CN104487596B

CN104487596B - 用于聚合酶链式反应(pcr)的新型组合物、方法和试剂盒

Info

Publication number: CN104487596B
Application number: CN201380039516.0A
Authority: CN
Inventors: C·博纳斯; M·刘; J·史蒂文斯
Original assignee: Life Technologies Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 2012-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2020-03-13
Anticipated expiration: 2033-06-14
Also published as: CN110343673B; JP7490022B2; US11788126B2; JP2022137275A; ES2770638T3; US20180282797A1; JP6664444B2; KR102264617B1; US10767217B2; KR20230074845A; EP2861757B1; US20140099644A1; JP6450308B2; JP2018183179A; CN110343673A; EP2861757A1; US20240182958A1; WO2013188839A1; JP7110259B2; US9951378B2

Abstract

本公开内容涉及用于使用双重热启动反应混合物扩增靶核酸同时减少非特异性扩增和非期望的扩增产物的组合物、方法和试剂盒，所述双重热启动反应混合物包含至少两个不同的热启动机制。

Description

用于聚合酶链式反应(PCR)的新型组合物、方法和试剂盒

领域

本公开内容总地来说涉及用于扩增核酸同时减少非特异性扩增和/或非期望的扩增产物的组合物、方法和试剂盒。

背景

虽然聚合酶链式反应(PCR)和相关技术对于各种应用是高度有用的，但因非期望的副反应而产生的非靶核酸的扩增可呈现严重问题。这样的副反应可因非靶核酸的错误引发(mis-priming)和/或引物寡聚化(有时称为引物-二聚体形成)和这些引物引发假象的后续扩增而发生。这在其中使用具有显著背景核酸而靶核酸以低拷贝数存在的核酸混合物来进行PCR的应用中尤其如此(参见，例如，Chou等人,Nucl.AcidsRes.20:1717(1992))。非特异性扩增产物的产生至少部分归因于DNA聚合酶在环境温度延伸非特异性退火的引物的活性(参见，例如，Chou等人,同上；Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:4580(1990))。因此，抑制DNA聚合酶在室温的活性在控制次级扩增子的产生中是有益的。

已描述了几个据报导减少非期望的第二扩增产物形成的“热启动”技术。根据某些“手工热启动”技术，在混合物的温度未高至足以阻止非特异性引物退火之前，不向反应混合物中添加对于DNA聚合酶活性至关重要的组分(例如，二价离子和/或DNA聚合酶本身)(参见，例如，Chou等人,同上；D’Aquila等人,Nucl.Acids Res.19:3749(1991))。较不劳动密集型的技术使用扩增反应的至少一种组分的物理隔离或可逆失活。例如，可将镁或DNA聚合酶隔离在石蜡珠粒中，随着反应温度升高所述石蜡珠粒熔化，从而仅在升高的温度释放隔离的组分。根据其它技术，例如通过DNA聚合酶的可逆化学修饰、抗体对DNA聚合酶的结合或结合DNA聚合酶的寡核苷酸分子来可逆地使DNA聚合酶失活或修饰其(参见，例如，美国专利No.5,677,152和5,338,671；和Dang等人,J.Mol.Biol. 264:268(1996))。在升高的反应温度下，化学修饰被逆转，或抗体分子或寡核苷酸分子被变性，从而释放功能性DNA聚合酶。然而，这些技术中的一些技术似乎不是最佳的，因为可在较低反应温度检测到一定的DNA聚合酶活性(尽管进行了失活)，或它们需要反应混合物在高温的持久暴露，以完全活化DNA聚合酶，这可导致反应混合物的一些组分永久性失活。

某些目前使用的核酸扩增技术包括用于检测和/或定量扩增产物(其包含核酸染料，例如但不限于

绿I(Life Technologies,Carlsbad,CA))的步骤，包括某些实时和/或终点检测技术(参见，例如，Ririe等人, Anal.Biochem.245:154(1997))。通常情况下，核酸染料与扩增产物和/或引物-模板双链体的双链区段结合，并以作为特定核酸染料的特征的波长发射可检测荧光信号。某些扩增法包括用于评价与核酸染料结合的扩增产物的纯度的检测步骤，例如但不限于PCR后解离曲线分析，也称为解链曲线分析。由于扩增子的解链曲线依赖于其长度和序列(除其它以外)，因此扩增子可一般地通过它们的解链曲线来区分(参见，例如，Zhang等人,Hepatology 36:723(2002))。可通过当反应温度经过扩增子的解链温度时监测核酸染料的荧光，来在某些扩增反应过程中获得解离或解链曲线。双链扩增子的解离被观察为在核酸染料特征性的发射波长上荧光的突然下降。根据某些解离曲线分析技术，当解链曲线显示单个恒定的解链温度(有时在图形上在荧光强度的负导数对温度(-dF/dt对T)的曲线上显示为峰)时，扩增产物被归类为“纯的”。相反地，来自单重扩增的这样的解离曲线中多个峰的出现通常表明非期望的副反应产物的存在。当使用这样的基于核酸染料的扩增产物检测技术时，通常期望：1)至少减少并优选消除非期望的副反应产物的形成，和2)至少减少和优选消除因其它核酸，即非扩增产物(例如，引物二聚体)和/或非特异性扩增产物(例如，因错误引发事件而产生的)的双链区段的变性而导致的荧光峰。

某些其他扩增技术还可因除其它以外，引物、连接探针、切割探针、启动子-引物等的非特异性退火和随后酶在最适温度以下的活性而产生非期望的扩增产物。例如，当通常在室温组合反应组分时，或当将反应组合物加热到所需的反应温度时。这些技术的至少一些可受益于本底荧光的减弱。因此，存在对这样的组合物和方法的需要，所述组合物和方法减少和/或消除1)非期望的副反应产物的形成和2)由这些非期望的副反应产物导致的本底荧光。

概述

本教导涉及用于扩增靶核酸同时减少非特异性扩增(例如，荧光)和非期望的扩增产物(有时在本领域中称为第二扩增子或假性副产物)的组合物、方法和试剂盒。

在某些实施方案中，提供了包含核酸聚合酶和双重热启动反应混合物的组合物，所述双重热启动反应混合物在第一温度(例如，<40℃的温度)抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。双重热启动反应混合物包含至少2个不同的热启动机制，所述热启动机制用于在第一温度抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。这样的热启动机制包括但不限于在较低温度阻断DNA聚合酶活性的抗体或抗体的组合、在较低温度阻断DNA聚合酶活性的寡核苷酸、在升高的温度解离的DNA聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度提供降低的活性的DNA聚合酶的氨基酸修饰、包括超稳定DNA结合结构域和拓扑异构酶的融合蛋白、抑制DNA聚合酶的温度依赖性配体、在较低温度隔离引物的单链结合蛋白、修饰的引物或修饰的dNTP。

在某些实施方案中，双重热启动反应混合物相较于常规热启动机制，在延长的时期内抑制非特异性核酸扩增和/或非特异性产物形成。例如，在一些实施方案中，本发明的双重热启动反应混合物在环境温度抑制非特异性核酸扩增和/或非特异性产物形成，持续至少24小时。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物相较于仅具有单个热启动机制的热启动反应混合物，使非特异性扩增和/或非特异性产物形成减少约20-100％。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物使非特异性扩增和/或非特异性产物形成减少约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物相较于仅具有单个热启动机制的反应混合物，使非特异性产物形成减少至约1/2至1/4。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物使非特异性产物形成减少至约1/2、2/5、1/3、2/7或1/4。

在某些实施方案中，提供了包含热稳定性核酸聚合酶和双重热启动反应混合物的组合物，所述双重热启动反应混合物在低于约40℃的温度抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性，以便双重热启动反应混合物在高于约40℃的温度不实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。在某些实施方案中，核酸聚合酶可以是DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。在某些实施方案中，核酸聚合酶可以是热稳定性的。

在某些实施方案中，提供了抑制核酸聚合酶的聚合酶活性的方法。在某些实施方案中，这些方法包括将聚合酶与双重热启动反应混合物接触，其中双重热启动反应混合物在第一温度(例如，<40℃的温度)抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。聚合酶抑制可以是可逆的(例如，通过加热至高于所述第一温度的温度，通常地加热至至少约40℃的温度)。双重热启动反应混合物包含至少两个不同的热启动机制，所述热启动机制用于在第一温度(例如，环境温度)抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。这样的热启动机制包括但不限于在较低温度阻断DNA聚合酶活性的抗体或抗体的组合、在较低温度阻断DNA聚合酶活性的寡核苷酸、在升高的温度解离的DNA聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度提供降低的活性的DNA聚合酶的氨基酸修饰、包括超稳定DNA结合结构域和拓扑异构酶的融合蛋白、抑制DNA聚合酶的温度依赖性配体、在较低温度隔离引物的单链结合蛋白、修饰的引物或修饰的dNTP。在某些实施方案中，核酸聚合酶可以是DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。在某些实施方案中，核酸聚合酶可以是热稳定性的。

在某些实施方案中，提供了合成核酸分子的方法。这样的方法包括将模板核酸与组合物接触，所述组合物包含热稳定性核酸聚合酶、双重热启动反应混合物、一种或多种核苷和/或脱氧核苷三磷酸以及至少一种引物，其中双重热启动反应混合物在第一温度(例如，环境温度)抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性(相较于无双重热启动机制的反应混合物中的聚合酶活性)，将所得的混合物带到足以解除聚合酶抑制的更高温度，和聚合模板核酸。

在某些实施方案中，提供了使用双重热启动反应混合物减少非特异性荧光的方法。根据这样的方法，在适合于双重热启动反应混合物实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性的条件下将核酸聚合酶在第一温度与双重热启动反应混合物接触。当将所得的混合物加热至适当的第二温度时，双重热启动反应混合物停止对核酸聚合酶或核酸聚合酶活性的抑制。

在某些实施方案中，提供了用于使用双重热启动反应混合物减少非特异性荧光的方法。根据这样的方法，在第一温度形成反应组合物，所述组合物包含核酸聚合酶、双重热启动反应混合物、至少一种NTP或dNTP、靶核酸、至少一种引物和至少一种核酸结合染料。在某些实施方案中，至少一种引物包含引物对。在第一温度(例如，<40℃的温度，例如环境温度或室温)，双重热启动反应混合物抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。随后将反应组合物加热至第二反应温度，该温度使得双重热启动反应混合物恢复核酸聚合酶的活性。将反应组合物经历至少一个循环的扩增，并产生至少一种扩增子。可根据与扩增子结合的核酸结合染料的荧光，“实时”地或在扩增反应完成后检测双链扩增子。

在某些实施方案中，提供了用于使用双重热启动反应混合物扩增靶核酸的方法。根据某些这样的方法，在第一温度形成反应组合物，所述组合物包含核酸聚合酶、双重热启动反应混合物、至少一种NTP或dNTP、靶核酸、至少一种引物和至少一种核酸结合染料。在某些实施方案中，至少一种引物包含引物对。在第一温度，双重热启动反应混合物抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。随后将反应组合物加热至第二反应温度，所述温度使双重热启动反应混合物停止抑制核酸聚合酶或核酸聚合酶活性。将反应组合物经历至少一个循环的扩增，并产生多个扩增子。可根据与扩增子结合的核酸结合染料的荧光，“实时”地或在扩增反应完成后检测双链扩增子。

在某些实施方案中，还提供了用于进行某些本发明的方法的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包括双重热启动反应混合物。在某些实施方案中，试剂盒还包括至少一种核酸聚合酶。在某些实施方案中，试剂盒还包括下列的一种或多种：至少一种引物或引物对、核酸结合染料、报告探针和逆转录酶。

本文中提供了本发明的这些和其它特性。

附图概述

图1：单独的Fast

Green预混合物(“方块”线)、单独的

Green qPCR预混合物(“十字形”线)与以1:1的比率与

Green qPCR预混合物组合的Fast

Green预混合物(“三角形”线)的比较。A：在室温预温育0h(“T0”)的cDNA的扩增；B：T0时的NTC(非特异性产物)的扩增；C：在室温预温育24h(“T24”)的cDNA的扩增；和D：T24时的NTC的扩增。

图2：单独地或组合地使用Fast

Green预混合物和

Green qPCR预混合物的核酸扩增。A：T0时的A2M cDNA和NTC的解链曲线分析；B：T24时的A2McDNA和NTC的解链曲线分析；C：T0时的COL1A1cDNA和NTC的解链曲线分析；D：T24时的COL1A1cDNA和NTC的解链曲线分析；E：针对单独的或组合的Fast

Green预混合物和

Green qPCR预混合物的平均Ct和ΔCt的比较；F：单独的或组合的Fast

Green预混合物和

Green qPCR预混合物的解链曲线分析。

图3：单独的Fast

Green预混合物(“菱形”线)与Fast

Green预混合物与

Taq抗体的组合(“十字形”线)的比较。A：T0时的cDNA的扩增；B：T0时的NTC的扩增；C：T24时的cDNA的扩增；和D：T24时的NTC的扩增。

图4：单独地或组合地使用Fast

Green预混合物和

Taq抗体的核酸扩增。A：在T0和T24时单独使用Fast

Green预混合物进行的A2M的解链曲线分析；B：在T0和T24时使用Fast

Green预混合物与

Taq抗体的组合进行的A2M的解链曲线分析；C：单独的或组合的Fast

Green预混合物和

Taq抗体的解链曲线分析。

图5：单独的Power

Green PCR预混合物(“菱形”线)与Power

Green PCR Mix与

图6：单独地或组合地使用Power

Green PCR预混合物和

Taq抗体的核酸扩增。A：在T0和T24时单独使用Power

Green PCR预混合物进行的A2M的解链曲线分析；B：在T0和T24时使用Power

Green PCR预混合物和

Taq抗体进行的A2M的解链曲线分析；C：单独的或组合的Power

Green PCR预混合物和

Taq抗体的解链曲线分析。

详述

在某些实施方案中，提供了包含核酸聚合酶和双重热启动反应混合物的组合物，所述双重热启动反应混合物在第一温度(例如，<40℃的温度)抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。在一些实施方案中，双重热启动反应混合物包含至少两个不同的热启动机制，所述热启动机制用于在第一(例如，较低的)温度抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。这样的热启动机制可包括例如但不限于在较低温度阻断DNA聚合酶活性的抗体或抗体的组合、在较低温度阻断DNA聚合酶活性的寡核苷酸、在升高的温度解离的DNA聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度提供降低的活性的DNA聚合酶的氨基酸修饰、包括超稳定DNA结合结构域和拓扑异构酶的融合蛋白、抑制DNA聚合酶的温度依赖性配体、在较低温度隔离引物的单链结合蛋白、修饰的引物或修饰的dNTP。

在某些实施方案中，提供了用于抑制核酸聚合酶的聚合酶活性的方法。这些方法包括将聚合酶与双重热启动反应混合物接触，其中双重热启动反应混合物在第一温度(例如，<40℃的温度)抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。聚合酶抑制可以是可逆的(例如，通过加热至至少约40℃的第二温度)。双重热启动反应混合物包含至少两个不同的热启动机制，所述热启动机制用于在第一温度抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。这样的热启动机制包括但不限于在较低温度阻断DNA聚合酶活性的抗体或抗体的组合、在较低温度阻断DNA聚合酶活性的寡核苷酸、在升高的温度解离的DNA聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度提供降低的活性的DNA聚合酶的氨基酸修饰、包括超稳定DNA结合结构域和拓扑异构酶的融合蛋白、抑制DNA聚合酶的温度依赖性配体、在较低温度隔离引物的单链结合蛋白、修饰的引物或修饰的dNTP。在某些实施方案中，核酸聚合酶可以是DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。在某些实施方案中，核酸聚合酶可以是热稳定性的。

在某些实施方案中，提供了用于合成核酸分子的方法。这样的方法包括将模板核酸与组合物接触，所述组合物包含热稳定性核酸聚合酶、双重热启动反应混合物、一种或多种核苷和/或脱氧核苷三磷酸和至少一种引物，其中双重热启动反应混合物在第一温度抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性，将所得的混合物带到足以解除聚合酶抑制的第二温度，和聚合模板核酸。在一些实施方案中，第一温度为环境温度(例如，室温)。在某些实施方案中，核酸聚合酶可以是DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。在某些实施方案中，核酸聚合酶可以是热稳定性的。

在某些实施方案中，提供了用于防止或减少错误引发事件的方法，该方法包括双重热启动反应混合物。根据这样的方法，在适合于双重热启动反应混合物实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性的条件下将核酸聚合酶在第一温度与双重热启动反应混合物接触。当将所得的混合物加热至适当的第二温度时，双重热启动机制停止抑制聚合酶或聚合酶活性，从而使引物延伸得以进行。

在某些实施方案中，提供了用于减少非特异性扩增产物形成的方法，该方法包括双重热启动反应混合物。根据这样的方法，将靶核酸与核酸聚合酶、双重热启动反应混合物、至少一种引物和至少一种dNTP接触。在某些实施方案中，至少一种引物包含引物对。在第一温度，双重热启动反应混合物抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。随后将反应组合物加热至第二温度，所述温度阻止双重热启动反应抑制核酸聚合酶。随后将反应组合物中的靶核酸经历至少一个循环的扩增。在某些实施方案中，核酸聚合酶是热稳定性的。在某些其它实施方案中，核酸聚合酶为DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。例如，核酸聚合酶可选自但不限于Taq DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tfi DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Vent^TM DNA聚合酶。在一些其它实施方案中，双重热启动反应混合物包含至少2个不同的热启动机制。在一些实施方案中，所述至少2个不同的热启动机制可选自在较低温度阻断DNA聚合酶活性的抗体或抗体的组合、在较低温度阻断DNA聚合酶活性的寡核苷酸、在升高的温度解离的DNA聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度提供降低的活性的DNA聚合酶的氨基酸修饰、包括超稳定DNA结合结构域和拓扑异构酶的融合蛋白、抑制DNA聚合酶的温度依赖性配体、在较低温度隔离引物的单链结合蛋白、修饰的引物或修饰的dNTP。

在某些实施方案中，双重热启动反应混合物相较于常规热启动机制，提供了增强的对非特异性核酸扩增和/或非特异性产物形成的抑制。在其它实施方案中，双重热启动反应混合物相较于常规热启动机制，在延长的时期内抑制非特异性核酸扩增和/或非特异性产物形成。例如，在一些实施方案中，双重热启动反应混合物在环境温度抑制非特异性核酸扩增和/或非特异性产物形成，持续至少24小时。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物相较于仅具有单个热启动机制的热启动反应混合物，使非特异性扩增和/或非特异性产物形成减少约20-100％。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物使非特异性扩增和/或非特异性产物形成减少约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物相较于仅具有单个热启动机制的反应混合物，使非特异性产物形成减少至约1/2至1/4。在某些实施方案中，双重热启动反应混合物使非特异性产物形成减少至约1/2、2/5、1/3、2/7或1/4。

在某些实施方案中，提供了用于减少非特异性荧光的方法，所述方法包括双重热启动反应混合物。根据这样的方法，在第一温度形成反应组合物，所述组合物包含核酸聚合酶、双重热启动反应混合物、至少一种NTP或dNTP、靶核酸、至少一种引物和至少一种核酸结合染料。在某些实施方案中，至少一种引物包含引物对。在第一温度，双重热启动反应混合物抑制或实质性抑制核酸聚合酶的聚合酶活性。随后将反应组合物加热至第二反应温度，该温度使得双重热启动反应混合物允许核酸聚合酶活性发生。将反应组合物经历至少一个循环的扩增，并产生多个扩增子。可根据与扩增子结合的核酸结合染料的荧光，“实时”地或在扩增反应完成后检测双链扩增子。

为了更清楚和简明地描述和指出本公开内容的主题，对于特定术语提供下列定义，所述术语用于下列描述和所附权利要求。在整个说明书中，特定术语的例证应当被当作非限制性实例。

如本说明书中所用的，除非另外明确地指出，否则单词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”意指至少一个/一种。在本说明书中，除非另外明确地指出，否则单数的使用包括复数。例如，但不限于，“一个/一种靶核酸”意指可存在超过一个/一种靶核酸；例如，一个或多个拷贝的特定靶核酸种类，以及两个或更多个不同种类的靶核酸。术语“和/或”意指斜杠之前和之后的术语可被一起采用或分开采用。为了举例说明目的，但非作为限制，“X和/或Y”可意指“X”或“Y”或“X”和“Y”。

应理解，在本公开内容中论述的温度、浓度、时间等之前存在隐含的“大约”，以便轻微的和非实质性偏差在本文中的教导的范围之内。并且，“包含”、“包括”、“有”、“具有”、“含有”、“拥有”、“带有”和“容有” 的使用并非旨在是限制性的。应当理解，前面的一般性描述和详细描述都只是示例和说明性的，不是限制本教导。

除非在上述说明书中明确地指出，否则上述说明书中引述“包含”各种组分的实施方案也可被考虑为“由引述的组分组成”或“基本上由引述的组分组成”；说明书中引述“由各种组分组成”的实施方案也被考虑为“包含”引述的组分或“基本上由引述的组分组成”；以及说明书中引述“基本上由各种组分组成”的实施方案也被考虑为“由引述的组分组成”或“包含”引述的组分(该互换性不用于这些术语在权利要求中的使用)。

本文中使用的小节标题仅为了组织目的，而不被解释为以任何方式限制期望的主题。本说明书引用的所有文献，包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍和学术论文为了任何目的明确地通过引用整体并入本文。如果任何并入的文献与本说明书中定义的任何术语发生矛盾，则以本说明书为准。虽然结合各种实施方案描述了本教导，但本教导无意限定于这样的实施方案。相反地，本教导包括各种替代、变动和等同物，如由本领域普通技术人员所理解的。

如本文中所用，术语“扩增子”和“扩增产物”通常是指扩增反应的产物。扩增子可以是双链或单链的，并且可包括通过使双链扩增产物变性获得的分开的组成链。在某些实施方案中，一个扩增循环的扩增子可在随后的扩增循环中用作模板。

术语“退火”和“杂交”，包括但不限于根词“杂交”和“退火”的变型，可互换使用，并且意指一个核酸与另一核酸的核苷酸碱基配对相互作用，该作用导致双链体、三链体或其它高级结构的形成。初级相互作用通常是核苷酸碱基特异性的，例如通过Watson-Crick和Hoogsteen型氢键合，A:T、A:U和G:C。在某些实施方案中，碱基堆积和疏水相互作用也可促成双链体的稳定性。允许引物和探针对互补序列退火的条件在本领域是公知的，例如如Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,Hames和Higgins,eds.,IRLPress,Washington,D.C.(1985)以及Wetmur和Davidson,Mol.Biol.31:349(1968)中描述的。

一般地，这样的退火是否发生，除其它以外，受如下因素影响：引物与它们在靶侧翼序列和/或扩增子中的相应结合位点的互补部分的互补部分长度，或报告探针与其结合位点的相应互补部分的长度；pH值；温度；单价和二价阳离子的存在；G和C核苷酸在杂交区域的比例；介质的粘度；以及变性剂的存在。这样的变量影响杂交所需的时间。因此，优选的退火条件将取决于具体应用。然而，这样的条件可由本领域的普通技术人员常规地确定而无需过多实验。优选地，选择退火条件来使引物和/或探针能够选择性地与相应的靶侧翼序列或扩增子中的互补序列杂交，但在第二反应温度对反应组合物中的不同靶核酸或非靶序列不杂交至任何显著程度。

术语“选择性杂交”及其变型意指在适当的严格度条件下，给定的序列(例如，但不限于引物)与包含互补核苷酸串的第二序列(例如但不限于靶侧翼序列，或扩增子的引物结合位点)退火，但不与非期望的序列例如非靶核酸、探针或其它引物退火。通常情况下，随着反应温度朝向特定双链序列的解链温度升高，选择性杂交的相对量通常增加并且错误引发通常减少。在本说明书中，一个序列与另一序列杂交或选择性杂交的陈述包括其中两个序列的整体彼此杂交或选择性杂交的情况，和其中仅一个或两个序列的一部分与整个的另一序列或另一序列的一部分杂交或选择性杂交的情况。

如本文中所用，术语“严格度”用于定义其中将形成包含两个互补核苷酸序列的杂交体的杂交和随后的处理步骤过程中存在的温度和溶剂组成。严格度还定义了两个核苷酸序列之间形成的杂交体的稳定性、同源性的量以及必需的条件。随着严格度条件增强，选择性杂交变得有利，并且非特异性交叉杂交变得不利。增强的严格度条件通常对应于相对于更可能发生错误引发的较低严格度条件，更高的温育温度、更低的盐浓度和/或更高的pH值。本领域技术人员理解，使得引物或引物对能够对相应的靶侧翼序列和/或扩增子进行选择性杂交的适当的严格度条件可使用公知的技术来常规确定，并且无需过度实验(参见，例如，PCR:The Basics from Background to Bench,McPherson and Moller,BiosScientific Publishers,2000)。

如本文中所用，“实质性抑制”聚合酶活性的双重热启动反应混合物或机制是指提供低于约30％、低于约25％、低于约20％，更优选低于约15％、低于约10％、低于约7.5％或低于约5％，最优选低于约5％、低于约2％、低于约1％、低于约0.5％、低于约0.25％的聚合酶活性或完全缺乏聚合酶活性的反应混合物。如本文中所用，被“实质性抑制”的聚合酶活性是指在所述热启动机制或热启动反应混合物存在的情况被抑制至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、99.75％、100％或>100％的聚合酶活性。

如本文中所用，术语“或其组合”是指该术语之前所列项的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC的至少一个，并且如果顺序在特定上下文中是重要的话，还包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。继续以该实例为例，明确地包括的是包含一个或多个条目或项的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。除非根据上下文是很明显地另有所指，否则本领域普通技术人员将理解通常在任何组合中对条目或项的数目没有限制。

如本文中所用，术语“使变性”和“变性”是指其中视情况而定，将双链多核苷酸(包括但不限于，包含至少一个靶核酸的基因组DNA(gDNA的)片段、双链扩增子或包含至少一个双链区段的多核苷酸)转化成两个单链多核苷酸，或单链或大体上单链的多核苷酸的任何过程。使双链多核苷酸变性包括但不限于各种热和化学技术，所述技术使得双链核酸变成单链或大体上单链，例如但不限于释放双链多核苷酸或包含两个寡核苷酸的双链体的两个单独的单链组分。本领域普通技术人员将理解，所用的变性技术通常不是限制性的，除非其严重干扰扩增反应的后续退火或酶促步骤，或在某些方法中，荧光信号的检测。

如本文中所用，术语“Tm”用于指解链温度。解链温度是双链核酸分子群体的一半解离成单链时所处的温度。

如本文中所用，术语“小沟结合剂”是指适应(有时以序列特异性的方式)双链DNA的小沟的小分子。一般而言，小沟结合剂是长的扁平的分子，其可采取新月样形状，从而刚好紧密地放进双螺旋的小沟中，通常置换水。小沟结合分子通常包含数个通过具有扭转自由度的键连接的芳香环，例如但不限于呋喃、苯或吡咯环。

如本文中所用，“错误引发”或“错误引发的”是指引物或探针与非靶核酸的杂交。如在本领域中已知的，引物(不包括随机引物)通常被设计来与侧翼连接靶核酸的经选择的序列或扩增子的引物结合位点杂交并指导始于该位点的DNA合成或引物延伸。当引物或探针与非靶核酸杂交(通常在低的或降低的严格度条件下)，并随后用作引物从该非靶位点延伸的起始点时，可发生错误引发，从而导致某些非期望的第二扩增产物的合成。

术语“非特异性”或“本底”，当用于指荧光时，是指从与除期望的扩增子外的双链核酸结合的核酸结合染料分子发射的可检测信号。期望的扩增子包含靶核酸的扩增产物，在一些实施方案中，包括为了(除其它以外)标准化和/或定量目的而可包含在本教导的某些反应组合物中的内标准或对照序列。因此，因核酸染料分子与假性第二扩增子结合(通常因错误引发、错误连接和/或引物二聚体形成而产生)而引起的荧光信号，为非特异性荧光的一个来源。

如本文中所用，术语“核酸结合染料”是指荧光分子，所述荧光分子对于双链多核苷酸是特异性的，或当与双链多核苷酸结合时至少显示比与单链多核苷酸结合时显著更大的荧光增强。通常情况下，核酸结合染料分子通过插入双链区段的碱基对之间但结合在双链区段的大沟或小沟或两者之中来与多核苷酸的双链区段结合。核酸结合染料的非限制性实例包括溴化乙锭、DAPI、Hoechst衍生物(包括但不限于Hoechst 33258和Hoechst33342)、包含镧系元素螯合剂的嵌合剂(例如，但不限于具有两个荧光四配位基β-二酮基-Eu³⁺螯合剂的萘二酰亚胺(NDI-(BHHCT-Eu³⁺)₂)，参见例如，Nojima等人,Nucl.Acids Res.Suppl.No.1 105(2001)，以及某些不对称菁染料例如

Green和

如本文中所用，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用并且是指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括但不限于，通过核苷酸间磷酸二酯键连接或核苷酸间类似物以及相关的平衡离子例如H⁺、NH₄ ⁺、三烷基铵、Mg²⁺、Na⁺等连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。多核苷酸可完全由脱氧核糖核苷酸，完全由核糖核苷酸，或由其嵌合混合物组成，并且可以包括核苷酸类似物。核苷酸单体单位可包括本文中描述的任何核苷酸，包括但不限于核苷酸和/或核苷酸类似物。多核苷酸在大小上通常在数个单体单位(例如，5-40个，此时它们有时在本领域中被称为寡核苷酸)至数千个单体核苷酸单位的范围内。除非另有所指，否则每当显示多核苷酸序列时，应理解，除非另有所指，否则核苷酸按5'至3'顺序从左至右排列，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”的表示脱氧鸟苷，“T”表示脱氧胸苷，“U”表示脱氧尿苷。

术语“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，例如三磷酸酯，其中最常见的酯化位点是在戊糖的C-5位置上连接的羟基。

术语“核苷”是指由在1'位连接于戊糖的嘌呤、脱氮嘌呤或嘧啶核苷碱基例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、脱氮腺嘌呤、脱氮鸟苷等组成的化合物，包括2'-脱氧和2'-羟基形式。当核苷碱基是嘌呤或7-脱氮嘌呤时，戊糖在嘌呤或脱氮嘌呤的9-位上连接于核碱基，当核碱基是嘧啶时，戊糖在嘧啶的1-位上连接于核碱基。

术语“类似物”包括具有修饰的碱基部分、修饰的糖部分和/或修饰的磷酸酯部分的合成类似物。磷酸盐类似物一般包括这样的磷酸盐的类似物，其中磷原子处于+5氧化态并且一个或多个氧原子被替换为非氧部分，例如硫。示例性磷酸盐类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯、硼磷酸盐，包括相关的平衡离子，例如H⁺、NH₄ ⁺、Na⁺。示例性碱类似物包括：2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、C-5－丙炔、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-硫代嘧啶。示例性糖类似物包括：2'-或3'-修饰，其中2'-或3'-位是氢、羟基、烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基和苯氧基、叠氮基、氨基或烷基氨基、氟、氯和溴。

如本文中所用，术语“反应容器”通常是指其中可按照本教导进行反应的任何容器、室、设备或装置。在一些实施方案中，反应容器可以是微型管，例如但不限于0.2mL或0.5mL反应管例如

Optical管(Life Technologies Corp.,Carslbad,CA)或微量离心管，或诸如在分子生物学实验室中通常使用的其它容器。在一些实施方案中，反应容器包括多孔板的孔、载玻片上的点或微流体装置的通道或室，包括但不限于

低密度阵列或

Open Array实时PCR板(两者都来自LifeTechnologies Corp.)。例如，但非作为限制，多个反应容器可存在于同一支持物上。在一些实施方案中，可以例如从Caliper,Fluidigm和Life Technologies Corp.获得的芯片样实验室装置(lab-on-a-chip-like device)，包括Ion 316^TM和Ion 318^TM芯片，可在本文公开的方法中用作反应容器。应承认，多种反应容器是商购可得的或可被设计用于本教导的背景中。

如本文中所用，术语“热启动”通常指当将反应混合物维持在第一温度(通常较低的温度)时限制必需反应组分(例如，聚合酶)的可用度直到达到允许必需组分参与反应的第二温度(通常地较高的温度)的方法。热启动反应通常包括在第一(例如，较低的)温度温育，和随后升高至允许期望的反应发生的第二(例如，较高的)温度。热启动反应的活化优选通过在等于或高于用于扩增反应的引物杂交(退火)温度下的温育来实现，以确保引物结合特异性。恢复酶活性所需的温育长度取决于反应混合物的温度和pH以及酶的稳定性。许多的温育条件是可用的；每一个反应的最佳条件可凭经验来确定。一般而言，在第一温度温育双重热启动反应混合物以抑制核酸合成(例如，聚合酶活性)，随后升高至第二温度以解除或停止抑制。未举例说明的核酸聚合酶的再活化的温育条件或未举例说明的反应混合物的温育条件的最优化可按照本文中提供的指导通过常规实验来确定。

在某些实施方案中，第一温度低于所述第二温度。在一些实施方案中，第一温度<40℃。在某些实施方案中，第一温度大致等于或低于约40℃,35℃,30℃,25℃,20℃,15℃,10℃,5℃或更低。在一些实施方案中，第一温度为环境温度。在一些其它实施方案中，第一温度为室温。在一些实施方案中，第二温度>40℃。在某些实施方案中，第一温度大致等于或高于约40℃、45℃、50℃、55℃、60、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃或更高。存在几个方法用于进行热启动反应，包括但不限于手工技术、屏障的使用、一个或多个必需反应组分的化学修饰和/或结构修饰。用于这样的热启动方法的适合的反应条件在本领域中是已知的，并且进一步描述于本文中和实施例中。

如本文中所用，术语“双重热启动反应混合物”是指用于在达到扩增反应(例如，PCR)中的初始变性温度的热启动条件之前，在低温(例如，环境温度)阻断核酸聚合酶延伸的试剂或试剂溶液的组合。在升高的扩增温度，核酸聚合酶不再受抑制并允许引物延伸。如本文中所用，双重热启动反应混合物意指包含含有至少两个不同的用于热启动的机制的反应混合物。因此，“双重热启动反应混合物”可包括超过两个热启动机制(例如，“三重热启动反应混合物”、“四重热启动反应混合物”、“五重热启动反应混合物”等)。可能的热启动机制可包括但不限于在较低温度阻断核酸聚合酶活性并且在升高的温度下与聚合酶解离的抗体或抗体的组合(参见，例如，Eastlund等人,LifeSci.Quarterly 2:2(2001),Mizuguchi等人,J.Biochem.(Tokyo)126:762(1999))；在较低温度阻断核酸聚合酶活性并且在升高的温度下与聚合酶解离的寡核苷酸(参见，例如，Dang等人,J.Mol.Biol.264:268(1996))；使得核酸聚合酶活性在较低温度被阻断并且在升高的温度下修饰逆转或解离的核酸聚合酶的可逆化学修饰(参见，例如，美国专利No.5,773,258和Moretti等人,Biotechniques25:716(1998))；在较低温度提供降低的活性的核酸聚合酶的氨基酸突变(参见，例如，Kermekchiev等人,Nucl.AcidsRes.31:6139(2003))；包括超稳定DNA结合结构域和拓扑异构酶的核酸聚合酶融合蛋白(参见，例如，Pavlov等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:13510(2002))；以温度依赖性方式抑制核酸聚合酶的配体(例如，来自Eppendorf(Hauppauge,NY)和5PRIME(Gaithersburg,MD)的HotMaster^TM Taq DNA聚合酶)；在低温隔离引物的单链结合蛋白(参见，例如，美国专利申请公开No.2008/0138878)；在升高的温度水解无机焦磷酸盐的热稳定性焦磷酸酶(参见，例如，美国专利申请公开No.2006/0057617)；不耐热的阻断剂，例如聚合酶阻断蛋白(参见，例如，美国专利申请公开No.2007/0009922)；引物竞争剂序列(参见，例如，Puskas等人,Genome Res.5:309(1995)和Vestheim等人,Front.Zool.5:12(2008))；修饰的引物构建体(参见，例如，Ailenberg等人,Biotechniques 29:22(2000)和Kaboev等人,Nucl.AcidsRes.28:E94(2000))；提高杂交选择性的修饰引物(参见，例如，美国专利No.6,794,142和6,001,611)；具有可通过3’-5’外切核酸酶活性移除的3’修饰的引物(参见，例如，美国专利申请公开No.2003/0119150和美国专利No.6,482,590)；具有可通过紫外辐射移除的修饰核碱基的引物(参见，例如，Young等人,Chem.Commun.(Camb)28:462(2008))；可通过热脱保护移除的引物修饰(参见，例如，美国专利申请公开No.2003/0162199和Lebedev等人,Nucl.Acids Res.36:e131(2008))；或利用不耐热的修饰基团的dNTP的修饰(参见，例如，美国专利申请公开No.2003/0162199和Koukhareva等人,Nucl.Acids Symp.Ser.(Oxford),259(2008))。本文中引用的所有参考资料为了所有目的在此通过引用并入。

如本文中所用，包含“至少两个不同的机制”的双重热启动反应混合物包括可包含至少两个功能相似或使用相似组分的不同热启动机制的那些反应混合物。例如，双重热启动反应混合物可包含这样的试剂或试剂溶液，其被设计用于两个不同的基于抗体的热启动机制或两个不同的基于寡核苷酸的热启动机制，或一个基于抗体和一个基于寡核苷酸的热启动机制，或一个基于抗体和一个基于化学修饰的热启动机制，或可获得的任何这样的组合。

术语“报告基团”在本文中以广义使用，并且是指任何可鉴定的标签、标记或部分。

术语“靶核酸”或“靶”是指使用本教导的组合物、方法和试剂盒进行特异性扩增和/或检测的核酸序列(与第二扩增产物相反，所述第二扩增产物是通常因错误引发而产生的假性副反应的结果)。在某些实施方案中，靶核酸用作引物延伸反应中的模板。在一些实施方案中，靶核酸用作扩增模板。在一些实施方案中，靶核酸在核酸切割结构中用作模板链。在某些实施方案中，靶核酸包含DNA并且存在于基因组DNA(gDNA)或线粒体DNA(mtDNA)中。在某些实施方案中，靶核酸包含RNA，例如但不限于核糖体RNA(rRNA)、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)或RNA分子例如micro RNA(miRNA)前体，包括但不限于pri-miRNA、pre-miRNA或pri-miRNA和pre-miRNA。在一些实施方案中，靶核酸包含小RNA分子，包括但不限于miRNA、sRNA、stRNA、snoRNA或其它ncRNA。靶核酸不必构成整个核酸分子。例如，但非限制性地，大的核酸例如gDNA片段，可包含多个不同靶核酸。通常情况下，靶核酸具有至少一个确定的末端。在许多核酸扩增反应中，核酸靶具有两个确定的末端。

术语“热稳定性的”，当用于指酶时，是指对加热失活具有抗性的酶(例如具有核酸聚合酶活性的多肽)。“热稳定性的”酶与可通过热处理失活的“不耐热的”聚合酶相反,。不耐热蛋白可在生理温度被灭活，并且可被分类为中等热稳定性的(在约45℃至约65℃失活)和热稳定性的(在高于约65℃失活)。例如，不耐热的T5和T7DNA聚合酶的活性可通过将酶暴露于约90℃的温度持续约30秒来进行完全失活。热稳定性聚合酶活性比不耐热的聚合酶更加抗热失活。然而，热稳定性聚合酶无意指对热失活具有完全抗性的酶；因此热处理可使聚合酶活性降低一定程度。热稳定性聚合酶通常还具有比不耐热的DNA聚合酶更高的最适温度。

工作浓度是指处于或接近用于溶液中以进行特定功能(例如核酸分子的扩增或消化)的最适浓度的试剂的浓度。试剂的工作浓度还等同地描述为试剂的“1×浓度”或“1×溶液”(如果试剂在溶液中的话)。因此，还可基于工作浓度描述试剂的更高浓度；例如，试剂的“2×浓度”或“2×溶液”被定义为高至试剂的工作浓度的2倍的浓度或溶液；“5×浓度”或“5×溶液”高至工作浓度的5倍等。

如本文中所用，“核酸聚合酶”是指催化核苷酸的聚合的酶。一般而言，酶将在与核酸模板序列退火的引物的3′末端起始合成，并且将朝向模板链的5′末端进行。如本文中所用，“DNA聚合酶”通常是指可通过以模板依赖性方式催化脱氧核苷酸、二脱氧核糖核苷酸和/或某些核苷酸类似物的聚合的添加来催化杂交的引物的5’至3’延伸的任何多肽。例如，但不限于，在引物延伸反应期间脱氧核糖核苷酸至与核酸模板退火的引物的3’末端的连续添加。DNA聚合酶的非限定性实例包括RNA依赖性DNA聚合酶，包括但不限于逆转录酶，和DNA依赖性DNA聚合酶。已知的DNA聚合酶包括例如激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶(Lundberg等人,1991,Gene,108:1)、大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I(Lecomte和Doubleday,1983,Nucleic Acids Res.11:7505)、T7DNA聚合酶(Nordstrom等人,1981,J.Biol.Chem.256:3112)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶(Myers和Gelfand 1991,Biochemistry 30:7661)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶(Stenesh和McGowan,1977,Biochim Biophys Acta 475:32)、嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)(Tli)DNA聚合酶(也称为Vent DNA聚合酶,Cariello等人,1991,Nucleic Acids Res,19:4193)、9°Nm DNA聚合酶(来自New EnglandBiolabs的停产产品)、喜温海洋杆菌(Thermotoga maritima)(Tma)DNA聚合酶(Diaz和Sabino,1998Braz J.Med.Res,31:1239)、栖热水生菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶(Chien等人,1976,J.Bacteoriol,127:1550)、Pyrococcus kodakaraensis KOD DNA聚合酶(Takagi等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:4504)、JDF-3DNA聚合酶(专利申请WO0132887)和焦球菌属(Pyrococcus)GB-D(PGB-D)DNA聚合酶(Juncosa-Ginesta等人,1994,Biotechniques,16:820)。上述酶的任一种的聚合酶活性可通过本领域中公知的方法来测定。根据本发明，一个单位的DNA聚合酶活性被定义为在最适温度(例如，对于Pfu DNA聚合酶，72℃)于30分钟内催化10纳摩尔的总dNTP至聚合物形式的掺入的酶的量。应理解，某些DNA聚合酶(例如，但不限于某些真细菌的A型DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶)还可包含结构特异性核酸酶活性。适合用于本发明的实践的逆转录酶在本领域内也是公知的，并且可来源于许多来源。这样的酶包括但不限于M-MLV、HIV、ASLV及其变体和突变体。

如本文中所用，术语“扩增”、“核酸扩增”或“扩增的”是指多个拷贝的核酸模板的产生，或多个与核酸模板互补的核酸序列拷贝的产生。术语(包括术语“聚合”)还可指延伸核酸模板(例如，通过聚合)。扩增反应可以是聚合酶介导的延伸反应例如，聚合酶链式反应(PCR)。然而，任何已知的扩增反应可适合于本文中描述的用途。通常指靶核酸的“指数”增加的术语“扩增”可在本文中用于描述核酸的选择靶序列的数目的线性和指数增加。

术语“扩增反应混合物”和/或“预混合物”可指包含用于扩增靶核酸的各种(一些或全部)试剂的水溶液。这样的反应还可使用固体支持物(例如，阵列)来进行。还可按用户所期望的，以单重或多重形式进行反应。这些反应通常包括酶、含水缓冲液、盐、扩增引物、靶核酸和核苷三磷酸。取决于上下文，混合物可以是完全或不完全的扩增反应混合物。用于扩增靶核酸的方法对于本领域技术人员是可任意获得的。可使用用于增加核酸的靶序列的拷贝的任何体外方法。这些方法包括线性、对数和/或任何其它扩增法。虽然本公开内容可总体地将PCR论述为核酸扩增反应，但预期本文中描述的修饰的去垢剂在其它类型的核酸扩增反应中应当是有效的，所述其它类型的核酸扩增反应包括聚合酶介导的扩增反应(例如解螺旋酶依赖性扩增(HDA)、重组酶-聚合酶扩增(RPA)和滚环扩增(RCA))，以及连接酶介导的扩增反应(例如连接酶检测反应(LDR)、连接酶链式反应(LCR)以及每一种的缺口形式(gap-version)),以及核酸扩增反应的组合例如LDR和PCR(参见，例如，美国专利6,797,470)。例如，修饰的去垢剂可用于例如各种连接介导的反应，其中例如与PCR引物相反，使用连接探针。另外的示例性方法包括聚合酶链式反应(PCR；参见，例如，美国专利No.4,683,202；4,683,195；4,965,188和/或5,035,996)、等温程序(使用一种或多种RNA聚合酶(参见，例如，PCT公开No.WO 2006/081222)、链置换(参见，例如，美国专利No.RE39007E)、引物分子的部分破坏(参见，例如，PCT公开No.WO 2006/087574))、连接酶链式反应(LCR)(参见，例如，Wu,等人,Genomics 4:560-569(1990))和/或Barany,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:189-193(1991))、QβRNA复制酶系统(参见，例如，PCT公开No.WO 1994/016108)、基于RNA转录的系统(例如，TAS、3SR)、滚环扩增(RCA)(参见，例如，美国专利No.5,854,033；美国专利申请公开No.2004/265897；Lizardi等人Nat.Genet.19:225-232(1998)；和/或Banér等人Nucleic Acid Res.,26:5073-5078(1998))和链置换扩增(SDA)(Little,等人Clin.Chem.45:777-784(1999))等等。这些系统与许多对于本领域技术人员是可获得的其它系统一起可适合用于聚合和/或扩增用于本文中描述的用途的靶核酸。

“扩增效率”可指可被定量以测定拷贝数的任何产物(例如，术语可指PCR扩增子、LCR连接产物和/或类似产物)。扩增和/或聚合效率可通过本领域中已知的各种方法来测定，所述方法包括但不限于校准稀释曲线的测定和斜率计算、使用如Hellemans等人,Genome Biology 8:R19(2007)中描述的qBase软件的测定、使用由Livak和Schmittgen,Methods 25:402(2001)描述的delta delta Cq(ΔΔCq)计算的测定，或通过由Pfaffl,Nucl.Acids Res.29:e45(2001)描述的方法，所有上述参考资料在此通过引用整体并入本文。

一般而言，PCR热循环包括在高温进行的初始变性步骤，随后是一系列重复的温度循环，所述温度循环被设计来使得能够进行模板变性、引物退火和利用聚合酶进行退火引物的延伸。一般而言，最开始将样品在约95℃的温度加热约2至10分钟，以使双链DNA样品变性。随后，在每一个循环的开始，取决于样品和使用的仪器类型，使样品变性约10至60秒。变性后，在约40℃至约60℃的较低温度下使引物对靶DNA退火，持续约20至60秒。通常在约60℃至约72℃的范围内的温度进行聚合酶对引物的延伸。用于延伸的时间的量取决于扩增子的大小和用于扩增的酶的类型，并且可通过常规实验来容易地确定。此外，可将退火步骤与延伸步骤组合，从而导致两步骤循环。热循环还可包括PCR测定中另外的温度变动。测定中使用的循环数取决于许多因素，包括使用的引物、存在的样品DNA的量和热循环条件。待用于任何测定的循环数可由本领域变通技术人员使用常规实验来容易地确定。任选地，在完成热循环后可添加终延伸步骤以确保所有扩增产物的合成。

可在“标准”PCR仪例如Applied Biosystems 7900HT、7500和7300标准PCR系统上或在“快速”PCR仪例如Applied Biosystems StepOne^TM、StepOne Plus^TM、7500和7900HTFast实时PCR系统或ViiA^TM 7或QuantStudio^TM 12K Flex实时PCR系统上进行利用本文公开的组合物的PCR。

在一些实施方案中，用于使用本文中公开的组合物和方法进行PCR扩增的示例性热循环条件如下：

UNG步骤(任选的)：50℃持续2分钟

活化：95℃持续2分钟

变性：95-97℃持续15秒

退火/延伸：60-62℃持续1分钟(×40个循环)

在一些实施方案中，用于使用本中公开的组合物和方法进行PCR扩增的示例性热循环条件如下：

UNG步骤(任选的)：50℃持续2分钟

活化：95℃持续2分钟

变性：95-97℃持续15秒

退火：55-60℃持续15秒

延伸：72℃持续1分钟(×多至40个循环)

在一些实施方案中，本文中公开的组合物用于快速PCR热循环。在一个实施方案中，用于使用本中公开的组合物和方法进行PCR扩增的快速热循环条件如下：

UNG步骤(任选的)：50℃持续2分钟

活化：95℃持续2分钟

变性：95-97℃持续1-3秒

延伸：60-62℃持续20-30秒(×多至40个循环)

在一些实施方案中，当进行快速PCR热循环时，推荐约400nM的引物浓度。

在某些实施方案中，扩增技术包括至少1个扩增循环，例如，但不限于如下步骤：使双链核酸变性以分离组成链；将引物与靶侧翼序列或扩增子的引物结合位点(或视情况而定，任一个的互补序列)杂交；和使用DNA聚合酶以模板依赖性方式合成核苷酸的链。可以重复或可以不重复循环。在某些实施方案中，扩增循环包括多个扩增循环，例如但不限于20个循环、25个循环、30个循环、35个循环、40个循环、45个循环或超过45个循环的扩增。

在一些实施方案中，扩增包括使用仪器的热循环，所述仪器是例如但不限于

PCR系统9700、9600、2700或2400热循环仪、QuantStudio^TM 12K Flex实时PCR系统、Applied

ViiA^TM 7实时PCR系统、Applied

7500Fast实时PCR系统、7900HT Fast实时PCR系统等(全都可获自Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)。在某些实施方案中，在扩增反应例如但不限于不对称PCR或A-PCR中产生单链扩增子。

已开发了可利用包含核酸结合染料的反应组合物进行热循环反应和检测所述组合物的装置，通过发射指定波长的光束，读取从与双链核酸结合的核酸结合染料分子发射的荧光信号的强度，和在每一个循环后显示荧光的强度来进行所述检测。包括热循环仪、光束发射器和荧光信号检测器的装置已描述于例如美国专利No.5,928,907；6.015,674和6,174,670中，包括但不限于ABI

7700序列检测系统、

PCR系统9700、9600、2700或2400热循环仪、Applied

ViiA^TM 7实时PCR系统、Applied

7500Fast实时PCR系统、7900HT Fast实时PCR系统等(全部可获自LifeTechnologies Corp.,Carlsbad,CA)。

在一些实施方案中，扩增包括两步骤反应，包括但不限于预扩增步骤，其中进行有限循环次数的扩增(例如，但不限于2、3、4或5个循环的扩增)，随后通常将所得扩增子稀释，并将稀释的扩增子的一部分在随后的扩增步骤中经历另外的扩增循环(参见，例如，美国专利No.6,605,451和美国专利申请公开No.2004/0175733)。在一些实施方案中，预扩增步骤、随后的扩增步骤或两者包括双重热启动反应混合物。

在某些实施方案中，扩增反应包括多重扩增，其中使用多个不同的引物组同时扩增多个不同的靶核酸和/或多个不同的扩增产物种类。在某些实施方案中，平行地进行多重扩增反应和单重扩增反应，包括多个单重或较低重的反应(例如但不限于二重、三重、四重、五重或六重反应)。

用于聚合和/或扩增核酸的示例性方法包括例如聚合酶-介导的延伸反应。例如，聚合酶-介导的延伸反应可以是聚合酶链式反应(PCR)。在其它实施方案中，核酸扩增反应是多重反应。例如，用于聚合和/或扩增以及检测适合于本文中描述的用途的核酸的示例性方法可作为

商购获得(参见，例如，美国专利No.4,889,818；5,079,352；5,210,015；5,436,134；5,487,972；5,658,751；5,210,015；5,487,972；5,538,848；5,618,711；5,677,152；5,723,591；5,773,258；5,789,224；5,801,155；5,804,375；5,876,930；5,994,056；6,030,787；6,084,102；6,127,155；6,171,785；6,214,979；6,258,569；6,814,934；6,821,727；7,141,377；和/或7,445,900，其全部在此通过引用以其整体并入本文)。通常通过在靶多核苷酸上使用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶、能够与所述靶多核酸杂交的引物和寡核苷酸探针(其能够在相对于所述引物的3'与所述靶多核苷酸杂交)进行核酸扩增来进行

测定。寡核苷酸探针通常包含可检测标记(例如，荧光报告分子)和能够淬灭所述报告分子的荧光的淬灭分子。通常情况下，可检测标记和淬灭分子为单个探针的部分。随着扩增进行，聚合酶消化探针以将可检测标记与淬灭分子分离。在反应过程中监测可检测探针(例如，荧光)，其中标记的检测对应于核酸扩增的发生(例如，信号越强，扩增的量越多)。

测定的变型(例如，LNA^TM加标的(spiked)

测定)在本领域中是已知的，并且可适合用于本文中描述的方法。

适合用于本文中描述的用途的另一个示例性系统利用置换杂交(displacementhybridization)法(参见，例如，Morrison等人Anal.Biochem.,18:231-244(1989)；和/或Li,等人Nucleic Acids Res.,30(2,e5)(2002))中的双链探针。在这样的方法中，探针通常包括具有不同长度的两个互补寡核苷酸，其中一个包含可检测标记，另一个包含淬灭分子。当未结合于靶核酸时，淬灭剂抑制来自可检测标记的信号。在与靶核酸置换杂交后，探针变得可检测。可使用多种探针，每种探针包含不同的可检测标记，以便可在单个反应中查询多种靶核酸。

用于聚合和/或扩增以及检测适合于本文中描述的用途的靶核酸的另外的示例性方法包括“分子信标”，其为单链发夹形寡核苷酸探针。在靶序列存在的情况下，探针展开、结合并发射信号(例如，荧光)。分子信标通常包含至少4个组分：1)“环”，与靶序列互补的18-30个核苷酸的区域；2)在环的任一末端上发现的并且彼此互补的两个5-7个核苷酸的“茎”；3)可检测标记，在5’末端上；和4)淬灭部分，在3’末端上，当探针以封闭环形状(例如，不结合于靶核酸)存在时，其阻止可检测标记发射信号。因此，在互补靶存在的情况下，信标的"茎"部分分开，从而导致探针与靶杂交。其它类型的分子信标也是已知的，并且可适合用于本文中描述的方法。分子信标可用于多种测定系统。一个这样的系统是基于核酸序列的扩增(

)，其是用于将RNA聚合和/或扩增至双链DNA而无温度循环的单步骤等温过程。NASBA反应通常需要禽成髓细胞瘤病毒(AMV)、反转录酶(RT)、T7RNA聚合酶、RNA酶H和两个寡核苷酸引物。扩增后，可使用分子信标检测扩增的靶核酸。分子信标的其它用途在本领域中是已知的，并且可适合用于本文中描述的方法。

Scorpions^TM系统是可用于本文中描述的方法的另一个示例性测定形式。Scorpions^TM引物是双功能分子，其中引物与可检测标记(例如，荧光基团)和非可检测的淬灭部分(其淬灭可检测标记的荧光)一起共价连接于探针。在靶核酸存在的情况下，可检测标记与淬灭剂分离，这导致从可检测标记发射的信号增加。通常情况下，用于扩增反应的引物在5'末端包含探针元件以及在发夹环的起始处包含“PCR阻断”元件(例如，六乙二醇(HEG)单体(Whitcombe,等人Nat.Biotech.17:804-807(1999))。探针通常包含在一个末端上具有可检测标记和在另一个末端上具有淬灭剂的自身互补的茎序列。在初始扩增循环(例如，PCR)中，引物与靶杂交，并且因聚合酶的作用而进行延伸。Scorpions^TM系统可用于使用多个探针检查和鉴定点突变，所述探针可被差异地标记来区分探针。使用PCR为例，在完成一个延伸循环后，新合成的靶区域将连接于与探针相同的链。在第二变性和退火循环后，探针与靶杂交。随后发夹序列与新产生的PCR产物的部分杂交。这导致可检测标记与淬灭剂的分离，从而引发信号的发射。这样的标记探针的其它用途在本领域中是已知的，并且适合用于本文中描述的方法。

在一些实施方案中，在测序反应之前进行所述方法或与测序反应结合来进行所述方法。术语“测序”在本文中以广义使用，意指本领域中已知的允许多核苷酸(例如但不限于靶核酸或扩增子)的至少部分中的至少一些连续核苷酸的顺序被鉴定的任何技术。测序技术的一些非限制性实例包括Sanger的双脱氧终止子法以及Maxam和Gilbert的化学裂解方法，并包括这些方法的变型；通过杂交测序；通过合成测序；和限制性内切酶图谱法。一些测序方法包括电泳，包括毛细管电泳和凝胶电泳；通过杂交包括微阵列杂交进行的测序；质谱；单分子检测；和离子/质子检测。在一些实施方案中，测序包括直接测序、双重测序、循环测序、单碱基延伸测序(SBE)、固相测序或其组合。在一些实施方案中，测序包括使用仪器检测测序产物，所述仪器是例如但不限于ABI

377 DNA测序仪、ABI

310、3100、3100-Avant、3730或3730xl Genetic分析仪、ABI

3700DNA分析仪、Ion PGM^TM测序仪或Ion Proton^TM测序仪(全部可获自Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)或质谱仪。在一些实施方案中，测序包括将dNTP(包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、dITP或其组合，以及包括dNTP的双脱氧核糖核苷酸类似物)掺入扩增产物。

可用于公开的核酸扩增反应的核酸聚合酶可以是用于进行期望的反应的任何核酸聚合酶，包括例如原核生物、真菌、病毒、噬菌体、植物和/或真核生物核酸聚合酶。如本文中所用，术语"DNA聚合酶"是指使用核酸链作为模板从头合成DNA链的酶。DNA聚合酶使用现有DNA或RNA作为DNA合成的模板，并且催化脱氧核糖核苷酸沿其阅读的模板链的聚合。新合成的DNA链与模板链互补。DNA聚合酶可仅将游离核苷酸添加至新形成的链的3'羟基末端。其通过将核苷一磷酸从脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)转移至正在生长的寡核苷酸链的3'羟基来合成寡核苷酸。这导致新链在5’至3'方向上的延伸。由于DNA聚合酶只能将核苷酸添加至预先存在的3'-OH基团，因此为了开始DNA合成反应，DNA聚合酶需要可向其添加第一个核苷酸的引物。适合的引物可包括RNA或DNA的寡核苷酸或其嵌合体(例如，RNA/DNA嵌合引物)。DNA聚合酶可以是天然存在的DNA聚合酶或具有上述活性的天然酶的变体。例如，其可包括具有链置换活性的DNA聚合酶、缺乏5'至3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶、具有逆转录酶活性的DNA聚合酶或具有内切核酸酶活性的DNA聚合酶。

适当的核酸聚合酶还可包括全酶、全酶的功能性部分、嵌合聚合酶或可实现核酸分子的合成的任何修饰聚合酶。在本公开内容内，DNA聚合酶还可包括聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒酶和/或多核苷酸磷酸化酶。聚合酶的非限制性实例可以包括例如T7DNA聚合酶、真核线粒体DNA聚合酶γ、原核生物DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和/或V；真核生物聚合酶α、β、γ、δ、ε、η、ζ、ι和/或κ；大肠杆菌DNA聚合酶I；大肠杆菌DNA聚合酶IIIα和/或ε亚单位；大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V；栖热水生菌(T.aquaticus)DNA聚合酶I；嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)DNA聚合酶I；广古菌门(Euryarchaeota)聚合酶；末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)；酿酒酵母(S.cerevisiae)聚合酶4；跨损伤合成聚合酶；逆转录酶；和/或端粒酶。可使用的适当的热稳定性DNA聚合酶的非限制性实例包括Taq,Tfl,Tfi,Pfu和Vent^TM DNA聚合酶、任何基因工程化DNA聚合酶、任何具有降低的或无关紧要的3'至5'外切酶活性的(例如SuperScript^TM DNA聚合酶)和/或遗传工程化DNA聚合酶(例如，具有活性位点突变F667Y或F667Y的等同物(例如，在Tth中)的聚合酶、

FS、ThermoSequenase^TM)、

Gold、

Taq DNA聚合酶、TherminatorI、Therminator II、Therminator III、Therminatorγ(全部都可获自New EnglandBiolabs,Beverly,MA)和/或其任何衍生物和片段。其它核酸聚合酶也可以是适合的，如可被本领域技术人员所理解的。

在另一个方面，本公开内容提供了用于聚合和/或扩增目标核酸序列(例如，靶序列)的反应混合物。在一些实施方案中，反应混合物还可包含可检测标记。方法还可包括用于检测可检测标记以定量扩增的核酸的一个或多个步骤。如本文中所用，术语“可检测标记”是指多种指示扩增的信号分子的任一种。例如，

Green和其它DNA结合染料是可检测标记。这样的可检测标记可包含或可以是例如核酸插入剂或非插入剂。如本文中所用，插入剂是能够非共价地插入在双链核酸分子的堆积的碱基对之间的试剂或部分。非插入剂是不插入双链核酸分子的试剂。核酸结合剂可直接或间接产生可检测信号。信号可使用例如荧光和/或吸光度直接地检测，或使用例如任何部分或配体间接地检测，所述部分或配体受到与双链分子的邻近度可检测地影响，适当的所述部分或配体包括例如取代的标记部分或连接于核酸结合剂的结合配体。当结合于双链核酸时核酸结合剂通常需要产生可与当相同试剂存在于溶液中或结合于单链核酸时产生的信号相区别的可检测信号。例如，当插入双链DNA时插入剂例如溴化乙锭发出的荧光比当结合于单链DNA、RNA或存在于溶液中时更强(参见，例如，美国专利No.5,994,056；6,171,785；和/或6,814,934)。类似地，当结合于单链核酸时，放线菌素D发出在UV/VIS光谱的红色部分中的荧光，并且当结合于双链核酸时，发出在UV/VIS光谱的绿色部分中的荧光。在另一实例中，已报导光反应性补骨脂素4-氨基甲基-4-5',8-三甲基补骨脂素(AMT)在插入双链DNA后显示减少的长波长上的吸收和荧光(Johnson等人Photochem.&Photobiol.,33:785-791(1981))。例如，美国专利No.4,257,774描述了荧光插入剂与DNA的直接结合(例如，乙啡啶盐、道诺霉素、米帕林和吖啶橙、4',6-二脒基-α-苯基吲哚)。非插入剂(例如，本文中描述的小沟结合剂例如Hoechst 33258、偏端霉素、纺锤菌素)也可以是适合使用的。例如，Hoechst 33258(Searle,等人Nucl.Acids Res.18(13):3753-3762(1990))对于递增量的靶显示改变的荧光。在本文中的其它地方更详细地描述了小沟结合剂。

其它DNA结合染料对于本领域技术人员是可获得的，并且可单独使用或与测定系统的其它试剂和/或组分组合使用。示例性DNA结合染料可包括例如除其它以外，吖啶(例如，吖啶橙、吖啶黄)、放线菌素D(Jain,等人J.Mol.Biol.68:21(1972))、氨茴霉素、BOBO ^TM-1、BOBO ^TM-3、BO-PRO^TM-1、cbromomycin、DAPI(Kapuseinski,等人Nucl.Acids Res.6(112):3519(1979))、道诺霉素、偏端霉素(例如，偏端霉素D)、美国专利No.7,387,887中描述的染料、玫瑰树碱、乙啡啶盐(例如，溴化乙锭)、fluorcoumanin、美国专利No.4,257,774中描述的荧光插入剂，

(Cambrex Bio Science Rockland Inc.,Rockland,Me.)、Hoechst 33258(Searle和Embrey,Nucl.Acids Res.18:3753-3762(1990))、Hoechst33342，二胺乙基苯菲啶(homidium)，JO-PRO^TM-1、LIZ染料、LO-PRO^TM-1、米帕林、光辉霉素、NED染料、纺锤菌素、4',6-二脒基-α-苯基吲哚、原黄素、POPO^TM-1、POPO^TM-3、PO-PRO^TM-1、碘化丙啶、ruthenium polypyridyls、S5、

Gold、

Green I(美国专利No.5,436,134和5,658,751)、

Green II、

蓝、

绿、

43、

44、

45、

蓝、

-1、

11、

13、

15、

16、

20、

23、噻唑橙(Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,Wis.)、TOTO ^TM-3、

-1和

-3(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)等。例如，

Green I(参见，例如，美国专利No.5,436,134；5,658,751；和/或6,569,927)已被用于监测PCR反应。其它DNA结合染料也可以是适合的，如被本领域技术人员所理解的。

对于本文中描述的用途，可将一个或多个可检测标记和/或淬灭剂连接于一个或多个引物和/或探针(例如，可检测标记)。当游离时或当结合于靶核酸之一时，可检测标记可发射信号。可检测标记还可在靠近另一个可检测标记时发射信号。还可将可检测标记与淬灭分子一起使用，以便当未充分接近淬灭分子时信号才是可检测的。例如，在一些实施方案中，测定系统可能会导致可检测标记被从淬灭分子释放出来。几种可检测标记的任一种可用于标记用于本文中描述的方法的引物和探针。如上文中提及的，在一些实施方案中，可检测标记可以连接于探针，其可被掺入引物，或可以以另外的方式结合于扩增的靶核酸(例如，可检测的核酸结合剂例如插入或非插入染料)。当使用超过一个可检测标记时，每一个在它们的光谱性质上应当不同以便标记可彼此区分，或使得可检测标记共同地发射不被任一单独的可检测标记发射的信号。示例性可检测标记包括例如荧光染料或荧光基团(例如，可以被光激发而发出荧光或磷光的化学基团)、能够淬灭来自荧光供体染料的荧光信号的“受体染料”等。合适的可检测标记可以包括，例如，荧光素(例如，5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羟基色胺(5-HAT)；6-JOE；6-羧基荧光素(6-FAM)；FITC；6-羧基-1,4-二氯-2',7'-二氯荧光素(TET)；6-羧基-1,4-二氯-2',4',5',7'-四氯荧光素(HEX)；6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基-荧光素(JOE)；Alexa

荧光基团(例如，350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750)；

荧光基团(例如，492/515、493/503、500/510、505/515、530/550、542/563、558/568、564/570、576/589、581/591、630/650-X、650/665-X、665/676、FL、FL ATP、FI-神经酰胺、R6G SE、TMR、TMR-X共轭物、TMR-X、SE、TR、TR ATP、TR-X SE)、香豆素(例如，7-氨基-4-甲基香豆素、AMC、AMCA、AMCA-S、AMCA-X、ABQ、CPM甲基香豆素、香豆素毒伞素、羟基香豆素、CMFDA、甲氧基香豆素)、钙黄绿素、钙黄绿素AM、钙黄绿素蓝、钙染料(例如，钙深红色、钙绿色、钙橙色、钙荧光白(calcofluor white))、Cascade Blue、Cascade Yellow；Cy^TM染料(例如，3、3.18、3.5、5、5.18、5.5、7)、青色GFP、环AMP荧光传感器(FiCRhR)、荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(例如，GFP.EGFP)、蓝色荧光蛋白(例如、BFP、EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)、青色荧光蛋白(例如，ECFP、Cerulean、CyPet)、黄色荧光蛋白(例如，YFP、Citrine、Venus、YPet)、FRET供体/受体对(例如，荧光素/四甲基罗丹明、IAEDANS/荧光素、EDANS/dabcyl、荧光素/荧光素、

FL/

FL、荧光素/QSY7和QSY9)、

和LysoSensor^TM(例如，

蓝DND-22、

蓝-白DPX、

黄HCK-123、

绿色DND-26、

红色DND-99、LysoSensor^TM蓝DND-167、 LysoSensor^TM绿色DND-189、LysoSensor^TM绿色DND-153、LysoSensor^TM黄/蓝DND-160、LysoSensor^TM黄/蓝10,000MW右旋糖酐)、Oregon绿(例如，488、488-X、500、514)；罗丹明(例如，110、123、B、B 200、BB、BG、B extra、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、5GLD、6-羧基罗丹明6G、丽丝胺、丽丝胺罗丹明B、Phallicidine、鬼笔环肽、Red、Rhod-2、ROX(6-羧基-X-罗丹明)、5-ROX(羧基-X-罗丹明)、Sulphorhodamine B canC、Sulphorhodamine G Extra、TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)、四甲基罗丹明(TRITC)、WT)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、VIC和在例如美国专利申请公开号2009/0197254(其在此通过引用以其整体并入本文)中描述的其它标记，除其它的如对于为本领域技术人员来说是已知的以外。也可以使用其他可检测的标记，(参见，例如，美国专利申请公开号2009/0197254(其在此通过引用以其整体并入本文))，如对于为本领域技术人员来说是已知的。任何这些系统和可检测标记以及许多其他的可用于检测扩增的靶核酸。

一些可检测标记可以是基于序列的(在本文中也称为“位点特异性可检测标记”)，例如5’-核酸酶探针。这样的探针可包含一个或多个可检测标记。各种可检测标记在本领域中是已知的，例如(本文中描述的

探针(也参见美国专利No.5,538,848(在此通过引用以其整体并入本文))各种茎-环分子信标(参见，例如，美国专利No.6,103,476和5,925,517以及Tyagi和Kramer,Nature Biotechnology 14:303-308(1996))、无茎或线性信标(参见，例如，PCT公开号WO99/21881；美国专利No.6,485,901)、PNA分子信标^TM(参见，例如，美国专利No.6,355,421和6,593,091)、线性PNA信标(参见，例如，Kubista等人,SPIE4264:53-58(2001)),非FRET探针(参见，例如，美国专利No.6,150,097)、

探针(美国专利No.6,548,250)、茎-环和双链体Scorpions^TM探针(Solinas等人,Nucleic Acids Research 29:E96(2001)和美国专利No.6,589,743)、凸环探针(美国专利No.6,590,091)、假结探针(美国专利No.6,589,250)、cyclicon(美国专利No.6,383,752)、MGB Eclipse^TM探针(Epoch Biosciences)、发夹型探针 (美国专利No.6,596,490)、肽核酸(PNA)点亮探针(light-up probe)(Svanvik,等人Anal Biochem 281:26-35(2001))、自装配纳米颗粒探针、于例如美国专利No.6,485,901；Mhlanga等人,Methods25:463-471(2001)；Whitcombe等人,Nature Biotechnology.17:804-807(1999)；Isacsson等人,Molecular Cell Probes.14:321-328(2000)；Svanvik等人,Anal Biochem.281:26-35(2000)；Wolffs等人,Biotechniques 766:769-771(2001)；Tsourkas等人,Nucleic Acids Research.30:4208-4215(2002)；Riccelli等人,Nucleic Acids Research 30:4088-4093(2002)；Zhang等人,Acta Biochimica et Biophysica Sinica(Shanghai).34:329-332(2002)；Maxwell等人,J.Am.Chem.Soc.124:9606-9612(2002)；Broude等人,Trends Biotechnol.20:249-56(2002)；Huang等人,Chem Res.Toxicol.15:118-126(2002)；和Yu等人,J.Am.Chem.Soc.14:11155-11161(2001)中描述的二茂络铁-修饰探针；

(www.qiagen.com)、

(French,等人Mol.Cell.Probes.15:363-374(2001))、置换探针(Li,等人Nucl.Acids Res.30:e5(2002))、HybProbes(Cardullo,等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8790-8794(1988))、MGBAlert(www.nanogen.com)、Q-PNA(Fiandaca,等人Genome Res.11:609-611(2001))、

(www.Promega.com)、LUX^TM引物(Nazarenko,等人Nucleic Acids Res.30:e37(2002))、DzyNA引物(Todd,等人Clin.Chem.46:625-630(2000))。可检测标记还可包含淬灭可检测标记的荧光的非可检测的淬灭部分，其包括例如黑洞淬灭剂(black holequencher)(Biosearch)、Iowa

淬灭剂(IDT)、QSY淬灭剂(Molecular Probes)以及Dabsyl和Dabcyl磺酸盐/羧酸盐淬灭剂(Epoch)。可检测标记还可包含两个探针，其中例如荧光基团在一个探针上，淬灭剂在另一探针上，其中两个探针一起在靶上的杂交淬灭信号，或其中靶上的杂交通过荧光的变化改变信号特征。示例性系统还可以包括FRET、水杨酸盐/DTPA配体系统(参见，例如，Oser等人Angew.Chem.Int.Engl.29(10):1167(1990))、置换杂交、同源探针和/或于欧洲专利No.EP 070685和/或美国专利No.6,238,927中描述的测定法。可检测标记还可包括具有替代羧酸基团的SO₃的荧光染料的磺酸盐衍生物、荧光素的亚磷酰胺形式、Cy5的亚磷酰胺形式(可以例如从Amersham获得)。以上引用的所有参考文献在此通过引用整体并入本文。

本文描述的组合物和方法可用于检测和/或定量来自测试样品的多种靶核酸。靶核酸是测定系统被设计来鉴定或检测其在测试样品中的存在(或不存在)和/或对其进行定量的任何核酸。这样的核酸可以包括例如感染原(例如病毒、细菌、寄生虫等)、疾病过程例如癌症、糖尿病等的核酸，或测量免疫反应的核酸。示例性“测试样品”包括各种类型的样品，例如生物样品。示例性生物样品包括例如体液(例如，血液、唾液、脊髓液)、组织样品、食品(例如，肉)或饮料(例如，牛奶)产品等。表达的核酸可以包括例如，其表达(或其缺失)与医学状况例如感染性疾病(例如，细菌、病毒、真菌、原生动物感染)或癌症相关的基因。本文中描述的方法还可以用于检测药物、食物或饮料产品中的污染物(例如，细菌、病毒、真菌和/或原生动物)。本文中描述的方法还可被用于检测在野生型等位基因存在的情况下的罕见等位基因(例如，在10⁶-10⁹野生型等位基因存在的情况下的一个突变等位基因)。方法可用于例如检测微小的残留病变(例如，缓解期间的极少的剩余癌细胞，尤其是p53基因或先前在肿瘤内鉴定的其他肿瘤抑制基因中的突变)，和/或测量突变负荷(例如存在于正常组织，例如血液或尿液中的特定体细胞突变的频率)。

还提供了用于进行本文中所描述的方法的试剂盒。如本文中所用，术语“试剂盒”是指包装的一组相关组分，通常地一种或多种化合物或组合物。试剂盒可包括用于聚合和/或扩增至少一种来自样品的靶核酸的寡核苷酸对、一种或多种去垢剂、核酸聚合酶、双重热启动反应混合物和/或相应的一种或多种标记有可检测标记的探针。试剂盒还可包括包含待用于对照反应的预先确定的靶核酸的样品。试剂盒还可任选地包括可用于完成扩增反应的原液、缓冲液、酶、可检测标记或检测所需的试剂、管、膜等。在一些实施方案中，包括多个引物组。在一个实施方案中，试剂盒可包括如下试剂的一种或多种：例如缓冲液(例如，Tris)、一种或多种盐(例如，KCl)、甘油、dNTP(dA、dT、dG、dC、dU)、重组BSA(牛血清白蛋白)、染料(例如，ROX被动参考染料(passive reference))、一种或多种去垢剂、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和/或明胶(例如，鱼或牛来源)。还涉及本领域普通技术人员将理解的特定系统和试剂盒的其它实施方案。

实施例

组合和测试了具有不同热启动机制的商购可得的预混合物以显示双重热启动反应混合物的效用。实验设置概述于表1中：

表1

使用2ng通用人参照(Universal Human Reference)(UHR)(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA)cDNA和200nM引物(24个测试的靶)在10μl的终体积中进行所有反应。对于每一个反应进行4个重复。在于室温温育0小时或24小时(分别地T0和T24)后，在ViiA^TM 7实时PCR系统(Life Technologies Corp.,Carlsbad,CA)上进行扩增。在于室温温育后，按照制造商的说明书进行扩增。简言之，如下设置热循环条件：

在一些情况下，将Power

Green qPCR SuperMix或Fast

Green预混合物与

Taq抗体一起温育过夜(16-20小时)。所有测试的组分都是商购可得的并且购自Life Technologies Corporation。

在图1A-1D中，使用单重或双重热启动反应混合物利用24个引物组扩增靶核酸。单重热启动反应混合物使用单独的Fast

Green预混合物(“方块”线)或单独的

Green qPCR SuperMix(“十字形”线)。双重热启动反应混合物使用Fast

Green预混合物与

Green qPCR SuperMix的1:1组合(“三角形”线)。在扩增之前，将所有3个反应组在室温温育0小时(“T0”)或24小时(“T24”)。在许多测定中，两个不同的热启动机制的组合导致非特异性产物形成的减少(参见，图1A(T0,cDNA)、1B(T0,非特异性产物(“NTC”))、1C(T24,cDNA)和1D(T24,NTC))。

在图2A-2D中，选择单个扩增子，并通过解链曲线分析进行分析。图2A显示在室温0小时后，当与单重热启动反应混合物(Fast

Green预混合物)相比较时，双重热启动反应混合物使非特异性产物的形成减少至1/4，以及当与其它单重热启动反应混合物(

Green qPCR SuperMix)相比较时，使非特异性产物的形成减少至1/2。图2B显示在室温进行24小时的预温育后，当与每一个单重热启动反应混合物相比较时，双重热启动反应混合物使非特异性产物的形成减少至1/2。图2C和2D显示双重热启动反应混合物在室温进行0小时预温育时使非特异性产物减少至少50％(图2C)，以及在室温进行24小时预温育后使非特异性产物减少100％(图2D)。图2E比较了单重热启动反应混合物与双重热启动反应混合物的扩增反应对非特异性产物形成的减少的作用的平均Ct和ΔCt分析。图2F显示单重热启动反应混合物与双重热启动反应混合物的解链曲线分析的比较，证明双重热启动反应混合物在室温进行0和24小时预温育时显著减少非特异性产物的形成(如通过NTC ΔRn信号的减少显示的)。

在图3A-3D中，使用单重或双重热启动反应混合物，利用24个引物组扩增靶核酸。单重热启动反应混合物使用单独的Fast

Green预混合物(“菱形”线)或与

Taq抗体组合使用(“十字形”线)。在扩增前将两个反应组在室温温育0小时(“T0”)或24小时(“T24”)。在许多测定中，两个不同热启动机制的组合导致非特异性产物的形成减少(参见，图3A(T0,cDNA)、3B(T0,非特异性产物(“NTC”))、3C(T24,cDNA)和3D(T24,NTC))。

在图4A-4D中，选择单个扩增子，利用解链曲线分析进行分析。图4A显示Fast

Green预混合物单重热启动反应混合物产生非特异性产物，特别地在室温进行24小时预温育后。图4B显示，双重热启动反应混合物导致在T0时75％的非特异性产物形成的减少，和在T24时100％的非特异性产物形成的减少。图4C显示，双重热启动反应混合物在T0和T24减少非特异性产物的形成，并且双重热启动反应混合物使非特异性产物的形成减少20-25％(取决于所使用的阈值)。

在图5A-5D中，使用单重或双重热启动反应混合物利用24个引物组扩增靶核酸。单重热启动反应混合物使用单独的Power

Green PCR预混合物(“菱形”线)或与

Taq抗体组合使用(“十字形”线)。在扩增之前将两个反应组在室温温育0小时(“T0”)或24小时(“T24”)。在许多测定中，两个不同热启动机制的组合导致非特异性产物的形成减少(参见，图5A(T0,cDNA)、5B(T0,非特异性产物(“NTC”))、5C(T24,cDNA)和5D(T24,NTC))。

在图6A-6D中，选择单个扩增子，通过解链曲线分析对其进行分析。图6A显示Power

Green PCR预混合物单重热启动反应混合物产生非特异性产物，尤其在于室温预温育24小时后。图6B显示双重热启动反应混合物在24小时时导致非特异性产物形成减少50％。图6C显示双重热启动反应混合物在T0和T24减少非特异性产物的形成(如通过Ct值的下降显示的)，和双重热启动反应混合物在T0时使非特异性产物的形成减少至1/3以及在T24时使其减少10％。

Claims

1.一种组合物，其包含：

a)核酸聚合酶；

b)第一热启动机制，其包含特异于所述聚合酶的抗体或抗体的组合；和

c)第二热启动机制；

其中所述第一热启动机制和所述第二热启动机制不同，并且二者一起能够在第一温度实质性抑制所述核酸聚合酶的活性而在第二温度不实质性抑制所述核酸聚合酶的活性，

其中所述第二热启动机制选自在较低温度阻断聚合酶活性的寡核苷酸、在升高的温度解离的核酸聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度提供降低的活性的核酸聚合酶的氨基酸修饰、包括超稳定核酸结合结构域和拓扑异构酶的融合蛋白和抑制聚合酶活性的温度依赖性配体。

2.权利要求1的组合物，其中所述核酸聚合酶为DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。

3.权利要求1的组合物，其中所述核酸聚合酶为热稳定性的。

4.权利要求1的组合物，其中所述核酸聚合酶选自Taq DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、TfiDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent^TMDNA聚合酶。

5.一种组合物，其包含：

a)热稳定性核酸聚合酶；

c)第二热启动机制；

其中所述第一热启动机制和所述第二热启动机制不同，并且二者一起能够在低于40℃的温度实质性抑制所述核酸聚合酶的活性而在高于40℃的温度不实质性抑制所述核酸聚合酶的活性，

6.权利要求5的组合物，其中所述热稳定性核酸聚合酶为DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。

7.权利要求5的组合物，其中所述热稳定性核酸聚合酶选自Taq DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、Tfi DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent^TMDNA聚合酶。

8.一种用于扩增靶核酸的方法，其包括：

a)在第一温度将靶核酸与核酸聚合酶、双重热启动反应混合物、至少一种引物和至少一种dNTP接触，从而形成反应组合物，所述双重热启动反应混合物包含第一热启动机制和第二热启动机制，其中所述第一热启动机制包含特异于所述聚合酶的抗体或抗体的组合，其中所述第一热启动机制和所述第二热启动机制不同，并且二者一起能够在第一温度实质性抑制所述核酸聚合酶的活性而在第二温度不实质性抑制所述核酸聚合酶的活性：

b)将所述反应组合物加热至第二温度；和

c)扩增反应组合物中的靶核酸；

其中所述第二热启动机制选自在较低温度阻断聚合酶活性的寡核苷酸、在升高的温度解离的热稳定性核酸聚合酶的可逆化学修饰、在较低温度提供降低的活性的热稳定性核酸聚合酶的氨基酸修饰、包括超稳定核酸结合结构域和拓扑异构酶的融合蛋白和抑制聚合酶活性的温度依赖性配体。

9.权利要求8的方法，其中所述核酸聚合酶是热稳定性的。

10.权利要求8的方法，其中所述核酸聚合酶为DNA依赖性DNA聚合酶或RNA依赖性DNA聚合酶。

11.权利要求8的方法，其中所述核酸聚合酶选自Taq DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、TfiDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Vent^TMDNA聚合酶。

12.一种试剂盒，其在第一容器中包含：

a)核酸聚合酶；

c)第二热启动机制；

其中所述第一热启动机制和所述第二热启动机制不同，并且二者一起能够在第一温度实质性抑制所述核酸聚合酶的活性而在第二温度不实质性抑制所述核酸聚合酶的活性；

13.权利要求12的试剂盒，其还在所述第一容器中或在第二容器中包含至少一种引物、dNTP和/或核酸结合染料。