CN109628423A - 一种热启动Taq DNA聚合酶组合优化分子试剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种热启动Taq DNA聚合酶组合优化分子试剂的方法。具体而言，本发明涉及一种针对不同分子试剂应用的热启动Taq DNA聚合酶的组合及优化方法，其特征在于，根据不同的分子试剂应用特点，将不同类型不同封闭程度的Taq DNA聚合酶进行有针对性的组合，发挥不同种类Taq DNA聚合酶的优势以适应不同的应用需求。本发明针对不同的应用需求，发挥不同热启动技术的优势相互取长补短。为反应体系的优化提供一种全新的思路。

Description

一种热启动Taq DNA聚合酶组合优化分子试剂的方法

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种针对不同分子试剂应用的热启动TaqDNA聚合酶的组合及优化方法，其特征在于，根据不同的分子试剂应用特点，将不同类型不同封闭程度的Taq DNA聚合酶进行有针对性的组合，发挥不同种类Taq DNA聚合酶的优势以适应不同的应用需求。

背景技术

聚合酶链式反应技术(PCR反应)是现代生物技术的核心技术之一，该技术的原理为利用Taq DNA聚合酶在体外利用与目的模板特异结合的上下游引物，通过95℃变性、60℃退火、72℃延伸三个步骤经过25-40个循环达到对目的基因片段的大量扩增。该技术经过近40年的发展，已经广泛的应用与生物科学科研和医学检测中。

随着检测技术的发展和需求的提高。PCR技术已经由之前的定性分析发展到了定量分析。通过实时荧光定量技术，检测人员可以实现对样品中的较低的病毒数量进行检测分析，为医生提供更为早期的诊断依据。

而传统的Taq DNA聚合酶由于其在常温下具备一定的活性，从而容易造成引物二聚体和非特异扩增，进而造成检测结果的偏离甚至产生假阳性的结果。针对这一应用需求开发的热启动技术的核心在于抑制Taq DNA聚合酶常温下的活性反应。目前常见的热启动技术分为：1石蜡包埋法；2抗体抑制法；3化学修饰法等。

1.石蜡包埋法的原理是将Taq DNA聚合酶包埋于石蜡小球中，常温下酶同反应体系隔绝，加热后石蜡融化后释放酶参加反应。但石蜡球制备复杂，且石蜡对于荧光读取有一定干扰，使用受到很大限制。

2.抗体抑制法使用传统单克隆抗体，低温抗体同酶结合抑制活性，高温抗体失活释放活性。本方法为目前主流方法之一。但抗体抑制法的问题在于：a传统的单克隆制备方式无法在制备阶段特异性的针对酶的活性位点进行制备，所以对于酶的抑制效果有限既对于扩增反应中无模板对照组(NTC)的抑制效果有限，无法满足高特异性应用的需求。b单克隆抗体制备成本较高。抗体抑制法出现的早期，人们首先想到使用多克隆抗体，多克隆抗体针对多个抗原决定簇，理论上是可以封闭所有位点的。但在实际操作过程中，往往因为可以结合的表位过多，当一些非活性表位上结合了相应的抗体后由于竞争抑制效应活性位点反而无法封闭。而且由于多克隆抗体生产的过程无法精准的实现控制，每个批次产生的针对各个表位的抗体的比例均不相同所以该方法无法实现标准化和重复性制备，已经被大家放弃。但本专利中首创将多克隆抗体作为辅助抑制剂使用辅助单克隆抗体无法封闭的位点。同时当PCR反应第一步预变性94℃ 2min时封闭剂均解离，酶活释放参与反应。多克隆抗体同时也能起到一定的提高酶稳定性的作用。

3.化学修饰法使用生化试剂对特定氨基酸进行修饰，进而达到抑制活性的作用。化学修饰法成本较抗体抑制法低，也是主流热封闭技术之一。但化学封闭技术容易造成TaqDNA聚合酶结构的不可逆损伤，进而影响活化后酶的灵敏度，不适用于一些对检测灵敏度高的应用。而且由于化学修饰的自身的稳定性，打开化学键释放酶活性的过程需要大量的能量，体现在反应中则需要95℃更长的时间，以ABI公司的金牌热启动Taq酶来说激活过程长达10-15min。大大增加了反应时间增加了反应的不确定性。

4.使用多肽片段进行封闭的热启动技术是近年来才发展起来的技术，其特点是利用噬菌体肽库筛选出的阳性系列配体本身基于用于药用靶向抗体筛选的单链抗体技术，优势如下：1以亲和力为指标，保证了同靶分子的结合效果；2配体序列可知，可以通过信息学分析比对选择最佳结合位点；3可以利用分子生物学和蛋白质工程技术实现该配体的高效、规模化、低成本的体外标准化制备，从而省略昂贵的细胞培养过程。

结合具体的应用场景又有各自需要针对解决的问题。

1)基于常规PCR应用。常规PCR主要利用目的双链在高温下(94℃)解链成单链，低温下(55℃)特异性引物形成局部双链结构，延伸温度(72℃)下taq DNA聚合酶识别局部双链后将体系中的dNTP按照碱基互补配对原则进行合成，合成新的双链结构。这个过程中通过使用热启动taq DNA聚合酶，该方法主要用于菌落PCR检测和转基因检测中。该类应用的特点在于检测样品为粗提样本，样本中含有大量且不可控的蛋白、核酸以及裂解液成分(通常为强碱性或变性剂)。所以Taq DNA聚合酶的稳定性和扩增能力在应用中非常重要。

2)基于双链掺入法的实时荧光定量检测。其在常规PCR反应的基础上，添加荧光染料，该染料非特异的和DNA双链结构的大沟区域结合后发出荧光可被机器检测到，通过荧光的强弱进而推断出目标分子的多少。该方法的优点在于荧光检测灵敏度高，采用了起点定量检测，克服了常规PCR方法终点检测重复性较差的问题。但缺点是荧光染料和DNA的结合是非特异的，当扩增产物非唯一的情况下会造成荧光信号过高，进而产生假阳性结果。大家公认热启动技术是提高双链掺入法实时荧光定量检测结果真实性的有效手段。但传统热启动方式化学法封闭灵敏度较差且容易对酶的活性产生不可逆的损伤。单克隆抗体封闭由于技术手段的局限很难筛选到封闭效果良好的抗体。

3)基于特异荧光探针法的荧光定量检测。该方法使用特异结合的荧光探针取代了非特异结合的荧光染料；荧光探针是由一段和目的基因特异结合的核酸序列组成，其上偶联有发光集团和猝灭集团正常情况下不发生荧光，荧光探针在退火阶段和扩增引物一起结合于单链DNA模板之上，延伸阶段荧光探针在Taq DNA聚合酶作用下水解，发光集团和猝灭集团分离发射荧光。特异荧光探针法的优势在于特异性高，探针和目的基因特异性结合，不会和扩增产生的杂扩增结合进而提高检测的灵敏度，该方法可以检测到血样中低至10拷贝/样品的病毒粒子。针对该应用的特点，需要的热启动Taq DNA聚合酶需要更强的扩增能力和更好的抗抑制剂(如血红素等)。

4)基于多重PCR扩增检测。多重PCR技术将多对引物探针于同一个体系中进行扩增，不同的探针带有不同波长的荧光，可以被检测器同时监控，这样就实现了多指标的检测。该技术的难点在于多对引物和探针存在于体系中，对taqdna聚合酶的特异性、扩增能力和稳定性要求更高。以最大程度的兼容各对引物之间可能存在竞争抑制的情况，保证扩增效率和灵敏度。

总体来说，不同的封闭技术既有优点又有缺点，而不同要求的PCR扩增技术有有着不同的技术指标倾向。这就造成了单一技术的热启动技术生产的热启动Taq DNA聚合酶很难满足个性化的应用需求。利用单一热启动Taq DNA聚合酶仅仅依靠缓冲液组分的调节作用不足以弥补聚合酶本身带来的不足。本发明涉及的根据不同应用的特点使用个性化多种类热启动Taq DNA聚合酶组合的方法可以取长补短给PCR检测技术的应用提供全新的解决思路。

发明内容

本发明的目的是在于针对不同的PCR检测技术及应用场景进行其核心原料-不同种类热启动Taq DNA聚合酶的个性化组合优化。其作用是针对不同的应用需求，发挥不同热启动技术的优势相互取长补短。为反应体系的优化提供一种全新的思路。

为了解决技术背景中应用的不足，本发明采用以下技术方案：

1.基于化学修饰剂的热启动Taq DNA聚合酶：Taq(Chem)通过交联比例和交联时间来控制交联度的差异。衍生出1#Taq(Chem)2#Taq(Chem)和3#Taq(Chem)其交联度从弱到强。控制其交联度为20％、30％和50％(即聚合酶分子中20％、30％和50％的氨基被封闭)。

2.基于单克隆抗体的热启动Taq DNA聚合酶：Taq(MA)。

3.基于特异性多肽片段的热启动Taq DNA聚合酶：Taq(PE)，利用筛选得到封闭效果不同的三种多肽序列配体A、配体B和配体C。通过和Taq DNA聚合酶配合衍生出Taq(PE)A、Taq(PE)B、Taq(PE)C。

4.基于多克隆抗体的热启动Taq DNA聚合酶：Taq(PA)。

5.适合于常规PCR扩增的优化热启动Taq DNA聚合酶方案为：3#Taq(Chem)∶Taq(MA)体积比为3∶1。

6.适合于双链掺入法的实时荧光定量检测用热启动聚合酶方案为：特异性多肽片段的热启动Taq DNA聚合酶(Taq(PE))配合多克隆抗体封闭的Taq(PA)。按照Taq(PE)A∶Taq(PE)B∶Taq(PE)C∶Taq(PA)体积比3∶4∶1∶0.5的比例混合而成的热启动DNA聚合酶。

7.适合于特异荧光探针法的荧光定量检测用热启动聚合酶配比方案为：Taq(MA)∶Taq(PE)C体积比1∶2配比。

不同热启动Taq DNA聚合酶的制备方式如下：

1.基于化学修饰剂的热启动Taq DNA聚合酶：Taq(Chem)；使用纯化好的Taq DNA聚合酶，调整浓度到1.0mg/ml，溶液组成为20mMTris-HCl pH8.0；0.1％NP-40；100mM KCl；50％甘油；搅拌加入终浓度2mM、3mM、5mM的甲醛。4℃过夜搅拌混匀。-20℃保存得到1#Taq(Chem)2#Taq(Chem)和3#Taq(Chem)。

2.基于单克隆抗体的热启动Taq DNA聚合酶：使用纯化好的Taq DNA聚合酶，调整浓度到1.0mg/ml，溶液组成为20mMTris-HCl pH8.0；0.1％NP-40；100mM KCl；50％甘油；搅拌加入1mg/ml的Taq单克隆抗体，终浓度0.05mg/ml，4℃搅拌混匀，室温静置30min后，-20℃保存得到Taq(MA)。

3.基于特异性多肽片段的热启动Taq DNA聚合酶：将纯化的Taq DNA聚合酶作为底物包被，利用噬菌体展示技术进行三轮的淘选流程，得到富集的同底物具有高亲和力的阳性备选配体，利用Taq DNA聚合酶的结构数据对备选配体进行分析筛选，并利用qPCR技术验证得到对Taq DNA聚合酶活性具备封闭效果的系列配体A、配体B和配体C，利用多肽合成技术合成相应多肽。取纯化好的Taq DNA聚合酶，调整浓度到1.0mg/ml，溶液组成为20mMTris-HCl pH8.0；0.1％NP-40；100mM KCl；50％甘油；4℃搅拌加入摩尔比30∶1的配体，-20℃保存得到Taq(PE)A、Taq(PE)B、Taq(PE)C。

4.基于多克隆抗体的热启动Taq DNA聚合酶：Taq(PA)使用纯化好的Taq DNA聚合酶，调整浓度到1.0mg/ml，溶液组成为20mMTris-HCl pH8.0；0.1％NP-40；100mM KCl；50％甘油；；4℃搅拌加入1mg/ml Taq多克隆抗体，终浓度0.01mg/ml.-20℃保存得到Taq(PA)。

附图说明

图1针对不同分子试剂组合优化用酶的特异性鉴定

图2针对不同分子试剂组合优化用酶的活性鉴定

图3基于常规PCR应用的组合优化-鼠尾粗提DNA基因型鉴定

图4基于常规PCR应用的组合优化-土壤DNA鉴定

图5基于双链掺入法的实时荧光定量检测的组合优化效果鉴定

图6基于特异荧光探针法的荧光定量检测的组合优化效果鉴定

图7基于多重PCR的组合优化效果鉴定

具体实施方式

实施例一 针对不同分子试剂组合优化用酶的特异性和活性鉴定

NTC实验验证酶的特异性：

NTC实验设置，于PCR管中，依次加入10x反应buffer 2μl；dNTP4μl上游引物1μl；下游引物1μl；双蒸水10μl；热启动Taq DNA聚合酶1μl；SYBR染料1μl

反应条件为：

1预变性95℃ 2min；

2变性94℃ 30sec；

3退火/延伸60℃ 30sec；采集荧光(2-3步重复40个循环)

4融解曲线按照机器默认设置。

数据分析按照机器软件设置。

采用5对引物，进行NTC验证，NTC验证即无模板扩增对照实验，反应体系中不加入扩增模板，用于验证扩增的特异性，特异性不好的引物NTC会有扩增。使用热启动Taq DNA聚合酶可以有效的改善NTC扩增。结果如图1所示，相比较普通Taq DNA聚合酶NTC扩增结果，5组引物使用热启动Taq DNA聚合酶NTC扩增均有改善，而使用本发明所述的热启动Taq DNA聚合酶NTC抑制效果更为明显。说明本发明针对不同分子试剂组合优化用酶封闭效果更好，特异性更高。

采用模板梯度稀释绘制标准曲线考察针对不同分子试剂组合优化用酶扩增能力：

采用市售HCV检测试剂盒中提供的质粒标准品，进行10倍梯度稀释后作为模板，使用试剂盒提供的探针和引物按照如下顺序配制反应体系：

于PCR管中，依次加入10x反应buffer 2μl；dNTP4μl；上游引物1μl；下游引物1μl；探针1μl双蒸水10μl；热启动Taq DNA聚合酶1μl；

按照试剂盒要求的方法进行标准曲线绘制。

采用模板梯度稀释绘制标准曲线考察针对不同分子试剂组合优化用酶扩增能力，代表性结果如图2标准曲线扩增效率100％，R²为1说明扩增能力良好准确度极高。

实施例二 基于常规PCR应用的组合优化

鼠尾粗提DNA基因型鉴定

鼠尾DNA制备：

1在含有小鼠尾巴的离心管中加入500μL lysis buffer，并加入10μL蛋白酶K，混匀后放到55°恒温箱反应过夜。

2离心管中加入500μL酚-氯仿沉淀蛋白。

3将离心管12000rpm离心10min取上清液约400μl，加入等体积的异丙醇。

4将离心管12000rpm离心15分钟，倒掉上清。

5加入1mL预冷的75％的酒精，12000rpm离心10分钟。

6倒掉上清晾干，加100μL灭菌的超纯水溶解DNA。

PCR体系配制：

于PCR管中，依次加入10x反应buffer 2μl；dNTP4μl；上游引物1μl；下游引物1μl；双蒸水11μl；热启动Taq DNA聚合酶1μl；

PCR反应设置

1预变性95℃ 2min；

2变性94℃ 30sec；

3退火60℃ 30sec；

4延伸72℃ 30sec(2-4步重复30个循环)

5终延伸72℃ 5min

6琼脂糖凝胶电泳检测

鼠尾粗提DNA基因型鉴定，如图3，使用传统Taq DNA聚合酶因为稳定性较差不能得到扩增片段。单独使用Taq(Chem)和Taq(MA)扩增目的片段较弱。使用优化后的热启动酶组合扩增目的条带明显增多。

土壤DNA鉴定

土壤DNA提取

1.称取样品土样5g，加入灭菌的石英砂，液氮研磨；

2.加入13.5mL的DNA提取Buffer，100μl，20mg/mL蛋白酶K，37℃225rpm摇2h；

3.加入700微升20％SDS，65℃水浴2h，间隔15min颠倒摇匀数次；

4.6000rpm室温离心15min，收集中间液相层；向沉淀中加入3mLDNA提取液，300μl20％SDS，65℃水浴30min，同上离心，收集中间液相层，合并；重复一次；

5.向收集的液相层中加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，8000rpm离心10min，收集上部液相层；

6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠，0.6倍体积的异丙醇，4℃过夜沉淀；

7.过夜沉淀物12000rpm离心15min，弃上清；向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清；12000rpm离心30sec，移液枪析出残留液体；

8.室温自然干燥沉淀，干燥后向沉淀中加入400μlTE溶解。

PCR体系配制：

于PCR管中，依次加入10x反应buffer 2μl；dNTP4μl；上游引物1μl；下游引物1μl；双蒸水11μl；热启动Taq DNA聚合酶1μl；

PCR反应设置

1预变性95℃ 2min；

2变性94℃ 30sec；

3退火60℃ 30sec；

4延伸72℃ 30sec(2-4步重复30个循环)

5终延伸72℃ 5min

6琼脂糖凝胶电泳检测

土壤DNA鉴定，如图4，使用优化后热启动Taq不仅扩增能力增强，扩增特异性也得到了提升。

实施例三 基于双链掺入法的实时荧光定量检测的组合优化

双链掺入法实时荧光定量检测

RNA提取

1.实验用小鼠，断颈处死后，立即解剖取肝组织约0.5g；

2.加入1ml Trizol于玻璃匀浆器中均匀研磨；

3.加入0.2ml氯仿后剧烈震荡30sec；

4.12,000rpm，4℃离心10min；取上清按照1∶1体积比加入异丙醇，室温静置30min；

5.12,000rpm，4℃离心10min；弃去上清，沉淀加0.5ml 75％的乙醇洗涤2次；静置晾干后加入0.1ml DEPC水溶解，280nm测量RNA浓度，-80度保存。

cDNA制备

于PCR管中，依次加入2x的反转录Buffer；12.5μl，dNTP 4μl，Oligo dT 2μl，Rnase抑制剂0.5μl，DEPC水4μl，RNA 2μl。反应体系于42℃反应30min，即为cDNA。

PCR体系配制

于PCR管中，依次加入10x反应buffer 2μl；dNTP4μl；上游引物1μl；下游引物1μl；双蒸水10μl；热启动Taq DNA聚合酶1μl；SYBR染料1μl

反应条件为：

1预变性95℃ 2min；

2变性94℃ 30sec；

3退火/延伸60℃ 30sec；采集荧光(2-3步重复40个循环)

4融解曲线按照机器默认设置。

数据分析按照机器软件设置。

双链掺入法实时荧光定量检测，如图5，优化后的热启动Taq酶相对于单独使用Taq(MA)的试剂特异性有提升(融解曲线无杂峰)，相对于单独使用Taq(Chem)的试剂扩增强度有提升。整体试剂性能更优越。

实施例四 基于特异荧光探针法的荧光定量检测的组合优化

采用市售HCV检测试剂盒中提供的质粒标准品，进行10倍梯度稀释后作为模板，使用试剂盒提供的探针和引物按照如下顺序配制反应体系：

于PCR管中，依次加入10x反应buffer 2μl；dNTP4μl；上游引物1μl；下游引物1μl；探针1μl双蒸水9μl；梯度模板1μl；热启动Taq DNA聚合酶1μl。

按照试剂盒要求进行反应，利用机器自带分析软件进行分析。

特异荧光探针法进行梯度稀释检测灵敏度，如图6，优化后的热启动Taq在低拷贝的情况下扩增效率明显优于优化前。

实施例五 基于多重PCR的组合优化

采用市售HBV试剂盒，其在一管反应体系通过检测不同的荧光可以同时检测多个基因。在本试剂盒中FAM通道检测HBV的含量；VIC通道检测内参基因的含量。

采用试剂盒中的标准品进行10倍梯度稀释后为模板，使用试剂盒提供的探针和引物按照如下顺序配制反应体系：

于PCR管中，依次加入10x反应buffer 5μl；dNTP 8μl；1#上游引物1μl；1#下游引物1μl；1#探针1μl；2#上游引物1μl；2#下游引物1μl；2#探针1μl；双蒸水28μl；梯度模板1μl；热启动Taq DNA聚合酶2μl。

按照试剂盒要求进行反应，利用机器自带分析软件进行分析。

多重PCR检测灵敏度测试，如图7，结果表明优化后在扩增效率方面相对于优化前2个通道均有提升。

Claims (5)

1.一种针对不同分子试剂应用的热启动Taq DNA聚合酶的组合及优化方法，其特征在于，根据不同的分子试剂应用特点，将不同类型不同封闭程度的Taq DNA聚合酶进行有针对性的组合，发挥不同种类Taq DNA聚合酶的优势以适应不同的应用需求。

2.根据权利要求1所述的方法，其是基于常规PCR分子试剂应用的热启动Taq DNA聚合酶的组合及优化方法，其特征在于，将基于化学修饰的Taq DNA聚合酶“Taq(chem)”与基于单克隆抗体的Taq DNA聚合酶“Taq(MA)”组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其是基于双链掺入法的实时荧光定量分子试剂应用的热启动Taq DNA聚合酶的组合及优化方法，其特征在于，将基于特异性多肽片段的热启动Taq DNA聚合酶“Taq(PE)”与基于多克隆抗体封闭的“Taq(PA)”组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其是基于特异荧光探针法的荧光定量分子试剂应用的热启动Taq DNA聚合酶的组合及优化方法，其特征在于，将基于特异性多肽片段的热启动Taq DNA聚合酶“Taq(PE)”与基于单克隆抗体封闭的“Taq(MA)”组合。

5.根据权利要求1所述的方法，其是基于多重PCR应用的热启动Taq DNA聚合酶的组合及优化方法，其特征在于，根据多重PCR分子试剂应用特点，将不同类型不同封闭程度的TaqDNA聚合酶进行有针对性的组合，发挥不同种类Taq DNA聚合酶的优势以适应多重PCR的应用需求。