CN113462796A - 核酸等温扩增和CRISPR/Cas13a联合检测微生物的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及重组酶介导的核酸等温扩增和CRISPR/Cas13a联合检测微生物的方法和应用。通过RAA恒温扩增微生物基因组DNA，得到带有T7启动子的DNA产物，称为T7‑DNA，然后合并进行T7转录和CRISPR/Cas13a检测。当Cas13a‑crRNA复合物识别并特异结合T7‑DNA转录得到的RNA时，Cas13a随机切割周围的无关单链RNA荧光报告分子，产生荧光信号。本发明方法仅需30min即可特异性检测10¹CFU/mL微生物，时间短、灵敏度高、特异性好，只需普通金属浴和便携式荧光检测仪，适合于食源性病原、医学和兽医病原微生物现场检测或基层实验室使用。

Description

核酸等温扩增和CRISPR/Cas13a联合检测微生物的方法和 应用

技术领域

本发明属于病原微生物和食源性病原检测生物技术领域，是一种基于重组酶介导的核酸等温扩增技术(RAA)和CRISPR/Cas13a技术联合应用，快速特异检测微生物的方法和应用。

背景技术

1983年Kary Mullis发明了聚合酶链式反应(PCR)，使扩增和克隆DNA成为一个常规操作程序。体外DNA扩增技术也因此迅猛发展，实时定量PCR、免疫PCR等技术相继问世。但由于热循环的需要，这些技术都依赖于较为昂贵的PCR仪，限制了其在基层实验室或现场应用。为解决上述缺点，等温核酸扩增技术悄然兴起。重组酶介导核酸扩增技术(RecombinaseAided Amplification,RAA)，是由众测生物公司发明的一种在等温条件下的核酸快速扩增技术。在37-42℃等温条件下，利用从细菌获得的recA重组酶与引物DNA紧密结合形成聚合体。当引物与靶DNA完全互补配对时，在单链DNA结合蛋白(SSB)的帮助下，重组酶解开靶DNA的双螺旋结构进行链置换，随后Bsu DNA聚合酶对链置换后的DNA进行延伸，在30min内即可使扩增产物指数级增长。基于上述原理，仅需一台等温仪研究人员即可对核酸模板进行快速扩增，极大地简化了检测条件，促进了快速诊断技术的发展。

CRISPR/Cas(规律间隔成簇短回文重复序列及其关联基因)系统是存在于细菌及古细菌中一种用于抵御噬菌体入侵的天然免疫系统。当外来噬菌体入侵时，细菌能够生成用于识别病毒基因组的crRNA，与具有核酸内切酶活性的Cas蛋白结合形成复合体，共同对病毒靶序列进行识别和切割。该系统近些年在基因编辑领域崭露头角，其基因编辑能力给生物学界带来了新的革命。自2015年张锋团队发现C2C2(Cas13a)蛋白以来，CRISPR/Cas13系统备受关注。该系统具有特异性靶向单链RNA和附属非特异性切割单链RNA等特点，其出色的靶向效率和特异酶切能力使其在核酸快速检测方面具有良好的应用前景。

随着时代发展，食源性微生物已经成为威胁公众健康和经济发展的一个重要因素。据统计，每年有约15亿人感染食源性疾病。据WHO报告，沙门氏菌是全球食物中毒和腹泻样本中最为常见的病原体之一，在食源性病原菌中位列第一。沙门氏菌属于肠杆菌科中的一类革兰氏阴性杆菌，在自然界中广泛存在，对人类和动物健康具有很大危害。感染沙门氏菌的动物会出现腹泻、肠胃炎和败血症等症状，母畜感染则容易流产，而人感染则易出现高热、呕吐和严重腹泻等急性肠胃炎症状。因此，建立一种快速检测食源性微生物尤其是沙门氏菌的方法和应用对公共卫生和畜禽养殖具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于：克服当前微生物检测技术需要贵重仪器和不能在基层实验室应用的不足，提供一种基于重组酶介导的核酸等温扩增(Recombinase AidedAmplification，RAA)以及T7转录和CRISPR/Cas13a联合反应的简便、快速检测微生物的方法和应用，该方法通过RAA和合并T7转录-CRISPR/Cas13a检测两步，30min即可完成微生物(如沙门氏菌)DNA样品的特异检测，且只需普通金属浴和便携式荧光检测仪，不需要荧光定量PCR仪。

本发明所采用的技术方案是：

一种基于RAA核酸等温扩增和T7转录-CRISPR/Cas13a联合快速检测微生物的方法，所述方法通过RAA等温扩增目标细菌DNA样品，得到带有T7启动子的DNA产物，称为T7-DNA，即目标DNA；然后合并进行T7转录和CRISPR/Cas13a检测，利用Cas13a-crRNA复合物检测T7-DNA转录后得到的目标细菌的靶标RNA。

具体原理为：当T7-DNA转录得到的目标RNA存在crRNA识别位点时，Cas13a/crRNA复合物识别并结合靶标RNA，同时激活Cas13a附属切割功能，随机切割周围无关单链RNA；通过在此单链RNA两端分别修饰荧光基团FAM(即荧光报告分子)和淬灭基团BHQ1，Cas13a切割后使荧光基团FAM远离淬灭基团BHQ1，破坏了BHQ1淬灭功能，使得检测体系中的FAM产生荧光信号，根据荧光信号强度，确定是否存在靶标RNA和目标细菌。

该技术方案的步骤如下：

(1)筛选特异靶基因，设计并制备crRNA；

(2)利用试剂盒提取样品中微生物的基因组DNA；

(3)对微生物特异性基因进行RAA等温扩增，获得T7-DNA；

(4)合并进行T7转录和CRISPR/Cas13a检测。

需要指出的是，所述T7转录方式为体外转录；所述合并进行T7转录和CRISPR/Cas13a检测是指混合转录体系和CRISPR/Cas13a检测体系的组分，于等温条件下共同反应，以简化操作流程，缩短检测时间；所述温度均为38℃。

基于上述方案和原理，可以通过设计特异性RAA等温扩增引物和crRNA，利用引物和crRNA的双特异性，达到特异且快速检测目标微生物的目的。

特别地，所述微生物为沙门氏菌；所述特异性基因为invA基因。

优选地，所述荧光报告分子核苷酸序列为：FAM-UUUUUU-BHQ1；

优选地，所述RAA等温扩增的上游引物携带T7启动子，引物序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGT-3’；RAA等温扩增的下游引物核苷酸序列为：5’-CTCATTAATCAACAATACGATGCTGTTATC-3’。

优选地，所述crRNA核苷酸序列为：5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCGCACGCCAUAAUCAAUAAA-3’；

优选地，所述靶标RNA序列为：5’-UUUAUUGAUUAUGGCGUGCG-3’；

优选地，所述T7-DNA核苷酸序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGTAGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGTTAGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTAATGAG-3’；

具体步骤如下：

(1)制备crRNA(可委托相关生物公司合成)

取10μM人工合成的T7-crDNA正链与负链混匀，取10μL混合液退火；加入10μL NTPmix、8μL DEPC水和2μL T7 RNA聚合酶混匀，37℃转录过夜；转录产物中加入18μL DEPC水和2μL DNaseⅠ，37℃水浴30min；加入25μL LiCl mix，-20℃静置1h，4℃13300rpm离心45min；倒弃上清，500μL 75％乙醇(预冷)重悬，4℃13300rpm离心15min；重复上一步骤；室温晾干，30-50μL DEPC水重悬crRNA，测定RNA浓度；

(2)提取沙门氏菌基因组：

优选地，参照

DC103-01细菌基因组提取试剂盒说明书，步骤如下：取1mL沙门氏菌菌液，10000rpm离心3min沉淀细菌，1mL ddH₂O洗涤菌体沉淀1次；依次加入230μLBuffer GA、20μL蛋白酶K和250μLBuffer GB，充分振荡混匀，70℃孵育10min，溶液应澄清透明；加入250μL无水乙醇，振荡混匀，转移溶液至吸附柱中，10000rpm离心30s，弃去收集柱中液体；加入500μL Buffer PB，12000rpm离心30s弃去收集柱中液体；加入600μL Buffer PW，12000rpm离心30s，弃去收集柱中液体；重复上一步骤；空柱12000rpm离心2min，弃去收集柱中液体；待酒精挥发完毕后加入50μLddH₂O洗脱基因组DNA。

(3)RAA等温扩增沙门氏菌invA基因

优选地，操作步骤如下：

配制预混液，组分如下：

将47.5μL预混液加入装有干粉的反应单元管中，吸取2.5μL B buffer加于管盖上，盖紧管盖并反复颠倒混匀数次，瞬离收集反应液。将反应管置于38℃等温条件反应10min-30min。

(4)合并T7转录和CRISPR/Cas13a检测

优选地，可以合并T7转录和CRISPR/Cas13a检测以减少反应流程和时间，步骤如下：

配制反应体系，组分如下：

优选地，预混crRNA和Cas13a以提升结合效率。将反应管置于38℃等温条件反应10min-30min。反应结束后于荧光检测仪中读取FAM荧光强度。

本发明涉及重组酶介导的核酸等温扩增(RAA)和CRISPR/Cas13a联合快速检测微生物的方法，通过RAA恒温扩增微生物基因组DNA，得到带有T7启动子的DNA产物(T7-DNA)，然后合并进行T7转录和CRISPR/Cas13a检测。当Cas13a-crRNA复合物识别并特异结合T7-DNA转录得到的RNA时，Cas13a随机切割周围的无关单链RNA荧光报告分子，产生荧光信号。本发明方法仅需30min即可特异性检测10¹CFU/mL目标病原，时间短、灵敏度高、特异性好，只需普通金属浴和便携式荧光检测仪，适合于食源性病原、医学和兽医病原微生物现场检测或基层实验室使用。与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.本发明检测方法温度为38℃，仅需一台等温仪且不需调整温度即可完成全程检测；

2.本发明检测方法操作简单，耗时短，在提前制备crRNA后仅需提取基因组、扩增和检测三个流程，全程仅需1h，其中扩增和检测总反应时间在30min以内；

3.本发明检测方法灵敏度高，最低检测下限仅为10¹CFU/mL，与荧光定量PCR相当；在样品中10⁰CFU/mL(即每毫升一个细菌)的沙门氏菌，增菌4-6h后即可检出。

4.本发明检测方法特异性好，由于存在RAA引物特异性扩增和crRNA特异性检测“双保险”机制，确保该检测方法不会检出共同存在的其他非目标病原；

5.本发明检测方法灵活性强，更改RAA引物和crRNA序列即可检测其他病原。

附图说明

图1为本发明具体实施方法中的实施例2的体系可行性分析结果，A图为荧光值，B图为反应管荧光发射图；

图2为本发明具体实施方法中的实施例3的体系灵敏性检测结果，“-”表示阴性对照(模板为DEPC水),“+”表示阳性对照(模板为沙门氏菌基因组)；

图3为本发明具体实施方法中的实施例4的扩增和检测总反应时间下限结果图，“-”表示阴性对照(模板为DEPC水)；使用的沙门氏菌浓度为10¹CFU/mL；

图4为本发明具体实施方法中的实施例5的体系特异性和保守性检测结果，“-”表示阴性对照(模板为DEPC水)；

图5为本发明具体实施方法中的实施例6的体系抗其他共存病原干扰的检测结果，“-”表示阴性对照(模板为10⁷CFU/mL金黄色葡萄球菌和大肠杆菌与PBS的混合样品)；

图6为本发明具体实施方法中的实施例7的体系模拟样品检测结果，A、B和C图分别为鸡肉、牛奶和鸡蛋人工污染检测结果图，“-”表示阴性对照(模板为PBS)；

具体实施方式

下面详细阐述该发明的具体实施方式，应该理解，给出的实施例仅用于说明目的，并非限制本发明的范围。

下述实施例涉及的试剂、材料和仪器等，如无特殊说明，均为常规市售产品；所用方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。

实施例1.建立一种基于RAA等温扩增和CRISPR/Cas13a检测沙门氏菌的体系

一、设计并合成RAA引物

1.设计原则

不同于PCR引物，RAA引物长度在30-35nt区间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构，通常不需要考虑引物Tm值。特异性和保守性需要经过NCBI Blast筛选确定。

2.设计RAA引物

优选地，选择沙门氏菌保守性良好的invA基因。根据上述原则，经过NCBI Blast筛选确定RAA引物序列为：

(注：下划线序列为T7启动子。)

二、设计并合成crRNA

1.设计原则

crRNA的作用是特异性识别靶标RNA并引导Cas13a蛋白对其进行编辑和对周围RNA的随机切割。其序列包含重复序列和引导序列，前者构成茎环结构，长度36nt，用于保护自身不被切割以及促进crRNA与Cas13a的紧密结合；后者则是特异性识别靶标RNA，长度20nt，其3’端侧翼序列不能为G，否则将显著降低Cas13a的活性。引导序列的特异性和保守性需要经NCBI Blast筛选确定。

2.设计crRNA

根据上述原则，利用NCBI对RAA扩增序列进行Blast，确定crRNA序列为5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCGCACGCCAUAAUCAAUAAA-3’，其中下划线序列为引导序列，与该引导序列互补的靶标RNA序列为：5’-UUUAUUGAUUAUGGCGUGCG-3’；

3.合成crRNA

优选地，所设计的crDNA正反链交由生物公司合成，并用DEPC水稀释至10μM。

三、提取沙门氏菌基因组DNA

操作步骤参照

DC103-01细菌基因组提取试剂盒说明书。具体如下：

取1mL沙门氏菌菌液，10000rpm离心3min沉淀细菌，1mL ddH₂O洗涤菌体沉淀1次；依次加入230μL Buffer GA、20μL蛋白酶K和250μL Buffer GB，充分振荡混匀，70℃孵育10min，溶液应澄清透明；加入250μL无水乙醇，振荡混匀，转移溶液至吸附柱中，10000rpm离心30s，弃去收集柱中液体；加入500μL Buffer PB，12000rpm离心30s弃去收集柱中液体；加入600μL Buffer PW，12000rpm离心30s，弃去收集柱中液体；重复上一步骤；空柱12000rpm离心2min，弃去收集柱中液体；待酒精挥发完毕后加入50μLddH₂O洗脱基因组DNA。

四、RAA等温扩增

操作步骤如下：

配制预混液，组分如下：

将47.5μL预混液加入装有干粉的反应单元管中，吸取2.5μL B buffer加于管盖上，盖紧管盖并反复颠倒混匀数次，瞬离收集反应液。将反应单元管置于38℃等温条件反应至少10min-30min。

五、合并T7转录和CRISPR/Cas13a检测

可以合并T7转录和CRISPR/Cas13a检测以减少反应流程。具体如下：

配制反应体系，组分如下：

预混crRNA和Cas13a以提升结合效率。将反应管置于38℃等温条件反应10min-30min，反应结束后于荧光检测仪中读取FAM荧光强度。

实施例2.对体系进行可行性分析

培养新鲜的沙门氏菌和大肠杆菌，按照实施例1所述步骤进行检测。

检测结果如附图1所示，当模板为沙门氏菌时，反应管会产生强烈的荧光信号，而大肠杆菌则无荧光信号，证明检测体系具有可行性，能够特异性检测沙门氏菌。

实施例3.对体系进行灵敏性检测

取新鲜的沙门氏菌，调整OD₆₂₀至0.05-0.09范围内(约10⁸CFU/mL)，使用PBS进行十倍梯度稀释，取1mL 10⁵-10⁰CFU/mL菌液按照实施例1所述步骤进行检测(同时取合适梯度菌液点板计数)，同时设立DEPC水作为阴性对照，高浓度沙门氏菌基因组作为阳性对照。

检测结果如附图2所示，证明体系的检测下限为10¹CFU/mL，具有较强灵敏性。

实施例4.探索扩增和检测总反应时间下限

取新鲜的沙门氏菌，调整细菌浓度至10¹CFU/mL，按照实施例1所述步骤进行检测，同时设立DEPC水作为阴性对照，其中RAA扩增时间设置为10、20和30min三个梯度，合并T7转录和CRISPR/Cas13a检测步骤于荧光定量PCR仪中进行，程序设定为每1min检测一次FAM荧光值，取10、20和30min时间点的荧光值作对比。

检测结果如附图3所示，当RAA等温扩增20min时，合并T7转录和CRISPR/Cas13a检测10min即可检出10¹CFU/mL沙门氏菌基因组，扩增和检测总反应时间为30min，表明本发明方法所用时间较短，优势明显。

实施例5.对体系进行特异性检测

培养Salmonella newport、Salmonella typhimurium、Salmonella enteritidis、Listeria monocytogenes、Escherichia coli、Staphylococcus aureus、Enterococcusfaecalis和Yersinia enteritidis等常见食源性细菌，按照实施例1所述步骤进行检测，同时设立DEPC水作为阴性对照。

检测结果如附图4所示，体系仅能检出沙门氏菌常见三种血清型而无法检出其他常见食源性细菌，表明本发明方法特异性和保守性良好。

实施例6.对体系进行抗干扰能力检测

取1mL 10⁷CFU/mL金黄色葡萄球菌和大肠杆菌与1mL 10⁴-10¹CFU/mL沙门氏菌混合作为试验组，与PBS混合作为阴性对照组，按照实施例1所述步骤进行检测。

检测结果如附图5所示，在高浓度非目标细菌存在下，体系检测下限为10²CFU/mL，表明本发明方法抗干扰能力良好。

实施例7.对体系进行模拟样品检测

向无菌均质袋中加入9g鸡肉和90mL沙门氏菌增菌液BPW，分别加入1mL 10⁴-10²CFU/mL沙门氏菌液，PBS作为阴性对照，37℃摇床培养。取0、2、4和6h时间点各1mL上清样品，按照实施例1所述步骤进行检测。同理，按照同样步骤对牛奶和鸡蛋进行检测。

检测结果如附图6所示，当10⁰、10¹和10²CFU/mL沙门氏菌污染样品时，鸡肉培养6h、4h和2h即可检出沙门氏菌，牛奶和鸡蛋培养4h、2h和0h即可检出沙门氏菌。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 核酸等温扩增和CRISPR/Cas13a联合检测微生物的方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uuuuuu 6

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taatacgact cactataggt taagcgtact cttctatttt aaattccgt 49

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcattaatc aacaatacga tgctgttatc 30

<210> 5

<211> 56

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaaccgca cgccauaauc aauaaa 56

<210> 4

<211> 346

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taatacgact cactataggt taagcgtact cttctatttt aaattccgtg aagcaaaacg 60

tagcgccgcc aaacctaaaa ccagcaaagg cgagcagccg ctcagtattg aggaaaaaga 120

agggtcgtcg ttaggactga ttggcgatct cgataaagtc tctacagaga ccgtaccgtt 180

gatattactt gtgccgaaga gccggcgtga agatctggaa aaagctcaac ttgcggagcg 240

tctacgtagt cagttcttta ttgattatgg cgtgcgcctg ccggaagtat tgttacgcga 300

tggcgagggc ctggacgata acagcatcgt attgttgatt aatgag 346

Claims (10)

1.一种核酸等温扩增和CRISPR/Cas13a联合检测微生物的方法，设计并合成目标微生物DNA片段的特异性扩增引物和特异性crRNA；对微生物特异性基因进行重组酶介导的核酸等温扩增，得到带有T7启动子的特异性DNA片段T7-DNA；然后合并进行T7 RNA聚合酶转录和CRISPR/Cas13a-crRNA酶切反应，当crRNA识别T7-DNA转录得到的靶标RNA时，CRISPR/Cas13a-crRNA复合物识别并结合目标RNA，同时激活Cas13a附属切割功能，随机切割周围无关单链RNA；通过在无关单链RNA两端分别修饰荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1，Cas13a切割后使荧光基团FAM远离淬灭基团BHQ1而发出荧光信号，进行荧光信号采集。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核酸等温扩增反应温度为37-39℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述T7转录方式为体外转录；所述合并进行T7聚合酶转录和CRISPR/Cas13a检测是指混合转录体系和CRISPR/Cas13a检测体系的组分，于37-39℃等温条件下共同反应，反应结束后于荧光检测仪中读取FAM荧光强度，与阴性组对比并得出检测结论。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：荧光报告分子核苷酸序列为：FAM-UUUUUU-BHQ1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微生物为沙门氏菌，所述特异性基因为invA基因。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述RAA等温扩增的上游引物携带T7启动子，引物序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGT-3’；下游引物序列为：5’-CTCATTAATCAACAATACGATGCTGTTATC-3’。

7.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述靶标RNA为5’-UUUAUUGAUUAUGGCGUGCG-3’。

8.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述crRNA核苷酸序列为：5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCGCACGCCAUAAUCAAUAAA-3’。

9.一种用于检测沙门氏菌的RAA-T7-CRISPR/Cas13a系统，包括权利要求5所述沙门氏菌invA基因靶标序列、权利要求6所述RAA扩增引物对和权利要求8所述的crRNA。

10.权利要求9所述的RAA-T7-CRISPR-Cas13a系统用于检测沙门氏菌的应用。

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