5)OC)(C5=CC=C(C=C5)OC)C5=CC=CC=C5)O4)C3=NC=N2)N)C=C1 MUSVHUYMGWQEPJ-OJIKYCEASA-N 0.000 description 1
- XWQUFPWZAHCRIS-ISSFYUFGSA-N C(C1=CC=CC=C1)(=O)C1(C2=NCN([C@H]3C[C@H](O)[C@@H](COC(C4=CC=C(C=C4)OC)(C4=CC=C(C=C4)OC)C4=CC=CC=C4)O3)C2=NC=N1)NCC1=CC=C(C=C1)C(C)(C)C Chemical compound C(C1=CC=CC=C1)(=O)C1(C2=NCN([C@H]3C[C@H](O)[C@@H](COC(C4=CC=C(C=C4)OC)(C4=CC=C(C=C4)OC)C4=CC=CC=C4)O3)C2=NC=N1)NCC1=CC=C(C=C1)C(C)(C)C XWQUFPWZAHCRIS-ISSFYUFGSA-N 0.000 description 1
- OKSZJGITOJABOR-PPISNQGISA-N C(C1=CC=CC=C1)C1(NC(N([C@H]2C[C@H](O)[C@@H](CO)O2)C=C1)=O)N Chemical compound C(C1=CC=CC=C1)C1(NC(N([C@H]2C[C@H](O)[C@@H](CO)O2)C=C1)=O)N OKSZJGITOJABOR-PPISNQGISA-N 0.000 description 1
- YAFWCNGISJEODJ-UNPWXMBTSA-N C(C1=CC=CC=C1)[C@@]1(C[C@H](O)[C@@H](CO)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12.[N+](=O)([O-])Br Chemical group C(C1=CC=CC=C1)[C@@]1(C[C@H](O)[C@@H](CO)O1)N1C=NC=2C(N)=NC=NC12.[N+](=O)([O-])Br YAFWCNGISJEODJ-UNPWXMBTSA-N 0.000 description 1
- SNSLIJCJLMUJBI-OGHNNQOOSA-N C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@]1(CC=2C=CC=CC=2)C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@]1(CC=2C=CC=CC=2)C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SNSLIJCJLMUJBI-OGHNNQOOSA-N 0.000 description 1
- CNQMDLYEPVZHJT-BEOKUUIDSA-N C1[C@@H](O[C@@H]([C@]1(O)OC(CC(=O)O)C(=O)O)CO)N2C=CC(NC2=O)(CC3=CC=CC=C3)N Chemical compound C1[C@@H](O[C@@H]([C@]1(O)OC(CC(=O)O)C(=O)O)CO)N2C=CC(NC2=O)(CC3=CC=CC=C3)N CNQMDLYEPVZHJT-BEOKUUIDSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000008021 Nucleoside-Triphosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010075285 Nucleoside-Triphosphatase Proteins 0.000 description 1
- IPSGRRPWHSSCPX-DKPWXRHPSA-N P(O)(N)OC[C@@H]1[C@H](C[C@@H](O1)N1CN=C2C(N)(N=CN=C12)CC1=CC=CC=C1)O Chemical compound P(O)(N)OC[C@@H]1[C@H](C[C@@H](O1)N1CN=C2C(N)(N=CN=C12)CC1=CC=CC=C1)O IPSGRRPWHSSCPX-DKPWXRHPSA-N 0.000 description 1
- ZKNNHEZMTCQDRH-SWMPQROXSA-N P(O)(N)OC[C@@H]1[C@H](C[C@@](O1)(N1C=NC=2C(N)=NC=NC12)CC1=CC=CC=C1)O Chemical compound P(O)(N)OC[C@@H]1[C@H](C[C@@](O1)(N1C=NC=2C(N)=NC=NC12)CC1=CC=CC=C1)O ZKNNHEZMTCQDRH-SWMPQROXSA-N 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- LTKCXZGFJFAPLY-OERIEOFYSA-N [1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2-oxopyrimidin-4-yl]azanium;chloride Chemical compound Cl.O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 LTKCXZGFJFAPLY-OERIEOFYSA-N 0.000 description 1
- AXVVWXCTOPRKCT-WVQJBOLRSA-N [N+](=O)([O-])C=1N=C(C=2N=C(N([C@]3(C[C@H](O)[C@@H](CO)O3)CC3=CC=CC=C3)C2N1)[N+](=O)[O-])N Chemical compound [N+](=O)([O-])C=1N=C(C=2N=C(N([C@]3(C[C@H](O)[C@@H](CO)O3)CC3=CC=CC=C3)C2N1)[N+](=O)[O-])N AXVVWXCTOPRKCT-WVQJBOLRSA-N 0.000 description 1
- SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N [amino(ethoxy)phosphanyl]oxyethane Chemical compound CCOP(N)OCC SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N benzyl bromide Chemical compound BrCC1=CC=CC=C1 AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 125000006487 butyl benzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N dimethylpyridine Natural products CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940048921 humira Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940087646 methanolamine Drugs 0.000 description 1
- 229940050176 methyl chloride Drugs 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 125000006503 p-nitrobenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1[N+]([O-])=O)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940083251 peripheral vasodilators purine derivative Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N purine Chemical compound N1=C[N]C2=NC=NC2=C1 IGFXRKMLLMBKSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 229940083082 pyrimidine derivative acting on arteriolar smooth muscle Drugs 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 125000006488 t-butyl benzyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Abstract
본 발명은 핵산 서열 증폭에 사용하기 위한 개질된 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 프라이머로서 개질된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실행한 증폭은 비개질된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실행한 증폭에 비하여 비특이성 증폭 생성물, 특히 프라이머 이량체가 덜 생성되고, 목적하는 증폭 생성물의 수율이 보다 증가하였다.
Description
본 발명은 분자 생물학 및 핵산 화학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 핵산 증폭 반응의 수율을 개선시키기 위한 방법 및 시약에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 핵산 증폭을 사용하는 임의의 분야에 응용된다.
본 발명의 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)은 핵산 서열의 시험관내 증폭을 가능하게 하였다. PCR은 미국 특허 제 4,683,195 호, 미국 특허 제 4,683,202 호 및 미국 특허 제 4,965,188 호; 사이키(Saiki) 등의 문헌[Science230:1350-1354]; 물리스(Mullis) 등의 문헌[Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol.51:263-273(1986)]; 및 물리스 및 팔루나(Faloona)의 문헌[Methods Enzymol.155:335-350(1987)]에 기술되어 있다. PCR의 개발 및 응용은 문헌에서 폭넓게 기술되어 있다. 예를 들어, 다양한 PCR-관련 논제가 문헌[PCR Technology-principles and applications for DNA amplification, 1989, 얼리치(H.A.Erlich) 편집, Stockton Press, New York; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, 이니스(M. A. Innis) 등 편집, Academic Press, San Diego; 및 PCR Strategies, 1995, 이니스 등 편집, Academic Press, San Diego]에 논의되어 있다. 퍼킨 엘머(Perkin Elmer, 미국 코넥티컷주 노웍 소재)와 같은 판매상이 PCR 시약을 판매하고 있으며 PCR 프로토콜을 출판하고 있다.
핵산 증폭에 관한 최초의 출판 이후로, 리가제 연쇄 반응(Ligase Chain Reaction; LCR)(우(Wu) 및 왈리스(Wallace)의 문헌[Genomics4: 560-569 (1989)] 및 바라니(Barany)의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA88: 189-193(1991)]), 폴리머라제 리가제 연쇄 반응(바라니의 문헌[PCR Methods and Applic.1:5-16 (1991)]), 갭(Gap)-LCR(PCT 특허 공개 공보 제 WO 90/01069 호), 회복 연쇄 반응(Repair Chain Reaction)(유럽 특허 공개 공보 제 439,182 A2 호), 3SR(콰(Kwoh) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:1173-1177 (1989)], 과텔리(Guatelli) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:1874-1878 (1990)], PCT 특허 공개 공보 제 WO 92/0880A 호); 및 NASBA(미국 특허 제 5,130,238 호)를 비롯한(이에 한정되지는 않는다) 다양한 프라이머-기제의 핵산 증폭 방법이 기술되어 있다. 증폭 시스템에 대한 조사는 아브램선(Abramson) 및 마이어스(Myers)의 문헌[Current Opinion in Biotechnology 4:41-47(1993)]에 제공되어 있다.
프라이머-기제 증폭 반응의 특이성은 프라이머 하이브리드화(hybridization)의 특이성에 좌우된다. 전형적인 증폭에 사용되는 고온에서 프라이머는 의도한 표적 서열에만 하이브리드화한다. 그러나, 증폭 반응 혼합물은 프라이머 하이브리드화의 특이성을 보장하는데 필요한 온도보다 훨씬 낮은 실온에서 전형적으로 회합된다. 이러한 덜 엄격한 조건하에서, 표적 서열에 따라 증폭할 수 있는 프라이머는 단지 부분적으로만 상보적인 다른 핵산 서열 또는 다른 프라이머에 비특이적으로 결합할 수 있고, 목적하지 않은 연장 생성물의 합성을 개시할 수 있다. 비특이성 프라이머 연장 생성물의 증폭은 목적하는 표적 서열의 증폭과 경쟁할 수 있어서 목적하는 서열의 증폭 효율을 상당히 감소시킬 수 있다.
비특이성 증폭 생성물의 종종 관찰되는 형태중 하나는 프라이머 이량체로서 불리는, 주형-비의존성 증폭 반응의 가공물이다. 프라이머 이량체는 이중사슬 분절로서 그 길이는 전형적으로 두 프라이머 길이의 합에 가깝고, 한 프라이머가 다른 프라이머 너머로 연장될 때 발생하는 것으로 보인다. 이렇게 얻어진 연결에 의해 원치않는 주형이 형성되지만, 이 주형은 짧은 길이 때문에 효율적으로 증폭된다.
비특이성 증폭은, 반응을 시작하기 전에 프라이머 연장 생성물의 형성을 감소시킴으로써 감소시킬 수 있다. 고온 출발(hot-start) 프로토콜로 지칭되는 한가지 방법은, 필요한 하이브리드화의 특이성을 제공하는데 충분한 온도에 도달하기 전에는 반응 혼합물에 1종 이상의 중요한 시약을 제공하지 않는 것이다. 이러한 방법에서, 반응 조건이 특이성 프라이머 하이브리드화를 보장하지 않는 동안, 반응 혼합물은 프라이머를 연장시킬 수 없다.
초기 고온 배양 단계후에 반응관을 열어 결여되어 있는 시약을 첨가하는 수동 고온 출발 방법은 노동 집약적이고 반응 혼합물을 오염시킬 위험이 크다. 선택적으로는 반응 성분들을 분리시키거나 또는 떨어뜨려 놓기 위해서 감온성 물질(예: 왁스)을 사용할 수 있다(미국 특허 제 5,411,876 호 및 추(Chou) 등의 문헌[Nucl. Acids Res.20(7):1717-1723(1992)]에 기술되어 있는 바와 같음). 이러한 방법에서는 고온에서 예비 반응 배양하여 감온성 물질을 용융시키고, 이로써 시약이 혼합되도록 한다.
반응을 시작하기 전에 프라이머 연장 생성물의 형성을 감소시키는 다른 방법은 미국 특허 제 5,338,671 호에서 기술한 바와 같이 DNA 폴리머라제-특이성 항체에 의해 DNA 폴리머라제를 열-가역적으로 억제시키는 것이다. 항체-DNA 폴리머라제 착체를 형성하기 위해서는 반응 혼합물이 회합하기 전에 실온의 완충액에서 DNA 폴리머라제와 함께 항체를 배양한다. DNA 폴리머라제 활성의 항체 억제는 고온의 예비-반응 배양에 의해 불활성된다. 이러한 방법의 단점은 DNA 폴리머라제에 특이적인 항체를 제조하는 것이 비용이 많이 들고, 시간 소모적(특히 대량일 때)이라는 점이다. 게다가, 항체를 반응 혼합물에 첨가하는 것은 증폭 반응의 재디자인을 필요로 할 수도 있다.
또한 반응 시작전에 연장 생성물이 형성되는 것은 단일사슬 결합 단백질 반응을 첨가함으로써 억제시킬 수 있으며, 이 단일사슬 결합 단백질은 열-가역적 방법으로 프라이머에 비-공유결합되고 하이브리드화를 억제하여 프라이머 연장을 억제시킨다.
또한 미국 특허 제 5,418,149 호에서 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 반응시작 전에 형성된 연장 생성물을 효소적으로 분해함으로써 비특이성 증폭을 감소시킬 수 있다. 새로 합성된 연장 생성물의 분해는 반응 혼합물에 dUTP 및 UNG를 혼입시키고, 증폭 반응을 실행하기 전에 반응 혼합물을 45 내지 60℃에 배양함으로써 이루어진다. 프라이머가 연장되면 우라실-함유 DNA가 형성되지만, 이것은 예비 증폭 조건하에서 UNG에 의해 분해된다. 이러한 방법의 단점은 연장 생성물의 분해가 연장 생성물의 형성과 경쟁하여 비특이성 프라이머 연장 생성물을 완전히 제거하지 못한다는 점이다. 이러한 방법의 이점은 선행 반응으로부터의 오염물로서 반응 혼합물에 혼입된 우라실-함유 DNA가 분해된다는 점이고, 따라서 이 방법은 선행 반응에서 증폭된 핵산에 의한 PCR의 오염 문제를 감소시킨다는 점이다.
당분야의 숙련자에게 분자 생물학 및 핵산 화학의 종래의 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다(샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis, 가이트(M.J. Gait) 편집 (1984)]; 문헌[Nucleic Acid Hybridization(헤임스(B.D. Hames) 및 히긴스(S. J. Higgins) 편집)(1984)]; 및 시리즈인 문헌[Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.)] 참고).
본 발명은 핵산 서열의 시험관내 증폭을 위한 공유결합에 의해 개질된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 제공하는 것이다. 본 발명의 개질된 프라이머를 사용하여, 비개질된 프라이머로 실행된 증폭에 비해 비특이성 증폭, 특히 프라이머 이량체 형성을 감소시키고/감소시키거나 부수적으로 목적하는 표적의 수율을 증가시키고자 하는 것이다.
도 1은 실시예 5에서 기술하는 바와 같이, 벤질화된 프라이머를 사용하여 실행한 HIV-1 RNA의 증폭 결과이다.
도 2는 실시예 6에서 기술하는 바와 같이, 벤질화된 프라이머를 사용하여 실행한 HCV RNA의 증폭 결과이다.
도 3은 실시예 7에서 기술하는 바와 같이, 3가지 개질기중 하나로 개질된 프라이머를 사용하여 실행한 HCV RNA의 증폭 결과이다.
도 4는 실시예 8에서 기술하는 바와 같이, 광-불안정한 개질된 프라이머를 사용하여 실행한 HCV RNA의 증폭 결과이다.
도 5는 실시예 10에서 기술하는 바와 같이, 벤질기로 개질된 프라이머 및 p-3급-부틸벤질기로 개질된 프라이머를 사용하여 실행한 마이코박테리아(mycobacteria) DNA의 증폭 결과이다.
도 6은 벤질-개질된 또는 치환된 벤질-개질된 dA 조절 다공질 유리(controlled pore glass; CPG)를 합성하는데 적당한 일반적인 반응식을 나타낸다.
한가지 양태에서, 본 발명은 핵산 서열의 증폭을 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 관한 것으로 하기 화학식 1a 또는 화학식 1b의 구조를 갖는다:
상기 식에서,
S1은 길이가 뉴클레오타이드 약 5 내지 약 50개인 뉴클레오타이드의 제 1 서열을 나타내고;
S2는 길이가 뉴클레오타이드 1 내지 3개인 제 2 서열을 나타내고;
N은 고리외(exocyclic) 아민을 함유하는 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기를 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내고;
R은 개질기를 나타내는 것으로, 고리외 아민에 의해 N에 공유결합되며, 이때 R은 하기 화학식 2의 구조를 갖는다.
상기 식에서,
R1및 R2는 독립적으로 수소, C1-C10알킬기, 알콕시기, 페닐기, 페녹시기, 치환된 페닐기, 나프틸기 또는 치환된 나프틸기를 나타낸다. 알킬기는 분지쇄 또는 비분지쇄일 수도 있다.
바람직한 양태에서, N은 개질된 종래의 뉴클레오타이드로, 이러한 경우 N은 개질된 아데노신, 시티딘 또는 구아노신이고, 개질제 잔기는 아데닌, 구아닌 또는 시토신 염기의 고리외 아민에 공유결합된다. 보다 바람직한 양태에서는 N은 개질된 아데노신이다.
바람직한 양태에서, R은 2-나프틸메틸 기; 벤질기; 또는 치환된 벤질기이다. 바람직한 치환된 벤질기는 하기 화학식 3의 구조를 갖는다:
상기 식에서,
R3은 C1-C6분지형 또는 선형 알킬기이고, 보다 바람직하게는 C1-C4분지형 또는 선형 알킬기, 메톡시기 또는 니트로기이다. R3이 파라 위치에 결합되는 것이 바람직하다.
보다 바람직한 양태에서, R은 벤질, p-메틸벤질, p-3급-부틸벤질, p-메톡시벤질 또는 2-나프틸메틸기이다.
본 발명의 또다른 양상은 개질기가 광-불안정한 공유 결합에 의해 개질된 증폭 프라이머에 관한 것으로, 공유 결합은 프라이머 연장을 부분적으로 또는 완전히 억제시킨다. 광-불안정 개질제는 전술한 개질된 뉴클레오타이드에서와 같이 고리외 아민 또는 고리의 질소에 결합될 수도 있다. 한가지 양태에서는, 하나 이상의 니트로벤질기가 3'-말단 뉴클레오타이드의 아데노신, 구아닌 또는 시토신 염기의 고리외 아민에 결합된다.
본 발명의 다른 양상은 하나 이상의 프라이머가 전술한 바와 같이 개질된 한쌍의 프라이머 또는 한 세트의 프라이머이다. 바람직한 양태는, 한쌍의 프라이머의 두 프라이머 또는 한 세트의 프라이머의 모든 프라이머가 개질되는 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 개질된 프라이머를 사용하여 증폭 반응을 실행함을 포함하는 핵산의 증폭 방법이다.
본 발명의 또다른 양상은 본 발명의 광-불안정한 개질된 프라이머를 사용하여 증폭 반응을 실행함을 포함하는 표적 핵산의 증폭 방법에 관한 것으로, 여기서 반응 혼합물은 개질기를 제거하기에 충분한 광선으로 조사되어, 프라이머 연장 생성물을 형성하게 된다. 본 발명의 한가지 양태에서, 조사 과정은 증폭 반응을 시작하기 전이지만 반응 혼합물이 약 50℃ 보다 높은 온도로 가열된 후에 개별적인 단계로서 실행된다. 다른 양태에서, 조사 단계는 RNA 증폭 반응에 있어서의 역전사 단계 또는 DNA 증폭 반응중의 초기 변성 단계와 같은 증폭 공정의 예비 단계와 조합된다.
본 발명의 다른 양상은 핵산 서열의 시험관내 증폭을 위한 키트에 관한 것으로, 이 키트는 한쌍의 프라이머중 하나 이상이 전술한 바와 같이 개질된 한 쌍의 프라이머를 포함한다. 또한 본 발명의 키트는 1종 이상의 증폭제(예: 핵산 폴리머라제 또는 리가제), 뉴클레오사이드 트리포스파타제 및 적당한 완충액을 포함할 수 있다.
본 발명의 이해를 돕기 위해서, 다수의 용어를 하기와 같이 정의한다.
핵산 및 올리고뉴클레오타이드는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(2-데옥시-D-리보즈 함유); 폴리리보뉴클레오타이드(D-리보즈 함유); 및 퓨린 또는 피리미딘 염기, 또는 개질된 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N 글리코사이드인 그밖의 임의이 유형의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 핵산 및 올리고뉴클레오타이드라는 용어를 길이면에서 구별하여 사용하지 않으며, 이들 용어는 상호 교환적으로 사용될 것이다. 이러한 용어는 분자의 1차 구조를 지칭하는 것이다. 따라서, 이러한 용어는 이중사슬 및 단일사슬 DNA 뿐만 아니라 이중사슬 및 단일사슬 RNA를 포함한다.
핵산 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 관하여 통상적인이라는 용어는 기술된 폴리뉴클레오타이드에 자연적으로 존재하는 것을 지칭한다. DNA의 4가지의 통상적인(주된을 의미하기도 함) 데옥시리보뉴클레오타이드는 퓨린계 염기인 아데닌과 구아닌 및 피리미딘계 염기인 시토신과 티민을 함유한다. RNA의 4가지의 통상적인 리보뉴클레오타이드는 퓨린계 염기인 아데닌과 구아닌, 및 피리미딘계 염기인 시토신과 우라실을 함유한다. 상기 통상적 또는 일반적인 염기 외에, 다수의 다른 퓨린 및 피리미딘 유도체, 소위 말하는 희소 또는 소수 염기가 일부 핵산에 소량으로 존재한다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 핵산 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 관하여 비통상적인이라는 용어는 희소 또는 소수의 핵산 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드; 및 통상적인 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드의 개질, 유도 또는 유사체를 지칭하는 것이고, 개질된 염기 잔기 및/또는 개질된 당 잔기를 갖는 합성 뉴클레오타이드를 포함한다(문헌[Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology, Vol 26,(아그라월(Sudhir Agrawal) 편집, 미국 뉴저지주 토토와 소재의 휴마나 프레스(Humana Press), (1994)); 및 Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach(엑스타인(Fritz Eckstein), IRL 프레스, 영국 옥스포드 소재의 옥스포드 유니버서티 프레스(Oxford University Press))] 참고).
올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 적당한 서열의 클로닝 및 제한; 및 나랑(Narang) 등의 문헌[Meth. Enzymol.68:90-99 (1979)]에 기술된 포스포트리에스테르 방법; 브라운(Brown) 등의 문헌[Meth. Enzymol.68:109-151 (1979)]에 기술된 포스포디에스테르 방법; 보케이지(Beaucage) 등의 문헌[Tetrahedron Lett.22:1859-1862 (1981)]에 기술된 디에틸포스포라미다이트 방법; 및 미국 특허 제 4,458,066 호의 고체 지지 방법과 같이 직접 화학 합성을 비롯한 임의의 적당한 방법에 의해 제조될 수 있다. 합성 방법에 대한 개론은 본원에서 참조로 인용되고 있는 굿칠드(Goodchild)의 문헌[Bioconjugate Chemistry1(3):165-187 (1990)]에 제공되어 있다.
당분야에서 왓슨-크릭 염기 짝짓기(Wastson-Crick base pairing)으로 지칭되는 염기 짝짓기이라는 용어는 잘 공지되어 있듯이 상보적인 염기쌍의 수소결합으로서, 이중사슬 DNA 구조에서는 아데닌-티민 및 구아닌-시토신 결합을 지칭하는 것이고, RNA/DNA 하이브리드 분자에서는 아데닌-우라실 및 구아닌-시토신 결합을 지칭하는 것이고, 비통상적인 뉴클레오타이드 쌍에서는 유사한 결합을 지칭하는 것이다.
하이브리드화라는 용어는 상보적인 염기 짝짓기로 인해 두개의 단일나선의 핵산이 중복 구조를 형성하는 것을 지칭한다. 하이브리드화는 완전히 상보적인 핵산사슬 사이에서 발생할 수 있거나 또는 소수의 부적합(mismatch) 영역을 함유하는 실질적으로 상보적인 핵산 사슬 사이에서 발생할 수 있다. 완전히 상보적인 핵산 사슬만 하이브리드화하는 조건을 엄격한 하이브리드화 조건 또는 서열-특이성 하이브리드화 조건이라고 지칭한다. 실질적으로 상보적인 서열의 안정한 중복사슬은 보다 덜 엄격한 하이브리드화 조건하에서 수득될 수 있으며, 하이브리드화 조건을 적절하게 제어하면 허용 부적합 정도를 제어할 수 있다. 핵산 기술 분야의 숙련자라면 당 분야에 제공된 지침에 따라 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 염기 쌍의 농도; 이온 강도 및 부적합 염기쌍의 발생률을 비롯한(이에 한정되지 않음) 다수의 변수를 고려하여 중복 구조의 안정성을 경험적으로 결정할 수 있다:(샘브룩 등의 문헌[Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)] 및 웨트머(Wetmur)의 문헌[Critical Review in Biochem. and Mol. Biol.26(3/4):227-259 (1991)] 참고).
프라이머라는 용어는 핵산 사슬에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성을 유도하는 조건하에(즉, 적당한 완충액 및 적합한 온도에서 4가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 연장제(예: DNA 폴리머라제 또는 역전사효소)의 존재하에) DNA 합성의 개시 지점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 지칭하는 것이다. 본원에서 사용되는 프라이머라는 용어는 연결(ligation)-매개된 증폭 방법에서 사용되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 이때 하나의 올리고뉴클레오타이드는 인접한 위치에서 하이브리드화되는 제 2의 뉴클레오타이드와 연결에 의해 연장된다. 따라서, 본원에서 사용하는 프라이머 연장이라는 용어는 DNA 합성의 개시 지점으로서 프라이머를 사용하여 개별적인 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 중합하는 것과 두 프라이머를 연결하여 연장된 생성물을 형성하는 것 모두를 지칭한다.
바람직하게는 프라이머는 단일사슬의 DNA이다. 프라이머의 적당한 길이는 프라이머가 사용되는 용도에 좌우되지만, 전형적으로는 6 내지 50개의 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자가 주형과 충분히 안정한 하이브리드 착체를 형성하기 위해서는 일반적으로 보다 낮은 온도가 요구된다. 프라이머는 주형 핵산의 정확한 서열을 반영할 필요는 없지만, 주형과 하이브리드화하기 위해서는 충분히 상보적이어야 한다. 주어진 표적 서열의 증폭을 위해 적절한 프라이머를 디자인하는 것은 당분야에 잘 공지되어 있고 본원에서 인용하는 문헌에 기술되어 있다.
프라이머는 프라이머를 감지하거나 또는 고정시킬 수 있는 추가적인 특징을 혼입할 수 있지만, 프라이머의 기본적인 특성, 즉 DNA 합성의 개시 지점으로서 작용하는 특성은 변화시키지는 않는다. 예를 들어, 프라이머는 표적 핵산에 하이브리드화되지는 않지만 증폭된 생성물의 클로닝을 용이하게 하는 추가적인 핵산 서열을 5'말단에 함유할 수도 있다. 하이브리드화되는 주형에 충분히 상보적인 프라이머의 영역을 본원에서는 하이브리드화 영역으로 지칭한다.
표적, 표적 서열, 표적 영역 및 표적 핵산이라는 용어는 증폭될 핵산 영역 또는 서열을 지칭한다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 프라이머 서열과 표적 서열간에 존재하는 부적합 수가 프라이머 서열과 샘플내에 존재할 수도 있는 비-표적 서열간에 존재하는 부적합 수보다 적은 프라이머는 표적 서열에 대해 특이한 것이다. 부적합 수가 프라이머 서열과 표적 서열간에 존재하는 부적합 수보다 많지 않은 경우에만 안정한 중복 구조를 형성할 수 있는 조건이 하이브리드화 조건으로 선택될 수 있다. 이러한 조건하에서, 프라이머는 표적 서열과만 안정한 중복 구조를 형성할 수 있다. 따라서, 적당하게 엄격한 증폭 조건하에서 표적-특이성 프라이머를 사용하면, 표적 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 서열을 특이-증폭시킬 수 있다. 서열-특이성 증폭 조건을 사용하면, 정확하게 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 서열을 특이성-증폭시킬 수 있다.
비특이성 증폭이라는 용어는 표적 서열 이외의 핵산 서열에 프라이머 하이브리드화되어, 프라이머 연장의 기질로서 작용함으로써 일어나는 표적 서열 이외의 핵산 서열의 증폭을 지칭하는 것이다. 비-표적 서열에 프라이머가 하이브리드화되는 것은 비특이성 하이브리드화로 지칭되고, 이것은 보다 낮은 온도의 덜 엄격한 예비 증폭 조건하에서 발생할 수 있다.
프라이머 이량체라는 용어는 주형-비의존적인 비특이성 증폭 생성물을 지칭하는 것으로, 이것은 다른 프라이머가 주형으로 작용하여 프라이머 연장된 결과이다. 프라이머 이량체는 종종 2개의 프라이머의 콘캐터머(concatamer), 즉 이량체로 보이지만, 2개보다 많은 프라이머의 콘캐터머도 발생한다. 프라이머 이량체라는 용어는 본원에서 일반적으로 주형-비의존적인 비특이성 증폭 생성물을 포함하도록 사용된다.
반응 혼합물이라는 용어는 주어진 반응을 실행하는데 필요한 시약을 함유하는 용액을 지칭힌다. 증폭 반응 혼합물은 증폭 반응을 실행하는데 필요한 시약을 함유하는 용액을 지칭하는 것으로, 전형적으로 적당한 완충액에 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 DNA 폴리머라제 또는 리가제를 함유한다. PCR 반응 혼합물은 전형적으로 적절한 완충액에 올리고뉴클레오타이드 프라이머, 열안정성 DNA 폴리머라제, dNTP 및 2가의 금속 이온을 함유한다. 반응 혼합물은 반응하는데 필요한 모든 시약을 함유하는 경우 완전하다고 지칭하고, 필요한 시약의 단지 일부만을 함유하는 경우 불완전하다고 지칭한다. 당분야의 숙련자라면, 편리함, 저장 안정성의 이유로 또는 성분의 농도를 적용하는 바에 따라 조절하기 위하여, 일반적으로 반응 성분들을 개별적인 용액으로, 즉 전체 성분중 일부를 함유하는 용액으로 저장한다는 사실과 완전한 반응 혼합물을 생성하기 위해 반응 전에 반응 성분들을 배합한다는 사실을 이해할 수 있을 것이다. 게다가, 당분야의 숙련자라면 반응 성분이 시판을 위해 개별적으로 포장되어 있다는 사실과 유용한 시판중인 키트는 본 발명의 개질된 프라이머를 포함하는 임의의 반응 성분 부분집합을 함유할 수도 있음을 이해할 것이다.
개질된 프라이머
본 발명의 증폭 프라이머는 프라이머의 3'-말단에 있는 4가지 뉴클레오타이드중 하나에 개질기를 공유 결합시켜 개질시킨다. 한가지 양태에서, 본 발명의 개질된 프라이머는 하기 화학식 1a 또는 화학식 1b의 구조를 갖는 핵산 서열로 구성된다:
화학식 1a
화학식 1b
상기 식에서,
S1은 길이가 뉴클레오타이드 약 5 내지 약 50개인 뉴클레오타이드의 제 1 서열을 나타내고;
S2는 길이가 뉴클레오타이드 1 내지 3개인 제 2 서열을 나타내고;
N은 고리외 아민을 함유하는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내고;
R은 개질기를 나타내는 것으로, 고리외 아민에 의해 N에 공유결합되며, 이때 R은 상기 화학식 2의 구조를 갖는다.
실시예에서 제시하는 바와 같이, 3'-말단 뉴클레오타이드를 개질시키는 경우 개질의 효과는 극대화된다. 따라서, 3'-말단 개질된 뉴클레오타이드를 함유하는 프라이머가 바람직하다.
개질되는 뉴클레오타이드는 그의 염기가 상보적인 뉴클레오타이드와의 뉴클레오타이드 염기 짝짓기에 관련되는 고리외 아민을 함유하는 것중에서 선택된다. 전형적으로, 프라이머는 통상적인 뉴클레오타이드만을 함유하는 DNA이다. DNA에서 발견되는 4가지의 통상적인 뉴클레오타이드중 아데닌, 구아닌 및 시토신은 고리외 1급 아민을 함유하고, 이 아민은 상보적인 염기와의 염기 짝짓기에 관련된다. 본 발명의 바람직한 양상으로, 고리외 아민에 하나의 개질기를 결합시켜 아민기의 두 수소(비개질된 염기에서는 염기 짝짓기에 관련될 수 있음)중 하나를 치환시킴으로써 프라이머를 개질시킨다. 개질된 아데닌, 구아민 및 시토신 염기를 함유하는 개질된 뉴클레오타이드의 구조는 각각 다음과 같다:
상기 식에서,
S는 당 잔기를 나타내고,
R은 개질기를 나타낸다.
본 발명은 통상적인 뉴클레오타이드로 구성된 프라이머에 한정되는 것은 아니다. 염기 잔기가 상보적인 염기와의 염기 짝짓기에 관련되는 고리외 1급 아민을 함유하는 뉴클레오타이드 유사체는 어느 것이나 전술한 바와 같이 개질가능하다. 비통상적인 뉴클레오타이드의 예로는 3-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 3-메틸구아닌, 5-메틸 시토신 및 5-하이드록시메틸 시토신을 들 수 있다.
개질기가 한개의 수소를 치환하기 때문에, 개질기는 수소 결합에 참여하는 개질된 염기의 능력을 제한한다. 나머지 수소 원자는 여전히 수소 결합에 참여할 수 있다. 따라서 개질제는 하이브리드화 반응의 동역학 및 열역학 모두에 영향을 미칠 수 있다. 다음 특성을 갖는 다양한 개질기를 계획한다:
1. 상보적인 염기와 개질된 염기의 왓슨-크릭 짝짓기를 방해하지만 억제하지는 않고,
2. 개질된 프라이머의 연장을 방해하지만 억제하지는 않고,
3. 개질된 프라이머의 연장 생성물에 상보적인 사슬을 합성하게 한다.
개질기는 염기 짝짓기를 입체적으로 방해하여 프라이머의 연장을 방해한다. 따라서, 물리적으로 거대한 개질제는 하이브리드화를 방해하는 정도에 영향을 미친다. 개질된 아데노신 또는 시티딘 뉴클레오타이드를 이중사슬 핵산에 도입하는 경우, 개질기는 큰 골(아민 부분)의 중앙 공간으로 돌출된다. 그 결과, 비교적 큰 개질기라도 중복 구조의 입체 구조를 거의 교란시키지 않는다. 그러나, 적합한 개질제는 수소 결합을 억제시키거나 또는 프라이머의 3'-하이드록실의 효소적 연장을 억제할 만큼 거대하지는 않다. 개질된 구아노신 뉴클레오타이드가 이중사슬 핵산에 도입되는 경우, 개질기는 개질기의 거대함을 수용하기에는 작은 공간을 제공하는 작은 골쪽으로 돌출된다. 결과적으로, 구아닌 염기에 결합되기 위해서는 보다 작은 개질기가 바람직하다.
후속적인 증폭 주기에서 주형으로 사용되는 프라이머 연장 생성물은 프라이머에 의해 도입된 개질된 염기를 함유한다. 개질기는 주형내에 개질된 염기가 존재하여 프라이머 연장을 종결시키거나 또는 프라이머 연장을 억제시키지 않도록 선택된다. 바람직하게는, 개질기의 본질은 돌연변이성 결과를 발생시키지는 않지만, 프라이머 유도된 주형의 복제시 개질된 염기의 동일성이 상실된다. 프라이머 연장에 대한 주형내 개질된 염기의 효과는 본원 및 당분야에 제공된 다음 지침에 따라 일반적으로 시험될 수 있다(예를 들어, 니아즈도우스키(Gniazdowski) 및 세라(Cera)의 문헌[Chem. Rev.96:619-634 (1996)] 참고).
상기 특성을 만족시키는 개질기 R은 본 발명의 방법에서 사용하기에 적당하다. 바람직한 개질기는 하기 화학식 2의 구조를 갖는다:
화학식 2
상기 식에서,
R1및 R2는 독립적으로 수소, C1-C10알킬기, 알콕시기, 페닐기, 페녹시기, 치환된 페닐기, 나프틸기 또는 치환된 나프틸기를 나타낸다. 알킬기는 분지형 또는 선형일 수도 있다. 보다 큰 알킬기인 C20이하의 알킬기를 사용할 수도 있다.
바람직한 양태에서, R은 2-나프틸메틸기; 벤질기; 또는 치환된 벤질기이다. 바람직한 치환된 벤질기는 하기 화학식 3의 구조를 갖는다:
화학식 3
상기 식에서,
R3은 C1-C6분지형 또는 선형 알킬기이고, 보다 바람직하게는 C1-C4분지형 또는 선형 알킬기, 메톡시기 또는 니트로기이다. C1-C4분지형 또는 선형 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소-프로필, 이소-부틸, 3급-부틸 등이다. 메틸 및 3급-부틸이 바람직한 알킬기이다. 바람직하게, R3은 파라 위치에 결합된다.
특히 바람직한 개질기 R은 다음과 같다:
.
다수의 특정한 개질기는 실시예에 기술되어 있다. 일반적으로, 당분야의 숙련자들은 보통 본원에서 제공하고 있는 지침에 따라, 기술되어 있는 일련의 화합물중에서 적합한 특정 개질기를 경험적으로 선택할 수 있다. 특정 기가 적합한지의 여부는 증폭 반응에서 개질된 프라이머를 사용함으로써 경험적으로 결정하는 것이 바람직하다. 성공적인 증폭이란 개질된 염기가 프라이머 연장을 완전히 억제하지 않고, 프라이머 유도된 주형에서 개질된 염기의 존재로 인해 프라이머 연장이 종결되지 않음을 나타낸다. 프라이머 이량체의 감소는 실시예에서 기술하는 바와 같이 측정된다.
광-불안정한 개질된 프라이머
본 발명의 선택적인 양태에서, 프라이머는 1종 이상의 광-불안정한 기로 개질되며, 이때 광-불안정한 기는 반응이 특이성을 보장하는 고온의 반응 조건에 도달한 후, 광선에 노출시켜 제거할 수 있다. 프라이머 연장전에 개질기가 제거되기 때문에, 개질기를 제거하기 전에 개질된 프라이머가 연장성일 필요는 없다. 본 발명의 방법에서 사용할 수 있는 광-불안정한 개질기의 예는 필라이(Pillai)의 문헌[Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis, Synthesis: 1-26 (1980)]에 기술되어 있다.
본 발명의 광-불안정성 프라이머는 3'-말단 뉴클레오타이드에서 일반식 $의 하나 또는 두개의 o-니트로벤질기를 결합시켜 개질시키는 것이 바람직하다.
하나의 니트로벤질기를 염기 잔기중 고리외 1급 아민에 결합시켜 개질된 프라이머에서, 생성된 2급 아민은 나머지 수소가 상보적인 염기를 향하여 배향되도록 아민기가 회전되는 경우, 여전히 염기 짝짓기에 참여할 수 있다. 실시예에서 기술한 바와 같이, 이러한 프라이머는 UV 광선으로 조사시켜 제거하거나 또는 제거하지 않은 채 증폭에서 사용될 수 있다.
두개의 니트로벤질기가 염기의 고리외 아민에 결합되어 개질된 프라이머는 연장될 수 없다. 고리외 아민의 두 수소가 거대한 니트로벤질기로 대체되기 때문에 개질된 염기는 염기 짝짓기를 할 수 없고, 따라서 프라이머 연장이 억제되는 것으로 추축된다. 증폭 과정에 두개의 니트로벤질기로 개질된 프라이머를 사용하는 것은 실시예에 기술되어 있으며, 이 증폭 과정에서 반응 혼합물은 니트로벤질기가 제거되기에 충분한 시간 동안 UV 광선에 노출된 다음 프라이머 연장이 이루어졌다.
선택적인 양태에서, 개질기는 고리 질소에 결합된다. 염기의 고리 질소에 니트로벤질기가 결합하여 개질된 프라이머는 개질된 염기가 염기 짝짓기를 할 수 없기 때문에 연장될 수 없다. UV 광선에 노출시켜 니트로벤질기를 제거하면 프라이머 연장이 일어난다.
개질기가 제거되어야 비로소 연장될 수 있는 광-불안정한 프라이머를 사용하면 근본적으로 고온-출발의 증폭이 제공된다. 프라이머 연장은 비특이성 예비 반응 조건에서는 억제된다. 반응 온도가 반응 특이성을 보장하는 온도까지 승온된 후에 반응물을 조사시켜 프라이머가 탈보호된다.
개질된 프라이머의 합성
개질된 프라이머를 합성하는 것은 당분야에 널리 공지되어 있는 표준 화학 방법을 사용하여 실행한다. 이러한 개질제를 도입시키는 방법은 4가지 종류로 나눠진다.
1. DNA 합성 지지체로서 개질된 뉴클레오사이드를 사용하여 개질제를 도입할 수 있다.
2. 포스포르아미다이트로서 개질된 뉴클레오사이드를 사용하여 개질제를 도입할 수 있다.
3. DNA 합성중에 시약을 사용하여 개질제를 도입할 수 있다(예: DNA 서열에 도입되는 경우 변환가능한 아미다이트를 벤질아민 처리함).
4. 개질제가 합성 DNA와 접촉하도록 반응성 시약으로 개질제를 도입할 수 있다(합성후 개질).
개질된 특정 프라이머의 합성은 실시예에 기술되어 있다. 추가의 개질된 프라이머는 유사 방법으로 표준 합성 방법을 사용하여 합성할 수 있다.
개질된 프라이머는 유도화된 조절 다공질 유리(CPG) 합성 지지체를 사용하여 합성하는 것이 바람직하다. 유도화된 dA CPG를 합성하는 일반적인 반응식을 도 6에 제시하였다. 특정한 개질기는 적당한 알킬-할라이드, 벤질-할라이드, 치환된 벤질 할라이드, 메틸나프틸-할라이드 또는 치환된 메틸나프틸-할라이드 알킬화제를 사용하여 첨가할 수 있다. 실시예 1 및 실시예 2에 기술된 벤질- 및 p-3급-부틸벤질-dA CPG의 합성은 도 6에 제시된 반응식에 따른다.
고리외 아민기를 알킬화시키는 것은 그리핀(Griffin) 및 리즈(Reese)의 문헌[Biochim. Acta68:185-192 (1963)]에 기술되어 있는 메틸화와 유사한 방법을 사용하여 실행할 수 있다. 추가의 합성 방법은 아리토마(Aritoma) 등의 문헌[J. Chem. Soc. Perkin Trans.1:1837-1849 (1995)]에 기술되어 있다.
개질된 프라이머의 증폭
본 발명의 방법은 본 발명의 개질된 프라이머를 사용하여 프라이머-기제의 증폭을 실행함을 포함한다. 일반적으로, 개질된 프라이머는 프라이머-기제의 증폭과정에서 증폭 반응 조건의 어떠한 변화없이도 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비개질된 프라이머와 대체될 수 있다. 물론, 당분야의 숙련자라면 일부 반응에서는 반응 조건을 다시 최적화시키는 것이 적을수록 이롭다는 것을 인식할 것이다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 개질된 프라이머는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 사용된다. 그러나, 본 발명은 임의의 특정한 증폭 시스템에 제한되지는 않는다. 본 발명의 개질된 프라이머는 프라이머 이량체 또는 비특이성 증폭 생성물을 형성할 수 있는 임의의 프라이머-기제의 증폭 시스템에 사용될 수 있다. 실시예는 앞에서 인용한 참고문헌에 기술된 증폭 방법을 포함한다. 다른 시스템이 개발되지만, 본 발명을 실시하면 이들 시스템도 개선될 것이다.
본 발명의 방법은 DNA 또는 RNA의 증폭에 적합하다. 예를 들어, 역전사/폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하는 RNA의 증폭은 당분야에 공지되어 있으며, 미국 특허 제 5,322,770 호 및 미국 특허 제 5,310,652 호 및 마이어스(Myers)와 겔판드(Gelfand)의 문헌[Biochemistry30(31):7661-7666 (1991)], 영(Young) 등의 문헌[J. Clin. Microbiol.31(4):882-886 (1993)] 및 멀더(Mulder) 등의 문헌[J. Clin. Microbiol.32(3):292-300 (1994)]에 기술되어 있다.
프라이머-기제의 증폭에서, 프라이머 연장은 열안정성 DNA 폴리머라제와 같이 열안정성 효소를 사용하여 고온에서 전형적으로 실행된다. 이 효소는 프라이머의 3'-말단에서 합성을 개시하고 합성이 종결될 때까지 주형의 5'-말단을 향하여 진행한다. 증폭 반응에서 유용한 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제는 당분야에 널리 공지되어 있으며, 미국 특허 제 4,889,818 호; 미국 특허 제 5,079,352 호; 미국 특허 제 5,352,600 호; 미국 특허 제 5,491,086 호; 제 WO 91/09950 호; 제 WO 92/03556 호; 제 WO 92/06200 호; 제 WO 92/06202 호; WO 제 92/09689 호 및 미국 특허 제 5,210,036 호에 기술되어 있는 효소를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 열안정성 DNA 폴리머라제에 대한 개론은 아브램선의 문헌[in PCR Strategies (이니스 편집), pp 39-57, Academic Press, 미국 샌디에고 소재 (1995)]에 제공하고 있다.
특히 DNA 증폭을 위한 바람직한 양태에서, 증폭은 가역적으로 불활성화된 효소를 사용하여 실행된다. 고온의 반응 조건에서 재활성화되는 가역적으로 불활성화된 효소를 사용하면, 추가로 반응 시작전에 프라이머 연장을 억제시킴으로써 비특이성 증폭을 감소시킨다. 호프만-라 롯슈(Hoffmann-La Roche)(미국 뉴저지주 너틀리 소재)에서 개발하여 제조하고, 퍼킨 엘머(미국 코넥티컷주 노웍 소재)에서 판매하는 가역적으로 불활성된 열안정성 DNA 폴리머라제는 버치(Birch) 등의 문헌[Nature,381(6581):445-446 (1996)]에 기술되어 있다.
효소의 프라이머 연장 능력에 대한 개질기의 영향은, 일부는 사용되는 특정 효소에 좌우되고, 일부는 선택된 반응 조건에 좌우된다. 예를 들어,TthDNA 폴리머라제는 일부 RNA 증폭에서와 같이 2가 양이온으로서 Mg2+보다 Mn2+가 사용되는 경우 보다 복제가 용이하다. 숙련자라면 적합한 개질기를 선택할 때, 효소 및 반응 조건을 고려해야 함을 인식할 것이다.
증폭 반응에 적합한 샘플의 제조 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 인용된 문헌에 충분히 기술되어 있다. 사용되는 특정 방법은 본 발명에서 중요하지 않다. 당분야의 숙련자라면 공지된 샘플 제조 방법에 사용하기 위해 반응 조건을 최적화시킬 수 있다.
증폭된 핵산의 분석법은 당분야에 널리 공지되어 있고 본원에 인용된 문헌에 충분히 기술되어 있다. 사용되는 특정 방법은 본 발명에서 중요하지 않다. 당분야의 숙련자라면 용도에 따라 적당한 분석법을 선택할 수 있다.
증폭 반응을 분석하기에 바람직한 방법은 히구치(Higuchi) 등의 문헌[Bio/Technology10:413-417 (1992)]; 히구치 등의 문헌[Bio/Technology11:1026-1030 (1993)]; 유럽 특허 공개 공보 제 512,334 호 및 유럽 특허 공개 공보 제 640,828 호에서 기술하고 있는 바와 같이, 반응 혼합물내의 이중사슬 DNA의 총량의 증가를 모니터하는 것이다. 본원에서 동역학적 PCR로 지칭되는 본 방법에서, 이중사슬 DNA의 검출은 이중사슬 DNA와 결합될 때 에티디움 브로마이드(EtBr) 및 다른 DNA 결합 표지가 나타내는 증가된 형광에 의존한다. 증폭은 표지의 존재하에 실행된다. 표적 서열의 합성의 결과로 이중사슬 DNA가 증가하면, 형광도 감지할 수 있게 증가하며, 이것을 증폭 과정동안 모니터한다. 따라서, 본 방법에 의해 증폭 반응의 진행을 모니터할 수 있다.
동역학적 PCR에서, 측정된 형광은 비특이성 증폭의 결과든지 또는 표적 서열의 증폭의 결과든지 존재하는 이중사슬 DNA의 총량에 의존한다. 형광을 모니터하면 이중사슬 DNA의 총량의 증가를 측정할 수 있으나, 표적 서열의 증폭으로 인한 증가분을 비특이성 증폭 생성물로 인한 증가분과 무관하게 측정하지는 못한다. 본 발명의 개질된 프라이머는 형성된 프라이머 이량체의 양을 감소시킬 뿐만 아니라 감지할 만한 양의 프라이머 이량체의 형성을 지연시키기 때문에 동역학적 PCR에서 특히 유용하다. 표적 서열이 상당히 증가할 때까지 프라이머 이량체의 형성이 지연되면, 표적 서열의 증폭을 독립적으로 모니터할 수 있고, 프라이머 이량체로 인한 방해를 최소화할 수 있다.
키트
본 발명은 또한 키트, 즉 본 방법을 실시하는데 있어서 유용한 구성요소를 포함하는 다용기 장치에 관한 것이다. 유용한 키트는 핵산 증폭을 위한 프라이머, 즉 그중 1종 이상이 전술한 바와 같이 개질된 프라이머를 함유한다. 키트의 다른 선택적인 구성요소로는, 예를 들어 프라이머 연장 생성물의 합성을 촉진시키는 시약, 기질인 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 적당한 반응 완충액 및 본 방법을 실행할 수 있는 기기를 들 수 있다.
하기에 제시된 본 발명의 실시예는 본 발명의 목적을 설명하기 위해 제공되었지, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 당분야의 숙련자는 본 명세서와 하기의 실시예를 읽어보면, 실시예 다음의 청구의 범위에 속하는 본 발명의 다수의 양태를 알 수 있을 것이다.
실시예 1
벤질기로 개질된 프라이머의 합성
벤질기를 첨가하여 개질된 프라이머는 하기에서 기술할 두 방법 중 하나의 방법으로 합성되었다. 3'-말단 염기에서 개질된 프라이머는 DNA 합성을 개시하기 위해서 N6-벤질데옥시아데노신 조절 다공질 유리(CPG)를 사용하여 합성하였다. 내부 염기가 개질된 프라이머는 N6-벤질데옥시아데노신 포스포르아미다이트를 사용하여 합성하였다.
다음의 표준 약자를 실시예에서 사용하였다:
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘;
DMF: N,N-디메틸포름아미드;
TEA: 트리에틸아민;
EDC: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드;
THF: 테트라하이드로푸란;
DMT: 4,4'-디메톡시트리틸;
LCAA-CPG: 장쇄 알킬 아미노 조절 다공질 유리.
I. N
6
-벤질데옥시아데노신 CPG의 합성
제 1 단계: N6-벤조일,N6-벤질-5'-O-DMT-2'-데옥시아데노신의 합성
N6-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신(657 ㎎, 1.0 mmol; 미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리히 케미칼 캄파니(Aldrich Chemical Co.))에 피리딘(10 ㎖)을 첨가하고, 혼합물을 진공하에서 증발시켜 건조시켰다. 이것을 되풀이하였다. 생성된 발포체를 무수 DMF(15 ㎖; 미국 위스콘신주 밀워키 소개의 알드리히 케미칼 캄파니)에 용해시키고, 5℃까지 냉각시켰다. 수소화 나트륨(44 ㎎, 1.1 mmol, 1.1 당량. 오일내의 60% 분산액)을 아르곤 분위기에서 첨가하고, 45분동안 실온에서 교반시켰다. 벤질 브로마이드(143 ㎕, 206 ㎎, 1.2 mmol, 1.2 당량; 미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리히 케미칼 캄파니)를 2분동안 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 진공하에서 증발시켜 건조시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에(각각 10 ㎖씩) 분배시켜 추출하였다. 수성 상을 에틸 아세테이트(10 ㎖)로 다시 추출시키고, 추출액을 모아 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고 여과시킨 다음 증발시켰다. 조질의 생성물을 메탄올, 트리에틸아민, 메틸렌 클로라이드(3:0.5:96.5)를 사용하여 실리카 겔(75 g)에서 컬럼 크로마토그래피하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 모아 증발에 의해 건조시키고, 예상된 N6-벤조일,N6-벤질-5'-O-DMT-2'-데옥시아데노신(410 ㎎, 54%)을 수득하였다. 생성물의 구조는 NMR로 확인하였다.
제 2 단계: 숙시닐화
N6-벤조일,N6-벤질-5'-O-DMT-2'-데옥시아데노신(295 ㎎, 0.39 mmol)에 피리딘(10 ㎖)을 첨가하고, 고 진공하에서 증발시켜 혼합물을 건조시켰다. 이 단계를 되풀이하였다. 추가의 무수 피리딘(10 ㎖)을 숙신산 무수물(200 ㎎, 2 mmol, 5.0 당량) 및 DMAP(24 ㎎)와 함께 첨가하고, 이 용액을 실온에서 밤새 아르곤 분위기에서 교반하였다. 진공하에서 대부분의 용매를 제거하고, 잔류물을 메틸렌 클로라이드(20 ㎖)와 나트륨 시트레이트 용액(20 ㎖, 0.1M, pH 5.0) 사이에 분배시켜 추출하였다. 수성 상을 보다 많은 메틸렌 클로라이드(20 ㎖)로 추출하고, 추출액을 모아 무수 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과한 다음 증발에 의해 건조시켰다. 생성물을 에틸 아세테이트, 트리에틸아민, 메틸렌 클로라이드(32:1:67)를 사용하여 실리카 겔(4.5 g)에서 컬럼 크로마토그래피하여 정제하여, 예상된 3'-숙시네이트 에스테르, 즉 N6-벤조일,N6-벤질-3'-O-숙시네이트-5'-O-DMT-2'-데옥시아데노신(247 ㎎, 74%)을 수득하였다.
제 3 단계: CPG의 유도화
산으로 세척한 CPG는 다음과 같이 제조하였다. LCAA-CPG(1 g, LCA00500C, 500 Å, 88.6 mol/g; 미국 뉴저지주 페어필드 소재의 CPG 인코포레이티드))를 실온에서 20분동안 주기적으로 저으면서 디클로메탄내 디클로로아세트산(2%, 20 ㎖)으로 세척하였다. 산으로 세척한 CPG를 유리 프리트(frit)로 여과하고, 산이 없어질 때까지 디클로로메탄으로 세척하였다. 이렇게 생성된 분말을 공기 건조시키고, 그 다음 실온에서 밤새 진공하에서 건조시켰다.
개질된 뉴클레오사이드 중간체를 산으로 세척한 CPG에 결합시키는 것은 다음과 같이 실행하였다. 디클로로메탄(10 ㎖)내의 전술한 바와 같이 제조된 N6-벤조일,N6-벤질-3'-O-숙시네이트-5'-O-DMT-2'-데옥시아데노신(170 ㎎, 0.2 mmol)에 TEA(100 ㎕)를 첨가하고, 이 용액을 아르곤 분위기에서 약 5 ㎖가 될 때까지 농축시켰다. DMAP(12 ㎎, 0.1 mmol, 0.5 당량), TEA(100 ㎕), EDC(384 ㎎, 2.0 mmol, 10 당량) 및 상기의 산으로 세척한 CPG를 순서대로 첨가하였다. 무수 피리딘(5 ㎖)을 첨가하고, 혼합물을 봉한 다음 실온에서 3일 동안 교반하였다. 진공하에서 CPG를 여거하고, 이소프로판올에 이어서 디클로로메탄으로 광범위하게 세척하고, 공기 건조시킨 다음 1시간 동안 진공하에서 건조시켰다.
유도화된 CPG의 캡핑(capping)을 다음과 같이 실행하였다. 건조 유도화된 CPG에 Cap A 및 Cap B 용액(각각 5 ㎖, 아세트산 무수물/2,6-루티딘/THF 및 THF내 10% N-메틸이미다졸; 미국 버지니아주 스털링 소재의 글렌 리서치(Glen Research)의 DNA 합성 시약)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 진공하에서 CPG를 여거하고, 이소프로판올에 이어서 디클로로메탄으로 광범위하게 세척하고, 공기 건조시킨 다음 진공하에서 건조시켰다.
II. N
6
-벤질 데옥시아데노신 포스포르아미다이트의 합성
N6-벤조일,N6-벤질-5'-O-DMT-2'-데옥시아데노신을 전술한 바와 같이 합성하였다.
무수 THF(8 ㎖)내 N6-벤조일,N6-벤질-5'-O-DMT-2'-데옥시아데노신(196 ㎎, 0.26 mmol)에 디이소프로필에틸아민(350 ㎕, 270 ㎎, 2.04 mmol, 7.8 당량) 및 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트(161 ㎎, 0.68 mmol, 2.6 당량; 미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리히 케미칼 캄파니)를 첨가하고 혼합물을 아르곤 분위기에서 실온에서 30분동안 교반하였다. 진공하에서 용매를 제거하고 잔류물을 중탄산나트륨 용액(5%, 20 ㎖)과 에틸 아세테이트(20 ㎖) 사이에 분배시켰다. 유기 상을 중탄산나트륨 용액, 물에 이어서 포화 염수로 세척하고(각각 20 ㎖씩), 황산 나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켰다. 잔류물을 아세톤/핵산/TEA(34:65:0.7)를 사용하여 실리카 겔(4 g)에서 컬럼 크로마토그래피하여 정제하여, 목적하는 포스포르아미다이트(248 ㎎, 100%)를 수득하였다.
III. DNA 합성, 정제 및 분석
벤질 유도화된 아데노신 CPG(25 ㎎, 1.0 mol)를 비어있는 합성 컬럼(미국 버지니아주 스털링 소재의 글렌 리서치)으로 옮기고, 통상적인 합성 및 탈보호 조건을 사용하여 ABI 374 DNA 합성기(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 퍼킨 엘머, 어플라이드 바이오시스템즈 디비젼(Applied Biosystems Division))에서 올리고뉴클레오타이드를 제조하는데 사용하였다. 조질의 DMT-DNA를 정제하여, 이것을 레이닌(Rainin) HPLC 시스템(미국 매사츄세츠주 우번 소재의 레이닌 인스트루먼트캄파니(Rainin Instrument Co.))에서 레이닌 퓨어-DNA 컬럼(Rainin Pure-DNA Column)을 사용하여 표준 DMT 온/오프(On/Off) HPLC에 의해 5'-하이드록시-DNA로 전환시켰다. 올리고뉴클레오타이드를 ABI 모세관 전기영동 시스템(미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 퍼킨 엘머, 어플라이드 바이오시스템즈 디비젼)을 사용하거나 또는 다이오넥스 뉴클레오팩 컬럼(Dionex Nucleopak column)(미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 다이오넥스 코포레이션(Dionex Corp.))에서 변성 음이온-교환 HPLC 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다.
유사하게, 내부 개질된 프라이머의 합성은 비개질된 CPG를 사용하여 실행하였고, 개질된 포스포르아미다이트는 전술한 바와 같이 합성하였다.
실시예 2
t-부틸-벤질기로 개질된 프라이머의 합성
본 실시예는 3'-말단 아데노신에서 p-3급-부틸벤질기로 개질된 프라이머의 합성을 기술한다. 개질된 프라이머는 N6-(p-3급-부틸벤질)데옥시아데노신 CPG를 사용하는 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 1에서 기술한 바와 같이 합성되었다. 유도화된 CPG의 합성은 다음과 같다.
제 1 단계: N6-벤조일-N6-(p-3급-부틸벤질)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신의 합성
N6-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신(658 ㎎, 1.0 mmol)에 DMF(무수물, 10㎖)를 첨가하고, 건조될 때까지 증발시켰다. 이것을 되풀이하였다. 추가의 DMF(10 ㎖)를 아르곤 분위기에서 첨가하였다. 수소화 나트륨(44 ㎎, 1.1 mmol, 오일내의 60% 분산액)을 첨가하고, 이 혼합물을 0.5 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 4-(3급-부틸)벤질 브로마이드(272 ㎎, 1.2 mmole)를 적가시키고 밤새 실온에서 교반하였다. 진공하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이와 물 사이에(각각 20 ㎖씩) 분배시켜 추출하였다. 유기 상을 물로 세척하고(3회, 20 ㎖), 무수 황산 마그네슘으로 건조시키고 여과시킨 다음, 건조될 때까지 증발시켰다. 조질의 생성물을 메틸렌 클로라이드/메탄올/트리에틸아민 (96.5:3:0.5)을 사용하여 실리카 겔(100 g)에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, N6-벤조일,N6-(p-3급-부틸벤질)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신(229 ㎎, 28.5%)을 수득하였다.
제 2 단계: 숙시닐화
N6-벤조일,N6-(p-3급-부틸벤질)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신(217 ㎎, 0.27 mmol)을 피리딘(10 ㎖)내 숙신산 무수물(135 ㎎, 5 당량) 및DMAP(17 ㎎, 0.5 당량)으로 처리하였다. 상기 실시예 1에서 기술한 바와 같이 후처리하고, 크로마토그래피하여, N6-벤조일,N6-(p-3급-부틸벤질)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신, 3'-O-숙시네이트(199 ㎎, 82%)를 수득하였다.
제 3 단계: CPG의 유도화
상기 제 2 단계로부터 수득한 숙시네이트(180 ㎎, 0.2 mmol)를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 산으로 세척한 LCAA-CPG로 처리하였다. CPG를 캡핑하고 진공 건조시켜, N6-벤조일,N6-(p-3급-부틸벤질)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-데옥시아데노신, 3'-O-숙시네이트 유도화된 CPG(1.065 g)를 수득하였다.
실시예 3
메틸기로 개질된 프라이머의 합성
3'-말단 아데노신에서 메틸기로 개질된 프라이머를 N6-메틸 dA CPG(22 ㎎, 1μmole, 미국 버지니아주 스털링 소재의 글렌 리서치)를 사용하여 합성하였다. N6-메틸 dA CPG를 비어있는 컬럼에 넣고, 합성 및 탈보호의 표준 조건에 따라 프라이머를 제조하였다. 프라이머를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 DMT 온/오프 HPLC 방법을 사용하여 정제하였다.
실시예 4
광-불안정한 개질된 프라이머의 합성
본 실시예는 3'-말단 아데노신에서 1개 또는 2개의 니트로벤질기로 개질된 프라이머의 합성을 기술한다. 개질된 프라이머는 모노니트로벤질 dA CPG 또는 비스니트로벤질 dA CPG를 사용한 것을 제외하고는, 본질적으로는 실시예 1에서 기술한 바와 같이 합성하였다.
I. 모노니트로벤질화된 프라이머
N6-벤조일,N6-벤질-2'-데옥시아데노신 유도화된 CPG(실시예 1 참고)의 일반적인 합성법을, 알킬화제로서 오르토-니트로벤질브로마이드의 치환에 의해 N6-벤조일,N6-오르토-니트로벤질-2'-데옥시아데노신 유도화된 CPG 합성에 적용하였다. CPG를 위한 후속 단계는 실시예 1에서 기술한 바와 동일하지만, 그외에 알루미늄 호일로 반응 플라스크를 감싸서 주위 광선으로부터 중간체를 보호한다.
유도화된 CPG를 합성한 다음, 프라이머를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 합성하였고, 제조자가 기술한 프로토콜을 사용하여 넨소브 프레프(Nensorb Prep) 일회용 컬럼(미국 매사츄세츠주 보스톤 소재의 듀퐁 캄파니(Du Pont Co.), NEN 리서치 프러덕츠 바이오테크놀로지 시스템즈(NEN Research Products Biochnology Systems))을 사용하여 고상 추출에 의해 프라이머를 단리하였다.
II. 비스니트로벤질화된 프라이머
비스니트로벤질 데옥시아데노신 CPG를 전술한 바와 같이 합성하였다. 유도화된 CPG를 합성한 다음, 모노니트로벤질 프라이머에 대해 기술한 바와 같이 프라이머를 합성하고 정제하였다.
제 1 단계: 5'-O-DMT-N6-비스-오르토-니트로벤질-2'-데옥시아데노신의 합성
진공하에서 2'-데옥시아데노신 일수화물(538 ㎎, 2.0 mmol, 미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리히 케미칼)을 무수 피리딘(2회, 10 ㎖)으로 증발시켜 건조시켰다. 잔류물을 아르곤 분위기에서 무수 DMF(10 ㎖, 미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리히)에 용해시키고, 수소화 나트륨(88 ㎎, 2.2 mmol, 1.1 당량, 오일내 60%의 분산액)을 첨가하고, 실온에서 40분동안 교반하였다. 2-니트로벤질 브로마이드(710 ㎎, 3.3 mmol, 1.5 당량)를 첨가하고, 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 진공하에서 DMF를 증발시켜 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에(각각 20 ㎖) 분배시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트(20 ㎖)로 추출시키고, 추출액을 모아 물(20 ㎖)로 세척하고, 황산 마그네슘으로 건조시키고, 여과한 다음 증발시켰다. 조질의 생성물을 실리카 겔(50 g, CH2CH2내 3% MeOH 사용)에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 2'-데옥시-N6-비스-오르토-니트로벤질아데노신(320 ㎎, 30%)을 수득하였다.
2'-데옥시-N6-비스-오르토-니트로벤질아데노신(200 ㎎, 0.518 mmol)에 무수 피리딘(10 ㎖)을 첨가하고 건조될 때까지 증발시켰다. 피리딘(10 ㎖)을 첨가하고, 그 다음 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(900 ㎎, 2.3 mmol, 4.5 당량) 및 트리에틸아민(280 ㎎, 2.76 mmol, 4.0 당량)을 첨가한 다음, 5시간 동안 아르곤 분위기의 실온에서 교반하였다. 물(0.5 ㎖)을 첨가하고 20분 동안 교반하였다. 혼합물을 에테르 및 물(각각 20 ㎖)에 분배시키고, 수성 상을 에테르(20 ㎖)로 다시 추출하였다. 추출액을 모아 물(20 ㎖)로 세척하고 무수 황산 나트륨으로 건조시킨 다음, 여과하고 증발시켰다. 이렇게 얻어진 물질을 실리카 겔(4 g, 메틸 클로라이드내 0.7 내지 2.5%의 메탄올)에서 크로마토그래피로 정제하여, 5'-O-DMT-N6-비스-오르토-니트로벤질-2'-데옥시아데노신(121 ㎎, 33%)을 수득하였다.
제 2 단계: 숙시닐화
5'-O-DMT-N6-비스-오르토-니트로벤질-2'-데옥시아데노신(121 ㎎, 0.145 mmol)을 무수 피리딘(2회, 3㎖)과 함꼐 증발시켜 건조시켰다. 피리딘(3 ㎖), 숙신산 무수물(58 ㎎, 0.58 mmol, 4 당량) 및 DMAP(11 ㎎, 촉매)를 첨가하고, 용액을 3일 동안 실온에서 교반하였다. 진공하에서 용액을 증발시키고, 잔류물을 메틸렌 클로라이드(10 ㎖) 및 나트륨 시트레이트 완충액(0.1 M, pH 5.0, 10 ㎖) 사이에 분배시켰다. 유기 상을 무수 황산 나트륨으로 건조시키고 여과한 다음, 건조될 때까지 증발시켰다. 조질의 생성물을 실리카 겔(2 g, EtOAc/CH2CH2/TEA(32:67:1) 10㎖에 이어서 MeOH/CH2CH2(3:97) 25㎖를 사용)에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 연황색 발포체로서 5'-O-DMT-N6-비스-오르토-니트로벤질-2'-데옥시아데노신-3'-O-숙시네이트(138 ㎎, 99.5%)를 수득하였다.
제 3 단계: CPG의 유도화
산으로 세척한 LCAA-CPG를 실시예 1에서와 같이 제조하였다.
개질된 뉴클레오사이드 중간체를 산으로 세척한 CPG에 결합시키는 것은 다음과 같이 실행하였다. 5'-O-DMT-N6-비스-오르토-니트로벤질-2'-데옥시아데노신-3'-O-숙시네이트(37 ㎎, 0.04 mmol)를 호박색 유리 바이알(vial)중에서 TEA(16 ℓ)로 처리하고 증발시켰다. 이 잔류물에 무수 피리딘(1.5 ㎖), TEA(2 ㎕), DMAP(2.4 ㎎), EDC(76 ㎎, 0.04 mmol) 및 산으로 세척한 LCAA-CPG(200 ㎎)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3일 동안 회전 혼합기로 교반하였다. CPG를 감압하에서 여거하고, 이소프로탄올에 이어서 메틸렌 클로라이드로 광범위하게 세척하고, 공기 건조시킨 다음, 1시간 동안 진공하에서 건조시켰다.
유도화된 CPG의 캡핑은 실시예 1에서 기술한 바와 같이 실행하였다.
실시예 5
개질된 프라이머를 사용하는 증폭-개질된 뉴클레오타이드의 위치의 영향
프라이머 이량체의 형성에 대한 개질된 프라이머의 영향을 설명하기 위해서, 개질된 프라이머 및 비개질된 프라이머 둘다를 사용하여 HIV-1 RNA의 증폭에 대해 비교해 보았다. 추가로, 프라이머 이량체의 감소에 대한 개질된 뉴클레오타이드의 위치의 영향을 평가하기 위해서 3가지의 상이한 업스트림(upstream) 개질된 프라이머, 즉 단지 개질된 염기의 위치가 상이한 프라이머를 사용하여 증폭을 실행하였다.
표적 핵산
HIV-1 RNA 주형은 본질적으로는 멀더 등의 문헌[J. Clin. Microbiol.32(2); 292-300 (1994)]에서 기술한 바와 같이 HIV-1 RNA 전사 벡터를 사용하여 합성하였다.
프라이머
개질된 프라이머 및 비개질된 프라이머를 사용하여 증폭을 실행하였다. 비개질된 프라이머의 뉴클레오타이드 서열을 5'에서 3'의 방향으로 하기 표 1에 나타내었다. 업스트림 프라이머 RAR1032MB(서열 식별 번호 : 1) 및 다운스트림(downstream) 프라이머 RAR1033 MB(서열 식별 번호 : 2)는 HIV-1 참고 균주 HXB2(유전자 은행(Genebank) 기탁 번호 제 K03455 호)의 서열중 위치가 뉴클레오타이드 위치 2956번부터 3130번에 해당하는 175개의 염기쌍 생성물을 증폭시킨다.
| 프라이머 | 서열 식별 번호 | 핵산 서열 |
| RAR1032MB | 1 | CAATGAGACACCAGGAATTAGATATCAGTACAA |
| RAR1033MB | 2 | CCCTAAATCAGATCCTACATATAAGTCATCCA |
상기 프라이머 표시는 비개질된 프라이머를 지칭하는 것이다. 비개질된 프라이머는 5'-말단에 바이오틴화되어 있다. 비개질된 프라이머와 동일한 뉴클레오타이드 서열로 구성된 개질된 프라이머는 실시예 1에서 기술하는 바와 같이 합성되었으며, 3'-말단 위치 또는 3'-말단으로부터 업스트림으로 1번째 또는 3번째 뉴클레오타이드에 벤질화된 아데노신을 함유하고 있다. 프라이머의 개질된 형태는 하기 표 2와 같이 표시된다.
| 프라이머 | 서열 식별 번호 | 개질된 뉴클레오타이드의 위치 |
| RAR1032MBA1 | 1 | 3' 말단 |
| RAR1032MBA2 | 1 | 3'-말단으로부터 업스트림으로 1번째 뉴클레오타이드 |
| RAR1032MBA4 | 1 | 3'-말단으로부터 업스트림으로 3번째 뉴클레오타이드 |
| RAR1033MBA1 | 2 | 3'-말단 |
증폭
증폭은 하기 시약을 함유하는 100 ㎖의 반응물에서 실행하였다:
100 카피(copy)의 HIV 주형 RNA,
50 mM의 트리신(pH 8.33),
110 mM의 KOAc,
300μM 씩의 dATP, dCTP 및 dGTP,
50 μM의 dTTP,
500 μM의 dUTP,
50 μM의 각각의 프라이머,
3.5 mM의 Mn(OAc)2,
13%의 글리세롤,
20 유니트의 Z05 DNA 폴리머라제*및
2.0 유니트의 UNG**.
*미국 특허 제 5,455,170 호에 개시되어 있음
**호프만-라 롯슈에서 개발하여 제조하고, 퍼킨 엘머(미국 코넥티컷주 노웍 소재)에서 판매함.
하기의 온도 분포를 사용하여 TC480 DNA 열 순환기(미국 코넥티컷주 노웍 소재의 퍼킨 엘머)에서 증폭 온도 순환을 수행하였다.
예비 반응 배양; 45℃에서 4분동안;
역전사: 60℃에서 20분동안;
46 주기: 94℃에서 45초 동안 변성, 60℃에서 45초 동안 어닐링(annealing)/연장;
최종 연장: 60℃에서 7분 동안;
반응 후 유지: 10℃에서 분석할 때까지(짧은 시간).
증폭된 생성물의 검출
증폭된 생성물의 존재는 다음과 같은 겔 전기영동으로 검출하였다. 반응 생성물을 아가로즈 겔(100 ㎖, 3%의 뉴시브(NuSieve) 및 0.5%의 시켐(SeaChem))을 사용하여 분별화하고, 1X TBE(0.089 M 트리스, 0.089 M 붕산, 0.0025 M 이나트륨 EDTA) 이동(running) 완충액을 사용하였다. 존재하는 임의의 DNA를 염색시키기 위해서 에티디움 브로마이드(0.5 ㎍/㎖)를 첨가하였다. 전기영동은 약 1시간 동안 100 볼트에서 실행하였다. DNA의 에티디움 브로마이드-염색된 밴드를 UV 조사에 의해 가시화시켰다.
결과
겔 전기영동 분석의 결과를 도 1에 제시하였다. 비개질된 프라이머와 개질된 프라이머의 조합물을 사용한 증폭에 각각 해당하는 레인의 번호를 하기 표 3에 제시하였다. 목적하는 HIV 생성물에 해당하는 밴드는 도 1에서 화살표로 표시하였다. 겔내의 다른 밴드는 비특이성 증폭 생성물 및 특히 프라이머 이량체에 해당된다.
| 프라이머 | 레인 번호 | |
| 업스트림 | 다운스트림 | |
| RAR1032MB | RAR1033MB | 1 |
| RAR1032MBA1 | RAR1033MB | 2 |
| RAR1032MBA2 | RAR1033MB | 3 |
| RAR1032MBA4 | RAR1033MB | 4 |
| RAR1032MB | RAR1033MBA1 | 5 |
| RAR1032MBA1 | RAR1033MBA1 | 6 |
| RAR1032MBA2 | RAR1033MBA1 | 7 |
| RAR1032MBA4 | RAR1033MBA1 | 8 |
프라이머 이량체의 형성은 목적하는 증폭 생성물의 형성과 경쟁하기 때문에, 전형적으로 프라이머 이량체를 감소시키면 그에 따라 목적하는 생성물의 형성량이 증가한다. 따라서, 개질된 프라이머의 영향은 비개질된 프라이머를 사용하여 형성된 프라이머 이량체의 형성량과, 개질된 프라이머를 사용하여 형성된 프라이머 이량체의 형성량을 비교하고, 비개질된 프라이머를 사용하여 형성된 목적하는 표적의 양과, 개질된 프라이머를 사용하여 형성된 목적하는 표적의 양을 비교함으로써 확인할 수 있다.
2개의 비개질된 프라이머를 사용한 결과(1번 레인)를 하나의 3'-개질된 프라이머를 사용한 결과(2번 레인 및 5번 레인) 및 2개의 3'-개질된 프라이머를 사용한 결과(6번 레인)와 비교하면, 1개 또는 2개의 개질된 프라이머를 사용하는 경우 프러머 이량체가 감소함을 알 수 있다. 하나의 3'-개질된 프라이머를 사용하여 증폭시키는 경우, 어느 프라이머가 개질되었는지에 따라 프라이머 이량체의 감소되는 정도에 작은 차이를 보였다. 2개의 개질된 프라이머를 사용하는 경우(6번 레인), 프라이머 이량체가 크게 감소하였고 증폭된 표적 서열의 양도 크게 증가하였다.
개질된 뉴클레오타이드 위치의 효과는 6번 레인 내지 8번 레인을 비교하여 확인하였다. 3'-말단 뉴클레오타이드에 인접한 뉴클레오타이드에서 개질된 프라이머(7번 레인)를 사용하여 얻은 프라이머 이량체의 감소 정도는 3'-말단 뉴클레오타이드(6번 레인)에서 개질된 프라이머를 사용하여 얻은 결과에 상당했으나, 3'-말단 뉴클레오타이드로부터 업스트림으로 3번째 염기에서 개질된 프라이머(8번 레인)를 사용한 경우 개선 정도가 약간 낮았다.
실시예 6
개질된 프라이머를 사용한 추가의 증폭-개질된 뉴클레오타이드 위치의 영향
프라이머 이량체의 형성에 대한 개질된 프라이머의 영향을 추가로 설명하기 위해서, 본질적으로는 전술한 바와 같이, 개질된 프라이머 및 비개질된 프라이머 둘다를 사용하여 HCV RNA의 증폭을 비교하였다. 3가지의 상이한 개질된 다운스트림 프라이머, 즉 단지 개질된 염기 위치가 상이한 프라이머를 사용하여 증폭을 실행하였다.
표적 핵산
HCV RNA 주형은 영 등의 문헌[J. Clin. Microbiol.31(4): 882-886(1993)]에서 기술한 바와 같이 HCV RNA 전사 벡터를 사용하여 합성하였다.
프라이머
증폭은 비개질된 프라이머 및 개질된 프라이머 둘다를 사용하여 실행하였다. 비개질된 프라이머의 뉴클레오타이드 서열을 5'에서 3'의 방향으로 하기 표 4에 나타내었다. 업스트림 프라이머 ST280A(서열 식별 변호 : 3) 및 다운스트림 프라이머 ST778AA(서열 식별 변호 : 4)는 HCV 게놈의 5' 비번역 영역으로부터 240개의 염기쌍 생성물을 증폭시킨다.
| 프라이머 | 서열 식별 번호 | 서열 |
| ST280A | 3 | GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTA |
| ST778AA | 4 | GCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAA |
상기 프라이머 표시는 비개질된 프라이머를 지칭한 것이다. 비개질된 프라이머와 동일한 뉴클레오타이드 서열로 구성된 개질된 프라이머는 실시예 1에서 기술하는 바와 같이 합성되었으며, 3'-말단 위치 또는 3'-말단으로부터 업스트림으로 1번째 또는 3번쩨 뉴클레오타이드 위치에 벤질화된 아데노신을 함유하고 있다. 프라이머의 개질된 형태는 하기 표 5와 같이 표시된다.
| 프라이머 | 서열 식별 번호 | 개질된 뉴클레오타이드의 위치 |
| ST280ABA1 | 3 | 3'-말단 |
| ST778AABA1 | 4 | 3'-말단 |
| ST778AABA2 | 4 | 3'-말단으로부터 업스트림으로 1번째 뉴클레오타이드 |
| ST778AABA4 | 4 | 3'-말단으로부터 업스트림으로 3번째 뉴클레오타이드 |
증폭 및 분석
증폭은 본질적으로는 100카피의 HCV RNA 주형을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 3에서 기술한 바와 같이 실행되었다. 증폭된 생성물의 겔 분석은 실시예 3에서 기술한 바와 같이 실행되었다.
결과
겔 전기영동 분석의 결과를 도 2에서 제시하였다. 비개질된 프라이머와 개질된 프라이머의 조합물을 사용한 증폭에 각각 해당하는 레인의 번호를 하기 표 6에 제시하였다. 목적하는 HCV 생성물에 해당하는 밴드는 도 2에서 화살표로 표시하였다. 겔내의 다른 밴드는 비특이성 증폭 생성물 및 특히 프라이머 이량체에 해당된다.
| 프라이머 | 레인 번호 | |
| 업스트림 | 다운스트림 | |
| ST280A | ST778AA | 1 |
| ST280A | ST778AABA1 | 2 |
| ST280A | ST778AABA2 | 3 |
| ST280ABA | ST778AABA4 | 4 |
| ST280ABA1 | ST778AA | 5 |
| ST280ABA1 | ST778AABA1 | 6 |
| ST280ABA1 | ST778AABA2 | 7 |
| ST280ABA1 | ST778AABA4 | 8 |
프라이머 이량체의 형성은 목적하는 증폭 생성물의 형성과 경쟁하기 때문에, 전형적으로 프라이머 이량체를 감소시키면 그에 따라 목적하는 생성물의 형성량이 부수적으로 증가한다. 따라서, 개질된 프라이머의 영향은 비개질된 프라이머를 사용하여 형성된 프라이머 이량체의 형성량과, 개질된 프라이머를 사용하여 형성된 프라이머 이량체의 형성량을 비교하고, 비개질된 프라이머를 사용하여 형성된 목적하는 표적의 양과 개질된 프라이머를 사용하여 형성된 목적하는 표적의 양을 비교함으로써 확인할 수 있다.
얻어진 결과는 선행 실시예에서 기술된 HIV 증폭에서 얻어진 결과와 유사하였으나, HCV 증폭의 경우, 목적하는 생성물의 증가가 HIV 증폭의 경우보다 현저히 나타났다. 2개의 비개질된 프라이머를 사용한 결과(1번 레인)를 하나의 3'-개질된 프라이머를 사용한 결과(2번 레인 및 5번 레인) 및 2개의 3'-개질된 프라이머를 사용한 결과(6번 레인)와 비교하면, 1개 또는 2개의 개질된 프라이머를 사용하는 경우 프라이머 이량체가 감소함을 알 수 있다. 2개의 개질된 프라이머를 사용하는 경우(6번 레인), 프라이머 이량체가 크게 감소하였고 증폭된 표적의 양도 크게 증가하였다. 선행 실시예에서와 같이, 어느 프라이머가 개질되었는지에 따라 하나의 3'-개질된 프라이머를 사용하여 증폭시키는 경우, 프라이머 이량체의 감소되는 정도에 작은 차이를 보였다.
개질된 뉴클레오타이드 위치의 영향은 6번 레인 내지 8번 레인을 비교하여 확인하였다. 3'-말단 뉴클레오타이드에서 개질된 프라이머(6번 레인), 3'-말단 뉴클레오타이드에 인접한 뉴클레오타이드에서 개질된 프라이머(7번 레인) 및 3'-말단 뉴클레오타이드로부터 업스트림으로 3번째 염기인 뉴클레오타이드에서 개질된 프라이머(8번 레인)를 사용한 경우, 본질적으로 동등한 결과를 얻었다. 이러한 결과는 개질기가 프라이머의 3'말단에서 4개의 뉴클레오타이드중 어느 것에나 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 7
개질된 프라이머를 사용한 증폭-개질기의 영향
프라이머 이량체의 형성에 대한 개질된 프라이머의 영향을 추가로 설명하고, 또다른 프라이머 개질을 설명하기 위해서, 3가지의 상이한 개질기(벤질, 니트로벤질 및 메틸기)중 한가지를 첨가함으로써 개질된 개질된 프라이머 및 비개질된 프라이머를 사용하여 HCV RNA의 증폭을 비교하였다.
증폭 결과는 2가지의 상이한 방법으로 분석하였다. 한 비교 세트에서는 반응 생성물의 겔 전기영동 분석에 의해 프라이머 이량체의 존재를 분석하였다. 다른 비교 세트에서는 전술했던 동역학적 PCR 방법을 사용하여, 증폭 과정 동안의 프라이머 이량체의 형성을 모니터하였다.
표적 핵산
HCV RNA 주형은 영 등의 문헌[J. Clin. Microbiol.31(4): 882-886(1993)]에서 기술한 바와 같이 HCV RNA 전사 벡터를 사용하여 합성하였다.
증폭 프라이머
개질된 프라이머 및 비개질된 프라이머를 사용하여 증폭을 실행하였다. 개질된 프라이머는 비개질된 프라이머와 동일한 뉴클레오타이드 서열로 구성되지만, 3'-말단 아데노신에 메틸기, 벤질기 또는 니트로벤질기를 첨가하여 개질시켰다. 프라이머는 선행 실시예에서 기술한 바와 같이 합성하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 7과 같이 표시된다.
| 프라이머 | 서열 식별 번호 | 3' 염기의 개질 |
| ST280A | 3 | 개질되지 않음 |
| ST280AMEA1 | 3 | 메틸 |
| ST280ABA1 | 3 | 벤질 |
| ST280ANBA1 | 3 | 니트로벤질 |
| ST788AA | 4 | 개질되지 않음 |
| ST788AAMEA | 4 | 메틸 |
| ST788AABA1 | 4 | 벤질 |
| ST788AANBA1 | 4 | 니트로벤질 |
증폭 반응
증폭은 하기 시약을 함유하는 100 ㎖의 반응물에서 실행하였다:
0, 20 또는 200 카피의 HCV RNA 주형
50 mM의 트리신(pH 8.3),
110 mM의 KOAc,
3.5 mM의 Mn(OAc)2,
300μM 씩의 dATP, dCTP 및 dGTP,
50 μM의 dTTP,
500 μM의 dUTP,
250 nM의 각각의 프라이머,
20유니트의 rTth*,
2유니트의 UNG*및
13%의 글리세롤.
*호프만-라 롯슈에서 개발하여 제조하고, 퍼킨 엘머(미국 코넥티컷주 노웍 소재)에서 판매함.
하기의 온도 분포를 사용하여 진앰프(GeneAmp(등록상표)) PCR 시스템 9600 열 순환기(미국 코넥티컷주 노웍 소재의 퍼킨 엘머)에서 각 반응 혼합물을 열순환시켰다:
예비 반응 배양; 45℃에서 4분동안;
역전사: 60℃에서 24분동안;
46 주기: 94℃에서 30초 동안 변성, 60℃에서 30초 동안 어닐링/연장;
최종 연장: 60℃에서 7분 동안;
반응 후 유지: 4℃에서.
증폭 생성물의 검출
A. 전기영동
증폭된 생성물의 존재는 다음과 같은 겔 전기영동에 의해 검출하였다. 반응 생성물을 아가로즈 겔(100㎖, 3%의 뉴시브, 0.5%의 시켐 및 0.5 ㎍/㎖의 에티디움 브로마이드) 및 1X TBE(0.089 M 트리스, 0.089 M 붕산, 0.0025 M 이나트륨 EDTA) 이동 완충액을 사용하여 분별화하였다. 전기영동은 약 1시간 동안 100 볼트에서 실행되었다. DNA의 에티디윰 브로마이드-염색된 밴드를 UV 조사에 의해 가시화시켰다.
B. 동역학적 PCR에 의한 검출
전술한 동역학적 PCR 방법에서, 이중사슬 DNA에 삽입되면 보다 강한 형광을 보이는 에티디움 브로마이드와 같은 삽입 염료를 PCR에 첨가한다. 증폭 과정 동안 염료의 형광을 측정함으로써 증폭 과정 동안 이중사슬 DNA의 증가를 모니터한다. 동역학적 PCR 방법은 단지 이중사슬 DNA의 총량의 증가를 측정하는 것이기 때문에, 비특이성 증폭의 형성이 독립적으로 측정되지는 않는다. 주형 증폭과 무관한, 프라이머-이량체로부터 일어나는 비특이성 증폭의 발생을 측정하기 위해서, 핵산 주형 없이 반응을 실행하였다. 이러한 주형이 없는 반응에서, 이중사슬 DNA가 증가하는 것은 주형-비의존성 비특이성 증폭 생성물에 의한 것이다.
동역학적 PCR 반응 조건은 반응 혼합물에 에티디움 브로마이드를 1 g/㎖의 농도로 첨가하는 것을 제외하면, 전술한 바와 같다. 반응은 유럽 특허 제 640 828 호에서 기술된 바와 같이 반응 혼합물의 형광을 측정하여 모니터하였다.
형광 측정치는 반응 초기의 주기 동안 얻은 초기 형광 측정치로 나누어서 정규화하였고, 주기 사이의 형광 측정치는 비교적 일정하였다. 초기 형광 측정을 위해 선택된 주기 번호는 비교된 모든 반응에서 동일하여, 모든 측정치가 동일한 반응 주기에 대한 상대적인 증가를 나타낸다. 프라이머 이량체가 형성될 때까지 표적이 없는 반응에서의 반응 형광은 비교적 일정하게 유지된다. 대부분의 반응에서, 충분한 증폭 주기가 실행되면, 프라이머 이량체는 결국 감지가능하게 된다. 개질된 프라이머의 영향은 적어도 프라이머 이량체가 형성될 때까지 실행된 주기의 횟수를 비교함으로써 알 수 있다.
결과
겔 전기영동의 결과를 도 3에 나타내었다. 비개질된 프라이머 및 3가지 유형의 개질된 프라이머를 사용하고, 200 카피, 20 카피 또는 0 카피의 HCV RNA를 사용하여 각각 증폭시킨 것에 해당하는 레인의 번호를 하기 표 8에 제시하였다(레인의 번호는 왼쪽에서 오른쪽으로 매긴다: 1번 레인 내지 30번 레인은 겔의 상반부에 있으며; 31번 레인 내지 60번 레인은 겔의 하반부에 있다). 또한, 분자량 마커(marker)는 1번 레인과 31번 레인(HaeIII 분해된 PhiX 174 RF DNA; 미국 매사츄세츠주 베벌리 소재의 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)), 및 30번 레인과 60번 레인(슈퍼 래더 로우(Superladder-low), 20bp 래더 ;미국 캘리포니아주 델 마르 소재의 진슈라(GenSura))에 존재한다. 목적하는 특이성 생성물에 해당하는 밴드(∼ 230 bp)는 도 3에 화살표로 표시되어 있다. 겔내의 다른 밴드는 비특이성 증폭 결과, 특히 프라이머 이량체에 해당한다.
| 주형 | 프라이머 | 레인 번호 |
| 200 | 개질되지 않음 | 2-5 |
| 200 | 메틸화됨 | 6-9 |
| 200 | 벤질화됨 | 10-13 |
| 200 | 니트로벤질화됨 | 14-17 |
| 20 | 개질되지 않음 | 18-21 |
| 20 | 메틸화됨 | 22-25 |
| 20 | 벤질화됨 | 26-29 |
| 20 | 니트로벤질화됨 | 32-35 |
| 0 | 개질되지 않음 | 36-41 |
| 0 | 메틸화됨 | 42-47 |
| 0 | 벤질화됨 | 48-53 |
| 0 | 니트로벤질화됨 | 54-59 |
이 결과는 개질된 프라이머를 사용하여 증폭시킨 경우가 비개질된 프라이머를 사용하여 증폭시킨 경우보다 증폭된 HCV 핵산의 양이 많음을 나타낸다. 또한, 개질된 프라이머를 사용하여 증폭시킨 경우는 비개질된 프라이머를 사용하여 증폭시킨 경우에 비해 프라이머 이량체의 양이 감소하였다.
동역학적 PCR 분석에서, 전체 반응에 걸쳐 형광을 모니터하였다. 형광 증가가 감지된 후의 형광 증가율은 형광 대 주기 번호를 플로팅하여 얻어진 곡선(제시하지 않음)의 모양으로 알 수 있듯이 모든 반응에서 거의 동일하였다. 이것은 개질된 프라이머가 초기 증폭 단계후에 각각의 증폭 단계의 효율을 감지할만큼 억제하지는 않음을 나타낸다. 반응은 형광의 증가가 감지되기 전에 실행된 주기 횟수에 있어서 상당히 상이하였다.
반응간의 차이 정도를 정량화하기 위해서, 형광이 임의의 형광 세기(arbitrary fluorescence level; AFL)를 초과할 때까지 실행된 증폭 주기 횟수로써 결과를 나타내었다. AFL은 기준선 형광 세기에 근접하지만, 측정된 형광내에서 불규칙적으로 변동하는 범위 보다는 높은 값으로 선택하여, 증폭이 기하학적으로 증대되는 동안 반응 동역학을 측정하였다. 나중의 주기에서는 증폭된 생성물이 축적되어 반응을 억제하고, 결국에는 반응 정체기에 들어선다.
동역학적 PCR의 결과를 하기 표 9에 요약하였다. 20 또는 200 카피의 표적 주형의 증폭에 대한 각각의 수치는 벤질화된 프라이머와 20 카피의 표적을 사용한 증폭외에는 5회의 반복 증폭의 평균치로 나타냈으며, 벤질화된 프라이머와 20 카피의 표적을 사용한 증폭은 4회 반복의 평균치를 나타내었다. 주형 없이 증폭시킨 경우의 각각의 수치는 8회 반복의 평균치로 나타내었다.
표적없이 벤질화된 프라이머를 사용한 증폭의 8회 반복중 2회는 46 주기를 끝내도 프라이머 이량체가 형성되지 않는 결과를 나타냈다. 따라서 나머지 6회의 증폭의 평균치를 나타냈으며, 이것은 형성된 프라이머 이량체에 대한 조건부 평균치이다. 이러한 조건부 평균치는 삭제된 데이타 때문에 제시된 다른 측정치와 비교할 수 없다.
| 프라이머 | 표적 카피 수 | ||
| 0 | 20 | 200 | |
| 개질되지 않음 | 35 | 36 | 34 |
| 메틸 | 39 | 38 | 36 |
| 니트로벤질 | 43 | 40 | 37 |
| 벤질 | (43*) | 41 | 37 |
| * 8개중에 2개는 프라이머 이합체가 형성되지 않음 |
상기 데이타를 통해 개질된 프라이머가 분명히 표적 핵산의 증폭을 지연시켜 수회의 주기 후에 AFL에 도달함을 알 수 있다. 이러한 지연이 특이성 증폭 생성물의 최종 수율의 감소를 가져오는 아니다. 표적 핵산에 대한 모든 증폭은 실험에 사용된 46 주기이내에 정체기에 도달하는 것으로 관찰되었으며, 겔 전기영동 분석의 상응하는 데이타로부터 알 수 있듯이 개질된 프라이머를 사용하는 경우 최종 수율이 증가하였다.
상기 데이타는 프라이머 이량체의 형성의 지연되는 것은 표적의 증폭이 지연되는 것 보다 상당히 큼을 나타낸다. 프라이머의 유리한 영향은 표적이 없는 증폭과 200 카피의 주형의 증폭을 비교하면 가장 명확하게 나타난다. 비개질된 프라이머를 사용하는 경우, 형광이 AFL까지 증가하는 것은 표적이 없는 경우보다 1주기 후에 나타나며, 이것은 표적의 증폭이 프라이머 이량체 형성과 구별하기가 힘들다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 개질된 프라이머를 사용하는 경우, 프라이머 이량체로 인한 형광의 증가는 적어도 3주기 후에 나타났고, 벤질화된 프라이머를 사용하는 경우 적어도 6주기 후에 나타났다. 따라서, 표적 증폭을 감지할 수 있고, 표적 증폭을 프라이머 이량체의 형성과 구별할 수 있었다.
표적이 없는 증폭 및 20 카피의 주형의 증폭을 비교하면, 개질된 프라이머의 영향은 표적 증폭을 지연시키는 것보다 프라이머 이량체의 개시를 보다 크게 지연시키는 동일한 패턴을 나타냈다. 비개질된 프라이머를 사용하는 경우, 20 카피의 주형을 검출할 수 없었다. 니트로벤질 및 벤질 프라이머를 사용하는 경우, 이러한 시스템에서 충분히 프라이머 이량체의 형성을 지연시켜 20 카피의 주형을 검출할 수 있었다.
각각의 증폭 주기에서의 형광을 모니터하여 얻은 데이타(데이타는 제시하지 않음)에 의하면, 일반적으로 프라이머 이량체 형성의 지연은 프라이머 이량체 형성이 46 주기이내에 정체기에 도달하지 않도록 하기에 충분하였다. 따라서, 개질된 프라이머는 프라이머 이량체가 상당량 형성되기 전에 표적의 증폭을 완료시키고 반응을 중지시키기에 충분하게 프라이머 이량체의 형성을 지연시키는 것으로 나타났다.
실시예 8
광-불안정한 프라이머
개질된 광-불안정한 프라이머의 사용을 설명하기 위해서, 개질된 프라이머 및 비개질된 프라이머 둘다를 사용하여 HCV RNA 증폭을 실행하였다. 개질된 프라이머는 3'-말단 아데닌의 고리외 아민에 1개 또는 2개의 니트로벤질기를 결합시켜 개질하였다.
증폭 프라이머
프라이머는 실시예 4에서 기술한 바와 같이 합성하였다. 사용된 프라이머는 표 10과 같이 표시하였다.
| 프라이머 | 서열 식별 번호 | 3' 염기의 개질 |
| ST280A | 3 | 개질되지 않음 |
| 15239 | 3 | 비스-니트로벤질 |
| 15241 | 3 | 모노니트로벤질 |
| ST778AA | 4 | 개질되지 않음 |
| 15240 | 4 | 비스-니트로벤질 |
| 15242 | 4 | 모노니트로벤질 |
증폭 반응
각각의 프라이머 쌍에 대해, 투입 표적 농도의 희석된 시리즈를 사용하여 반응을 실행하였다. 프라이머 쌍 및 투입 표적 농도의 조합을 각각 포함하는 2조의 반응을 실행하였고, 각 반응 조에서, 주어진 프라이머 쌍 및 표적 농도를 함유하는 각각의 반응을 2회씩 실행하였다. 증폭은 하기 시약을 함유하는 100 ㎖의 반응물에서 실행하였다:
0, 10, 102, 103, 104또는 105카피의 HCV RNA 주형,
55 mM의 트리신,
90 mM의 KOAc,
3 mM의 Mn(OAc)2,
200μM 씩의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP,
200 μM의 dUTP,
250 nM의 각각의 프라이머,
10유니트의 rTth*,
2유니트의 UNG*및
8%의 글리세롤.
*호프만-라 롯슈에서 개발하여 제조하고, 퍼킨 엘머(미국 코넥티컷주 노웍 소재)에서 판매함.
하기의 온도 분포를 사용하여 진앰프 PCR 시스템 9600 열 순환기(미국 코넥티컷주 노웍 소재의 퍼킨 엘머)에서 각 반응 혼합물을 열순환시켰다:
예비 반응 배양; 50℃에서 5분동안;
역전사: 60℃에서 30분동안;
초기 변성: 95℃에서 1분동안;
2 주기: 195℃에서 5초동안 변성, 60℃에서 20초 동안 어닐링/연장;
46 주기: 90℃에서 15초 동안 변성, 60℃에서 20초 동안 어닐링/연장;
최종 연장: 72℃에서 10분 동안.
전체 반응에 걸쳐 폴리싱(polishing)된 반응 시험관 캡(미국 코넥티컷주 노웍 소제의 퍼킨 엘머)을 사용하였다. 역전사 단계에서 반응 온도를 60℃까지 올린 후, 열 순환기의 구역내의 PCR 트레이에서 가열된 뚜껑을 제거하고, 반응 시험관중 반을 알루미늄 호일로 차폐하였다(두번의 반응중 한번은 전부 호일로 차폐함). 나머지 반은 302 nm에서 빛을 방출하는 수동 UV 램프(UVP 모델 UVP-57; 미국 캘리포니아주 샌 가브리엘 소재의 UVP 프러덕츠(UVP Products))를 사용하여 10분 동안 조사시켰다. 가열된 차폐물을 제거하고 증폭을 계속하였다.
결과
증폭 결과를 전술한 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 그 결과를 도 4에 제시하였다. 각 반응에서 사용된 프라이머 및 주형 카피 수(카피 수는 로그값으로 나타냄)를 겔에 나타내었다. 목적하는 생성물에 해당하는 밴드를 도 4에 표시하였다. 겔의 다른 밴드는 비특이성 증폭 생성물, 특히 프라이머 이량체에 해당한다.
UV-조사된 반응 세트를 비교하면, 개질된 프라이머를 사용하는 경우 프라이머 이량체가 상당히 감소함을 나타냈고, 특히 적은 카피수에서 프라이머 이량체가 상당히 감소함을 나타냈다.
비-조사된 반응 세트를 비교하면, 비스니트로벤질 프라이머를 사용하는 경우 예상한 바와 같이 증폭이 완전히 억제되는 결과를 보였다. 모노니트로벤질 프라이머를 사용하는 증폭의 경우, 생성물만을 수득하였을 뿐만 아니라 프라이머 이량체가 상당히 감소함을 보였고, 이것은 선행 실시예에서 얻어진 결과와 일치하는 결과이다.
실시예 9
p-3급-부틸벤질-개질된 프라이머의 증폭
본 실시예는 p-3급-부틸벤질기로 개질된 프라이머를 사용하는 HCV RNA의 증폭을 기술한다.
표적 핵산
HCV RNA 주형은 영 등의 문헌[J. Clin. Microbiol.31(4): 882-886(1993)]에서 기술한 바와 같이 HCV RNA 전사 벡터를 사용하여 합성하였다.
프라이머
증폭은 상기 실시예 2에서 기술하고 있는 바와 같이 개질된 프라이머를 사용하여 실행하였다. 비개질된 프라이머의 뉴클레오타이드 서열을 5'에서 3'의 방향으로 하기 표 11에 나타내었다. 업스트림 프라이머 ST280A(서열 식별 번호 : 3) 및 다운스트림 프라이머 ST778AA(서열 식별 번호 : 4)의 개질된 영역을 갖는 프라이머를 사용하였다. 프라이머의 개질된 형태를 하기 표 11과 같이 표시하였다.
| 프라이머 | 서열 식별 번호 | 개질된 뉴클레오타이드의 위치 |
| ST280ATBU | 3 | 3'-말단 |
| ST778AATBU | 4 | 3'-말단 |
증폭 및 분석
증폭은 하기 시약을 함유하는 100 ㎖의 반응물에서 실행하였다:
20, 5, 2.5, 2 또는 0 카피의 HCV 주형 RNA,
50 mM의 트리신(pH 8.33),
110 mM의 KOAc,
300μM 씩의 dATP, dCTP 및 dGTP,
50 μM의 dTTP,
500 μM의 dUTP,
50 nM의 각각의 프라이머,
3.5 mM의 Mn(OAc)2,
13%의 글리세롤,
20 유니트의TthDNA 폴리머라제*및
8.0 유니트의 UNG*.
*호프만-라 롯슈에서 개발하여 제조하고, 퍼킨 엘머(미국 코넥티컷주 노웍 소재)에서 판매함.
하기의 온도 분포를 사용하여 TC480 DNA 열 순환기(미국 코넥티컷주 노웍 소재의 퍼킨 엘머)에서 증폭 온도를 순환시켰다:
예비 반응 배양; 45℃에서 12분동안;
UNG 불활성화: 90℃에서 30초 동안;
역전사: 60℃에서 20분동안;
47 주기: 94℃에서 45초동안 변성, 60℃에서 70초동안 어닐링/연장;
최종 연장: 60℃에서 7분 동안;
반응 후 유지:10℃에서 분석할 때까지(짧은 시간).
증폭 생성물은 전술한 바와 같이 겔 전기영동으로 분석하였다.
결과
다음과 같이 각각의 카피의 주형에서 증폭을 반복하였다: 20카피의 표적 주형을 사용하여 3회의 증폭을 실행하였고, 5카피의 표적 주형을 사용하여 3회의 증폭을 실행하였고, 2.5카피의 표적 주형을 사용하여 2회의 증폭을 실행하였고, 2카피의 표적 주형을 사용하여 1회 증폭을 실행하였고, 표적이 없이 23회 증폭을 실행하였다. 모든 주형의 양성 증폭은 예상된 표적 크기의 겔에 단일 밴드로 나타났다. 프라이머 이량체 또는 다른 비특이성 증폭 생성물을 발생시키는 어떠한 증폭도 일어나지 않았다.
이 결과는 상기 실시예 6의 결과와 비교할 수 있으며, 이때 동일한 HCV 표적은 동일한 프라이머 서열을 사용하여 증폭되었다. 이러한 결과를 실시예 6의 결과와 비교하면, p-3급-부틸벤질-개질된 프라이머를 사용한 증폭은 비개질된 프라이머를 사용하여 실행된 상응하는 증폭에 비해 상당히 개선됨을 알 수 있다.
상기 실시예 5에 기술된 p-3급-부틸벤질-개질된 프라이머를 사용하여 HIV-1 RNA의 증폭시키는 추가적인 실험을 실행하였다. 증폭은 본질적으로 전술한 바와 동일하게 실행되었다. 전술한 HCV 시스템에서와 같이, 모든 HIV-1 주형 양성 증폭은 예상된 표적 크기의 겔상에서 단일 밴드로 나타났고, 프라이머 이량체 또는 다른 비특이성 증폭 생성물을 발생시키는 어떠한 증폭도 발생하지 않았다.
이러한 추가적인 결과는 동일한 HIV 표적을 동일한 프라이머 서열을 사용하여 증폭시킨 실시예 5의 결과와 비교할 수 있다. 상기 실시예 5의 이러한 결과와 비교하면, p-3급-부틸벤질-개질된 프라이머를 사용한 증폭은 비개질된 프라이머를 사용하여 실행된 상응는 증폭에 비해 상당히 개선됨을 알 수 있다.
실시예 10
마이코박테리아 DNA의 증폭
본 실시예는 비개질된 프라이머 및 개질된 프라이머를 사용하여 마이코박테리아 DNA의 증폭을 비교한 것을 기술하고 있다. 벤질기를 3'-말단 뉴클레오타드에 첨가하여 개질한 프라이머 및 p-3급-부틸벤질기를 3'-말단 뉴클레오타이드에 첨가하여 개질한 프라이머 둘다를 사용하였다. 비개질된 프라이머를 사용한 반응은 본질적으로 테베레(Tevere) 등의 문헌[J. Clin. Microbiol.34(4): 918-923(1996)]에서 기술한 바와 같다. 마이코박테리아 DNA를 공지된 농도로 모방 감염된 임상 샘플에 첨가한 담(痰) 샘플을 사용하여 증폭을 실행하였다. 정제된 마이코박테리아 DNA 및 DNA가 없는 음성 대조 샘플을 사용하여 추가적인 증폭을 실행하였다.
샘플의 제조
현미경 검사에 의해 마이코박테리아에 대해 이미 음성을 보인 담 표본 및 배양물을 액화시키고, CDC(켄트(Kent) 및 쿠비카(Kubica), Public Health Mycobacteriology-a guide for the level III laboratory, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control, Athlanta,(1985); 본원에서 참고로 인용함)가 추천한 N-아세틸-시스테인-NaOH 방법으로 오염 제거시켰다. 액화된 담(100 ㎕)을 호흡기 표본 세척 시약(Respiratory Specimen Wash Reagent; 10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, 1%(v/v)의 트리톤 X-100, 0.05%의 NaN3, pH 8.0)에 첨가하고, 12,500×g에서 10분동안 원심분리시켰다. 각각의 펠렛트를 100 ㎕의 용해 시약(0.05 N NaOH, 1% (v/v)의 트리톤 X-100, 1 mM EDTA, 0.05%의 NaN3)에 다시 현탁시키고, 60℃에서 45분 동안 배양하였다. 그 다음 용해물을 100 ㎕의 중화 시약(0.2 M 트리스-HCl, 8mM MgCl2, 0.05%의 NaN3, pH 7.5)으로 중화시켰다.
두가지 개별적인 담 용해물을 각각 80㎕씩 합하여 담 용해물을 수집하였다. 8가지의 수집된 각각의 담 용해물(각각 160 ㎕)에 배양된 M. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)로부터 정제된 DNA 스톡 15 ㎕(용해 시약과 중화 시약의 1:1 혼합물 1㎕ 당 2카피)를 첨가하였다.
정제된 마이코박테리아 DNA(담이 없음)를 공지된 농도로 함유하는 샘플은 10 ㎕의 DNA 스톡을 용해 시약과 중화 시약의 1:1 혼합물 100 ㎕에 첨가하여 제조하였다.
음성 대조 샘플(DNA가 없음)은 100 ㎕의 용해 시약 및 100 ㎕의 중화 시약의 혼합물로 구성된다.
증폭 프라이머
하기 표 12의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 증폭을 실행하였다.
| 프라이머 | 서열 |
| KY18 (서열 식별 번호: 5) | 5'-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3' |
| KY436 (서열 식별 번호: 6) | 5'-TAACACATGCAAGTCGAACGGAAA-3' |
| KY75 (서열 식별 번호: 7) | 5'-GCCCGTATCGCCCGCACGCTCACA-3' |
3'-말단 염기에 결합된 지정된 개질기를 함유하는 하기 프라이머 쌍을 증폭에 사용하였다. 모든 개질된 프라이머는 선행 실시예에서 기술하는 것과 같이 합성되었다. 모든 프라이머는 5'말단에서 바이오틴화되었다.
| 프라이머 쌍 | 프라이머 서열 | 개질화 |
| A | KY18 (서열 식별 번호: 5) | 개질되지 않음 |
| KY75 (서열 식별 번호: 7) | 개질되지 않음 | |
| B | KY436 (서열 식별 번호: 6) | 벤질 |
| KY75 (서열 식별 번호: 7) | 벤질 | |
| C | KY436 (서열 식별 번호: 6) | p-3급-부틸벤질 |
| KY75 (서열 식별 번호: 7) | p-3급-부틸벤질 |
증폭
각각의 샘플에 대해서, 비개질된 프라이머 쌍(KY18 (서열 식별 번호: 5)과 KY75 (서열 식별 번호: 7)) 및 개질된 프라이머 쌍(KY436 (서열 식별 번호: 6)과 KY75 (서열 식별 번호: 7))을 사용하여 증폭을 실행하였다.
증폭은 하기 시약을 함유하는 100 ㎖의 반응물에서 실행하였고, 각각은 전술한 3가지 샘플 중의 하나를 50 ㎕로 함유하고, 2X 시약 혼합물을 50 ㎕로 함유하였다:
100 mM의 트리스-HCl, pH 8.9;
500 nM의 각각의 프라이머;
200μM 씩의 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dUTP);
20%(v/v)의 글리세롤;
10 유니트의 앰플리타크*(AmpliTaq);
6 유니트의 앰프이레이즈*(AmpErase);
*호프만-라 롯슈에서 개발하여 제조하고, 퍼킨 엘머(미국 코넥티컷주 노웍 소재)에서 판매함.
하기의 온도 분포를 사용하여 진앰프 PCR 시스템 9600 열 순환기(미국 코넥티컷주 노웍 소재의 퍼킨 엘머)에서 열순환을 수행하였다.
예비 반응 배양; 50℃에서 5분동안;
2 주기: 98 ℃에서 20초 동안 변성,
62℃에서 20초 동안 어닐링,
72℃에서 45초 동안 연장;
41 주기: 94 ℃에서 20초 동안 변성,
62℃에서 20초 동안 어닐링,
72℃에서 45초 동안 연장;
최종 연장: 72℃에서 12시간 동안(밤새).
증폭된 생성물의 존재는 2%의 뉴시브, 0.5% 아가로즈 겔로 전기영동시킨 다음, 에티디늄 브로하이드를 염색시켜 가시화시켰다.
결과
전기영동의 분석 결과를 도 5에 나타내었다. 각각의 샘플에 있어서, 비개질된 프라이머로 실행된 증폭의 생성물(A로 표시) 및 개질된 프라이머로 실행된 증폭의 생성물(B 및 C로 표시함)을 인접한 레인에서 전기영동시켰다. 목적하는 마이코박테리아 표적 서열에 해당하는 밴드를 화살표로 표시하였다. 다른 밴드는 비특이성 개질 생성물로서, 겔의 가장 아래에 있는 밴드가 프라이머 이량체에 해당하는 것이다. M으로 표시한 레인은 분자량 마커(HaeIII 분해된 PhiX 174 DNA)를 함유한다.
비개질된 프라이머를 사용하는 경우, 정제된 마이코박테리아 DNA를 증폭시키면 프라이머 이량체가 형성되었다. 개질된 프라이머 쌍을 사용하면, 목적하는 표적의 존재량이 증가하였고, 본질적으로 감지할만한 프라이머 이량체의 형성이 제거되었다.
정제된 DNA의 증폭과는 대조적으로, 비개질된 프라이머를 사용하는 경우, 증폭 반응에 담 용해물의 존재하면 이질적인 생성물 밴드가 나타나는 것에서 알 수 있듯이, 효율이 감소되고 비특이성 증폭 생성물의 형성이 증가되었다. 담 용해물이 정제된 마이코박테리아 DNA의 증폭에는 존재하지 않는 상당량의 인간 DNA를 함유하는 경우, 비특이성 증폭 생성물이 증가되는 것은 놀라운 것이 아니다. 담의 존재하에 실행된 증폭에 개질된 프라이머 쌍을 사용하면 목적하는 생성물의 발생량이 상당히 증가하고, 비특이성 증폭이 감소되는 결과가 나타났다.
실시예 11
벤질기로 개질된 프라이머의 추가 합성
말단 시토신에 벤질기를 첨가하여 개질한 프라이머를 본질적으로는 실시예 1에서 기술한 방법으로 합성하였으나, 하기에서 기술하는 바와 같이 제조한 LCAA-CPG-연결된 N4-아세틸,N4-벤질-5'-O-DMT-2'-데옥시시티딘을 사용하였다.
제 1 단계: N4-벤질-2'-데옥시시티딘의 합성
2'-데옥시시티딘 하이드로클로라이드(5.28 g, 20 mmol, 미국 오하이오주 클리블랜드 소재의 유 에스 바이오케미칼 코포레이션(U.S. Biochemical Corp.))에 벤질아민(20 ㎖)을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기에서 3시간 동안 150 ℃에서 가열하였다. 진공하에서 용액을 농축시켜 점성의 황색 오일을 수득하였고, 이것을 물(100 ㎖)과 에틸 아세테이트(100 ㎖) 사이에 분배시켰다. 수성 상을 에틸 아세테이트(100 ㎖)로 세척하여 분리시켰다. 수성 상을 진공하에서 농축시켜 황색 시럽(13 g)을 수득하고, 이것을 용리액으로서 메틸렌 클로라이드와 메탄올(15:1)을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색의 시럽으로서 목적하는 생성물(5.8 g, 91.5 %)의 수득하였다.
제 2 단계: N4-아세틸,N4-벤질-2'-데옥시시티딘의 합성
N4-벤질-2'-데옥시시티딘(2.5 g, 7.9 mmol)을 무수 디메틸포름아마이드(15 ㎖)에 용해시키고, 아세트산 무수물(8g, 79 mmol, 10 당량)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매 및 과량의 아세트산 무수물을 진공하에서 증발시켰다. 생성물을 용리액으로서 메틸렌 클로라이드와 메탄올(20:1)을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 표제 화합물(1.3 g, 48%)을 수득하였다. 화합물은 매우 흡습성이어서 -20℃에서 건조상태로 보관하였다.
제 3 단계: N4-아세틸,N4-벤질-5'-O-DMT-2'-데옥시시티딘의 합성
N4-아세틸,N4-벤질-2'-데옥시시티딘(76 ㎎, 0.2 mmol)을 1㎖의 무수 피리딘에 용해시키고, DMT-Cl(122 ㎎, 0.2 mmol, 1.0 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. TLC 분석에 의하면 일부 출발 물질이 남아 있어서, 추가량의 DMT-Cl(61 ㎎, 0.5 당량)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 추가로 1시간 동안 교반한 다음, TLC 분석에 의해 반응이 완료됨을 확인하였다. 15 ㎖의 염수 용액으로 반응을 종결시키고, 수성 상을 메틸렌 클로라이드(3×15 ㎖)로 추출하였다. 유기 층을 모아 염수(2×15 ㎖)로 세척하고, 무수 황산 마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 증발시키고, 용리액으로서 메틸렌 클로라이드와 메탄올(50:1)을 사용하여 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, N4-아세틸,N4-벤질-5'-O-DMT-2'-데옥시시티딘(96 ㎎, 65% 수율)을 수득하였다.
제 4 단계: 숙시닐화
N4-아세틸,N4-벤질-5'-O-DMT-2'-데옥시시티딘(96 ㎎, 0.13 mmol)을 2 ㎖의 무수 피리딘에 용해시켰다. 숙신산 무수물(100 ㎎, 1.0 mmol) 및 디메틸아미노피리딘(20 ㎎)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 3일 동안 실온에서 교반하였다. 용매를 증발시키고 잔류물을 톨루엔(3 × 10 ㎖)으로 동시증류시켰다. 클로로포름(50 ㎖)을 첨가하여 잔류물을 용해시켰다(용해를 돕기 위해 초음파 파쇄법을 사용함). 클로로포름 층을 염수(3 × 15㎖)로 세척하고, 물(1 × 15㎖)로 세척하였다. 유기 층을 무수 황산 마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 증발시켜, 108 ㎎의 순수한 N4-아세틸,N4-벤질-5'-O-DMT-2'-데옥시시티딘-3'-O-숙시네이트(97%의 수율)를 수득하였다.
제 5 단계: LCAA-CPG 연결된 5'-O-DMT-N4-아세틸,N4-벤질-2'-데옥시시티딘-3'-O-숙시네이트의 제조
활성화된 CPG를 다음과 같이 제조하였다. LCAA-CPG(1.0 g, LCA00500C; 미국 뉴저지주 페어필드 소재의 CPG 인코포레이티드)를 메틸렌 클로라이드내 트리클로로아세트산(3%, 10 ㎖)으로 처리하고, 4시간 동안 회전 증발기(로타베이퍼(rotavapor); 스위스 플라윌 소재의 부치(Buchi))(진공은 아님)에서 회전시켜 혼합하였다. 용매를 여거하고, CPG를 트리에틸아민와 에틸디이소프로필아민(9:1)(3×5㎖)으로 세척하고, 메틸렌 클로라이드(3×10㎖) 및 에테르(3×10㎖)로 계속 세척하고, 진공하에서 건조시켰다.
산으로 세척한 CPG에 개질된 뉴클레오사이드 중간체를 결합시키는 것은 다음과 같이 실행하였다. 전술한 바와 같이 제조한 1g의 활성화된 LCAA-CPG에 N4-아세틸,N4-벤질-5'-O-DMT-데옥시시티딘, 3'-O-숙시네이트(108 ㎎, 0.13 mmol), 디메틸아미노피리딘(20 ㎎) 및 5㎖의 무수 피리딘을 첨가하였다. 반응 혼합물을 로타베이퍼(진공이 아님)에서 3일 동안 회전시켰다. 상청액을 여거하고, 결합된 LCAA-CPG를 피리딘(3×5㎖), 메틸렌 클로라이드(3×10㎖) 및 에테르(3×10㎖)로 계속해서 세척하고, 진공하에서 건조시켰다.
N4-아세틸,N4-벤질-5'-O-DMT-2'-데옥시아데노신-3'-O-숙시네이트에 결합된 LCAA-CPG를 캡핑시키는 것은 다음과 같이 실행하였다. 유도된 CPG에 캡핑 혼합 시약 A(THF/루티딘/Ac2O=8:1:1, 미국 버지니아주 스털링 소재의 글렌 러서치) 및 캡핑 혼합 시약 B(THF내에 10%의 N-메틸이미다졸, 글렌 리서치)를 첨가하고, 반응 혼합물을 밤새 로타베이퍼(진공이 아님)에서 회전시켰다. 용액을 여거하고, 연결된 LCAA-CPG를 피리딘(3×5㎖), 메틸렌 클로라이드(3×10㎖), THF(3×10㎖) 및 에테르(3×10㎖)로 계속 세척하고, 그 다음 진공하에서 건조시켰다.
유도화된 LCAA-CPG의 결합 용량은, 메틸렌 클로라이드내 3%의 트리클로로아세트산으로 5㎎의 생성물을 처리하여 결정하고, 방출된 디메톡실트리틸 카보늄 이온의 양을 UV 분광분석법으로 측정하였다. LCAA-CPG에 결합된 뉴클레오사이드의 양은 19.5 μmol/g인 것으로 결정되었다.
서열 목록
서열들에 관한 일반 정보
출원인:
명칭: 에프 호프만-라 롯슈 아크티엔게젤샤프트
가: 그렌짜헤르스트라세 124
시: 바즐
주: BS
국가: 스위스
우편 번호(ZIP): 체하-4070
전화: 061-688 25 11
팩스: 061- 688 13 95
텔렉스: 962292/965542 hlr ch
발명의 명칭: 개질된 프라이머
서열의 갯수: 7
컴퓨터 판독 형태:
매체 유형: 플로피 디스크
컴퓨터: 애플 매킨토시
운용 시스템: 시스템 7.1 (매킨토시)
소프트 웨어: 워드 5.1
선출원 정보:
출원 번호: 60-041127
출원일: 1997년 3월 20일
1. 서열 식별 번호 1에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 33 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA(게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 1:
2. 서열 식별 번호 2에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 32 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA(게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 2:
3. 서열 식별 번호 3에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 26 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA(게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 3:
4. 서열 식별 번호 4에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 28 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA(게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 4:
5. 서열 식별 번호 5에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 23 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA(게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호; 5:
6. 서열 식별 번호 6에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 24 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA (게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 6:
7. 서열 식별 번호 7에 대한 정보:
서열 특징:
길이: 24 염기쌍
유형: 핵산
사슬수: 1
토폴로지: 선형
분자 유형: DNA (게놈)
서열 표시: 서열 식별 번호: 7:
본 발명에 의하면, 프라이머로서 개질된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실행한 증폭의 경우 비개질된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실행한 증폭과 비교하여 비특이성 증폭 생성물, 특히 프라이머 이량체가 덜 생성되고, 목적하는 증폭 생성물의 수율이 보다 증가하였다.
Claims (10)
- 하기 화학식 1a 또는 화학식 1b의 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드:화학식 1a화학식 1b상기 식에서,S1은 길이가 뉴클레오타이드 약 5 내지 약 50개인 뉴클레오타이드의 제 1 서열을 나타내고;S2는 길이가 뉴클레오타이드 1 내지 3개인 제 2 서열을 나타내고;N은 고리외(exocyclic) 아민을 함유하는 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기를 함유하는 뉴클레오타이드를 나타내고;R은 개질기를 나타내는 것으로, 고리외 아민에 의해 N에 공유결합되며, 이때 R은 하기 화학식 2의 구조를 갖는다:화학식 2상기 식에서,R1및 R2는 독립적으로 수소, C1-C10알킬기, 알콕시기, 페닐기, 페녹시기, 치환된 페닐기, 나프틸기 또는 치환된 나프틸기를 나타낸다.
- 제 1 항에 있어서,R이 2-나프틸메틸기, 벤질기 또는 치환된 벤질기인 올리고뉴클레오타이드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,R이 하기 화학식 3의 구조를 갖는 치환된 벤질기 올리고뉴클레오타이드:화학식 3상기 식에서,R3은 C1-C6분지형 또는 선형 알킬기, 메톡시기 또는 니트로기이다.
- 제 3 항에 있어서,R3이 C1-C4분지형 또는 선형 알킬기, 메톡시기 또는 니트로기를 나타내는 올리고뉴클레오타이드.
- 제 3 항에 있어서,R3이 파라 위치에 결합되는 올리고뉴클레오타이드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,N이 아데노신인 올리고뉴클레오타이드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,R이 벤질, p-메틸벤질, p-3급-부틸벤질, p-메톡시벤질, o-니트로벤질 및 2-나프틸메틸로 구성된 그룹에서 선택되는 올리고뉴클레오타이드.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 증폭 반응을 실행함을 포함하는, 핵산 표적 서열의 증폭 방법.
- 제 8 항에 있어서,폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)인 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산 증폭 반응을 실행하기 위한 키트.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4112797P | 1997-03-20 | 1997-03-20 | |
| US60/041,127 | 1997-03-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR19980080494A true KR19980080494A (ko) | 1998-11-25 |
| KR100292997B1 KR100292997B1 (ko) | 2001-12-17 |
Family
ID=21914898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019980009644A KR100292997B1 (ko) | 1997-03-20 | 1998-03-20 | 개질된프라이머 |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6001611A (ko) |
| EP (1) | EP0866071B1 (ko) |
| JP (1) | JP2966389B2 (ko) |
| KR (1) | KR100292997B1 (ko) |
| CN (1) | CN1065873C (ko) |
| AT (1) | ATE280177T1 (ko) |
| AU (1) | AU712448B2 (ko) |
| BR (1) | BR9801878B1 (ko) |
| CA (1) | CA2229766C (ko) |
| CZ (1) | CZ291525B6 (ko) |
| DE (1) | DE69827060T2 (ko) |
| DK (1) | DK0866071T3 (ko) |
| ES (1) | ES2230631T3 (ko) |
| HK (1) | HK1012192A1 (ko) |
| HU (1) | HU223669B1 (ko) |
| IL (1) | IL123694A (ko) |
| NO (1) | NO322136B1 (ko) |
| PL (1) | PL190142B1 (ko) |
| RU (1) | RU2159248C2 (ko) |
| TW (1) | TW567188B (ko) |
| UA (1) | UA49843C2 (ko) |
Families Citing this family (181)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6200757B1 (en) * | 1999-01-19 | 2001-03-13 | Dade Behring Inc. | Method for controlling the extension of an oligonucleotide |
| US6509157B1 (en) * | 1999-11-05 | 2003-01-21 | Roche Molecular Systems, Inc | 3 blocked nucleic acid amplification primers |
| PL202358B1 (pl) | 1999-11-17 | 2009-06-30 | Roche Diagnostics Gmbh | Sposób wytwarzania kompozycji magnetycznych cząstek szklanych, magnetyczne cząstki szklane, kompozycja magnetycznych cząstek szklanych, zawiesina z magnetycznymi cząstkami szklanymi, probówka z kompozycją lub zawiesiną magnetycznych cząstek szklanych, zestaw części z tą probówką, zastosowanie kompozycji, zawiesiny i zestawu zawierających magnetyczne cząstki szklane, sposób izolowania materiału biologicznego |
| ATE312204T1 (de) | 1999-12-15 | 2005-12-15 | Gen Probe Inc | Methoden und zusammensetzungen zur detektion von spezies des mycobacterium avium-komplexes |
| EP1242633B1 (en) * | 1999-12-17 | 2011-01-12 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species |
| US6664081B2 (en) * | 1999-12-17 | 2003-12-16 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid amplification and detection of mycobacterium species |
| US7205129B1 (en) | 2000-02-28 | 2007-04-17 | Qiagen Gmbh | Method for reducing artifacts in nucleic acid amplification |
| WO2001075139A1 (en) * | 2000-04-03 | 2001-10-11 | Biolink Partners, Inc. | Reversible chemical modification of nucleic acids and improved method for nucleic acid hybridization |
| US6548251B1 (en) * | 2000-09-05 | 2003-04-15 | Fidelity Systems, Inc. | Inhibition of molecular and biological processes using modified oligonucleotides |
| US20020031777A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Linda Starr-Spires | Ultra yield amplification reaction |
| WO2002029003A2 (en) | 2000-10-06 | 2002-04-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding dna and rna |
| US9708358B2 (en) | 2000-10-06 | 2017-07-18 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Massive parallel method for decoding DNA and RNA |
| DE60115811T2 (de) * | 2000-10-25 | 2006-08-03 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplifizierung unter Verwendung von modifizierten Primern |
| US6986992B2 (en) * | 2001-03-30 | 2006-01-17 | Amersham Biosciences Ab | P450 single nucleotide polymorphism biochip analysis |
| US6905827B2 (en) | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
| US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| WO2002101041A1 (fr) * | 2001-06-12 | 2002-12-19 | Takara Bio Inc. | Procede d'amplification de l'acide nucleique et procede de detection du polymorphisme des nucleotides a l'aide d'un analogue de nucleotide |
| US20030096277A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-05-22 | Xiangning Chen | Allele specific PCR for genotyping |
| US6617137B2 (en) | 2001-10-15 | 2003-09-09 | Molecular Staging Inc. | Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions |
| US7297485B2 (en) * | 2001-10-15 | 2007-11-20 | Qiagen Gmbh | Method for nucleic acid amplification that results in low amplification bias |
| US7211382B2 (en) * | 2002-04-09 | 2007-05-01 | Orchid Cellmark Inc. | Primer extension using modified nucleotides |
| JP4457001B2 (ja) * | 2002-05-31 | 2010-04-28 | セクレタリー・デパートメント・オブ・アトミック・エナジー | ドナー／アクセプター部分が相補鎖上となる標的核酸検出のｍｅｔ／ｆｒｅｔに基づく方法 |
| US7955795B2 (en) | 2003-06-06 | 2011-06-07 | Qiagen Gmbh | Method of whole genome amplification with reduced artifact production |
| US9487823B2 (en) | 2002-12-20 | 2016-11-08 | Qiagen Gmbh | Nucleic acid amplification |
| KR20070121853A (ko) * | 2003-03-31 | 2007-12-27 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 일본 뇌염 바이러스 혈청군의 구성원을 포함하는, 특정플라비바이러스 검출용 조성물 및 방법 |
| WO2004094986A2 (en) | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| US7892745B2 (en) | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7408051B2 (en) | 2004-04-14 | 2008-08-05 | Applera Corporation | Modified oligonucleotides and applications thereof |
| US7517978B1 (en) | 2004-04-14 | 2009-04-14 | Applied Biosystems, Llc | Modified oligonucleotides and applications thereof |
| US7939251B2 (en) | 2004-05-06 | 2011-05-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | SENP1 as a marker for cancer |
| WO2006006722A1 (ja) | 2004-07-13 | 2006-01-19 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | 細胞機能の調節方法 |
| WO2006029184A2 (en) * | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Expression Diagnostics, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
| EP1809765A2 (en) * | 2004-11-04 | 2007-07-25 | Roche Diagnostics GmbH | Classification of acute myeloid leukemia |
| US7842794B2 (en) | 2004-12-17 | 2010-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Reagents and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae |
| DE602005018840D1 (de) * | 2005-04-14 | 2010-02-25 | Applied Biosystems Llc | 3'-modifizierte oligonukleotide mit pseudoisocytosin-nukleobasenderivaten sowie deren anwendungen als primer oder sonden |
| US7465561B2 (en) | 2005-06-30 | 2008-12-16 | Roche Molecular Systems, Inc. | Probes and methods for hepatitis C virus typing using single probe analysis |
| US10081839B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US10083273B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
| US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
| EP2032714B1 (en) * | 2006-06-01 | 2011-03-16 | TriLink BioTechnologies | Chemically modified oligonucleotide primers for nucleic acid amplification |
| US20080009007A1 (en) * | 2006-06-16 | 2008-01-10 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Controlled initiation of primer extension |
| ATE538216T1 (de) * | 2006-07-31 | 2012-01-15 | Wanli Bi | Nukleinsäureverstärkung mithilfe eines reversibel modifizierten oligonukleotids |
| US9045522B2 (en) | 2006-07-31 | 2015-06-02 | Wanli Bi | Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide |
| US7993832B2 (en) | 2006-08-14 | 2011-08-09 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
| WO2008140484A2 (en) | 2006-11-09 | 2008-11-20 | Xdx, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
| GB2457402B (en) | 2006-12-01 | 2011-10-19 | Univ Columbia | Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators |
| US7893227B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-02-22 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked nucleotides and nucleosides base modified with non-cleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
| US7897737B2 (en) | 2006-12-05 | 2011-03-01 | Lasergen, Inc. | 3′-OH unblocked, nucleotides and nucleosides, base modified with photocleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing |
| US9938641B2 (en) | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| EP2574681B1 (en) | 2007-03-28 | 2016-03-23 | Signal Diagnostics | System and method for high resolution analysis of nucleic acids to detect sequence variations |
| US8460874B2 (en) | 2007-07-03 | 2013-06-11 | Genaphora Ltd. | Use of RNA/DNA chimeric primers for improved nucleic acid amplification reactions |
| WO2009021054A2 (en) | 2007-08-06 | 2009-02-12 | Orion Genomics Llc | Novel single nucleotide polymorphisms and combinations of novel and known polymorphisms for determining the allele-specific expression of the igf2 gene |
| CA2639416C (en) | 2007-09-11 | 2019-12-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Diagnostic test for susceptibility to b-raf kinase inhibitors |
| ES2460896T3 (es) * | 2007-10-04 | 2014-05-14 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Amplificación de ácido nucleico |
| US20100086914A1 (en) * | 2008-10-03 | 2010-04-08 | Roche Molecular Systems, Inc. | High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing |
| EP4310194A2 (en) | 2007-10-19 | 2024-01-24 | The Trustees of Columbia University in the City of New York | Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis |
| US9115163B2 (en) | 2007-10-19 | 2015-08-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA sequence with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified nucleotide terminators |
| DE102008005667A1 (de) | 2008-01-19 | 2009-07-30 | Olfert Landt | Basenmodifizierte Primeroligomere für die Multiplex-RT-PCR |
| US8911948B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-12-16 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| EP2644707B1 (en) | 2008-04-30 | 2015-06-03 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers |
| KR101677772B1 (ko) | 2008-06-11 | 2016-11-18 | 레이저젠, 인코퍼레이티드 | 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 그리고 시퀀싱에서의 이들의 이용 방법 |
| CA2731991C (en) | 2008-08-04 | 2021-06-08 | Gene Security Network, Inc. | Methods for allele calling and ploidy calling |
| WO2010046067A1 (en) * | 2008-10-20 | 2010-04-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Improved allele-specific amplification |
| US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
| US8206929B2 (en) * | 2009-01-07 | 2012-06-26 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid amplification with allele-specific suppression of sequence variants |
| CA2751758A1 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Orion Genomics Llc | Combinations of polymorphisms for determining allele-specific expression of igf2 |
| US8409802B2 (en) | 2009-08-14 | 2013-04-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Format of probes to detect nucleic acid differences |
| ES2640776T3 (es) | 2009-09-30 | 2017-11-06 | Natera, Inc. | Métodos para denominar de forma no invasiva ploidía prenatal |
| US9238832B2 (en) * | 2009-12-11 | 2016-01-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids |
| US8614071B2 (en) | 2009-12-11 | 2013-12-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | Preferential amplification of mRNA over DNA using chemically modified primers |
| WO2011128096A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment |
| US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
| US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| AU2011255641A1 (en) | 2010-05-18 | 2012-12-06 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
| US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
| EP2576837B1 (en) | 2010-06-04 | 2017-09-06 | Chronix Biomedical | Prostate cancer associated circulating nucleic acid biomarkers |
| WO2012038049A2 (en) | 2010-09-22 | 2012-03-29 | Roche Diagnostics Gmbh | Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers |
| US20120142908A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-07 | Berry And Associates, Inc. | Compounds for the synthetic introduction of n-alkyl nucleosides into dna oligonucleotides |
| ES2770342T3 (es) | 2010-12-22 | 2020-07-01 | Natera Inc | Procedimientos para pruebas prenatales no invasivas de paternidad |
| US20120164641A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and Compositions for Detecting Mutation in the Human Epidermal Growth Factor Receptor Gene |
| CA2824387C (en) | 2011-02-09 | 2019-09-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
| WO2012135053A2 (en) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Rnase h-based assays utilizing modified rna monomers |
| WO2012162429A2 (en) | 2011-05-23 | 2012-11-29 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection |
| US9034581B2 (en) | 2011-05-26 | 2015-05-19 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Staphylococcus aureus |
| US20140303008A1 (en) | 2011-10-21 | 2014-10-09 | Chronix Biomedical | Colorectal cancer associated circulating nucleic acid biomarkers |
| ES2413566B1 (es) | 2011-12-14 | 2014-05-20 | Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud | Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y pronóstico de la hipoacusia neurosensorial. |
| US9115394B2 (en) | 2011-12-22 | 2015-08-25 | Roche Molecular Systems, Inc. | Methods and reagents for reducing non-specific amplification |
| KR101545848B1 (ko) * | 2012-04-09 | 2015-08-21 | (주)바이오니아 | 핵산중합효소로 핵산을 검출하는데 사용되는 고민감도 핵산준비방법 |
| CN110343673B (zh) | 2012-06-14 | 2024-04-05 | 生命技术公司 | 用于聚合酶链式反应(pcr)的新型组合物、方法和试剂盒 |
| US9982313B2 (en) | 2012-08-17 | 2018-05-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of herpes simplex virus 1 and 2 |
| EP2722399A1 (en) | 2012-10-18 | 2014-04-23 | Roche Diagniostics GmbH | Method for preventing high molecular weight products during amplification |
| US9382581B2 (en) | 2012-12-13 | 2016-07-05 | Roche Molecular Systems, Inc. | Primers with modified phosphate and base in allele-specific PCR |
| WO2014093825A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Chronix Biomedical | Personalized biomarkers for cancer |
| US9828629B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-28 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid target identification by structure based probe cleavage |
| US10648026B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-05-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Raman cluster tagged molecules for biological imaging |
| EP3004388B2 (en) | 2013-05-29 | 2023-05-31 | Chronix Biomedical | Detection and quantification of donor cell-free dna in the circulation of organ transplant recipients |
| CN107318267B (zh) | 2013-08-12 | 2021-08-17 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于治疗补体相关的病症的组合物和方法 |
| US10577655B2 (en) | 2013-09-27 | 2020-03-03 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| US10262755B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-04-16 | Natera, Inc. | Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments |
| US9499870B2 (en) | 2013-09-27 | 2016-11-22 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
| RU2016117929A (ru) | 2013-10-09 | 2017-11-15 | Флюоресентрик, Инк. | Мультиплексные зонды |
| CA2923706C (en) | 2013-10-09 | 2020-08-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Methods and compositions for detecting mutation in the human ezh2 gene |
| WO2015066341A2 (en) | 2013-10-30 | 2015-05-07 | Green Life Biotech, Llc | Pathogenesis quantification systems and treatment methods for citrus greening blight |
| US10072288B2 (en) | 2013-11-11 | 2018-09-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detecting single nucleotide polymorphism using overlapped primer and melting probe |
| US9637791B2 (en) | 2013-12-20 | 2017-05-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Multiplexed nucleic acid target identification by strucutre based probe cleavage |
| MX2016010237A (es) | 2014-02-08 | 2017-04-27 | Genentech Inc | Metodos de tratamiento de enfermedad de alzheimer. |
| RU2717641C2 (ru) | 2014-04-21 | 2020-03-24 | Натера, Инк. | Обнаружение мутаций и плоидности в хромосомных сегментах |
| EP3201361B1 (en) | 2014-10-01 | 2020-02-12 | Chronix Biomedical | Methods of quantifying cell-free dna |
| US9745618B2 (en) | 2014-11-19 | 2017-08-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Photoblocked probes and methods for sequential detection of nucleic acids |
| US9920381B2 (en) * | 2014-12-02 | 2018-03-20 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting MECC-containing methicillin-resistant Staphylococcus aureus |
| US9909169B2 (en) | 2014-12-17 | 2018-03-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Allele-specific amplification of nucleic acids using blocking oligonucleotides for wild type suppression |
| US10006910B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-06-26 | Agilome, Inc. | Chemically-sensitive field effect transistors, systems, and methods for manufacturing and using the same |
| US9859394B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-02 | Agilome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US9857328B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-02 | Agilome, Inc. | Chemically-sensitive field effect transistors, systems and methods for manufacturing and using the same |
| WO2016100049A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | Edico Genome Corporation | Chemically-sensitive field effect transistor |
| US9618474B2 (en) | 2014-12-18 | 2017-04-11 | Edico Genome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| US10020300B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-07-10 | Agilome, Inc. | Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids |
| ES2961374T3 (es) | 2015-04-24 | 2024-03-11 | Atila Biosystems Incorporated | Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada |
| WO2016183106A1 (en) | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
| US9970062B2 (en) * | 2015-08-06 | 2018-05-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of mycobacterium tuberculosis |
| US9382582B1 (en) * | 2015-08-25 | 2016-07-05 | Tracy Hayden | Methods, compositions and kits for enriching for a minor template amplification product in a mixed template amplification reaction |
| LT3402880T (lt) | 2016-01-15 | 2024-03-12 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Termofiliniai dnr polimerazės mutantai |
| CN108779500B (zh) | 2016-03-11 | 2022-12-13 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测寨卡病毒的组合物和方法 |
| WO2017169119A1 (ja) * | 2016-03-30 | 2017-10-05 | 大研医器株式会社 | 変異プライマーの設計方法 |
| JP6681804B2 (ja) * | 2016-03-30 | 2020-04-15 | 大研医器株式会社 | 変異プライマーの設計方法 |
| EP3459115A4 (en) | 2016-05-16 | 2020-04-08 | Agilome, Inc. | GRAPHEN-FET DEVICES, SYSTEMS AND METHODS FOR USE THEREOF FOR SEQUENCING NUCLEIC ACIDS |
| ES2874259T3 (es) * | 2016-05-27 | 2021-11-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Composiciones y procedimientos para la detección de Trichomonas vaginalis |
| US10612101B2 (en) * | 2016-05-27 | 2020-04-07 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Mycoplasma genitalium |
| US10934597B2 (en) * | 2016-05-27 | 2021-03-02 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of trichomonas vaginalis |
| US20170356025A1 (en) | 2016-06-14 | 2017-12-14 | Roche Molecular Systems, Inc. | Internal control probes for improving pcr assay performance |
| US10443095B2 (en) | 2016-08-02 | 2019-10-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Helper oligonucleotide for improved efficiency of amplification and detection/quantitation of nucleic acids |
| US11485996B2 (en) | 2016-10-04 | 2022-11-01 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
| US10793923B2 (en) | 2016-11-09 | 2020-10-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of BK virus |
| US20190284618A1 (en) | 2016-11-10 | 2019-09-19 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of neisseria gonorrhoeae |
| EP3538668A4 (en) | 2016-11-10 | 2020-08-26 | Talis Biomedical Corporation | POLYNUCLEOTIDES FOR AMPLIFICATION AND DETECTION OF CHLAMYDIA TRACHOMATIS |
| US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
| US20190211377A1 (en) | 2016-12-22 | 2019-07-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | Cobra probes to detect a marker for epidemic ribotypes of clostridium difficile |
| EP3585889A1 (en) | 2017-02-21 | 2020-01-01 | Natera, Inc. | Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids |
| WO2019002178A1 (en) | 2017-06-26 | 2019-01-03 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | DNA MUTANTS THERMOPHILIC POLYMERASES |
| US10760137B2 (en) | 2017-07-18 | 2020-09-01 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of Babesia |
| KR102380264B1 (ko) * | 2017-08-31 | 2022-03-29 | 주식회사 씨젠 | 다이머-형성 프라이머 쌍을 이용한 구성요소의 성능 평가 |
| WO2019063661A1 (en) | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Roche Diagnostics Gmbh | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DETECTION OF TRICHOMONAS VAGINALIS |
| EP3768832B1 (en) | 2018-03-21 | 2023-11-29 | F. Hoffmann-La Roche AG | Dna polymerases for efficient and effective incorporation of methylated-dntps |
| US10450616B1 (en) | 2018-05-09 | 2019-10-22 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Chlamydia trachomatis |
| EP3814531A4 (en) | 2018-06-29 | 2022-04-06 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DELIVERING MOLECULES AND COMPLEXES TO REACTION SITES |
| US11525159B2 (en) | 2018-07-03 | 2022-12-13 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
| WO2020092134A1 (en) * | 2018-10-29 | 2020-05-07 | Cepheid | Exponential base-3 nucleic acid amplification with reduced amplification time using nested overlapping primers |
| US20220017973A1 (en) | 2018-12-03 | 2022-01-20 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of candida auris |
| KR102141312B1 (ko) * | 2019-04-19 | 2020-08-04 | 주식회사 제노헬릭스 | 짧은 RNA-primed 제노 센서 모듈 증폭 기반 짧은 RNA 탐지 기법 |
| WO2020221915A1 (en) | 2019-05-02 | 2020-11-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | UTILIZATION OF dITP FOR PREFERENTIAL/SELECTIVE AMPLIFICATION OF RNA VERSUS DNA TARGETS BASED ON STRAND-SEPARATION TEMPERATURE |
| EP3966351A1 (en) | 2019-05-07 | 2022-03-16 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for detection of neisseria gonorroheae |
| US10954572B2 (en) | 2019-07-25 | 2021-03-23 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for the amplification and detection of Neisseria gonorrhoeae |
| WO2021013972A1 (en) | 2019-07-25 | 2021-01-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detection of epstein barr virus (ebv) |
| CN114286866A (zh) | 2019-08-27 | 2022-04-05 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于扩增和检测包括从cccDNA转录的HBV RNA在内的乙型肝炎病毒RNA的组合物和方法 |
| US11441167B2 (en) | 2019-11-20 | 2022-09-13 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for rapid identification and phenotypic antimicrobial susceptibility testing of bacteria and fungi |
| US11891662B2 (en) | 2019-12-02 | 2024-02-06 | Talis Biomedical Corporation | Polynucleotides for amplification and detection of human beta actin |
| EP4081666A2 (en) | 2019-12-27 | 2022-11-02 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compositions and methods for detecting methicillin-resistant staphylococcus aureus |
| WO2021136752A1 (en) | 2019-12-31 | 2021-07-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Quantitative pcr screening of inducible prophage from bacterial isolates |
| KR20220152205A (ko) | 2020-03-09 | 2022-11-15 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(sars-cov-2), 인플루엔자 a 및 인플루엔자 b를 검출하기 위한 조성물 및 방법 |
| JP2023536962A (ja) | 2020-08-06 | 2023-08-30 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－２）、インフルエンザａ及びインフルエンザｂの検出のための組成物及び方法 |
| JP2023552546A (ja) | 2020-12-04 | 2023-12-18 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | マラリアを検出するための組成物および方法 |
| US20220205020A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-06-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detection of bacteria and fungi associated with bacterial and candida vaginosis |
| CN116806268A (zh) | 2021-02-05 | 2023-09-26 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测人副流感病毒1-4(hpiv 1-4)的组合物和方法 |
| US20220290221A1 (en) | 2021-03-15 | 2022-09-15 | Roche Molecular Systems, Inc. | Compositions and methods for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) variants having spike protein mutations |
| JP2024517835A (ja) | 2021-05-06 | 2024-04-23 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 二重標的アッセイによりデルタ型肝炎ウイルスを検出するための組成物及び方法 |
| WO2023079032A1 (en) | 2021-11-05 | 2023-05-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detection of malaria |
| WO2023089186A1 (en) | 2021-11-22 | 2023-05-25 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting vana and/or vanb genes associated with multidrug resistance |
| WO2023104812A1 (en) | 2021-12-09 | 2023-06-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Mass based detection of pcr amplicons |
| WO2024003260A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting lymphogranuloma venereum (lgv) serovars of chlamydia trachomatis |
| WO2024018485A1 (en) * | 2022-07-18 | 2024-01-25 | Haystackanalytics Private Limited | Methods and systems for detection and identification of pathogens and antibiotic resistance genes |
| WO2024042042A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Compositions and methods for detecting monkeypox virus |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| US5256549A (en) * | 1986-03-28 | 1993-10-26 | Chiron Corporation | Purification of synthetic oligomers |
| US5459255A (en) * | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
| DK0540693T3 (da) * | 1990-07-24 | 1999-09-13 | Hoffmann La Roche | Reduktion af ikke-specifik amplifikation under in vitro-nukleinsyreamplifikation under anvendelse af modificerede nukleinsy |
| US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
| ATE155467T1 (de) * | 1993-03-30 | 1997-08-15 | Sanofi Sa | Acyclische nucleosid analoge und sie enthaltende oligonucleotidsequenzen |
| US5599662A (en) * | 1995-02-17 | 1997-02-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Oliconucleotide primers and probes for the detection of HIV-1 |
| US5837442A (en) * | 1995-11-29 | 1998-11-17 | Roche Molecular Systems, Inc. | Oligonucleotide primers for amplifying HCV nucleic acid |
-
1998
- 1998-03-12 DK DK98104461T patent/DK0866071T3/da active
- 1998-03-12 AT AT98104461T patent/ATE280177T1/de active
- 1998-03-12 ES ES98104461T patent/ES2230631T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 DE DE69827060T patent/DE69827060T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 EP EP98104461A patent/EP0866071B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-13 AU AU58404/98A patent/AU712448B2/en not_active Expired
- 1998-03-16 US US09/039,866 patent/US6001611A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-16 IL IL12369498A patent/IL123694A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-03-16 HU HU9800581A patent/HU223669B1/hu active IP Right Grant
- 1998-03-18 CA CA002229766A patent/CA2229766C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-19 CZ CZ1998841A patent/CZ291525B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-19 NO NO19981239A patent/NO322136B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-03-19 UA UA98031382A patent/UA49843C2/uk unknown
- 1998-03-19 CN CN98105627A patent/CN1065873C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-19 RU RU98105786/04A patent/RU2159248C2/ru active
- 1998-03-19 PL PL98325439A patent/PL190142B1/pl unknown
- 1998-03-20 JP JP10090641A patent/JP2966389B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-20 BR BRPI9801878-7A patent/BR9801878B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-03-20 KR KR1019980009644A patent/KR100292997B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 TW TW087104213A patent/TW567188B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-12-15 HK HK98113390A patent/HK1012192A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100292997B1 (ko) | 개질된프라이머 | |
| JP3789817B2 (ja) | Ｐｎａ−ｄｎａキメラプローブを用いたテンプレート依存型ライゲーション | |
| CA2329135C (en) | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders | |
| EP2395098B1 (en) | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis | |
| JP3437184B2 (ja) | 切断可能なプライマーを用いるオリゴヌクレオチドサイズ計測 | |
| Liu et al. | Pentaribonucleotides of mixed sequence are synthesized and efficiently prime de novo DNA chain starts in the T4 bacteriophage DNA replication system. | |
| CN114250278A (zh) | 捕获、检测和定量小rna的方法、组合物与试剂盒 | |
| EA004327B1 (ru) | Способ амплификации последовательности нуклеиновой кислоты | |
| WO1995006752A1 (en) | A method of nucleic acid sequencing | |
| JP2013518598A (ja) | ランダム化配列を含むプライマー及び特異的プライマーを用いる核酸の等温増幅並びにその使用 | |
| JP2002291490A (ja) | 修飾プライマーを使用する増幅 | |
| WO2018165459A1 (en) | Method for highly sensitive dna methylation analysis | |
| WO1998011120A1 (en) | A method of nucleic acid sequencing | |
| WO2016089958A1 (en) | Methods and kits for theranostic applications | |
| KR100901392B1 (ko) | 캐리어 핵산에 의한 핵산 증폭 특이성의 증진 | |
| Sheppard et al. | Nucleoglycoconjugates: design and synthesis of a new class of DNA–carbohydrate conjugates | |
| JP2017533733A (ja) | ハイブリダイゼーションプローブおよび方法 | |
| WO2000028084A1 (en) | Isothermal nucleic acid amplification methods | |
| JPH05146299A (ja) | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キツト | |
| MXPA98002007A (en) | Cebers modify | |
| Zhao et al. | Method for highly sensitive DNA methylation analysis | |
| WO2023107899A2 (en) | A method of capturing crispr endonuclease cleavage products | |
| JP2024501637A (ja) | 塩基配列決定用の核酸サンプルの調製 | |
| Korte | Nucleic acids, proteins and carbohydrates | |
| McGuire | Synthesis and studies of modified nucleotides and oligonucleotides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130227 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140227 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150227 Year of fee payment: 15 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151230 Year of fee payment: 16 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20161229 Year of fee payment: 17 |
|
| EXPY | Expiration of term |