CN112708660B - Crispr-poct检测组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种CRISPR‑POCT检测组合物及其应用，属于医学检测技术领域。该检测组合物包括：探针，包括依次连接的示踪部、识别切割区和固定相；所述示踪部包括标记示踪物和第一结合物，所述识别切割区根据CRISPR系统的Cas酶识别序列设计，为可被CRISPR系统识别酶切的RNA或DNA；试纸条，含有可与所述第一结合物特异性结合的第二结合物。该检测组合物，通过将探针进行固化，不让其完全进入试纸条检测系统中，可以避免因探针过量而造成的假阳性结果。与常规方法相比，提高了检测准确性，降低了假阳率，且具有较好的质控效果。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，特别是涉及一种CRISPR-POCT检测组合物及其应用。
背景技术
快速且准确地诊断感染性疾病的病因，对指导临床感染性疾病的治疗，感染性疾病防控工作，以及重大疫情的传播控制具有重大的意义。目前临床上应用于感染性疾病诊治的常见方法包含形态学检测、抗原抗体检测、体外培养、血清学检测及分子检测如PCR(Polymerase chain reaction)等。在这些方法中，或受限于时间，或依赖于昂贵的仪器设备，无法同时满足价格低廉、快速诊断、灵敏度特异性高，以及操作简便等临床或公共卫生事业的应用需求。2017年，张锋等在基于Cas12/13等CRISPR蛋白的“反式切割”(transcleavage)活力的发现上，开发了CRISPR应用于核酸检测的技术，成功地实现了对寨卡病毒的检测，并做到“快速、灵敏、高特异、简便、低价”的特性。
CRISPR-Cas检测过程通常分为两步。第一步是利用RPA、LAMP、PCR或者RT-PCR对靶标分子的扩增；第二步则是对扩增得到的靶标分子进行检测，即Cas蛋白的反式切割反应：当Cas蛋白与对应靶标的crRNA结合后，可特异性地识别靶标分子，并对靶标分子进行切割，激活Cas蛋白的“反式切割”活性；此时体系中的核酸报告分子(一边为荧光基团、一边为猝灭基团)可被激活的Cas酶切割，释放荧光信号，通过检测报告分子的荧光信号从而检测反应体系中是否有靶标分子的存在。
目前基于CRISPR-Cas的常温等温快速检测核酸的技术包括HOLMES(one-HOurLow-cost Multipurpose highly Efficient System)，DETECTR(DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter)以及SHERLOCK(specific high-sensitivityenzymatic reporter unlocking)三个技术平台，这些检测平台均是通过荧光定量PCR仪或者酶标仪等荧光检测仪器来检测体系中被切割的荧光探针所实现的，存在仪器依赖性大，不适用于床边诊断的问题，临床也难以得到广泛性应用。
2018年，Gootenberg团队对SHERLOCK技术进行了改进，开发出了SHERLOCKv2检测系统，SHERLOCKv2的检测结果除了可以是此前一直使用的荧光读数，还可以是侧向流免疫层析(lateral flow assays)方式。进一步简化了实验操作及节省了仪器设备，这使得CRISPR技术在POCT(point-of-care testing)领域可以得到更广泛的应用。
侧向流免疫层析的检测方式是通过改变CRISPR-Cas检测体系中的核酸报告分子修饰基团来实现的。其一端使用羧基荧光素修饰，另一端使用生物素修饰。当体系中无靶标分子存在时，Cas酶无活性，核酸报告分子保持完整，此时进行侧向流免疫层析检测，完整的核酸报告分子通过生物素基团与试纸条质控线上的链霉亲和素结合，连接着的FAM(羧基荧光素)基团与胶体金上的anti-FAM抗体结合，使胶体金聚集在质控线上显色而检测线不显色，此为阴性结果；当体系中含靶标分子时，Cas酶被激活切割核酸报告分子，带anti-FAM抗体的胶体金会向前层析至检测带，与检测带上的特异性二抗结合，使检测带上显色，此为阳性结果，如图1所示。
该方法的检测原理为：将两个分子基团进行切割分离，使得体系中同时存在“完整的”和“被切割的”两种核酸报告分子形式时，试纸条可同时检测到两种分子，此为阳性结果；体系中仅存在“完整的”一种核酸报告分子形式时，为阴性结果。这意味着无论是完整的，或被切割的报告分子，均会进入反应体系中，这也带来一定的检测问题。一方面，如果胶体金过量，或加入体系中的核酸报告分子过量，质控线上的链霉亲和素不足以结合所有进入试纸条反应的完整的核酸报告分子，则会出现假阳性的结果。另一方面，如果加入体系中的核酸报告分子过少，在探针被切割完全的情况下，质控线可能会不完全显色，达不到质控效果。因此，使用一种可与经典试纸条系统兼容的检测探针，可使CRISPR检测结果更加可信，为其实现POCT产品化奠定基础。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种CRISPR-POCT检测组合物，能够提高检测准确性，降低假阳率，且具有较好的质控效果。
一种CRISPR-POCT检测组合物，包括：
探针，包括依次连接的示踪部、识别切割区和固定相；所述示踪部包括标记示踪物和第一结合物，所述识别切割区根据CRISPR系统的Cas酶识别序列设计，为可被CRISPR系统识别酶切的RNA或DNA；
试纸条，含有可与所述第一结合物特异性结合的第二结合物。
上述探针，通过将经设计的示踪部和识别切割区(二者结合成为可固化探针)连接到可固定/分离的物体(固定相)表面，该探针带有可区分试纸条阴阳性的分子基团(即示踪部)且可被CRISPR系统切割(即识别切割区)，当反应体系中有靶标分子存在时，CRISPR体系中的Cas蛋白的“反式切割”活性被激活，切割识别切割区，与试纸条检测相关的分子基团(即示踪部)被切割游离出来，进入试纸条系统使得试纸条检测带显色呈阳性；当反应体系中无靶标分子存在时，探针保持完整结构而无法进入试纸条系统，试纸条检测带不显色而显示阴性。
可以理解的，上述“连接”和“结合”，既包括“直接”的连接或结合，也包括“间接”的连接或结合，如通过生物素和链霉亲和素，或通过抗原和抗体等能够相互结合的搭桥物以间接的方式连接或结合。
上述示踪部用于区分试纸条阴阳性，可以理解的，其分子基团根据不同试纸条的原理进行设计：
如采用Milenia HybriDetect(TwistDx)试纸条原理进行定性检测，可通过识别(FITC/FAM和生物素)来实现；此时，可以通过直接合成同时带有生物素和FITC/FAM基团的DNA探针，或通过两条DNA探针退火实现将两个分子基团一体化(如图2所示)。
另外，还可采用半定量试纸条原理，需借助仪器完成检测的，也适用于此探针，如利用生物素(VB7)荧光定量快速检测，此时探针设计仅需带有生物素基团即可，检测中，当发生切割反应时，游离下来的生物素与试纸条上样品垫中的荧光微球标记生物素抗体结合并通过毛细作用向前层析，到达检测区后，检测线上固定的生物素抗原与剩余未结合的荧光微球标记生物素抗体结合。此时，检测线上结合的荧光微球标记生物素抗体的量与样品中生物素的浓度成反比。层析结束后，采用荧光读数仪读取检测线(T线)和质控线(C线)的荧光强度并计算T/C值，通过仪器内置的标准曲线即可计算出样品中生物素的含量并判断阴阳性。即此时所述标记示踪物和第一结合物均为生物素(VB7)，而第二结合物为可被定量测定的荧光微球标记生物素抗体。
在其中一个实施例中，所述示踪部包括连接的标记示踪物和第一结合物，所述试纸条包括检测带，所述检测带包被有可与所述第一结合物特异性结合的第二结合物。如上述定性检测试纸条。
在其中一个实施例中，所述试纸条上设有样品垫区和检测带，所述样品垫区含有可与所述第一结合物特异性结合的第二结合物，所述第二结合物可被定量测定，所述检测带包被有第一结合物。如上述半定量检测试纸条。
在其中一个实施例中，所述固定相选自：磁性微球、乳胶珠、葡萄糖珠、聚苯乙烯表面固体、聚丙烯表面固体、聚丙烯酰胺凝胶、金表面固体、玻璃表面固体和硅片。
适用于本发明的磁性微球也称为磁珠或磁球，可以是本领域中常用的磁性微球。优选的，可选用将纳米级的Fe2O3或Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机高分子材料的种类没有特别限制，可根据需要进行选择。
本发明所使用的磁性微球还可以通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH2、-CHO、-SH等。如可选用Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，并且，所述磁性微球任选地通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团等。
可以理解的，对于上述固定相，仅需能够经设计的示踪部和识别切割区(可固化探针)连接，并不影响CRISPR系统的识别切割即可，对于其具体材料选择、形态确定，可根据具体应用环境进行调整。
在其中一个实施例中，所述标记示踪物选自：FITC、FAM、生物素、地高辛。上述标记示踪物指最终能够在试纸条上显色、发光等可被直接或间接观测或检测到，用以判读检测结果的基团或物质。可以理解的，标记示踪物也可以选择其他物质，仅需能够起到判读作用即可。
在其中一个实施例中，所述第一结合物和第二结合物分别独立的选自：生物素、地高辛、FICT/FAM、抗原；链霉亲和素、地高辛抗体、抗FICT/FAM抗体、可与抗原结合的特异性抗体。以上第一结合物和第二结合物能够特异性结合，达到在试纸条上能够结合并使标记示踪物固定在检测线上的目的即可。
在其中一个实施例中，所述标记示踪物和第一结合物通过DNA和/或RNA单条序列连接；
或者
所述标记示踪物和第一结合物分别与两条DNA单链连接，且两条所述DNA单链可形成双螺旋结构。
在其中一个实施例中，所述示踪部中用以连接标记示踪物和第一结合物的序列与所述识别切割区序列类型不相同。如Cas12/14识别单链DNA序列，识别切割区设计为ssDNA序列，相应的试纸条设计部分则不能为ssDNA序列,需设计成RNA或双链DNA。Cas13识别ssRNA序列，识别切割区设计为ssRNA序列，相应的试纸条设计部分不为ssRNA序列即可。
标记示踪物和第一结合物需作为一个整体部分被试纸条检测，如若标记示踪物和第一结合物的连接序列与所述识别切割区序列类型相同，则会导致标记示踪物和第一结合物被切割分离，无法达到检测目的。通过上述设置，可以避免标记示踪物和第一结合物被切割的情况发生。
在其中一个实施例中，该CRISPR-POCT检测组合物还包括CRISPR反应体系，所述CRISPR反应体系包括：Cas酶，crRNA；所述crRNA根据待检测目标物特异性靶序列基因设计，与待测序列片段相匹配。
在其中一个实施例中，当所述Cas酶为Cas12或Cas14，所述识别切割区采用单链DNA序列；当所述Cas酶为Cas13，所述识别切割区采用单链RNA序列。
在其中一个实施例中，所述试纸条沿层析方向依次设有：样品垫、包被膜、吸水纸，所述检测带和质控带沿层析方向依次设置于所述包被膜上；所述样品垫上设有标志物，所述质控带包被有可与标志物结合的抗原或抗体。
本发明还公开了上述的CRISPR-POCT检测组合物的制备方法，包括探针制备步骤：
合成可固化探针：合成连接的示踪部和识别切割区；
固定相偶联：再将上述可固化探针通过识别切割区与固定相偶联，即得。
在其中一个实施例中，所述可固化探针选自：单链可固化探针、双链可固化探针；
所述单链可固化探针选自：标记示踪物-(N)n-第一结合物-识别切割区-(M)m-NH2，或者第一结合物-(N)n-标记示踪物-识别切割区-(M)m-NH2；
所述双链可固化探针选自：标记示踪物-(N)n-识别切割区-(M)m-NH2及第一结合物-(N’)n所形成的互补双链，或者第一结合物-(N)n-识别切割区-(M)m-NH2及标记示踪物-(N’)n所形成的互补双链；
其中：N，M选自独立的任意碱基，m，n独立的任选自：1-50的自然数。
本发明还公开了上述的CRISPR-POCT检测组合物在开发和/或制备用于CRISPR检测产品中的应用。
可以理解的，上述产品可以是试剂盒，也可以是一体化检测设备。
本发明还公开了一种CRISPR-POCT检测试剂盒，包括上述的CRISPR-POCT检测组合物。
本发明还公开了一种CRISPR-POCT检测方法，采用上述的检测组合物，包括以下步骤：
扩增：针对待测序列，设计特异性引物对，对待测样本中基因序列进行扩增，得反应液；
CRISPR反应：向上述反应液中加入CRISPR反应体系和探针，进行CRISPR反应，所述探针中识别切割区被切割，使所述示踪部与所述固定相连接断开，分离固定相，得上清液；
试纸条层析：取所述上清液，以所述试纸条进行层析检测，根据试纸条上检测带的显示情况进行结果判定。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种CRISPR-POCT检测组合物，通过将经设计的示踪部和识别切割区连接到固定相表面，该探针带有可区分试纸条阴阳性的示踪部，和可被CRISPR系统切割的识别切割区，当反应体系中有靶标分子存在时，CRISPR体系中的Cas蛋白的“反式切割”活性被激活，切割识别切割区，示踪部被切割游离出来，进入试纸条系统使得试纸条检测带显色呈阳性；当反应体系中无靶标分子存在时，探针保持完整结构而无法进入试纸条系统，试纸条检测带不显色而显示阴性。即在阳性情况下，试纸条体系中为一个完整的同时带有标记示踪物和第一结合物两个基团的分子(示踪部)，而在阴性情况下，试纸条体系中无上述示踪部。通过将探针进行固化，不让其完全进入试纸条检测系统中，可以避免因探针过量而造成的假阳性结果。与常规方法相比，提高了检测准确性，降低了假阳率，且具有较好的质控效果。
附图说明
图1为背景技术中所述侧向流免疫层析原理示意图；
图2为本发明中单链探针和双链探针示意图；
图3为实施例3中试纸条实际检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例所用原料，如非特别说明，均为市售购得。
实施例1
一种CRISPR-POCT检测组合物，通过以下制备方法得到：
一、探针的制备。
1、合成可固化探针。
按照“示踪部-识别切割区”设计可固化探针，如FAM-(N)n-Biotin-UUUUU-(M)m-NH2，N，M选自独立的任意碱基，m，n独立的任选自：1-50的自然数，其中，“FAM-(N)n-Biotin”部分为示踪部，“UUUUU”为识别切割区，通过“(M)m-NH2”与固定相连接。
例如，在本实施例中，可设计合成以下可固化探针：5’-FAM-TAGCGCGTAAAGTCGCATGCCTCGCA-Biotin-UUUUU-TCCGAATTGGCATTCCCAAGGAT-3’NH2。
2、固定相偶联。
2.1磁珠漂洗：取100-200μl粒径为0.2-1μm羧基磁珠(盘古基因)于干净的离心管中，加入100μl灭菌超纯水，震荡混匀后磁力架吸附后去除上清液，重复该步骤1次；
2.2磁珠偶联：在离心管中加入10-50μl 100μM步骤1中合成的可固化探针，加入25-50μl 1M EDC,25-50μl 0.5M MES(pH5.5),补水至200μl，50℃缓慢转动孵育4小时。
此处MES为2-(N-吗啉代)乙烷磺酸一水(MES monohydrate)，购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号145224-94-8；EDC为乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)，购自自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号25952-53-8，溶剂为上述MES。
2.3偶联后漂洗：孵育完成后，简短离心置于磁力架上吸附，去除上清，加入500μl0.1M咪唑漂洗2次；500μl 0.1M NaHCO3漂洗2次；
2.4磁珠封闭：使用500μl 20mM甘氨酸漂洗2次；
2.5磁珠重悬：使用100μl 0.05％Proclin-300重悬磁珠，震荡混匀，2-8℃保存。
二、试纸条的制备。
检测试纸条Milenia Hybridetect1购买于英国TwistDx公司。
实施例2
一种CRISPR-POCT检测组合物，通过以下制备方法得到。
1、合成可固化探针。
按照“示踪部-识别切割区”设计可固化探针，如探针1：FAM-(N)n-UUUUU-(M)m-NH2，同时合成退火探针2:Biotin-(N’)n(与1的部分反向互补)，N，M选自独立的任意碱基，m，n独立的任选自：1-50的自然数。其中，探针1的“FAM-(N)n”和探针2形成的双链结构为示踪部，探针1:的“UUUUU”为识别切割区，通过“(M)m-NH2”与固定相连接。
例如，在本实施例中，可设计合成可以下固化探针：5’-FAM-TAGCGCGTAAAGTCGCATGCCTCGCA-UUUUU-TCCGAATTGGCATTCCCAAGGAT-3’NH2，同时合成退火探针2：5’-Biotin-TGCGAGGCAT GCGACTTTACGCGCTA-3’。
2、磁珠偶联。
按照实施例1中的步骤2进行探针偶联。
3、偶联探针退火。
取10-30μl步骤2中偶联完成的磁珠探针，加入3-6μl步骤1中合成的100μM退火探针2，10μl 10x Annealing buffer/100μl反应体系，震荡混匀，95℃变性5min后，放至室温自然冷却退火。10x Annealing buffer：100mM Tris,pH 7.5-8.0、500mM NaCl和10mMEDTA。
4、磁珠漂洗：使用500μl 20mM甘氨酸漂洗2次磁珠，500μl灭菌超纯水漂洗2次；
5、磁珠重悬：使用10-30μl 0.05％Proclin-300重悬磁珠，震荡混匀，2-8℃保存。
实施例3
一种CRISPR-POCT检测方法，用以检测无乳链球菌，包括以下步骤：
一、扩增：
RPA扩增：使用GBS(无乳链球菌)特异性引物进行扩增。
GBS-F:5’-TAATACGACTCACTATAGGGCGGATTATGATGCAATTGAATGGAATGAA-3’(SEQ IDNO.1)
GBS-R:5’-CAGGCATAAGGGTGTCCGTAAGCTAATGT-3’(SEQ ID NO.2)。
对1pg GBS的gDNA模板进行恒温扩增，37℃反应30分钟，命名为C+；同时以DEPC水为对照组，命名为C-。
二、CRISPR反应：
往反应体系中加入CRISPR体系组分：
lμl实施例1制备得到的探针；
45nM LwCas13a酶；
22.5nM GBS-crRNA：5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUCUCUCUUCAGGAUAAUAAUGAUUAAAU-3’(SEQ ID NO.3)；
lμl T7 polymerase mix(New England Biolabs)；
20mM NTP。
37℃反应10分钟。
三、试纸条检测：
往上述反应液中加入100μL of HybriDetect 1 assay buffer(Milenia)，混匀后进行试纸条(Milenia)检测，得到结果如图3所示。
结果显示，含靶标分子GBS的实验组C+显示为两条带，不含靶标分子的对照组C-显示为一条带。说明本方法可通过试纸条检测明确区分是否有靶标分子GBS的存在。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州微远基因科技有限公司
<120> CRISPR-POCT检测组合物及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taatacgact cactataggg cggattatga tgcaattgaa tggaatgaa 49
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggcataag ggtgtccgta agctaatgt 29
<210> 3
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu cucucuucag gauaauaaug 60
auuaaau 67
Claims (9)
1.一种CRISPR-POCT检测组合物，其特征在于，包括：
探针，包括依次连接的示踪部、识别切割区和固定相；所述示踪部包括标记示踪物和第一结合物，所述识别切割区根据CRISPR系统的Cas酶识别序列设计，为可被CRISPR系统识别酶切的RNA或DNA；以及
试纸条，含有可与所述第一结合物特异性结合的第二结合物；
所述示踪部包括连接的标记示踪物和第一结合物，所述试纸条包括检测带，所述检测带包被有可与所述第一结合物特异性结合的第二结合物；所述检测带和质控带沿层析方向依次设置，所述质控带包被有可与标志物结合的抗原或抗体；
所述固定相选自：磁性微球、乳胶珠、葡萄糖珠、聚苯乙烯表面固体、聚丙烯表面固体、聚丙烯酰胺凝胶、金表面固体、玻璃表面固体和硅片；
所述标记示踪物选自：FITC、FAM、生物素、地高辛；
所述第一结合物和第二结合物分别选自：生物素、地高辛、FITC、FAM、抗原；链霉亲和素、地高辛抗体、抗FITC、FAM抗体、可与抗原结合的特异性抗体；
所述标记示踪物和第一结合物通过DNA和/或RNA单条序列连接；或者，所述标记示踪物和第一结合物分别与两条DNA单链连接，且两条所述DNA单链可形成双螺旋结构；
所述示踪部中用以连接标记示踪物和第一结合物的序列与所述识别切割区序列类型不相同。
2.根据权利要求1所述的CRISPR-POCT检测组合物，其特征在于，还包括CRISPR反应体系，所述CRISPR反应体系包括：Cas酶，crRNA；所述crRNA根据待检测目标物特异性靶序列基因信息设计，与待测序列片段相匹配。
3.根据权利要求2所述的CRISPR-POCT检测组合物，其特征在于，当所述Cas酶为Cas12或Cas14，所述识别切割区采用单链DNA序列；当所述Cas酶为Cas13，所述识别切割区采用单链RNA序列。
4.根据权利要求1所述的CRISPR-POCT检测组合物，其特征在于，所述试纸条沿层析方向依次设有：样品垫、包被膜、吸水纸，所述检测带和质控带沿层析方向依次设置于所述包被膜上；所述样品垫上设有标志物。
5.权利要求1-4任一项所述的CRISPR-POCT检测组合物的制备方法，其特征在于，包括探针制备步骤：
合成可固化探针：合成连接的示踪部和识别切割区；
固定相偶联：再将上述可固化探针通过识别切割区与固定相偶联，即得。
6.根据权利要求5所述的CRISPR-POCT检测组合物的制备方法，其特征在于，所述可固化探针选自：单链可固化探针、双链可固化探针；
所述单链可固化探针选自：标记示踪物-(N)n-第一结合物-识别切割区-(M)m-NH2，或者第一结合物-(N)n-标记示踪物-识别切割区-(M)m-NH2；
所述双链可固化探针选自：标记示踪物-(N)n-识别切割区-(M)m-NH2及第一结合物-(N’)n所形成的互补双链，或者第一结合物-(N)n-识别切割区-(M)m-NH2及标记示踪物-(N’)n-所形成的互补双链；
其中：N，M选自独立的任意碱基，m，n独立的任选自：1-50的自然数。
7.权利要求1-4任一项所述的CRISPR-POCT检测组合物在制备用于CRISPR检测产品中的应用。
8.一种CRISPR-POCT检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的CRISPR-POCT检测组合物。
9.一种非疾病诊断治疗的CRISPR检测方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的检测组合物，包括以下步骤：
扩增：针对待测序列，设计特异性引物对，对待测样本中基因序列进行扩增，得反应液；
CRISPR反应：向上述反应液中加入CRISPR反应体系和探针，进行CRISPR反应，所述探针中识别切割区被切割，使所述示踪部与所述固定相连接断开，分离固定相，得上清液；
试纸条层析：取所述上清液，以所述试纸条进行层析检测，根据试纸条上检测带的显示情况进行结果判定。
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