CN111647642B - 一种基于检测试纸显示的核酸检测方法及核酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于检测试纸显示的核酸检测方法及核酸检测试剂盒，所述方法包括步骤：提供一种核酸探针，所述核酸探针一端通过共价键与固相颗粒连接，另一端通过共价连接着抗体识别物；将扩增后的待测样品以及所述核酸探针加入由crRNA以及Cas蛋白组成的反应体系中，反应得到反应液；将所述反应液滴加在检测试纸的加样区，所述加样区含有胶体金标记的第一抗体，所述检测试纸包括与所述第一抗体特异性结合的第二抗体位点，以及与所述抗体识别物结合的链霉亲和素位点；通过观察所述检测试纸的显色条带判断所述待测样品中是否含有靶标核酸。本发明能有效回避此前核酸检测出现的弱阳性与假阳性问题，从而有效提升检测试纸显色的核酸检测方法的灵敏度与准确性。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，特别涉及一种基于检测试纸显色的核酸检测方法及核酸检测试剂盒。
背景技术
核酸检测是指针对生物样本(如微生物、病毒、人、动物、植物等)中的遗传物质DNA或RNA的碱基特性进行检测的一类技术方法，比较常见的包括qPCR、LAMP以及RPA等。核酸检测通常是用核酸扩增的方法将待测样本的特定序列进行扩增并富集，再用特殊的方法对其进行标记，达到高灵敏度高特异性的检测效果。相比于蛋白免疫技术，核酸检测能够精确地区分单个碱基的差别，可以用于病毒亚型的分型，在临床上能更准确地鉴定出病原体、突变，对制定更精确的治疗方案具有重要的参考意义。
近年来随着CRISPR技术的发展，基于Cas蛋白附带剪切活性而制备的相关检测技术应运而生，两端修饰的DNA或者RNA探针(一端为FAM或FITC修饰，另一端为biotin修饰)能在受到靶标核酸激活的Cas12或Cas13蛋白的剪切而在合适的条件下产生信号，该信号可以被检测试纸进行显色。
然而，由于检测试纸原本并非设计为Cas12或Cas13核酸检测，导致检测试纸有以下缺陷：第一，无法有效区分弱阳性与阴性结果；第二，试剂中若无探针能产生与阳性一致的结果；而以上两个缺陷能严重干扰到核酸检测的灵敏性与准确性，也是Cas12与Cas13作为检测技术无法有力推广的关键原因。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于检测试纸显色的核酸检测方法及核酸检测系统，旨在解决现有基于检测试纸显色的核酸检测方法灵敏度与准确性较差的问题。
本发明的技术方案如下：
一种基于检测试纸显色的核酸检测方法，其中，包括步骤：
提供一种核酸探针，所述核酸探针一端通过共价键与固相颗粒连接，所述核酸探针另一端通过共价连接着抗体识别物；
将待测样品进行扩增，将扩增后的待测样品以及所述核酸探针加入由crRNA以及Cas蛋白组成的反应体系中，反应得到反应液；
将所述反应液滴加在检测试纸的加样区，所述检测试纸的加样区含有胶体金标记的第一抗体，所述检测试纸包括与所述第一抗体特异性结合的第二抗体位点，以及与所述抗体识别物结合的链霉亲和素位点；
通过观察所述检测试纸的显色条带判断所述待测样品中是否含有靶标核酸。
所述基于检测试纸显色的核酸检测方法，其中，当所述核酸探针为DNA探针时，所述Cas蛋白为Cas12蛋白。
所述基于检测试纸显色的核酸检测方法，其中，当所述核酸探针为RNA探针时，所述Cas蛋白为Cas13蛋白。
所述基于检测试纸显色的核酸检测方法，其中，所述固相颗粒为磁珠、玻璃珠，塑料珠或琼脂糖珠中的一种。
所述基于检测试纸显色的核酸检测方法，其中，所述抗体识别物为生物素分子、FAM和FITC中的一种或多种。
所述基于检测试纸显色的核酸检测方法，其中，所述待测样品为拭子、血液、分泌物、环境采集物或痰液中的一种。
所述基于检测试纸显色的核酸检测方法，其中，所述通过观察所述检测试纸的显色条带判断所述待测样品中是否含有靶标核酸的步骤包括：
若观察到所述检测试纸上出现两条显色条带，则判定所述待测样品中含有靶标核酸；
若观察到所述检测试纸上仅第二抗体位点出现显色条带，则判定所述待测样品中不含有靶标核酸。
一种基于检测试纸显示的核酸检测试剂盒，其中，包括核酸探针，由crRNA以及Cas蛋白组成的反应体系，以及检测试纸；所述核酸探针一端通过共价键与固相颗粒连接，所述核酸探针另一端通过共价连接着抗体识别物；所述检测试纸的加样区含有胶体金标记的第一抗体，所述检测试纸包括与所述第一抗体特异性结合的第二抗体位点，以及与所述抗体识别物结合的链霉亲和素位点。
有益效果：本发明提供了一种基于检测试纸显色的核酸检测方法，若反应体系中反应失败，则失败的反应产物则因无法切割核酸探针，使得抗体识别物驻留在固相颗粒上，又由于固相颗粒体积过大，无法顺利在检测试纸中游动，因而无法在链霉亲和素位点产生红色条带，从而显示阴性结果；若反应体系中反应成功，则反应产物可切割核酸探针，使得抗体识别物与所述固相颗粒分离，所述抗体识别物可在检测试纸中游动，因而可在链霉亲和素位点产生红色条带，从而显示阳性结果。本发明可真正意义上实现阳性-有带，阴性-无带的试纸检测方法，该法能有效回避此前核酸检测出现的弱阳性与假阳性问题，从而有效提升检测试纸显色的核酸检测方法的灵敏度与准确性。
附图说明
图1为现有技术使用的试纸检测示意图。
图2为本发明一种基于检测试纸显示的核酸检测方法较佳实施例的流程图。
图3为本发明核酸探针的结构示意图。
图4为本发明一种基于检测试纸显示的核酸检测结果示意图。
图5为不同Cas蛋白作用于核酸探针上的示意图。
具体实施方式
本发明提供一种基于检测试纸显示的核酸检测方法及核酸检测试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
近年来随着CRISPR技术的发展，基于Cas蛋白附带剪切(collateral cleavage)活性而制备的相关检测技术应运而生，两端修饰的核酸(DNA或者RNA)探针(一端为FAM或FITC修饰，另一端为生物素修饰)能在受到靶标核酸激活的Cas蛋白的剪切而在合适的条件下产生信号，该信号可以被检测试纸进行显色。
具体来讲，如图1所示，若样品中存在靶标核酸，则靶标核酸可激活所述Cas蛋白，激活后的Cas蛋白可剪切两端修饰的核酸探针，得到一端修饰有生物素的核酸以及一端修饰有FAM的核酸，所述一端修饰有生物素的核酸可在检测试纸中游动并与检测试纸中的链霉亲和素位点结合，所述一端修饰有FAM的核酸与第一抗体结合后可在检测试纸中游动并与检测试纸中的第二抗体位点结合，标记有胶体金的第一抗体从而在所述检测试纸中的第二抗体位点上富集而形成单条带，即阳性结果。若样品中不存在靶标核酸，则Cas蛋白无法剪切两端修饰的核酸探针，所述核酸探针可与第一抗体结合后直接在检测试纸中游动并同时与检测试纸中的第二抗体位点及链霉亲和素位点结合，此时标记有胶体金的所述第一抗体从而在所述检测试纸中的第二抗体位点及链霉亲和素位点富集而形成双条带，即阴性结果。
然而，由于检测试纸原本并非设计为Cas核酸检测，这将导致检测试纸存在无法有效区分弱阳性和阴性结果，以及试剂中若无核酸探针能产生与阳性一致的假阳性结果的缺陷。如图1所示，若试剂中无核酸探针，所述第一抗体可在所述检测试纸中游动并与所述第二抗体位点结合，此时胶体金可在所述第二抗体位点富集而形成与阳性结果相同的单条带。核酸探针也可因为Cas蛋白反应时间不够长或者靶标核酸含量太低而不能完全被剪切，则依然能在链霉亲和素处产生条带，同时也由于部分探针被剪切，而在第二抗体处产生条带，这与阴性结果表现出的带型一致。
上述核酸检测的两个缺陷能严重干扰到核酸检测的灵敏性与准确性，也是Cas12与Cas13作为检测技术无法有力推广的关键原因。基于此，本发明提供了一种基于检测试纸显色的核酸检测方法，如图2所示，其包括步骤：
S10、提供一种核酸探针，所述核酸探针一端通过共价键与固相颗粒连接，所述核酸探针另一端通过共价连接着抗体识别物；
S20、将待测样品进行扩增，将扩增后的待测样品以及所述核酸探针加入由crRNA以及Cas蛋白组成的反应体系中，反应得到反应液；
S30、将所述反应液滴加在检测试纸的加样区，所述加样区含有胶体金标记的第一抗体，所述检测试纸包括与所述第一抗体特异性结合的第二抗体位点，以及与所述抗体识别物结合的链霉亲和素位点；
S40、通过观察所述检测试纸的显色条带判断所述待测样品中是否含有靶标核酸。
在本实施例中，如图3所示，所述核酸探针一端通过共价键与固相颗粒连接，所述核酸探针另一端通过共价连接着抗体识别物，所述固相颗粒可以为磁珠、玻璃珠，塑料珠或琼脂糖珠中的一种，但不限于此；所述抗体识别物为生物素分子、FAM和FITC中的一种或多种，但不限于此。
下面以所述核酸探针一端通过共价键连接磁珠，另一端通过共价键连接生物素/FAM双标分子为例，如图4所示，在本实施例中，若待测样品中不包含靶标核酸，则Cas蛋白未被激活，无法切割核酸探针，使得核酸探针上的生物素/FAM双标分子无法从磁珠上脱离，而磁珠粒径较大且不溶于水，因此所述核酸探针会滞留在所述检测试纸的加样区，无法顺利在检测试纸中游动，即核酸探针无法与链霉亲和素位点结合，此时胶体金标记的第一抗体可在检测试纸中游动并与检测试纸中的第二抗体位点结合，因此，胶体金可在所述第二抗体位点富集产生红色条带，无法在链霉亲和素位点富集并产生红色条带，从而显示阴性结果；若待测样品中包含靶标核酸，则Cas蛋白可被靶标核酸激活，激活后的Cas蛋白可切割核酸探针，使得核酸探针上的生物素/FAM双标分子与磁珠脱离后可溶解在反应液里，且与磁珠脱离后的生物素/FAM双标分子可在检测试纸中游动，并与检测试纸中的链霉亲和素位点结合，此时胶体金标记的第一抗体在检测试纸的游动时可同时与第二抗体位点以及链霉亲和素位点上的生物素结合，因此，胶体金可同时富集在所述第二抗体位点以及所述链霉亲和素位点富集产生红色条带，从而显示阳性结果。本实施例可真正意义上实现阳性-有带，阴性-无带的试纸检测方法，该法能有效回避此前核酸检测出现的弱阳性与假阳性问题，从而有效提升检测试纸显色的核酸检测方法的灵敏度与准确性。
在一些实施方式中，当所述待测样品为DNA时，则可直接用PCR或者RPA等DNA扩增方法对其进行扩增，若所述待测样品为RNA时，则需要先经过反转录，再进行扩增；扩增后的产物可直接加入到由crRNA以及Cas蛋白组成的反应体系中，所述胶体金可与所述第一抗体结合，所述生物素可与所述第一抗体结合。
在一些实施方式中，当所述核酸探针为DNA探针时，则所述Cas蛋白为Cas12蛋白；当所述核酸探针为RNA探针时，所述Cas蛋白为Cas13蛋白。
在一些实施方式中，所述待测样品为拭子、血液、分泌物、环境采集物或痰液中的一种，但不限于此。本发明检测的靶标核酸包括但不限于DNA、RNA，所述靶标核酸来源包括各类人、哺乳动物、植物、微生物、真菌、病毒、原生生物等。
在一些实施方式中，本发明还提供一种基于检测试纸显示的核酸检测试剂盒，其中，包括核酸探针，由crRNA以及Cas蛋白组成的反应体系，以及检测试纸；所述核酸探针一端通过共价键与固相颗粒连接，所述核酸探针另一端通过共价连接着抗体识别物；所述检测试纸的加样区含有胶体金标记的第一抗体，所述检测试纸还包括与所述第一抗体特异性结合的第二抗体位点，以及与所述抗体识别物结合的链霉亲和素位点。
基于所述核酸检测试剂盒，本发明可真正意义上实现阳性-有带，阴性-无带的试纸检测方法，该法能有效回避此前核酸检测出现的弱阳性与假阳性问题，从而有效提升检测试纸显色的核酸检测方法的灵敏度与准确性。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种非疾病诊断目的的基于检测试纸显色的核酸检测方法，其特征在于，包括步骤：
提供一种核酸探针，所述核酸探针一端通过共价键与固相颗粒连接，所述核酸探针另一端通过共价连接着抗体识别物；
将待测样品进行扩增，将扩增后的待测样品以及所述核酸探针加入由crRNA、以及Cas蛋白组成的反应体系中，反应得到反应液；
将所述反应液滴加在检测试纸的加样区，所述加样区含有胶体金标记的第一抗体，所述检测试纸包括与所述第一抗体特异性结合的第二抗体位点，以及与所述抗体识别物结合的链霉亲和素位点；
通过观察所述检测试纸的显色条带判断所述待测样品中是否含有靶标核酸；所述待测样品为拭子、血液、分泌物、环境采集物或痰液中的一种；所述固相颗粒为琼脂糖珠；
所述抗体识别物为生物素分子和FAM；
所述第一抗体为针对FAM的抗体；
所述通过观察所述检测试纸的显色条带判断所述待测样品中是否含有靶标核酸的步骤包括：
若观察到所述检测试纸上出现两条显色条带，则判定所述待测样品中含有靶标核酸；
若观察到所述检测试纸上仅第二抗体位点出现显色条带，则判定所述待测样品中不含有靶标核酸。
2.根据权利要求1所述非疾病诊断目的的基于检测试纸显色的核酸检测方法，其特征在于，
当所述核酸探针为DNA探针时，所述Cas蛋白为Cas12蛋白。
3.根据权利要求1所述非疾病诊断目的的基于检测试纸显色的核酸检测方法，其特征在于，当所述核酸探针为RNA探针时，所述Cas蛋白为Cas13蛋白。
4.一种基于检测试纸显示的核酸检测试剂盒，其特征在于，包括核酸探针，由crRNA以及Cas蛋白组成的反应体系，以及检测试纸；所述核酸探针一端通过共价键与固相颗粒连接，所述核酸探针另一端通过共价连接着抗体识别物；所述检测试纸的加样区含有胶体金标记的第一抗体，所述检测试纸还包括与所述第一抗体特异性结合的第二抗体位点，以及与所述抗体识别物结合的链霉亲和素位点；所述固相颗粒为琼脂糖珠；
所述抗体识别物为生物素分子和FAM；所述第一抗体为针对FAM的抗体。
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