KR102264617B1 - 폴리머라제 연쇄 반응 (pcr)을 위한 신규 조성물, 방법 및 키트 - Google Patents

폴리머라제 연쇄 반응 (pcr)을 위한 신규 조성물, 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 2종 이상의 상이한 고온 개시 메카니즘을 포함하는 이중 고온 개시 반응 혼합물을 사용하여, 비-특이적 증폭 및 원치않는 증폭 생성물을 감소시키면서 표적 핵산을 증폭시키기 위한 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다.

Description

폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 위한 신규 조성물, 방법 및 키트 {NOVEL COMPOSITIONS, METHODS AND KITS FOR POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)}
본 개시내용은 일반적으로 비-특이적 증폭 및/또는 원치않는 증폭 생성물을 감소시키면서 핵산을 증폭시키기 위한 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다.
폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 관련 기술들이 다양한 적용분야에 매우 유용하기는 하지만, 원치않는 부반응으로 인한 비-표적 핵산의 증폭은 상당한 문제를 야기할 수 있다. 그와 같은 부반응은 비-표적 핵산의 미스-프라이밍(mis-priming), 및/또는 종종 프라이머-이량체 형성으로도 지칭되는 프라이머 올리고머화, 및 이후의 해당 프라이밍 생성물의 증폭의 결과로서 발생할 수 있다. 이는 특히 상당한 배경 핵산을 포함하는 반면 표적 핵산은 적은 카피 수로 존재하는 핵산 혼합물을 사용하여 PCR이 수행되는 적용분야에서 그러하다 (예컨대 문헌 [Chou et al ., Nucl. Acids Res. 20:1717 (1992)] 참조). 비-특이적으로 증폭되는 생성물의 생성은 적어도 부분적으로는 비-특이적으로 어닐링된 프라이머를 연장하는 주변 온도에서의 DNA 폴리머라제 활성에 기인하여 왔다 (예컨대 상기 문헌 [Chou et al .]; [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4580 (1990)] 참조). 따라서, 주변 온도에서의 DNA 폴리머라제 활성의 억제는 부차적인 앰플리콘의 생성을 억제하는 데에 유익하다.
원치않는 부차적인 증폭 생성물의 형성을 감소시킨다고 보고되어 있는 몇 가지 "고온 개시(hot start)" 기술들이 기술되어 있다. 어떤 "수동 고온 개시" 기술에 따르면, 혼합물의 온도가 비-특이적 프라이머 어닐링을 방지하기에 충분하게 높아질 때까지, DNA 폴리머라제 활성에 결정적인 성분 (예컨대 2가 이온 및/또는 DNA 폴리머라제 자체)이 반응 혼합물에 첨가되지 않는다 (예컨대 상기 문헌 [Chou et al.]; [D'Aquila et al ., Nucl. Acids Res. 19:3749 (1991))] 참조). 덜 노동-집약적인 기술들은 1종 이상 증폭 반응 성분의 물리적 분리 또는 가역적 불활성화를 사용한다. 예를 들어, 마그네슘 또는 DNA 폴리머라제가 왁스 비드(bead) 중에 봉쇄될 수 있는데, 그것은 반응 온도가 증가할 때 용융되므로, 승온에서만 봉쇄된 성분을 방출하게 된다. 다른 기술에 따르면, 예컨대 DNA 폴리머라제의 가역적인 화학적 변형, DNA 폴리머라제에 대한 항체의 결합, 또는 DNA 폴리머라제에 결합하는 올리고뉴클레오티드 분자에 의해, DNA 폴리머라제가 가역적으로 불활성화 또는 변형된다 (예컨대 U.S. 특허 제5,677,152호 및 5,338,671호; 및 문헌 [Dang et al., J. Mol. Biol. 264:268 (1996)] 참조). 상승된 반응 온도에서는, 화학적 변형이 역전되거나 항체 분자 또는 올리고뉴클레오티드 분자가 변성됨으로써, 기능성의 DNA 폴리머라제를 방출한다. 그러나, 일부 DNA 폴리머라제 활성이 불활성화에도 불구하고 더 낮은 반응 온도에서 검출가능하거나, 또는 그것이 DNA 폴리머라제를 완전히 활성화하는 데에 반응 혼합물 중 일부 성분의 영구적인 불활성화를 초래할 수 있는 고온에서의 연장된 반응 혼합물의 노출을 요구한다는 점에서, 이러한 기술들 중 일부는 최적 미만인 것으로 보인다.
특정 실시간 및/또는 종말점 검출 기술을 포함하여, 현재 사용되고 있는 어떤 핵산 증폭 기술들은 핵산 염료, 비제한적으로 예를 들어 SYBR® 그린(Green) I (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 캘리포니아 칼스배드 소재)를 포함하는 증폭 생성물을 검출 및/또는 정량하기 위한 단계를 포함한다 (예컨대 문헌 [Ririe et al ., Anal. Biochem. 245:154 (1997)] 참조). 통상적으로, 핵산 염료는 증폭 생성물의 이중-가닥 분절 및/또는 프라이머-주형 이중체와 결합되어, 구체적인 핵산 염료 특유의 파장에서 검출가능한 형광 신호를 방출한다. 어떤 증폭 방법은 비제한적으로 예를 들어 용융 곡선 분석으로도 알려져 있는 PCR-후 해리 곡선 분석에 의한, 핵산 염료와 결합되어 있는 증폭 생성물(들)의 순도를 평가하기 위한 검출 단계를 포함한다. 앰플리콘의 용융 곡선은 (특히) 그의 길이 및 서열에 따라 달라지기 때문에, 앰플리콘은 일반적으로 그의 용융 곡선에 의해 구별될 수 있다 (예컨대 문헌 [Zhang et al ., Hepatology 36:723 (2002)] 참조). 해리 또는 용융 곡선은 특정 증폭 반응 동안 반응 온도가 앰플리콘(들)의 용융 온도를 통과할 때 핵산 염료 형광을 모니터링하는 것에 의해 수득될 수 있다. 이중-가닥 앰플리콘의 해리는 핵산 염료 특유의 방출 파장에서의 형광의 갑작스런 감소로 관찰된다. 특정 해리 곡선 분석 기술에 따르면, 용융 곡선이 때로는 형광 강도의 음의 도함수 대 온도 (-dF/dt 대 T)의 플롯에서 그래픽상 피크로 나타나는 단일의 일관된 용융 온도를 나타내는 경우, 증폭 생성물은 "순수한" 것으로 분류된다. 반면, 단일체(single-plex) 증폭으로부터의 그와 같은 해리 곡선에서의 다수 피크의 출현은 통상적으로 원치않는 부반응 생성물의 존재를 표시한다. 그와 같은 핵산 염료-기반 증폭 생성물 검출 기술이 사용될 때에는, 종종 하기가 바람직하다: 1) 원치않는 부반응 생성물의 형성을 적어도 감소시키고, 바람직하게는 제거하는 것, 및 2) 다른 핵산, 즉 비-증폭 생성물 (예컨대 프라이머 이량체) 및/또는 비-특이적 증폭 생성물 (예컨대 미스-프라이밍 사례로 인한 것)의 이중-가닥 분절의 변성으로부터 생성되는 형광 피크를 적어도 감소시키고, 바람직하게는 제거하는 것.
어떤 다른 증폭 기술들은 특히 프라이머, 라이게이션 프로브, 절단 프로브, 프로모터-프라이머 등의 비-특이적 어닐링, 및 이후의 최적-미만 온도에서의 효소 활성으로 인하여 원치않는 증폭 생성물을 산출할 수도 있다. 예를 들어, 종종 실온에서, 또는 반응 조성물이 원하는 반응 온도까지 가열되는 동안, 반응 성분들이 조합되는 것이다. 이러한 기술들 중 적어도 일부는 배경 형광의 감소로부터 이익을 얻을 수 있다. 따라서, 1) 원치않는 부반응 생성물의 형성, 및 2) 이러한 원치않는 부반응 생성물에 기인하는 배경 형광을 감소시키고/거나 제거하는 조성물 및 방법에 대한 요구가 존재한다.
본 교시는 비-특이적 증폭 (예컨대 형광), 및 업계에서 종종 부차 앰플리콘 또는 의사 부산물로 지칭되는 원치않는 증폭 생성물을 감소시키면서 표적 핵산을 증폭시키기 위한 조성물, 방법 및 키트에 관한 것이다.
특정 실시양태에서는, 핵산 폴리머라제, 및 제1 온도 (예컨대 < 40℃의 온도)에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제하는 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 제1 온도에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제하는 데에 사용되는 2종 이상의 상이한 고온 개시 메카니즘을 포함한다. 그와 같은 고온 개시 메카니즘에는 더 낮은 온도에서 DNA 폴리머라제 활성을 차단하는 항체 또는 항체 조합, 더 낮은 온도에서 DNA 폴리머라제 활성을 차단하는 올리고뉴클레오티드, 승온에서 해리되는 DNA 폴리머라제의 가역적인 화학적 변형, 더 낮은 온도에서 감소된 활성을 제공하는 DNA 폴리머라제의 아미노산 변형, 초안정성 DNA 결합 도메인 및 토포이소머라제를 포함하는 융합 단백질, DNA 폴리머라제를 억제하는 온도 의존성 리간드, 더 낮은 온도에서 프라이머를 봉쇄하는 단일 가닥 결합 단백질, 변형된 프라이머 또는 변형된 dNTP가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 통상적인 고온 개시 메카니즘에 비해 연장된 시간 기간 동안 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 억제한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중 고온 개시 반응 혼합물은 주변 온도에서 24시간 이상 동안 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 억제한다. 특정 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 단일 고온 개시 메카니즘만을 가지는 고온 개시 반응 혼합물과 비교하였을 때 약 20-100%까지 비-특이적 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%까지 비-특이적 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 단일 고온 개시 메카니즘만을 가지는 반응 혼합물과 비교하였을 때 약 2- 내지 4-배까지 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 약 2-, 2.5-, 3-, 3.5- 또는 4-배까지 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다.
특정 실시양태에서는, 열안정성 핵산 폴리머라제, 및 약 40℃ 미만의 온도에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제하며 약 40℃ 초과의 온도에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 실질적으로 억제하지 않는 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 핵산 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 폴리머라제는 열안정성일 수 있다.
특정 실시양태에서는, 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성의 억제 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 폴리머라제를 제1 온도 (예컨대 < 40℃의 온도)에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제하는 이중 고온 개시 반응 혼합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 폴리머라제 억제는 가역적일 수 있다 (예컨대 상기 제1 온도를 초과하는 온도, 통상적으로는 약 40℃ 이상의 온도까지 가열하는 것에 의함). 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 제1 온도 (예컨대 주변 온도)에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제하는 데에 사용되는 2종 이상의 상이한 고온 개시 메카니즘을 포함한다. 그와 같은 고온 개시 메카니즘에는 더 낮은 온도에서 DNA 폴리머라제 활성을 차단하는 항체 또는 항체 조합, 더 낮은 온도에서 DNA 폴리머라제 활성을 차단하는 올리고뉴클레오티드, 승온에서 해리되는 DNA 폴리머라제의 가역적인 화학적 변형, 더 낮은 온도에서 감소된 활성을 제공하는 DNA 폴리머라제의 아미노산 변형, 초안정성 DNA 결합 도메인 및 토포이소머라제를 포함하는 융합 단백질, DNA 폴리머라제를 억제하는 온도 의존성 리간드, 더 낮은 온도에서 프라이머를 봉쇄하는 단일 가닥 결합 단백질, 변형된 프라이머 또는 변형된 dNTP가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 핵산 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 폴리머라제는 열안정성일 수 있다.
특정 실시양태에서는, 핵산 분자의 합성 방법이 제공된다. 그와 같은 방법은 주형 핵산을, 열안정성 핵산 폴리머라제, 이중 고온 개시 반응 혼합물, 1종 이상의 뉴클레오시드 및/또는 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 1종 이상의 프라이머를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것으로써, 여기서 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 더 낮은 온도 (예컨대 주변 온도)에서 (이중 고온 개시 메카니즘이 없는 반응 혼합물에서의 폴리머라제 활성에 비해) 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제하는 것, 생성 혼합물이 폴리머라제 억제를 완화하기에 충분한 더 높은 온도가 되도록 하는 것, 및 주형 핵산을 중합하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서는, 이중 고온 개시 반응 혼합물을 사용한 비-특이적 형광의 감소 방법이 제공된다. 그와 같은 방법에 따르면, 핵산 폴리머라제는 이중 고온 개시 반응 혼합물이 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 실질적으로 억제하는 데에 적합한 조건하에 제1 온도에서 이중 고온 개시 반응 혼합물과 접촉된다. 생성 혼합물이 적합한 제2 온도로 가열되는 경우, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 핵산 폴리머라제 또는 핵산 폴리머라제 활성의 억제를 중지한다.
특정 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 통상적인 고온 개시 메카니즘에 비해 연장된 시간 기간 동안 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 억제한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중 고온 개시 반응 혼합물은 주변 온도에서 24시간 이상 동안 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 억제한다. 특정 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 단일 고온 개시 메카니즘만을 가지는 고온 개시 반응 혼합물과 비교하였을 때 약 20-100%까지 비-특이적 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%까지 비-특이적 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 단일 고온 개시 메카니즘만을 가지는 반응 혼합물과 비교하였을 때 약 2- 내지 4-배까지 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 약 2-, 2.5-, 3-, 3.5- 또는 4-배까지 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다.
특정 실시양태에서는, 이중 고온 개시 반응 혼합물을 사용한 비-특이적 형광의 감소 방법이 제공된다. 그와 같은 방법에 따르면, 제1 온도에서 핵산 폴리머라제, 이중 고온 개시 반응 혼합물, 1종 이상의 NTP 또는 dNTP, 표적 핵산, 1종 이상의 프라이머 및 1종 이상의 핵산 결합 염료를 포함하는 반응 조성물이 형성된다. 특정 실시양태에서, 상기 1종 이상의 프라이머는 프라이머 쌍을 포함한다. 제1 온도 (예컨대 < 40℃의 온도, 예컨대 주변 온도 또는 실온)에서는, 이중 고온 개시 반응 혼합물이 핵산 폴리머라제의 폴라머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제한다. 이후, 반응 조성물은 이중 고온 개시 반응 혼합물이 핵산 폴리머라제에 대한 활성을 회복하도록 하는 제2 반응 온도로 가열된다. 반응 조성물은 1회 이상의 증폭 주기에 적용되며, 1개 이상의 앰플리콘이 생성된다. 이중-가닥의 앰플리콘들은 앰플리콘과 결합되는 핵산 결합 염료의 형광으로 인하여 "실시간" 또는 증폭 반응이 완료된 후 중 어느 하나로 검출될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 통상적인 고온 개시 메카니즘에 비해 연장된 시간 기간 동안 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 억제한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중 고온 개시 반응 혼합물은 주변 온도에서 24시간 이상 동안 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 억제한다. 특정 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 단일 고온 개시 메카니즘만을 가지는 고온 개시 반응 혼합물과 비교하였을 때 약 20-100%까지 비-특이적 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%까지 비-특이적 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 단일 고온 개시 메카니즘만을 가지는 반응 혼합물과 비교하였을 때 약 2- 내지 4-배까지 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 약 2-, 2.5-, 3-, 3.5- 또는 4-배까지 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다.
특정 실시양태에서는, 이중 고온 개시 반응 혼합물을 사용한 표적 핵산의 증폭 방법이 제공된다. 특정 상기 방법에 따르면, 제1 온도에서 핵산 폴리머라제, 이중 고온 개시 반응 혼합물, 1종 이상의 NTP 또는 dNTP, 표적 핵산, 1종 이상의 프라이머 및 1종 이상의 핵산 결합 염료를 포함하는 반응 조성물이 형성된다. 특정 실시양태에서, 상기 1종 이상의 프라이머는 프라이머 쌍을 포함한다. 제1 온도에서는, 이중 고온 개시 반응 혼합물이 핵산 폴리머라제의 폴라머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제한다. 이후, 반응 조성물은 이중 고온 개시 반응 혼합물이 핵산 폴리머라제 또는 핵산 폴리머라제 활성의 억제를 중지하도록 하는 제2 반응 온도로 가열된다. 반응 조성물은 1회 이상의 증폭 주기에 적용되며, 다수의 앰플리콘들이 생성된다. 이중-가닥의 앰플리콘들은 앰플리콘과 결합되는 핵산 결합 염료의 형광으로 인하여 "실시간" 또는 증폭 반응이 완료된 후 중 어느 하나로 검출될 수 있다.
특정 실시양태에서는, 본 발명의 방법들 중 어느 것을 수행하기 위한 키트도 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 키트는 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 키트는 추가로 1종 이상의 핵산 폴리머라제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 하기 중 1종 이상을 추가로 포함한다: 1종 이상의 프라이머 또는 프라이머 쌍, 핵산 결합 염료, 리포터 프로브 및 리버스 트랜스크립타제.
본원에서는, 본 교시의 이들 및 기타 특징들을 제공한다.
도 1: 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스 단독 ("정사각형" 선), 플래티넘® SYBR® 그린 qPCR 마스터 믹스 단독 ("십자가" 선), 및 플래티넘® SYBR® 그린 qPCR 마스터 믹스와의 1:1 비의 조합으로써의 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스 ("삼각형" 선)의 비교. a: 0시간 실온 사전-인큐베이션 ("T0")에서의 cDNA의 증폭; b: T0에서의 NTC (비-특이적 생성물)의 증폭; c: 24시간 실온 사전-인큐베이션 ("T24")에서의 cDNA의 증폭; 및 d: T24에서의 NTC의 증폭.
도 2: 단독 또는 조합으로써의 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스 및 플래티넘® SYBR® 그린 qPCR 마스터 믹스를 사용한 핵산 증폭. a: T0에서의 A2M cDNA 및 NTC의 용융 곡선 분석; b: T24에서의 A2M cDNA 및 NTC의 용융 곡선 분석; c: T0에서의 COL1A1 cDNA 및 NTC의 용융 곡선 분석; d: T24에서의 COL1A1 cDNA 및 NTC의 용융 곡선 분석; e: 단독 또는 조합으로써의 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스 및 플래티넘® SYBR® 그린 qPCR 마스터 믹스에 있어서의 평균 Ct 및 ΔCt의 비교; f: 단독 또는 조합으로써의 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스 및 플래티넘® SYBR® 그린 qPCR 마스터 믹스의 용융 곡선 분석.
도 3: 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스 단독 ("다이아몬드" 선) 및 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스와 플래티넘® Taq 항체의 조합 ("십자가" 선)의 비교. a: T0에서의 cDNA의 증폭; b: T0에서의 NTC의 증폭; c: T24에서의 cDNA의 증폭; 및 d: T24에서의 NTC의 증폭.
도 4: 단독 또는 조합으로써의 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스 및 플래티넘® Taq 항체를 사용한 핵산 증폭. a: T0 및 T24에서의 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스 단독을 사용한 A2M의 용융 곡선 분석; b: T0 및 T24에서의 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스와 플래티넘® Taq 항체의 조합을 사용한 A2M의 용융 곡선 분석; c: 단독 또는 조합으로써의 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스 및 플래티넘® Taq 항체의 용융 곡선 분석.
도 5: 파워 SYBR® 그린 PCR 마스터 믹스 단독 ("다이아몬드" 선) 및 파워 SYBR® 그린 PCR 믹스와 플래티넘® Taq 항체의 조합 ("십자가" 선)의 비교. a: T0에서의 cDNA의 증폭; b: T0에서의 NTC의 증폭; c: T24에서의 cDNA의 증폭; 및 d: T24에서의 NTC의 증폭.
도 6: 단독 또는 조합으로써의 파워 SYBR® 그린 PCR 마스터 믹스 및 플래티넘® Taq 항체를 사용한 핵산 증폭. a: T0 및 T24에서의 파워 SYBR® 그린 PCR 마스터 믹스 단독을 사용한 A2M의 용융 곡선 분석; b: T0 및 T24에서의 파워 SYBR® 그린 PCR 마스터 믹스와 플래티넘® Taq 항체의 조합을 사용한 A2M의 용융 곡선 분석; c: 단독 또는 조합으로써의 파워 SYBR® 그린 PCR 마스터 믹스 및 플래티넘® Taq 항체의 용융 곡선 분석.
특정 실시양태에서는, 핵산 폴리머라제, 및 제1 온도 (예컨대 < 40℃의 온도)에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제하는 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 제1 (예컨대 더 낮은) 온도에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제하는 데에 사용되는 2종 이상의 상이한 고온 개시 메카니즘을 포함한다. 그와 같은 고온 개시 메카니즘에는 예를 들어 더 낮은 온도에서 DNA 폴리머라제 활성을 차단하는 항체 또는 항체 조합, 더 낮은 온도에서 DNA 폴리머라제 활성을 차단하는 올리고뉴클레오티드, 승온에서 해리되는 DNA 폴리머라제의 가역적인 화학적 변형, 더 낮은 온도에서 감소된 활성을 제공하는 DNA 폴리머라제의 아미노산 변형, 초안정성 DNA 결합 도메인 및 토포이소머라제를 포함하는 융합 단백질, DNA 폴리머라제를 억제하는 온도 의존성 리간드, 더 낮은 온도에서 프라이머를 봉쇄하는 단일 가닥 결합 단백질, 변형된 프라이머 또는 변형된 dNTP가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 통상적인 고온 개시 메카니즘에 비해 연장된 시간 기간 동안 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 억제한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중 고온 개시 반응 혼합물은 주변 온도에서 24시간 이상 동안 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 억제한다. 특정 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 단일 고온 개시 메카니즘만을 가지는 고온 개시 반응 혼합물과 비교하였을 때 약 20-100%까지 비-특이적 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%까지 비-특이적 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 단일 고온 개시 메카니즘만을 가지는 반응 혼합물과 비교하였을 때 약 2- 내지 4-배까지 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 약 2-, 2.5-, 3-, 3.5- 또는 4-배까지 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다.
특정 실시양태에서는, 열안정성 핵산 폴리머라제, 및 약 40℃ 미만의 온도에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제하며 약 40℃ 초과의 온도에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 실질적으로 억제하지 않는 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 실시양태에서, 핵산 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 폴리머라제는 열안정성일 수 있다.
특정 실시양태에서는, 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성의 억제 방법이 제공된다. 이러한 방법은 폴리머라제를 제1 온도 (예컨대 < 40℃의 온도)에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제하는 이중 고온 개시 반응 혼합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 폴리머라제 억제는 가역적일 수 있다 (예컨대 약 40℃ 이상의 제2 온도까지 가열하는 것에 의함). 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 제1 온도에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제하는 데에 사용되는 2종 이상의 상이한 고온 개시 메카니즘을 포함한다. 그와 같은 고온 개시 메카니즘에는 더 낮은 온도에서 DNA 폴리머라제 활성을 차단하는 항체 또는 항체 조합, 더 낮은 온도에서 DNA 폴리머라제 활성을 차단하는 올리고뉴클레오티드, 승온에서 해리되는 DNA 폴리머라제의 가역적인 화학적 변형, 더 낮은 온도에서 감소된 활성을 제공하는 DNA 폴리머라제의 아미노산 변형, 초안정성 DNA 결합 도메인 및 토포이소머라제를 포함하는 융합 단백질, DNA 폴리머라제를 억제하는 온도 의존성 리간드, 더 낮은 온도에서 프라이머를 봉쇄하는 단일 가닥 결합 단백질, 변형된 프라이머 또는 변형된 dNTP가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 핵산 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 폴리머라제는 열안정성일 수 있다.
특정 실시양태에서는, 핵산 분자의 합성 방법이 제공된다. 그와 같은 방법은 주형 핵산을, 열안정성 핵산 폴리머라제, 이중 고온 개시 반응 혼합물, 1종 이상의 뉴클레오시드 및/또는 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 1종 이상의 프라이머를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것으로써, 여기서 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 제1 온도에서 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제하는 것, 생성 혼합물이 폴리머라제 억제를 완화하기에 충분한 제2 온도가 되도록 하는 것, 및 주형 핵산을 중합하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 온도는 주변 온도 (예컨대 실온)이다. 특정 실시양태에서, 핵산 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 폴리머라제는 열안정성일 수 있다.
특정 실시양태에서는, 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함하는, 미스-프라이밍 사례의 방지 또는 감소 방법이 제공된다. 그와 같은 방법에 따르면, 핵산 폴리머라제는 이중 고온 개시 반응 혼합물이 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 실질적으로 억제하는 데에 적합한 조건하에 제1 온도에서 이중 고온 개시 반응 혼합물과 접촉된다. 생성 혼합물이 적합한 제2 온도로 가열되는 경우, 이중 고온 개시 메카니즘이 폴리머라제 또는 폴리머라제 활성을 억제하는 것이 중지되고, 프라이머 연장이 이루어지도록 허용된다.
특정 실시양태에서는, 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함하는, 비-특이적 증폭 생성물 형성의 감소 방법이 제공된다. 그와 같은 방법에 따르면, 표적 핵산은 핵산 폴리머라제, 이중 고온 개시 반응 혼합물, 1종 이상의 프라이머 및 1종 이상의 dNTP와 접촉된다. 특정 실시양태에서, 상기 1종 이상의 프라이머는 프라이머 쌍을 포함한다. 제1 온도에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제한다. 이후, 반응 조성물은 이중 고온 개시 반응이 핵산 폴리머라제를 억제하는 것을 방지하는 제2 온도로 가열된다. 반응 조성물 중 표적 핵산은 이후 1회 이상의 증폭 주기에 적용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산 폴리머라제는 열안정성이다. 특정의 다른 실시양태에서, 핵산 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제이다. 예를 들어, 핵산 폴리머라제는 비제한적으로 Taq DNA 폴리머라제, Tfl DNA 폴리머라제, Tfi DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제 및 벤트(Vent)™ DNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 2종 이상의 상이한 고온 개시 메카니즘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 2종 이상의 상이한 고온 개시 메카니즘은 더 낮은 온도에서 DNA 폴리머라제 활성을 차단하는 항체 또는 항체 조합, 더 낮은 온도에서 DNA 폴리머라제 활성을 차단하는 올리고뉴클레오티드, 승온에서 해리되는 DNA 폴리머라제의 가역적인 화학적 변형, 더 낮은 온도에서 감소된 활성을 제공하는 DNA 폴리머라제의 아미노산 변형, 초안정성 DNA 결합 도메인 및 토포이소머라제를 포함하는 융합 단백질, DNA 폴리머라제를 억제하는 온도 의존성 리간드, 더 낮은 온도에서 프라이머를 봉쇄하는 단일 가닥 결합 단백질, 변형된 프라이머 또는 변형된 dNTP로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 통상적인 고온 개시 메카니즘에 비해 증가된 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성의 억제를 제공한다. 다른 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 통상적인 고온 개시 메카니즘에 비해 연장된 시간 기간 동안 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 억제한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 주변 온도에서 24시간 이상 동안 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 억제한다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 단일 고온 개시 메카니즘만을 가지는 고온 개시 반응 혼합물과 비교하였을 때 약 20-100%까지 비-특이적 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%까지 비-특이적 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 단일 고온 개시 메카니즘만을 가지는 반응 혼합물과 비교하였을 때 약 2- 내지 4-배까지 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 약 2-, 2.5-, 3-, 3.5- 또는 4-배까지 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다.
특정 실시양태에서는, 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함하는, 비-특이적 형광의 감소 방법이 제공된다. 그와 같은 방법에 따르면, 제1 온도에서 핵산 폴리머라제, 이중 고온 개시 반응 혼합물, 1종 이상의 NTP 또는 dNTP, 표적 핵산, 1종 이상의 프라이머 및 1종 이상의 핵산 결합 염료를 포함하는 반응 조성물이 형성된다. 특정 실시양태에서, 상기 1종 이상의 프라이머는 프라이머 쌍을 포함한다. 제1 온도에서는, 이중 고온 개시 반응 혼합물이 핵산 폴리머라제의 폴라머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제한다. 이후, 반응 조성물은 이중 고온 개시 반응 혼합물이 핵산 폴리머라제 활성이 이루어지는 것을 허용하도록 하는 제2 반응 온도로 가열된다. 반응 조성물은 1회 이상의 증폭 주기에 적용되며, 다수의 앰플리콘들이 생성된다. 이중-가닥의 앰플리콘들은 앰플리콘과 결합되는 핵산 결합 염료의 형광으로 인하여 "실시간" 또는 증폭 반응이 완료된 후 중 어느 하나로 검출될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 통상적인 고온 개시 메카니즘에 비해 연장된 시간 기간 동안 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 억제한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중 고온 개시 반응 혼합물은 주변 온도에서 24시간 이상 동안 비-특이적 핵산 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 억제한다. 특정 실시양태에서, 상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 단일 고온 개시 메카니즘만을 가지는 고온 개시 반응 혼합물과 비교하였을 때 약 20-100%까지 비-특이적 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%까지 비-특이적 증폭 및/또는 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 단일 고온 개시 메카니즘만을 가지는 반응 혼합물과 비교하였을 때 약 2- 내지 4-배까지 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 약 2-, 2.5-, 3-, 3.5- 또는 4-배까지 비-특이적 생성물 형성을 감소시킨다.
특정 실시양태에서는, 이중 고온 개시 반응 혼합물을 사용한 표적 핵산의 증폭 방법이 제공된다. 특정 상기 방법에 따르면, 제1 온도에서 핵산 폴리머라제, 이중 고온 개시 반응 혼합물, 1종 이상의 NTP 또는 dNTP, 표적 핵산, 1종 이상의 프라이머 및 1종 이상의 핵산 결합 염료를 포함하는 반응 조성물이 형성된다. 특정 실시양태에서, 상기 1종 이상의 프라이머는 프라이머 쌍을 포함한다. 제1 온도에서는, 이중 고온 개시 반응 혼합물이 핵산 폴리머라제의 폴라머라제 활성을 억제 또는 실질적으로 억제한다. 이후, 반응 조성물은 이중 고온 개시 반응 혼합물이 핵산 폴리머라제 또는 핵산 폴리머라제 활성의 억제를 중지하도록 하는 제2 반응 온도로 가열된다. 반응 조성물은 1회 이상의 증폭 주기에 적용되며, 다수의 앰플리콘들이 생성된다. 이중-가닥의 앰플리콘들은 앰플리콘과 결합되는 핵산 결합 염료의 형광으로 인하여 "실시간" 또는 증폭 반응이 완료된 후 중 어느 하나로 검출될 수 있다.
특정 실시양태에서는, 본 발명의 방법들 중 어느 것을 수행하기 위한 키트도 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 키트는 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 키트는 추가로 1종 이상의 핵산 폴리머라제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 키트는 하기 중 1종 이상을 추가로 포함한다: 1종 이상의 프라이머 또는 프라이머 쌍, 핵산 결합 염료, 리포터 프로브 및 리버스 트랜스크립타제.
본 개시내용의 주제를 더욱 명확하고 간결하게 기술하고 나타내기 위하여, 하기의 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 특정 용어들에 대하여 하기의 정의가 제공된다. 명세서 전체에 걸쳐, 특정 용어의 예시는 비-제한적인 예로 간주되어야 한다.
본 명세서에서 사용될 때, "a" 또는 "an"이라는 단어는 구체적으로 다르게 언급되지 않는 한, 하나 이상을 의미한다. 본 명세서에서, 단수형의 사용은 구체적으로 다르게 언급되지 않는 한, 복수형을 포함한다. 제한으로서가 아닌 예를 들자면, "표적 핵산(a target nucleic acid)"은 하나를 초과하는 표적 핵산; 예를 들어 특정 표적 핵산 종의 1개 이상 카피는 물론, 2종 이상의 상이한 표적 핵산 종이 존재할 수 있음을 의미한다. "및/또는"이라는 용어는 슬래시 전 및 후의 용어들이 함께 또는 별도로 채택될 수 있음을 의미한다. 제한으로서가 아닌 예시 목적으로, "X 및/또는 Y"는 "X" 또는 "Y", 또는 "X 및 Y"를 의미할 수 있다.
본 개시내용에서 논의되는 온도, 농도, 시간 등에 선행하는 "약"은 묵시적으로 존재하는 것으로써, 본원에서 약간의 실질적이지 않은 편차는 본 교시의 영역에 속한다는 것을 알고 있을 것이다. 또한, "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)", "포함하는 것", "함유하다(contain)", "함유하다(contains)", "함유하는 것", "포함되다(include)", "포함되다(includes)" 및 "포함되는 것"의 사용은 제한하고자 하는 것이 아니다. 전기한 일반적 기술 및 상세한 기술 모두는 단지 대표적인 설명 목적의 것으로써, 교시를 제한하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다.
상기 명세서에 구체적으로 주지되어 있지 않은 한, 다양한 구성요소들을 "포함하는 것"을 언급하는 상기 명세서의 실시양태는 언급된 구성요소들로 "이루어지는 것" 또는 "본질적으로 이루어지는 것"으로도 고려되며; 다양한 구성요소들로 "이루어지는 것"을 언급하는 명세서의 실시양태는 언급된 구성요소들을 "포함하는 것" 또는 그들로 "본질적으로 이루어지는 것"으로도 고려되고; 다양한 구성요소들로 "본질적으로 이루어지는 것"을 언급하는 명세서의 실시양태는 언급된 구성요소들로 "이루어지는 것" 또는 그들을 "포함하는 것"으로도 고려된다 (이와 같은 호환가능성은 청구범위에서의 해당 용어들의 사용에는 적용되지 않음).
본원에서 사용되는 부문 표제는 편성 목적만을 위한 것으로써, 어떠한 방식으로도 원하는 주제를 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 된다. 비제한적으로 특허, 특허 출원, 논문, 서적 및 논설을 포함하여, 명세서에서 인용되는 모든 문헌은 모든 목적에 있어서 그 전문이 명시적으로 참조로 포함된다. 포함 문헌 중 어느 것이 본 명세서에서 정의되는 임의의 용어와 모순되는 경우, 본 명세서가 우선한다. 본 교시가 다양한 실시양태들과 연계되어 기술되기는 하지만, 그와 같은 실시양태로 본 교시가 제한되는 것을 원하는 것은 아니다. 반대로, 업계 숙련자라면 알고 있을 바와 같이, 본 교시는 다양한 대안, 변형 및 등가물들을 포괄한다.
본원에서 사용될 때의 "앰플리콘" 및 "증폭 생성물"이라는 용어는 일반적으로 증폭 반응의 생성물을 지칭한다. 앰플리콘은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있으며, 이중-가닥의 증폭 생성물을 변성시킴으로써 수득되는 분리된 구성요소 가닥이 거기에 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 일 증폭 주기의 앰플리콘은 이어지는 증폭 주기에서 주형으로 작용할 수 있다.
비제한적으로 기본 단어인 "혼성화하다" 및 "어닐링하다"의 변이들을 포함하여, "어닐링하는 것" 및 "혼성화하는 것"이라는 용어는 호환가능하게 사용되며, 이중체, 삼중체 또는 기타 더 고급인 구조의 형성을 초래하는 일 핵산의 또 다른 핵산과의 뉴클레오티드 염기-쌍형성 상호작용을 의미한다. 일차적인 상호작용은 통상적으로 뉴클레오티드 염기 특이적인, 예컨대 왓슨-크릭(Watson-Crick) 및 후그스틴(Hoogsteen)-유형의 수소 결합에 의한 A:T, A:U 및 G:C이다. 특정 실시양태에서는, 염기-적층 및 소수성 상호작용이 이중체 안정성에 기여할 수도 있다. 프라이머 및 프로브가 상보성 서열에 어닐링되는 조건에 대해서는 예컨대 문헌 [Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, Hames and Higgins, eds., IRL Press, Washington, D.C. (1985)] 및 [Wetmur and Davidson, Mol. Biol. 31:349 (1968)]에 기술되어 있는 바와 같이 업계에 잘 알려져 있다.
일반적으로, 그와 같은 어닐링이 이루어질지 여부는 특히 프라이머와 그의 표적 측접 서열 및/또는 앰플리콘에서의 상응 결합 부위의 상보성인 부분, 또는 리포터 프로브와 그의 결합 부위의 상응하는 상보성 부분의 길이; pH; 온도; 1가 및 2가 양이온의 존재; 혼성화 영역에서의 G 및 C 뉴클레오티드의 비율; 매체의 점도; 및 변성제의 존재에 의해 영향을 받는다. 그와 같은 변수들은 혼성화에 요구되는 시간에 영향을 준다. 따라서, 바람직한 어닐링 조건은 구체적인 적용분야에 따라 달라지게 된다. 그러나, 그와 같은 조건들은 과도한 실험 없이도 업계 일반의 숙련자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다. 바람직하게는, 어닐링 조건은 프라이머 및/또는 프로브가 상응하는 표적 측접 서열 또는 앰플리콘의 상보성 서열과는 선택적으로 혼성화되나, 제2 반응 온도에서는 반응 조성물 중의 상이한 표적 핵산 또는 비-표적 서열에는 어떠한 유의성 있는 정도로도 혼성화되지 않는 것을 가능케 하도록 선택된다.
"선택적으로 혼성화되다"라는 용어 및 그의 변이들은 적절한 엄격도(stringency) 조건하에서 주어진 서열 (예를 들어 비제한적으로 프라이머)이 상보성인 일련의 뉴클레오티드들 (예를 들어 비제한적으로 앰플리콘의 표적 측접 서열 또는 프라이머 결합 부위)을 포함하는 제2의 서열과는 어닐링되나, 비-표적 핵산, 프로브 또는 다른 프라이머와 같은 원치않는 서열과는 어닐링되지 않는다는 것을 의미한다. 통상적으로, 반응 온도가 특정 이중-가닥 서열의 용융 온도를 향하여 증가하면서, 선택적 혼성화의 상대적인 양은 일반적으로 증가하며, 미스-프라이밍은 일반적으로 감소한다. 본 명세서에서, 일 서열이 또 다른 서열과 혼성화 또는 선택적으로 혼성화된다는 언급은 양 서열의 전체가 서로 혼성화 또는 선택적으로 혼성화되는 상황, 및 일 서열 또는 양 서열의 일부만이 전체 다른 서열 또는 다른 서열의 일부에 혼성화 또는 선택적으로 혼성화되는 상황을 포괄한다.
본원에서 사용될 때, "엄격도"라는 용어는 2개의 상보성 뉴클레오티드 서열로 구성되는 혼성체가 형성되게 되는 혼성화 및 이후의 처리 단계 동안 존재하는 온도 및 용매 조성물을 정의하는 데에 사용된다. 엄격도는 또한 상동성의 양, 필요한 조건, 및 2개 뉴클레오티드 서열 사이에 형성되는 혼성체의 안정성을 한정한다. 엄격도 조건이 증가할수록, 선택적 혼성화가 선호되며, 비-특이적인 교차-혼성화는 소외된다. 엄격도 조건의 증가는 통상적으로 미스-프라이밍이 발생할 가능성이 더 큰 더 낮은 엄격도 조건에 비해 더 높은 인큐베이션 온도, 더 낮은 염 농도 및/또는 더 높은 pH에 상응한다. 업계 관련자라면, 상응하는 표적 측접 서열 및/또는 앰플리콘에 대한 프라이머 또는 프라이머 쌍의 선택적 혼성화를 가능케 하는 적절한 엄격도 조건이 잘 알려져 있는 기술을 사용하여 과도한 실험 없이도 일상적으로 결정될 수 있다는 것을 알고 있다 (예컨대 문헌 [PCR: The Basics from Background to Bench, McPherson and Moller, Bios Scientific Publishers, 2000] 참조).
본원에서 사용될 때, 폴리머라제 활성을 "실질적으로 억제하는" 이중 고온 개시 반응 혼합물 또는 메카니즘은 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 더욱 바람직하게는 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 7.5% 미만 또는 약 5% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 약 0.5% 미만, 약 0.25% 미만의 폴리머라제 활성을 제공하거나, 또는 폴리머라제 활성이 완전히 결핍되어 있는 반응 혼합물을 지칭한다. 본원에서 사용될 때의 "실질적으로 억제되는" 폴리머라제 활성은 상기 고온 개시 메카니즘 또는 고온 개시 반응 혼합물의 존재하에서 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 99.75%, 100% 또는 > 100% 이상 억제되는 폴리머라제 활성을 지칭한다.
본원에서 사용될 때의 "또는 그의 조합"이라는 용어는 상기 용어에 선행하는 열거된 용어들의 모든 순열 및 조합을 지칭한다. 예를 들어, "A, B, C 또는 이들의 조합"은 하기 중 1종 이상을 포함하고자 하는 것이다: A, B, C, AB, AC, BC 또는 ABC, 그리고 구체적인 문맥상 순서가 중요한 경우라면 또한 BA, CA, CB, ACB, CBA, BCA, BAC 또는 CAB. 이와 같은 예에 계속하여, 명시적으로 포함되는 것은 1개 이상 항목 또는 용어의 반복을 포함하는 조합, 예컨대 BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등이다. 숙련 기술자라면, 문맥상 다르게 드러나지 않는 한, 통상적으로 임의의 조합에서 항목 또는 용어의 수에 있어서 제한은 존재하지 않는다는 것을 알고 있을 것이다.
본원에서 사용될 때의 "변성시키는 것" 및 "변성"이라는 용어는 비제한적으로 1개 이상의 표적 핵산을 포함하는 게놈 DNA (gDNA) 단편, 이중-가닥 앰플리콘, 또는 1개 이상의 이중-가닥 분절을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 이중-가닥의 폴리뉴클레오티드가 2개의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드, 또는 해당될 경우 단일-가닥 또는 실질적으로 단일-가닥인 폴리뉴클레오티드로 전환되는 임의의 과정을 지칭한다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 변성시키는 것은 비제한적으로 이중-가닥 핵산이 단일-가닥 또는 실질적으로 단일-가닥이 되도록 함으로써 예를 들어 비제한적으로 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 2개의 개별 단일-가닥 구성요소, 또는 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중체를 방출하는 다양한 열적 및 화학적 기술들을 포함한다. 업계 관련자라면, 그것이 이후의 어닐링 또는 증폭 반응의 효소 단계, 또는 방법에 따라서는 형광 신호의 검출을 실질적으로 방해하지 않는 한, 일반적으로 사용되는 변성 기술이 제한되지는 않는다는 것을 알고 있을 것이다.
본원에서 사용될 때, "Tm"이라는 용어는 용융 온도와 관련하여 사용된다. 용융 온도는 이중-가닥 핵산 분자의 군집이 절반 단일 가닥으로 해리되는 온도이다.
본원에서 사용될 때의 "작은 홈 결합제(minor groove binder)"라는 용어는 때로는 서열 특이적인 방식으로 이중-가닥 DNA의 작은 홈에 정합되는 소형 분자를 지칭한다. 일반적으로, 작은 홈 결합제는 초승달-유형의 형상을 채택할 수 있으며 그에 따라 종종 물을 대체하면서 이중 나선의 작은 홈에 편안하게 정합되는 길고 편평한 분자이다. 작은 홈 결합 분자는 통상적으로 비틀림의 자유를 가지는 결합에 의해 연결되어 있는 수개의 방향족 고리, 예를 들어 비제한적으로 푸란, 벤젠 또는 피롤 고리를 포함한다.
본원에서 사용될 때의 "미스-프라이밍" 또는 "미스-프라이밍된"은 비-표적 핵산에의 프라이머 또는 프로브의 혼성화를 지칭한다. 업계에 알려져 있는 바와 같이, 프라이머 (무작위 프라이머 제외)는 일반적으로 표적 핵산에 측접하는 선택된 서열, 또는 앰플리콘의 프라이머 결합 부위에 혼성화되어, 그 부위에서 시작하는 DNA 합성 또는 프라이머 연장을 유도하도록 설계된다. 미스-프라이밍은 프라이머 또는 프로브가 때로는 낮거나 감소된 엄격도 조건에서 비-표적 핵산에 혼성화된 다음 그 비-표적 부위로부터의 프라이머 연장을 위한 개시점으로 작용함으로써 특정의 원치않는 부차적인 증폭 생성물의 합성을 야기하는 경우에 발생할 수 있다.
형광과 관련하여 사용될 때의 "비-특이적인" 또는 "배경"이라는 용어는 원하는 앰플리콘이 아닌 다른 이중-가닥 핵산과 결합되어 있는 핵산 결합 염료 분자로부터 방출되는 검출가능한 신호를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 원하는 앰플리콘은 특히 표준화 및/또는 정량 목적으로 본 교시의 특정 반응 조성물에 포함될 수 있는 내부 표준 또는 대조 서열을 포함한 표적 핵산의 증폭 생성물을 포함한다. 따라서, 종종 미스-프라이밍, 라이게이션-오류(mis-ligation) 및/또는 프라이머-이량체 형성의 결과인 의사의 부차적인 앰플리콘과의 핵산 염료 분자의 결합에 기인하는 형광 신호가 비-특이적인 형광의 한 가지 공급원이 된다.
본원에서 사용될 때의 "핵산 결합 염료"라는 용어는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드에 특이적이거나, 또는 적어도 단일 가닥 폴리뉴클레오티드와에서에 비해 이중-가닥 폴리뉴클레오티와 결합되는 경우에 실질적으로 더 큰 형광 증대를 나타내는 형광 분자를 지칭한다. 통상적으로, 핵산 결합 염료 분자는 이중-가닥 분절의 주홈 또는 작은 홈, 또는 모두에서의 결합 이외에, 이중-가닥 분절의 염기 쌍들 사이에 개재하는 것에 의해 폴리뉴클레오티드의 이중-가닥 분절과 결합한다. 핵산 결합 염료의 비-제한적인 예에는 에티듐 브로마이드, DAPI, 비제한적으로 회흐스트(Hoechst) 33258 및 회흐스트 33342를 포함한 회흐스트 유도체, 란탄족 킬레이트 (비제한적으로 예를 들어 2개의 형광 테트라덴테이트 β-디케톤-Eu3 + 킬레이트 (NDI-(BHHCT-EU3+)2)를 보유하는 나프탈렌 디이미드 유도체)를 포함하는 삽입제(intercalator) (예컨대 문헌 [Nojima et al ., Nucl. Acids Res. Suppl. No. 1105 (2001)] 참조), 그리고 SYBR® 그린(Green) 및 피코그린(PicoGreen)®과 같은 특정 비대칭 시아닌 염료가 포함된다.
본원에서 사용될 때, "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"이라는 용어는 호환가능하게 사용되며, 비제한적으로 뉴클레오티드간 포스포디에스테르 결합 연결에 의해 연결된 2'-데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 및 리보뉴클레오티드 (RNA), 또는 뉴클레오티드간 유사체들을 포함한 뉴클레오티드 단량체들, 그리고 관련 상대 이온, 예컨대 H+, NH4 +, 트리알킬암모늄, Mg2 +, Na+ 등의 단일-가닥 및 이중-가닥 중합체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 완전히 데옥시리보뉴클레오티드로, 완전히 리보뉴클레오티드로, 또는 이들의 키메라 혼합물로 구성될 수 있으며, 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 단량체 단위에는 비제한적으로 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함하여, 본원에서 기술되는 뉴클레오티드들 중 어떠한 것도 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 크기가 수개 단량체 단위로부터 (예컨대 그것이 종종 업계에서 올리고뉴클레오티드로 지칭되는 경우, 5-40개) 수천개 단량체 뉴클레오티드 단위까지의 범위이다. 다르게 나타내지 않는 한 폴리뉴클레오티드 서열이 제시되는 모든 경우에서, 뉴클레오티드는 좌측에서 우측으로 5"-내지-3' 순서이며, 다르게 주지되지 않는 한 "A"는 데옥시아데노신을 나타내고, "C"는 데옥시시토신을 나타내며, "G"는 데옥시구아노신을 나타내고, "T"는 데옥시티미딘을 나타내며, "U"는 데옥시우리딘을 나타낸다는 것은 이해될 것이다.
"뉴클레오티드"라는 용어는 뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르, 예컨대 트리포스페이트 에스테르를 지칭하는데, 여기서 가장 일반적인 에스테르화 부위는 5탄당의 C-5 위치에 결합되어 있는 히드록실 기이다.
"뉴클레오시드"라는 용어는 2'-데옥시 및 2'-히드록실 형태를 포함하여, 5탄당의 1' 위치에 연결된 퓨린, 데아자퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오시드 염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민, 데아자아데닐, 데아자구아노신 등으로 구성되는 화합물을 지칭한다. 뉴클레오시드 염기가 퓨린 또는 7-데아자퓨린인 경우, 5탄당은 퓨린 또는 데아자퓨린의 9-위치에서 뉴클레오염기에 결합되며, 뉴클레오염기가 피리미딘인 경우, 5탄당은 피리미딘의 1-위치에서 뉴클레오염기에 결합된다.
"유사체"라는 용어에는 변형된 염기 모이어티, 변형된 당 모이어티 및/또는 변형된 포스페이트 에스테르 모이어티를 가지는 합성 유사체가 포함된다. 포스페이트 유사체에는 일반적으로 인 원자가 +5 산화 상태에 있으며 1개 이상의 산소 원자가 비-산소 모이어티, 예컨대 황으로 대체되어 있는 포스페이트의 유사체가 포함된다. 대표적인 포스페이트 유사체에는 하기가 포함된다: 관련 상대이온, 예컨대 H+, NH4 +, Na+를 포함하는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트, 보로노포스페이트. 대표적인 염기 유사체에는 하기가 포함된다: 2,6-디아미노퓨린, 히포크산틴, 슈도우리딘, C-5-프로핀, 이소시토신, 이소구아닌, 2-티오피리미딘. 대표적인 당 유사체에는 하기가 포함된다: 2'- 또는 3'-위치가 수소, 히드록시, 알콕시 예컨대 메톡시, 에톡시, 알릴옥시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시 및 페녹시, 아지도, 아미노 또는 알킬아미노, 플루오로, 클로로 및 브로모인 2'- 또는 3'-변형.
본원에서 사용될 때, "반응 용기"라는 용어는 일반적으로 본 교시에 따라 반응이 이루어질 수 있는 임의의 용기, 챔버, 장치 또는 조립체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 반응 용기는 미세튜브, 예를 들어 비제한적으로 0.2 mL 또는 0.5 mL 반응 튜브 예컨대 마이크로앰프(MicroAmp)® 옵티칼(Optical) 튜브 (라이프 테크놀로지스 코포레이션, 캘리포니아 칼스배드 소재) 또는 미세-원심분리 튜브, 또는 분자 생물학 실험실에서 흔하게 사용되는 종류의 기타 용기들일 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응 용기에는 비제한적으로 택맨(TaqMan)® 저밀도 어레이(Low Density Array) 또는 택맨® 오픈 어레이(Open Array) 실시간 PCR 플레이트 (모두 라이프 테크놀로지스 코포레이션)를 포함한 다중-웰 플레이트의 웰, 유리 슬라이드 상의 스폿(spot), 또는 미세유체공학 장치의 채널 또는 챔버가 포함된다. 제한으로서가 아닌 예를 들자면, 다수의 반응 용기가 하나의 지지체 상에 구비될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 예를 들어 이온(Ion) 316™ 및 이온 318™ 칩을 포함하여, 캘리퍼, 플루이다임 앤드 라이프 테크놀로지스 코포레이션(Caliper, Fluidigm and Life Technologies Corp.)에서 구입가능한 칩-상-실험형 장치들이 개시되는 방법에서 반응 용기로 사용될 수도 있다. 다양한 반응 용기들이 시중에서 구입가능하거나, 또는 본 교시 맥락에서의 사용을 위해 설계될 수 있다는 것은 알고 있을 것이다.
본원에서 사용될 때, "고온 개시"라는 용어는 일반적으로 반응 혼합물이 제1 온도 (통상적으로 더 낮은 온도)에서 유지될 때, 필수 성분이 반응에 참여하는 것을 허용하는 제2 온도 (통상적으로 더 높은 온도)에 도달할 때까지 필수적인 반응 성분 (예컨대 폴리머라제)의 가용성을 제한하는 수단을 지칭한다. 고온 개시 반응은 통상적으로 제1 (예컨대 더 낮은) 온도에서의 인큐베이션, 및 원하는 반응이 일어나는 것을 가능케 하는 제2 (예컨대 더 높은) 온도로의 이후의 상승을 포함한다. 고온 개시 반응의 활성화는 바람직하게는 프라이머 결합 특이성을 보장하기 위하여 증폭 반응에서 사용되는 프라이머 혼성화 (어닐링) 온도와 동일하거나 그보다 더 높은 온도에서의 인큐베이션에 의해 달성된다. 효소 활성을 회복하는 데에 요구되는 인큐베이션의 길이는 반응 혼합물의 온도 및 pH, 그리고 효소의 안정성에 따라 달라진다. 광범위한 인큐베이션 조건이 사용가능한데; 최적의 조건은 각 반응별로 경험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 핵산 합성 (예컨대 폴리머라제 활성)을 억제하는 제1 온도에서 인큐베이션된 다음, 억제가 완화 또는 중지되는 제2 온도로 상승된다. 예시된 바 없는 핵산 폴리머라제 또는 예시된 바 없는 반응 혼합물의 재활성화를 위한 인큐베이션 조건의 최적화는 본원에서 제공되는 안내에 따른 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 상기 제1 온도는 상기 제2 온도에 비해 더 낮다. 일부 실시양태에서, 상기 제1 온도는 < 40℃이다. 특정 실시양태에서, 제1 온도는 대략 약 40℃, 35℃, 30℃, 25℃, 20℃, 15℃, 10℃, 5℃ 또는 그 미만이다. 일부 실시양태에서, 제1 온도는 주변 온도이다. 일부 다른 실시양태에서, 제1 온도는 실온이다. 일부 실시양태에서, 상기 제2 온도는 > 40℃이다. 특정 실시양태에서, 상기 제1 온도는 대략 약 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃, 100℃ 또는 그 초과이다. 비제한적으로 수동 기술, 장벽, 필수 반응 성분들 중 1종 이상의 화학적 변형 및/또는 구조적 변형의 사용을 포함하여, 고온 개시 반응을 수행하기 위한 몇 가지 방법들이 존재한다. 그와 같은 고온 개시 방법에 적합한 반응 조건들에 대해서는 업계에 알려져 있으며, 본원의 실시예에 추가로 기술되어 있다.
본원에서 사용될 때, "이중 고온 개시 반응 혼합물"이라는 용어는 증폭 반응 (예컨대 PCR)의 최초 변성 온도인 고온 개시 조건이 달성될 때까지 저온 (예컨대 주변 온도)에서의 핵산 폴리머라제 연장을 차단하는 데에 사용되는 시약 또는 시약 용액들의 조합을 지칭한다. 상승된 증폭 온도에서는, 핵산 폴리머라제가 더 이상 억제되지 않음으로써, 프라이머 연장을 가능케 한다. 본원에서 사용될 때, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 2종 이상의 상이한 고온 개시 메카니즘을 포함하는 반응 혼합물을 포함하여 의미한다. 따라서, "이중 고온 개시 반응 혼합물"은 2종을 초과하는 고온 개시 메카니즘 (예컨대 "삼중 고온 개시 반응 혼합물", "사중 고온 개시 반응 혼합물", "오중 고온 개시 반응 혼합물" 등)을 포함할 수 있다. 가능한 고온 개시 메카니즘에는 더 낮은 온도에서는 핵산 폴리머라제 활성을 차단하며 승온에서는 폴리머라제로부터 해리되는 항체 또는 항체 조합 (예컨대 문헌 [Eastlund et al ., LifeSci. Quarterly 2:2 (2001)], [Mizuguchi et al ., J. Biochem. (Tokyo) 126:762 (1999)] 참조); 더 낮은 온도에서는 핵산 폴리머라제 활성을 차단하며 승온에서는 폴리머라제로부터 해리되는 올리고뉴클레오티드 (예컨대 문헌 [Dang et al ., J. Mol. Biol. 264:268 (1996)] 참조); 핵산 폴리머라제 활성이 더 낮은 온도에서는 차단되고 승온에서는 변형이 역전 또는 해리되도록 하는 핵산 폴리머라제의 가역적인 화학적 변형 (예컨대 U.S. 특허 제5,773,258호 및 문헌 [Moretti et al ., Biotechniques 25:716 (1998)] 참조); 더 낮은 온도에서 감소된 활성을 제공하는 핵산 폴리머라제의 아미노산 돌연변이 (예컨대 문헌 [Kermekchiev et al ., Nucl. Acids Res. 31:6139 (2003)] 참조); 초안정성 DNA 결합 도메인 및 토포이소머라제를 포함하는 핵산 폴리머라제 융합 단백질 (예컨대 문헌 [Pavlov et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:13510 (2002)] 참조); 온도-의존성인 방식으로 핵산 폴리머라제를 억제하는 리간드 (예를 들어 에펜도르프(Eppendorf) (뉴욕 하우파우지 소재)의 핫마스터(HotMaster)™ Taq DNA 폴리머라제 및 5 프라임(PRIME) (매릴랜드 가이터스부르그 소재)); 더 낮은 온도에서 프라이머를 봉쇄하는 단일-가닥 결합 단백질 (예컨대 U.S. 특허 출원 공개 제2008/0138878호 참조); 승온에서는 무기 피로포스페이트를 가수분해하는 열안정성 피로포스파타제 (예컨대 U.S. 특허 출원 공개 제2006/0057617호 참조); 폴리머라제 차단 단백질과 같은 열불안정성 차단제 (예컨대 U.S. 특허 출원 공개 제2007/0009922호 참조); 프라이머 경쟁자 서열 (예컨대 문헌 [Puskas et al ., Genome Res. 5:309 (1995)] 및 [Vestheim et al ., Front. Zool. 5:12 (2008)] 참조); 변형된 프라이머 구성체 (예컨대 문헌 [Ailenberg et al ., Biotechniques 29:22 (2000)] 및 [Kaboev et al ., Nucl. Acids Res. 28:E94 (2000)] 참조); 혼성화 선택성을 향상시키는 변형된 프라이머 (예컨대 U.S. 특허 제6,794,142호 및 6,001,611호 참조); 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 제거가능한 3' 변형을 가지는 프라이머 (예컨대 U.S. 특허 출원 공개 제2003/0119150호 및 U.S. 특허 제6,482,590호 참조); UV 조사에 의해 제거가능한 변형된 뉴클레오염기를 가지는 프라이머 (예컨대 문헌 [Young et al ., Chem. Commun. (Camb) 28:462 (2008)] 참조); 열적 탈보호에 의해 제거가능한 프라이머 변형 (예컨대 U.S. 특허 출원 공개 제2003/0162199호 및 문헌 [Lebedev et al ., Nucl. Acids Res. 36:e131 (2008)] 참조); 또는 열불안정성 변형 기를 가지는 dNTP의 변형 (예컨대 U.S. 특허 출원 공개 제2003/0162199호 및 문헌 [Koukhareva et al ., Nucl. Acids Symp. Ser. (Oxford), 259 (2008)] 참조)이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 인용되는 모든 참고문헌은 모든 목적에 있어서 그 전문이 참조로 포함된다.
본원에서 사용될 때, "2종 이상의 상이한 메카니즘"을 포함하는 이중 고온 개시 반응 혼합물은 유사하게 기능하거나 유사한 성분들을 사용하는 2종 이상의 상이한 고온 개시 메카니즘을 포함할 수 있는 반응 혼합물들을 포괄한다. 예를 들어, 이중 고온 개시 반응 혼합물은 2종의 상이한 항체-기반 고온 개시 메카니즘, 또는 2종의 상이한 올리고뉴클레오티드-기반 고온 개시 메카니즘, 또는 1종의 항체-기반 및 1종의 올리고뉴클레오티드-기반 고온 개시 메카니즘, 또는 1종의 항체-기반 및 1종의 화학적 변형-기반 고온 개시 메카니즘, 또는 임의의 그와 같은 가용한 조합을 위하여 설계된 시약 또는 시약 용액을 포함할 수 있다.
"리포터 기"라는 용어는 본원에서 넓은 의미로 사용되며, 임의의 확인가능한 태그, 라벨 또는 모이어티를 지칭한다.
"표적 핵산" 또는 "표적"이라는 용어는 (통상적으로 미스-프라이밍으로 인한 의사 부반응의 결과인 부차적 증폭 생성물과 달리) 본 교시의 조성물, 방법 및 키트를 사용하여 특이적으로 증폭 및/또는 검출되는 핵산 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 표적 핵산은 프라이머 연장 반응에서 주형으로 작용한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 증폭 주형으로 작용한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 핵산 절단 구조의 주형 가닥으로 작용한다. 특정 실시양태에서, 표적 핵산은 DNA를 포함하며, 게놈 DNA (gDNA) 또는 미토콘드리아 DNA (mtDNA)에 존재한다. 특정 실시양태에서, 표적 핵산에는 RNA, 예를 들어 비제한적으로 리보솜 RNA (rRNA), 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 또는 비제한적으로 pri-miRNA, pre-miRNA, 또는 pri-miRNA와 pre-miRNA를 포함한 마이크로 RNA (miRNA) 전구체와 같은 RNA 분자가 포함된다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산에는 비제한적으로 miRNA, sRNA, stRNA, snoRNA 또는 기타 ncRNA를 포함한 소형 RNA 분자가 포함된다. 표적 핵산이 핵산 분자의 전체를 구성할 필요는 없다. 제한으로서가 아닌 예를 들자면, 대형 핵산, 예를 들어 gDNA 단편은 다수의 상이한 표적 핵산들을 포함할 수 있다. 통상적으로, 표적 핵산은 1개 이상의 한정된 말단을 가진다. 많은 핵산 증폭 반응에서, 핵산 표적은 2개의 한정된 말단을 가진다.
효소와 관련하여 사용될 때의 "열안정성"이라는 용어는 열에 의한 불활성화에 내성인 효소 (예컨대 핵산 폴리머라제 활성을 가지는 폴리펩티드)를 지칭한다. "열안정성" 효소는 열 처리에 의해 불활성화될 수 있는 "열불안정성" 폴리머라제와 반대된다. 열불안정성인 단백질은 생리학적 온도에서 불활성화될 수 있으며, 중간열안정성 (약 45℃ 내지 약 65℃에서 불활성화) 및 열안정성 (약 65℃ 초과에서 불활성화)로 범주화될 수 있다. 예를 들어, 열불안정성 T5 및 T7 DNA 폴리머라제의 활성은 약 30초 동안 약 90℃의 온도에 효소를 노출시키는 것에 의해 완전히 불활성화될 수 있다. 열안정성 폴리머라제 활성은 열불안정성 폴리머라제에 비해 열 불활성화에 대하여 더 내성이다. 그러나, 열안정성 폴리머라제가 열 불활성화에 대하여 완전히 내성인 효소를 지칭하여 의미하는 것은 아니며; 예컨대 열 처리는 어느 정도까지 폴리머라제 활성을 감소시킬 수 있다. 열안정성 폴리머라제는 또한 통상적으로 열불안정성 DNA 폴리머라제에 비해 더 높은 최적 온도를 가지게 된다.
작용 농도(working concentration)는 특정 기능 (예컨대 핵산 분자의 증폭 또는 분해)을 수행하기 위하여 용액에 사용되는 최적 농도, 또는 그 부근인 시약의 농도를 지칭한다. 시약의 작용 농도는 시약의 "1× 농도" 또는 "1× 용액" (시약이 용액 중에 존재하는 경우)과 같이, 당량으로 기술되기도 한다. 따라서, 더 높은 시약 농도 역시 작용 농도를 기준으로 기술될 수 있는데; 예를 들어 시약의 "2× 농도" 또는 "2× 용액"은 시약의 작용 농도보다 2배만큼 더 높은 농도 또는 용액으로 정의되며; "5× 농도" 또는 "5× 용액"은 작용 농도보다 5배만큼 더 높은 등이다.
본원에서 사용될 때, "핵산 폴리머라제"는 뉴클레오티드의 중합을 촉매하는 효소를 지칭한다. 일반적으로, 상기 효소는 핵산 주형 서열에 어닐링된 프라이머의 3'-말단에서 합성을 개시하게 되며, 주형 가닥의 5' 말단을 향하여 진행하게 된다. 본원에서 사용될 때의 "DNA 폴리머라제"는 일반적으로 주형-의존성 방식의 데옥시뉴클레오티드, 디데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 특정 뉴클레오티드 유사체들의 첨가 촉매 중합에 의해 혼성화된 프라이머의 5'-내지-3' 연장을 촉매할 수 있는 임의의 폴리펩티드를 지칭한다. 비제한적으로 예를 들자면, 프라이머 연장 반응 동안의 핵산 주형에 어닐링되어 있는 프라이머의 3'-말단에의 데옥시리보뉴클레오티드의 순차적인 첨가이다. DNA 폴리머라제의 비-제한적인 예에는 비제한적으로 리버스 트랜스크립타제를 포함한 RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 그리고 DNA-의존성 DNA 폴리머라제가 포함된다. 알려져 있는 DNA 폴리머라제에는 예를 들어 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) (Pfu) DNA 폴리머라제 (문헌 [Lundberg et al., 1991, Gene, 108:1]), 이. 콜라이(E. coli) DNA 폴리머라제 I (문헌 [Lecomte and Doubleday, 1983, Nucleic Acids Res. 11:7505]), T7 DNA 폴리머라제 (문헌 [Nordstrom et al., 1981, J. Biol. Chem. 256:3112]), 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus) (Tth) DNA 폴리머라제 (문헌 [Myers and Gelfand 1991, Biochemistry 30:7661]), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus) DNA 폴리머라제 (문헌 [Stenesh and McGowan, 1977, Biochim Biophys Acta 475:32]), 써모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) (Tli) DNA 폴리머라제 (벤트 DNA 폴리머라제로도 지칭됨, 문헌 [Cariello et al., 1991, Nucleic Acids Res, 19:4193]), 9°Nm DNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)의 단종 제품), 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) (Tma) DNA 폴리머라제 (문헌 [Diaz and Sabino, 1998 Braz J. Med. Res, 31:1239]), 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) (Taq) DNA 폴리머라제 (문헌 [Chien et al., 1976, J. Bacteoriol, 127:1550]), 피로코쿠스 코다카라엔시스(Pyrococcus kodakaraensis) KOD DNA 폴리머라제 (문헌 [Takagi et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:4504]), JDF-3 DNA 폴리머라제 (특허 출원 WO 0132887호) 및 피로코쿠스(Pyrococcus) GB-D (PGB-D) DNA 폴리머라제 (문헌 [Juncosa-Ginesta et al., 1994, Biotechniques, 16:820])가 포함된다. 상기 효소들 중 어느 것의 폴리머라제 활성은 업계에 잘 알려져 있는 수단에 의해 측정될 수 있다. 본 발명에 있어서, DNA 폴리머라제 활성의 한 가지 단위는 최적 온도 (예컨대 Pfu DNA 폴리머라제의 경우 72℃)에서 30분 이내에 중합체 형태로의 10 nmole의 총 dNTP의 도입을 촉매하는 효소의 양으로 정의된다. 어떤 DNA 폴리머라제 (예를 들어 비제한적으로 특정 유박테리아 유형 A DNA 폴리머라제 및 Taq DNA 폴리머라제)는 추가로 구조-특이적인 뉴클레아제 활성을 포함할 수 있다는 것을 알아야 한다. 본 발명의 실시에 적합한 리버스 트랜스크립타제 효소 역시 업계에 잘 알려져 있으며, 수많은 공급처로부터 유래할 수 있다. 그와 같은 효소에는 M-MLV, HIV, ASLV 및 이들의 변이 및 돌연변이가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용될 때, "증폭", "핵산 증폭" 또는 "증폭시키는 것"이라는 용어는 핵산 주형의 다수 카피의 생성, 또는 핵산 주형에 대하여 상보성인 다수의 핵산 서열 카피의 생성을 지칭한다. 상기 용어들 ("중합하는 것"이라는 용어 포함)은 (예컨대 중합체 의해) 핵산 주형을 연장하는 것을 지칭할 수도 있다. 증폭 반응은 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)과 같은 폴리머라제-매개 연장 반응일 수 있다. 그러나, 알려져 있는 증폭 반응들 중 어떠한 것도 본원에서 기술되는 바와 같은 사용에 적합할 수 있다. 본원에서, 통상적으로는 표적 핵산의 "지수적" 증가를 지칭하는 "증폭시키는 것"이라는 용어는 선택된 표적 핵산 서열 수의 선형 및 지수적 증가 모두를 기술하는 데에 사용될 수 있다.
"증폭 반응 혼합물" 및/또는 "마스터 혼합물(master mix)"라는 용어는 표적 핵산을 증폭시키는 데에 사용되는 다양한 (일부 또는 전체) 시약들을 포함하는 수용액을 지칭할 수 있다. 해당 반응들은 고체 지지체 (예컨대 어레이)를 사용하여 수행될 수도 있다. 반응들은 사용자가 원하는 대로 단일 또는 다중 포맷으로 수행될 수도 있다. 이러한 반응은 통상적으로 효소, 수성 완충제, 염, 증폭 프라이머, 표적 핵산 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함한다. 상황에 따라, 혼합물은 완전하거나 불완전한 증폭 반응 혼합물 중 어느 하나일 수 있다. 표적 핵산을 증폭시키는 데에 사용되는 방법은 업계 숙련자에게 가용한 모든 것일 수 있다. 표적 핵산 서열의 카피를 증가시키기 위한 어떠한 시험관내 수단도 이용될 수 있다. 여기에는 선형, 대수 및/또는 어떠한 다른 증폭 방법도 포함된다. 본 개시내용이 핵산 증폭 반응으로서 일반적으로 PCR을 논의할 수 있기는 하지만, 본원에서 기술되는 변형된 디터전트(detergent)들은 폴리머라제-매개 증폭 반응 (예컨대 헬리카제-의존성 증폭 (HDA), 리콤비나제-폴리머라제 증폭 (RPA) 및 회전환 증폭(rolling circle amplification) (RCA))은 물론, 리가제-매개 증폭 반응 (예컨대 리가제 검출 반응 (LDR), 리가제 연쇄 반응 (LCR) 및 각각의 갭(gap)-버젼) 양자, 및 LDR 및 PCR과 같은 핵산 증폭 반응들의 조합을 포함한 다른 유형의 핵산 증폭 반응들에도 효과적인 것이 틀림없을 것으로 예상된다 (예를 들어 U.S. 특허 6,797,470호 참조). 예를 들어, 변형된 디터전트는 예컨대 PCR 프라이머와는 대조적으로 라이게이션 프로브가 사용되는 다양한 라이게이션-매개 반응에 사용될 수 있다. 추가적인 대표적 방법에는 특히 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR; 예컨대 U.S. 특허 제4,683,202호; 4,683,195호; 4,965,188호; 및/또는 5,035,996호 참조), 등온 절차 (1종 이상의 RNA 폴리머라제 (예컨대 PCT 공개 제WO 2006/081222호 참조), 가닥 대체 (예컨대 U.S. 특허 제RE39007E호 참조), 프라이머 분자의 부분적 파괴 (예컨대 PCT 공개 제WO 2006/087574호 참조) 사용), 리가제 연쇄 반응 (LCR) (예컨대 문헌 [Wu, et al., Genomics 4:560-569 (1990)] 및/또는 [Barany, et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193 (1991)] 참조), Qβ RNA 레플리카제 시스템 (예컨대 PCT 공개 제WO 1994/016108호 참조), RNA 전사-기반 시스템 (예컨대 TAS, 3SR), 회전환 증폭 (RCA) (예컨대 U.S. 특허 제5,854,033호; U.S. 특허 출원 공개 제2004/265897호; 문헌 [Lizardi et al ., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)]; 및/또는 [Baner et al ., Nucleic Acid Res., 26:5073-5078 (1998)] 참조) 및 가닥 대체 증폭 (SDA) (문헌 [Little, et al ., Clin. Chem. 45:777-784 (1999)])이 포함된다. 숙련 기술자에게 가용한 다른 많은 시스템들과 함께, 이들 시스템은 본원에서 기술되는 바와 같이 사용하기 위하여 표적 핵산을 중합 및/또는 증폭시키는 데에 사용하기에 적합할 수 있다.
"증폭 효율"은 카피 수를 측정하기 위하여 정량될 수 있는 임의의 생성물을 지칭할 수 있다 (예컨대 상기 용어는 PCR 앰플리콘, LCR 라이게이션 생성물 및/또는 유사 생성물을 지칭할 수 있음). 증폭 및/또는 중합 효율은 비제한적으로 보정 희석 곡선의 측정 및 기울기 계산, 문헌 [Hellemans et al ., Genome Biology 8:R19 (2007)]에 기술되어 있는 바와 같은 큐베이스(qBase) 소프트웨어를 사용한 측정, 문헌 [Livak and Schmittgen, Methods 25:402 (2001)]에 기술되어 있는 바와 같은 델타 델타 Cq (ΔΔCq) 계산을 사용한 측정, 또는 문헌 [Pfaffl, Nucl. Acids Res. 29:e45 (2001)]에 기술되어 있는 바와 같은 방법을 포함하여, 업계에 알려져 있는 다양한 방법들에 의해 측정될 수 있는 바, 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일반적으로, PCR 열 순환은 고온에서의 개시 변성 단계후 이어지는 주형 변성, 프라이머 어닐링, 및 폴리머라제에 의한 어닐링된 프라이머의 연장을 가능케 하도록 설계된 반복적인 일련의 온도 주기들을 포함한다. 일반적으로, 샘플은 처음에 약 2 내지 10분 동안 이중 가닥 DNA 샘플을 변성시키기 위하여 약 95℃의 온도로 가열된다. 이후, 각 주기의 개시시에, 샘플은 사용되는 샘플 및 기기 유형에 따라 약 10 내지 60초 동안 변성된다. 변성 후, 약 40℃ 내지 약 60℃의 더 낮은 온도에서 약 20 내지 60초 동안 프라이머가 표적 DNA에 어닐링된다. 폴리머라제에 의한 프라이머의 연장은 종종 약 60℃ 내지 약 72℃ 범위의 온도에서 수행된다. 연장에 사용되는 시간의 양은 증폭에 사용되는 앰플리콘의 크기 및 효소의 유형에 따라 달라지게 되는데, 일상적인 실험에 의해 용이하게 결정된다. 또한, 어닐링 단계가 연장 단계와 조합됨으로써, 2단계 순환을 초래할 수 있다. 열 순환은 PCR 검정에서의 추가적인 온도 이동을 포함할 수도 있다. 검정에 사용되는 주기 수는 사용되는 프라이머, 존재하는 샘플 DNA의 양 및 열 순환 조건을 포함한 많은 인자들에 따라 달라진다. 임의의 검정에서 사용될 주기 수는 일상적인 실험을 사용하여 업계 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 임의로, 모든 증폭 생성물의 합성을 보장하기 위하여, 열 순환의 완료 후 최종 연장 단계가 첨가될 수 있다.
개시되는 조성물을 사용한 PCR은 "표준" PCR 기기, 예컨대 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)의 7900HT, 7500 및 7300 표준 PCR 시스템에서, 또는 "속성(fast)" PCR 기기, 예컨대 어플라이드 바이오시스템즈의 스텝원(StepOne)™, 스텝원 플러스(Plus)™, 7500 및 7900HT 속성 실시간 PCR 시스템, 또는 ViiA™ 7 또는 퀀트스튜디오(QuantStudio)™ 12K 플렉스(Flex) 실시간 PCR 시스템에서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물 및 방법을 사용한 PCR 증폭을 위한 대표적인 열 순환 조건은 하기와 같다:
UNG 단계 (임의): 2분 동안 50℃,
활성화: 2분 동안 95℃,
변성: 15초 동안 95-97℃,
어닐링/연장: 1분 동안 60-62℃ (× 40 주기까지).
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물 및 방법을 사용한 PCR 증폭을 위한 대표적인 열 순환 조건은 하기와 같다:
UNG 단계 (임의): 2분 동안 50℃,
활성화: 2분 동안 95℃,
변성: 15초 동안 95-97℃,
어닐링: 15초 동안 55-60℃,
연장: 1분 동안 72℃ (× 40 주기까지).
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 속성 PCR 열 순환에 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물 및 방법을 사용한 PCR 증폭을 위한 속성 열 순환 조건은 하기와 같다:
UNG 단계 (임의): 2분 동안 50℃,
활성화: 2분 동안 95℃,
변성: 1-3초 동안 95-97℃,
연장: 20-30초 동안 60-62℃ (× 40 주기까지).
일부 실시양태에서, 속성 PCR 열 순환이 수행되는 경우에는, 약 400 nM의 프라이머 농도가 권장된다.
특정 실시양태에서, 증폭 기술은 예를 들어 비제한적으로 하기 단계들의 1회 이상 증폭 주기를 포함한다: 이중-가닥 핵산을 별도의 구성요소 가닥들로 변성시키는 단계; 표적 측접 서열 또는 앰플리콘의 프라이머-결합 부위 (또는 해당될 경우, 어느 하나의 상보체)에 프라이머를 혼성화시키는 단계; 및 DNA 폴리머라제를 사용하여 주형-의존성 방식으로 뉴클레오티드 가닥을 합성하는 단계. 상기 주기는 반복될 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 증폭 주기는 다수의 증폭 주기, 예를 들어 비제한적으로 20 주기, 25 주기, 30 주기, 35 주기, 40 주기, 45 주기, 또는 45 주기 초과의 증폭을 포함한다.
일부 실시양태에서, 증폭시키는 것은 비제한적으로 진앰프(GeneAmp)® PCR 시스템 9700, 9600, 2700 또는 2400 써모사이클러(thermocycler), 퀀트스튜디오™ 12K 플렉스 실시간 PCR 시스템, 어플라이드 바이오시스템즈® ViiA™ 7 실시간 PCR 시스템, 어플라이드 바이오시스템즈® 7500 속성 실시간 PCR 시스템, 7900HT 속성 실시간 PCR 시스템 등 (모두 캘리포니아 칼스배드 소재 라이프 테크놀로지스 코포레이션으로부터 구입가능함)과 같은 기기를 사용한 열 순환을 포함한다. 특정 실시양태에서는, 증폭 반응, 예를 들어 비제한적으로 비대칭 PCR 또는 A-PCR에서 단일-가닥 앰플리콘이 생성된다.
특정 파장의 광선을 방출하는 것, 이중-가닥 핵산과 결합되어 있는 핵산 결합 염료 분자로부터 방출되는 형광 신호의 강도를 해독하는 것, 및 각 주기 후 형광의 강도를 디스플레이하는 것에 의해, 핵산 결합 염료를 함유하는 반응 조성물을 검출하면서 열 순환 반응을 수행할 수 있는 장치들이 개발되어 있다. 써멀 사이클러(thermal cycler), 광선 방출장치 및 형광 신호 검출기를 포함하는 장치가 예컨대 U.S. 특허 제5,928,907호; 6.015,674호; 및 6,174,670호에 기술되어 있는데, 비제한적으로 ABI 프리즘(Prism)® 7700 서열 검출 시스템, 진앰프® PCR 시스템 9700, 9600, 2700 또는 2400 써모사이클러, 어플라이드 바이오시스템즈® ViiA™ 7 실시간 PCR 시스템, 어플라이드 바이오시스템즈® 7500 속성 실시간 PCR 시스템, 7900HT 속성 실시간 PCR 시스템 등 (모두 캘리포니아 칼스배드 소재 라이프 테크놀로지스 코포레이션에서 구입가능함)이 포함된다.
일부 실시양태에서, 증폭은 비제한적으로 제한된 수의 증폭 주기가 이루어지는 예비-증폭 단계 (예를 들어 비제한적으로 2, 3, 4 또는 5회의 증폭 주기)를 포함하며, 다음에 생성 앰플리콘이 일반적으로 희석된 후 희석된 앰플리콘 중 일부가 이어지는 증폭 단계에서 추가적인 증폭 주기에 적용되는 2-단계 반응을 포함한다 (예컨대 U.S. 특허 제6,605,451호 및 U.S. 특허 출원 공개 제2004/0175733호 참조). 일부 실시양태에서는, 예비-증폭 단계, 이후의 증폭 단계, 또는 모두가 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 증폭 반응은 다수의 상이한 프라이머 세트를 사용하여 다수의 상이한 표적 핵산들 및/또는 다수의 상이한 증폭 생성물 종들이 동시에 증폭되는 다중 증폭을 포함한다. 특정 실시양태에서는, 다수의 단중(single-plex) 또는 저중성(lower-plexy) 반응 (예를 들어 비제한적으로 이중, 삼중, 사중, 오중 또는 육중 반응)을 포함하여, 다중 증폭 반응 및 단중 증폭 반응이 병행하여 수행된다.
대표적인 핵산의 중합 및/또는 증폭 방법에는 예를 들어 폴리머라제-매개 연장 반응이 포함된다. 예를 들어, 폴리머라제-매개 연장 반응은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)일 수 있다. 다른 실시양태에서, 핵산 증폭 반응은 다중 반응이다. 예를 들어, 본원에서 기술되는 바와 같이 사용하기에 적합한 대표적인 핵산의 중합 및/또는 증폭 및 검출 방법은 택맨®으로서 시중에서 구입가능하다 (예컨대 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 제4,889,818호; 5,079,352호; 5,210,015호; 5,436,134호; 5,487,972호; 5,658,751호; 5,210,015호; 5,487,972호; 5,538,848호; 5,618,711호; 5,677,152호; 5,723,591호; 5,773,258호; 5,789,224호; 5,801,155호; 5,804,375호; 5,876,930호; 5,994,056호; 6,030,787호; 6,084,102호; 6,127,155호; 6,171,785호; 6,214,979호; 6,258,569호; 6,814,934호; 6,821,727호; 7,141,377호; 및/또는 7,445,900호 참조). 택맨® 검정은 통상적으로 5'-내지-3' 뉴클레아제 활성을 가지는 핵산 폴리머라제, 해당 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 프라이머, 및 상기 프라이머에 비례하여 해당 표적 폴리뉴클레오티드 3'에 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 상에서 핵산 증폭을 수행하는 것에 의해 수행된다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 통상적으로 검출가능한 표지 (예컨대 형광 리포터 분자), 및 상기 리포터 분자의 형광을 켄칭할 수 있는 켄처(quencher) 분자를 포함한다. 통상적으로, 상기 검출가능한 표지 및 켄처 분자는 단일 프로브의 일부이다. 증폭이 진행되면서, 폴리머라제는 프로브를 분해하여 켄처 분자로부터 검출가능한 표지를 분리한다. 검출가능한 표지 (예컨대 형광)는 반응 동안 모니터링되는데, 여기서 표지의 검출은 핵산 증폭의 발생에 해당한다 (예컨대 신호가 더 높을수록 증폭량은 더 큼). 택맨® 검정의 변이들 (예컨대 LNA™ 스파이킹(spiked) 택맨® 검정)이 업계에 알려져 있는데, 본원에서 기술되는 방법에 사용하기에 적합할 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같이 사용하기에 적합한 또 다른 대표적인 시스템은 대체 혼성화 방법에서 이중-가닥 프로브를 이용한다 (예컨대 문헌 [Morrison et al ., Anal. Biochem., 18:231-244 (1989)]; 및/또는 [Li, et al ., Nucleic Acids Res.. 30(2,e5) (2002)] 참조). 그와 같은 방법에서, 프로브는 통상적으로 1개는 검출가능한 표지를 포함하며 다른 하나는 켄처 분자를 포함하는, 상이한 길이를 가지는 2개의 상보성 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 표적 핵산에 결합되어 있지 않은 경우에는, 켄처가 검출가능 표지로부터의 신호를 억제한다. 표적 핵산을 사용한 대체 혼성화시, 프로브는 검출가능하게 된다. 단일 반응에서 다수의 표적 핵산이 조회될 수 있도록 각각 상이한 검출가능 표지들을 포함하는 다수의 프로브가 사용될 수도 있다.
본원에서 기술되는 바와 같이 사용하기에 적합한 표적 핵산의 추가적인 대표적 중합 및/또는 증폭 및 검출 방법은 단일-가닥의 헤어핀 형상 올리고뉴클레오티드 프로브인 "분자 비콘(molecular beacon)"을 포함한다. 표적 서열의 존재하에서, 프로브는 접힘해제되어 결합된 후 신호 (예컨대 형광)를 방출한다. 분자 비콘은 통상적으로 하기 4종 이상의 구성요소를 포함한다: 1) 표적 서열에 상보성인 18-30개 뉴클레오티드 영역인 "루프"; 2) 루프의 양 말단에서 발견되며 서로 상보성인 2개의 5-7개 뉴클레오티드 "스템(stem)"; 3) 5' 말단의 검출가능한 표지; 및 4) 프로브가 폐쇄된 루프 형상으로 존재할 경우 (예컨대 표적 핵산에 결합되어 있지 않음) 검출가능 표지가 신호를 방출하는 것을 방지하는 3' 말단의 켄처 모이어티. 예컨대, 상보성인 표적의 존재하에서는, 비콘의 "스템" 부분이 분리되면서 프로브가 표적에 혼성화되는 결과를 가져온다. 다른 유형의 분자 비콘들도 알려져 있는데, 본원에서 기술되는 방법에서 사용하기에 적합할 수 있다. 분자 비콘은 다양한 검정 시스템에서 사용될 수 있다. 한 가지 그와 같은 시스템이 핵산 서열-기반 증폭 (나스바(NASBA)®)으로써, 온도 순환 없이 RNA를 이중 가닥 DNA로 중합 및/또는 증폭시키기 위한 단일 단계 등온 과정이다. 나스바 반응은 통상적으로 조류 골수아세포증 바이러스 (AMV), 리버스 트랜스크립타제 (RT), T7 RNA 폴리머라제, RNase H, 및 2종의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 필요로 한다. 증폭 후, 증폭된 표적 핵산은 분자 비콘을 사용하여 검출될 수 있다. 분자 비콘의 다른 용도에 대해서는 업계에 알려져 있는데, 본원에서 기술되는 방법에서 사용하기에 적합할 수 있다.
스코르피온스(Scorpions)™ 시스템은 본원에서 기술되는 방법에서 사용될 수 있는 또 다른 대표적인 검정 포맷이다. 스코르피온스™ 프라이머는 검출가능 표지 (예컨대 형광단), 및 검출가능 표지의 형광을 켄칭하는 비-검출가능 켄처 모이어티와 함께 프라이머가 프로브에 공유 결합되어 있는 2-관능성 분자이다. 표적 핵산의 존재하에서는, 검출가능 표지와 켄처가 분리되고, 이는 검출가능 표지로부터 방출되는 신호의 증가로 이어진다. 통상적으로, 증폭 반응에 사용되는 프라이머는 헤어핀 루프 개시부의 "PCR 차단제" 요소 (예컨대 헥사에틸렌 글리콜 (HEG) 단량체 (문헌 [Whitcombe, et al . Nat. Biotech. 17:804-807 (1999)]))와 함께 5' 말단의 프로브 요소를 포함한다. 프로브는 통상적으로 일 말단에는 검출가능 표지를, 타 말단에는 켄처를 가지는 자가-상보성 스템 서열을 포함한다. 최초 증폭 주기 (예컨대 PCR)에서는, 프라이머가 표적에 혼성화된 후, 폴리머라제의 작용으로 인하여 연장이 이루어진다. 스코르피온스™ 시스템은 프로브들 사이를 구별하기 위하여 서로 다르게 태그가 구비될 수 있는 다중 프로브들을 사용하여 점 돌연변이를 조사 및 확인하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어 PCR을 사용하는 경우, 일 연장 주기가 완료된 후, 새롭게 합성된 표적 영역이 프로브로서 동일한 가닥에 결합되게 된다. 변성 및 어닐링의 제2 주기 후에는, 프로브와 표적이 혼성화된다. 다음에는, 헤어핀 서열이 새롭게 생성되는 PCR 생성물의 일부에 혼성화된다. 이는 켄처로부터의 검출가능 표지의 분리를 초래하여 신호의 방출을 야기한다. 그와 같이 표지되는 프로브의 기타 용도에 대해서는 업계에 알려져 있는데, 본원에서 기술되는 방법에서 사용하기에 적합할 수 있다.
일부 실시양태에서는, 서열분석 반응 전에 또는 그와 함께 방법이 수행된다. "서열분석하는 것"이라는 용어는 본원에서 넓은 의미로 사용되며, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 비제한적으로 표적 핵산 또는 앰플리콘의 적어도 일부의 일부 이상 연속 뉴클레오티드의 순서가 확인되는 것을 가능케 하는 업계 공지의 임의의 기술을 지칭한다. 서열분석 기술의 일부 비-제한적인 예에는 생거(Sanger)의 디데옥시 터미네이터법 및 막삼 및 길버트(Maxam and Gilbert)의 화학적 절단법이 포함되며, 이러한 방법들의 변이; 혼성화에 의한 서열분석; 합성에 의한 서열분석; 및 제한 매핑(restriction mapping)이 포함된다. 일부 서열분석 방법은 모세관 전기영동 및 겔 전기영동을 포함한 전기영동; 마이크로어레이(microarray) 혼성화를 포함한 혼성화에 의한 서열분석; 질량 분광측정법; 단일 분자 검출; 및 이온/양성자 검출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열분석에는 직접적인 서열분석, 이중 서열분석, 주기 서열분석, 단일 염기 연장 서열분석 (SBE), 고체-상 서열분석 또는 이들의 조합이 포함된다. 일부 실시양태에서, 서열분석은 기기, 예를 들어 비제한적으로 ABI 프리즘® 377 DNA 서열분석기, ABI 프리즘® 310, 3100, 3100-아반트(Avant), 3730 또는 3730xl 유전자 분석기, ABI 프리즘® 3700 DNA 분석기, 이온 PGM™ 서열분석기, 또는 이온 프로톤(Proton)™ 서열분석기 (모두 캘리포니아 칼스배드 소재 라이프 테크놀로지스 코포레이션에서 구입가능함), 또는 질량 분광측정기를 사용하여 서열분석 생성물을 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열분석은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP, dITP 또는 이들의 조합, 그리고 dNTP의 디데옥시리보뉴클레오티드 유사체를 포함한 dNTP를 증폭 생성물에 도입하는 것을 포함한다.
개시되는 핵산 증폭 반응에 사용될 수 있는 핵산 폴리머라제는 예를 들어 원핵, 진균, 바이러스, 박테리오파지, 식물 및/또는 진핵 핵산 폴리머라제를 포함하여, 원하는 반응을 수행하는 기능을 하는 것일 수 있다. 본원에서 사용될 때, "DNA 폴리머라제"라는 용어는 핵산 가닥을 주형으로 사용하여 새로이 DNA 가닥을 합성하는 효소를 지칭한다. DNA 폴리머라제는 기존의 DNA 또는 RNA를 DNA 합성을 위한 주형으로 사용하며, 그것이 해독하는 주형 가닥을 따라 데옥시리보뉴클레오티드의 중합을 촉매한다. 새롭게 합성되는 DNA 가닥은 주형 가닥에 대하여 상보성이다. DNA 폴리머라제는 새롭게 형성되는 가닥의 3'-히드록실 말단에만 자유 뉴클레오티드를 첨가할 수 있다. 그것은 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP)로부터 성장하는 올리고뉴클레오티드 쇄의 3'-히드록실 기로의 뉴클레오시드 모노포스페이트의 전달을 통하여 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 이는 5'-내지-3' 방향으로의 새로운 가닥의 연장을 초래한다. DNA 폴리머라제는 기존의 3'-OH 기에만 뉴클레오티드를 첨가할 수 있기 때문에, DNA 합성 반응을 개시하기 위하여, DNA 폴리머라제는 그것이 첫 번째 뉴클레오티드를 첨가할 수 있는 프라이머를 필요로 한다. 적합한 프라이머는 RNA 또는 DNA의 올리고뉴클레오티드, 또는 이들의 키메라 (예컨대 RNA/DNA 키메라 프라이머)를 포함할 수 있다. DNA 폴리머라제는 자연 발생 DNA 폴리머라제, 또는 상기-언급된 활성을 가지는 자연 효소의 변이일 수 있다. 예를 들어, 거기에는 가닥 대체 활성을 가지는 DNA 폴리머라제, 5'-내지-3' 엑소뉴클레아제 활성이 결핍되어 있는 DNA 폴리머라제, 리버스 트랜스크립타제 활성을 가지는 DNA 폴리머라제, 또는 엔도뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 폴리머라제가 포함될 수 있다.
적합한 핵산 폴리머라제에는 또한 완전효소, 완전효소의 기능성인 일부, 키메라 폴리머라제, 또는 핵산 분자의 합성을 수행할 수 있는 임의의 변형된 폴리머라제가 포함될 수 있다. 본 개시내용 내에서, DNA 폴리머라제에는 또한 폴리머라제, 말단 트랜스퍼라제, 리버스 트랜스크립타제, 텔로머라제 및/또는 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제가 포함될 수 있다. 폴리머라제의 비-제한적인 예에는 예를 들어 T7 DNA 폴리머라제, 진핵 미노콘드리아 DNA 폴리머라제 γ, 원핵 DNA 폴리머라제 I, II, III, IV 및/또는 V; 진핵 폴리머라제 α, β, γ, δ, ε, η, ζ, ι 및/또는 κ; 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I; 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 III 알파 및/또는 엡실론 서브유닛; 이. 콜라이 폴리머라제 IV, 이. 콜라이 폴리머라제 V; 티. 아쿠아티쿠스(T. aquaticus) DNA 폴리머라제 I; 비. 스테아로써모필루스(B. stearothermophilus) DNA 폴리머라제 I; 유리아르카에오타(Euryarchaeota) 폴리머라제; 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 (TdT); 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 폴리머라제 4; 트랜스리죤(translesion) 합성 폴리머라제; 리버스 트랜스크립타제; 및/또는 텔로머라제가 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 열안정성 DNA 폴리머라제의 비-제한적인 예에는 Taq, Tfl, Tfi, Pfu 및 벤트™ DNA 폴리머라제, 임의의 유전자 조작 DNA 폴리머라제, 감소되거나 유의성 없는 3'-내지-5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 것 (예컨대 슈퍼스크립트(SuperScript)™ DNA 폴리머라제), 및/또는 유전자 조작 DNA 폴리머라제 (예컨대 활성 부위 돌연변이 F667Y 또는 F667Y의 등가물을 가지는 것들 (예컨대 Tth의 것), 앰플리태크(AmpliTaq)® FS, 테르모시쿼네이스(ThermoSequenase)™), 앰플리태크® 골드(Gold), 플래티넘(Platinum)® Taq DNA 폴리머라제, 테르미네이터(Therminator) I, 테르미네이터 II, 테르미네이터 III, 테르미네이터 감마 (모두 매사추세츠 비벌리 소재 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 구입가능함), 및/또는 이들의 임의의 유도체 및 단편이 포함된다. 업계 숙련자라면 알고 있을 바와 같이, 다른 핵산 폴리머라제들이 적합할 수도 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대상 핵산 서열 (예컨대 표적 서열)을 중합 및/또는 증폭시키기 위한 반응 혼합물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 추가로 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 방법은 증폭된 핵산을 정량하기 위하여 검출가능한 표지를 검출하기 위한 하나 이상의 단계를 포함할 수도 있다. 본원에서 사용될 때, "검출가능한 표지"라는 용어는 증폭을 표시해주는 다양한 신호전달 분자들 중 어느 것을 지칭한다. 예를 들어, SYBR® 그린 및 기타 DNA-결합 염료들이 검출가능한 표지이다. 그와 같은 검출가능한 표지는 예를 들어 핵산 개재 작용제 또는 비-개재 작용제를 포함할 수 있거나, 또는 그것일 수 있다. 본원에서 사용될 때, 개재 작용제는 이중-가닥 핵산 분자의 적층된 염기 쌍들 사이에의 비-공유 삽입을 할 수 있는 작용제 또는 모이어티가다. 비-개재 작용제는 이중-가닥 핵산 분자에 삽입되지 않는 것이다. 핵산 결합 작용제는 직간접적으로 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있다. 신호는 예를 들어 형광 및/또는 흡광도를 사용하여 직접, 또는 예를 들어 핵산 결합 작용제에 결합되어 있는 치환된 표지 모이어티 또는 결합 리간드와 같이 적합한 이중-가닥 핵산에의 근접성에 의해 검출가능하게 영향을 받는 임의의 모이어티 또는 리간드를 사용하여 간접적으로 검출가능할 수 있다. 이중 -가닥 핵산에 결합되었을 때, 통상적으로 핵산 결합 작용제는 동일한 그 작용제가 용액 중에 있거나 또는 단일-가닥 핵산에 결합되었을 때 생성되는 신호와 구별되는 검출가능 신호를 생성시킬 필요가 있다. 예를 들어, 에티듐 브로마이드와 같은 개재 작용제는 단일-가닥 DNA, RNA에 결합되었을 때 또는 용액 중에 있을 때에 비해 이중-가닥 DNA에 개재되었을 때 더욱 강하게 형광한다 (예컨대 U.S. 특허 제5,994,056호; 6,171,785호; 및/또는 6,814,934호 참조). 유사하게, 악티노마이신 D는 단일-가닥 핵산에 결합되었을 때에는 UV/VIS 스펙트럼의 적색 부분에서 형광하며, 이중-가닥 핵산에 결합되었을 때에는 UV/VIS 스펙트럼의 녹색 부분에서 형광한다. 그리고 또 다른 예에서, 광반응성인 소랄렌 4-아미노메틸-4-5',8-트리메틸소랄렌 (AMT)은 이중-가닥 DNA에의 개재시 긴 파장에서의 감소된 흡수 및 형광을 나타내는 것으로 보고되어 있다 (문헌 [Johnson et al . Photochem. & Photobiol, 33:785-791 (1981)]). 예를 들어, U.S. 특허 제4,257,774호는 DNA에 대한 형광 삽입제 (예컨대 에티듐염, 다우노마이신, 메파크린 및 아크리딘 오렌지, 4',6-디아미디노-α-페닐인돌)의 직접적인 결합에 대해 기술하고 있다. 비-개재 작용제 (예컨대 본원에서 기술되는 바와 같은 작은 홈 결합제 예컨대 회흐스트 33258, 디스타마이신, 네트롭신) 역시 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 회흐스트 33258 (문헌 [Searle, et al . Nucl. Acids Res. 18(13):3753-3762 (1990)])은 표적의 양이 증가함에 따라 변경된 형광을 나타낸다. 작은 홈 결합제에 대해서는 본원의 다른 곳에서 더욱 상세하게 기술된다.
다른 DNA 결합 염료들이 업계 숙련자에게 가용한데, 단독으로, 또는 다른 작용제 및/또는 검정 시스템 구성요소와의 조합으로써 사용될 수 있다. 대표적인 DNA 결합 염료에는 예를 들어 특히 아크리딘 (예컨대 아크리딘 오렌지, 아크리플라빈), 악티노마이신 D (문헌 [Jain, et al. J. Mol. Biol. 68:21 (1972)]), 안트라마이신, BOBO™-1, BOBO™-3, BO-PRO™-1, 크로모마이신, DAPI (문헌 [Kapuseinski, et al . Nucl. Acids Res. 6(112):3519 (1979)]), 다우노마이신, 디스타마이신 (예컨대 디스타마이신 D), U.S. 특허 제7,387,887호에 기술되어 있는 염료, 엘립티신, 에티듐염 (예컨대 에티듐 브로마이드), 플루오르쿠마린, U.S. 특허 제4,257,774호에 기술되어 있는 바와 같은 형광 삽입제, 젤스타(GelStar)® (메인 록랜드 소재 캄브렉스 바이오 사이언스 록랜드 인크.(Cambrex Bio Science Rockland Inc.)), 회흐스트 33258 (문헌 [Searle and Embrey, Nucl. Acids Res. 18:3753-3762 (1990)]), 회흐스트 33342, 호미듐, JO-PRO™-1, LIZ 염료, LO-PRO™-1, 메파크린, 미트라마이신, NED 염료, 네트롭신, 4',6-디아미디노-α-페닐인돌, 프로플라빈, POPO™-1, POPO™-3, PO-PRO™-1, 프로퓸 아이오다이드, 루테늄 폴리피리딜, S5, SYBR® 골드, SYBR® 그린 I (U.S. 특허 제5,436,134호 및 5,658,751호), SYBR® 그린 II, SYTOX® 블루, SYTOX® 그린, SYTO® 43, SYTO® 44, SYTO® 45, SYTOX® 블루, TO-PRO®-1, SYTO® 11, SYTO® 13, SYTO® 15, SYTO® 16, SYTO® 20, SYTO® 23, 티아졸 오렌지 (위스콘신 밀워키 소재 알드리치 케미칼(Aldrich Chemical) Co.사), TOTO™-3, YO-PRO®-1, 및 YOYO®-3 (오리건 유진 소재 몰레큘라 프로브스, 인크.(Molecular Probes, Inc.))가 포함될 수 있다. SYBR® 그린 I (예컨대 U.S. 특허 제5,436,134호; 5,658,751호; 및/또는 6,569,927호 참조)은 예를 들어 PCR 반응을 모니터링하는 데에 사용되어 왔다. 업계 숙련자라면 알고 있을 바와 같이, 다른 DNA 결합 염료들 역시 적합할 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같이 사용하기 위하여, 1종 이상의 검출가능 표지 및/또는 켄칭 작용제가 1종 이상의 프라이머 및/또는 프로브 (예컨대 검출가능 표지)에 결합될 수 있다. 검출가능 표지는 자유로울 때, 또는 표적 핵산들 중 하나에 결합되었을 때 신호를 방출할 수 있다. 검출가능 표지는 또 다른 검출가능 표지에 근접하여 있을 때 신호를 방출할 수도 있다. 검출가능 표지는 켄처 분자 근처에 충분히 가깝게 있지 않은 경우에만 신호가 검출가능하도록 켄처 분자와 함께 사용될 수도 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 검정 시스템은 검출가능 표지가 켄칭 분자로부터 방출되도록 할 수 있다. 본원에서 기술되는 방법에서 사용되는 프라이머 및 프로브를 표지하는 데에는, 수종의 검출가능 표지 중 어느 것이 사용될 수 있다. 상기에서 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 검출가능 표지는 프로브에 결합될 수 있으며, 그것은 프라이머에 도입될 수 있거나, 또는 다르게는 증폭된 표적 핵산에 결합될 수 있다 (예컨대 검출가능한 핵산 결합 작용제 예컨대 개재 또는 비-개재 염료). 1종을 초과하는 검출가능 표지를 사용하는 경우, 표지가 서로 구별될 수 있도록, 또는 검출가능 표지들이 함께 어느 하나의 검출가능 표지 단독으로는 방출되지 않는 신호를 방출하도록, 각각이 그의 스펙트럼 특성상 상이해야 한다. 대표적인 검출가능 표지에는 예를 들어 형광 염료 또는 형광단 (예컨대 광에 의해 여기되어 형광 또는 인광을 방출할 수 있는 화학 기), 형광 공여자 염료(fluorescent donor dye)로부터의 형광 신호를 켄칭할 수 있는 "수용자 염료(acceptor dye)" 등이 포함된다. 업계 숙련자라면 알고 있을 바와 같이, 적합한 검출가능 표지에는 예를 들어 특히 플루오레세인 예컨대 5-카르복시-2,7-디클로로플루오레세인; 5-카르복시플루오레세인 (5-FAM); 5-히드록시 트립타민 (5-HAT); 6-JOE; 6-카르복시플루오레세인 (6-FAM); FITC; 6-카르복시-1,4-디클로로-2',7'-디클로로-플루오레세인 (TET); 6-카르복시-1,4-디클로로-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인 (HEX); 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인 (JOE); 알렉사 플루오르(Alexa fluor)® 형광단 (예컨대 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750); 바디파이(BODIPY)® 형광단 (예컨대 492/515, 493/503, 500/510, 505/515, 530/550, 542/563, 558/568, 564/570, 576/589, 581/591, 630/650-X, 650/665-X, 665/676, FL, FL ATP, FI-세라미드, R6G SE, TMR, TMR-X 접합체, TMR-X, SE, TR, TR ATP, TR-X SE), 쿠마린 (예컨대 7-아미노-4-메틸쿠마린, AMC, AMCA, AMCA-S, AMCA-X, ABQ, CPM 메틸쿠마린, 쿠마린 팔로이딘, 히드록시 쿠마린, CMFDA, 메톡시쿠마린), 칼세인, 칼세인 AM, 칼세인 블루, 칼슘 염료 (예컨대 칼슘 크림슨, 칼슘 그린, 칼슘 오렌지, 칼코플루오르 화이트), 캐스케이드 블루, 캐스케이드 옐로우; Cy™ 염료 (예컨대 3, 3.18, 3.5, 5, 5.18, 5.5, 7), 시안 GFP, 고리형 AMP 플루오로센서 (FiCRhR), 형광 단백질 예컨대 녹색 형광 단백질 (예컨대 GFP. EGFP), 청색 형광 단백질 (예컨대 BFP, EBFP, EBFP2, 아주라이트, 엠칼라마 1), 시안 형광 단백질 (예컨대 ECFP, 세룰레안, CyPet), 황색 형광 단백질 (예컨대 YFP, 시트린, 비너스, YPet), FRET 공여자/수용자 쌍 (예컨대 플루오레세인/테트라메틸로다민, IAEDANS/플루오레세인, EDANS/답실, 플루오레세인/플루오레세인, 바디파이® FL/바디파이® FL, 플루오레세인/QSY7 및 QSY9), 리소트랙커(LysoTracker)® 및 리소센서(LysoSensor)™ (예컨대 리소트랙커® 블루 DND-22, 리소트랙커® 블루-화이트 DPX, 리소트랙커® 옐로우 HCK-123, 리소트랙커® 그린 DND-26, 리소트랙커® 레드 DND-99, 리소센서™ 블루 DND-167, 리소센서™ 그린 DND-189, 리소센서™ 그린 DND-153, 리소센서™ 옐로우/블루 DND-160, 리소센서™ 옐로우/블루 10,000 MW 덱스트란), 오레곤 그린 (예컨대 488, 488-X, 500, 514); 로다민 (예컨대 110, 123, B, B 200, BB, BG, B 엑스트라, 5-카르복시테트라메틸로다민 (5-TAMRA), 5 GLD, 6-카르복시로다민 6G, 리싸민, 리싸민 로다민 B, 팔리시딘, 팔로이딘, 레드, Rhod-2, ROX (6-카르복시-X-로다민), 5-ROX (카르복시-X-로다민), 술포로다민 B can C, 술포로다민 G 엑스트라, TAMRA (6-카르복시테트라메틸로다민), 테트라메틸로다민 (TRITC), WT), 텍사스 레드, 텍사스 레드-X, VIC 및 예컨대 U.S. 특허 출원 공개 제2009/0197254호 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있는 기타 표지들이 포함될 수 있다. 업계 숙련자라면 알고 있을 바와 같이, 기타 검출가능한 표지들도 사용될 수 있다 (예컨대 U.S. 특허 출원 공개 제2009/0197254호 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 이들 시스템 및 검출가능 표지들 중 어느 것은 물론, 많은 다른 것들이 증폭된 표적 핵산을 검출하는 데에 사용될 수 있다.
일부 검출가능 표지들은 서열-기반 (본원에서는 "위치-특이적 검출가능 표지"로도 지칭됨)일 수 있는데, 예를 들어 5'-뉴클레아제 프로브일 수 있다. 그와 같은 프로브들은 1종 이상의 검출가능 표지를 포함할 수 있다. 다양한 검출가능 표지들이 업계에 알려져 있는데, 예를 들어 본원에서 기술되는 택맨® 프로브 (U.S. 특허 제5,538,848호 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)도 참조), 다양한 스템-루프 분자 비콘 (예컨대 U.S. 특허 제6,103,476호 및 5,925,517호, 및 문헌 [Tyagi and Kramer, Nature Biotechnology 14:303-308 (1996)] 참조), 무스템 또는 선형 비콘 (예컨대 PCT 공개 제WO 99/21881호; U.S. 특허 제6,485,901호 참조), PNA 몰레큘라 비콘(Molecular Beacons)™ (예컨대 U.S. 특허 제6,355,421호 및 6,593,091호 참조), 선형 PNA 비콘 (예컨대 문헌 [Kubista et al ., SPIE 4264:53-58 (2001)] 참조), 비-FRET 프로브 (예컨대 U.S. 특허 제6,150,097호 참조), 선라이즈(Sunrise)®/앰플리플루오르(Amplifluor)® 프로브 (U.S. 특허 제6,548,250호), 스템-루프 및 이중 스코르피온스™ 프로브 (문헌 [Solinas et al ., Nucleic Acids Research 29:E96 (2001)] 및 U.S. 특허 제6,589,743호), 돌출 루프 프로브 (U.S. 특허 제6,590,091호), 의사 노트(knot) 프로브 (U.S. 특허 제6,589,250호), 시클리콘 (U.S. 특허 제6,383,752호), MGB 에클립스(Eclipse)™ 프로브 (에포크 바이오사이언시즈(Epoch Biosciences)), 헤어핀 프로브 (U.S. 특허 제6,596,490호), 펩티드 핵산 (PNA) 점화 프로브(light-up probe) (문헌 [Svanvik, et al . Anal Biochem 281:26-35 (2001)]), 자가-조립 나노입자 프로브, 예를 들어 U.S. 특허 제6,485,901호; 문헌 [Mhlanga et al ., Methods 25:463-471 (2001)]; [Whitcombe et al ., Nature Biotechnology. 17:804-807 (1999)]; [Isacsson et al ., Molecular Cell Probes. 14:321-328 (2000)]; [Svanvik et al ., Anal Biochem. 281 :26-35 (2000)]; [Wolffs et al ., Biotechniques 766:769-771 (2001)]; [Tsourkas et al ., Nucleic Acids Research. 30:4208-4215 (2002)]; [Riccelli et al ., Nucleic Acids Research 30:4088-4093 (2002)]; [Zhang et al ., Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 34:329-332 (2002)]; [Maxwell et al ., J. Am. Chem. Soc. 124:9606-9612 (2002)]; [Broude et al ., Trends Biotechnol. 20:249-56 (2002)]; [Huang et al ., Chem Res. Toxicol. 15:118-126 (2002)]; 및 [Yu et al ., J. Am. Chem. Soc. 14:11155-11161 (2001)]에 기술되어 있는 페로센-변형 프로브; 퀀티프로브스(QuantiProbes)® (www.qiagen.com), 하이비컨스(HyBeacons)® (문헌 [French, et al . Mol. Cell. Probes 15:363-374 (2001)]), 대체 프로브 (문헌 [Li, et al . Nucl. Acids Res. 30:e5 (2002)]), 하이브프로브(HybProbe) (문헌 [Cardullo, et al . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8790-8794 (1988)]), MGB 알러트(Alert) (www.nanogen.com), Q-PNA (문헌 [Fiandaca, et al . Genome Res. 11:609-611 (2001)]), 플렉소르® (www.Promega.com), LUX™ 프라이머 (문헌 [Nazarenko, et al . Nucleic Acids Res. 30:e37 (2002)]), DzyNA 프라이머 (문헌 [Todd, et al . Clin. Chem. 46:625-630 (2000)])이다. 검출가능 표지는 또한 예를 들어 블랙 홀(black hole) 켄처 (바이오서치(Biosearch)), 아이오와 블랙(Iowa Black)® 켄처 (IDT), QSY 켄처 (몰레큘라 프로브스), 그리고 답실 및 답실 술포네이트/카르복실레이트 켄처 (에포크(Epoch))를 포함하여, 검출가능 표지의 형광을 켄칭하는 비-검출가능 켄처 모이어티들을 포함할 수 있다. 검출가능 표지는 예를 들어 일 프로브에는 형광단이 존재하고 다른 프로브에는 켄처가 존재하거나, 표적 상에서 2개 프로브를 서로 혼성화하는 것이 신호를 켄칭하거나, 또는 표적 상에서의 혼성화가 형광의 변화를 통하여 신호 시그너쳐(signature)를 변경하는 2개의 프로브를 포함할 수도 있다. 대표적인 시스템은 또한 FRET, 살리실레이트/DTPA 리간드 시스템 (예컨대 문헌 [Oser et al . Angew. Chem. Int. Engl. 29(10):1167 (1990)] 참조), 대체 혼성화, 상동성 프로브, 및/또는 유럽 특허 제EP 070685호 및/또는 U.S. 특허 제6,238,927호에 기술되어 있는 검정을 포함할 수 있다. 검출가능 표지는 또한 카르복실레이트 기 대신 SO3를 가지는 플루오레세인 염료의 술포네이트 유도체, 플루오레세인의 포스포르아미다이트 형태, Cy5의 포스포르아미다이트 형태 (예를 들어 아머샴(Amersham)으로부터 구입가능함)를 포함할 수 있다. 상기에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 기술되는 조성물 및 방법은 시험 샘플로부터 다양한 표적 핵산을 검출 및/또는 정량하는 데에 유용할 수 있다. 표적 핵산은 시험 샘플 중에 그것이 존재하는지 (또는 그렇지 않은지)를 확인 또는 검출하기 위하여, 및/또는 그것을 정량하기 위하여 검정 시스템이 설계되는 임의의 핵산이다. 그와 같은 핵산에는 예를 들어 감염성 작용제 (예컨대 바이러스, 박테리아, 기생충 등), 암, 당뇨병 등과 같은 질환 과정의 것들, 또는 면역 반응을 측정하기 위한 것들이 포함될 수 있다. 대표적인 "시험 샘플"에는 생물학적 샘플과 같은 다양한 유형의 샘플들이 포함된다. 대표적인 생물학적 샘플에는 예를 들어 체액 (예컨대 혈액, 타액, 척수액), 조직 샘플, 식품 (예컨대 고기) 또는 음료 (예컨대 우유) 제품 등이 포함된다. 발현되는 핵산은 예를 들어 발현 (또는 그의 결핍)이 감염성 질환 (예컨대 박테리아, 바이러스, 진균, 원생동물 감염) 또는 암과 같은 의학적 상태와 연관되어 있는 유전자를 포함할 수 있다. 본원에서 기술되는 방법은 제약, 식품 또는 음료 제품에서 오염물 (예컨대 박테리아, 바이러스, 진균 및/또는 원생동물)을 검출하는 데에 사용될 수도 있다. 본원에서 기술되는 방법은 또한 야생형 대립유전자 존재하에서 희귀 대립유전자 (예컨대 106-109개 야생형 대립유전자 존재하에서의 1개의 돌연변이 대립유전자)를 검출하는 데에 사용될 수 있다. 상기 방법은 예를 들어 최소 잔류 질환 (예컨대 회복시의 희귀 잔류 암 세포, 특히 p53 유전자, 또는 이전에 종양 내에서 확인되었던 다른 종양 억제인자 유전자에서의 돌연변이)을 검출하고/거나 돌연변이 부하(mutation load) (혈액 또는 소변과 같은 정상 조직에 존재하는 특정 체세포 돌연변이의 빈도)를 측정하는 데에 유용하다.
본원에서 기술되는 방법을 수행하기 위한 키트도 제공된다. 본원에서 사용될 때, "키트"라는 용어는 통상적으로 1종 이상의 화합물 또는 조성물인 관련 구성요소들의 포장된 세트를 지칭한다. 키트는 샘플로부터 1종 이상의 표적 핵산을 중합 및/또는 증폭시키기 위한 한 쌍의 올리고뉴클레오티드, 1종 이상의 디터전트, 핵산 폴리머라제, 이중 고온 개시 반응 혼합물, 및/또는 검출가능한 표지로 표지된 상응하는 1종 이상 프로브를 포함할 수 있다. 키트는 대조 반응에 사용될 사전-한정 표적 핵산을 함유하는 샘플도 포함할 수 있다. 키트는 또한 임의로 검출에 필요한 모 용액, 완충제, 효소, 검출가능 표지 또는 시약, 증폭 반응을 완료하는 데에 사용될 수 있는 튜브, 막 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 다수의 프라이머 세트가 포함된다. 일 실시양태에서, 키트는 예를 들어 완충제 (예컨대 트리스(Tris)), 1종 이상의 염 (예컨대 KCl), 글리세롤, dNTP (dA, dT, dG, dC, dU), 재조합 BSA (소 혈청 알부민), 염료 (예컨대 ROX 불활성 참조 염료), 1종 이상의 디터전트, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리비닐 피롤리돈 (PVP) 및/또는 젤라틴 (예컨대 어류 또는 소 공급원) 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 업계 숙련자라면 알고 있을 구체적인 시스템 및 키트의 다른 실시양태들도 고려된다.
실시예
상이한 고온 개시 메카니즘을 가지는 시중에서 구입가능한 마스터 혼합물들을 조합한 후, 이중 고온 개시 반응 혼합물의 효과성을 입증하기 위하여 시험하였다. 실험 설정을 하기 표 1에 개괄하였다:
Figure 112015002214874-pct00001
모든 반응은 2 ng의 범용 인간 참조 (UHR) (캘리포니아 산타클라라 소재 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)) cDNA 및 200 nM의 프라이머 (24종의 표적을 시험)를 사용하여 10 μl의 최종 부피로 수행하였다. 각 반응 당 4반복을 수행하였다. 증폭은 실온에서 0시간 또는 24시간 (각각 T0 및 T24) 중 어느 하나 동안의 인큐베이션 후, ViiA™ 7 실시간 PCR 시스템 (캘리포니아 칼스배드 소재 라이프 테크놀로지스 코포레이션)에서 수행하였다. 실온에서의 인큐베이션 후, 제조자의 지침에 따라 증폭을 수행하였다. 간단하게 말하자면, 하기와 같이 열 순환 조건을 설정하였다:
Figure 112015002214874-pct00002
일부 경우에서는, 파워 SYBR® 그린 qPCR 슈퍼믹스 또는 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스를 플래티넘® Taq 항체와 함께 밤새 (16-20시간) 인큐베이션하였다. 시험된 모든 성분들은 시중에서 구입가능한데, 라이프 테크놀로지스 코포레이션으로부터 구매하였다.
도 1a-1d에서는, 단일 또는 이중 고온 개시 반응 혼합물 중 어느 하나를 사용하고 24종의 프라이머 세트를 사용하여 표적 핵산을 증폭시켰다. 단일 고온 개시 반응 혼합물은 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스 단독 ("정사각형" 선) 또는 플래티넘® SYBR® 그린 qPCR 슈퍼믹스 단독 ("십자가" 선) 중 어느 하나를 사용하였다. 이중 고온 개시 반응 혼합물은 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스와 플래티넘® SYBR® 그린 qPCR 슈퍼믹스의 1:1 조합 ("삼각형" 선)을 사용하였다. 3종의 반응 세트 모두를 증폭 전에 0시간 ("T0") 또는 24시간 ("T24") 중 어느 하나 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 많은 검정에서, 2종의 상이한 고온 개시 메카니즘의 조합이 비-특이적 생성물 형성의 감소를 초래하였다 (도 1a (T0, cDNA), 1b (T0, 비-특이적 생성물 ("NTC")), 1c (T24, cDNA) 및 1d (T24, NTC) 참조).
도 2a-2d에서는, 개별 앰플리콘들을 선택하여, 용융 곡선 분석에 의해 분석하였다. 도 2a는 이중 고온 개시 반응 혼합물이 실온에서 0시간 후 단일 고온 개시 반응 혼합물 (속성 SYBR® 그린 마스터 믹스)에 비해서는 4-배의 비-특이적 생성물 형성의 감소를, 그리고 다른 단일 고온 개시 반응 혼합물 (플래티넘® SYBR® 그린 qPCR 슈퍼믹스)에 비해서는 2-배의 감소를 산출한다는 것을 입증하고 있다. 도 2b는 이중 고온 개시 반응 혼합물이 실온에서 24시간 사전-인큐베이션 후 단일 고온 개시 반응 혼합물 각각에 비해 2-배의 비-특이적 생성물 형성의 감소를 산출한다는 것을 입증하고 있다. 도 2c 및 2d는 이중 고온 개시 반응 혼합물이 실온에서 0시간의 사전-인큐베이션에서는 50% 이상의 비-특이적 생성물 감소를 (도 2c), 그리고 실온에서 24시간의 사전-인큐베이션 후에는 100%의 비-특이적 생성물 감소를 (도 2d) 산출한다는 것을 보여준다. 도 2e는 비-특이적 생성물 형성의 감소에 대한 단일 및 이중 고온 개시 반응 혼합물 증폭 반응의 효과의 평균 Ct 및 ΔCt 분석을 비교한다. 도 2f는 이중 고온 개시 반응 혼합물이 실온에서의 0 및 24시간 사전-인큐베이션 모두에서 비-특이적 생성물의 형성을 상당히 감소시킨다는 것을 (NTC ΔRn 신호의 감소에 의해 나타나는 바와 같음) 입증하는 단일 및 이중 고온 개시 반응 혼합물의 용융 곡선 분석 비교를 보여준다.
도 3a-3d에서는, 단일 또는 이중 고온 개시 반응 혼합물 중 어느 하나를 사용하고 24종의 프라이머 세트를 사용하여 표적 핵산을 증폭시켰다. 단일 고온 개시 반응 혼합물로써 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스 단독 ("다이아몬드" 선)을 사용하거나, 또는 플래티넘® Taq 항체와의 조합으로써 ("십자가" 선) 사용하였다. 양 반응 세트를 증폭 전에 0시간 ("T0") 또는 24시간 ("T24") 중 어느 하나 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 많은 검정에서, 2종의 상이한 고온 개시 메카니즘의 조합이 비-특이적 생성물 형성의 감소를 초래하였다 (도 3a (T0, cDNA), 3b (T0, 비-특이적 생성물 ("NTC")), 3c (T24, cDNA) 및 3d (T24, NTC) 참조).
도 4a-4c에서는, 개별 앰플리콘들을 선택하여, 용융 곡선 분석에 의해 분석하였다. 도 4a는 속성 SYBR® 그린 마스터 믹스 단일 고온 개시 반응 혼합물이 특히 실온에서 24시간 사전-인큐베이션 후에는 비-특이적인 생성물을 생성시킨다는 것을 입증하고 있다. 도 4b는 이중 고온 개시 반응 혼합물이 T0에서 비-특이적인 생성물 형성의 75% 감소를, T24에서 비-특이적인 생성물 형성의 100% 감소를 초래한다는 것을 입증하고 있다. 도 4c는 이중 고온 개시 반응 혼합물이 T0 및 T24 모두에서 비-특이적 생성물의 형성을 감소시킨다는 것, 그리고 이중 고온 개시 반응 혼합물이 20-25% (사용된 역치 값에 따라 달라짐)까지 비-특이적 생성물의 형성을 감소시킨다는 것을 입증하고 있다.
도 5a-5d에서는, 단일 또는 이중 고온 개시 반응 혼합물 중 어느 하나를 사용하고 24종의 프라이머 세트를 사용하여 표적 핵산을 증폭시켰다. 단일 고온 개시 반응 혼합물로써 파워 SYBR® 그린 PCR 마스터 믹스 단독 ("다이아몬드" 선)을 사용하거나, 또는 플래티넘® Taq 항체와의 조합으로써 ("십자가" 선) 사용하였다. 양 반응 세트를 증폭 전에 0시간 ("T0") 또는 24시간 ("T24") 중 어느 하나 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 많은 검정에서, 2종의 상이한 고온 개시 메카니즘의 조합이 비-특이적 생성물 형성의 감소를 초래하였다 (도 5a (T0, cDNA), 5b (T0, 비-특이적 생성물 ("NTC")), 5c (T24, cDNA) 및 5d (T24, NTC) 참조).
도 6a-6c에서는, 개별 앰플리콘들을 선택하여, 용융 곡선 분석에 의해 분석하였다. 도 6a는 파워 SYBR® 그린 PCR 마스터 믹스 단일 고온 개시 반응 혼합물이 특히 실온에서 24시간 사전-인큐베이션 후에는 비-특이적인 생성물을 생성시킨다는 것을 입증하고 있다. 도 6b는 이중 고온 개시 반응 혼합물이 24시간에서 비-특이적인 생성물 형성의 50% 감소를 초래한다는 것을 입증하고 있다. 도 6c는 이중 고온 개시 반응 혼합물이 T0 및 T24 모두에서 비-특이적 생성물의 형성을 감소시킨다는 것 (Ct 값의 강하로 나타난 바와 같음), 그리고 이중 고온 개시 반응 혼합물이 T0에서는 3-배까지, T24에서는 10%까지 비-특이적 생성물의 형성을 감소시킨다는 것을 입증하고 있다.

Claims (20)

  1. a) 제1 핵산 폴리머라제; 및
    b) 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함하고,
    상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 제1 핵산 폴리머라제에 결합하는 항체 또는 항체 조합을 포함하는 제1 고온 개시 성분; 및 제1 핵산 폴리머라제의 가역적인 화학적 변형의 매개제 또는 제1 핵산 폴리머라제에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 온도 의존성 리간드를 포함하는 제2 고온 개시 성분을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 고온 개시 성분은 함께, 제1 온도에서 제1 핵산 폴리머라제의 활성을 실질적으로 억제할 수 있고, 제2 온도에서는 그렇지 않는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 제1 핵산 폴리머라제가 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 제1 핵산 폴리머라제가 열안정성인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 제1 핵산 폴리머라제가 Taq DNA 폴리머라제, Tfl DNA 폴리머라제, Tfi DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제 및 벤트(Vent)™ DNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. a) 제1 열안정성 핵산 폴리머라제; 및
    b) 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함하고,
    상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 제1 핵산 폴리머라제에 결합하는 항체 또는 항체 조합을 포함하는 제1 고온 개시 성분; 및 제1 핵산 폴리머라제의 가역적인 화학적 변형의 매개제 또는 제1 핵산 폴리머라제에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 온도 의존성 리간드를 포함하는 제2 고온 개시 성분을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 고온 개시 성분은 40℃ 미만의 온도에서 제1 열안정성 핵산 폴리머라제의 폴리머라제 활성을 실질적으로 억제하며, 40℃ 초과의 온도에서는 그렇지 않는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 제1 열안정성 핵산 폴리머라제가 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 제1 열안정성 핵산 폴리머라제가 Taq DNA 폴리머라제, Tfl DNA 폴리머라제, Tfi DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제 및 벤트™ DNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. a) 표적 핵산을 제1 온도에서 제1 핵산 폴리머라제, 이중 고온 개시 반응 혼합물, 1종 이상의 프라이머 및 1종 이상의 dNTP와 접촉시킴으로써 반응 조성물을 형성시키고;
    b) 반응 조성물을 제2 온도로 가열하고;
    c) 반응 조성물에서 표적 핵산을 증폭시키는 것
    을 포함하고,
    상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 제1 핵산 폴리머라제에 결합하는 항체 또는 항체 조합을 포함하는 제1 고온 개시 성분; 및 제1 핵산 폴리머라제의 가역적인 화학적 변형의 매개제 또는 제1 핵산 폴리머라제에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 온도 의존성 리간드를 포함하는 제2 고온 개시 성분을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 고온 개시 성분은 함께, 제1 온도에서 제1 핵산 폴리머라제의 활성을 실질적으로 억제할 수 있고, 제2 온도에서는 그렇지 않는,
    표적 핵산을 증폭시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제1 핵산 폴리머라제가 열안정성인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 제1 핵산 폴리머라제가 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 제1 핵산 폴리머라제가 Taq DNA 폴리머라제, Tfl DNA 폴리머라제, Tfi DNA 폴리머라제, Pfu DNA 폴리머라제 및 벤트™ DNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. a) 제1 핵산 폴리머라제; 및
    b) 이중 고온 개시 반응 혼합물을 포함하고,
    상기 이중 고온 개시 반응 혼합물은 제1 핵산 폴리머라제에 결합하는 항체 또는 항체 조합을 포함하는 제1 고온 개시 성분; 및 제1 핵산 폴리머라제의 가역적인 화학적 변형의 매개제 또는 제1 핵산 폴리머라제에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 온도 의존성 리간드를 포함하는 제2 고온 개시 성분을 포함하고,
    상기 제1 및 제2 고온 개시 성분은 함께, 제1 온도에서 제1 핵산 폴리머라제의 활성을 실질적으로 억제할 수 있고, 제2 온도에서는 그렇지 않는, 키트.
  19. 제18항에 있어서, 1종 이상의 프라이머, dNTP 및 핵산 결합 염료를 추가로 포함하는 키트.
  20. 삭제
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