JP2001013139A - 免疫学的測定法 - Google Patents
免疫学的測定法Info
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- JP2001013139A JP2001013139A JP11182063A JP18206399A JP2001013139A JP 2001013139 A JP2001013139 A JP 2001013139A JP 11182063 A JP11182063 A JP 11182063A JP 18206399 A JP18206399 A JP 18206399A JP 2001013139 A JP2001013139 A JP 2001013139A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】熱サイクルを必要としない核酸増幅法を用いる
ことにより、抗原抗体反応を損なうことがなく、簡便か
つ迅速で、しかも極めて微量の生体試料成分を検出及び
定量することが可能な高感度な免疫測定法を提供する。 【解決手段】増幅されうる塩基配列を有する核酸が標識
されてなる生体試料成分と免疫学的に反応性を有する抗
体もしくは抗原を用いた免疫学的測定法であって、該抗
体もしくは該抗原と生体試料成分とを反応せしめ、次い
で得られた該抗体もしくは該抗原と該生体試料成分との
複合体において結合される該核酸を標的核酸としてＮＡ
ＳＢＡ法、３ＳＲ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法およびＣＰＲ
法等の恒温核酸増幅反応を行い、増幅された該核酸を検
出することにより生体試料成分を検出もしくは定量する
ことを特徴とする免疫学的測定法。
ことにより、抗原抗体反応を損なうことがなく、簡便か
つ迅速で、しかも極めて微量の生体試料成分を検出及び
定量することが可能な高感度な免疫測定法を提供する。 【解決手段】増幅されうる塩基配列を有する核酸が標識
されてなる生体試料成分と免疫学的に反応性を有する抗
体もしくは抗原を用いた免疫学的測定法であって、該抗
体もしくは該抗原と生体試料成分とを反応せしめ、次い
で得られた該抗体もしくは該抗原と該生体試料成分との
複合体において結合される該核酸を標的核酸としてＮＡ
ＳＢＡ法、３ＳＲ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法およびＣＰＲ
法等の恒温核酸増幅反応を行い、増幅された該核酸を検
出することにより生体試料成分を検出もしくは定量する
ことを特徴とする免疫学的測定法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細菌、ウイルス、
寄生虫等の感染疾患の診断、自己免疫疾患等の診断、組
織適合抗原の検出、ホルモンの検出、ホルモン異常の診
断、癌診断、食品中の細菌毒素の検出等において微量の
生体試料から免疫学的方法により、試料成分を検出もし
くは定量する免疫学的測定法に関する。
寄生虫等の感染疾患の診断、自己免疫疾患等の診断、組
織適合抗原の検出、ホルモンの検出、ホルモン異常の診
断、癌診断、食品中の細菌毒素の検出等において微量の
生体試料から免疫学的方法により、試料成分を検出もし
くは定量する免疫学的測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、生体試料成分の検出や測定に際し
ては、特異性の高い抗原抗体反応を利用した免疫測定法
が好んで用いられている。この方法では、生体試料成分
と免疫学的に反応する抗体または抗原を放射性物質や酵
素などで標識し、最終的に反応した標識物を検出及び測
定することにより目的成分の検出及び定量を行うが、こ
れらの方法で通常用いられる標識物による検出及び測定
の感度には理論的に限界があり、標識物の検出限界が目
的成分の検出、測定の感度を定める最大要因となってい
る。しかも上記の検出限界は、例外的に感度の高い場合
はあるが、実際にはある物質とそれに対する特異的結合
性物質との親和性が、必ずしも満足できる程に高いとは
限らないことが多い。
ては、特異性の高い抗原抗体反応を利用した免疫測定法
が好んで用いられている。この方法では、生体試料成分
と免疫学的に反応する抗体または抗原を放射性物質や酵
素などで標識し、最終的に反応した標識物を検出及び測
定することにより目的成分の検出及び定量を行うが、こ
れらの方法で通常用いられる標識物による検出及び測定
の感度には理論的に限界があり、標識物の検出限界が目
的成分の検出、測定の感度を定める最大要因となってい
る。しかも上記の検出限界は、例外的に感度の高い場合
はあるが、実際にはある物質とそれに対する特異的結合
性物質との親和性が、必ずしも満足できる程に高いとは
限らないことが多い。
【０００３】酵素免疫測定法では、アビジン−ビオチン
系を用いた増幅方法が一般的であるが、ビオチン化ある
いはアビジン化した標識物の非特異的な結合によるバッ
クグラウンドが高くなり、感度が悪くなるという欠点が
ある。高感度化の操作のために特異性の非常に高い方法
を採用することによって、バックグラウンドの干渉を抑
えることが求められるところである。
系を用いた増幅方法が一般的であるが、ビオチン化ある
いはアビジン化した標識物の非特異的な結合によるバッ
クグラウンドが高くなり、感度が悪くなるという欠点が
ある。高感度化の操作のために特異性の非常に高い方法
を採用することによって、バックグラウンドの干渉を抑
えることが求められるところである。
【０００４】一方、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）
は、鋳型となる特定のＤＮＡ領域に対して、その領域を
挟むように２つのプライマーをアニールさせ、ＤＮＡポ
リメラーゼを用いた反応を繰り返すことによって、鋳型
の領域を特異的に増幅する方法である（特開昭６１−２
７４６９７号公報）。この方法を利用すれば、特定領域
を１０万〜１００万倍に増幅をする事が可能であり、試
験中の１ＤＮＡ分子の存在でも検出が可能である事が報
告されている〔リ（Ｈ．Ｌｉ）らネイチャー（Nature、
第３３５巻、４１４〜４１７頁、１９８８）〕。そこで
微量検体を用いた遺伝子診断、ウイルス診断、微生物検
出等の利用が考案されている。しかしながら、ＰＣＲ法
はＤＮＡやＲＮＡのような核酸を検出する目的には非常
に優れた方法であるが、核酸以外の物質を増幅すること
は不可能であり、これらの検出には適用されないといっ
た欠点がある。
は、鋳型となる特定のＤＮＡ領域に対して、その領域を
挟むように２つのプライマーをアニールさせ、ＤＮＡポ
リメラーゼを用いた反応を繰り返すことによって、鋳型
の領域を特異的に増幅する方法である（特開昭６１−２
７４６９７号公報）。この方法を利用すれば、特定領域
を１０万〜１００万倍に増幅をする事が可能であり、試
験中の１ＤＮＡ分子の存在でも検出が可能である事が報
告されている〔リ（Ｈ．Ｌｉ）らネイチャー（Nature、
第３３５巻、４１４〜４１７頁、１９８８）〕。そこで
微量検体を用いた遺伝子診断、ウイルス診断、微生物検
出等の利用が考案されている。しかしながら、ＰＣＲ法
はＤＮＡやＲＮＡのような核酸を検出する目的には非常
に優れた方法であるが、核酸以外の物質を増幅すること
は不可能であり、これらの検出には適用されないといっ
た欠点がある。
【０００５】そこで、抗原抗体反応において、標識物と
して核酸を用い、抗原抗体反応せしめた後に核酸をＰＣ
Ｒ法を用いて、検出感度を高めることができること(imm
uno-ＰＣＲ法)が報告されている(Sanoら、Science、Vo
l.258、120-122、1992)。しかし、ＰＣＲ反応を行う場
合、核酸の変性、プライマーのアニール、プライマーの
伸長とういう工程を経るため、熱変性サイクルが必要で
あり、その為に特別な機器が必要となってくる。さらに
は熱反応により、結合した抗原抗体反応が損なわれる欠
点もある。
して核酸を用い、抗原抗体反応せしめた後に核酸をＰＣ
Ｒ法を用いて、検出感度を高めることができること(imm
uno-ＰＣＲ法)が報告されている(Sanoら、Science、Vo
l.258、120-122、1992)。しかし、ＰＣＲ反応を行う場
合、核酸の変性、プライマーのアニール、プライマーの
伸長とういう工程を経るため、熱変性サイクルが必要で
あり、その為に特別な機器が必要となってくる。さらに
は熱反応により、結合した抗原抗体反応が損なわれる欠
点もある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、熱サ
イクルを必要としない核酸増幅法を用いることにより、
抗原抗体反応を損なうことなく、極めて微量の生体試料
成分を検出及び定量することが可能な免疫測定法を提供
することにある。
イクルを必要としない核酸増幅法を用いることにより、
抗原抗体反応を損なうことなく、極めて微量の生体試料
成分を検出及び定量することが可能な免疫測定法を提供
することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み、鋭意検討を行った結果、標識物の検出限界に由
来する問題に対し、生体試料成分と反応性を有する抗原
もしくは抗体を核酸により標識化し、抗原抗体反応を行
った後に該核酸を恒温増幅法を用いて増幅することによ
り、簡便かつ迅速でしかも高感度な検出が可能となるこ
とを見出し、本発明を完成させるに至った。
に鑑み、鋭意検討を行った結果、標識物の検出限界に由
来する問題に対し、生体試料成分と反応性を有する抗原
もしくは抗体を核酸により標識化し、抗原抗体反応を行
った後に該核酸を恒温増幅法を用いて増幅することによ
り、簡便かつ迅速でしかも高感度な検出が可能となるこ
とを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】すなわち、本発明は以下のような構成から
成る。 （１）増幅されうる塩基配列を有する核酸が標識されて
なる生体試料成分と免疫学的に反応性を有する抗体もし
くは抗原を用いた免疫学的測定法であって、該抗体もし
くは該抗原と生体試料成分とを反応せしめ、次いで得ら
れた該抗体もしくは該抗原と該生体試料成分との複合体
において結合される該核酸を標的核酸として恒温核酸増
幅反応を行い、増幅された該核酸を検出することにより
生体試料成分を検出もしくは定量することを特徴とする
免疫学的測定法。 （２）恒温核酸増幅反応が、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、
ＳＤＡ法、ＴＭＡ法およびＣＰＲ法よりなる群から選ば
れたいずれかの方法により行われる（１）の方法。 （３）核酸増幅反応および核酸検出反応とを同時に行う
（１）または（２）の方法。 （４）核酸配列が、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本
鎖ＲＮＡよりなる群から選ばれたいずれかである（１）
〜（３）のいずれかの方法。 （５）核酸配列が、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を含む核酸配列である（４）の方法。
成る。 （１）増幅されうる塩基配列を有する核酸が標識されて
なる生体試料成分と免疫学的に反応性を有する抗体もし
くは抗原を用いた免疫学的測定法であって、該抗体もし
くは該抗原と生体試料成分とを反応せしめ、次いで得ら
れた該抗体もしくは該抗原と該生体試料成分との複合体
において結合される該核酸を標的核酸として恒温核酸増
幅反応を行い、増幅された該核酸を検出することにより
生体試料成分を検出もしくは定量することを特徴とする
免疫学的測定法。 （２）恒温核酸増幅反応が、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法、
ＳＤＡ法、ＴＭＡ法およびＣＰＲ法よりなる群から選ば
れたいずれかの方法により行われる（１）の方法。 （３）核酸増幅反応および核酸検出反応とを同時に行う
（１）または（２）の方法。 （４）核酸配列が、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本
鎖ＲＮＡよりなる群から選ばれたいずれかである（１）
〜（３）のいずれかの方法。 （５）核酸配列が、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を含む核酸配列である（４）の方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明において抗原抗体反応と
は、具体的にはＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosor
bent assay）であり、一般的なＥＬＩＳＡにおける検出
および測定の限界を飛躍的に向上させ、標識物の検出限
界に由来する問題を解決するものである。即ち、ＥＬＩ
ＳＡで用いられる標識体を核酸とし、抗原抗体反応を行
った後、核酸を恒温増幅することを特徴とする簡便かつ
迅速な高感度検出法である。本発明は、標識物を用いた
ＥＬＩＳＡの全てに適用されうるものであり、従来のＥ
ＬＩＳＡ検出および定量による微量な生体試料成分の測
定法の代わりに用いることが出来るものである。ここ
で、検出あるいは定量される生体試料中に、核酸を含ん
でいるか否かは問題とならない。該生体試料が核酸を含
んでいる場合には、その核酸中に含まれない塩基配列を
標識として用いれば良い。いずれの場合であっても、標
識に用いた核酸は、オリゴヌクレオチドからキロ塩基単
位の大きさのものまで利用可能であるが、抗原抗体反応
の特異的結合を妨害しない程度の大きさであることが望
ましい。
は、具体的にはＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosor
bent assay）であり、一般的なＥＬＩＳＡにおける検出
および測定の限界を飛躍的に向上させ、標識物の検出限
界に由来する問題を解決するものである。即ち、ＥＬＩ
ＳＡで用いられる標識体を核酸とし、抗原抗体反応を行
った後、核酸を恒温増幅することを特徴とする簡便かつ
迅速な高感度検出法である。本発明は、標識物を用いた
ＥＬＩＳＡの全てに適用されうるものであり、従来のＥ
ＬＩＳＡ検出および定量による微量な生体試料成分の測
定法の代わりに用いることが出来るものである。ここ
で、検出あるいは定量される生体試料中に、核酸を含ん
でいるか否かは問題とならない。該生体試料が核酸を含
んでいる場合には、その核酸中に含まれない塩基配列を
標識として用いれば良い。いずれの場合であっても、標
識に用いた核酸は、オリゴヌクレオチドからキロ塩基単
位の大きさのものまで利用可能であるが、抗原抗体反応
の特異的結合を妨害しない程度の大きさであることが望
ましい。
【００１０】本発明において測定対象となる生体試料成
分としては、血液、血清、血漿、リンパ液、尿、糞便、
腹水、胸水、組織標本などが広く生体に由来するものが
挙げられる。
分としては、血液、血清、血漿、リンパ液、尿、糞便、
腹水、胸水、組織標本などが広く生体に由来するものが
挙げられる。
【００１１】本発明において、標識として用いられる核
酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、さらには一本鎖でも
二本鎖でもよい。しかし一本鎖のＲＮＡは、被検液中あ
るいは増幅反応液中のＲＮａｓｅ活性により、容易に分
解されるので、一本鎖で用いる場合は一般的にＤＮＡを
使用するか、あるいは修飾ヌクレオチドで合成したＲＮ
ａｓｅ耐性のあるＲＮＡの必要がある。二本鎖の場合は
いずれでもよい。さらには、ＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を含んでいても良い。
酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、さらには一本鎖でも
二本鎖でもよい。しかし一本鎖のＲＮＡは、被検液中あ
るいは増幅反応液中のＲＮａｓｅ活性により、容易に分
解されるので、一本鎖で用いる場合は一般的にＤＮＡを
使用するか、あるいは修飾ヌクレオチドで合成したＲＮ
ａｓｅ耐性のあるＲＮＡの必要がある。二本鎖の場合は
いずれでもよい。さらには、ＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を含んでいても良い。
【００１２】本発明において、核酸を標識する方法は、
標識核酸を合成する際に、抗原または抗体と結合し得る
ように、予め修飾を加えておき、次に該標識物と被標識
物を反応させて結合することにより行うのが好ましい。
例えば、核酸の５′末端にＳＨ基を導入し、予め被標識
物に導入しておいたマレイミド基と反応させることによ
り標識する方法が知られている（Innis ら，PCR Protoc
ols， Academic Press, 1990）。あるいは、上記ＳＨ基
と生物学的成分のＳＨ基を酸化することにより、ジスル
フィド結合を形成させることも可能である。
標識核酸を合成する際に、抗原または抗体と結合し得る
ように、予め修飾を加えておき、次に該標識物と被標識
物を反応させて結合することにより行うのが好ましい。
例えば、核酸の５′末端にＳＨ基を導入し、予め被標識
物に導入しておいたマレイミド基と反応させることによ
り標識する方法が知られている（Innis ら，PCR Protoc
ols， Academic Press, 1990）。あるいは、上記ＳＨ基
と生物学的成分のＳＨ基を酸化することにより、ジスル
フィド結合を形成させることも可能である。
【００１３】アビジン−ビオチンのような特異的かつ強
い結合性を利用して、間接的に核酸を結合することも可
能である。例えば、まず被標識物をビオチン化してお
き、次にこの標識ビオチンに対して過剰のアビジンを結
合させる。１分子のアビジンは４分子のビオチンと結合
し得るが、アビジン過剰の条件下においては、標識ビオ
チンとアビジンが１対１の量比で結合し、被標識物質に
結合したアビジンは、さらにビオチン３分子との結合能
力を保持している。次に、予めビオチン化した核酸を反
応させることによって、アビジンを介して核酸による標
識が行うことができる。この方法では、抗原−抗体複合
体を形成した後に、核酸による標識化が可能であるの
で、複合体の形成にほとんど影響を与えることなく、大
きな核酸分子でも標識として用いることが出来る。さら
には、抗体を標識する場合、プロテインＡとストレプト
アビジンのキメラ蛋白を用いることも可能である(Sano
ら、Science、Vol.258、120-122、1992)。
い結合性を利用して、間接的に核酸を結合することも可
能である。例えば、まず被標識物をビオチン化してお
き、次にこの標識ビオチンに対して過剰のアビジンを結
合させる。１分子のアビジンは４分子のビオチンと結合
し得るが、アビジン過剰の条件下においては、標識ビオ
チンとアビジンが１対１の量比で結合し、被標識物質に
結合したアビジンは、さらにビオチン３分子との結合能
力を保持している。次に、予めビオチン化した核酸を反
応させることによって、アビジンを介して核酸による標
識が行うことができる。この方法では、抗原−抗体複合
体を形成した後に、核酸による標識化が可能であるの
で、複合体の形成にほとんど影響を与えることなく、大
きな核酸分子でも標識として用いることが出来る。さら
には、抗体を標識する場合、プロテインＡとストレプト
アビジンのキメラ蛋白を用いることも可能である(Sano
ら、Science、Vol.258、120-122、1992)。
【００１４】さらには、本発明において、恒温核酸増幅
法とは、一定の温度において、標識核酸をその固有の配
列の相補性を利用して増幅する方法をいう。該核酸増幅
法としては、特に限定されるものではないが、具体的に
は、例えば、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic acid sequence-ba
sed amplification Method:Nature 350,p91,1991）、Ｓ
ＤＡ法（Strand Displacement Amplification:Nucleic
Acids Res. 20,p1691,1992）、ＴＭＡ法（Transcriptio
n Mediated Amplification Method:J.Clin.Microbiol.
31,p3270,1993）、３ＳＲ法（Self Sustained sequence
Replication Reactions:Proc.Nat.Acad.Sci.,USA 87,p
1874-1878,1990）、ＣＰＲ法（特許第２６９１１７７号
公報）などが挙げられ、いずれの方法においても適用す
ることが可能である。
法とは、一定の温度において、標識核酸をその固有の配
列の相補性を利用して増幅する方法をいう。該核酸増幅
法としては、特に限定されるものではないが、具体的に
は、例えば、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic acid sequence-ba
sed amplification Method:Nature 350,p91,1991）、Ｓ
ＤＡ法（Strand Displacement Amplification:Nucleic
Acids Res. 20,p1691,1992）、ＴＭＡ法（Transcriptio
n Mediated Amplification Method:J.Clin.Microbiol.
31,p3270,1993）、３ＳＲ法（Self Sustained sequence
Replication Reactions:Proc.Nat.Acad.Sci.,USA 87,p
1874-1878,1990）、ＣＰＲ法（特許第２６９１１７７号
公報）などが挙げられ、いずれの方法においても適用す
ることが可能である。
【００１５】本発明において、増幅された核酸を検出す
る方法としては、特に限定されるものではないが、公知
の方法により行うのが好ましい。例えば、放射性同位元
素、酵素及び蛍光物質等を用いて行うのが好ましい。そ
の方法としては、一般的な核酸ハイブリダイゼーション
法、核酸特異抗体を用いたＥＬＩＳＡ等の方法を用いる
ことが可能である。核酸ハイブリダイゼーション法には
ナイロン膜に増幅核酸を結合させ、標識プローブにより
検出する方法や、補足プローブを担体に結合させてお
き、検出プローブでサンドイッチする方法や、核酸特異
抗体を用いてサンドイッチする方法がある。さらには２
本鎖を形成したときに特異的に蛍光を発する色素やプロ
ーブを用いることにより、恒温核酸増幅反応と同時に検
出することも可能である。また、増幅反応と同時に検出
する方法としては、蛍光団と、消光団を標識したプロー
ブを用いる方法も可能である。
る方法としては、特に限定されるものではないが、公知
の方法により行うのが好ましい。例えば、放射性同位元
素、酵素及び蛍光物質等を用いて行うのが好ましい。そ
の方法としては、一般的な核酸ハイブリダイゼーション
法、核酸特異抗体を用いたＥＬＩＳＡ等の方法を用いる
ことが可能である。核酸ハイブリダイゼーション法には
ナイロン膜に増幅核酸を結合させ、標識プローブにより
検出する方法や、補足プローブを担体に結合させてお
き、検出プローブでサンドイッチする方法や、核酸特異
抗体を用いてサンドイッチする方法がある。さらには２
本鎖を形成したときに特異的に蛍光を発する色素やプロ
ーブを用いることにより、恒温核酸増幅反応と同時に検
出することも可能である。また、増幅反応と同時に検出
する方法としては、蛍光団と、消光団を標識したプロー
ブを用いる方法も可能である。
【００１６】
【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００１７】実施例１ 核酸標識した抗体を用いること
によるヒトＩｇＧ測定の高感度検出 （１）ビオチン化標識核酸の合成 パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用
いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマ
ー１と呼ぶ）および配列番号２に示される塩基配列を有
するビオチン化オリゴヌクレオチド（以下、プライマー
２と呼ぶ）を合成した。
によるヒトＩｇＧ測定の高感度検出 （１）ビオチン化標識核酸の合成 パーキンエルマー社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用
いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１に示される
塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマ
ー１と呼ぶ）および配列番号２に示される塩基配列を有
するビオチン化オリゴヌクレオチド（以下、プライマー
２と呼ぶ）を合成した。
【００１８】プライマー１は、増幅対象となる核酸に相
補的な配列（２０ヌクレオチド）の５’側に、Ｔ７プロ
モーター配列（２７ヌクレオチド）を連結している。合
成は上記装置のマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオ
チドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。
オリゴヌクレオチドの精製はファルマシア社製ＦＰＬＣ
で陰イオン交換カラムにて実施した。
補的な配列（２０ヌクレオチド）の５’側に、Ｔ７プロ
モーター配列（２７ヌクレオチド）を連結している。合
成は上記装置のマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオ
チドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。
オリゴヌクレオチドの精製はファルマシア社製ＦＰＬＣ
で陰イオン交換カラムにて実施した。
【００１９】プライマー２は、増幅対象となる核酸に相
補的な配列（２０ヌクレオチド）の５’側に、ビオチン
を連結している。ビオチンの結合はパーキンエルマー社
製の、ビオチンアミダイトを用いて行った。合成はその
マニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護は
アンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオ
チドの精製はＨＰＬＣにより、逆相カラム（ファルマシ
ア製Resource RPC）を用いて実施した。
補的な配列（２０ヌクレオチド）の５’側に、ビオチン
を連結している。ビオチンの結合はパーキンエルマー社
製の、ビオチンアミダイトを用いて行った。合成はその
マニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護は
アンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオ
チドの精製はＨＰＬＣにより、逆相カラム（ファルマシ
ア製Resource RPC）を用いて実施した。
【００２０】増幅対象となる核酸を含むｃＤＮＡを鋳型
として、前記プライマー１及び前記プライマー２を用い
てＰＣＲ反応を行いビオチン化標識を作製した。ＰＣＲ
反応は以下の条件で行った。
として、前記プライマー１及び前記プライマー２を用い
てＰＣＲ反応を行いビオチン化標識を作製した。ＰＣＲ
反応は以下の条件で行った。
【００２１】反応液 トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．９） １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ 牛血清アルブミン ５００μg/ml コール酸ナトリウム ０．１％ TritonX-100 ０．１％ ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ プライマー１ ０．２μＭ プライマー２ ０．２μＭ Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ ４Ｕ 標的核酸 ０．１ｎｇ
【００２２】増幅サイクル 変性 ９４℃、１分 アニール ５５℃、２分 伸長 ７２℃、１．５分 ３０サイクル
【００２３】（２）ビオチン標識核酸の精製 上記増幅反応が成功したことを、２％アガロースゲルを
用いて電気泳動を行って確認した後、増幅反応液を直接
QIAGEN社のQIAquick PCR purification kitsを用いて精
製し、吸光度を測定して濃度を計算した。
用いて電気泳動を行って確認した後、増幅反応液を直接
QIAGEN社のQIAquick PCR purification kitsを用いて精
製し、吸光度を測定して濃度を計算した。
【００２４】（３）捕捉抗体のマイクロタイタープレー
トへの結合とブロッキング ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体(DAKO製、Cat.No.A0423)を０．
０５Ｎ ＮａＨＣＯ3で、８０００倍に希釈し、マイク
ロタイタープレート（MicroFLUOR B、ダイナテック社）
に各５０μｌずつ分注し、４℃で一晩放置した。その
後、３％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液(ＰＢＳ
（−）)に置換して、非特異反応を抑えるためのブロッ
キングを３７℃で１時間程度行った。
トへの結合とブロッキング ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体(DAKO製、Cat.No.A0423)を０．
０５Ｎ ＮａＨＣＯ3で、８０００倍に希釈し、マイク
ロタイタープレート（MicroFLUOR B、ダイナテック社）
に各５０μｌずつ分注し、４℃で一晩放置した。その
後、３％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液(ＰＢＳ
（−）)に置換して、非特異反応を抑えるためのブロッ
キングを３７℃で１時間程度行った。
【００２５】（４）抗原抗体反応 上記（３）で作成したマイクロタイタープレートのブロ
ッキング溶液を除去した後、ヒトＩｇＧ(DAKO製、Cat.N
o.X0593)を１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳ（−）で、
５０pg/ml、５pg/ml、０．５ pg/ml、０．０５ pg/ml及
び０pg/mlの各濃度の希釈溶液を作成し、各濃度の希釈
液１００μlを添加し、３７℃で２時間反応させた。
ッキング溶液を除去した後、ヒトＩｇＧ(DAKO製、Cat.N
o.X0593)を１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳ（−）で、
５０pg/ml、５pg/ml、０．５ pg/ml、０．０５ pg/ml及
び０pg/mlの各濃度の希釈溶液を作成し、各濃度の希釈
液１００μlを添加し、３７℃で２時間反応させた。
【００２６】（５）標識抗体の反応 上記（４）で反応したマイクロタイタープレートを０．
０２５％ Tween20含有ＰＢＳ（−）で３回洗浄した
後、２０００倍に希釈したビオチン標識抗体(DAKO製、C
at.No.E0482)を１００μｌ添加して、３７℃で２時間反
応させた。
０２５％ Tween20含有ＰＢＳ（−）で３回洗浄した
後、２０００倍に希釈したビオチン標識抗体(DAKO製、C
at.No.E0482)を１００μｌ添加して、３７℃で２時間反
応させた。
【００２７】（６）ストレプトアビジン反応 （５）で反応したマイクロタイタープレートを０．０２
５％ Tween20含有ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、１
μｇ／ｍｌ濃度のストレプトアビジン溶液１００μｌを
添加し、３７℃で１５分反応させた。
５％ Tween20含有ＰＢＳ（−）で３回洗浄した後、１
μｇ／ｍｌ濃度のストレプトアビジン溶液１００μｌを
添加し、３７℃で１５分反応させた。
【００２８】（６）で反応したマイクロタイタープレー
トを０．０２５％ Tween20含有ＰＢＳ（−）で３回洗
浄した後、核酸標識群は、（２）で調製したビオチン標
識核酸を１０3分子／ｍｌに調製し、１００μｌを添加
し、３７℃で１５分反応させた。一方、比較例として、
酵素標識を用いたアッセイ系についても検討を行った。
酵素標識群は、０．５μｇ／ｍｌ濃度のビオチン標識ア
ルカリフォスファターゼ１００μｌを添加し、３７℃で
１５分反応させた。
トを０．０２５％ Tween20含有ＰＢＳ（−）で３回洗
浄した後、核酸標識群は、（２）で調製したビオチン標
識核酸を１０3分子／ｍｌに調製し、１００μｌを添加
し、３７℃で１５分反応させた。一方、比較例として、
酵素標識を用いたアッセイ系についても検討を行った。
酵素標識群は、０．５μｇ／ｍｌ濃度のビオチン標識ア
ルカリフォスファターゼ１００μｌを添加し、３７℃で
１５分反応させた。
【００２９】（７）標識核酸の増幅 上記（６）で、核酸標識抗体で反応させたマイクロタイ
タープレートを、０．０２５％ Tween２０含有ＰＢＳ
（−）で３回洗浄した後、ＮＡＳＢＡ法により、標識核
酸の増幅を行った。ＮＡＳＢＡ法は以下の反応液を添加
し、４１℃で９０分間保温することにより行った。
タープレートを、０．０２５％ Tween２０含有ＰＢＳ
（−）で３回洗浄した後、ＮＡＳＢＡ法により、標識核
酸の増幅を行った。ＮＡＳＢＡ法は以下の反応液を添加
し、４１℃で９０分間保温することにより行った。
【００３０】反応液 トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５） ４０ｍＭ ＭｇＣｌ2 １２ｍＭ 牛血清アルブミン １mg/ml 塩化カリウム ７０ｍＭ ＤＴＴ ５ｍＭ ｄＮＴＰ １ｍＭ ｒＮＴＰ ２ｍＭ プライマー１ ０．２μＭ 非ビオチン化プライマー２ ０．２μＭ ＡＭＶ逆転写酵素 ７．５Ｕ ＲＮａｓｅＨ ０．０８Ｕ ＲＮＡポリメラーゼ ２０Ｕ
【００３１】（８）増幅核酸の検出 増幅核酸の検出はマイクロプレートを用いたサンドイッ
チハイブリダイゼーション法により行った（特願平９−
１３３５５３号）。
チハイブリダイゼーション法により行った（特願平９−
１３３５５３号）。
【００３２】（９）アルカリフォスファターゼ標識の検
出 上記（６）で、アルカリフォスファターゼ標識抗体で反
応させたプレートを、０．０２５％ Tween20含有ＰＢＳ
（−）で３回洗浄した後、アルカリ性ホスファターゼの
発光基質であるジオキセタン化合物（商品名：Lumiphos
480、Lumigen社）１００μｌを注入し、３７℃で１５
分間保温後に暗室中でホトンカウンター（浜松ホトニク
ス社）で発光量を測定した。
出 上記（６）で、アルカリフォスファターゼ標識抗体で反
応させたプレートを、０．０２５％ Tween20含有ＰＢＳ
（−）で３回洗浄した後、アルカリ性ホスファターゼの
発光基質であるジオキセタン化合物（商品名：Lumiphos
480、Lumigen社）１００μｌを注入し、３７℃で１５
分間保温後に暗室中でホトンカウンター（浜松ホトニク
ス社）で発光量を測定した。
【００３３】（１０）核酸標識した抗体を用いることに
よるヒトＩｇＧ測定の高感度検出検討結果 上記（８）及び（９）において検出されたヒトＩｇＧの
検出結果を表１に示す。表中の数値は発光量（cps；cou
nt/second）で表示されている。
よるヒトＩｇＧ測定の高感度検出検討結果 上記（８）及び（９）において検出されたヒトＩｇＧの
検出結果を表１に示す。表中の数値は発光量（cps；cou
nt/second）で表示されている。
【００３４】
【表１】
【００３５】アルカリフォスファターゼ標識抗体に比較
して、核酸標識抗体を用いて増幅、検出した場合は、検
出感度が著しく上昇している。結論として、核酸標識し
た抗体を用いることにより抗原抗体反応の高感度化に絶
大な効果を発揮するものと考えられる。
して、核酸標識抗体を用いて増幅、検出した場合は、検
出感度が著しく上昇している。結論として、核酸標識し
た抗体を用いることにより抗原抗体反応の高感度化に絶
大な効果を発揮するものと考えられる。
【００３６】
【発明の効果】上述したように、本発明における生体試
料中に含まれる成分を免疫学的検出もしくは定量する免
疫学的測定法に関し、増幅されうる核酸により標識し、
該標識核酸を標的核酸として恒温増幅反応を行うことに
より得られた増幅核酸を検出することにより、温度サイ
クルのための特別な機器を必要とせず、また抗原抗体反
応を損なうこともない比較的マイルドな条件による免疫
学的測定法の簡便かつ迅速で、しかも高感度な方法を実
現するものである。
料中に含まれる成分を免疫学的検出もしくは定量する免
疫学的測定法に関し、増幅されうる核酸により標識し、
該標識核酸を標的核酸として恒温増幅反応を行うことに
より得られた増幅核酸を検出することにより、温度サイ
クルのための特別な機器を必要とせず、また抗原抗体反
応を損なうこともない比較的マイルドな条件による免疫
学的測定法の簡便かつ迅速で、しかも高感度な方法を実
現するものである。
【００３７】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..47 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）16S rRNA遺伝子の配 列と相補的な配列を有する 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGCTA CCCGTCGTCG CCTTGGT 47
【００３８】 配列番号：２ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）16S rRNA遺伝子の配 列と相補的な配列を有する 配列 GGAAAGGTCT CTTCGGAGAT A 21
Claims (5)
- 【請求項１】 増幅されうる塩基配列を有する核酸が標
識されてなる生体試料成分と免疫学的に反応性を有する
抗体もしくは抗原を用いた免疫学的測定法であって、該
抗体もしくは該抗原と生体試料成分とを反応せしめ、次
いで得られた該抗体もしくは該抗原と該生体試料成分と
の複合体において結合される該核酸を標的核酸として恒
温核酸増幅反応を行い、増幅された該核酸を検出するこ
とにより生体試料成分を検出もしくは定量することを特
徴とする免疫学的測定法。 - 【請求項２】 恒温核酸増幅反応が、ＮＡＳＢＡ法、３
ＳＲ法、ＳＤＡ法、ＴＭＡ法およびＣＰＲ法よりなる群
から選ばれたいずれかの方法により行われる請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】 核酸増幅反応および核酸検出反応とを同
時に行う請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 核酸配列が、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮ
Ａ、１本鎖ＲＮＡよりなる群から選ばれたいずれかであ
る請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 核酸配列が、ＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を含む核酸配列である請求項４記載の方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11182063A JP2001013139A (ja) | 1999-06-28 | 1999-06-28 | 免疫学的測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11182063A JP2001013139A (ja) | 1999-06-28 | 1999-06-28 | 免疫学的測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001013139A true JP2001013139A (ja) | 2001-01-19 |
Family
ID=16111705
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11182063A Pending JP2001013139A (ja) | 1999-06-28 | 1999-06-28 | 免疫学的測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001013139A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1431400A3 (en) * | 2002-12-19 | 2004-07-07 | Tosoh Corporation | Method of detecting acid-fast bacteria using ribosomal RNA as target |
| JP2007527995A (ja) * | 2004-02-20 | 2007-10-04 | ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア | 分子上のエピトープの免疫検出のための試薬、キット及び方法 |
| WO2016057842A3 (en) * | 2014-10-08 | 2017-05-11 | Aratome, LLC | High resolution imaging of tissue proteins |
| US10781477B2 (en) | 2016-12-16 | 2020-09-22 | Aratome, LLC | Molecular detection using ligation amplification |
| CN117405878A (zh) * | 2023-10-12 | 2024-01-16 | 上海领检科技有限公司 | 一种二氧化硅微球复合物及其制备方法和用途 |
-
1999
- 1999-06-28 JP JP11182063A patent/JP2001013139A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1431400A3 (en) * | 2002-12-19 | 2004-07-07 | Tosoh Corporation | Method of detecting acid-fast bacteria using ribosomal RNA as target |
| EP1988176A1 (en) * | 2002-12-19 | 2008-11-05 | Tosoh Corporation | Method of detecting acid-fast bacteria using ribosomal RNA as target |
| JP2007527995A (ja) * | 2004-02-20 | 2007-10-04 | ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア | 分子上のエピトープの免疫検出のための試薬、キット及び方法 |
| US7842456B2 (en) | 2004-02-20 | 2010-11-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Reagents, kits and methods for immunodetection of epitopes on molecules |
| JP4700626B2 (ja) * | 2004-02-20 | 2011-06-15 | ザ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ペンシルバニア | 分子上のエピトープの免疫検出のための試薬、キット及び方法 |
| WO2016057842A3 (en) * | 2014-10-08 | 2017-05-11 | Aratome, LLC | High resolution imaging of tissue proteins |
| US10781477B2 (en) | 2016-12-16 | 2020-09-22 | Aratome, LLC | Molecular detection using ligation amplification |
| CN117405878A (zh) * | 2023-10-12 | 2024-01-16 | 上海领检科技有限公司 | 一种二氧化硅微球复合物及其制备方法和用途 |
| CN117405878B (zh) * | 2023-10-12 | 2024-06-11 | 上海领检科技有限公司 | 一种二氧化硅微球复合物及其制备方法和用途 |
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