CN117210612A - 一种检测呼吸道合胞病毒的探针和引物组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测呼吸道合胞病毒(RSV)的crRNA探针和引物组合，属于基因检测技术领域，其特征在于，所述crRNA探针包括：RSV_probe‑F和RSV_probe‑R，所述引物组合包括：RSV_F1和RSV_R1，其中，RSV_probe‑F和RSV_F1在5’端带有T7启动子序列，所述RSV_probe‑R与RSV_probe‑F碱基序列反向互补；Cas13a核酸酶通过在crRNA识别靶基因后，激活酶活性，并对可视化显色报告分子进行切割，释放检测信号。本发明的crRNA及引物对能灵敏特异性的对合胞病毒进行检测，首次将检测灵敏度降低到200copies，采用恒温扩增的方式并结合横向流动试纸条，不需要复杂的温控，具有操作简单，灵敏度高，特异性强，检测速度快的优势。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物基因检测技术领域，具体涉及一种基于等温扩增结合Cas13a基因编辑方法检测呼吸道合胞病毒(RSV)的crRNA探针和引物组合。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)属于副黏病毒科的肺病毒属(Pneumovirus)，只有一种血清型。主要引起6个月以下婴儿患细支气管炎和肺炎等下呼吸道感染，以及较大儿童和成人的鼻炎、感冒等上呼吸道感染。
病毒形态为球形，直径为120～300nm，有包膜，基因组为非分节段的单负链RNA，主要编码10种蛋白质，即融合蛋白(F)、黏附蛋白(G)和小疏水蛋白(SH)三种跨膜蛋白，两种基质蛋白M1和M2，三种与病毒RNA相结合形成核衣壳的蛋白(N、P和L)，两种非结构蛋白(NS1和NS2)。病毒包膜上有糖蛋白组成的刺突，无HA、NA和HL。该病毒不能在鸡胚中生长，但可在多种培养细胞中缓慢增殖，约2～3周出现细胞病变。病变特点是形成细胞融合形成的多核巨细胞，胞质内有嗜酸性包涵体。
目前市面上针对呼吸道合胞病毒(RSV)的检测手段，主要有PCR加电泳凝胶的检测模式、QPCR荧光定量检测模式和基因测序等。这些检测手段需要依赖较多的仪器，且耗时相对较长。
本发明运用等温扩增和Cas13系统检测，减少了对大型仪器的依赖，检测时长稳定且相对较短，成本相对较低。能够做到快速、便携、准确的检测。作为辅助检测手段，有很大的应用空间。且本发明体系完善后，针对其他靶基因设计制备引物和编码DNA探针，也可完成其他靶基因的检测。
发明内容
本发明能够对呼吸道合胞病毒(RSV)进行检测，其检测流程简单方便，成本较低。同时本发明检测灵敏度高，检测的特异性好。
本发明提供一种基于等温扩增结合Cas13a基因编辑方法检测呼吸道合胞病毒(RSV)的crRNA探针和引物组合，其特征在于，所述crRNA探针包括：RSV_probe-F和RSV_probe-R，所述引物组合包括：RSV_F1和RSV_R1，其中，RSV_probe-F和RSV_F1在5’端带有T7启动子序列，
所述RSV_probe-R与RSV_probe-F碱基序列反向互补；
T7启动子序列为：GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
RSV_probe-F的碱基序列为：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCATGTTAGACTACATGCCTTGATTTCA；
RSV_probe-R的碱基序列为：
TGAAATCAAGGCATGTAGTCTAACATGCGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC；
RSV_F1的碱基序列为：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAAGAAGCAAGCTGGCATATGATGTAACCAC；
RSV_R1的碱基序列为：
GTTTTCATAGTGAGATCTTTAACTGTAGTTAACATA。
所述RSV_F1和RSV_R1的靶基因序列为：
GTGCCAATGTGTCCTTGGATGAAAGAAGCAAGCTGGCATATGATGTAACCACACCCTGTGAAATCAAGGCATGTAGTCTAACATGCCTAAAATCAAAAAATATGTTAACTACAGTTAAAGATCTCACTATGAAAACACTC。
所述crRNA探针的编码DNA序列包括：用于Cas13a核酸酶识别的核酸序列，以及与靶基因互补的核酸序列；
所述用于Cas13a核酸酶识别的核酸序列为：
GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAAC；
与所述靶基因互补的核酸序列为：
GCATGTTAGACTACATGCCTTGATTTCA。
所述检测呼吸道合胞病毒的方法包括如下步骤：
第一步：crRNA制备：将浓度为10mM-50mM的RSV_probe-F和RSV_probe-R各取5μL混匀，95℃退火5min。后取退火的RSV_probe-F和RSV_probe-R加入转录反应体系(2～10μL浓度2×T7 Reaction Buffer，2～10μL浓度为2～100U/μL的T7Polymerase Mix，无核酸酶水补充体系至20μL)中，混匀；将反应管置于37℃反应4～16h。反应结束后，用磁珠纯化或柱纯化反应产物，得到crRNA。
第二步：等温扩增：取取1～10μL待检测样品加入等温扩增反应体系(5～25μL浓度为2×缓冲液V，RPA重组酶冻干粉2～200U/份，1-10μL的RSV_F1和RSV_R1各5～50mM，1-5μL浓度为280mM的醋酸镁，加无核酸酶水至50μL)中，混匀；将反应板置于39℃反应15min，反应结束后，得到待检测样品的等温扩增反应产物。
第三步：靶向检测：取1μL等温扩增产物加入到靶向检测体系(5-20μL浓度为5-100mM的检测缓冲液，1-20μL浓度为2×的T7 Reaction Buffer，0.1～2μL浓度为10～100U/μL的T7 Polymerase Mix，1-10μL浓度为1～80ng/μL的crRNA，0.1～5μL浓度为50——500nM的Cas13a核酸酶，0.1-5μL浓度为1～10nM可视化显色报告分子，0.1～5μL浓度为1～50mM的氯化钠)。
第四步：试纸条检测：取1～10μL第三步靶向检测产物，加入20～50μL试纸条检测层析液(10～100mM Tris-HCL，1-100mM NaCl，1～50mM MgCl2，pH 6.5-8.5)，混匀后，将试纸条放入缓冲液等待1-10分钟。肉眼观察结果。
有益效果
本发明设计的crRNA探针包括：RSV_probe-F和RSV_probe-R，所述引物组合包括：RSV_F1和RSV_R1，其中，RSV_probe-F和RSV_F1在5’端带有T7启动子序列，所述RSV_probe-R与RSV_probe-F碱基序列反向互补；Cas13a核酸酶通过在crRNA识别靶基因后，激活酶活性，并对可视化显色报告分子进行切割，释放检测信号。
本发明的crRNA及引物对能灵敏特异性的对合胞病毒进行检测，采用恒温扩增的方式并结合横向流动试纸条，不需要复杂的温控，具有操作简单，灵敏度高，特异性强，检测速度快的优势，可用于不同环境的快速检测。
针对呼吸道合胞病毒(RSV)来说，目前发现的检测灵敏度普遍在10^4～10^7之间，本发明设计出的引物对可以显著降低呼吸道合胞病毒(RSV)的灵敏度，提高检测的准确率。本发明的检测方法对呼吸道合胞病毒(RSV)的M2基因进行等温扩增，实现低拷贝分子的富集，从而大大提高检测下限，使低拷贝的分子被检出，最低限可达200个拷贝，提高扩增效率使检出率到达更高的要求，满足低拷贝模板的检出率。而且由于检测体系利用基因编辑探针特异性，因此检测有很高的特异性。
本发明能够对呼吸道合胞病毒(RSV)进行快速检测，采用恒温扩增的方式并结合横向流动试纸条，不需要复杂的温控，具有操作简单，灵敏度高，特异性强，检测速度快等诸多技术优势。
附图说明
图1为本发明的检测原理图。
图2为引物对F1-R1靶向检测的试纸条结果图。
图3为引物对F2-R2靶向检测的试纸条结果图。
图4为引物对F3-R3靶向检测的试纸条结果图。
图5为特异性测试的试纸条结果图。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
1.1针对呼吸道合胞病毒(RSV)的基因设计多对引物序列，完成进行DNA序列合成，具体如下：
(1)RSV基因的引物对
设计编码DNA探针，crRNA探针的编码DNA序列具体如下，三对引物共用一对crRNA：
1.2探针制备
将编码DNA探针转录成向导RNA探针(crRNA)：一对编码DNA探针各取5μL混匀，95℃退火5min。后取退火的DNA探针加入转录反应体系中，混匀；将反应管置于37℃反应16h。反应结束后，用磁珠纯化或柱纯化反应产物，得到crRNA。检测后分装备用。
转录反应体系为：
| 试剂 | 浓度 | 用量 |
| T7 Reaction Buffer | 2× | 10μL |
| T7 Polymerase Mix | 10U/μL | 2μL |
| RSV_probe-F+RSV_probe-R | 10mM each | 5μL |
| 无核酸酶水 | —— | 3μL |
1.3等温扩增
取5μL待检测样品和无核酸酶水分别加入等温扩增反应体系中，混匀；将反应板置于39℃反应15min，反应结束后，得到待检测样品的等温扩增反应产物。
| 试剂 | 浓度 | 用量 |
| 缓冲液V和RPA重组酶冻干粉 | 2× | 25μL |
| 引物对(RSV_F1和RSV_R1) | 10mM each | 2μL |
| 醋酸镁 | 280mM | 2.5μL |
| 无核酸酶水 | —— | 15.5μL |
| 模板 | —— | 5μL |
1.4靶向检测
取1μL等温扩增产物进行检测，其中，所述检测反应体系如下：
非特异性报告分子如下：
| 名称 | 序列(5'to 3') |
| 非特异性报告分子 | /56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/ |
反应结束后，向产物添加20μL试纸条检测层析液，混匀离心后将横向流动试纸条的载样区插入检测液中，2-5min后根据检测线条带的明亮度差异，可以通过肉眼直接观察并进行判读。
1.5灵敏度测试
将制备好的模板溶解后测定其浓度，通过浓缩或稀释成不同浓度。
Copy Number(N)＝con.(ng/ul)*6.022*10^(23)*10^(-9)/660*bases number
测试：参与等温扩增的模板浓度(copies/mL)如下表：
取5μL不同浓度模板参与等温扩增，后取1μL等温扩增产物进行靶向检测，经试纸条检测结果，引物对F1-R1结果如图2，F2-R2结果如图3，F3-R3结果如图4。对于F1-R1引物当模板浓度高于100copies/mL时，可以有效的检出，对于F2-R2引物当模板浓度高于1*105copies/mL时，可以有效的检出，对于F3-R3引物当模板浓度高于1*106copies/mL时，可以有效的检出。结果表明引物F1-R1具有更好的检出效果。
实施例2
2.1针对呼吸道合胞病毒(RSV)的基因进行引物对F1-R1进行各反应体系优化如下。
(1)RSV基因的引物对
设计编码DNA探针，crRNA探针的编码DNA序列具体如下：
2.2探针制备
将编码DNA探针转录成向导RNA探针(crRNA)：一对编码DNA探针各取5μL混匀，95℃退火5min。后取退火的DNA探针加入转录反应体系中，混匀；将反应管置于37℃反应4h。反应结束后，不进行磁珠纯化，得到crRNA，分装备用。
转录反应体系为：
| 试剂 | 浓度 | 用量 |
| T7 Reaction Buffer | 2× | 10μL |
| T7 Polymerase Mix | 10U/μL | 4μL |
| RSV_probe-F+RSV_probe-R | 10mM each | 3μL |
| 无核酸酶水 | —— | 3μL |
2.3等温扩增
取10μL待检测样品和无核酸酶水分别加入等温扩增反应体系中，混匀；将反应板置于39℃反应15min，反应结束后，得到待检测样品的等温扩增反应产物。
| 试剂 | 浓度 | 用量 |
| 缓冲液V和RPA重组酶冻干粉 | 2× | 25μL |
| 引物对(RSV_F1和RSV_R1) | 10mM each | 2μL |
| 醋酸镁 | 280mM | 3μL |
| 无核酸酶水 | —— | 10μL |
| 模板 | —— | 10μL |
2.4靶向检测
取1μL等温扩增产物进行检测，其中，所述检测反应体系如下：
| 试剂 | 浓度 | 含量 |
| 检测缓冲液(Tris pH 7.4) | 40mM | 12.5μL |
| T7 Reaction Buffer | 2× | 5μL |
| T7 Polymerase Mix | 10U/μL | 1μL |
| crRNA | 10ng/μL | 2μL |
| Cas13a核酸酶 | 82.58nM | 1μL |
| 可视化显色报告分子 | 10nM | 1μL |
| 氯化镁 | 2.5mM | 1.5μL |
| 等温扩增产物 | —— | 1μL |
非特异性报告分子如下：
| 名称 | 序列(5'to 3') |
| 非特异性报告分子 | /56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/ |
反应结束后，向产物添加20μL试纸条检测层析液，混匀离心后将横向流动试纸条的载样区插入检测液中，2-5min后根据检测线条带的明亮度差异，可以通过肉眼直接观察并进行判读。
2.5灵敏度测试
通过基因合成的方法将等温扩增产物进行合成，并构建进质粒形成标准品。将标准品以1/10进行梯度稀释。取10μL各梯度标准品参与等温扩增，后取1μL等温扩增产物进行靶向检测，经试纸条检测。结果表明较实施案例1中的检测结果，使用10μL的标准品进行检测，模板高于10copies/mL时，应用本发明，可以有效的检出。
实施例3
3.1针对呼吸道合胞病毒(RSV)的基因设计的引物对F1-R1，进行临床样本检测。
RSV基因的引物对
设计编码DNA探针，crRNA探针的编码DNA序列具体如下：
3.2探针制备
将编码DNA探针转录成向导RNA探针(crRNA)：一对编码DNA探针各取5μL混匀，95℃退火5min。后取退火的DNA探针加入转录反应体系中，混匀；将反应管置于37℃反应4h。反应结束后，不进行磁珠纯化，得到crRNA，分装备用。
转录反应体系为：
| 试剂 | 浓度 | 用量 |
| T7 Reaction Buffer | 2× | 10μL |
| T7 Polymerase Mix | 10U/μL | 4μL |
| RSV_probe-F+RSV_probe-R | 10mM each | 3μL |
| 无核酸酶水 | —— | 3μL |
3.3等温扩增
取10μL待检测样品和无核酸酶水分别加入等温扩增反应体系中，混匀；将反应板置于39℃反应15min，反应结束后，得到待检测样品的等温扩增反应产物。
| 试剂 | 浓度 | 用量 |
| 缓冲液V和RPA重组酶冻干粉 | 2× | 25μL |
| 引物对(RSV_F1和RSV_R1) | 10mM each | 2μL |
| 醋酸镁 | 280mM | 3μL |
| 无核酸酶水 | —— | 10μL |
| 模板 | —— | 10μL |
3.4靶向检测
取1μL等温扩增产物进行检测，其中，所述检测反应体系如下：
| 试剂 | 浓度 | 含量 |
| 检测缓冲液(TrispH7.4) | 40mM | 12.5μL |
| T7 Reaction Buffer | 2× | 5μL |
| T7 Polymerase Mix | 10U/μL | 1μL |
| crRNA | 10ng/μL | 2μL |
| Cas13a核酸酶 | 82.58nM | 1μL |
| 可视化显色报告分子 | 10nM | 1μL |
| 氯化镁 | 2.5mM | 1.5μL |
| 等温扩增产物 | —— | 1μL |
非特异性报告分子如下：
| 名称 | 序列(5'to 3') |
| 非特异性报告分子 | /56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/ |
反应结束后，向产物添加20μL试纸条检测层析液，混匀离心后将横向流动试纸条的载样区插入检测液中，2-5min后根据检测线条带的明亮度差异，可以通过肉眼直接观察并进行判读。
3.5特异性测试
选取10例临床样本，其中5例为阳性样本，3例为阴性样本，留存的记录见下表所示。
| 盲样序号 | A | B | C | D | E | F | G | H |
| 样本情况 | 阳性 | 阳性 | 阴性 | 阴性 | 阳性 | 阳性 | 阳性 | 阴性 |
试纸条结果如图5。结果表明合胞病毒能有效的检测出，且无交叉反应。证实了本发明检测具有较高的特异性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种检测呼吸道合胞病毒的探针和引物组合，其特征在于，所述crRNA探针包括：RSV_probe-F和RSV_probe-R，所述引物组合包括：RSV_F1和RSV_R1，其中，RSV_probe-F和RSV_F1在5’端带有T7启动子序列，
所述RSV_probe-R与RSV_probe-F碱基序列反向互补；
T7启动子序列为：GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
RSV_probe-F的碱基序列为：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCATGTTAGACTACATGCCTTGATTTCA；
RSV_probe-R的碱基序列为：
TGAAATCAAGGCATGTAGTCTAACATGCGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGT CTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC；
RSV_F1的碱基序列为：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAAGAAGCAAGCTGGCATATGATGTAACCAC；
RSV_R1的碱基序列为：
GTTTTCATAGTGAGATCTTTAACTGTAGTTAACATA。
2.根据权利要求1所述的一种基检测呼吸道合胞病毒的探针和引物组合，其特征在于，所述RSV_F1和RSV_R1的靶基因序列为：
GTGCCAATGTGTCCTTGGATGAAAGAAGCAAGCTGGCATATGATGTAACCACACCC TGTGAAATCAAGGCATGTAGTCTAACATGCCTAAAATCAAAAAATATGTTAACTACAGTT AAAGATCTCACTATGAAAACACTC。
3.根据权利要求1所述的检测呼吸道合胞病毒的探针和引物组合，其特征在于，所述crRNA探针的编码DNA序列包括：用于Cas13a核酸酶识别的核酸序列，以及与靶基因互补的核酸序列；
用于Cas13a核酸酶识别的核酸序列为：
GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAAC；
与靶基因互补的核酸序列为：
GCATGTTAGACTACATGCCTTGATTTCA。
4.一种检测呼吸道合胞病毒的探针和引物组合的应用，其特征在于：所述检测呼吸道合胞病毒的探针和引物组合用于试纸条，并通过显示C线和T线的方式判断是否含有呼吸道合胞病毒。
5.一种根据权利要求1所述的探针和引物组合检测呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于：所述检测呼吸道合胞病毒的方法包括如下步骤：
第一步：将浓度为10mM-50mM的RSV_probe-F和RSV_probe-R各取5μL混匀，95℃退火5min。后取退火的RSV_probe-F和RSV_probe-R加入转录反应体系中，混匀；将反应管置于37℃反应4～16h。反应结束后，用磁珠纯化或柱纯化反应产物，得到crRNA；
第二步：取1～10μL待检测样品加入等温扩增反应体系中，混匀；将反应板置于39℃反应15min，反应结束后，得到待检测样品的等温扩增反应产物；
第三步：取等温扩增产物加入到靶向检测体系，得到靶向检测产物；
第四步：试纸条检测：取1～10μL靶向检测产物，加入20～50μL试纸条检测层析液，混匀后，将试纸条放入缓冲液等待1-10分钟。肉眼观察结果。
6.根据权利要求5所述的探针和引物组合检测呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于：所述转录反应体系为2～10μL浓度2×T7 Reaction Buffer，2～10μL浓度为2～100U/μL的T7Polymerase Mix，无核酸酶水补充体系至20μL。
7.根据权利要求5所述的探针和引物组合检测呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于：所述等温扩增反应体系由如下成分组成：5～25μL浓度为2×缓冲液V，RPA重组酶冻干粉2～200U/份，1-10μL的RSV_F1和RSV_R1各5～50mM，1-5μL浓度为280mM的醋酸镁，加无核酸酶水至50μL。
8.根据权利要求5所述的探针和引物组合检测呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于：所述靶向检测体系为5-20μL浓度为5-100mM的检测缓冲液，1-20μL浓度为2×的T7ReactionBuffer，0.1～2μL浓度为10～100U/μL的T7 Polymerase Mix，1-10μL浓度为1～80ng/μL的crRNA，0.1～5μL浓度为50～500nM的Cas13a核酸酶，0.1-5μL浓度为1～10nM可视化显色报告分子，0.1～5μL浓度为1～50mM的氯化钠。
9.根据权利要求5所述的探针和引物组合检测呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于：所述试纸条检测层析液为10～100mM Tris-HCL，1-100mM NaCl，1～50mM MgCl2，pH 6.5-8.5。
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| CN117551818B (zh) * | 2024-01-11 | 2024-05-10 | 天津欧德莱生物医药科技有限公司 | 一种检测呼吸道合胞病毒的靶基因、引物探针组合以及试剂盒和应用 |
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