JP7110259B2 - ポリメラーゼ連鎖反応(pcr)のための新規の組成物、方法、およびキット - Google Patents
ポリメラーゼ連鎖反応(pcr)のための新規の組成物、方法、およびキット Download PDFInfo
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Description
本開示は、概して、非特異的な増幅および/または望ましくない増幅産物を減少させながら核酸を増幅するための組成物、方法、およびキットに関する。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および関連技術は、様々な適用に極めて有用である一方で、望ましくない副反応による非標的核酸の増幅は重大な問題を提起し得る。そのような副反応は、非標的核酸のミスプライミング、および/またはプライマーダイマー形成と称されることもあるプライマーオリゴマー化、ならびにこれらのプライミング人工物の後続の増幅の結果として生じ得る。これは、かなりのバックグラウンド核酸を有し、一方で標的核酸が低コピー数で存在している、核酸の混合物を用いてPCRが実施される適用においてとりわけ当てはまる(例えば、Chou et al., Nucl. Acids Res. 20:1717 (1992)(非特許文献1)を参照されたい)。非特異的に増幅された産物の生成は、非特異的にアニールしたプライマーを伸長させる周囲温度でのDNAポリメラーゼ活性に少なくとも部分的に起因している(例えば、上記のChou et al.(非特許文献1);Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4580 (1990)(非特許文献2)を参照されたい)。したがって、周囲温度でのDNAポリメラーゼ活性の阻害は、二次的アンプリコンの生成を制御することにおいて有益である。
本教示は、当技術分野において二次的アンプリコンまたは疑似副産物と称されることもある、非特異的な増幅(例えば、蛍光)および望ましくない増幅産物を減少させながら、標的核酸を増幅するための、組成物、方法、およびキットに向けられている。
[本発明1001]
(a)核酸ポリメラーゼ;および
(b)二重ホットスタート反応混合物
を含む、組成物。
[本発明1002]
核酸ポリメラーゼがDNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼである、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
核酸ポリメラーゼが熱安定性である、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
核酸ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tfi DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、およびVent(商標)DNAポリメラーゼからなる群より選択される、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
二重ホットスタート反応混合物が少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
少なくとも2種の異なるホットスタート機構が、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPからなる群より選択される、本発明1005の組成物。
[本発明1007]
(a)熱安定性核酸ポリメラーゼ;および
(b)約40℃未満の温度で該ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を実質的に阻害し、約40℃を上回る温度で該ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を実質的に阻害しない、二重ホットスタート反応混合物
を含む、組成物。
[本発明1008]
核酸ポリメラーゼがDNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼである、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
核酸ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tfi DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、およびVent(商標)DNAポリメラーゼからなる群より選択される、本発明1007の組成物。
[本発明1010]
二重ホットスタート反応混合物が少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む、本発明1007の組成物。
[本発明1011]
少なくとも2種の異なるホットスタート機構が、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPからなる群より選択される、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
(a)標的核酸を、核酸ポリメラーゼ、二重ホットスタート反応混合物、少なくとも1種のプライマー、および少なくとも1種のdNTPと第一の温度で接触させ、それによって反応組成物を形成する工程;
(b)該反応組成物を第二の温度まで加熱する工程;ならびに
(c)該反応組成物中の標的核酸を増幅する工程
を含む、標的核酸を増幅するための方法。
[本発明1013]
核酸ポリメラーゼが熱安定性である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
核酸ポリメラーゼがDNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼである、本発明1012の方法。
[本発明1015]
核酸ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tfi DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、およびVent(商標)DNAポリメラーゼからなる群より選択される、本発明1012の方法。
[本発明1016]
二重ホットスタート反応混合物が少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む、本発明1012の方法。
[本発明1017]
少なくとも2種の異なるホットスタート機構が、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPからなる群より選択される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
(a)核酸ポリメラーゼ;および
(b)二重ホットスタート反応混合物
を含む、キット。
[本発明1019]
少なくとも1種のプライマー、dNTP、および核酸結合色素をさらに含む、本発明1018のキット。
[本発明1020]
二重ホットスタート反応混合物が少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む、本発明1018のキット。
ある特定の態様において、核酸ポリメラーゼ、および、第一の温度(例えば、<40℃の温度)で該核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するまたは実質的に阻害する二重ホットスタート反応混合物を含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、二重ホットスタート反応混合物は、第一の(例えば、より低い)温度で核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害するためにまたは実質的に阻害するために用いられる少なくとも2種の異なるホットスタート機構を含む。そのようなホットスタート機構には、例えば、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断する抗体もしくは抗体の組み合わせ、より低温でDNAポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、上昇した温度で解離する、DNAポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低温で活性の低下をもたらす、DNAポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定DNA結合ドメインおよびトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、DNAポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低温でプライマーを捕捉する一本鎖結合タンパク質、修飾されたプライマー、または修飾されたdNTPが含まれてよいが、それらに限定されるわけではない。
UNG工程(任意):50℃で2分間
活性化:95℃で2分間
変性:95~97℃で15秒間
アニーリング/伸長:60~62℃で1分間(×最大40サイクルまで)
UNG工程(任意):50℃で2分間
活性化:95℃で2分間
変性:95~97℃で15秒間
アニーリング:55~60℃で15秒間
伸長:72℃で1分間(×最大40サイクルまで)
UNG工程(任意):50℃で2分間
活性化:95℃で2分間
変性:95~97℃で1~3秒間
伸長:60~62℃で20~30秒間(×最大40サイクルまで)
Claims (8)
- 以下を含む組成物:
(a)第一の核酸ポリメラーゼ;
(b) 該第一のポリメラーゼに結合するオリゴヌクレオチドを含む第一のホットスタート機構;および
(c) 該第一のポリメラーゼの可逆的化学修飾を媒介する薬剤、または、該第一の核酸ポリメラーゼに結合するリガンドを含む第二のホットスタート機構; ここで、該第一のホットスタート機構および該第二のホットスタート機構は、一緒になって、40℃未満の温度で該第一のポリメラーゼの活性を実質的に阻害することができるが、40℃を上回る温度では阻害しない。 - 前記核酸ポリメラーゼが熱安定性である、請求項1記載の組成物。
- 前記核酸ポリメラーゼがDNA依存性DNAポリメラーゼまたはRNA依存性DNAポリメラーゼである、請求項1または2記載の組成物。
- 前記核酸ポリメラーゼが、Taq DNAポリメラーゼ、Tfl DNAポリメラーゼ、Tfi DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、およびVent(商標)DNAポリメラーゼからなる群より選択される、請求項1~3のいずれか一項記載の組成物。
- 請求項1~4のいずれか一項記載の組成物、および、核酸サンプルを含む反応混合物。
- 少なくとも一つの検出可能な標識をさらに含む、請求項5記載の反応混合物。
- 以下を含む、関連成分のパッケージ化されたセット:
(a) 請求項1~4のいずれか一項記載の組成物を含む増幅混合物;および
(b) サンプル由来の少なくとも1種の標的核酸を重合するおよび/または増幅するための一以上のオリゴヌクレオチドのペア、dNTP、検出可能に標識されたプローブ、および/または検出可能な標識。 - 前記(a)、および、前記(b)の一以上が、別々の容器またはチューブの中にある、請求項7記載の関連成分のパッケージ化されたセット。
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