JP2007189991A

JP2007189991A - 遺伝子の検出方法

Info

Publication number: JP2007189991A
Application number: JP2006013239A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Murakami; 博村上
Original assignee: Nippon Meat Packers Inc
Current assignee: NH Foods Ltd
Priority date: 2006-01-20
Filing date: 2006-01-20
Publication date: 2007-08-02

Abstract

【課題】特定の遺伝子配列を簡便にして高精度で検出する方法の提供。
【解決手段】1)検出対象遺伝子に特異的なプライマーを用いてＤＮＡ伸長反応を行う工程；2)上記で伸長したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとして固定相に捕捉する工程；3)固定相に捕捉したＤＮＡに対して、当該ＤＮＡに対して相補的配列と非相補的配列を有する第１次プローブをハイブリダイゼーションする工程；4)第１次プローブに対して相補的配列と非相補的配列を有する第２次プローブをハイブリダイゼーションする工程からなり、上記第１次プローブ及び第２次プローブの少なくとも一種は標識化されており、当該標識に基づくシグナルを測定することにより遺伝子を検出することかならなる。
【選択図】なし

Description

本発明は遺伝子の検出方法に関する。より詳細には、本発明は特定の遺伝子配列を特異的、高感度かつ迅速に検出する方法に関する。本発明の方法は医学、薬学、農学、食品分野における診断、衛生管理、さらに環境保全等の分野において利用できる。

サンプル中の特異的な遺伝子配列の有無を判定する従来の方法としては、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法が知られている。ＰＣＲ法は特異的な2種類のプライマー間のＤＮＡ配列を高温耐性のTaq ＤＮＡポリメラーゼにより自動温度調節ができる増幅装置を用いて増幅させる方法である。増幅させたＤＮＡ配列は、アガロースなどのゲル電気泳動により移動度（分子量）を確認し、目的の遺伝子であるか否かが判定される。ＰＣＲ法はヒト及びその他の動植物、原虫、細菌、ウイルスなどの全ての遺伝子配列を増幅することができるため、微量な遺伝子の存在を見出す手段として優れている。
サザンハイブリダイゼーション法はあらかじめ作製されたＤＮＡプローブに相補的なＤＮＡ配列が結合するか否かで遺伝子の有無または量を判定する方法である。サザンハイブリダイゼーション法はサンプルから同時に多数の目的の遺伝子配列を探す手段として優れており、現在ＤＮＡマイクロアレイなどで使われている。

ＰＣＲ法の問題点としては、ＤＮＡの増幅に高額の増幅装置を必要とし、増幅産物も電気泳動しなければ目的の長さの遺伝子か否かが判定できないため、それらの機器が整備された検査所で、一定レベルの技術的訓練を受けた従事者が実施するのが通常である。従って、病院、食品工場、農場などの現場において迅速かつ簡便に行える検査法にはなっていない。また、従来のサザンハイブリダイゼーション法には目的のＤＮＡ配列を増幅させる工程がないため、ＰＣＲ法に比べると感度は劣り、微量な遺伝子の検出は困難であった。
近年、これらの問題点を解決するため現場レベルでも簡便に遺伝子検出が可能なLAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法が提案され、一部の検査では実用化されている（例えば非特許文献１）。しかし、LAMP法はターゲットとする遺伝子配列を増幅するために、厳密な規則に従って４種類ものプライマーを設計する必要があり、全ての遺伝子に応用する上で問題があった。
そこで、本発明は、上記問題点を解決し、迅速かつより簡便に感度良く遺伝子を検出する方法を提供することを目的とする。
月刊バイオインダストリー、２００５年３月号、シーエムシー出版

上記課題を解決するためになされた本発明は、
1)検出対象遺伝子に特異的なプライマーを用いてＤＮＡ伸長反応を行う工程；
2)上記で伸長したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとして固定相に捕捉する工程；
3)固定相に捕捉したＤＮＡに対して、当該ＤＮＡに対して相補的配列と非相補的配列を有する検出用第１次プローブをハイブリダイゼーションする工程；
4)検出用第１次プローブに対して相補的配列と非相補的配列を有する検出用第２次プローブをハイブリダイゼーションする工程からなり、
上記検出用第１次プローブ及び検出用第２次プローブの少なくとも一種は標識化されており、当該標識に基づくシグナルを測定することにより遺伝子を検出することかならなる遺伝子の検出方法である。
好ましくは、上記工程4)の後、検出用第２次プローブに対して相補的配列及び非相補的配列並びに標識を有する検出用第３次プローブをハイブリダイゼーションし、必要に応じて、前工程で使用したプローブに対して相補的配列及び非相補的配列並びに標識を有するプローブを順次ハイブリダイゼーションし感度を増強させる。
なお、上記の一本鎖ＤＮＡを固定相に捕捉する工程としては、結合性を有する物質対の一方の物質を結合させたプライマーを用いて伸長し乖離させて得た一本鎖ＤＮＡを、結合性を有する物質対の他方が固定化された固定相に捕捉する工程からなるのが好ましく、当該結合性を有する物質対としては、ビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）、ＤＩＧ(Digoxigen)−抗ＤＩＧ抗体、ＤＮＰ（核蛋白）−抗ＤＮＰ抗体などを使用するのが好適である。
さらに、標識として、蛍光性物質又は結合性を有する物質対の一方の物質を使用するのが好ましい。

本発明のプローブ連鎖反応により増幅させる遺伝子検出法によれば、ＰＣＲ操作及びＰＣＲ後のアガロース等ゲル電気泳動を行う必要がないため、それらに必要な高価な遺伝子増幅器及びその他の設備を必要とせずに特定遺伝子の検出を行うことができる。また、プローブを連続的に反応させることで、微量な遺伝子でも検出に必要な感度が得られるまで増幅させることができ、場合によっては目視でも検出できるという格別な効果を奏する。
本発明は上記の特長を有し、その利用分野としては、
医療分野における感染性微生物（寄生虫、原虫、ウイルス、細菌、カビ等）の検出、特定、及び診断；
動物医療分野における感染性微生物（寄生虫、原虫、ウイルス、細菌、カビ等）の検出、特定、及び診断；
食品製造分野における病原微生物（寄生虫、原虫、ウイルス、細菌、カビ等）、GMO原材料、アレルゲン性原材料の検出、特定、及び安全管理；
バイオ研究分野における新規な遺伝子検出手法、例えばIn Situ Hibridization法、FISH法などへの応用；
などへの利用が考えられ、従来法に比べて簡便且つ高精度である。

本発明は前記の構成からなり、本発明の第１工程は、検出対象遺伝子に特異的なプライマー（以下、検出用プライマーという）を用いてＤＮＡ伸長反応を行う工程である。
上記の検出用プライマーのオリゴヌクレオチド配列は検出対象遺伝子のＤＮＡ配列の中から選択するが、既存のプライマー設計ソフトを使用して設計することができる。選択性や検出感度及び再現性から考えて、10塩基以上、望ましくは15塩基以上の長さを持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然物由来のどちらでもよい。ＤＮＡ伸長反応には検出用プライマーを最低1種類使用すればよく、ＰＣＲ法のようにセンス鎖とアンチセンス鎖の２種類を必要としない点で本発明の方法の方が有利である。
ＤＮＡ伸長反応は常法に準じて行うことができる。特に常温で行えばよいため、通常のＤＮＡポリメラーゼを使用でき、ＰＣＲ法のようにTaq ＤＮＡポリメラーゼなどの耐熱性酵素は必要ない。ただし、耐熱性ポリメラーゼで行うことも可能である。伸長させる長さはプライマーの塩基数にもよるが、少なくともプライマーの塩基数を含めて30塩基以上は必要であるが、1000塩基程度が望ましい。しかし、それ以上でもよい。伸長に必要なＤＮＡポリメラーゼの反応時間は、どれだけ長くてもよいが、例えば1000塩基以上を伸長させるため10分以上が望ましい。

本発明の第２の工程は、上記で伸長したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとして固定相に捕捉する工程である。
ＤＮＡポリメラーゼ反応により伸長させた検出対象遺伝子の二本鎖ＤＮＡは、常法に準じて加熱（例えば95℃以上）して一本鎖に乖離することができる。
次いで、乖離した一本鎖ＤＮＡを固定相に捕捉する。固定相としては、例えば、メンブラン、ビーズ、ELISA用プレートなどが例示される。
固定相への一本鎖ＤＮＡの捕捉は、常法に準じて固定相への化学的結合法などによっても行うことができるが、好ましくは結合性を有する物質対の一方の物質を結合させた検出用プライマーを用いて伸長・乖離させて得た一本鎖ＤＮＡを、結合性を有する物質対の他方が固定化された固定相に捕捉する工程からなる。当該結合性を有する物質対としては、ビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）、ＤＩＧ−抗ＤＩＧ抗体、ＤＮＰ−抗ＤＮＰ抗体などを使用するのが好適である。

より具体的には、検出用プライマーの一端に、上記の結合性を有する物質対の一方の物質（例えば、ビオチンとする）を結合させておく。すると、前記の工程で生成した一本鎖ＤＮＡの末端にはビオチンが結合していることになる。一方、固定相上に、結合性を有する物質対の他方の物質（即ち、アビジン）を塗布・乾燥などの手段で固定化しておくと、ビオチン−アビジン結合を介して、一本鎖ＤＮＡを固定相上に固定することができる。この操作は、一本鎖ＤＮＡを含む溶液に、アビジンを固定化した固定相を浸漬した後、洗浄する方法；アビジンを固定化した固定相に一本鎖ＤＮＡを含む溶液を滴下した後、洗浄する方法などにより行うことができる。

検出用プライマーの一端に結合性を有する物質対の一方の物質を結合した物質は慣用の方法により調製することができる。例えば、ビオチン化検出プライマーは、例えばフォトプローブ・ビオチン（商品名:PHOTOPROBE Biotin, Vector Laboratories, Inc．）を使用して作製することができる。また、係る検出用プライマーは、専門の業者（例えばSIGMA GENOSIS社）に委託して作製することもできる。

本発明の第３の工程は、上記の方法で検出対象遺伝子ＤＮＡを固定相上に捕捉した後、その配列の少なくとも一部に対して相補的な配列を持つ検出用ＤＮＡプローブ（検出用第１次プローブ）をハイブリダイズさせる工程である。
上記の検出用第1次プローブは、伸長させた検出対象遺伝子ＤＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド配列と、それに続く非相補的なオリゴヌクレオチド配列よりなる。相補的な部分はそれぞれ検出対象遺伝子ＤＮＡ配列の異なる１または２以上の領域と相補性を持つように設計するのが好ましく、１種類または２種類以上の複数のプローブが混合されたものが好適である（図１参照）。即ち、検出用第１次プローブは検出対象遺伝子ＤＮＡにできるだけ多く結合するとその後の感度が高くなる。相補的な部分のオリゴヌクレオチド配列は伸長開始に使用したプライマー領域を除いて伸長された検出対象遺伝子ＤＮＡ配列の中から選択できる。伸長させた長さにより第1次プローブの相補配列に利用できる領域は限定されるが、例えば30分以上の伸長反応を行った場合には、プライマー配列を除く1000塩基程度までの配列領域から複数の領域を選択すればよい。また感度を高めるためには伸長反応時間を長めるとともに、1000塩基以上の領域からもプローブとなる配列を選択してもよい。相補的な部分のオリゴヌクレオチド配列の長さは選択性や検出感度及び再現性から考えて、5塩基以上、望ましくは10塩基以上の長さを持ったヌクレオチド配列で、化学合成あるいは天然物由来のどちらでもよい。

上記の非相補的なオリゴヌクレオチド配列は検出対象遺伝子に存在しないＤＮＡ配列であればどのようなものでもよいが、後記する検出用第２次プローブの一部と相補的な配列になるよう設計されなければならない（図１）。非相補的なオリゴヌクレオチド配列の長さは選択性や検出感度及び再現性から考えて、5塩基以上、望ましくは10塩基以上の長さを持ったヌクレオチド配列で、化学合成あるいは天然物由来のどちらでもよい。

固定相に捕捉したＤＮＡと検出用第１次プローブ（以下、単に第１次プローブという。他のプローブについても同様）とのハイブリダイゼーションは常法に準じて行うことができ、例えばＤＮＡを捕捉した固定相に、第１次プローブを溶解した溶液を添加することにより行われる。この際に使用される溶媒としては、一般にＤＮＡハイブリダイゼーションで使用できる慣用の緩衝液でよく、例えばPerfectHyb Hybridization Solution（商品名、東洋紡績社製）などが利用可能であるが、これに限定されない。なお、後記するハイブリダイゼーション（プローブ反応）工程で使用される溶媒も同様である。
ハイブリダイゼーションは、常法に準じて、常温〜加温（例えば３７℃）下、１０〜６０分間程度反応させることにより行われ、反応終了後、適当な洗浄液で洗浄することにより、ハイブリダイゼーションを終了する。プローブの洗浄に使用する洗浄液としては一般的にTris-HCl、Tween20などから組成される緩衝液でよいが、これらに限定されない。

本発明の第４の工程は、上記のハイブリダイゼーションの終了後、固定相上に捕捉された第１次プローブに対して第２次プローブをハイブリダイゼーションする工程である。
第２次プローブは第1次プローブの配列の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列と、検出対象遺伝子ＤＮＡ及び第１次プローブに対して非相補的であり且つ第３次プローブの少なくとも一部と相補的になるよう設計されたヌクレオチド配列からなるヌクレオチド断片である。係る第２次プローブは、前記第１次プローブと同程度の塩基長程度であり、その作製方法も前記第１次プローブの作製方法を参照することができる。
このハイブリダイゼーションは、前記の第１次プローブのハイブリダイゼーションと同様にして行うことができる。

上記の第１次プローブ及び第２次プローブの少なくとも一方は標識化されている。標識としては、例えば蛍光性物質が例示できる。当該蛍光性物質としては、例えばCyDye、FITC、TexasRed、ローダミン、FAMなどを用いることができるが、これらに限定されない。
また、標識として、前述の結合性を有する物質対の一方を使用することもできる。この場合には、結合性を有する物質対の他方の物質にシグナルを発生し得る物質を結合させた物を使用する。より具体的には、第１及び／又は第２次プローブに標識としてビオチンを結合させた場合、アビジンにシグナルを発生し得る物質を結合させた物を使用し、これらを反応させると、ビオチン−アビジン結合を介して、固定相にシグナルを発生し得る物質が捕捉される。なお、この際、検出用プライマーの捕捉に利用した物質とは別の物質を使用する必要があり、例えば前記の検出用プライマーにビオチンを結合させた場合は、プローブは例えばＤＩＧで標識する。

上記のシグナルを発生し得る物質としては、例えば蛍光性物質、酵素、色素などが挙げられる。蛍光性物質としては上記の物質を例示できる。酵素としては例えばアルカリフォスファターゼ（AP）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）などを挙げることができるが、これらに限定されない。APやHRPは検出に使う基質を変えることで化学発光、蛍光、発色のいずれかの方法で検出することができる。
色素としては、例えばメチレン青、クリスタル紫などが挙げられるが、これらに限定されない。
上記の蛍光性物質標識化プローブや結合性を有する物質対の一方の物質にシグナルを発生し得る物質を結合させたプローブは常法に準じて作製することができ、また専門の業者（例えばSIGMA GENOSIS社）に委託して作製することができる。

本発明の方法においては、上記の処理を行った後、標識に基づくシグナルを測定することにより、遺伝子の検出を行う。
シグナルの測定は、この分野で慣用の方法にて行うことができる。標識又はシグナルを発生し得る物質として、蛍光性物質を使用した場合の蛍光量測定には、例えばBIO-RAD社のマイクロプレートリーダーが利用できるが、これに限定されない。また酵素を利用した場合には、例えばアマシャムバイオサイエンス社のECF化学蛍光、NBT/BCIP発色検出、CDP-Star化学発光、ECL化学発光などが利用できるが、これらに限定されない。発色量の測定にはBIO-RAD社のマイクロプレートリーダーが、また発光量の測定にはLabsystems社のFluoroskan Ascent FLなどが利用できるが、これらに限定されない。特に発色反応で検出する場合には、肉眼による診断も可能である。
係るシグナル測定により、目的とする遺伝子の有無を判断することができる。

上記の本発明の方法にて目的とする遺伝子の検出を行うことができるが、更に高感度で測定したい場合には、第３次プローブ以下順次プローブを第ｎ次プローブまで反応させて感度を上げることができる。なお、これらのプローブには前述の標識が付加されている。
より具体的には、第３次プローブは第２次プローブの少なくとも一部と相補的な配列と、検出対象遺伝子ＤＮＡ及び第２次プローブとは非相補的であり且つ第４次プローブの少なくとも一部と相補的になるよう設計されたヌクレオチド断片である。前記した第２次プローブが捕捉された固定相と第３次プローブを反応させると、第２次プローブと第３次プローブがハイブリダイゼーションし、第３次プローブが固定相に捕捉される。

必要に応じて、以下同様にして、固定相に、第４次プローブ、第５次プローブ、第６次プローブ及び第ｎ次プローブまで捕捉することにより測定感度を増幅させることができる。換言すれば、前工程で使用したプローブの配列の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列と、検出対象遺伝子ＤＮＡ及び前工程で使用したプローブの配列に対して非相補的であり且つ後工程で使用されるプローブの配列の少なくとも一部と相補的になるよう設計されたヌクレオチド配列を有し、更に標識化されたプローブを順次ハイブリダイゼーションし、標識を増加させることにより感度を増幅することができる。なお、当然のことながら、各プローブ反応後は必ず洗浄して余剰のプローブを除去する。また、最後のプローブである第ｎ次プローブは非相補的配列を有さなくてもよい。
このようにプローブを反応させ、所望の感度が達成されたらプローブのハイブリダイゼーションを終了する。この際、直接蛍光または発光物質をシグナルとしたプローブを用いる場合には、蛍光または発光を測定しながらプローブ反応を進めてゆくことができ、サンプルより蛍光または発光が確認された時点で検出できたと見なすことができる。

本発明において、検出対象遺伝子としては、動植物、原虫、細菌またはウイルスなどの遺伝子を挙げることができるが、これらに限定されず、医学、薬学、農学、食品学、衛生学、環境学等の等の分野で検出対象とされる遺伝子全てを含む。
遺伝子を検出する試料はどのような形態でもよいが、たとえば土壌や糞便のように、検出用プライマーと検出対象遺伝子ＤＮＡとの結合が阻害される物質を含むような試料である場合には、試料からＤＮＡ精製を行うのが望ましい。ＤＮＡの精製は、例えばWizard Genomic DNA Purification Kit（商品名、Promega社製)などの簡易キットを用いて行うことができる。

以下、本発明の工程を図面に基づいて説明する。図１は本発明により検出対象遺伝子を検出する工程の概要を表す説明図で、図２はハイブリダイゼーションの概要を示す概念図である。

まず血液、食品、糞便などの試料よりＤＮＡを精製抽出する。血液など反応阻害物質が少ない試料についてはＤＮＡ精製工程が必要ない場合もある。
抽出したＤＮＡ溶液よりサンプル分を分取し蒸留水の入ったチューブに入れ、沸騰水中で5分程度加熱してサンプル中のＤＮＡの２本鎖を乖離させる。加熱後チューブは速やかに氷上に置き、ＤＮＡが乖離した状態を保持する。それに10倍濃縮ＤＮＡポリメラーゼ反応用緩衝液を添加して、反応液の最終濃度を、例えば50ｍM Tris-HCl（pH7.8）、10ｍM MgCl₂、0.1ｍM DTT、0.02mg/ml BSAとする。次にチューブに検出用プライマーとしてＤＩＧで標識されたプライマー、ＤＮＡポリメラーゼI、dNTP（N=A,G,C,T）を添加し、37℃で5分以上ＤＮＡポリメラーゼ反応を行う。例えばプライマーは1μM、ＤＮＡポリメラーゼＩは0.5-2.5
units/ml、dNTPは0.4 mM（dATP、dTTP、dCTP、dGTP：各0.1 mM）の濃度で反応を行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼＩとdNTPは市販品を使用することができる。ＤＮＡポリメラーゼ反応は5分より短くても長くてもよい。これにより検出対象遺伝子がＤＩＧ標識プライマーの伸長により複製される。

反応後、チューブを再度沸騰水中で5分加熱してＤＮＡポリメラーゼを失活させるとともに、複製されたＤＩＧ標識ＤＮＡを乖離させる。加熱後チューブは速やかに氷上に置いて氷温とし、あらかじめ抗ＤＩＧ抗体を結合させたメンブラン（ニトロセルロース膜）をチューブに入れてよく混ぜる。メンブランは、あらかじめ点状または線状に抗ＤＩＧ抗体を塗布した後、乾燥させて抗体を固定したものを使用する。この工程により、複製されたＤＩＧ標識ＤＮＡをメンブラン上の抗ＤＩＧ抗体塗布部分に結合させる。

メンブランを適当な洗浄液でよく洗浄し、ＤＮＡ反応液を除去した後、ビオチンで標識した第1次プローブをメンブランに滴下する。プローブとのハイブリダイゼーション反応は、第1次プローブが持つ検出対象遺伝子に対する相補配列のTm値より低い温度で１分以上行う。
反応後、メンブランを洗浄液で洗浄して余剰の第1次プローブを除去し、ビオチン標識第２次プローブを滴下して同様に反応させる。反応後、洗浄液で洗浄して余剰の第２次プローブを除去し、必要に応じて、さらに同様に第３次プローブ、第４次プローブ、第ｎ次プローブとビオチン標識プローブによるハイブリダイゼーション反応を繰り返す。係るハイブリダイゼーション反応を重ねることにより、検出対象遺伝子に結合するビオチン化プローブの数が増加し、その後の検出感度が上昇する。また、その時に各プローブに結合するプローブの数が多いほど検出感度は上昇する（図１及び２参照）。

必要なプローブ反応の終了後、HRP結合アビジンを反応させ、DABまたはTMBにより発色させ対象遺伝子を検出する。この場合ベクターラボラトリー社のVECTASTAIN
ABC Kitなどを利用することができる。また、この時、同時に抗ＤＩＧ抗体を塗布していないメンブランを用いて同じ工程を行っておき、陰性対象とすることで、バックグラウンドと発色の強さを比較して判定することが重要である。

以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る実施例に限定されるものではない。

実施例１（プローブ連鎖反応法による食中毒菌の同定）
検体の調製
表１に示した食中毒菌５種（５株）を使用した。それぞれの菌株を常用されている増菌培地に接種し、大腸菌O-157、黄色ブドウ球菌及びサルモネラは36℃好気的条件下で、リステリアは30℃の好気的条件下で、またカンピロバクターは36℃の微好気的条件下で18時間培養した。
菌液からのＤＮＡの抽出精製は既存のキット（Wizard Genomic DNA Purification Kit、Promega社製）を用いておこなった。

プライマー及びプローブの合成
使用する各菌種に特異的なＤＮＡ配列を持つＤＩＧ標識オリゴヌクレオチド（検出用プライマー）及び連鎖反応用ビオチン標識オリゴヌクレオチド（第1次プローブ、第２次プローブ、第３次プローブ、及び第４次プローブ）を合成するにあたっては、オリゴヌクレオチド合成受託会社に委託して作製した（表１参照）。その際、オリゴヌクレオチドの合成はβ−シアノエチルホスホアミダイド法により行った。オリゴヌクレオチドのＤＩＧ標識はオリゴヌクレオチドをアミノ化した後、DIG-NHSエステルを結合させて行った。ビオチンの標識は5'-Biotin
Phosphoramidite（Glen Research社製）を用いて行った。合成オリゴヌクレオチドの精製はオリゴプリフィキ逆相カートリッジで行った。

各試験菌の検出対象遺伝子は、大腸菌O-157はO-antigen gene cluster、サルモネラはinvasion protein (inv A) gene、黄色ブドウ球菌はstaphylocoagulase
gene、カンピロバクターはsuperoxide dismutase (sod B) gene、リステリアはlisteriolysin O precursor (hlyA) geneとし、検出用プライマーと第1次プローブの菌種特異的配列はそれらの遺伝子配列の中から適当な配列を選択した。また、共通に使用する第２、第３、第４次プローブは検出する菌種に関係なく設計した。

ＤＮＡポリメラーゼ反応
各菌種のＤＮＡ抽出液（10μg/ml）１μlを86μlの蒸留水の入ったチューブに入れ、95℃で5分加熱してサンプル中のＤＮＡの2本鎖を乖離させた。加熱後チューブは速やかに氷上に置き、ＤＮＡが乖離した状態を保持した。次にチューブに10倍濃縮ＤＮＡポリメラーゼ反応用緩衝液（500ｍM Tris-HCl pH7.8、100ｍM MgCl₂、1ｍM DTT、0.25mg/ml BSA）10μl、検出用ＤＩＧ標識プライマー（20μM）1μl、ＤＮＡポリメラーゼＩ 2.5 units、dNTP（N=A,G,C,T各最終濃度0.4 mM）を1μl添加し、37℃で30分反応を行った。反応後、チューブを再度95℃で5分加熱してＤＮＡポリメラーゼを失活させるとともに、複製されたＤＩＧ標識ＤＮＡを乖離させた。加熱後チューブは速やかに氷上に置いて氷温とした。

ＤＮＡ結合反応
上記反応液100μlを、あらかじめ抗ＤＩＧ抗体を結合させたELISA用プレートに添加し、４℃で30分反応させた。ELISA用プレートは前日に抗ＤＩＧ抗体（5μg/ml）を100μl添加して４℃下で１６時間インキュベートした後、Tween20（0.05％）を含むPBS（PBS-T）で3回洗浄し、その後反応開始まで４℃で保存した。サンプル反応後はプレートを上記洗浄液で3回洗浄し、ＤＮＡ反応液を除去した。

プローブ結合反応
全てのプローブはハイブリダイゼーション液（PerfectHyb Hybridization Solution、東洋紡績社製）で5
pmol/mlのプローブ液として使用した。上記ELISA用プレートにビオチン標識第1次プローブ液を50μl添加した。プローブ反応は、37℃で30分行った。反応後プレートを、65℃に加温したプローブ洗浄液（0.1% SDS, 0.5×SSC）100μlで3回洗浄し、不要のプローブを除去した。同様に第2、第3、第4次プローブ液を用いて、順次添加−反応−洗浄を繰り返した。

シグナル検出
第4次プローブの反応後、洗浄したプレートに、HRP結合アビジン（0.01μg/ml）を100μl添加して30分反応させた。反応後、PBS-Tで3回洗浄して余分なアビジンを除去し、次にHRPの基質となるTMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）液（TMB Microwell Substrate、KPL社製）を100μl添加した。室温で10分放置した後、反応停止液（2M H₂SO₄）を100μl添加し、直ちにプレートリーダーにより450nmでOD値を測定した。

結果
上記の結果を表２にまとめた。各食中毒菌液に対して、表１の（a）大腸菌O-157 O-antigen gene cluster、（b）サルモネラinvasion protein (inv A) gene、（c）黄色ブドウ球菌staphylocoagulase gene、（d）カンピロバクターsuperoxide dismutase (sod B) gene、（e）リステリアlisteriolysin O precursor (hlyA) geneの５つの検出用プライマーを用いて検出工程を進めた。各サンプルの検出はトリプリケートで行い、3回の結果の平均と標準偏差を計測した。その結果、該当菌種に特異的な検出用プライマーを用いた場合にのみ、全ての食中毒菌でＤＮＡが検出できた。一方、菌種に非特異的なプライマーを用いた場合には、全て陰性対照であるサケＤＮＡを検体とした場合と同等の測定値であり、陰性と判断できる結果となった。この結果からわかるように、本発明による方法を用いて、試験に使用した5種類の食中毒菌が正しく検出できることが示された。

実施例2（プローブ連鎖反応による感度増強効果）
検体の調製
試験菌には表１に示したSalmonella Enteritidisを使用した。菌株を常用されている増菌培地に接種し、36℃の好気的条件下で18時間培養した。菌液からのＤＮＡの抽出精製は実施例１に準じておこなった。

プライマー及びプローブの合成
使用するサルモネラに特異的なプライマー及びプローブ（第1次プローブ、第２次プローブ、第３次プローブ、及び第４次プローブ）は表１の配列及び標識物質を使用した。オリゴヌクレオチドを合成するにあたっては、オリゴヌクレオチド合成受託会社に委託して実施例１と同様の方法により作製した。

ＤＮＡポリメラーゼ反応
実施例１と同じ工程で行った。
ＤＮＡ結合反応
実施例１と同じ工程で行った。

プローブ結合反応
全てのプローブ結合反応は実施例１と同じ手順で順次添加−反応−洗浄を繰り返したが、本実験では反応させるプローブ数と検出感度の相関を検討する目的より、検体によっては第１から第４までの各工程でその後のプローブ反応を終了させた。
シグナル検出
実施例１と同じ工程で行った。

結果
上記の結果を表３にまとめた。各サンプルの検出はトリプリケートで行い、3回の結果の平均と標準偏差を計測した。それによると反応させたプライマー数依存的に発色強度が上昇することが認められた。特に第1次プローブだけ反応させた検体と第4次プローブまで反応させた検体では発色量に約２０倍の差が見られた。従って、一般的に行われる単一プローブによるハイブリダイゼーション法よりも、本発明の方法は感度を著しく高められることが明らかとなった。

本発明の方法の工程の概要を示した説明図である。本発明におけるハイブリダイゼーションの概要を示した概念図である。

Claims

遺伝子の検出方法であって、
1)検出対象遺伝子に特異的なプライマーを用いてＤＮＡ伸長反応を行う工程；
2)上記で伸長したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとして固定相に捕捉する工程；
3)固定相に捕捉したＤＮＡに対して、当該ＤＮＡに対して相補的配列と非相補的配列を有する検出用第１次プローブをハイブリダイゼーションする工程；
4)検出用第１次プローブに対して相補的配列と非相補的配列を有する検出用第２次プローブをハイブリダイゼーションする工程からなり、
上記検出用第１次プローブ及び検出用第２次プローブの少なくとも一種は標識化されており、当該標識に基づくシグナルを測定することにより遺伝子を検出することかならなる遺伝子の検出方法。
請求項１の工程4)の後、検出用第２次プローブに対して相補的配列及び非相補的配列並びに標識を有する検出用第３次プローブをハイブリダイゼーションし、必要に応じて、前工程で使用したプローブに対して相補的配列及び非相補的配列並びに標識を有するプローブを順次ハイブリダイゼーションすることからなる請求項１記載の遺伝子の検出方法。
一本鎖ＤＮＡを固定相に捕捉する工程が、結合性を有する物質対の一方の物質を結合させたプライマーを用いて伸長し乖離させて得た一本鎖ＤＮＡを、結合性を有する物質対の他方が固定化された固定相に捕捉することからなる請求項１又は２記載の遺伝子の検出方法。
結合性を有する物質対が、ビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）、ＤＩＧ−抗ＤＩＧ抗体、ＤＮＰ−抗ＤＮＰ抗体である請求項３に記載の遺伝子の検出方法。
標識が、蛍光性物質又は結合性を有する物質対の一方の物質である請求項１〜４の何れかに記載の遺伝子の検出方法。