JP3789817B2 - Pna−dnaキメラプローブを用いたテンプレート依存型ライゲーション - Google Patents
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Description
(I.発明の分野)
本発明は、概して、酵素学および核酸アナログの分野に関する。詳細には、本発明は、リガーゼ酵素を用いたPNA−DNAキメラおよびオリゴヌクレオチドのテンプレート依存型ライゲーションに関する。
【0002】
(II.参考文献)
【0003】
【化1】
【0004】
【化2】
【0005】
【化3】
【0006】
【化4】
【0007】
【化5】
(III.背景)
リガーゼ酵素による核酸プローブの共有結合は、分子生物学者に利用可能な最も有用なツールの1つである。2つのプローブがテンプレート核酸(ここで、2つのプローブは隣接し、そして介在ギャップを伴わない)にアニーリングされる場合、リガーゼ酵素によりリン酸ジエステル結合が形成され得る(Whiteley、1989)。一方のプローブの5’末端と他方のプローブの3’末端との間に、ライゲーション結合が形成される。
【0008】
アニーリングおよびライゲーションという事象はそれぞれ、連結プローブの配列とテンプレート核酸の配列との間に高レベルの忠実度(すなわち、相補性)を必要とする。塩基対のミスマッチが生じる場合、両事象は効率が悪い。一般に、DNAリガーゼは、それらがPCR産物のような変性テンプレート核酸を完全に補完する場合にのみ、2つの隣接するプローブを連結し得る(Landegren,1988;Nickerson,1990)。プローブのライゲーション部位での、またはその近くの一つのヌクレオチドミスマッチでさえ、アニーリングされたプローブのライゲーションを阻止する。
【0009】
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイは、標的DNAサンプルにおいて特異的な配列の存在を検出する。例えば、対立遺伝子識別アッセイは、標的に対する対立遺伝子型の相補的な配列を表すプローブに依存する。共通の、標的に相補的な第2のプローブへのライゲーションは、多型部位の存在を示す(Whiteley,1989;Landegren,1988)。ライゲーションの不在は、多型部位がないことを示す。ライゲーションは、対立遺伝子プローブ上の検出可能な標識、およびライゲーション産物の電気泳動分離により検出され得る(Grossman,1994)。
【0010】
最適化されたプローブ、ならびにアニーリングおよびライゲーションの方法を提供することが望ましい。このような方法は、より高い精密さおよび正確さから利益を得ることでアッセイおよび試験を改良する。
【0011】
(IV.要旨)
本発明は、PNAモノマー単位およびDNAモノマー単位のキメラ分子、ならびにライゲーション産物を生成するためのライゲーション方法におけるその使用に関する。本発明は、部分的には、リガーゼ酵素が、広範囲の実験条件および実験変数の下で、PNA−DNAキメラプローブと第2のプローブとを連結し得る、という発見に基づく。本発明のPNA−DNAキメラは、共有結合で共に結合された少なくとも2つの部分、好ましくは:i)3〜15のPNAモノマー単位の連続部分、およびii)少なくとも2つのヌクレオチドの連続部分、を含む。ヌクレオチド部分は、ライゲーション可能な末端を有し、その結果PNA−DNAキメラは第2のプローブに連結され得る。
【0012】
第1の局面において、本発明は、リガーゼおよびライゲーション試薬の存在下でテンプレート核酸にアニーリングされたPNA−DNAキメラプローブを、テンプレート核酸上のキメラプローブに隣接して、アニーリングされた第2のプローブに連結することによる、テンプレート依存型ライゲーション産物を産生する方法を提供する。第2のプローブは、テンプレート依存型ライゲーションを支持することが可能である。第2のプローブは、PNA−DNAキメラまたはオリゴヌクレオチドである。第2のプローブは、5〜100のモノマー単位またはヌクレオチド(nt)長であり得る。好ましくは、第2のプローブは、10〜30ntである。同時に、キメラプローブおよび第2プローブは、10〜100ntであり得る。
【0013】
本発明の1つの例示的実施形態において、PNA−DNAキメラは、式:
Px−L−Ny
を有する。
【0014】
ここで、各Pは独立して、PNAモノマーであり、xは3〜15の整数であり、LはPとNとの間の共有結合を表し、各Nは独立して、ヌクレオチドであり、yは2〜15の整数であり、そして末端Nは、3’ヒドロキシル基または5’ヒドロキシル基のいずれかを有する。
【0015】
好ましい実施形態において、PNA−DNAキメラのPNA部分(すなわち、Px)は、2−アミノエチルグリシンペプチド核酸である。
【0016】
PNA−DNAキメラのDNA部分(すなわち、Ny)は、2’−デオキシヌクレオチド(DNA)、リボヌクレオチド(RNA)、および修飾された糖またはそれらのヌクレオチド間結合(特に、より良好な特異性、親和性、ハイブリダイゼーションの速度、および化学安定性を与えるもの)を含み得る。
【0017】
キメラおよび/または第2のプローブは、非放射性同位体標識で標識され得、その結果ライゲーション産物は非放射性同位体で標識される。標識したPNA−DNAキメラを用いる実施形態において、PNA−DNAキメラは以下:(i)核酸塩基(例えば、プリン核酸塩基もしくはデアザプリン核酸塩基の7−デアザ位もしくはC−8位、またはピリミジン核酸塩基のC−5位);(ii)糖;(iii)PNA骨格;あるいは(iv)アミノ基、スルフィド基、ヒドロキシル基、および/またはカルボキシル基、で標識され得る。好ましくは、キメラは、PNA部分のアミノ末端で標識される。標識したオリゴヌクレオチドを用いる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、好ましくはライゲーション部位(3’または5’)から反対側の末端で標識される。あるいは、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基で標識され得るが、標識がハイブリダイゼーションの親和性または特異性、あるいはリガーゼの効率を妨げない場合は、他の位置でもまた標識され得る。標識は蛍光色素、蛍光消光剤、ハイブリダイゼーション安定剤、エネルギー移動色素対、電気泳動移動度変更剤(electrophoretic mobility modifier)、化学発光色素、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、酵素、および親和性リガンドであり得る。好ましくは、標識は光(例えば、赤外、可視または紫外励起波長でのレーザー源)の照射で検出可能である。
【0018】
キメラプローブのPNAおよびDNA部分は、共有結合で共に結合されている。PNA部分とDNA部分との間のその結合(L)は、例えば、アミド基におけるカルボニル−窒素結合(その部分は、介在原子または複数の原子のリンカーを有することなく結合される)であり得る。その結合は、リン酸ジエステル基またはホスホルアミデート基を含み得る。
【0019】
テンプレート核酸または標的核酸は、テンプレート指向性の核酸合成を媒介し得る、任意の核酸または核酸アナログであり得る。適切なテンプレート核酸の例としては、例えば、ゲノムDNA、DNA消化物、DNAフラグメント、DNA転写物、プラスミド、ベクター、ウイルスDNA、PCR産物、RNA、および合成核酸が挙げられる。テンプレート核酸はまた、中期染色体または間期染色体であり得る。好ましくは、染色体は、DNA−PNAのキメラハイブリダイゼーションおよびライゲーションの前に変性される。テンプレート核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、そして、特定の適用に依存して、わずか約20〜30から数百万程ものヌクレオチド(nt)または塩基対(bp)の範囲にわたり得る。
【0020】
テンプレート核酸、PNA−DNAキメラ、または第2プローブは、固体基材上に固定され得る。ライゲーションは、プローブまたはテンプレートの1つが固体支持体または固体表面に付着されている場所で行われ得る。
【0021】
(VI.好ましい実施形態の詳細な説明)
ここで、本発明の好ましい実施形態について詳細に参照する。本発明を、好ましい実施形態と関連して記載するが、それは、それらの実施形態に対して本発明を限定することを意図しないこが理解される。これに対して、本発明は、代替物、変更物、および等価物を包含することを意図し、添付のクレームによって定義されるように本発明の範囲内に含まれ得る。
【0022】
(VI.1 定義)
他の記載がない限り、本明細書中で使用される場合、以下の用語および句は、以下の意味を有することを意図する。
【0023】
「核酸塩基」とは、窒素含有複素環式部分(例えば、プリン、7−デアザプリン、またはピリミジン)のことをいう。代表的な核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニンなどである。
【0024】
「ヌクレオシド」とは、リボース糖のC−1’炭素に連結した核酸塩基からなる化合物のことをいう。
【0025】
「ヌクレオチド」とは、モノマー単位としてか、または核酸内のヌクレオシドのリン酸エステルのことをいう。ヌクレオチドは、リボース糖の構造的特徴を詳しく示すために、「NTP」、または「dNTP」および「ddNTP」として、時として記載される。「ヌクレオチド5’三リン酸塩」とは、5’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドのことをいう。三リン酸エステル基は、種々の酸素の代わり硫黄置換物を含み得る(例えば、α−チオヌクレオチド5’三リン酸塩)。
【0026】
本明細書において使用された場合、用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含し、そして2’デオキシリボヌクレオチド(DNA)およびリボヌクレオチド(RNA)を含むヌクレオチドモノマーの一本鎖ポリマーおよび二本鎖ポリマーを意味する。この核酸は、全てのデオキシリボヌクレオチド、全てのリボヌクレオチド、またはそのキメラ混合物を構成し得、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の連結により連結し、そして対イオン(例えば、H+、NH4 +、トリアルキルアンモニウム、Mg2+、Na+など)と会合し得る。核酸は、代表的に数個のモノマー単位(例えば、それらが一般にオリゴヌクレオチドといわれる場合、5〜40)から数千のモノマー単位までの大きさの範囲である。他に記載のない限り、オリゴヌクレオチド配列が示される場合はいつも、ヌクレオチドは、左から右へ5’から3’の順番であり、そして他に記載のない限り、「A」は、デオキシアデノシンを示し、「C」はデオキシシチジンを示し、「G」は、デオキシグアノシンを示し、そして「T」は、チミジンを示すことが理解される。
【0027】
用語「ワトソン/クリック塩基対形成」とは、二本鎖DNAにおいて一般に見られる水素結合塩基対形成のことをいう。
【0028】
「付着部位」とは、リンカーを共有結合する部分(例えば、キメラまたはヌクレオチド)での部位のことをいう。
【0029】
「リンカー」とは、ある部分が別の部分(例えば:(i)オリゴヌクレオチドまたはPNA−DNAキメラに対する標識、または(ii)PNA−DNAキメラにおけるDNA部分に対するPNA部分)に連結する部分のことをいう。
【0030】
「PNA−DNAキメラ」とは、以下を含むオリゴマーのことをいう:(i)PNAモノマー単位の連続する部分および(ii)酵素学的に伸長可能な末端を有するヌクレオチドモノマー単位の連続する部分。
【0031】
「アルキル」とは、親アルカン、親アルケン、または親アルキンの単一炭素原子から1つの水素原子の除去により誘導された飽和炭化水素ラジカル、もしくは不飽和炭化水素ラジカル、分枝炭化水素ラジカル、直鎖炭化水素ラジカル、分枝炭化水素ラジカル、または環式炭化水素ラジカルのことをいう。代表的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、アルキル基は、1〜12の飽和炭素および/または1〜12の不飽和炭素からなる。
【0032】
「シクロアルキル」とは、環式アルキルラジカルのことをいう。シクロアルキル置換物を有する窒素原子は、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、より大きな大員環(larger rings)およびそれの複素環式の置換された形態を形成し得る。
【0033】
「アルキルジイル」とは、1〜20炭素原子の飽和炭化水素ラジカルもしくは不飽和炭化水素ラジカル、分枝炭化水素ラジカル、直鎖炭化水素ラジカルまたは環式炭化水素ラジカルのことをいい、そして親アルカン、親アルケンまたは親アルキンの同じか、または2つの異なる炭素原子から2つの水素原子の除去により誘導される2つの一価のラジカルセンター(radical center)を有する。代表的なアルキルジイルラジカルとしては、1,2−エチルジイル、1,3−プロピジイル、1,4−ブチルジイルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0034】
「アリールジイル」とは、共役共鳴電子系および親アリール化合物の2つの異なる炭素原子から2つの水素原子の除去により誘導される少なくとも2つの一価のラジカルセンターを有する、6〜20の炭素原子の不飽和環式炭化水素ラジカルまたは不飽和多環式炭化水素ラジカルのことをいう。代表的なアリールジイル基としては、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導されたラジカルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0035】
「標識」とは、連結伸長産物において検出可能であるか、あるいは所望の機能性または所望の特性をもたらすキメラまたはヌクレオチドに共有結合された任意の非放射性同位体部分のことをいう。
【0036】
「ライゲーション」は、キメラおよび第2のプローブが、隣接して、そしてテンプレート核酸に対してハイブリダイズ(アニール)する場合の、PNA−DNAキメラプローブと第2のプローブオリゴヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合の形成による酵素的連結である。
【0037】
(VI.2 PNA−DNAキメラ)
1つの局面において、本発明は、PNA部分およびDNA部分を含むキメラプローブを利用する。PNA部分は、核酸塩基が付着する非環式結合、アキラル結合、および中性ポリアミド結合の任意の骨格であり得る。PNA部分の好ましい形態は、カルボキシル末端アミドを有する部分的な構造において以下に示されたように、N−(2−アミノエチル)−グリシン、ペプチド様、アミド連結単位の骨格(Buchardt,1992;Nielsen,1991)である:
【0038】
【化6】
PNAオリゴマーそれ自体は、核酸プロセッシング酵素(例えば、DNAポリメラーゼ)のための基質ではない(Lutz,1999;Kyger,1998;Lutz,1997)。
【0039】
PNA−DNAキメラは、以下を含むオリゴマーである:1)PNAモノマー単位の連続する部分および2)ヌクレオチドの連続する部分。この2つの部分は、お互いに共有結合される。キメラのヌクレオチド部分は、2’デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの混合物であり得る。キメラのヌクレオチド部分は、3’ヒドロキシ末端を有する。PNA部分の好ましい長さは、3〜15PNAモノマー単位であり、最適な酵素活性、ハイブリダイゼーション特異性および親和性、合成試薬の経済性、ならびにキメラ合成および精製の容易さをもたらす。DNA部分の長さは、2〜15ヌクレオチドである。DNA部分の好ましい長さは、効率的なライゲーションを促進する最も短い配列である(すなわち、少なくとも2つの2’デオキシヌクレオチド)(図1A)。
【0040】
1つ以上のPNAモノマー単位中の好ましい核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、C−5−アルキルピリミジン、2−チオピリミジン、2,6−ジアミノプリン、C−5−プロピンピリミジン、フェノキサジン(Flanagan,1999)、7−デアザプリン、イソシチジン、プソイドイソシチジン(Egholm,1995)、イソグアノシン、4(3H)−ピリミドン、ヒポキサンチン、および8−オキソプリン(Meyer,1994)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0041】
PNA−DNAキメラ中のPNA部分により、与えられた増加された親和性および特異性(Egholm,1993;Jensen,1997)は、より短いプローブをハイブリダイゼーション実験およびアッセイにおいて使用することを可能にする。(UhlmanおよびPeyman,1998;Uhlmann,1998;Cook;1997;Uhlmann,1996)一般的に、より短いプローブは、対応するより長いプローブよりも特異的である(すなわち、相対的な構造の変動は、小さいプローブで大きい。)。また、短いプローブは、より経済的である(すなわち、合成のために安価であり、そして設計のためにより少ない配列情報を必要とする)。PNA−DNAキメラを、オリゴヌクレオチドおよび他のPNA−DNAキメラに連結し、PNA含有ライゲーション産物を形成し得る方法を供給することが望ましい。
【0042】
そのDNA相補鎖またはRNA相補鎖へのPNA−DNAキメラ中のPNA部分の結合は、平行配向か、または逆平行配向のいずれかで起こり得る。逆平行二重鎖(ここで、PNAのカルボキシル末端は、相補的DNAの5’末端と整列し、そしてPNAのアミノ末端は、DNA相補鎖の3’末端と整列する)は、代表的に、平行二重鎖(ここで、PNAのカルボキシル末端は、DNA相補鎖の3’末端と整列し、そしてPNAのアミノ末端は、DNA相補鎖の5’末端と整列する)より安定である(Koppitz,1998;Egholm,1993)。本明細書中で示された例示的なキメラは、PNA部分が、標的配列と逆平行配向の状態でアニールするように、設計される。PNA配列が、一連の文字として表される場合は常に、アミノ末端が左側、そしてカルボキシル基が右側であることが理解される。
【0043】
キメラ配列は代表的に、標的配列の部分に対して完全に相補的である。しかし、キメラ配列は、混合塩基(「縮退」または「縮重」)部位を含み得る。これにより、キメラサンプルは、2つ以上の異なる核酸塩基により表された1つ以上の塩基位置を有する配列の混合物であり得る。混合塩基部位は、オリゴマーのPNA部分またはDNA部分中に位置し得る。混合塩基キメラは、特定の標的配列に対する変化するレベルの相補性を有する配列の混合物である。混合塩基キメラは、ランダムプライミングのためか、もしくはテンプレート配列情報が未知か、または不確定である場合に有用であり得る。
【0044】
本発明の特定の特性を、本明細書中で一本鎖プローブおよびテンプレート核酸を用いて例示したが、プローブおよびテンプレート核酸のいずれもが、二本鎖領域を含み得ることがまた明らかである。PNA−DNAキメラは、第2の二重鎖と連結する二重鎖の1つまたは両方の鎖として、ライゲーションを受け得る。ここで、各二重鎖の両方の鎖は、突出(「粘着末端」)を用いて連結され得る。例えば、キメラプローブは、突出鎖が、テンプレート核酸と相補的であるDNA部分および少なくとも一部のPNA部分を含み、そして、テンプレートに対するキメラプローブのハイブリダイゼーションにおいて、キメラのプローブの陥凹(recessed)鎖が、テンプレート核酸の末端の直後に近接するか、または1つ以上のヌクレオチド位のギャップで間隔をあけるかのいずれかで位置するように、粘着末端を有する二重鎖形態において提供され得る。隣接してハイブリダイズされたプローブのライゲーションを可能にする1つ以上のPNAモノマーのPNA部分を含むテンプレートもまた意図される。
【0045】
PNA−DNAキメラを、PNAオリゴマー、DNAオリゴヌクレオチド、およびRNAオリゴヌクレオチドの合成のそれぞれの従来の方法を用いて、実質的に任意の組み合わせまたは配列におけるPNAモノマーとヌクレオチドとの共有結合により合成し得る(Vinayak,1997;Uhlmann,1996;Van der Laan,1997)。効率的かつ自動化された方法は、市販の自動合成機(例えば、「ExpediteTM」、Model 433AおよびModel 394合成機(PE Biosystems))において、市販の試薬(Uhlmann,1996;Vinayak,1997;Van der Laan,1997)を用いて、2〜25μモルスケールでPNA/DNAキメラを合成するために開発された。この方法において、キメラを、1つのカラムおよび1つの合成機で連続的に作製し得る。
【0046】
代表的に、キメラの合成を、合成カラム中に充填された市販の高架橋、非膨潤性ポリスチレンビーズの5’−ジメトキシトリチル(DMT)基の脱トリチル化により開始する。支持体を、塩基不安定性サクシネート/ヒドロキシメチル安息香酸リンカーを介して、支持体に3’水酸基により連結された5’−DMTデオキシヌクレオシド(Abz、Gibu、Cbz、T)を、20〜30μモル/gで充填する(Vinayak,1997)。5’−DMT,3’−シアノエチルホスホロアミダイト(phosphoramidite)デオキシヌクレオシドモノマー(Beaucage,1992)を、乾燥アセトニトリルに溶解し、そしてテトラゾール活性化剤と同時に送達し、支持体結合5’水酸基に結合させる。結合の後に、未反応の5’水酸基の無水酢酸でのキャッピング、および5価のヌクレオチド間のリン酸トリエステルに対するヨウ素での酸化を行う。DNA合成サイクルを、最後のデオキシヌクレオシドの添加まで繰り返す。ここで、5’モノメトキシトリチル(MMT)アミノヌクレオシドホスホロアミダイトを使用し、キメラにおけるDNAとPNAとの間の結合において、PNAモノマーに結合するために、支持体結合DNA部分に5’アミノ末端を与える。MMT基は、これが酸不安定性であるので、PNA−DNAキメラの合成において骨格アミノの保護のために好都合である。MMT基を、キメラに対する脱プリン化または他の損傷を引き起こさない温和な酸性状態下で窒素から効率的に、そして迅速に除去する。
【0047】
PNA部分の合成を開始するために、5’MMT基を3%トリクロロ酢酸含有ジクロロメタンを用いて除去し、そしてアミノ基をPNAモノマーおよびカップリング試薬を用いて結合する。PNAモノマーの骨格アミノ基を好ましくは、MMTで保護し、そして核酸塩基環外アミンをAbz、Gibu、およびCbzとして保護する(Breipohl,1997;Finn,1996;Will,1995)。任意の従来のペプチドカップリング試薬を使用し得るが、HBTUおよびHATUは、好ましいカップリング試薬である。PNAモノマーを、1:1のDMF:アセトニトリル中に溶解し、約0.2Mの濃度にし得る。合成カラムに送達する前に、モノマー溶液をまた、等量の0.2M HBTU(O−ベンゾトリアゾール−1−イル−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸)含有DMF:アセトニトリル(1:1)と混合する(Vinayak,1997)。この溶液を、0.2M ジイソプロピルエチルアミン含有DMF:アセトニトリル(1:1)と共に同時にカラムへ送達する。2μモルスケールでModel 394合成機でのキメラにおけるPNA部分およびDNA部分のための合成サイクルを以下の表1に要約する。
【0048】
【表1】
合成が完了後、アミノ末端をアセチル化し、移動または環化を最小化し得るか、または標識化において求核試薬として反応し得る。粗キメラを支持体から切断し、そして8〜16時間、55℃で濃縮された水酸化アンモニウムを用いて、全ての保護基を除去する。キメラを、逆相HPLCまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)による分析および精製、質量分光法よる分析、ならびに質量と260nmでのUV吸収を相関させることにより定量化する。
【0049】
リボヌクレオチドを含むDNA部分を有するキメラを、適切なRNAホスホロアミダイトヌクレオシドおよび/または5’DMT保護化リボヌクレオチド支持体を用いて合成し得る(Vinayak,1994)。RNAホスホロアミダイトの2’水酸基を代表的に、第3ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を用いて保護し、そしてAbz、Gdmf、およびCbzとして核酸塩基の環外のアミノ基を保護する。合成後、TBDMS基を、フルオライド試薬(例えば、テトラブチルアンモニウムフルオライド含有テトラヒドロフラン)を用いて、除去する。それ以外は、リボヌクレオチド含有PNA−DNAキメラのための合成、精製、および分析方法は、2’デオキシヌクレオチド含有DNA部分のみを有するキメラについての方法と実質的に同一である。
【0050】
本発明のキメラプローブのPNA部分とDNA部分との間の結合は、直接結合であり得る(例えば、介在原子なしで、デオキシヌクレオチドの5’位のアミノ基とPNA部分のカルボキシル末端のカルボキシル基により形成されたアミド結合)(図1A〜1B)。あるいは、結合Lは、ホスホジエステル基またはホスホロアミデート(phosphoramidate)基であり得る。結合はまた、非塩基対形成部分(例えば、エチレンオキシ)の1つ以上の単位を含み、アミド結合(図2B)またはリン酸結合(図2C)によりPNA部分およびDNA部分に連結し得る。PNA部分とDNA部分との間のエチレンオキシ結合単位を、カップリング試薬(例えば、2−[2−(2−アミノエトキシ)エトキシ]酢酸の保護化形態)により導入し得る。Oリンカーである、2−[2−(2−アミノエトキシ)]酢酸を、MMT−アミノ保護化アミド形成カルボン酸、またはホスホロアミダイトシントンとして結合する(図2A)。1つ以上のOリンカー単位は、可撓性の、非塩基対形成性の、PNA部分とDNA部分との間の結合として作用し得る。図2は、ビスエチレンオキシアセトアミドリンカー(2B)およびビスエチレンオキシホスフェートリンカー(2C)を示す。他の例示的なリンカーとしては、アルキジイル基(例えば、ヘキシジイル基(Vinayak,1997)、または1,4−フェニルジイル基)が挙げられる(図2A)。
【0051】
(VI.3 オリゴヌクレオチド)
一般に、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロアミダイト合成方法により調製される。なぜなら、出発ヌクレオシドモノマーの効率的および迅速なカップリングならびに安定性のために好ましいからである(Caruthers,1983;Beaucage,1983;Beaucage,1992)。ホスホロアミダイト法は、ヌクレオチドモノマー単位の固体支持体上で成長しているオリゴヌクレオチド鎖への周期的な添加を伴なう(最も一般的には、3’末端ヌクレオシドが、合成の始まりで、固体支持体に付着する3’から5’の方向)。この方法は通常、自動化された市販の合成機を用いて行う(Caruthers,1984)。代表的に、ホスホロアミダイトヌクレオシドモノマー単位は:
【0052】
【化7】
を含む。ここで、R1は、保護基または置換基(例えば、シアノエチル、メチル、低級アルキル、置換アルキル、フェニル、アリール、および置換アリール)である;R2およびR3は、アミノ置換基(例えば、イソプロピル、モルホリノ、メチル、エチル、低級アルキル、シクロアルキル、およびアリール)である;R4は、環外窒素保護基(例えば、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、アリールオキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジアルキルホルムアミジン、およびジアルキルアセトアミジン)である;そしてR5は、酸不安定性保護基(例えば、DMT、MMT、ピクシル(pixyl)、トリチル、およびトリアルキルシリル)である。
【0053】
1つ以上のヌクレオシド中の好ましい核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、C−5−アルキルピリミジン、2−チオピリミジン、2,6−ジアミノプリン、C−5−プロピンピリミジン、フェノキサジン(Flanagan,1999)、7−デアザプリン、イソシチジン、プソイドイソシチジン(Egholm,1995)、イソグアノシン、4(3H)−ピリミドン、ヒポキサンチン、および8−オキソプリン(Meyer,1994)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0054】
1つ以上のヌクレオシド中の好ましい糖としては、2’デオキシリボース、リボース、および2’リボース修飾物または3’リボース修飾物(ここで2’位または3’位は、水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモであり得る)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0055】
他の好ましい糖としては、4’−α−アノマーヌクレオチド、1’−α−アノマーヌクレオチド、および2’−4’−結合した二環式糖修飾物ならびに他の「ロックされた」二環式糖修飾物(Wengel,1999)が挙げられる。
【0056】
(VI.4 リガーゼ酵素)
本発明において使用されるリガーゼ酵素は、キメラプローブおよび第2のプローブが、標的テンプレート中の隣接する領域にアニールする場合、PNA−DNAキメラプローブと第2のプローブとのライゲーションを行う任意のリガーゼであり得る。DNAリガーゼは、隣接する2つのプローブにおいて(すなわち、お互いに、直ぐ隣りとハイブリダイズする)、5’ホスフェートと3’水酸基との間のホスホジエステル結合を形成することによりDNA配列を連結する(Kornberg,1980;Whiteley,1989)。あるいは、あるプローブの3’ホスフェート末端および他のプローブの5’水酸基が、ホスホジエステル結合を形成し得る。本発明において、1つまたは両方のプローブは、PNA部分を含む。
【0057】
例えば、バクテリオファージT4由来DNAリガーゼは、DNA配列およびRNA配列の両方を連結し得、そしてこのDNAリガーゼは、連結された配列を整列するためにDNAテンプレートまたはRNAテンプレートのいずれかを使用し得る。DNA鎖のみを含む反応は、非常に効率的に進む。塩基対形成された平滑末端を有する2つのDNA二重鎖をファージリガーゼにより連結し得る。特定のリガーゼは、補因子(例えば、NADまたはATP)を必要とする。
【0058】
最近、多くのリガーゼが、好熱性生物から単離されており、60℃以上で有意な活性を有していて、そしてDNAを変性する条件で生存する。好ましい熱安定性リガーゼは、Thermus aquaticus(Takahashi,1984)由来であり、そしてまた組換え的に調製され得る(Barany,WO 91/17239,1991)。この熱安定性リガーゼはまた、平滑末端または短い相補的な突出末端を有する二重鎖DNAの連結の減少した活性を示す。これらの特徴は、検出の上昇された特異性ならびに多くの分析アッセイおよびライゲーションを含む適用における利便性を生じる。
【0059】
(VI.5 標識)
標識化したPNA−DNAキメラおよび標識化オリゴヌクレオチドが、非放射性同位体的に標識化されたライゲーション産物を形成するためにプローブとして酵素学的にライゲーションし得る方法が提供されることが望ましい。蛍光は、多くのライゲーション実験および適用(例えば、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイおよび他のインビトロDNAプローブに基づく診断テスト)のために好ましい検出方法として放射活性に大きく取って代わっている。従って、蛍光性標識は、検出標識の好ましいクラスである。ハイブリダイゼーションの特異性および親和性を向上する標識もまた、好ましい(例えば、マイナーグルーブ結合剤)。親和性リガンド標識もまた、好ましい。ビオチンは、キメラプローブならびにライゲーション産物の捕獲および単離のためのオリゴヌクレオチドのための有用な親和性リガンド標識である。特定の実験において、テンプレート核酸のビオチン標識化は捕獲目的、単離目的、除去目的、または検索目的のために有用であり得る。
【0060】
ライゲーションに関与するPNA−DNAキメラおよびオリゴヌクレオチドは、共有的に付着した標識を有し得る。標識化は、公知のラベル、結合、連結基、標準試薬および標準反応条件、ならびに分析方法および精製方法を使用する多くの公知の技術のいずれか1つを用いて達成され得る。一般に、色素およびオリゴヌクレオチドまたはキメラを連結している結合は、(i)ライゲーションを妨害せず、(ii)リガーゼ活性を阻害せず、そして(iii)色素の蛍光特性に有害な影響(例えば、クエンチングまたはブリーチング)を与えないべきである。
【0061】
PNA−DNAキメラおよびオリゴヌクレオチドは、核酸塩基、糖、アミノエチルグリシン骨格、アミノ、スルフィド、ハイドロキシル、およびカルボキシルを含む部位で標識され得る。核酸塩基標識部位は一般的に、プリンもしくはデアザプリンの7−デアザまたはC−8位、およびピリミジンのC−5位を含む。標識とキメラまたはオリゴヌクレオチドとの間の結合(NUC)は、アセチレンアミド結合またはアルケンアミド結合であり得る(Khan,1998)。代表的に、標識におけるカルボキシル基は、活性エステル(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル)の形成により活性化され、そしてアルキニルアミノ誘導化キメラまたはヌクレオチド、あるいはアルケニルアミノ誘導化キメラまたはヌクレオチドのアミノ基と反応する。得られる結合は、以下の構造を有する3−(カルボキシ)アミノ−1−プロピン−1−イルである:
【0062】
【化8】
標識は、以下を含む任意の最適な末端付着部位または内部付着部位において、オリゴヌクレオチドに付着され得る:(i)末端(例えば、5’および/または3’)(Mullah,1998)、(ii)ヌクレオチド間結合、(iii)糖、または(iv)核酸塩基。標識は、自動化手順の一環として、蛍光色素(FAM,HEX,TET)およびホスホロアミダイト試薬として機能化されている他の標識を用いて最も簡便かつ効率的に5’末端に導入される(Theisen,1992)。
【0063】
標識の好ましいクラスは、蛍光、化学発光、および電気化学的発光による標識化オリゴヌクレオチドの検出のための信号を提供する(Kricka,1992)。標識化オリゴヌクレオチドのために有用な蛍光性色素としては、フルオレセイン(Menchen,1993)、ローダミン(Bergot,1994)、エネルギー移動色素(LeeおよびSpurgeon,1998)、シアニン(Kubista,1997)、および金属ポルフィン錯体(Stanton,1988)が挙げられる。
【0064】
フルオレセイン色素の例としては、6−カルボキシフルオレセイン(6−FAM)、2’,4’,1,4,−テトラクロロフルオレセイン(TET)、2’,4’,5’,7’,1,4−ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、2’,7’−ジメトキシ−4’,5’−ジクロロ−6−カルボキシローダミン(JOE)、および芳香族置換キサンテン色素(Benson,1997)が挙げられる。5−カルボキシル、および他のレジオ異性体はまた、有用な検出特性を有し得る。
【0065】
標識の別の好ましいクラスは、蛍光消光剤を含む。消光剤の発光スペクトルは、近位の分子内蛍光性色素または分子間蛍光性色素と重複し、その結果、蛍光性色素の蛍光は、蛍光性共鳴エネルギー移動「FRET」の現象により実質的に減少されるか、またはクエンチされる(Clegg,1992)。本発明におけるFRETの例では、PNA−DNAキメラプローブを蛍光性色素を用いて標識化し、そして第2のプローブを蛍光消光剤を用いて標識化する。あるいは、キメラを蛍光消光剤を用いて標識化し得、そして第2のプローブを蛍光性色素を用いて標識化する。ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの前に、蛍光性色素は、実質的にクエンチされていない。ライゲーション後、ライゲーション産物の蛍光性色素は、FRETにより実質的にクエンチされる。
【0066】
特に好ましい消光剤としては、(i)テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)、テトラプロパノ−6−カルボキシローダミン(ROX)からなる群から選択されるローダミン色素、ならびに(ii)DABSYL、DABCYL、ニトロチアゾールブルー(NTB)を含むシアニン色素、アントラキノン、マラカイトグリーン、ニトロチアゾール、およびニトロイミダゾール化合物などが含まれるがこれらに限定されない。消光剤のニトロ置換形態は、特に好ましい。
【0067】
エネルギー移動色素は、キメラ標識およびオリゴヌクレオチド標識の好ましいクラスである。エネルギー移動色素標識は、アクセプター色素に連結されたドナー色素を含む(LeeおよびSpurgeon,1998)。第1の波長における光(例えば、レーザーから)は、ドナー色素(例えば、FAM)により吸収される。ドナー色素は、アクセプター色素により吸収される励起エネルギーを放射する。アクセプター色素は、第2のより長い波長で蛍光を発する。エネルギー移動の標識のドナー色素およびアクセプター色素部分は、ドナー色素(例えば、FAM)の4’位または5’位およびアクセプター色素の5−カルボキシル基または6−カルボキシル基を連結するリンカーにより付着され得る。他の強固なリンカーおよび強固ではないリンカーが有用であり得る。
【0068】
金属ポルフィリン錯体(例えば、アルミニウムフタロシアニンテトラスルホネート(Stanton、1988)および化学発光化合物(例えば、1,2−ジオキシエタン(dioxethane)化学発光部分(Bronstein、1990)もまた、キメラおよびオリゴヌクレオチド標識の好ましい種類である。
【0069】
別の好ましい種類の標識(本明細書中でヒドラジン安定化部分と呼ばれる)は、マイナーグルーブ(minor groove)結合剤(Blackburn、1996、337〜46頁)、インターカレーター、ポリカチオン(例えば、ポリリジン)およびスペルミン、ならびに架橋官能基が、挙げられるが、これらに限定されない。ハイブリダイゼーション安定化部分は、塩基対形成の安定性(すなわち、親和性)またはハイブリダイゼーションの速度(二重鎖の高い熱融解温度(Tm)により示される)を増加し得る。ハイブリダイゼーション安定化部分はまた、塩基対形成の特異性(完全に相補的なオリゴヌクレオチドと標的配列との間のTmの大きな差異により示される)を増加し得、そして生じた二重鎖はワトソン/クリック塩基対形成の1つ以上のミスマッチを含む。好ましいマイナーグルーブ結合剤としては、Hoechst 33258(Rajur、1997)、CDPI1-3(Kutyavin、1996)、ネトロプシン(netropsin)およびジスタマイシン(distamycin)が、挙げられる。他の有用な標識としては、電気泳動移動度変更剤、アミノ酸、ペプチド、酵素、および親和性リガンド(例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニン)が、挙げられる。
【0070】
標識とPNA/DNAキメラとの間のリンカーは、アミド結合(例えば、活性エステル形態の標識が、このキメラのアミノ基と結合している)であり得る。また、リンカーは、アルキルジイル、アリールジイル、、または1つ以上のエチレンオキシ単位(Rajur、1997)を含み得る。
【0071】
(VI.6 ライゲーション)
図3Aは、3’ヒドロキシPNA−DNAキメラプローブと5’リン酸オリゴヌクレオチド(第2のプローブとして、DNAテンプレートにハイブリダイズしている)との間を、DNAリガーゼを用いてライゲーションしてPNA−DNAライゲーション産物を形成する、模式図を示す。第1のプローブは3’ヒドロキシ末端5’リン酸末端を有し、そして第2のプローブは5’リン酸末端を有する。あるいは、第1のプローブは5’リン酸末端を有し、そして第2のプローブは3’ヒドロキシ末端を有する。
【0072】
ライゲーション混合物は、一般的に、DNAテンプレート、PNA−DNAキメラプローブ、第2のプローブ(別のPNA−DNAキメラプローブまたはオリゴヌクレオチドである)、リガーゼ、および他のライゲーション試薬を含む。このPNA−DNAキメラに対応するDNAプローブが、コントロールまたは比較として使用され得る。代表的条件下で、これらのプローブは、最終濃度各約1μMとして使用される。
【0073】
さらに、このライゲーション混合物は、例えば、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液[50mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP、25μg/mlウシ血清アルブミン]および1,000単位のT4 DNAリガーゼおよび10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼのような試薬を、容量50μlにて含み得る。このライゲーション試薬はまた、リガーゼ補因子(例えば、NADおよびATP)、ポリエチレングリコール、EDTA、KCl、硫酸アンモニウム、ジチオスレイトール、BSA、MgCl2、Tris−HCl、グリセロール、水、NaCl、メルカプトエタノール、および他の塩または緩衝液を含み得る。この混合物は、22〜25℃にて3時間以上インキュベートされ得る。このライゲーションの間の、10〜20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼのさらなる添加が、このライゲーションに有用であり得る。
【0074】
代表的にはインキュベーションの後に、リガーゼ反応産物は、約80℃で約20分間熱不活化され、そして氷上または4℃に短い間置かれる。分析のために、代表的には、このライゲーション産物のうちの5〜25pmolが、最終濃度の1×ローディング緩衝液(45mM Trisベース、45mMホウ酸、0.4mM EDTA、3% Ficoll、0.02%ブロモフェノールブルー、0.02%キシレンシアノ−ル)と混合され、そして95℃で10〜20分変性される。このサンプルが、10〜15%の変性PAGEゲルにローディングされ、そして1×TBE(89mM Trisベース、89mMホウ酸、2mM EDTA)中で100〜160V、70℃にて25〜60分間泳動される。このライゲーション産物は、このゲルを40〜120mlのSYBR−Green(Molecular Probe、Eugene、OR)で1×TBE中で10〜30分間染色することによって、可視化される。その画像は、ゲル記録システム(例えば、ChemiImager 4000 Imaging System、Alpha Innotech Corporation、San Leandro、CA)にキャプチャーされ得る。
【0075】
図3Bは、モデル系におけるライゲーションアッセイのためのテンプレート配列およびプローブ配列を示す。このプローブ配列は、2つのオリゴヌクレオチドプローブ(6ntおよび9nt)および5つのPNA−DNAキメラ(0〜4のDNA 2’−デオキシヌクレオチドを含む)を含む。これらのオリゴヌクレオチドおよびキメラは、38nt DNAテンプレートにハイブリダイズする。このテンプレートは、単離および移入を容易にするために、3’末端または5’末端をビオチンで標識される。
【0076】
このオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)は、既知のDNA配列改変体間の識別を可能にする、簡便で非常に厳密な方法である(Landegren、1988)。非常に多型性の遺伝子座の多重分析は、例えば、父系試験のため、および法医学において、器官移植ドナー−レシーバー適合において、遺伝子疾患の診断において、予後において、および出生前カウンセリングにおいて、および多数の遺伝子座での一塩基の差異の識別に依存する他の遺伝子に基づく技術において、有用である(Delahunty、1996)。多重オリゴヌクレオチドアッセイ(OLA)の産物は、蛍光検出を用いて変性条件下で、互いからそして未結合のプローブから、電気泳動によって分離され得る(Grossman、1994)。例えば、図8A〜8Cは、2つのPNA−DNAキメラ(野生型(WT)配列キメラおよび変異配列キメラ)が異なる蛍光色素を保有する、異なるアッセイを示す。変異配列が標的サンプル中に存在する場合にのみ、変異配列キメラは、その変異塩基対がライゲーション部位である場合に、隣接してアニールした第2のプローブ(オリゴ)にライゲーションする(図8A)。
【0077】
このライゲーション産物は、(i)電気泳動またはクロマトグラフィーを使用してサイズに基づく分離、および/または検出可能な標識に基づく分離よって識別され得る(Grossman、1994)。独特の標的配列を標的とする配列を有するキメラに標識された多数の蛍光色素を用いて、多重OLAが、単一の容器中の1つのサンプルに対して実行され得る。効率の良い多重OLAの要件は、非常に特異的かつ迅速な様式でアニールおよびライゲーションする、プローブが挙げられる。このキメラ配列および第2のプローブ配列は、変異塩基(または一塩基多型)が、第2のプローブの5’リン酸(図8B)またはキメラの3’末端(図8C)であり得るように、選択され得る。
【0078】
本発明のOLA実験は、テンプレート核酸、PNA−DNAキメラプローブ、または第2のプローブが、固体粒子またはビーズ上、あるいは固体の多孔性表面または非多孔性表面上に固定されている、固体基材上で実施され得る。固定されている場合、このテンプレート、キメラまたは第2のプローブは、好ましくは、この固体基材に、例えば、末端モノマー単位を介して共有結合している。この固体基材は、ポリスチレン、コントロールド−ポア−ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、磁性ビーズ、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、ならびに上記の固体基材のいずれかのコポリマーおよびグラフト(graft)であり得る。この固体基材の立体配置または形態は、直径約1〜50μmの小粒子またはビーズ、膜、フリット(frit)、スライド、プレート、マイクロマシン化(micromachined)チップ、アルカンチオール−金層、非多孔性表面、およびポリヌクレオチド固定化媒体であり得る。
【0079】
例えば、PNA−DNAキメラプローブは、リンカーによって、アミノ末端で非多孔性無機表面(例えば、ガラス)に共有結合している(Guo、1994)。テンプレート核酸サンプルが、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、このキメラプローブにハイブリダイズするのを可能にされる。このテンプレートと相補的な配列を有する第2のプローブが、ハイブリダイズした二重鎖に添加され、そしてこの第2のプローブが、このキメラプローブに隣接するテンプレートにハイブリダイズする。このキメラプローブと第2のプローブは、リガーゼによってともに連結される。このライゲーション産物は、検出および/または単離され得る。この産物において、このキメラプローブ、テンプレート、または第2のプローブが標識または親和性リガンドを保有し、そしてオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイが、それによって実施される。
【0080】
好ましい実施形態において、キメラプローブのアレイが、既知の配列のキメラプローブが二次元表面上の規定された領域を占有する、固体基材上にアセンブルされる。任意の特定の表面上のキメラプローブの数は、数百個または数千個でさえあり得、合成、付着、および検出についての空間的要件によって限定される(Fodor、1995)。あるいは、プローブのアレイが、ウェルまたは容器中に収容された、ビーズまたは粒子上に固定され得る。テンプレート、またはテンプレートの混合物が、この表面上の固定されたキメラプローブへのハイブリダイゼーションのために添加され得る。十分な配列相補性が、所定のハイブリダイゼーション条件下で存在する場合、二重鎖形成が生じる。第2のプローブの混合物が、ハイブリダイゼーションのために、別々にかまたはテンプレートサンプルとともに添加され得る。リガーゼの存在下で、キメラプローブと第2のプローブが隣接してハイブリダイズしている場合にのみ、ライゲーションが生じる。ハイブリダイズしているないプローブおよびテンプレートサンプルは、ハイブリダイゼーションと維持する条件下または変性条件下で、洗浄によって除去され得る。第2のプローブが標識(例えば、蛍光色素)を保有する場合、このライゲーション産物は、表面上に共有結合により固定され、そして例えば、レーザー誘導蛍光によって検出され得る。固定されたキメラプローブ配列の知識から、テンプレートサンプル中の特定の配列の存在が、このアレイ表面上で検出された蛍光の位置から推定され得る。
【0081】
本発明の第2の局面において、ライゲーションのためのキットが提供される。1つの実施形態において、例えば、本発明を実施するために有用なキットは、以下を含む:(i)3〜15個連続するPNAモノマー単位、2〜15個連続するヌクレオチド、および3’ヒドロキシを有する、PNA−DNAキメラ;(ii)第2のプローブ(この第2のプローブは、PNA−DNAキメラまたはオリゴヌクレオチドである);ならびに(iii)リガーゼ酵素。このキメラおよび/またはオリゴヌクレオチドは、非放射性同位体標識で標識され得る。別の実施形態において、このキットはさらに、このキメラに相補的な配列を含むテンプレートか、またはこのキメラに対する1つ以上のミスマッチを含むテンプレートを含む。別の実施形態において、このキットはさらに、ポリヌクレオチドキナーゼを含む。
【0082】
上記の考察から、本発明の種々の特徴および利点を満たす方法が理解され得る。本発明は、非常に感度が高くそして正確である、選択された標的配列を検出するための方法を提供する。選択された標的配列は、以前のオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイにおいて使用されたすべてのDNAプローブよりも短い標的特異的配列を含むキメラPNA/DNAプローブを使用して、検出され得る。従って、このキメラプローブは、設計するためにより少ない標的配列情報しか必要とせず、そして合成するためにより安価であり得る。さらに、本発明は、広範な種類の標的配列およびアッセイ形式に適合され得、そして容易に自動化され得る。
【0083】
(VI.7 実施例)
本発明は、以下の実施例によってさらに例証される。この実施例は、本発明の純粋な例示であり、そしていかようにも本発明の範囲を限定することは意図しない。
【0084】
(実施例1 PNA−DNAキメラの標識)
(TAMRAおよびNTB標識)
標識を、100μl DMFまたはNMP、および10μl DIEAに溶解した、TAMRAまたはNTBのNHSエステル5mgを用いて実施する。この標識混合物を、支持体に結合したPNA−DNAキメラに添加し、そして2〜18時間(代表的には、一晩)反応させる。この支持体を、洗浄し、続いてDMAその後DMFで標識した後、切断する。
【0085】
(CDPI標識)
CDPI3を、PNA−DNAキメラのアミノ末端へのFmoc−CDPIの3つ連続するカップリングによってこのキメラに結合し(Lukhtanov、1995)、CDPI3標識PNA−DNAキメラを作製する。Fmoc(5mg、0.012mmole)で保護したCDPIモノマー単位(1,2−ジヒドロ−3(H)−ピロロ(pyrrolo)[3,2−e]インドールー7−カルボキシレート)を100μl NMPに溶解し、そして0.95等量のHATU(DMF中0.2M)および2等量のDIEA(DMF中0.4M)によって活性化する。室温で1時間後、この活性化Fmoc−CDPI溶液を、支持体に結合したキメラに添加し、そして室温でさらに1時間カップリングさせる。カップリング後、この樹脂を20ml DMFで洗浄する。このFmocを、1:4のピペリジン:DMFを用いる室温で10分間の樹脂支持体の処理によって除去する。このカップリングおよび脱保護のサイクルを、さらに2回、合計3回の手動のカップリングの間反復して、CDPI3標識PNA−DNAキメラを生成する。
【0086】
(実施例2 ライゲーション)
図4は、ライゲーション混合物が、テンプレートおよび2つのプローブ(各々最終濃度1μM)、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液[50mM Tris−HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP、25μg/mlウシ血清アルブミン]および1,000単位のT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs、Beverly、MA)を、容量50mlにて含んだ、ライゲーション実験を示す。T4リガーゼはまた、Boehringer−Manheimから購入され得る。約70単位のNE Biolabs T4 DNAリガーゼは、1 Weiss単位のBoehringer−Manheim T4 DNAリガーゼに等しい。同じ反応を、リガーゼなしでも実行した。22.5〜25℃にて3〜4時間のインキュベーションの後、この反応混合物を、80℃で20分間加熱した。5μlの反応混合物を、変性条件(7M尿素)下で120〜140Vにて20〜60分間、(15%)ポリアクリルゲル電気泳動(PAGE)によって分析した。オリゴヌクレオチドDNA3またはPNA−DNAキメラへの、5’リン酸オリゴヌクレオチド(DNA2、DNA4またはDNA5)のライゲーションは、表2によるテンプレート(DNA1またはDNA6)に対して実行した。PNA−DNAキメラと5’リン酸オリゴヌクレオチドとの間のT4リガーゼを用いてのライゲーション(上のゲル画像)は、新規なバンドによって、レーン3、4、6、8、10において明らかである。6個のPNAモノマーを有するキメラと2〜4個の2’−デオキシヌクレオチドモノマーとのライゲーションが、有効であった。2つのオリゴヌクレオチドプローブ間のコントロールライゲーション(レーン2)は、ライゲーション産物のバンドを示す。1つのプローブのみでのコントロールライゲーション(レーン1、5、7、))は、新規なバンドを示さない。T4リガーゼなしの実験(下のゲル画像)は、テンプレートおよびプローブについてのバンドを示す。
【0087】
(表2.図4A〜4B)
【0088】
【表2】
(大文字−PNA、小文字−DNA)。
【0089】
図4Bは、SpotDensoプログラムを用いたデンシトメトリーによる、図4Aにおけるリガーゼ反応の定量評価を示す。箱で囲まれたバンドは、ライゲーション後に残っている、5’リン酸プローブを示す。レーン1、5、7および9におけるネガティブコントロール実験は、ライゲーションが生じなかった場合の、残存する5’リン酸プローブのレベルを立証した。レーン2におけるポジティブコントロール実験は、2つの全てDNAのプローブ間のライゲーション効率を示した。定量されたこれらの値から、PNA−DNAキメラプローブとのライゲーション効率は、図(右)における面積(IDV−積分密度値(Integrated Density Value))から計算され得る。
【0090】
図5は、PNA−DNAキメラプローブ(PNAオリゴマ−の3’末端に1〜4個のDNA塩基が結合する)および第2のプローブ(可変の長さの5’リン酸オリゴヌクレオチド)を用いてT4 DNAリガーゼを使用するライゲーション実験を示す(レーン4〜7)。このキメラプローブおよびオリゴヌクレオチドプローブの長さは、等しい長さのライゲーション産物を形成するように選択する(表3)。さらに、このキメラの代わりに、プローブ(レーン2)なし、すべてのPNAプローブ(レーン3)、すべてのDNAプローブ(6nt)(レーン8)、およびすべてのDNAプローブ(9nt)を使用した、コントロールライゲーションを行った。このライゲーション混合物は、38nt DNAテンプレートおよび2つのプローブ(最終濃度各1μM)、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液[50mM Tris−HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP、25μg/mlウシ血清アルブミン]、および1,000単位のT4 DNAリガーゼを、容量50μl中に含んだ。このライゲーション反応混合物を、22.5〜25℃にて3〜4時間インキュベートした。インキュベーション後、この反応混合物を、80℃にて20分間加熱し、次いで4℃にて貯蔵した。この反応混合物5μlを、15%ポリアクリルアミドゲル上にローディングし、そして変性条件(7M尿素、70℃)下で120〜140Vにて20〜60分間泳動し、次いでSYBR−Greenで染色した。図5Aは、染色したゲルをスキャンした画像を示す。図5Bは、DNAテンプレート(38nt)(配列番号(SEQ.ID NO.)9)にハイブリダイズした5’リン酸オリゴヌクレオチドへの、PNA、PNA−DNAキメラおよびDNAのライゲーションの模式図である。
【0091】
PNA−DNAキメラが、そのキメラが2、3、または4個のDNAモノマー(2’−デオキシヌクレオチド)を有する場合(それぞれ、レーン5〜7)に連結されるということは、テンプレートバンドの下の新規なバンドから明らかである。全PNAプローブまたは1個のDNAモノマーのみ含むキメラ(それぞれ、レーン3および4)について、ライゲーションが生じないことは、明らかである。レーン1は、ネガティブコントロールである。レーン8および9は、ポジティブコントロールであり、6ntおよび9ntのオリゴヌクレオチドが、5’リン酸オリゴヌクレオチドに連結している。キメラのライゲーション産物中のPNAの電気泳動での遅れ(レーン5〜7)は、全てDNAのライゲーション産物(レーン8および9)と比較して明らかである。
【0092】
(表3.図5A〜5B)
【0093】
【表3】
(大文字−PNA、小文字−DNA)。
【0094】
図6は、PNA−DNAキメラプローブとのライゲーションの特異性を示す。PNA−DNAキメラと5’リン酸オリゴヌクレオチドは、完全な一致として、およびミスマッチを伴って、テンプレート上でライゲーションされた。ライゲーション混合物は、テンプレートおよび2つのプローブ(最終濃度各1μM)、1×T4リガーゼ緩衝液[50mM Tris−HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP、25μg/mlウシ血清アルブミン]および1,000単位のT4 DNAリガーゼを、容量50ml中に含んだ。ライゲーション反応物を、22.5〜25℃にて3〜4時間インキュベーションした。インキュベーション後、この反応混合物を、80℃にて20分間加熱し、次いで4℃にて貯蔵した。5μlの反応混合物を、PAGE分析に使用し、120〜140Vにて20〜60分間電気泳動した。
【0095】
(表4 図6)
【0096】
【表4】
(大文字−DNA、小文字−DNA)
図6の実験は、PNA−DNAキメラプローブは、ライゲーションが生じるために高いレベルの配列相補性を必要とすることを示す。ミスマッチが、キメラプローブまたは第2のプローブのいずれかにおいて生じる場合、示されるシステムの範囲内で、ライゲーションは検出可能ではない。比較により、全てDNAのプローブは特異性が低い。ミスマッチが全てDNAのプローブのいずれかにおいて生じる場合、いくつかのライゲーションがなお明らかである。レーン1は、ポジティブコントロールライゲーションであり、2つのオリゴヌクレオチドが、テンプレートに完全に一致(W)し、そして予想速度24ntにて移動するライゲーション産物を形成する。レーン2の実験は、さらに、ライゲーションするミスマッチ(W+M)プローブを有する。これは、完全な一致産物とテンプレート(38nt)との間の新規なバンドによって示される。ミスマッチプローブ(DNA2A)は、そのライゲーション部位(5’リン酸プローブの5’末端のA塩基)にミスマッチを有する。レーン3の実験は、完全に一致するPNA6−DNA3キメラとDNA2第2プローブを連結して、新規なバンドを生じ、これはテンプレートよりも早く移動する。レーン4の実験は、さらにミスマッチDNA2Aプローブを有する。レーンの全てDNAの実験とは異なり、ミスマッチDNA2Aは、キメラと連結しない。このことは、PNA部分によって付与されるより大きな特異性を示す。レーン5および7の実験は、同様に、このキメラの3’末端にミスマッチを有する。レーン8の実験におけるキメラの3’末端は、欠失およびミスマッチを有する。これらの実験(レーン5、7、8)は、ライゲーション産物を示さない。レーン6の実験は、DNA9プローブの付近の終わりから2番目の塩基にミスマッチを有する。この実験において、ライゲーション産物が明らかであり、これは、全てDNAのプローブのライゲーションのより低い特異性を反映する。
【0097】
まとめると、このライゲーション実験は、図6において、PNA−DNAキメラプローブが、オリゴヌクレオチドプローブにライゲーションした場合に、2つの全てDNAのオリゴヌクレオチドプローブ間のライゲーションよりも良好に塩基対ミスマッチ(特異性)を、そのミスマッチがキメラプローブで生じようと、またはオリゴヌクレオチドプローブで生じようと、識別し得ることを、示す。
【0098】
(実施例3 ライゲーション産物のMALDI−TOF分析)
質量スペクトルを、MALDI−TOF MS(Voyage DE、PerSeptive Biosystems、PE Corporationの事業部)ワークステーションにて得た。脱塩サンプルを、マトリクス溶液(50μg/ml 3−ヒドロキシピコリン酸、50mMクエン酸アンモニウム、および30%アセトニトリルを含む)と1:1で混合し、そしてサンプルプレート上にスポットする。20〜50個の個々のレーザーパルスからの飛行時間データを、過渡(transient)ディジタイザー上で記録し、そして平均し、その後、平均したスペクトルを、データ処理ソフトウェアによって、自動的に変換する。図7のライゲーション反応。3’ビオチン化20ntオリゴヌクレオチド(質量6303)およびPNA−DNAキメラ(質量2539)を、5’ビオチン化DNAテンプレート38nt(質量12358)にハイブリダイズさせた。図7Aは、リガーゼを含まない混合物のMALDI−TOF Mass Spectroscopy分析を示す。この分析は、出発物質のイオンピークのみを示す。このライゲーション混合物が、リガーゼを含む場合(図7B)、予想質量8823.8を有するライゲーション産物が、明らかである。
【0099】
【化9】
Ac=アセチル化アミノ末端
(大文字−PNA、小文字−DNA)。
【0100】
(実施例4 CFTR遺伝子座についての多重オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ)
CFTR遺伝子座についてのOLA反応を、1つのチューブにおいて多重化した。2つの示差的に標識した(すなわち、5’部位でFAM標識またはTET標識した)PNA−DNAキメラおよび1つの5’リン酸化DNAオリゴヌクレオチドを、各変異の分析に使用した。このプローブおよびテンプレートの配列を、図8に示す。すべての多重OLA反応を、20mM Tris−HCl(pH7.6)、25mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、10mM DTT、1mM NAD、0.1% Triton X−100、1〜50nM各プローブ、5〜10μlのプールしたPCR産物、および2〜10単位の熱安定性リガーゼ(例えば、Thermus aquaticusリガーゼ)を含む、20μlの反応容器において実行する。産物の線形増幅が、Model 9700 Thermocycler(PE CorporationのPE Biosystems事業部)94℃にて30秒および30〜50℃にて1〜3分を20〜30サイクル、続いて95℃にて10〜20分間の加熱によって達成される。
【0101】
各多重PLA産物のアリコート2μlを、2.5μlの脱イオンホルムアミド、0.5μlのデキストランブルーローディング緩衝液、および0.5μlのGENESCAN−500 TAMRAサイズマーカーと混合した。この混合物を、95℃にて3分間変性し、次いで、ゲルにローディングする前に氷上で迅速に冷却した。OLA産物を、Model 373A蛍光スキャニングDNA配列決定機(PE CorporationのPE Biosystem事業部)上に2,500Vにて3.5時間電気泳動した。このゲルは、8.3M尿素、89mM Tris、89mMホウ酸、および2mM EDTAを含む、8%アクリルアミド、19:1 アクリルアミド:ビスアクリルアミド、変性ゲルを使用した。得られたゲルデータを、GENESCAN Fragment Analysis SoftwareおよびGenotyper Software(PE CorporationのPE Biosystems事業部)を使用して、ピークの色およびフラグメントのサイズを分析する。
【0102】
図9は、ヒトCFTR遺伝子座における変異を識別するための、PNA−DNAキメラプローブを用いてのオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを示す。ライゲーション混合物は、テンプレートおよび2つのプローブ(最終濃度各1μM)、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液[50mM Tris−HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP、25μg/mlウシ血清アルブミン]および1,000単位のT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)および10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼを、容量50μ中に含んだ。この混合物を、22.5〜25℃にて3〜4時間インキュベーションした。インキュベーション後、この反応混合物を、80℃にて20分間加熱し、次いで4℃にて貯蔵した。この反応混合物5μlを、PAGE分析に使用し、120〜140Vにて20〜60分間電気泳動した。(9A)ヒトpCFTR621G−T:エキソン4;(9B)ヒトpCFTR1078delT:エキソン7;(9C)ヒトpCFTRG551D:エキソン11。(大文字−PNA、小文字−DNA)。
【0103】
図9Dは、PNA−DNAキメラプローブおよび全てDNAのコントロールプローブを用いた、OLA実験をスキャンした画像を示す(レーン10)。T4リガーゼを用いた、CFTR遺伝子座621G−Tでの、PNA10−DNA3キメラとの3’−TAMRA標識5’リン酸オリゴヌクレオチドのライゲーションは、UV光下で染色なしで目に見える、蛍光標識産物を生じ(9D、上のゲル)、そしてSYBR−Greenで染色することによって目に見える、蛍光標識産物を生じた(9D、下のゲル)。PNA−DNAキメラとのライゲーション産物もまた、レーン3およびレーン9において、実験から明らかである。
【0104】
(表5 図9D)
【0105】
【表5】
すべての刊行物および特許出願は、本明細書中で、あたかも個々の刊行物または特許出願の各々が、参考として援用されると、特にそして個々に示されたのと同じ程度に、参考として援用される。
【0106】
特定の実施形態が上記に詳細に記載されているが、当業者は、多くの改変が、好ましい実施形態において、その教示を逸脱しないで可能であることを、明らかに理解する。このような改変すべては、上記の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、PNAおよびPNA−DNAキメラの構造を示す:(1A)2つの2’−デオキシヌクレオチド、および(1B)3つの2’−デオキシヌクレオチド、Bは核酸塩基。
【図2A】 図2Aは、リンカー剤および結合の構造を示す:(2A)アミド結合およびホスホジエステル結合を形成するリンカー剤。
【図2B】 図2Bは、リンカー剤および結合の構造を示す:(2B)2−(2−アミノエトキシ)エトキシ酢酸のビス−アミド結合。
【図2C】 図2Cは、リンカー剤および結合の構造を示す:
(2C)2−(2−アミノエトキシ)エタノールのアミド、リン酸エステル結合。
【図3A】 図3Aは、ライゲーションの一般化した図式を示す:(3A)3’−ヒドロキシルPNA−DNAキメラと5’−リン酸オリゴヌクレオチドとの間(DNAリガーゼを用いてDNAテンプレートにハイブリダイズされ、PNA−DNAライゲーション産物を形成する)
【図3B】 図3Bは、ライゲーションの一般化した図式を示す:(3B)ライゲーション実験のための、プローブの配列および38ntの完全一致DNAテンプレート。
【図4A】 図4Aは、ライゲーション実験のPAGE分析のスキャンされたイメージを示す:(4A 上)T4 DNAリガーゼあり、および(4A 下)リガーゼなし。
【図4B】 図4Bは、ライゲーション実験のPAGE分析のスキャンされたイメージを示す:(4B)デンシトメトリー(SpotDensoプログラム)によるライゲーションの定量的評価。
【図5A】 図5Aは、T4 DNAリガーゼを用いたライゲーション実験のPAGE分析の、スキャンされたイメージを示す:(5A)SYBR−Green染色されたゲルイメージ。
【図5B】 図5Bは、T4 DNAリガーゼを用いたライゲーション実験のPAGE分析の、スキャンされたイメージを示す:(5B)PNA、PNA−DNAキメラ、およびDNAの、DNAテンプレート38ntにハイブリダイズされた5’−リン酸オリゴヌクレオチドへのライゲーションの図式。
【図6】 図6は、野生型配列および変異型配列を検出するPNA−DNAキメラリガーゼ反応のPAGE分析の、スキャンされたイメージ、ならびにオリゴヌクレオチド:オリゴヌクレオチドライゲーションと比較した、PNA−DNAキメラプローブ:オリゴヌクレオチドライゲーションの特異性を示す。
【図7A】 図7Aは、ライゲーション反応産物のMALDI−TOF質量分析を示す:(7A)リガーゼなし。
【図7B】 図7Bは、ライゲーション反応産物のMALDI−TOF質量分析を示す:(7B)リガーゼあり。
【図8A】 図8Aは、PNA−DNAキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)を示す:(8A)異なる色素標識を用いて遺伝子座の性質を決定する工程。
【図8B】 図8Bは、PNA−DNAキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)を示す:(8B)異なる長さのオリゴヌクレオチドの5’−リン酸でのミスマッチ塩基および/または移動度変更剤を用いる、複合的なOLA。
【図8C】 図8Cは、PNA−DNAキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)を示す:(8C)異なる長さのPNA−DNAキメラの3’末端でのミスマッチ塩基および/または移動度変更剤を用いる、複合的なOLA。
【図9A】 図9Aは、ヒトCFTRの遺伝子座における変異を識別するための、PNA−DNAキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを示す:(9A)ヒトpCFTR621G−T:エキソン4。
【図9B】 図9Bは、ヒトCFTRの遺伝子座における変異を識別するための、PNA−DNAキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを示す:(9B)ヒトpCFTR1078delT:エキソン7。
【図9C】 図9Cは、ヒトCFTRの遺伝子座における変異を識別するための、PNA−DNAキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを示す:(9C)ヒトpCFTRG551D:エキソン11(大文字−PNA、小文字−DNA)。
【図9D】 図9Dは、ヒトCFTRの遺伝子座における変異を識別するための、PNA−DNAキメラプローブを用いたオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイを示す:(9D)CFTR遺伝子座621G−TにPNA10マー−DNA3マーを有するOLA。UV照明下で(上)およびSYBR Green染色で(下)、視覚化され、そして記録された。
【配列表】
Claims (30)
- テンプレート依存型ライゲーション産物を産生する方法であり、PNA−DNAキメラプローブを、テンプレート核酸およびリガーゼの存在下で、第2プローブに酵素的に連結する工程を包含し、ここで該キメラプローブがPNA部分およびDNA部分を有し、該DNA部分が、少なくとも2つのヌクレオチドおよび3’ヒドロキシル末端または5’ヒドロキシル末端を有し、
ここで、該キメラプローブおよび該第2プローブが、それぞれ該テンプレート核酸にハイブリダイズされ、そして互いに隣接し、そして該PNA部分の少なくとも一部分が該テンプレートにハイブリダイズされ、そしてここで該第2プローブはPNA−DNAキメラまたはオリゴヌクレオチドである、方法。 - 前記PNA−DNAキメラが以下の構造を有する請求項1に記載の方法:
Px−L−Ny
ここで:
各Pは独立して、PNAモノマーであり;
xは3〜15の整数であり;
各Nは独立して、ヌクレオチドであり;そして
yは2以上の整数であり;
LはPとNとの間の共有結合を表す;
ただし、該末端ヌクレオチドNが、3’−ヒドロキシル基または5’−ヒドロキシル基を有する。 - 前記キメラの前記3’−末端ヌクレオチドNが、3’−リン酸基を含み、そして前記第2プローブの5’末端が、5’−ヒドロキシルを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記キメラの前記3’−末端ヌクレオチドNが、3’−ヒドロキシルを含み、そして前記第2プローブの5’末端が、5’−リン酸基を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記キメラの前記5’−末端ヌクレオチドNが、5’−リン酸基を含み、そして前記第2プローブの3’末端が、3’ヒドロキシルを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記キメラの前記5’−末端ヌクレオチドNが、5’−ヒドロキシルを含み、そして前記第2プローブの3’末端が、3’−リン酸基を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記Pxが2−アミノエチルグリシンペプチド核酸である、請求項2に記載の方法。
- 前記各ヌクレオチドNが、独立して、2’−デオキシリボヌクレオチドである、請求項2に記載の方法。
- 前記各ヌクレオチドNが、独立して、リボヌクレオチドである、請求項2に記載の方法。
- 前記Nyの核酸塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、7−デアザアデニン、7−デアザグアニン、C−5−アルキルピリミジン、2,6−ジアミノプリン、2−チオピリミジン、C−5−プロピンピリミジン、フェノキサジン、イソシチジン、偽イソシチジン、イソグアノシン、ヒポキサンチン、8−オキソプリン、および4(3H)−ピリミドンからなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記Nyの糖が、2’−O−アルキル−リボヌクレオチド、2’−O−メチル−リボヌクレオチド、2’−O−アリル−リボヌクレオチド、2’−アリル−リボヌクレオチド、2’−ハロ−リボヌクレオチド、2’−O−メトキシエチル−リボヌクレオチド、4’−α−アノマーヌクレオチド、1’−α−アノマーヌクレオチド、2’,4’−結合ヌクレオチド、および二環式ヌクレオチドからなる群から各々独立に選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記PNA−DNAキメラおよび/または前記オリゴヌクレオチドが、非放射性同位体で標識される、請求項1に記載の方法。
- 前記PNA−DNAキメラが、該PNA部分のアミノ末端で標識される、請求項12に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、核酸塩基で標識される、請求項12に記載の方法。
- 前記核酸塩基が、前記プリンまたはデアザプリンの7−デアザ位またはC−8位、および前記ピリミジンのC−5位で標識される、請求項14に記載の方法。
- 前記標識が、蛍光色素、蛍光消光剤、ハイブリダイゼーション安定剤、エネルギー移動色素セット(energy−transfer dye set)、電気泳動移動度変更剤、化学発光色素、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、酵素、および親和性リガンドからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記標識が、FAM、TET、HEX、JOE、TAMRA、ROX、芳香族置換キサンテン色素、4,7−ジクロロ−フルオレセイン、4,7−ジクロロ−ローダミン、およびシアニンからなる群から選択される蛍光色素である、請求項16に記載の方法。
- 前記標識が、TAMRA、d−TAMRA、ROX、DABCYL、DABSYL、マラカイトグリーン、NTBおよびシアニンからなる群から選択される蛍光消光剤である、請求項16に記載の方法。
- 前記標識が、マイナーグルーブ結合剤であるハイブリダイゼーション安定剤である、請求項16に記載の方法。
- 前記マイナーグルーブ結合剤が、Hoechst33258、CDPI1−3、MGB1、ネトロプシン、ジスタマイシンからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記標識が、ビオチン、2,4−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、コレステロール、ポリエチレンオキシ、ペプチド、およびフルオレセインからなる群から選択される親和性リガンドである、請求項16に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、3’末端で標識される、請求項12に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、5’末端で標識される、請求項12に記載の方法。
- 前記Lが、共有結合、リン酸、ホスホルアミデート、1〜20の炭素原子からなるアルキルジイル、6〜20の炭素原子からなるアリールジイル、O−リンカー、および−(CH2CH2O)m−(ここでmは1〜6である)からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記テンプレート核酸がDNAであり、そして前記リガーゼが、T4 DNAリガーゼ、E.coli DNAリガーゼ、および熱安定性リガーゼからなる群から選択されるリガーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記テンプレート核酸がRNAであり、そして前記リガーゼがRNAリガーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記PNA−DNAキメラプローブ、前記第2プローブ、または前記テンプレート核酸が、固体基材上に固定される、請求項1に記載の方法。
- 前記PNA−DNAキメラプローブ、前記第2プローブ、または前記テンプレート核酸が、必要に応じて、リンカーの補助を伴い、前記固体基材に共有結合される、請求項27に記載の方法。
- 前記固体基材が、ポリスチレン、コントロールド−ポア−ガラス、ガラス、シリカゲル、シリカ、ポリアクリルアミド、磁気ビーズ、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリアミド、ポリエチレン、ポリエチレンオキシ、ならびに該固体基材のいずれかのコポリマーおよびグラフトからなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
- 前記固体基材が、微粒子、ビーズ、膜、フリット、スライド、プレート、マイクロマシン化チップ、アルカンチオール−金層、非多孔質表面、およびポリヌクレオチド固定化媒体、からなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
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