CN117405878A - 一种二氧化硅微球复合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子诊断领域，特别是涉及一种二氧化硅微球复合物及其制备方法和用途。本发明中二氧化硅微球复合物为二氧化硅微球表面直接或间接附着有多肽和多核苷酸。本发明可稳定可控的将DNA共价标记在二氧化硅微球上，标记效率高，可达90％以上；特异性标记DNA达到非特异性吸附DNA的几千倍，从标记方法上降低了系统误差，提高了检测的准确性；本发明Ab标记具有可控性的同时，不影响单克隆抗体自身活性，保证了检测系统的抗原抗体特异性结合能力；本方法的检测灵敏度达到fg/mL级别，可为临床早期诊断提供技术支持，也为其他试剂盒的开发提供一种高灵敏度、高特异性的检测技术手段。

Description

一种二氧化硅微球复合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及分子诊断领域，特别是涉及一种二氧化硅微球复合物及其制备方法和用途。
背景技术
当代标记免疫检测技术是在抗原抗体特异性反应的基础上，通过标记不同的检测标记物，并配以相适宜的检测仪器进行检测，从而将特异性反应的信号放大，达到对低丰度样品进行定性定量检测目标物质的技术。随着当代标记免疫检测技术的发展，技术手段不断向着灵敏度高、特异性强、操作便利以及造价便宜的方向更新。在一些癌症、神经系统疾病、疾病感染的早期阶段，生物标志物往往处于极低的浓度，因此开发更高灵敏度的免疫检测技术，对疾病的早期诊断以及预后随访具有重要意义。
免疫PCR(Immuno-PCR,Im-PCR)是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原的检测技术。该项技术在抗原抗体特异性反应的基础上，连接DNA与检测抗体，将信号通过PCR呈指数放大，从而提高检测的灵敏度和检测范围。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种二氧化硅微球复合物及其制备方法和用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种二氧化硅微球复合物，所述二氧化硅微球复合物为二氧化硅微球表面直接或间接附着有多肽和多核苷酸。
优选地，所述二氧化硅微球复合物的表面还直接或间接附着有第一交联剂和第二交联剂；其中，所述第一交联剂与所述第二交联剂所述多核苷酸或所述多肽通过化学键连接；或，所述第二交联剂与所述多肽通过化学键连接。
本发明还提供前述二氧化硅微球复合物的制备方法，所述制备方法包含如下步骤：
1)将第一交联剂和二氧化硅微球混合，使二氧化硅微球活化；
2)将多核苷酸和步骤1)中活化后的二氧化硅微球混合，获得负载多核苷酸的二氧化硅微球；
3)将第二交联剂和步骤2)中负载多核苷酸的二氧化硅微球混合；
4)将多肽和步骤3)中负载多核苷酸的二氧化硅微球混合，与封闭液混合封闭，获得所述二氧化硅微球复合物。
本发明还提供前述二氧化硅微球复合物在制备免疫PCR产品中的用途。
本发明还一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含前述二氧化硅微球复合物。
本发明还提供一种免疫PCR检测蛋白的方法，所述免疫PCR检测蛋白的方法包含如下步骤：
I)将样品与偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠混合，分离磁珠；
II)将如权利要求1-6任一所述的二氧化硅微球复合物与步骤I)中分离的磁珠混合，分离磁珠；
III)对步骤II)中分离的磁珠，进行荧光定量PCR扩增，通过荧光信号检测样品的含量。
如上所述，本发明的一种二氧化硅微球复合物及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
本发明可稳定可控的将DNA共价标记在二氧化硅微球上，标记效率高，可达90％以上；特异性标记DNA达到非特异性吸附DNA的几千倍，从标记方法上降低了系统误差，提高了检测的准确性；本发明Ab标记具有可控性的同时，不影响单克隆抗体自身活性，保证了检测系统的抗原抗体特异性结合能力；本方法的检测灵敏度达到fg/mL级别，可为临床早期诊断提供技术支持，也为其他试剂盒的开发提供一种高灵敏度、高特异性的检测技术手段。
附图说明
图1显示为本发明的二氧化硅微球复合物应用于免疫PCR检测的原理示意图。
图2显示为本发明的二氧化硅微球复合物在免疫PCR应用中的结果图。
图3显示为本发明中二氧化硅微球和纳米金在团聚实验中的结果图。
图4显示为本发明中二氧化硅微球和纳米金在复溶实验中的结果图。
具体实施方式
本发明提供一种二氧化硅微球复合物，所述二氧化硅微球复合物为二氧化硅微球表面直接或间接附着有多肽和多核苷酸。
在一些具体实施方式中，所述多肽为氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物。更具体地，所述多肽为抗体或抗原。
在一些具体实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。更具体地，所述抗体为降钙素原(PCT)抗体。
在一些具体实施方式中，所述多核苷酸可以理解为核酸分子，通常为人工核酸分子，例如天然不存在的DNA或RNA。换句话说，人工核酸分子可以理解为非天然核酸分子。此类核酸分子由于其单独的序列(其不是天然存在的)和/或由于不是天然存在的其他修饰例如核苷酸的结构修饰而可能是非天然的。人工核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或包含DNA和RNA部分的杂合分子。通常，可以通过基因工程方法设计和/或产生人工核酸分子以对应于所需的人工核苷酸序列(异源序列)。在这种情况下，人工序列通常是可能天然不存在的序列，即，其与野生型序列相差至少一个核苷酸。术语“野生型”可以理解为天然存在的序列。此外，术语“人工核酸分子”不限于表示“一个单一分子”，而是通常被理解为包括相同分子的整体。因此，它可以涉及包含在试样中的多个相同分子。
在一些具体实施方式中，所述多核苷酸为长度50-70bp的单链DNA(dsDNA)或双链DNA。更具体地，所述单链DNA的长度为50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70bp。优选地，所述单链DNA的长度为50-60bp。
在一些具体实施方式中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。其中，SEQ ID No.1为：TCCCATTGGAAGAACGTTATTTAAGATTAGGCGATGTCGTCTGGGATGATGTA。
在一些具体实施方式中，所述二氧化硅微球的粒径为10-200nm。更具体地，所述粒径为10-20nm、20-40nm、40-50nm、50-60nm、60-80nm、80-100nm、100-120nm、120-140nm、140-160nm、160-180nm或180-200nm。优选地，所述粒径为40-60nm。
在一些具体实施方式中，所述二氧化硅微球复合物的表面直接或间接还附着有第一交联剂和第二交联剂。其中，所述第一交联剂与所述第二交联剂所述多核苷酸或所述多肽通过化学键连接；所述第二交联剂与所述多肽通过化学键连接。更具体地，所述第一交联剂选自EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物)、MMTM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物)或CDI(N,N'-羰基二咪唑)；或，所述第二交联剂选自SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-EMCS(ε-马来酰亚胺己酸磺基琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐)、Sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)、碘乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯或琥珀酰亚胺基4-叠氮基苯甲酸酯。优选地，所述第一交联剂为EDC；第二交联剂为Sulfo-NHS。
在一些具体实施方式中，所述二氧化硅微球复合物中第一交联剂和第二交联剂的质量比为0.1：1-10：1。更具体地，所述质量比为0.1：1-0.5：1、0.5：1-1：1、1：1-2：1、2：1-2.5：1、2.5：1-3：1、3：1-5：1、5：1-7：1、7：1-9：1或9：1-10：1。优选地，所述质量比为2：1-5：1。
本发明还提供前述二氧化硅微球复合物的制备方法，所述制备方法包含如下步骤：
1)将第一交联剂和二氧化硅微球混合，使二氧化硅微球活化；
2)将前述多核苷酸和步骤1)中活化后的二氧化硅微球混合，获得负载多核苷酸的二氧化硅微球；
3)将第二交联剂和步骤2)中清洗后负载多核苷酸的二氧化硅微球混合，清洗未负载的多余多核苷酸、第一交联剂和第二交联剂；
4)将多肽和步骤3)中负载多核苷酸的二氧化硅微球混合，与封闭液混合封闭，获得前述二氧化硅微球复合物。
在一些具体实施方式中，所述制备方法还包含如下步骤：
5)将储存液和步骤4)中所述的二氧化硅微球复合物混合。
在一些具体实施方式中，以步骤1)中反应液的总体积为基准，步骤1)中所述二氧化硅微球和所述第一交联剂的质量比为1：1-1：3。更具体地，所述质量比为1：1-1：1.5、1：1：1.5-1：2、1：2-1：2.5或1：2.5-1：3。更具体地，所述二氧化硅微球的质量浓度为1-2mg/mL、2-4mg/mL、4-5mg/mL、5-6mg/mL、6-7mg/mL、7-8mg/mL或8-10mg/mL。优选地，所述质量浓度为2-7mg/mL。
在一些具体实施方式中，步骤1)中所述第一交联剂选自EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物)、MMTM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物)或CDI(N,N'-羰基二咪唑)。
在一些具体实施方式中，以步骤2)中反应液的总体积为基准，步骤1)中每微克所述第一交联剂对应的步骤2)中所述多核苷酸的摩尔量为0.0001-0.05fmol。更具体地，所步骤1)中每微克所述第一交联剂对应的步骤2)中所述多核苷酸的摩尔量为0.0001-0.001fmol、0.001-0.002fmol、0.002-0.004fmol、0.004-0.006fmol、0.006-0.008fmol、0.008-0.01fmol、0.01-0.03fmol、或0.03-0.05fmol。优选地，步骤1)中每微克所述第一交联剂对应的步骤2)中所述多核苷酸的摩尔量为0.002-0.008fmol。
在一些具体实施方式中，步骤2)中所述混合的时间为1-45min。更具体地，所述时间选自1-5min、5-10min、10-15min、15-20min、20-25min、25-30min、30-35min、35-40min或40-45min。优选地，所述时间为5-15min。
在一些具体实施方式中，步骤3)中所述第二交联剂选自SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-EMCS(ε-马来酰亚胺己酸磺基琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐)、Sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)、碘乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯或琥珀酰亚胺基4-叠氮基苯甲酸酯。
在一些具体实施方式中，以步骤3)中反应液的总体积为基准，步骤1)中所述第一交联剂和步骤3)中所述第二交联剂的质量比为0.1：1-10：1。更具体地，所述质量比为0.1：1-0.5：1、0.5：1-1：1、1：1-2：1、2：1-2.5：1、2.5：1-3：1、3：1-5：1、5：1-7：1、7：1-9：1或9：1-10：1。优选地，所述质量比为2：1-5：1。
在一些具体实施方式中，以步骤4)中反应液的总体积为基准，步骤1)中所述第一交联剂和步骤4)中所述多肽的质量比为100：1-150：1。更具体地，所述质量比为100：1-110：1、110：1-120：1、120：1-125:1、125：1-130：1、130：1-140：1或140：1-150：1。优选地，所述质量比为120：1-130：1。
在一些具体实施方式中，步骤3)中所述清洗采用清洗缓冲液。更具体地，所述清洗缓冲液选自磷酸缓冲液(PBS)、Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)缓冲液、柠檬酸缓冲液、MES(吗啉乙磺酸)缓冲液、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)缓冲液、硼酸缓冲液或碳酸缓冲液。优选地，所述清洗缓冲液为MES缓冲液。
在一些具体实施方式中，步骤4)中所述封闭液或步骤5)中所述储存液包含BSA、牛血清、山羊血清、酪蛋白、明胶、鱼胶蛋白、鲑鱼精中的一种或多种。
在一些具体实施方式中，前述储存液还包含表面活性剂、蛋白保护剂和/或防腐剂。更具体地，所述表面活性剂选自Tw-20(吐温-20)、Tw-80(吐温-80)、Triton X-100(曲拉通X-100)、SDS(十二烷基硫酸钠)、PVP K30(聚乙烯吡咯烷酮K30)中的一种或多种；所述防腐剂选自叠氮钠、ProClin300、硫化汞、山梨酸钾中的一种或多种；所述蛋白保护剂选自海藻糖、葡萄糖或甘露醇中的一种或多种。
本发明还提供前述二氧化硅微球复合物在制备免疫PCR产品中的用途。
本发明还提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含前述二氧化硅微球复合物。
在一些具体实施方式中，所述检测试剂盒还包含引物对、PCR反应缓冲液或DNA聚合酶中的一种或多种。
本发明还提供一种免疫PCR检测蛋白的方法，所述免疫PCR检测蛋白的方法包含如下步骤：
I)将样品与偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠混合反应后，清洗后分离磁珠；
II)将前述二氧化硅微球复合物与步骤I)中清洗后分离的磁珠混合反应后，清洗后分离磁珠；
III)对步骤II)中分离的磁珠，进行荧光定量PCR扩增，通过荧光信号检测样品的含量。
在一些具体实施方式中，步骤I)中所述偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠通过如下方式制备：
1)将交联剂和磁珠混合，活化磁珠，清洗去除多余的交联剂；
2)将和样品特异性结合的抗体和步骤1)中活化的磁珠混合，获得负载抗体的磁珠，清洗未负载的多余抗体；
3)步骤2)中负载抗体的磁珠，加入封闭液封闭，获得所述偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠。
在一些具体实施方式中，步骤1)中所述交联剂选自EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物)、MMTM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5,-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐水合物)或CDI(N,N'-羰基二咪唑)。
在一些具体实施方式中，步骤1)、步骤2)中所述清洗采用清洗缓冲液。更具体地，所述清洗缓冲液选自磷酸缓冲液、Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)缓冲液、柠檬酸缓冲液，MES(吗啉乙磺酸)缓冲液、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)缓冲液、硼酸缓冲液或碳酸缓冲液。优选地，所述清洗缓冲液为MES缓冲液。
在一些具体实施方式中，以步骤II)中反应液的总体积为基准，步骤II)中所述二氧化硅微球复合物与所述步骤I)中清洗后分离的磁珠的质量比1：0.5-1：2。更具体地，所述质量比为1：0.5-1：0.8、1：0.8-1：1、1：1-1：1.5、1：1.5-1：2。优选地，所述质量比为1：0.8-1：1.5。
在一些具体实施方式中，步骤III)中荧光定量PCR中引物对的核苷酸序列如SEQID No.2:TCCCATTGGAAGAACG或SEQ ID No.3:TACATCATCCCAGACG所示。
在一些具体实施方式中，步骤III)中所述荧光定量PCR反应包含如下特征中的一种或多种：
a)预变性的温度为90-105℃；更具体地，所述预变性的温度为90-95℃、95-100℃或100-105℃；和/或，预变性的时间为1-5min；更具体地，所述预变性的时间为1-2min、2-3min、3-4min或4-5min；
b)变性的温度为90-100℃；更具体地，所述变性的温度为90-92℃、92-94℃、94-96℃、96-98℃或98-100℃；和/或，变性的时间为5-15s；更具体地，所述变性的时间为5-7s、7-9s、9-10s、10-11s、11-13s或13-15s；
c)退火、延伸的温度为50-70℃；更具体地，所述退火、延伸的温度为50-55℃、55-60℃、60-65℃或65-70℃；和/或，退火、延伸的时间为10-30s；更具体地，所述退火、延伸的时间为10-15s、15-20s、20-25s或25-30s；
4)扩增的循环数为30-50；更具体地，所述扩增的循环数为30-35、35-40、40-45或45-50。
本申请中，术语“DNA”是脱氧核糖核酸的常用缩写。它是核酸分子，即由核苷酸组成的聚合物。这些核苷酸通常是脱氧腺苷单磷酸、脱氧胸苷单磷酸、脱氧鸟苷单磷酸和脱氧胞苷单磷酸单体，它们本身由糖部分(脱氧核糖)、碱基部分和磷酸部分组成，并通过特征性的骨架结构聚合。通常，骨架结构由第一核苷酸的糖部分即脱氧核糖和第二相邻单体的磷酸部分之间的磷酸二酯键形成。单体的特定顺序，即与糖/磷酸骨架相连的碱基的顺序，被称为DNA序列。DNA可以是单链或双链的。在双链形式中，第一链的核苷酸通常与第二链的核苷酸杂交，例如通过A/T碱基配对和G/C碱基配对杂交。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1二氧化硅微球复合物在免疫PCR中的应用
制备偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠FB-PCT-AbⅠ：
洗涤磁珠：于2mL无菌离心管中，加入10uL 100mg/mL的羧基磁珠(从JSR LifeSciences购买，货号MS300/Carboxyl)，再加入200uL pH5.6 MES缓冲液，振荡混匀，磁力架上静置2min，移除全部液体，如此重复洗涤磁珠2次；
活化磁珠：于上述离心管中，加入100uL 1mg/mL EDC(MES缓冲液10mM pH5.6)，37℃孵育30min后，用MES缓冲液洗涤磁珠2次，并磁分离；
包被抗体：于上述离心管中，加入100uL 600ug/mL PCT-AbⅠ(从凯优乐生物购买，货号Mab5-1054)(MES缓冲液10mM pH5.6)，37℃孵育5h后，用MES缓冲液洗涤磁珠2次，并磁分离；
封闭磁珠：于上述离心管中，加入200uL封闭液(pH7.0 PBS+1％BSA+10％CE210)，37℃孵育1h后，用清洗液(pH7.0 PBS+0.05％Tw20)洗涤磁珠2次，并磁分离；
储存磁珠：于上述离心管中，加入1mL储存液(PBST+1％BSA+0.02％NaN3)，FB-PCT-AbⅠ的终浓度为1mg/mL，于2-8℃存放。
制备二氧化硅微球复合物DNA-SiO2-PCT-AbⅡ：
标记DNA：于2mL无菌离心管中，加入20uL 10mg/mL SiO2(从南京东纳购买，货号SM-C-50)，加入10uL 25mg/mL EDC(MES)，加入100uL 0.01pmol/mL ssDNA(MES缓冲液10mMpH5.6)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育10min，再加入10uL 10mg/mL sulfo-NHS(MES缓冲液10mM pH5.6)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育15min后，12000×g离心10min，去上清；
标记Ab：于上述离心管中，加入100uL 20ug/mL PCT-AbⅡ(从凯优乐生物购买，货号Mab5-1053)(MES缓冲液10mM pH5.6)，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育1h30min后，12000×g离心10min，去上清；
洗涤：于上述离心管中，加入200uL洗涤液1(pH7.0 PBS+0.05％Tw20)，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm振荡洗涤5min后，12000×g离心10min，去上清，重复洗涤3次，再加入200uL洗涤液2(pH7.0 Tris-Hcl+0.05％Tw20)，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm振荡洗涤5min后，12000×g离心10min，去上清，重复洗涤2次；
封闭：于上述离心管中，加入100uL封闭液，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育1h后，12000×g离心10min，去上清，再加入200uL清洗液(pH7.0
PBS+0.05％Tw20)洗涤，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm振荡洗涤5min后，12000×g离心10min，去上清，重复洗涤2次；
储存：于上述离心管中，加入100uL储存液，超声振荡10s，DNA-SiO2-PCT-AbⅡ的终浓度为2mg/mL，于2-8℃存放。
其他实施例中，所用磁珠、抗体、二氧化硅微球及缓冲液的来源均同本实施例。
二氧化硅微球复合物在免疫PCR中应用：
二氧化硅微球复合物与偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠结合原理如图1所示，二氧化硅微球复合物用于免疫PCR实验中的具体步骤如下：
捕获抗原：于5个1.5mL离心管中，分别加入2uL FB-PCT-AbⅠ(1mg/mL)，和100uL不同浓度的PCT-Ag(0pg/mL，24fg/mL，240fg/mL，2400fg/mL，24000fg/mL)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃孵育30min后，于磁力架上静置2min，移除全部液体，将离心管从磁力架上取下，加入200uL清洗液(pH7.0 PBS+0.05％Tw20)，振荡混匀5s，磁力架上静置2min，移除全部液体，如此重复洗涤磁珠3次；
信号放大：于上述5个离心管中，分别加入100uL DNA-SiO2-PCT-AbⅡ(1:100，PBST稀释)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃孵育30min后，用200uL清洗液洗涤磁珠5次，并磁分离，再加入10uL无酶水将磁珠重悬；
检测：将上述重悬液10uL转移至PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共15uL，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95℃3min；95℃10s，60℃15s，共40个循环。
上述实验结果图2所示，二氧化硅微球复合物用于免疫PCR时，其检测灵敏度可低至24fg/mL。
实施例2不同材质纳米微球的筛选
EDC标记DNA对于纳米金与二氧化硅微球的影响：
向1.5mL离心管中加入50uL 10mg/mL SiO2和50uL 10mg/mL纳米金，加入10uL25mg/mL EDC(MES缓冲液10mM pH5.6)，同时加入100uL 0.01pmol/mL的ssDNA(MES缓冲液10mM pH5.6)。混匀后，将离心管放置在恒温混匀仪上37℃900rpm孵育30min后，结果如图3所示：孵育前后二氧化硅微球未发生变化，纳米金颜色由正常的紫红色转变为深紫色，这表示纳米金形成了团聚。
将两个离心管放入高速冷冻离心机中，12000×g离心10min，分别进行超声振荡30s、漩涡震荡30s、反复吹打30s、调节pH值从5.6至7.0，观察微球复溶情况，结果如图4所示：纳米金离心后形态呈黑色聚集状态，二氧化硅微球呈乳白色聚集状态。经超声振荡、漩涡震荡、反复吹打、调节pH值，纳米金依旧不能复溶，而根据观察二氧化硅微球在超声振荡后就可复溶。
由上可知，对羧基化的纳米金(PEG修饰)，采用EDC/sulfo-NHS两步法标记DNA与Ab时，纳米金被EDC活化后会在加入DNA时易形成团聚，使标记过程中止，并且通过超声振荡、漩涡震荡、反复吹打、调节pH值等方式都无法解除团聚；使用羧基化的二氧化硅纳米微球(PEG修饰)时，微球不易团聚，在不同的pH值与不同的活化剂浓度以及不同的DNA浓度下，均可保证较好的稳定性，即使微球高速离心后发生团聚，也可通过超声振荡的方式将微球打散，保证标记稳定进行。
实施例3 二氧化硅微球中不同交联剂的筛选
EDC标记法：向1.5mL离心管中加入50uL 10mg/mL SiO2，加入10uL 25mg/mL EDC(MES缓冲液10mM pH5.6)，混匀后，将离心管放置在恒温混匀仪上37℃900rpm孵育25min后，12000×g离心10min，去上清，加入5uL 1mg/mL的PCT-Ab(MES缓冲液10mM pH5.6)，超声振荡10s后，将离心管放置在恒温混匀仪上37℃900rpm孵育120min后，12000×g离心10min，去上清，加入100uLMES缓冲液，超声振荡10s后，放入4℃保存备用；
EDC/sulfo-NHS标记法：向1.5mL离心管中加入50uL 10mg/mL SiO2，加入10uL25mg/mL EDC(MES缓冲液10mM pH5.6)，10uL 10mg/mL sulfo-NHS(MES缓冲液10mM pH5.6)，混匀后，将离心管放置在恒温混匀仪上37℃900rpm孵育25min后，12000×g离心10min，去上清，加入5uL 1mg/mL的PCT-Ab(MES缓冲液10mM pH5.6)，超声振荡10s后，将离心管放置在恒温混匀仪上37℃900rpm孵育120min后，12000×g离心10min，去上清，加入100uLMES缓冲液，超声振荡10s后，放入4℃保存备用；
对照组：向1.5mL离心管中加入50uL 10mg/mL SiO2，加入5uL 1mg/mL的PCT-Ab(MES缓冲液10mM pH5.6)。混匀后，将离心管放置在恒温混匀仪上37℃900rpm孵育120min后，12000×g离心10min，去上清，加入100uLMES缓冲液，超声振荡10s后，放入4℃保存备用；
检测：将上述各组反应后试剂，12000×g离心10min，去上清，再加入200uL洗涤液(pH7.0PBS+0.05％Tw20)超声振荡10s，重复离心洗涤3次。洗涤结束后，加入100uL洗涤液保存，取5uL试剂，加入100uL 0.01mg/mL的羊抗鼠IgG-吖啶酯，将离心管放置在恒温混匀仪上37℃900rpm孵育20min，12000×g离心10min洗涤3次后，使用化学发光仪检测发光信号，检测结果如表1所示。
表1
标记方法 EDC标记法 EDC/sulfo-NHS标记法 对照组
数据输出 化学发光值 化学发光值 化学发光值
1 5902830 12578620 16295
2 5226588 12457938 15820
AVE 5564709 12518279 16057.5
由表1可知，EDC/sulfo-NHS标记法标记Ab的标记效率更高。在EDC标记法中，活化微球后，有一步15min左右的洗涤步骤，因为EDC活化的微球中间体不够稳定，一定时间内没有反应会导致其中间体水解还原，使得标记效率降低。而sulfo-NHS与EDC活化形成的中间体足够稳定，保证了标记的稳定性和高效性。
实施例4 二氧化硅微球复合物中第一交联剂与DNA反应时间的筛选
为了防止EDC与DNA反应时间较长，使EDC活化中间体失活，导致Ab的标记无法进行，需要控制DNA的标记时间。因此选用5min、10min、15min、30min进行标记时间筛选。
(1)对于DNA的标记：
实验组标记：向4组1.5mL离心管中加入50uL 10mg/mL SiO2，加入10uL 25mg/mLEDC(MES缓冲液10mM pH5.6)，同时加入100uL 0.01pmol/mL的ssDNA(MES缓冲液10mMpH5.6)。混匀后，将各组离心管放置在恒温混匀仪上37℃900rpm分别孵育5min/10min/15min/30min后，12000×g离心10min，去上清，加入100uLMES缓冲液，超声振荡10s后，放入4℃保存备用；
对照组标记：向1.5mL离心管中加入50uL 10mg/mL SiO2，同时加入100uL0.01pmol/mL的ssDNA(MES缓冲液10mM pH5.6)。混匀后，将离心管放置在恒温混匀仪上37℃900rpm孵育30min后，12000×g离心10min，去上清，加入100uLMES缓冲液，超声振荡10s后，放入4℃保存备用；
(2)对于DNA的检测：
将上述各组反应后试剂，12000×g离心10min，去上清，再加入200uL洗涤液(pH7.0Tris-Hcl+0.05％Tw20)超声振荡10s，重复离心洗涤5次。洗涤结束后，加入100uL洗涤液保存，取5uL于PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共20uL，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95℃3min；95℃10s，60℃15s，共40个循环，检测数据如表2所示。
表2
孵育时间 5min 10min 15min 30min 对照组
数据输出 Ct Ct Ct Ct Ct
1 14.35 12.04 11.59 11.54 23.09
2 15.00 11.60 11.68 11.60 23.26
AVE 14.675 11.83 11.635 11.57 23.175
由表2可知，二氧化硅微球复合物中交联剂与DNA反应时间10min左右时，标记效率和30min左右基本一致，并且可以避免EDC与DNA反应时间较长，使EDC活化中间体失活，有利于加入sulfo-NHS进行进一步的活化。
实施例5 二氧化硅微球复合物中第一交联剂和第二交联剂配比的筛选
EDC/sulfo-NHS投入量与微球表面羧基含量存在关系，过量会导致微球发生聚集，而低投入量则会导致标记效率过低。在总体交联剂投入量适度的条件下，第一交联剂和第二交联剂的投入比例则会影响DNA与Ab的标记效率。
(1)EDC/sulfo-NHS投入量计算：根据微球表面羧基含量计算投入量合适区间。根据羧基微球投入体积50uL和投入浓度10mg/mL，计算出投入质量为0.5mg，根据微球表面羧基密度250nmol/mg，计算出羧基投入的物质的量为125nmol。为了保证充分的活化反应，EDC投入的物质的量约为羧基的4～10倍，即500nmol～1250nmol。本实例中所用EDC分子量为191.7，因此EDC的投入质量在95.85ug～239.625ug，固定EDC的投入体积10uL，可计算出EDC的投入浓度为9.585mg/mL～23.9625mg/mL。由于本实例中所用sulfo-NHS分子量为217.13，与EDC分子量接近1：1，并且固定sulfo-NHS的投入体积10uL，因此可根据EDC和sulfo-NHS的投入比例，换算出sulfo-NHS的投入浓度。
(2)EDC/sulfo-NHS投入比例优化：
EDC:sulfo-NHS设置5组投入质量比例，分别为1:1/2:1/1:2/5:1/5:2
标记DNA：取5组2mL无菌离心管，加入50uL 10mg/mL SiO2，加入10uL 25/10/20mg/mL EDC(MES缓冲液10mM pH5.6)，加入0.01pmol/mL ssDNA(MES缓冲液10mM pH5.6)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育10min后，再加入10uL 5/10/20mg/mL sulfo-NHS(MES缓冲液10mM pH5.6)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育15min后，12000×g离心10min，去上清；
标记Ab：于上述离心管中，加入100uL 20ug/mL PCT-AbⅡ(MES缓冲液10mMpH5.6)，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育1h30min后，12000×g离心10min，去上清；
洗涤：于上述离心管中，加入200uL洗涤液1(pH7.0 PBS+0.05％Tw20)，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm振荡洗涤5min后，12000×g离心10min，去上清，重复洗涤3次，再加入200uL洗涤液2(pH7.0 Tris-Hcl+0.05％Tw20)，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm振荡洗涤5min后，12000×g离心10min，去上清，重复洗涤2次；
封闭：于上述离心管中，加入100uL封闭液，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育1h后，12000×g离心10min，去上清，再加入200uL清洗液(pH7.0PBS+0.05％Tw20)洗涤，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm振荡洗涤5min后，12000×g离心10min，去上清，重复洗涤2次；
储存：于上述离心管中，加入100uL储存液，超声振荡10s，DNA-SiO2-PCT-AbⅡ的终浓度为5mg/mL，于2-8℃存放；
(3)对DNA与Ab的检测：
对DNA的检测：取上述各组反应后试剂5uL于PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共20uL，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95℃3min；95℃10s，60℃15s，共40个循环，结果如表3所示；
对Ab的检测：取上述各组反应后试剂5uL于1.5uL离心管中，加入100uL 0.01mg/mL的羊抗鼠IgG-吖啶酯，将离心管放置在恒温混匀仪上37℃900rpm孵育20min，12000×g离心10min洗涤3次后，使用化学发光仪检测发光信号，结果如表3所示。
表3
由表3可知，实时定量PCR扩增的结果显示在EDC与sulfo-NHS的投入质量比例在5：2时，其DNA标记量最高，同时其化学发光值也最高，说明这一条件下，整体的标记效果最好。
实施例6二氧化硅微球复合物中DNA含量的筛选
若DNA的标记量过高，会反应微球上大部分的羧基基团，导致Ab反应效率低，且过多的DNA会影响后续灵敏度检测中的Ab和Ag的反应；若DNA的标记量过低，尽管Ab标记较多有利于后续Ab和Ag的反应效率，但会导致灵敏度检测中Ct值过高，检测结果不具备检测意义。由于本方法优先标记DNA，因此我们通过控制DNA的标记量，从而控制Ab的可标记量，最终控制DNA和Ab的投入比例。
(1)对不同投入量的DNA和过量Ab的标记：
标记DNA：取5组2mL无菌离心管，加入50uL 10mg/mL SiO2，加入10uL 25mg/mL EDC(MES缓冲液10mM pH5.6)，加入100uL 100/10/1/0.1/0.01/0.001pmol/mL ssDNA(MES缓冲液10mM pH5.6)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育10min后，再加入10uL10mg/mLsulfo-NHS(MES缓冲液10mM pH5.6)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育15min后，12000×g离心10min，去上清；
标记Ab：于上述离心管中，加入100uL 20ug/mL PCT-AbⅡ(MES缓冲液10mMpH5.6)，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育1h30min后，12000×g离心10min，去上清；
洗涤：于上述离心管中，加入200uL洗涤液1(pH7.0 PBS+0.05％Tw20)，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm振荡洗涤5min后，12000×g离心10min，去上清，重复洗涤3次，再加入200uL洗涤液2(pH7.0 Tris-Hcl+0.05％Tw20)，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm振荡洗涤5min后，12000×g离心10min，去上清，重复洗涤2次；
封闭：于上述离心管中，加入100uL封闭液，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育1h后，12000×g离心10min，去上清，再加入200uL清洗液(pH7.0PBS+0.05％Tw20)洗涤，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm振荡洗涤5min后，12000×g离心10min，去上清，重复洗涤2次；
储存：于上述离心管中，加入100uL储存液，超声振荡10s，DNA-SiO2-PCT-AbⅡ的终浓度为5mg/mL，于2-8℃存放；
(2)对DNA与Ab的检测：
对DNA的检测：取上述各组反应后试剂5uL于PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共20uL，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95℃3min；95℃10s，60℃15s，共40个循环，如表4所示；
对Ab的检测：取上述各组反应后试剂5uL于1.5uL离心管中，加入100uL 0.01mg/mL的羊抗鼠IgG-吖啶酯，将离心管放置在恒温混匀仪上37℃900rpm孵育20min，12000×g离心10min洗涤3次后，使用化学发光仪检测发光信号，如表4所示。
表4
DNA标记浓度 100pmol/mL 10pmol/mL 1pmol/mL 0.1pmol/mL 0.01pmol/mL 0.001pmol/mL
数据输出 Ct Ct Ct Ct Ct Ct
1 4.74 5.36 6.43 8.46 11.64 15.43
2 4.82 5.58 5.97 8.95 12.26 14.97
AVE 4.78 5.47 6.2 8.705 11.95 15.2
数据输出 化学发光值 化学发光值 化学发光值 化学发光值 化学发光值 化学发光值
1 526381 767961 2344906 6478146 13854372 14462711
2 553226 759672 2785244 6877792 11554096 16373987
AVE 549803.5 763816.5 2565075 6677969 12704234 15418349
(3)DNA含量对非特异性扩增的影响：
捕获抗原：取3组，每组5个1.5mL离心管，分别加入2uL FB-PCT-AbⅠ(1mg/mL)，和100uL不同浓度的PCT-Ag(0pg/mL，24fg/mL，240fg/mL，2400fg/mL，24000fg/mL)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃孵育30min后，于磁力架上静置2min，移除全部液体，将离心管从磁力架上取下，加入200uL清洗液(pH7.0 PBS+0.05％Tw20)，振荡混匀5s，磁力架上静置2min，移除全部液体，如此重复洗涤磁珠3次；
信号放大：于上述3组共15个离心管中，分别加入100uL 0.1/0.01/0.001pmol/mL的DNA-SiO2-PCT-AbⅡ(1:100，PBST稀释)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃孵育30min后，用200uL清洗液洗涤磁珠5次，并磁分离，再加入10uL无酶水将磁珠重悬；
检测：将上述重悬液10uL转移至PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共15uL，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95℃3min；95℃10s，60℃15s，共40个循环，结果如表5所示。
表5
DNA标记浓度 0.1pmol/mL 0.01pmol/mL 0.001pmol/mL
数据输出 Ct Ct Ct
24000fg/mL 24.72 22.50 27.62
2400fg/mL 28.10 25.83 30.86
240fg/mL 31.43 29.15 34.38
24fg/mL 33.17 33.51 38.25
0pg/mL 33.26 N/A N/A
结论：根据表4结果可知，DNA的投入量过高，会反应微球上大部分的羧基基团，导致Ab的标记效率降低,同时根据表5结果可知，DNA投入量高的情况会使后续灵敏度检测中非特异性吸附增加；根据表4结果可知，DNA的投入量过低，Ab标记量会有提高，有利于后续Ab和Ag的反应效率，但根据表5结果可知，在低丰度的校准品浓度下，这种标记会导致灵敏度检测中Ct值过高，检测结果不具备检测意义，故DNA投入量在100uL 0.01pmol/mL时，DNA和Ab的标记效果良好。
实施例7 二氧化硅微球复合物中二氧化硅微球粒径的筛选
由于不同粒径的微球之间存在不同的比表面积，理论上小粒径微球的比表面积更大，有利于生物识别分子的吸附或偶联，但单个微球上可偶联总量小，对于检测微量样本的放大效应有限。而大粒径的比表面积更小，导致偶联效率不高，但单个微球上可偶联总量大，放大比例的可控性更好。
(1)制备降钙素原磁珠捕获系统FB-PCT-AbⅠ：
洗涤磁珠：于2mL无菌离心管中，加入10uL 100mg/mL的羧基磁珠，再加入200uLpH5.6MES缓冲液，振荡混匀，磁力架上静置2min，移除全部液体，如此重复洗涤磁珠2次；
活化磁珠：于上述离心管中，加入100uL 1mg/mL EDC(MES缓冲液10mM pH5.6)，37℃孵育30min后，用MES缓冲液洗涤磁珠2次，并磁分离；
包被抗体：于上述离心管中，加入100uL 600ug/mL PCT-AbⅠ(MES缓冲液10mMpH5.6)，37℃孵育5h后，用MES缓冲液洗涤磁珠2次，并磁分离；
封闭磁珠：于上述离心管中，加入200uL封闭液(pH7.0 PBS+1％BSA+10％CE210)，37℃孵育1h后，用清洗液(pH7.0 PBS+0.05％Tw20)洗涤磁珠2次，并磁分离；
储存磁珠：于上述离心管中，加入1mL储存液(PBST+1％BSA+0.02％NaN3)，FB-PCT-AbⅠ的终浓度为1mg/mL，于2-8℃存放；
(2)制备不同粒径大小的降钙素原纳米微球放大系统DNA-SiO2-PCT-AbⅡ：
标记DNA：取3组2mL无菌离心管，加入20uL 10mg/mL 20nm/50nm/100nm SiO2，加入10uL 25mg/mL EDC(MES缓冲液10mM pH5.6)，加入100uL 0.01pmol/mL ssDNA(MES缓冲液10mM pH5.6)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育10min，再加入10uL10mg/mLsulfo-NHS(MES缓冲液10mM pH5.6)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育15min后，12000×g离心10min，去上清；
标记Ab：于上述离心管中，加入100uL 20ug/mL PCT-AbⅡ(MES缓冲液10mMpH5.6)，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育1h30min后，12000×g离心10min，去上清；
洗涤：于上述离心管中，加入200uL洗涤液1(pH7.0 PBS+0.05％Tw20)，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm振荡洗涤5min后，12000×g离心10min，去上清，重复洗涤3次，再加入200uL洗涤液2(pH7.0 Tris-Hcl+0.05％Tw20)，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm振荡洗涤5min后，12000×g离心10min，去上清，重复洗涤2次；
封闭：于上述离心管中，加入100uL封闭液，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm孵育1h后，12000×g离心10min，去上清，再加入200uL清洗液(pH7.0PBS+0.05％Tw20)洗涤，超声振荡10s，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃900rpm振荡洗涤5min后，12000×g离心10min，去上清，重复洗涤2次；
储存：于上述离心管中，加入100uL储存液，超声振荡10s，DNA-SiO2-PCT-AbⅡ的终浓度为2mg/mL，于2-8℃存放；
(3)应用免疫PCR技术检测降钙素原(PCT)校准品：
捕获抗原：取3组，每组5个1.5mL离心管，分别加入2uL FB-PCT-AbⅠ(1mg/mL)，和100uL不同浓度的PCT-Ag(0pg/mL，24fg/mL，240fg/mL，2400fg/mL，24000fg/mL)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃孵育30min后，于磁力架上静置2min，移除全部液体，将离心管从磁力架上取下，加入200uL清洗液(pH7.0 PBS+0.05％Tw20)，振荡混匀5s，磁力架上静置2min，移除全部液体，如此重复洗涤磁珠3次；
信号放大：于上述3组共15个离心管中，分别加入100uL 20nm/50nm/100nm的DNA-SiO2-PCT-AbⅡ(1:100，PBST稀释)，放置于恒温振荡混匀仪中，37℃孵育30min后，用200uL清洗液洗涤磁珠5次，并磁分离，再加入10uL无酶水将磁珠重悬；
检测：将上述重悬液10uL转移至PCR管中，加入PCR反应预混液和引物对共15uL，放入实时荧光定量PCR分析仪中，进行扩增检测，扩增条件是：95℃3min；95℃10s，60℃15s，共40个循环，结果如表6所示。
表6
微球粒径 20nm 50nm 100nm
数据输出 Ct Ct Ct
24000fg/mL 28.28 22.49 21.13
2400fg/mL 34.77 26.17 24.97
240fg/mL N/A 29.85 27.48
24fg/mL N/A 34.51 29.79
0pg/mL(阴性对照) N/A N/A 30.01
由表6可知，二氧化硅微球复合物中20nm粒径的纳米微球，由于单个微球上可标记的DNA和Ab总量少，校准品浓度较低时，无法通过PCR放大效应反映检测情况。而100nm粒径的纳米微球，尽管其单个微球表面可标记分子数量多，但根据校准品浓度0pg/mL的检测结果(即非特异性吸附检测的结果)，表明检测的非特异吸附增加。因此，综合考虑，选用50nm的羧基二氧化硅微球最合适。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (12)

1.一种二氧化硅微球复合物，其特征在于，所述二氧化硅微球复合物为二氧化硅微球表面直接或间接附着有多肽和多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的二氧化硅微球复合物，其特征在于，所述二氧化硅微球复合物的表面还直接或间接附着有第一交联剂和第二交联剂；其中，所述第一交联剂与所述第二交联剂、所述多核苷酸和/或所述多肽通过化学键连接；或，所述第二交联剂与所述多肽通过化学键连接。
3.根据权利要求2所述的二氧化硅微球复合物，其特征在于，所述第一交联剂选自EDC、DMTMM或CDI；和/或，所述第二交联剂选自SMCC、Sulfo-EMCS、Sulfo-NHS、Sulfo-SMCC、碘乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯或琥珀酰亚胺基4-叠氮基苯甲酸酯。
4.根据权利要求2所述的二氧化硅微球复合物，其特征在于，所述二氧化硅微球复合物中第一交联剂和第二交联剂的质量比为0.1：1-10：1。
5.根据权利要求1所述的二氧化硅微球复合物，其特征在于，所述二氧化硅微球复合物还包含如下特征中的一种或多种：
1)所述多核苷酸为长度50-70bp的单链DNA或双链DNA；
2)所述多肽为抗体或抗原；
3)所述二氧化硅微球的粒径为10-200nm。
6.根据权利要求5所述的二氧化硅微球复合物，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
7.如权利要求1-6任一所述二氧化硅微球复合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含如下步骤：
1)将第一交联剂和二氧化硅微球混合，使二氧化硅微球活化；
2)将多核苷酸和步骤1)中活化后的二氧化硅微球混合，获得负载多核苷酸的二氧化硅微球；
3)将第二交联剂和步骤2)中负载多核苷酸的二氧化硅微球混合；
4)将多肽和步骤3)中负载多核苷酸的二氧化硅微球混合，与封闭液混合进行封闭，即获得所述二氧化硅微球复合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包含如下特征中一种或多种：
1)以步骤1)中反应液的总体积为基准，步骤1)中所述二氧化硅微球和所述第一交联剂的质量比为1：1-1：3；
2)以步骤2)中反应液的总体积为基准，步骤1)中每微克所述第一交联剂对应的步骤2)中所述多核苷酸的摩尔量为0.0001-0.05fmol；
3)步骤2)中所述混合的时间为1-45min；
4)以步骤3)中反应液的总体积为基准，步骤1)中所述第一交联剂和步骤3)中所述第二交联剂的质量比为0.1：1-10：1；
5)以步骤4)中反应液的总体积为基准，以步骤4)中反应液的总体积为基准，步骤1)中所述第一交联剂和步骤4)中所述多肽的质量比为100：1-150：1。
9.如权利要求1-6任一所述二氧化硅微球复合物在制备免疫PCR产品中的用途。
10.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含如权利要求1-6任一所述的二氧化硅微球复合物。
11.一种免疫PCR检测蛋白的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：
I)将样品与偶联有和样品特异性结合的抗体的磁珠混合反应后，分离磁珠；
II)将如权利要求1-6任一所述的二氧化硅微球复合物与步骤I)中分离的磁珠混合反应后，分离磁珠；
III)对步骤II)中分离的磁珠，进行荧光定量PCR扩增，通过荧光信号检测样品的含量。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包含如下特征的中一种或多种：
1)以步骤II)中反应液的总体积为基准，步骤II)中所述二氧化硅微球复合物与所述步骤I)中分离的磁珠的质量比1：0.5-1：2；
2)步骤III)中荧光定量PCR中引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3:所示。
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