CN114250272B - 一种基于crispr的荧光生物传感器及其在dna糖基化酶检测中的应用 - Google Patents

一种基于crispr的荧光生物传感器及其在dna糖基化酶检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于CRISPR的荧光生物传感器及其在DNA糖基化酶检测中的应用，属于荧光检测技术领域。所述荧光生物传感器至少包括一个发夹探针、一个检测探针、一个信号探针和一个crRNA；本发明设计的荧光生物传感器采用发夹探针并结合二次链置换扩增和CRISPR/Cas12a效应子，用多核苷酸激酶(PNK)代替脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)从而大大简化了检测过程，能够快速灵敏地多重检测甲酰嘧啶[fapy]‑DNA糖基化酶(Fpg)和人8‑氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种基于CRISPR的荧光生物传感器及其在DNA糖基化酶检测 中的应用
技术领域
本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR的荧光生物传感器及其在DNA糖基化酶检测中的应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
传统的DNA糖基化酶检测方法包括放射性同位素标记、质谱(MS)、高效液相色谱(HPLC)和酶联免疫分析法(ELISA)，但它们存在危险辐射、抗体昂贵、样品制备复杂和灵敏度差等缺陷。此外，还引入了一些信号扩增策略(如外切酶III辅助的等温扩增技术、环介导等温扩增技术(LAMP)和滚环扩增技术(RCA))用于8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的灵敏检测。然而，这些方法大多涉及探针设计复杂，步骤繁琐且耗时(例如，总分析时间超过500分钟)，以及有非特异性扩增导致的假阳性信号等问题。因此，迫切需要开发一种能简单快速、灵敏地检测8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的生物传感器。
近年来，CRISPR-Cas系统已成为基因组编辑、转录调控和分子诊断领域的新兴有力工具。CRISPR-Cas系统是一个由CRISPR相关蛋白(Cas)和引导RNA(gRNA)组成的核糖核蛋白复合物。对于CRISPR-Cas系统中的CRISPR-Cas12(V-A型)和CRISPR-Cas13(VI型)，gRNA是一种单链CRISPR RNA(crRNA)，负责与Cas核酸酶和靶DNA/RNA结合。在形成Cas-crRNA靶复合物时，CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13效应子表现出靶激活的非特异性侧链切割活性(单链DNA(ssDNA)或RNA的任意水解)，这有助于构建简单且灵敏的生物传感器。目前，多种信号扩增策略(如RCA、LAMP、双链特异性核酸酶(DSN)辅助的信号放大、杂交链反应(HCR)、催化发夹自组装(CHA))与CRISPR-Cas12效应子相结合用于构建各种生物传感器。尽管它们表现出良好的分析性能，但发明人发现，这些生物传感器存在耗时长、步骤繁琐和费力的洗涤/分离步骤等缺点。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提供一种基于CRISPR的荧光生物传感器及其在DNA糖基化酶检测中的应用。本发明设计的荧光生物传感器采用发夹探针并结合二次链置换扩增和CRISPR/Cas12a效应子，用多核苷酸激酶(PNK)代替脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)从而大大简化了检测过程，能够快速灵敏地多重检测甲酰嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)和人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)，因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种基于CRISPR的荧光生物传感器，所述荧光生物传感器至少包括一个发夹探针、一个检测探针、一个信号探针和一个crRNA；
其中，所述发夹探针作为链置换扩增(SDA)模板，可以有效地阻止生成的激活剂(activator)与游离的发夹探针杂交；
具体的，所述发夹探针由5个结构域构成，包括1个检测探针的结合域，2个Nt.BbvCI切刻酶的识别域以及2个二次链置换扩增反应(Q-SDA)反应模板域。
所述检测探针标记有DNA糖基化酶切除修复位点；
所述信号探针序列两末端修饰有荧光基团和猝灭基团，且其可以被激活的CRISPR/Cas12a效应子切割。
本发明的第二个方面，提供上述荧光生物传感器在检测DNA糖基化酶中的应用。
本发明的第三个方面，提供一种检测DNA糖基化酶的方法，所述方法包括采用上述荧光生物传感器进行检测。
所述DNA糖基化酶包括但不限于人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)、甲酰嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)、烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(AAG)、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、胸腺嘧啶-DNA糖基化酶(TDG)等；优选的，所述DNA糖基化酶包括人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和甲酰嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)。
本发明的第四个方面，提供上述生物传感器和/或检测方法在DNA糖基化酶相关药物筛选和/或生物样品酶分析中的应用。
需要说明的，本发明虽然以检测人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)为例，提供相关荧光生物传感器以及检测方法，但是基于本发明的构思，如将检测探针中的DNA糖基化酶切除修复位点进行替换用于检测其他DNA糖基化酶等显然也是容易想到的，因此同样应属于本发明的保护范围。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
1.构建一种基于CRISPR的荧光生物传感器可实现在单分子水平上快速灵敏检测细胞和人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶：该生物传感器采用发夹探针并结合二次链置换扩增和CRISPR/Cas12a效应子，用PNK代替APE1大大简化了实验过程，只需一步反应，具有快速(在40分钟内)和等温分析的优点。8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的存在可以启动二次链置换扩增反应，在多核苷酸激酶(PNK)的帮助下产生大量的激活剂。随后，激活剂与crRNA结合，激活Cas12a的反式切割活性，导致信号探针的切割和Cy5的释放，最后通过单分子检测定量检测。
2.灵敏度高：与基于线性探针的检测方法相比，引入发夹探针可以有效地阻断生成的激活剂与游离发夹探针的杂交，大大提高了检测灵敏度。单分子检测的应用进一步提高了灵敏度，减少了样品的消耗。该生物传感器检测灵敏度高，检测限低至4.24×10-9单位每微升，可在单细胞水平准确测量细胞中的hOGG1。
3.特异性好：此前报道的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性分析方法由于易受无关生物分子的干扰产生假阳性结果，因此其特异性往往比较受限。本技术中用C3 spacer间隔子修饰可以有效地防止非特异性扩增，使该生物传感器具有很高的特异性。本技术方案由于所使用的基于CRISPR的生物传感器对8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性信号的特异性识别和转换，具有较高的检测特异性。
4.应用范围广：该生物传感器可用于多重检测Fpg和hOGG1。此外，该生物传感器还可用于筛选潜在的抑制剂，分析动力学参数，以及区分正常细胞和癌细胞，在分子诊断和即时检测方面具有潜在的应用价值。
5.操作简单：在本技术方案中，整个反应都在同质模式下进行，且只需一步反应，具有快速(在40分钟内)和等温分析的优点，不涉及任何热循环，洗涤和分离步骤，大大简化了实验程序。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明基于整合靶触发Q-SDA和CRISPR/Cas12a效应子的生物传感器用于8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶检测的原理示意图。
图2为本发明人类细胞中8-oxoG:C碱基对修复8-oxoG的APE1和PNK依赖的BER通路模型。
图3为基于CRISPR/Cas12的生物传感器用线性探针检测8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶原理示意图。
图4为本发明实施例中测量分别响应PNK和APE1的信噪比(S/N)。误差棒代表三次独立实验的标准偏差。Fpg的浓度为0.1单位每微升。
图5为本发明实施例中原理验证相关图，其中，A为反应产物的非变性PAGE分析。泳道1，在Fpg存在下的反应产物；泳道2，在Fpg不存在的反应产物；泳道3，合成的激活剂/crRNA杂交条带；泳道M，DNA标记(DNA marker)。实验采用0.01单位每微升Fpg、150纳摩尔每升合成的激活剂/crRNA杂交体和1.5微摩尔每升信号探针。B为分别在仅存在PNK、同时存在PNK+Fpg以及均不存在Fpg和PNK的情况下对应的荧光发射光谱。实验采用0.01单位每微升Fpg和0.1单位每微升PNK。
图6为本发明实施例中通过单分子成像检测8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性；具体为存在Fpg(A)和不存在(B)Fpg(0.01单位每微升)的Cy5的单分子图像。比例尺为5微米。(C)不同浓度Fpg的Cy5计数变化。插图显示Cy5计数随Fpg浓度在对数尺度上呈线性相关。
图7为本发明实施例中发夹探针和线性探针性能比较图，其中，A为用非变性PAGE分析杂交反应产物。泳道1，20纳摩尔每升发夹底物；泳道2，20纳摩尔每升线性底物；泳道3，20纳摩尔每升发夹底物+20纳摩尔每升合成激活剂；泳道4，20纳摩尔每升线性底物+20纳摩尔每升合成激活剂；泳道5，20纳摩尔每升发夹底物+20纳摩尔每升合成激活剂+20纳摩尔每升crRNA；泳道6，20纳摩尔每升线性底物+20纳摩尔每升合成激活剂+20纳摩尔每升crRNA；B为分别用线性底物和发夹底物测量响应不同浓度Fpg的Cy5计数。实验采用10纳摩尔每升线性底物和10纳摩尔每升发夹底物。误差棒表示三次重复实验的标准差。
图8为本发明实施例中信噪比(S/N)随反应温度(A)、反应时间(B)、dNTP浓度(C)和信号探针浓度(D)的变化情况。误差棒表示三个独立实验的标准差。Fpg的浓度为0.1单位每微升。
图9为本发明实施例中信噪比(S/N)与PNK量(A)、Klenow片段聚合酶量(B)、Nt.BbvCI量(C)、Cas12a-crRNA复合物浓度(D)的关系。误差棒代表三次独立实验的标准差。Fpg的浓度为0.1单位每微升。
图10为本发明实施例中分别在反应缓冲液(对照)，0.1毫克每毫升BSA，0.1毫克每毫升免疫球蛋白，0.01单位每微升UDG，0.01单位每微升hAAG，0.01单位每微升Fpg，和0.01单位每微升Fpg+以上干扰混合物的存在下测定的Cy5单分子计数。误差棒表示三个独立实验的标准差。
图11为本发明实施例中抑制剂相关图，其中，A为不同浓度的CdCl2对Fpg相对活性的抑制效果。Fpg浓度为1×10-5单位每微升。B为反应初始速度(V)随DNA底物浓度的变化。Fpg浓度为0.01单位每微升。误差棒表示三次重复实验的标准偏差。
图12为本发明实施例中细胞hOGG1的检测相关图；其中，A为分别在10000个A549细胞的细胞质提取物、细胞核提取物和全细胞提取物以及对照组存在的情况下测定的Cy5单分子计数；B为不同A549细胞数诱导的Cy5计数变化；C为在1到100个细胞的范围内，Cy5计数与A549细胞数的对数之间的线性关系；D为分别在A549细胞提取物、HeLa细胞提取物、HL-7702细胞提取物、A549细胞提取物+Cd2+和灭活A549细胞提取物存在的情况下测定Cy5单分子计数。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，传统的DNA糖基化酶生物传感器存在耗时长、步骤繁琐和费力的洗涤/分离步骤等缺点。
有鉴于此，本发明构建了一种基于CRISPR的荧光生物传感器可以在单分子水平上实现快速、灵敏地检测Fpg和hOGG1。Fpg和hOGG1均为双功能DNA糖基化酶，兼有AP-裂解酶活性和N-端糖基化酶活性。N-端糖基化酶活性可以切割糖基和氧化嘌呤碱之间的N-糖苷键，从而产生一个脱嘌呤(AP)位点。Fpg的AP-裂解酶活性通过βδ消除切割DNA链上的AP位点，产生一个具有5'和3'磷酸末端的单核苷酸缺口，而hOGG1的AP-裂解酶活性通过β消除裂解DNA链上的AP位点，产生一个5'磷酸和一个3'磷酸-α，β-不饱和醛(3'dRP)。8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶可在PNK的协助下启动二次链置换扩增反应(Q-SDA)产生大量激活剂。随后，激活剂与crRNA结合以激活Cas12a的反式切割活性，导致信号探针被切割和Cy5荧光信号的恢复，最终可通过单分子成像准确定量恢复的Cy5荧光信号。设计的发夹探针可以有效地阻止生成的激活剂与游离的发夹探针杂交，使所有激活剂都与crRNA结合激活Cas12，使得该荧光生物传感器的灵敏度显著提高。此外，C3 spacer间隔子修饰的发夹探针可以有效地防止非特异性扩增，使该生物传感器具有很高的特异性。此外，用PNK代替APE1大大简化了实验过程，只需一步反应。该生物传感器具有快速(在40分钟内)和等温分析的特点，不需要任何复杂的洗涤/分离步骤。特别是单分子检测的引入进一步提高了检测灵敏度，减少了样品的消耗。该生物传感器检测Fpg的检测限低至4.24×10-9单位每微升，能在单细胞灵敏度上准确测量细胞中的hOGG1。此外，该生物传感器可用于抑制剂的筛选、动力学参数的分析、正常细胞与癌细胞的区分，在分子诊断和即时检测方面具有潜在的应用价值。
其实验原理(如图1)：Fpg和hOGG1均为双功能DNA糖基化酶，兼有AP-裂解酶活性和N-端糖基化酶活性。N-端糖基化酶活性可以切割糖基和氧化嘌呤碱之间的N-糖苷键，从而产生一个脱嘌呤(AP)位点。Fpg的AP-裂解酶活性通过βδ消除切割DNA链上的AP位点，产生一个具有5'和3'磷酸末端的单核苷酸缺口，而hOGG1的AP-裂解酶活性通过β消除裂解DNA链上的AP位点，产生一个5'磷酸和一个3'磷酸-α，β-不饱和醛(3'dRP)。
人类细胞中8-oxoG:C碱基对8-oxoG的修复主要依赖于三个BER亚途径(图2)。hOGG1可以特异性识别和切除8-oxoG:C碱基对中的8-oxoG，产生一个带有5'磷酸端和3'磷酸-α，β-不饱和醛(3'dRP)端的单核苷酸缺口。随后，由hOGG1产生的3'dRP可被APE1有效去除，以产生修复合成所需的3'-羟基末端(途径I)。此外，β消除后产生的3'dRP可通过人Nei内切核酸酶Ⅷ样蛋白1(NEIL1)(途径II)导入PNK依赖的途径，从而绕过APE1。NEIL1可以去除8-oxoG以生成AP位点，然后催化AP位点的βδ消除，在链断裂处生成3'磷酸末端。βδ消除后产生的3'磷酸末端可被PNK有效去除以产生3'-OH末端(途径III)。与hOGG1相比，NEIL1从8-oxoG:C碱基对中切除8-oxoG的活性较差，即使在高水平上也是如此。然而，NEIL1可以通过竞争AP位点显著增强hOGG1的活性。因此，在本研究中，主要采用NEIL1/PNK依赖、APE1非依赖的BER途径II来定量检测细胞hOGG1。
具体的，本发明生物传感器由四部分探针组成，包括一个发夹探针、一个检测探针、一个信号探针和一个crRNA。发夹探针由5个结构域构成，包括1个检测探针的结合域，2个Nt.BbvCI切刻酶的识别域，2个Q-SDA反应模板域。发夹探针5'和3'端用C3 spacer间隔子(聚合酶延伸阻断基团)修饰，以避免非特异性扩增。在检测探针从5'端开始的第18nt上标记8-oxoG碱基。发夹底物是由检测探针与发夹探针杂交形成的。值得注意的是，与基于线性探针的检测方法(图3)相比，引入发夹探针可以有效地阻断激活剂与游离发夹探针的杂交(图1)，大大提高了检测灵敏度。在信号探针的5'和3'端分别标记猝灭基团(BHQ2)和荧光基团(Cy5)，由于它们之间的荧光共振能量转移(FRET)导致Cy5被BHQ2猝灭。本技术方案包括4个连续步骤:(1)8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶驱动的8-oxoG切除修复反应，(2)酶辅助的Q-SDA反应，(3)CRISPR/Cas12a催化的信号探针水解，(4)单分子检测。在8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(以Fpg为例)存在时，Fpg特异性识别发夹底物中受损的8-oxoG，并将其从8-oxoG:C对中切除，留下一个单核苷酸缺口。生成的3'-磷酸端可被PNK催化生成的3'-羟基(3'-OH)端。值得注意的是，使用PNK而不是APE1来检测Fpg，且只需要一步反应，因为在相同条件下，PNK的检测性能比APE1好得多(图4)。游离3'-OH末端的检测探针可作为引物，在dNTPs和Klenow大片段DNA聚合酶的辅助下启动聚合延伸反应，使得发夹探针展开形成稳定的双链DNA(dsDNA)，该双链DNA包含Nt.BbvCI切刻酶的两个识别位点。随后，Nt.BbvCI切刻酶对dsDNA的上面得DNA链进行切割，产生两个新的DNA聚合酶复制位点，在Nt.BbvCI酶和Klenow大片段DNA聚合酶的协助下，启动第一个链置换扩增(SDA)反应，产生丰富的激活剂和触发器(trigger)。合成得触发器可与新的游离发夹探针杂交启动二次循环聚合-切割-置换，从而产生大量的激活剂。生成的激活剂与crRNA结合可以激活Cas12a的反式切割活性，导致信号探针被切割，释放出大量的Cy5荧光分子，最后可通过单分子成像进行定量检测。相反，当Fpg不存在时，不能启动8-oxoG碱基切除修复反应，进而不能发生Q-SDA反应，最终导致没有激活剂生成。因此，CRISPR/Cas12a不能被激活，也没有观察到Cy5荧光信号。
因此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种基于CRISPR的荧光生物传感器，所述荧光生物传感器至少包括一个发夹探针、一个检测探针、一个信号探针和一个crRNA；
其中，所述发夹探针作为链置换扩增(SDA)模板，可以有效地阻止生成的激活剂(activator)与游离的发夹探针杂交；
具体的，所述发夹探针由5个结构域构成，包括1个检测探针的结合域，2个Nt.BbvCI切刻酶的识别域以及2个二次链置换扩增反应(Q-SDA)反应模板域。
进一步的，所述发夹探针末端(5'端和3'端)用C3 spacer间隔子(聚合酶延伸阻断基团)修饰，以避免非特异性扩增。
所述检测探针标记有DNA糖基化酶切除修复位点；更具体的，所述检测探针标记8-oxoG碱基；进一步优选的，所述检测探针从5'端开始的第18nt上标记8-oxoG碱基；
所述信号探针序列两末端修饰有荧光基团和猝灭基团，且其可以被激活的CRISPR/Cas12a效应子切割。
其中，所述荧光基团和猝灭基团并不做具体限定，在本发明的一个具体实施方式中，所述荧光基团可以为Cy5，所述猝灭基团可以为BHQ2。
所述crRNA为单链CRISPR RNA，其与Cas核酸酶和靶DNA结合。
所述荧光生物传感器还包括多核苷酸激酶(PNK)和脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)，优选为PNK；以及，Nt.BbvCI限制性内切酶、KF DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和Cas12a；
更具体的，所述荧光生物传感器还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液具体为：100微克每毫升牛血清蛋白，10毫摩尔每升氯化镁，10毫摩尔每升1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷-盐酸，pH 7.0。
本发明又一具体实施方式中，提供上述荧光生物传感器在检测DNA糖基化酶中的应用。
所述DNA糖基化酶包括但不限于人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)、甲酰嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)、烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(AAG)、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、胸腺嘧啶-DNA糖基化酶(TDG)等；优选的，所述DNA糖基化酶包括人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和甲酰嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)。
本发明又一具体实施方式中，提供一种检测DNA糖基化酶的方法，所述方法包括采用上述荧光生物传感器进行检测。
具体的，所述方法包括：将待测样品与上述荧光生物传感器进行孵育，然后终止反应。
其中，所述孵育条件为：在30～40℃(优选为37℃)孵育10-60分钟(优选为30分钟)，然后在60-70℃(优选为65℃)加热5-30分钟(优选为10分钟)终止反应。
本发明的又一具体实施方式中，所述方法包括：将待测样品、发夹底物、PNK或APE1、Nt.BbvCI切刻酶、KF DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、Cas12a、crRNA和信号探针置于反应缓冲液中孵育，终止反应后进行荧光检测分析。
其中，所述待测样品可以是生物样品，包括离体的血液、体液、组织或细胞，经试验证明，本发明生物传感器能够在单细胞水平灵敏检测细胞hOGG1。
所述发夹底物由检测探针与发夹探针复合获得。
所述DNA糖基化酶包括但不限于人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)、甲酰嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)、烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(AAG)、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、胸腺嘧啶-DNA糖基化酶(TDG)等；本发明的又一具体实施方式中，所述DNA糖基化酶包括人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和甲酰嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)。
本发明又一具体实施方式中，提供上述生物传感器和/或检测方法在DNA糖基化酶相关药物筛选和/或生物样品酶分析中的应用。
所述DNA糖基化酶相关药物包括但不限于DNA糖基化酶抑制剂和DNA糖基化酶激活剂；
所述生物样品包括离体的血液、体液、组织或细胞，经试验证明，本发明生物传感器能够在单细胞水平灵敏检测细胞hOGG1，因此在生物医学基础研究(如正常细胞与癌细胞的区分)及临床诊断(包括分子诊断和即时检测)等领域都具有极佳的应用潜力。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。下述实施例中，使用相关探针等核苷酸序列如下所示：
其中，检测探针中“O”代表8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)碱基。
实施例
实验方法
1.发夹底物的制备：2微摩尔每升检测探针与2微摩尔每升发夹探针在含有1.5毫摩尔每升的氯化镁和10毫摩尔每升的三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸盐(Tris-HCl)，pH 8.0的缓冲液中在95摄氏度下孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温得到发夹底物。
2.8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性检测：整个反应是在含有不同浓度的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶，10纳摩尔每升的发夹底物，2个单位的PNK，5个单位的Nt.BbvCI，0.5个单位的KF DNA聚合酶，200微摩尔每升的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，50纳摩尔每升的Cas12a、50纳摩尔每升的crRNA、1.5微摩尔每升的信号探针，1×的反应缓冲液(100微克每毫升牛血清蛋白，10毫摩尔每升氯化镁，10毫摩尔每升1,3-二[三(羟甲基)甲氨基]丙烷-盐酸，pH 7.0)的20微升反应混合物中37摄氏度下孵育30分钟，然后在65℃下加热10分钟终止反应。
3.稳态荧光测量和凝胶电泳：用FLS-1000荧光光谱仪在635纳米的激发波长下测量荧光光谱。在室温120伏的恒定电压下，用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在1×TBE缓冲液(9纳摩尔每升Tris-HCl，9毫摩尔每升硼酸，0.2毫摩尔每升乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 7.9)中对扩增反应的产物进行分析，以SYBR Gold为指示剂，电泳时间为65分钟。此后，用Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统(Hercules，California，U.S.A)进行拍摄分析。
4.单分子检测与数据分析：将反应产物在成像缓冲液(含1毫克每毫升的葡萄糖氧化酶、0.4％(质量体积比)的D-葡萄糖、0.04％毫克每毫升的过氧化氢酶、50微克每毫升的牛血清蛋白、67毫摩尔每升的甘氨酸-氢氧化钾、1毫克每毫升的水溶性维生素E、2.5毫克每毫升的氯化镁，pH 9.4)中稀释。使用移液枪吸取10微升上述样品直接滴到盖玻片上以用于全内反射荧光显微镜(TIRF)成像，使用640纳米的激光器激发Cy5荧光分子，Cy5的荧光信号由100×的奥林巴斯物镜进行收集，并由安道尔Ixon DU897 EMCCD以500毫秒的曝光时间成像，利用Image J软件选择600×600像素的图像区域对Cy5分子进行计数，并用10帧Cy5的总计数进行数据分析。
5.抑制分析：为了评估8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶抑制剂的作用效果，DNA糖基化酶抑制分析是通过将不同浓度的氯化铬与1×10-5单位每微升的Fpg在1×反应缓冲溶液中37℃孵育20分钟，后续过程同8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性检测。
6.细胞培养和细胞提取物的制备：将人肝细胞(HL-7702细胞)、人宫颈癌细胞(HeLa细胞)和人肺腺癌细胞(A549细胞)分别用含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素双抗的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)在37摄氏度、含5％二氧化碳培养箱中进行培养并用于实际样品分析。待细胞生长到对数生长期时，利用胰蛋白酶收集细胞，并使用Countstar生物技术有限公司的自动细胞计数器IC1000进行计数。使用核提取物试剂盒(Active Motif,Carlsbad,CA,USA)制备细胞提取物。
实验结果
1.原理的实验验证
反应产物用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析(图5)。检测到明显的与合成的激活剂/crRNA杂交体(图5A，泳道1)长度相同的激活剂/crRNA杂交体条带(图5A，第3道)，表明Fpg启动了Q-SDA反应。同时，可以观察明显的红色荧光条带(图5A，泳道1)，说明二次SDA反应生成的激活剂可以激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性，导致信号探针的切割和Cy5的荧光恢复。当Fpg缺失时，未检测到明显的条带(图5A，泳道2)，说明既不会发生Q-SDA反应，也不会发生CRISPR/Cas12a裂解信号探针反应。
随后进行了荧光测量(图5B)。当Fpg存在时，检测到一个明显增强的Cy5信号(图5B)，但当Fpg不存在时，没有明显的Cy5信号(图5B)，与没有Fpg和PNK的对照组荧光一致(图5B)。
与传统的荧光测定方法相比，单分子检测具有样品消耗量少、分析时间短、灵敏度高等显著优点。因此进一步采用全内反射荧光成像技术测定了单个Cy5的荧光信号。通过单分子成像检测8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性(图6)。当Fpg存在时，产生明显的Cy5荧光信号(图6A)，说明Fpg可以在PNK的协助下识别并去除受损的8-oxoG，并启动Q-SDA反应和CRISPR/Cas12a催化的裂解反应。相反，当Fpg不存在的情况下，观察到一个接近于零的背景信号(图6B)，说明既没有发生二次SDA反应，也没有发生CRISPR/Cas12a催化的裂解反应。这些结果清楚地表明，所提出的基于CRISPR的荧光生物传感器可以用于8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的定量检测。
2.PNK与APE1性能比较
比较了PNK和APE1的性能(图4)。当反应过程分为两个步骤(碱基切除修复反应+Q-SDA反应(步骤Ⅰ)、CRISPR/Cas12a催化裂解反应(步骤Ⅱ))时，PNK和APE1均表现出优异的分析性能，PNK组的信噪比(S/N)为38.5，APE1组为35.4。但是，当以“混合检测”方式快速检测Fpg时，PNK组的S/N高达37.0，而APE1组的S/N低至8.0。因此，本研究中使用PNK代替APE1。
3.发夹探针和线性探针性能比较
为了比较发夹探针(图1)和线性探针(图3)的性能，采用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析杂交反应产物。如图7A所示，加入合成激活剂后，发夹探针保持不变(图7A，泳道3)，而线性探针与激活剂杂交形成稳定的双链(图7A，泳道4)。这表明发夹结构可以有效地防止发夹探针与生成的激活剂杂交。在合成的激活剂和crRNA均存在的情况下，发夹探针仍保持不变且伴随着激活剂/crRNA杂交条带的出现(图7A，通道5)，而线性探针与激活剂杂交且crRNA保持不变(图7A，通道6)。这表明crRNA的加入并不能阻止激活剂与线性探针的杂交。
在靶标浓度相同的情况下，发夹探针(图7B)产生的Cy5信号远高于线性探针(图7B)。在靶蛋白Fpg浓度较低(1×10-6单位每微升)时，线性探针产生的Cy5信号与对照组无差异，说明无法检测到靶蛋白。然而，发夹探针产生的Cy5信号明显高于对照组，说明发夹探针仍然可以有效检测靶标。这些结果表明，发夹探针可以有效地阻止生成的激活剂与发夹探针杂交，大大提高了检测灵敏度。
4.灵敏度实验
在优化的实验条件下，测量了不同浓度8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶对应的Cy5单分子点数来评估本技术方案的分析灵敏度，研究了在最佳条件下Fpg浓度对Cy5点数的影响(图8和9)。如图6C，随着8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶浓度从0增加到0.01单位每微升，Cy5的单分子计数逐渐增加。Cy5的单分子计数在1×10-8到5×10-5单位每微升的浓度范围内与8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶浓度的对数呈现线性相关，线性相关系数(R2)为0.9980。线性回归方程为N＝1831.77+206.95lgC，其中N为Cy5的单分子计数，C为8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的浓度(单位每微升)。高灵敏度可归因于以下因素:(1)Fpg催化的8-oxoG切除修复导致的二次SDA反应扩增效率高；(3)激活剂/crRNA/Cas12a复合物驱动信号探针的循环裂解诱导信号放大；(4)单分子成像的高灵敏度。
5.特异性实验
此前报道的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性分析方法由于易受无关生物分子的干扰产生假阳性结果，因此其特异性往往比较受限。为了检验本技术方案的特异性分析效果，测量了Cy5信号对人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)、免疫球蛋白G(IgG)、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和牛血清白蛋白(BSA)等不同生物干扰物的响应。理论上，这些酶和蛋白均不能诱导检测探针的碱基切除修复，因此检测不到Cy5的荧光信号。如图10所示，只有Fpg能产生高Cy5信号(图10)。相反，BSA(图10)、IgG(图10)、UDG(图10)和hAAG(图10)均不能产生明显的Cy5信号。此外，在干扰物中加入Fpg可产生高水平的Cy5信号(图10)，与0.01单位每微升的Fpg产生的Cy5信号(图10)相同，进一步证实了该生物传感器的良好选择性。因此本技术方案具有高度的特异性，这可以归因于CRISPR生物传感器的使用对8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性信号的特异性识别和转换。
6.抑制剂实验
8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的抑制剂是一种潜在的疾病治疗药物，可以用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病以及不同类型的癌症(如乳腺癌、肺癌、口喉癌、结肠癌、胃癌)。使用一种典型的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶抑制剂氯化铬(CdCl2)来测试本技术方案用于8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性抑制分析的能力。CdCl2通过Cd2+与DNA糖基化酶-底物结合抑制DNA底物裂解，并通过Cd2+与DNA糖基化酶活性位点直接结合灭活催化活性。如图11A所示，随着CdCl2浓度的增加，8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的相对活性逐渐下降。经计算，半抑制浓度IC50为33.3纳摩尔每升，这表明本技术方案可用于8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶抑制剂的筛选，且具有较高的选择性。在药物开发和疾病治疗方面均表现出巨大的潜力。
7.动力学实验
Fpg的动力学参数是通过测量在37℃下不同浓度的DNA底物反应5分钟的初始速度得到的。初始速度随DNA底物浓度的增加而增加(图11B)。根据米氏方程(2)可计算出最大初速度Vmax和米氏常数Km等动力学参数。
V＝Vmax[S]/(Km+[S]) (2)
其中[S]为DNA底物浓度，V为初始速度。实测的Km和Vmax分别为8.91纳摩尔每升和181.66每秒。值得注意的是，得到的Km值与凝胶电泳(Km＝8.9纳摩尔每升)测量值一致。
8.细胞hOGG1的检测
大肠杆菌Fpg是hOGG1的功能同系物，二者均有从8-oxoG:C碱基对中去除8-oxoG的能力。，hOGG1是在人体中负责从8-oxoG:C碱基对中修复8-oxoG的一种DNA糖基化酶。为了证明本技术方案的通用性，使用该荧光生物传感器检测人肺腺癌细胞系(A549细胞)中的细胞hOGG1活性。当用全细胞提取物(图12A)或细胞核提取物(图12A)代替Fpg添加到体系中时，均检测到高荧光信号，但没有观察到明显的荧光信号响应于细胞质提取物(图12A)，表明hOGG1主要位于细胞核中，与先前研究结果一致。此外，Cy5计数随着A549细胞数的增加而增加(图12B)，并且Cy5计数(N)与A549细胞数(X)的对数在1-100个细胞范围内呈良好的线性关系(图12C)，相应方程为N＝347.69lg X+301.58(R2＝0.9911)。值得注意的是，可以直接测量1个细胞中的hOGG1活性，表明该生物传感器能够在单细胞水平灵敏检测细胞hOGG1。
进一步测定了人宫颈癌细胞系(HeLa细胞)、人肝细胞系(HL-7702细胞)和A549细胞(图12D)中的hOGG1活性。A549细胞(图12D)和HeLa细胞(图12D)的细胞核提取物均产生明显增强的的Cy5计数，这与癌细胞中的高糖化酶活性一致。相反，HL-7702细胞(图12D)提取物则产生较低的Cy5计数，表明正常细胞中hOGG1活性较低。值得注意的是，将热处理的(图12D)或与CdCl2(图12D)孵育后的A549细胞提取物添加到体系中，均检测到较低的Cy5计数，这可能是因为糖基酶活性的丧失导致的。
由上述实施例可知，与现有技术相比，本申请技术方案具有：
1.操作简单：相比其他的信号扩增策略(如外切酶III辅助的等温扩增技术、环介导等温扩增技术(LAMP)和滚环扩增技术(RCA))用于8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶的检测，本技术方案探针操作简单，可以进行一步等温反应且反应时间非常短，40分钟即可完成信号放大，大大简化了分析过程；此外，由于C3 spacer间隔子修饰的使用，避免了非特异性扩增导致的假阳性信号，因此本技术方案的检测准确性也得到了保证。
2.效率高，效果好：本技术方案中的(Q-SDA)扩增反应在40分钟即可达到很好的扩增效果且用PNK代替AE1只需要一步反应，单分子检测方法的引入也大大降低了数据处理难度，提高了数据呈现的直观性和数据处理效率，且本实验的信噪比可达到38.5，实现了对8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的高效简单测定。
3.灵敏度高，应用潜力巨大：本技术方案中，由于8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶诱导发生的扩增反应所产生的有效信号放大和单分子检测本身所固有的高灵敏度，使得Fpg检测限低至4.24×10-9单位每微升，优于多数现有的8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性检测方法；此外，本技术方案可用于筛选8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶相关抑制剂，分析动力学参数，成分复杂的实际样品(癌细胞)内8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性的灵敏测定(可直接定量1个细胞内hOGG1的活性)以及区分癌细胞和正常细胞，应用范围广泛，研究潜力较大。
4.特异性好：由于本技术方案所使用的基于CRISPR的生物传感器对8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶活性信号的特异性识别和转换，使得本技术方案具有较高的检测特异性；此外，我们对本技术方案中的各项反应条件也做了细致的优化，因此检测特异性较为出色。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种基于CRISPR的荧光生物传感器及其在DNA糖基化酶检测中的应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gttaccctta ccctaggctg aggatcaccg tactagggta agggtaacta cgctgaggat 60
aagtaccaac caccacccag tcc 83
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggactgggtg gtggttgota cttatctttt tttt 34
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcagcctagg gtaagggtaa c 21
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gttaccctta ccctaggctg aggatgaccg aaaccgtaac tacgctgagg ataagtacca 60
accaccaccc agtcc 75
<210> 5
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
uaauuucuac uaaguguaga uacccuuacc cuaggcuga 39
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaccgcttcc ccgacttcc 19

Claims (11)

1.一种基于CRISPR的荧光生物传感器，其特征在于，所述荧光生物传感器至少包括一个发夹探针、一个检测探针、一个信号探针和一个crRNA；
核苷酸序列 (5'−3') 发夹探针 C3 Spacer-GTT ACC CTT ACC CTA GGC TGA GGA TCA CCG TAC TAG GGT AAG GGT AAC TAC GCT GAG GAT AAG TAC CAA CCA CCA CCC AGT CC-C3Spacer（SEQ ID NO.1） 检测探针 GGA CTG GGT GGT GGT TAC TTA TCT TTT TTT T（SEQ ID NO.2） 激活剂 TCA GCC TAG GGT AAG GGT AAC（SEQ ID NO.3） 线性探针 C3 Spacer-GTT ACC CTT ACC CTA GGC TGA GGA TGA CCG AAA CCG TAA CTA CGC TGA GGA TAA GTA CCA ACC ACC ACC CAG TCC- C3 Spacer（SEQID NO.4） crRNA UAA UUU CUA CUA AGU GUA GAU ACC CUU ACC CUA GGC UGA（SEQ ID NO.5） 信号探针 Cy5-AAC CGC TTC CCC GAC TTC C-BHQ2（SEQ ID NO.6）
所述荧光生物传感器还包括多核苷酸激酶；
以及，Nt.BbvCI限制性内切酶、KF DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和Cas12a。
2.如权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述荧光生物传感器还包括反应缓冲液。
3.权利要求1-2任一项所述荧光生物传感器在检测DNA糖基化酶中的应用。
4.一种非诊断和治疗目的的检测DNA糖基化酶的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1-2任一项所述荧光生物传感器进行检测。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将待测样品与权利要求1-2任一项所述荧光生物传感器进行孵育，然后终止反应。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述孵育条件为：在30~40℃孵育10-60分钟，然后在60-70℃加热5-30分钟终止反应。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述孵育条件为：在37℃孵育30分钟，然后在65℃加热10分钟终止反应。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将待测样品、发夹底物、PNK或APE1、Nt.BbvCI切刻酶、KF DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、Cas12a、crRNA和信号探针置于反应缓冲液中孵育，终止反应后进行荧光检测分析。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样品为生物样品，包括离体的血液、体液、组织和细胞；
所述发夹底物由检测探针与发夹探针复合获得；
所述DNA糖基化酶包括人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶、甲酰嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶、烷基腺嘌呤DNA糖基化酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶、胸腺嘧啶-DNA糖基化酶。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述DNA糖基化酶包括人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶和甲酰嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶。
11.权利要求1-2任一项所述生物传感器和/或权利要求4-9任一项所述非诊断和治疗目的的检测方法在DNA糖基化酶相关药物筛选和/或生物样品酶分析中的应用；
所述DNA糖基化酶相关药物包括DNA糖基化酶抑制剂和DNA糖基化酶激活剂；
所述生物样品包括离体的血液、体液、组织和细胞。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111154839A (zh) * 2020-01-20 2020-05-15 山东师范大学 一种同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器、其检测方法及应用
CN112725416A (zh) * 2021-01-20 2021-04-30 山东师范大学 一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器及其检测方法和应用
CN113088557A (zh) * 2021-03-29 2021-07-09 山东师范大学 一种同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器及其检测方法和应用

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