CN110592201A - 一管式高特异性核酸产物的pcr扩增方法、核酸快速检测方法和核酸检测试纸条 - Google Patents

一管式高特异性核酸产物的pcr扩增方法、核酸快速检测方法和核酸检测试纸条 Download PDF

Info

Publication number
CN110592201A
CN110592201A CN201911045819.9A CN201911045819A CN110592201A CN 110592201 A CN110592201 A CN 110592201A CN 201911045819 A CN201911045819 A CN 201911045819A CN 110592201 A CN110592201 A CN 110592201A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
probe
annealing
specific ligand
pcr amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201911045819.9A
Other languages
English (en)
Inventor
罗海贝
王臣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Qianlu Gene Technology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Qianlu Gene Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Qianlu Gene Technology Co Ltd filed Critical Shanghai Qianlu Gene Technology Co Ltd
Priority to CN201911045819.9A priority Critical patent/CN110592201A/zh
Publication of CN110592201A publication Critical patent/CN110592201A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高特异性核酸产物的PCR扩增方法，包括第一循环阶段和第二循环阶段，且第一循环阶段的退火/延伸温度高于第二循环阶段，PCR扩增时的反应体系中包括一对引物，一对引物中的任意一个的5’端连接有A，在进行PCR扩增时的反应体系中还包括探针，探针标记有B，探针的5’端不能被酶切，探针的3’端不能被延伸。利用本发明的扩增方法使得目的核酸序列被快速而高效的扩增，且在目的核酸序列上特异性的结合了检测标记。因而使得核酸检测效率高，检测速度快且结果准确度高。本发明还公开了一种核酸快速检测方法，利用本发明的核酸检测方法，能够利用普通的胶体金试纸条进行靶核苷酸序列的快速检出，操作简单，成本低。

Description

一管式高特异性核酸产物的PCR扩增方法、核酸快速检测方法 和核酸检测试纸条
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种一管式高特异性核酸产物的PCR扩增方法、一种核酸快速检测方法和核酸检测试纸条。
背景技术
胶体金免疫层析法(Gold Immunochromagraphy Assay)是20世纪80年代末发展起来的一种快速的免疫学检测方法，它是基于胶体金标记技术和免疫层析技术相结合的产物，基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用，使胶体金标记的抗原特异配体发生反应，在试纸条标记有抗原或特异配体的检测线位呈现胶体金颗粒聚集的红色条带，而阴性反应时胶体金颗粒无法聚集于检测线位置，不显色。
近年来，人们利用胶体金免疫层析法对目的核酸进行检测而实现了对多种疾病和目的核酸的快速诊断和检测。在进行核酸检测时，首先通过将特定抗原标记于核酸上，再利用胶体金免疫层析法对目的核酸片段进行检测。目前，已经有利用该方法制备得到的多种核酸检测试纸条面市，并且已经在结核分枝杆菌、甲型H1N1病毒、外源基因EPSPS的检测等方面都有了成功应用的报道。
一般情况下，在利用核酸检测试纸条时，通常需要在针对目的核酸设计的引物两端修饰双重标记物(如生物素、地高辛或荧光素等)，使核酸产物可以在结合胶体金颗粒的同时，与试纸条上检测线相应位置标记的对应特异配体结合，从而实现特定核酸产物的检测，而无需进行传统的核酸电泳鉴定或代价高昂的荧光定量PCR检测。利用试纸条进行核酸检测的方法便捷便宜，直观快速。
但是，在对目的核酸片段进行PCR扩增时，经过双重标记的引物在扩增过程中易于彼此相互结合而产生引物二聚体或产生其他非特异扩增产物，因而，引物二聚体或者是其他非特异扩增序列均携带双重标记，并可在胶体金免疫层析试纸条上呈现假阳性反应，因而，无法有效区分出靶核酸序列。因此，通过简单的对上、下游扩增引物分别修饰的方法显然对于检测的特异性难以保证，影响了检测的准确性，特别是在体外诊断应用领域，高特异性的要求使引物直接双重标记法无法直接应用于临床检测。
为了提高对核酸检测的特异性，目前通常的解决方案是，在试纸条上的检测区设置探针对PCR扩增产物进行特异性杂交。但是，这种解决方法存在诸多缺点：①试纸条通用程度不高，在针对不同的检测项目或是目的核酸片段不同时，必须要重新制作试纸条，使得检测成本较高；②PCR扩增产物与试纸条上设置的探针杂交的反应条件较严格，处理流程复杂，增加时间成本和设备成本；③以试纸条为探针载体进行杂交捕获时因PCR产物原本以双链形式存在，与单链探针结合效率偏低，导致检测的灵敏度下降，如显色不明显甚至无法看出胶体金颗粒结合带。
发明内容
为克服上述缺点，本发明的目的在于提供一种一管式高特异性核酸产物的PCR扩增方法及核酸快速检测方法。通过本发明的技术方案能够实现对目的核酸片段的一管式PCR特异性扩增，并将标记与目的核酸片段特异性结合。利用本发明的PCR扩增方法得到的产物能在通用型胶体金试纸条即可实现对目的核酸片段的特异性检测的效果，本发明的核酸检测方法方便、快速、准确。
本发明的目的之一在于，提供一种一管式高特异性核酸产物的PCR扩增方法，其包括第一循环阶段和第二循环阶段，且所述第一循环阶段和所述第二循环阶段的退火/延伸温度不同，在进行PCR扩增时的反应体系中包括一对引物，一对所述引物中的任意一个的5’端连接有A，在进行PCR扩增时的反应体系中还包括探针，所述探针标记有B，所述B与所述A不同。本发明的PCR扩增方法包括第一循环阶段和第二循环阶段，也即PCR扩增过程按照如下程序进行：预变性→[变性—退火/延伸1—(若干循环阶段)]→→[变性—退火/延伸2—(若干循环阶段)]，在PCR扩增时引入的探针的连接标记B与引物的连接标记A不同，因而能够增加核酸片段的识别特异性。
进一步的，所述探针与连接有A的引物所延伸的DNA单链的至少一部分片段互补。因而，探针序列存在于目标核酸DNA上，且探针序列位于上游引物和下游引物之间，因而确保按照本发明的方法扩增得到的目标产物上同时具有A标记和B标记，便于后续对目的核酸片段的高效识别。
更进一步的，所述探针的5’端不能被酶切，所述探针的3’端不能被延伸。因此当引物与DNA模板链结合并延伸时，遇到探针也无法切除探针5’端的修饰，从而使得引物无法与探针结合；此外，即使探针本身结合到模板上也无法延伸，因此引物和探针之间无法形成指数扩增，即使引物与探针与其他模板形成非特异结合，也无法扩增出足量产物，因而，只有在引物产生正确产物的基础上，探针才能与之配对并形成足量双重标记的核酸产物，从而确保得到的检测结果准确度高。
更进一步的，第一循环阶段的退火/延伸1的温度高于第二循环阶段的退火/延伸2的温度2℃以上，所述引物的退火温度与退火/延伸1的温度相接近，所述探针的退火温度低于所述引物的退火温度2℃以上，所述探针的退火温度高于退火2的温度。由于从退火/延伸1的温度到退火/延伸2的温度为逐渐降低的过程，因此，在高退火温度的条件下扩增时，探针无法有效结合到DNA模板上而处于游离状态，一对高Tm值的引物完成对DNA模板的预放大，即使此阶段发生引物非特异扩增，但形成的产物只具有一端标记，不会出现假阳性判定结果。降温前期以引物继续形成扩增产物为主，降温后期探针与模板结合逐渐增强，以形成双重标记核酸产物为主。在保证扩增效率的同时使扩增产物逐渐转化为双重标记产物。随着扩增的进行，能够检测的具有双标结构的目的核酸片段不断增加，从而能够得到足量的核酸片段，便于进行目的核酸片段的检测。
进一步的，所述A与所述B均为核酸标记物。
本发明的目的之二在于，提供一种核酸快速检测方法，其包括如下步骤：
(1)按照本发明的目的之一所述的一管式高特异性核酸产物的PCR扩增方法制备得到核酸产物；
(2)将胶体金与A的特异配体或B的特异配体结合后，将其与步骤(1)所得到的核酸产物混合；
(3)将B的特异配体与A、或A的特异配体与B分别设置于同一具有扩散效果的反应载体上；
(4)将步骤(2)所得到的混合物依次通过步骤(3)所得到的反应载体的设置有B的特异配体和A的区域、或依次通过步骤(3)所得到的反应载体的设置有A的特异配体和B的区域扩散通过，根据反应载体上的显色情况进行检测结果判读。在胶体金与A的特异配体结合后，能与步骤(1)得到的具有A和B双重标记的核酸产物结合，在核酸产物上结合胶体金，在结合有胶体金的核酸产物经过反应载体的设置B的特异配体的区域时，目的核酸产物中的标记B会与反应载体上的B的特异配体结合，并使结合有胶体金的核酸产物被部分截留并显色，在结合有胶体金的核酸产物经过反应载体的设置有A的区域时，与反应载体预设的A相结合并显色，设置有A的区域为质控区域，若设置有B的特异配体和A的区域均显色，可确定核酸产物为目的片段；同样的，在胶体金与B的特异配体结合后，能与步骤(1)得到的具有A和B双重标记的核酸产物结合，在核酸产物上结合胶体金，在将结合有胶体金的核酸产物依次经过反应载体的设置A的特异配体的区域时，目的核酸产物中的标记A与会与反应载体上的A的特异配体结合并显色，在结合有胶体金的核酸产物经过反应载体的设置有B的区域时，与反应载体预设的B相结合并显色，设置有B的区域为质控区域，若设置有A的特异配体和B的区域均显色，可确定核酸产物为目的片段。
进一步的，步骤(1)中在进行PCR扩增阶段的所述的探针与连接有A的引物所延伸的DNA单链的至少一部分片段互补，所述探针的5’端不能被酶切，所述探针的3’端不能被延伸。因此引物和探针之间无法形成指数扩增，即使引物与探针与其他模板形成非特异结合，也无法扩增出足量产物，因而确保利用步骤(1)得到的核酸产物中引入的双重标记能够有效结合于目的核酸片段上。
更进一步的，步骤(1)中的PCR扩增阶段的第一循环阶段的退火/延伸1的温度高于第二循环阶段的退火/延伸2的温度2℃以上，引物的退火温度与退火/延伸1的温度相接近，所述探针的退火温度低于所述引物的退火温度2℃以上，所述探针的退火温度高于退火/延伸2的温度。因此按照本发明的核酸检测方法的PCR扩增阶段，在高退火温度的条件下扩增时，探针无法有效结合到DNA模板上而处于游离状态，一对高Tm值的引物完成对DNA模板的预放大，即使此阶段发生引物非特异扩增，但形成的产物只具有一端标记，无法在反应载体显色。在降温前期，引物扩增出足量产物，降温后期探针与模板结合逐渐增强，从而形成了双重标记的核酸产物。在保证扩增效率的同时使扩增产物逐渐转化为双重标记产物。随着扩增的进行，能够检测的具有双标结构的目的核酸片段不断增加，从而使得具有足量的核酸片段，便于进行目的核酸片段的检测。
进一步的，所述反应载体为硝酸纤维素膜。
本发明的目的之三在于，提供一种核酸检测试纸卡，金标垫上设置有胶体金与权利要求1-5中任一项所述的A的特异配体的预混物或B的特异配体的预混物，当金标垫上设置有胶体金与A的特异配体的预混物时，在检测线包埋有B的特异配体，在质控线包埋有A；当金标垫上设置有胶体金与B的特异配体的预混物时，在检测线包埋有A的特异配体，在质控线包埋有B。
附图说明
图1为本发明核酸快速检测方法的技术原理示意图；
图2为利用本发明的方法对10个样本中的非洲猪瘟病毒的检测结果；
图3(a)-(j)为采用常规检测方法对同样的10个样本中的非洲猪瘟病毒的检测结果。
具体实施方式
本发明的核酸快速检测方法的操作步骤参见图1所示。
第一步，高特异性核酸产物的PCR扩增，其按照如下流程进行：预变性→[变性—退火/延伸1—(若干循环)]→→[变性—退火/延伸2—(若干循环)]，针对靶核酸序列涉及一对引物，在PCR扩增体系中，一对引物之一的5’端修饰大分子标记A，PCR扩增体系中加入5’端修饰大分子标记B的探针。A与B均可为核酸标记物，优选的，其可选自生物素、地高辛和异硫氰酸荧光素中的任意一种，且A与B不同时为同一种核酸标记物。探针的5’端标记有不能被外切酶切除的修饰，优选采用硫代磷酸化修饰，在探针的3’端标记有抑制其作为引物延伸的修饰，优选采用双脱氧核苷酸ddC。退火/延伸1的温度高于退火/延伸2的温度2℃以上，引物的退火温度与退火/延伸1的温度相接近，探针的退火温度低于所述一对引物的退火温度2℃以上，并且探针的退火温度略高于退火/延伸2的温度。
第二步，将胶体金与A的特异配体或B的特异配体结合后设置于胶体金试纸条的金标垫上；
第三步，将B的特异配体与A的特异配体、(或A的特异配体与B的特异配体)分别涂布于胶体金试纸条的反应线处和质控线处。在标记A或标记B选自生物素、地高辛或异硫氰酸荧光素时，与其相配对的特异配体分别为链霉亲和素、地高辛抗体和异硫氰酸荧光素抗体。
第四步，将第一步所得到的混合物依次扩散通过胶体金试纸条的金标垫、反应线和质控线，根据胶体金试纸条的显色情况进行检测结果判读。
下面以非洲猪瘟(ASFV)病毒的核酸检测为例进行说明，显然，本发明的保护方案并不仅局限于对非洲猪瘟病毒的检测。
以猪血浆为样本，共10例，利用Qiagen公司生产的QIAamp DSP Virus Spin Kit(货号：61704)进行病毒核酸纯化，分别按照本发明所述优选方法和常规荧光定量检测方法进行检测，然后进行对比分析。
1)引物/探针的设计和标记如表1所示：
表1非洲猪瘟病毒核酸检测的引物和探针的核苷酸序列
2)基于Thermo Fisher生产的PCR Master Mix(2X)(货号：K0171)的扩增试剂进行扩增，扩增体系由以下备份预混合而成；
3)在PCR仪上按照以下温度程序完成PCR扩增：
4)检测结果由图2所示。
2.按照常规检测方法进行检测：将剩余上述采集并完成纯化的10例样本的DNA，利用世纪元亨公司的非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂盒在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行检测。检测结果如图3所示。
表2利用本发明的核酸检测方法与常规检测方法的检测结果一致性对比
利用本发明的高特异性PCR扩增方法和市售试剂盒对10个样本的检测结果的统计分析如表2所示。由表2的结果可看出，两种方法的检测结果完全一致，由此证明了本发明的核酸检测方法的检测结果准确度高。
本发明具有如下有益效果：
按照本发明的方法，能够确保双重标记被充分结合于靶核酸片段上，在进行靶核酸的扩增时，由于第一循环阶段的退火/延伸1的温度高于第二循环阶段的退火/延伸2温度，且第一循环阶段的退火/延伸1的温度高于探针的退火温度，因而在第一循环阶段，探针无法有效结合到DNA模板上而处于游离状态，一对高Tm值的引物完成对DNA模板的预放大，即使此阶段发生引物的非特异扩增，但形成的产物只具有一端标记，不会产生假阳性的检测结果，且在第一循环阶段扩增出了足量的产物，便于进行检测。本发明的探针不会与引物直接连接，其只能与正常扩增的靶核酸配对并形成足量双重标记核酸产物。因而能够实现高效而特异的检测效果。
利用本发明的核酸检测方法，能够通过针对不同的DNA靶标，设计不同的引物和探针，而得到特异性的PCR扩增产物，因而降低了对胶体金试纸条的要求，不需在试纸条上杂交核酸，使得对靶核苷酸序列的检测过程简单，并有效降低了操作成本。此外，通过调节引物/探针的使用浓度比例，以及退火温度的设计、扩增温度的设置和扩增体系的调节达到特异性扩增的效率最大化。
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海千履基因科技有限公司
<120> 一管式高特异性核酸产物的PCR扩增方法、核酸快速检测方法和核酸检测试纸条
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagcacagct gaaccgttct gaag 24
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaataccaac ccagtggtca tattaacgt 29
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgtggtatc ggcatctgct at 22

Claims (10)

1.一种一管式高特异性核酸产物的PCR扩增方法，其特征在于，包括第一循环阶段和第二循环阶段，且所述第一循环阶段和所述第二循环阶段的退火/延伸温度不同，在进行PCR扩增时的反应体系中包括一对引物，一对所述引物中的任意一个的5’端连接有A，在进行PCR扩增时的反应体系中还包括探针，所述探针标记有B，所述B与所述A不同。
2.根据权利要求1所述的一管式高特异性核酸产物的PCR扩增方法，其特征在于，所述探针与连接有A的引物所延伸的DNA单链的至少一部分片段互补。
3.根据权利要求2所述的一管式高特异性核酸产物的PCR扩增方法，其特征在于，所述探针的5’端不能被酶切，所述探针的3’端不能被延伸。
4.根据权利要求3所述的一管式高特异性核酸产物的PCR扩增方法，其特征在于，第一循环阶段的退火/延伸1的温度高于第二循环阶段的退火/延伸2的温度2℃以上，所述引物的退火温度与退火/延伸1的温度相接近，所述探针的退火温度低于所述引物的退火温度2℃以上，所述探针的退火温度高于退火/延伸2的温度。
5.根据权利要求1所述的一管式高特异性核酸产物的PCR扩增方法，其特征在于，所述A与所述B为核酸标记物。
6.一种核酸快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按照权利要求1所述的一管式高特异性核酸产物的PCR扩增方法制备得到核酸产物；
(2)将胶体金与A的特异配体或B的特异配体结合后，将其与步骤(1)所得到的核酸产物混合；
(3)将B的特异配体与A、或A的特异配体与B分别设置于同一具有扩散效果的反应载体上；
(4)将步骤(2)所得到的混合物依次通过步骤(3)所得到的反应载体的设置有B的特异配体和A的区域、或依次通过步骤(3)所得到的反应载体的设置有A的特异配体和B的区域扩散通过，根据反应载体上的显色情况进行检测结果判读。
7.根据权利要求6所述的核酸快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中在进行PCR扩增阶段的所述的探针与连接有A的引物所延伸的DNA单链的至少一部分片段互补，所述探针的5’端不能被酶切，所述探针的3’端不能被延伸。
8.根据权利要求7所述的核酸快速检测方法，其特征在于，步骤(1)中的PCR扩增阶段的第一循环阶段的退火/延伸1的温度高于第二循环阶段的退火/延伸2的温度2℃以上，引物的退火温度与退火1的温度相接近，所述探针的退火温度低于所述引物的退火温度2℃以上，所述探针的退火温度高于退火/延伸2的温度。
9.根据权利要求6所述的核酸快速检测方法，其特征在于，所述反应载体为硝酸纤维素膜。
10.一种核酸检测试纸条，其特征在于，金标垫上设置有胶体金与权利要求1-5中任一项所述的A的特异配体的预混物或B的特异配体的预混物，当金标垫上设置有胶体金与A的特异配体的预混物时，在检测线包埋有B的特异配体，在质控线包埋有A；当金标垫上设置有胶体金与B的特异配体的预混物时，在检测线包埋有A的特异配体，在质控线包埋有B。
CN201911045819.9A 2019-10-30 2019-10-30 一管式高特异性核酸产物的pcr扩增方法、核酸快速检测方法和核酸检测试纸条 Withdrawn CN110592201A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911045819.9A CN110592201A (zh) 2019-10-30 2019-10-30 一管式高特异性核酸产物的pcr扩增方法、核酸快速检测方法和核酸检测试纸条

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911045819.9A CN110592201A (zh) 2019-10-30 2019-10-30 一管式高特异性核酸产物的pcr扩增方法、核酸快速检测方法和核酸检测试纸条

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110592201A true CN110592201A (zh) 2019-12-20

Family

ID=68852133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911045819.9A Withdrawn CN110592201A (zh) 2019-10-30 2019-10-30 一管式高特异性核酸产物的pcr扩增方法、核酸快速检测方法和核酸检测试纸条

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110592201A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111073984A (zh) * 2019-12-30 2020-04-28 江苏猎阵生物科技有限公司 一种检测靶核酸的试剂盒及方法
CN111518871A (zh) * 2020-04-28 2020-08-11 上海权阳生物科技有限公司 一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1228538A (zh) * 1997-12-24 1999-09-15 曼海姆泊灵格股份公司 分析元件的多种功能结构及其用于测定分析物的应用
WO2001057269A2 (en) * 2000-02-07 2001-08-09 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US20050037410A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-17 Dieter Heindl Detection format for hot start real time polymerase chain reaction
CN101818200A (zh) * 2010-03-04 2010-09-01 宁波博奥生物工程有限公司 创伤弧菌核酸定量检测试纸条
CN102618626A (zh) * 2011-01-30 2012-08-01 杭州优思达生物技术有限公司 一种快速单核苷酸多态性的检测方法及试剂盒
CN105002282A (zh) * 2015-07-29 2015-10-28 江苏猎阵生物科技有限公司 核酸检测试纸条及其制备方法和检测核酸的方法
CN105203759A (zh) * 2015-10-12 2015-12-30 武汉中帜生物科技股份有限公司 一种用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸的方法及试剂盒
CN109136408A (zh) * 2018-09-29 2019-01-04 南京农业大学 非洲猪瘟病毒的检测试剂、试剂盒及其应用
CN109797246A (zh) * 2019-02-23 2019-05-24 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种快速检测非洲猪瘟病毒rpa扩增引物及检测试剂盒

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1228538A (zh) * 1997-12-24 1999-09-15 曼海姆泊灵格股份公司 分析元件的多种功能结构及其用于测定分析物的应用
WO2001057269A2 (en) * 2000-02-07 2001-08-09 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US20050037410A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-17 Dieter Heindl Detection format for hot start real time polymerase chain reaction
US20090181401A1 (en) * 2003-08-01 2009-07-16 Dieter Heindl Detection format for hot start real time polymerase chain reaction
CN101818200A (zh) * 2010-03-04 2010-09-01 宁波博奥生物工程有限公司 创伤弧菌核酸定量检测试纸条
CN102618626A (zh) * 2011-01-30 2012-08-01 杭州优思达生物技术有限公司 一种快速单核苷酸多态性的检测方法及试剂盒
CN105002282A (zh) * 2015-07-29 2015-10-28 江苏猎阵生物科技有限公司 核酸检测试纸条及其制备方法和检测核酸的方法
CN105203759A (zh) * 2015-10-12 2015-12-30 武汉中帜生物科技股份有限公司 一种用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸的方法及试剂盒
CN109136408A (zh) * 2018-09-29 2019-01-04 南京农业大学 非洲猪瘟病毒的检测试剂、试剂盒及其应用
CN109797246A (zh) * 2019-02-23 2019-05-24 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种快速检测非洲猪瘟病毒rpa扩增引物及检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIHUA XIAO等: "Quantitation of RT-PCR amplified cytokine mRNA by aequorin-based bioluminescence immunoassay", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 *
蒋韬: "免疫层析技术在口蹄疫POCT中的应用研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)农业科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111073984A (zh) * 2019-12-30 2020-04-28 江苏猎阵生物科技有限公司 一种检测靶核酸的试剂盒及方法
CN111518871A (zh) * 2020-04-28 2020-08-11 上海权阳生物科技有限公司 一种利用复合磁珠实现核酸可视化检验方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4268944B2 (ja) 核酸の検出あるいは定量方法
CN106399517B (zh) 一种多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感的核酸检测技术
CN104755630B (zh) 多阶段核酸扩增
CN110106290A (zh) 一种基于CRISPR/Cas系统用于检测ASFV的现场快速检测方法及试剂盒
CN110804669B (zh) 用于肺炎支原体的crispr检测引物组及其用途
WO2022077687A1 (zh) 一种新型crispr核酸检测方法及应用
EP0855447B1 (en) Method of assay of nucleic acid sequences
JP2012008148A (ja) ディップスティック検定における改良型検出シグナルおよび捕捉
US7186508B2 (en) Capture and detection of target nucleic acid in dipstick assays
CN109913565B (zh) 一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒、引物对、探针及方法
WO2023284514A1 (zh) 一种超灵敏抗体检测方法
US20240002917A1 (en) Method of detection of a target nucleic acid sequence
AU2001267752A1 (en) Improved capture and detection of target nucleic acid in dipstick assays
US11685960B2 (en) Rapid nucleic acid detection without sample preparation
CN110592201A (zh) 一管式高特异性核酸产物的pcr扩增方法、核酸快速检测方法和核酸检测试纸条
CN113684317B (zh) 一种基于CRISPR-Cas12b对乙肝病毒B型和C型的超灵敏快速检测及鉴别系统
US9121054B2 (en) Detection of nucleic acid amplification products in the presence of an internal control sequence on an immunochromatographic strip
Gao et al. Rapid isothermal detection assay: a probe amplification method for the detection of nucleic acids
CN110982814A (zh) 一种引物及其用途
CN106191314B (zh) 一种dna病毒的lamp检测试剂盒、检测方法及应用
Bortolin et al. Time-resolved immunofluorometric determination of specific mRNA sequences amplified by the polymerase chain reaction
CN115058493B (zh) 一种用于多重核酸检测的dna探针、crispr-反向点杂交核酸检测系统及应用
JP2001013139A (ja) 免疫学的測定法
Watanabe et al. Simultaneous detection of two verotoxin genes using dual‐label time‐resolved fluorescence immunoassay with duplex PCR
CN113201593B (zh) 用于检测actn3基因型的引物探针组合产品

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20191220