CN115404268B - 一种sry基因检测探针和试剂盒 - Google Patents

一种sry基因检测探针和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种SRY基因检测试剂盒，属于基因检测技术领域，所述SRY基因检测试剂盒包括：转录系统，等温扩增系统，用于检测SRY基因的CRISPR‑Cas13系统，以及可视化系统。其中用于检测SRY基因的CRISPR‑Cas13系统，包括：Cas13a核酸酶、转录后的crRNA、可视化显色报告分子；上述crRNA针对SRY基因，Cas13a核酸酶通过在crRNA识别靶基因后，激活酶活性，并对可视化显色报告分子进行切割，释放检测信号。本发明试剂盒能够对SRY基因检测，采用恒温扩增的方式并结合横向流动试纸条，不需要复杂的温控，具有操作简单，灵敏度高，特异性强，检测速度快的优势，可用于不同环境的快速检测。

Description

一种SRY基因检测探针和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物基因检测技术领域，具体涉及一种用于SRY基因检测的探针、CRISPR-Cas13系统和相关的试剂盒。
背景技术
SRY基因(sex-determining region of Y-chromosome，全称：Y染色体性别决定区)是哺乳动物的雄性性别决定基因。自发现后，对SRY基因的研究迅速发展开来。在基础医学、畜牧业和产前诊断等方面都有着广泛的应用。
像目前孕妇产检除了常规的医院检查，产前诊断主要的还有唐氏筛查、羊水穿刺和无创产检基因检测等。唐氏筛查准确率比较低，只有70％。羊水穿刺核酸检测是行业金标准，准确率高达100％，但容易造成孕妇流产，穿刺过程也会给孕妇很大的心理负担。因此，准确率高达99.9％、仅仅从手臂上抽取孕妇不到10毫升外周血的无创产前基因检测(NIPT)成为了广受孕妇家庭欢迎的基因遗传病筛查手段。而SRY基因检测，可以辅助选择产前诊断的最佳时间。且随着技术的进步和数据的扩大，可以搭建正常母体胎儿游离DNA的浓度平台，这将对某些病理妊娠、性连锁遗传病的早期诊断提供帮助。
目前市面上针对SRY基因的检测手段，主要有PCR加电泳凝胶的检测模式、QPCR荧光定量检测模式和基因测序等。这些检测手段需要依赖较多的仪器，且耗时相对较长。
本发明运用等温扩增和Cas13系统检测，减少了对大型仪器的依赖，检测时长稳定且相对较短，成本相对较低。能够做到快速、便携、准确的检测。作为辅助检测手段，有很大的应用空间。且本发明体系完善后，针对其他靶基因设计制备引物和编码DNA探针，也可完成其他靶基因的检测。
发明内容
本发明能够辅助产前诊断，其检测流程简单方便，成本较低。同时本发明检测灵敏度高，检测的特异性好。
本发明提供一种用于检测SRY基因的crRNA探针，所述crRNA探针包括：SRY probeF1和SRY probe R1，其中，SRY probe F1在5’端带有T7启动子序列，
所述SRY probe R1与SRY probe F1互补；
T7启动子序列为：GAAATTAATACGACTCACTATAGGG；
SRY probe F1的碱基序列为：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCAAAACATGGTAATTCAGTAACGTTGA；
SRY probe R1的碱基序列为：
TCAACGTTACTGAATTACCATGTTTTGCGTTTTGATCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC。
其中，所述SRY probe F1的靶基因为SRY基因。
SRY基因的碱基序列为：
TGGCGATTAAGTCAAATTCGCATTTTTCAGGACAGCAGTAGAGCAGTCAGGGAGGCAGATCAGCAGGGCAAGTAGTCAACGTTACTGAATTACCATGTTTTGCTTGAGAATGAATACATTGTCAGGGTACTAGG。
其中，所述crRNA探针的编码DNA序列包括：用于Cas13a核酸酶识别的核酸序列，以及与靶基因互补的核酸序列。
用于Cas13a核酸酶识别的核酸序列为：
GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAAC；
与靶基因互补的核酸序列为：
GCAAAACATGGTAATTCAGTAACGTTGA。
基于上述探针，本发明还提供一种用于检测SRY基因的CRISPR-Cas13系统，包括：Cas13a核酸酶、crRNA探针和可视化显色报告分子；所述crRNA用于识别SRY基因，Cas13a核酸酶在crRNA识别靶基因后，激活酶活性，并对可视化显色报告分子进行切割，释放检测信号。
其中，所述CRISPR-Cas13系统还包括：检测缓冲液；检测缓冲液包括：Tris。
其中，所述报告分子为非特异性报告分子，其序列为5’-mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA-3’，其中5’端用FAM标记，3’端用生物素标记。
同时，本发明提供一种SRY基因检测试剂盒，包括：转录系统，等温扩增系统，用于检测SRY基因的CRISPR-Cas13系统，以及可视化系统；
其中，所述转录系统包括T7 ReactionBuffer、T7 Polymerase Mix、SRYprobe探针对和无核酸酶水；
所述用于检测SRY基因的CRISPR-Cas13系统包括：Cas13a核酸酶、crRNA探针和可视化显色报告分子；
所述等温扩增系统包括：针对SRY基因的引物对，包括SRY-F1和SRY-R1；
SRY-F1的碱基序列为：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTGGCGATTAAGTCAAATTCGCATTTTTCAG；
SRY-R1的碱基序列为：
CCTAGTACCCTGACAATGTATTCATTCTCA；
所述可视化系统包括：横向流动试纸条和检测层析液。
所述横向流动试纸条前端包被有带FAM抗体的彩色微球，检测线上包被有生物素抗体，质控线上包被有羊抗鼠抗体。
优选地，等温扩增系统还包括：RPA重组酶、反应缓冲液V、醋酸镁溶液、无核酸酶水。
优选地，RPA重组酶包括：T4噬菌体重组酶UvsX、辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白和dNTPs。
优选地，反应缓冲液V包括：40mM Tris(pH＝7.9)、64mM醋酸钾、8mM乙酸镁、0.8mMDTT、2.4mMATP、16mM磷酸肌酸、80ng/μL肌酸激酶和质量浓度为5％的聚乙二醇。
优选地，醋酸镁溶液摩尔浓度为250mM。
上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：先将编码DNA探针转录成crRNA，检测后备用；再将样品DNA通过等温扩增系统进行扩增；随后经用于检测SRY基因的CRISPR-Cas13系统对SRY基因特异性识别；最后通过可视化系统观察检测信号以判断待检样品是否含有SRY基因。
横向流动试纸条前端包被有带FAM抗体的彩色微球，其彩色微球采用(羧基)偶联抗体两步法工艺，经过微球的稀释、活化、去除残留EDC、偶联抗体、封闭、去除未结合抗体等步骤制成。质控线(C线)在后端，其上包被有羊抗鼠抗体；检测线(T线)位于控制线前，其上包被有生物素抗体。完整的非特异性报告分子在和彩色微球上的FAM抗体结合后，会被检测线上的生物素抗体捕获显色，而多余的彩色微球上的FAM抗体会与羊抗鼠抗体结合而被保留在控制线上显色；而经过Cas13a水解的非特异性报告分子，其一端的生物素与检测线上的生物素抗体结合，但不显色。另一端的FAM会和彩色微球上的FAM抗体结合，不会被检测线上的生物素抗体限制，而是和控制线上的羊抗鼠抗体结合显色。
有益效果
本发明的优势在于：对SRY基因靶分子进行等温扩增，实现低拷贝分子的富集，从而大大提高检测下限，使低拷贝的分子被检出，最低限可达200个拷贝，提高扩增效率使检出率到达更高的要求，满足低拷贝模板的检出率。而且由于检测体系利用基因编辑探针特异性，因此检测有很高的特异性。
本发明能够对SRY基因检测，采用恒温扩增的方式并结合横向流动试纸条，不需要复杂的温控，具有操作简单，灵敏度高，特异性强，检测速度快等诸多技术优势。该试剂盒可用于实验室、临床、现场即时等多种环境中进行快速检测，并且可以以此为基础衍生出对其他病原体或者非病原体DNA和RNA的检测方法。
附图说明
图1为本发明的检测原理图。
图2为靶向检测的试纸条结果图。
图3为特异性测试的试纸条结果图。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
1.1引物及探针设计
针对SRY基因进行引物设计。设计完成进行DNA序列合成，具体如下：
(1)SRY基因的引物对
Figure SMS_1
设计编码DNA探针，crRNA探针的编码DNA序列具体如下：
Figure SMS_2
1.2探针制备
将编码DNA探针转录成向导RNA探针(crRNA)：一对编码DNA探针各取5μL混匀，95℃退火5min。后取退火的DNA探针加入转录反应体系中，混匀；将反应管置于37℃反应16h。反应结束后，用磁珠纯化或柱纯化反应产物，得到crRNA。检测后分装备用。
转录反应体系为：
试剂 用量
T7 Reaction Buffer 10μL
T7 Polymerase Mix 2μL
SRY probe探针对 5μL
无核酸酶水 3μL
1.3等温扩增
取5μL待检测样品和无核酸酶水分别加入等温扩增反应体系中，混匀；将反应板置于39℃反应15min，反应结束后，得到待检测样品的等温扩增反应产物。
试剂 用量
缓冲液V和RPA重组酶冻干粉 25μL
引物对(SRY-F1和SRY-R1) 2μL
醋酸镁 2.5μL
无核酸酶水 15.5μL
模板 5μL
1.4靶向检测
取1μL等温扩增产物进行检测，其中，所述检测反应体系如下：
Figure SMS_3
Figure SMS_4
非特异性报告分子如下：
名称 序列(5'to3')
非特异性报告分子 /56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/
反应结束后，向产物添加20μL试纸条检测层析液，混匀离心后将横向流动试纸条的载样区插入检测液中，2-5min后根据检测线条带的明亮度差异，可以通过肉眼直接观察并进行判读。
1.5灵敏度测试
将制备好的模板溶解后测定其浓度，通过浓缩或稀释成不同浓度。
测试：参与等温扩增的模板浓度(copies/mL)如下表：
Figure SMS_5
取5μL不同浓度模板参与等温扩增，后取1μL等温扩增产物进行靶向检测，经试纸条检测结果如图2。结果表明当模板浓度高于200copies/mL时，应用本发明，可以有效的检出。
1.6特异性测试
随机选取了七位志愿者采集样本参与特异性测试，并加上了一个空白对照(不加入样本，用检测缓冲液代替)。由不参与实验的人员进行编号记录留存。样本以盲样的形式进入实验室进行检测，留存的记录见下表所示。
盲样序号 A B C D E F G
性别 女 男 男 女 女 女 男
试纸条结果如图3，。结果表明SRY基因可以被检测到，且无交叉反应。证实了本发明检测具有较高的特异性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测SRY基因的crRNA探针，其特征在于，所述crRNA探针包括：SRY probeF1和SRY probe R1，其中，SRY probe F1在5’端带有T7启动子序列，
所述SRY probe R1与SRY probe F1互补；
T7启动子序列为：GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
SRY probe F1的碱基序列为：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCAAAACATGGTAATTCAGTAACGTTGA；
SRY probe R1的碱基序列为：
TCAACGTTACTGAATTACCATGTTTTGCGTTTTGATCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC。
2.根据权利要求1所述的用于检测SRY基因的crRNA探针，其特征在于，所述SRY probeF1的靶基因为SRY基因；
SRY基因的碱基序列为：
TGGCGATTAAGTCAAATTCGCATTTTTCAGGACAGCAGTAGAGCAGTCAGGGAGGCAGATCAGCAGGGCAAGTAGTCAACGTTACTGAATTACCATGTTTTGCTTGAGAATGAATACATTGTCAGGGTACTAGG。
3.根据权利要求1所述的用于检测SRY基因的crRNA探针，其特征在于，所述crRNA探针的编码DNA序列包括：用于Cas13a核酸酶识别的核酸序列，以及与靶基因互补的核酸序列；
用于Cas13a核酸酶识别的核酸序列为：
GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAAC；
与靶基因互补的核酸序列为：
GCAAAACATGGTAATTCAGTAACGTTGA。
4.一种用于检测SRY基因的CRISPR-Cas13系统，其特征在于，包括：Cas13a核酸酶、crRNA探针和可视化显色报告分子；所述crRNA用于识别SRY基因，Cas13a核酸酶在crRNA识别靶基因后，激活酶活性，并对可视化显色报告分子进行切割，释放检测信号，其中，所述crRNA探针为权利要求1所述的crRNA探针。
5.根据权利要求4所述用于检测SRY基因的CRISPR-Cas13系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas13系统还包括：Tris检测缓冲液。
6.根据权利要求4所述用于检测SRY基因的CRISPR-Cas13系统，其特征在于，所述报告分子为非特异性报告分子，其序列为5’-mArArUrGrGr CmAmArArUrGrGrCmA-3’，其中5’端用FAM标记，3’端用生物素标记。
7.一种基于权利要求1所述crRNA探针的SRY基因检测试剂盒，其特征在于，包括：转录系统，等温扩增系统，用于检测SRY基因的CRISPR-Cas13系统，以及可视化系统；
其中，所述转录系统包括T7 Reaction Buffer、T7 Polymerase Mix、SRY probe 探针对和无核酸酶水；
所述用于检测SRY基因的CRISPR-Cas13系统包括：Cas13a核酸酶、crRNA探针和可视化显色报告分子；
所述等温扩增系统包括：针对SRY基因的引物对，包括SRY-F1和SRY-R1；
SRY-F1的碱基序列为：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTGGCGATTAAGTCAAATTCGCATTTTTCAG；SRY-R1的碱基序列为：
CCTAGTACCCTGACAATGTATTCATTCTCA；
所述可视化系统包括：横向流动试纸条和检测层析液。
8.根据权利要求7所述的基于权利要求1所述crRNA探针的SRY基因检测试剂盒，其特征在于，所述横向流动试纸条前端包被有带FAM抗体的彩色微球，检测线上包被有生物素抗体，质控线上包被有羊抗鼠抗体。
9.根据权利要求7所述的基于权利要求1所述crRNA探针的SRY基因检测试剂盒，其特征在于，所述T7 Polymerase Mix包括：T7 DNA聚合酶，所述T7 Reaction Buffer包括：rNTPs。
10.根据权利要求7所述的基于权利要求1所述crRNA探针的SRY基因检测试剂盒，其特征在于，所述等温扩增系统还包括：RPA重组酶、反应缓冲液V、醋酸镁溶液、无核酸酶水；
其中，所述RPA重组酶包括：T4噬菌体重组酶UvsX、辅助因子UvsY、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白和dNTPs；
所述反应缓冲液V包括：pH=7.9的Tris、醋酸钾、乙酸镁、DTT、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶和质量浓度为5%的聚乙二醇。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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