CN113640268A - 一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统及检测方法 - Google Patents

一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a的妥布霉素检测系统，其包括：适配体探针AP、CrRNA、AsCas12a蛋白、KF聚合酶和两端分别修饰了荧光基团和淬灭基团的报告探针；适配体探针AP的序列如SEQ ID NO：1所示；CrRNA的序列如SEQ ID NO：2所示。与现有技术相比，该检测系统中的适配体探针可以与妥布霉素进行特异性结合并改变构型，在KF聚合酶的作用下产生可被CRISPR‑Cas12a系统的识别的触发DNA，最后在CRISPR‑Cas12a系统切割荧光探针以产生荧光信号，通过蓝光照射及荧光强度分析，可实现对妥布霉素可视化及定量检测，并且检测灵敏度高。

Description

一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统及检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统及检测方法。
背景技术
CRISPR-Cas系统是一类存在于细菌以及古细菌中的适应性免疫系统。近年来CRISPR-Cas系统被广泛研究，成为一种能够对靶基因进行高效切割的分子生物学工具。除了基因组编辑，CRISPR-Cas系统还被应用于生物检测。例如，SHERLOCK(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)和DETECTR(DNA endonuclease-targetedCRISPR trans reporter)生物传感器实现了利用CRISPR-Cas系统对于核酸类靶标进行检测，进而应用于由寨卡病毒、新冠病毒等引起的传染疾病检疫工作。与Cas9蛋白不同，Cas12a可与单链引导CRISPR RNA(crRNA)结合形成复合体(CRISPR-Cas12a)，当靶序列存在时切割报告探针。CRISPR-Cas12a系统对具有极高的检测灵敏度及优良的选择特异性，目前已被用于多种非核酸类物质的检测，如肿瘤标记物甲胎蛋白、小分子化合物ATP、可卡因等。
妥布霉素(Tobramycin)是一种广谱的氨基糖苷类抗生素，主要用于治疗人和动物的细菌感染。大量研究表明，妥布霉素的滥用会对人类的生命健康造成不可逆的副作用，包括肾毒性、神经肌肉阻滞和过敏反应等。由于妥布霉素的价格较低，目前为止妥布霉素仍然被广泛用于畜牧业，导致其在湖水，牛奶，鸡蛋和肉类中潜在的残留，通过食物链和食物网进入人体内，损害生命健康。目前检测抗生素的常规方法主要有气相色谱(GC)，高效液相色谱(HPLC)，液相色谱-质谱(LC-MS)，毛细管电泳和酶联免疫吸附测定(ELISA)等。由于氨基糖苷类抗生素缺乏紫外发色团或荧光基团，因此对于妥布霉素的检测仍然存在很大的挑战。此外，传统检测方法往往需要昂贵的分析仪器，复杂的样品制备和测试过程，较长的操作时间，有时还具有较高的假阳性率等缺陷。因此，创建一种快速、高效的检测妥布霉素的方法，具有非常重要的意义。
核酸适配体是指利用SELEX技术从短链核苷酸文库中筛选出能与相应靶标物特异性结合的一段短链DNA或RNA。目前为止，已有多种针对抗生素的适配体被报道，包括卡那霉素，链霉素，四环素，氯霉素，氧氟沙星和妥布霉素。核酸适配体一旦与靶标物特异性结合后，其自身结构会发生一定改变，利用这一特性，研究者将核酸适配体开发成新型探针用于多种抗生素的识别和检测。为了实现高灵敏度检测，多种信号方法技术被应用于核酸适配体传感器的构建，如如滚环扩增(RCA)，链置换扩增(SDA)和杂交链反应扩增(HCR)等。本发明利用适配体探针特异性结合妥布霉素，释放触发DNA，进而激活CRISPR-Cas12a荧光探针切割活性，实现了对于妥布霉素的超微量、可视化检测。
发明内容
本发明的目的在于解决上述背景技术的不足，提供一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统及检测方法，通过蓝光照射及荧光强度分析，可实现对妥布霉素可视化及定量检测，并且检测灵敏度高。
技术方案
一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统，包括：适配体探针AP、crRNA、AsCas12a蛋白、KF聚合酶和两端分别修饰了荧光基团和淬灭基团的报告探针；
所述适配体探针AP的序列为：5’-ATC ATT TGG AGG AAC TGG AGT CAC AAG CTGAGG ATG TGA CTC CAG GCA CTT AGT CAC A-3’(SEQ ID NO：1)；
所述crRNA的序列为：5’-UAA UUU CUA CUC UUG UAG AUG CUU GUG ACU CCA GUUCCU C-3’(SEQ ID NO：2)；
所述报告探针的序列为：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’。
本发明的检测原理：
本发明所设计的适配体探针AP包含两个功能区域:一个是妥布霉素的适配体序列，另一个为用于KF聚合酶结合并延伸，进行信号放大的信号转导序列，这两个区域被设计成部分杂交，可以形成一个茎环结构，因此该适配体可以自锁为一个发夹结构，可以在没有妥布霉素存在的情况下保持稳定。加入妥布霉素后，适配体序列可以识别妥布霉素并且与之结合，从而导致适配体探针的构象发生变化，释放出信号转导序列，然后KF聚合酶与之结合并延伸，产生可被CRISPR-Cas12a系统的识别的触发DNA(触发DNA序列为：5’-ATC ATTTGG AGG AAC TGG AGT CAC AAG CTG AGG ATG TGA CTC CAG GCA CTT AGT CAC A TC CTCAGC TTG TGA CTC CAG TTC CTC CAA ATG AT-3’)；当环境中不存在触发DNA时，Cas12a蛋白-crRNA复合体保持稳定，不具有切割活性；当环境中存在触发DNA时，Cas12a蛋白-crRNA复合体会识别该触发DNA，同时激活复合体的非特异性的单链DNA切割活性，降解周围的报告探针，释放出荧光基团，从而释放出荧光信号。最后使用蓝光发射器照射样品进行观测实现可视化检测或者使用荧光分光光度计进行荧光强度的测试。
采用上述检测系统检测妥布霉素的方法，包括如下步骤：
(1)取1μL适配体探针AP与124μL 1x Buffer A在95℃金属浴中孵育3-5min，缓慢冷却至室温，得到退火后的溶液；
(2)取1.25μL退火后的溶液，加入3μL不同浓度的妥布霉素标准溶液或待测溶液，使用1x Buffer A补齐到终体积20μL，在室温下孵育1h后，加入0.1U-0.6U的KF聚合酶、1μLdNTP和8.5μL 1x Buffer A至终体积30μL，在37℃金属浴中孵育1-2h，然后在65℃下灭活10min，得到反应液；
(3)往离心管中加入1U AsCas12a蛋白、10μL crRNA、4μL 10x buffer B和25μL水，混合后在室温下静置孵育30min，然后加入1μL步骤(2)制得的反应液、6μL报告探针、6μL10x buffer B，加水补齐到总体积100μL，在室温下静置反应30min后，在65℃灭活10min，最后利用荧光分光光度计测量荧光信号；
(4)根据不同浓度的妥布霉素标准溶液作妥布霉素浓度-荧光强度的标准曲线，计算回归方程，再根据待测溶液的荧光强度，计算待测溶液中妥布霉素的浓度。
步骤(1)和(2)中，所述1x Buffer A的配方为：50mM醋酸钾，20mM Tris-乙酸，10mM醋酸镁；100μg/mL牛血清白蛋白，pH 7.9。
步骤(2)中，所述10x buffer B的配方为：400mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，1M氯化钠，200mM氯化镁，pH＝7.4。
进一步，步骤(2)中，KF聚合酶的加入量为0.5U。
进一步，步骤(3)中，利用荧光分光光度计测量荧光信号时，设置激发波长为480nm，扫描范围为500-600nm。
本发明的有益效果：本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统，该检测系统中的适配体探针可以与妥布霉素进行特异性结合并改变构型，在KF聚合酶的作用下产生可被CRISPR-Cas12a系统的识别的触发DNA，最后在CRISPR-Cas12a系统切割荧光探针以产生荧光信号，通过蓝光照射及荧光强度分析，可实现对妥布霉素可视化及定量检测，并且检测灵敏度高。
附图说明
图1为本发明的检测系统检测妥布霉素的原理图；
图2为crRNA的浓度对CRISPR-Cas12a系统的影响的测试结果；
图3为以触发链为靶标时CRISPR-Cas12a系统产生的荧光强度曲线；
图4为以触发链为靶标时的荧光强度和靶标浓度的相关性曲线和线性关系曲线；
图5为本发明所设计的妥布霉素检测系统的可行性验证结果；
图6为不同KF聚合酶浓度下的荧光强度的相关性曲线；
图7为以妥布霉素为靶标时的荧光图谱；
图8为以妥布霉素为靶标时的荧光强度和靶标浓度的相关性曲线和线性关系曲线；
图9为使用蓝光发射器照射反应后样品的照片；
图10为本发明的检测系统检测妥布霉素的特异性分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作详细说明。
实施例1
一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统，包括：适配体探针AP、CrRNA、AsCas12a、KF聚合酶和两端分别修饰了荧光基团和淬灭基团的报告探针；
所述适配体探针AP的序列为：5’-ATC ATT TGG AGG AAC TGG AGT CAC AAG CTGAGG ATG TGA CTC CAG GCA CTT AGT CAC A-3’(SEQ ID NO：1)；
所述CrRNA的序列为：5’-UAA UUU CUA CUC UUG UAG AUG CUU GUG ACU CCA GUUCCU C-3’(SEQ ID NO：2)；
所述报告探针的序列为：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’。
本发明妥布霉素检测系统的检测原理图见图1。本发明所设计的适配体探针AP包含两个功能区域:一个是妥布霉素的适配体序列，另一个为用于KF聚合酶结合并延伸，进行信号放大的信号转导序列，这两个区域被设计成部分杂交，可以形成一个茎环结构，因此该适配体可以自锁为一个发夹结构，可以在没有妥布霉素存在的情况下保持稳定。加入妥布霉素后，适配体序列可以识别妥布霉素并且与之结合，从而导致适配体探针的构象发生变化，释放出信号转导序列，然后KF聚合酶与之结合并延伸，产生可被CRISPR-Cas12a系统的识别的触发DNA；当环境中不存在触发DNA时，AsCas12a蛋白-crRNA复合体保持稳定，不具有切割活性；当环境中存在触发DNA时，AsCas12a蛋白-crRNA复合体会识别该触发DNA，同时激活复合体的非特异性的单链DNA切割活性，降解周围的报告探针，释放出荧光基团，从而释放出荧光信号。最后使用蓝光发射器照射样品进行观测实现可视化检测或者使用荧光分光光度计进行荧光强度的测试。本发明中涉及的寡核苷酸序列见表1：
表1寡核苷酸序列
Figure BDA0003237303770000051
注：下划线部分为CRISPR-Cas12a系统识别区域，斜体部分为核酸适配体区域。
采用上述检测系统检测妥布霉素的方法，包括如下步骤：
(1)取1μL(100μM)适配体探针AP与124μL 1x Buffer A(50mM醋酸钾，20mM Tris-乙酸，10mM醋酸镁；100μg/mL牛血清白蛋白，pH 7.9)在95℃金属浴中孵育3-5min，缓慢冷却至室温，使得适配体探针中互补的区域能够充分通过碱基互补作用形成稳定的发夹结构产物，得到退火后的溶液；
(2)取1.25μL退火后的溶液，加入3μL不同浓度的妥布霉素标准溶液或待测溶液，使用1x Buffer A补齐到终体积20μL，在室温下孵育1h后，使得适配体探针的发夹结构在妥布霉素发生构型的转变，形成适配体发夹-妥布霉素复合体，加入0.5U的KF聚合酶(1U定义为在37℃下，30min内将10nmol dNTP结合到DNA上的酶量)、1μL dNTP(10mM)和8.5μL 1xBuffer A至终体积30μL，在37℃金属浴中孵育1-2h，使得适配体发夹-妥布霉素复合体在KF聚合酶的作用下进行延伸，产生用于CRISPR-Cas12a系统识别的DNA触发链，最后在65℃下灭活10min，得到反应液；
(3)往离心管中加入1U AsCas12a蛋白(1U定义为在25℃，30min内将60pmol的5nt的单链DNA降解的酶量)、10μL(200nM)crRNA、4μL 10x buffer B(400mM HEPES，1M NaCl，200mM MgCl，pH＝7.4)和25μL水，混合后在室温下静置孵育30min，然后加入1μL步骤(2)制得的反应液、6μL报告探针、6μL 10x buffer B，加水补齐到总体积100μL，在室温下静置反应30min后，在65℃灭活10min，最后利用荧光分光光度计测量荧光信号；激发波长为480nm，扫描范围为500-600nm。整个反应过程均要注意避光。
(4)根据不同浓度的妥布霉素标准溶液作妥布霉素浓度-荧光强度的标准曲线，计算回归方程，再根据待测溶液的荧光强度，计算待测溶液中妥布霉素的浓度。
实施例2
本发明采用CRISPR-Cas12a系统作为信号输出元件，crRNA的浓度直接导致了CRISPR-Cas12a系统识别触发链的灵敏度。为了探究CRISPR-Cas12a系统最佳的crRNA浓度，设计了不同浓度的crRNA(0nM,5nM,10nM,15nM,20nM,25nM,30nM,50nM,80nM,100nM,200nM)，恒定双链触发链(ds-Activator)浓度为1nM。结果如图2所示，荧光强度在crRNA浓度为20nM时达到最高，大于20nM时荧光强度将会下降，所以本发明中采用20nM的crRNA浓度进行分析，以保证较高的检测效率。
实施例3
CRISPR-Cas12a系统对不同浓度触发链的响应情况：为了验证CRISPR-Cas12a系统的特性，设计了不同浓度的触发链(ds-Activator)，来探究CRISPR-Cas12a系统对触发链的浓度响应范围和最低响应的浓度。如图3为不同浓度触发链下，CRISPR-Cas12a系统产生的荧光强度曲线。可以看到，在激发波长为480nm时，520nm处有发射峰，根据520nm处的荧光强度，可以画出该触发链浓度范围内测量的荧光强度与触发链浓度之间的相关性，结果如图4所示。图4的插图显示其荧光强度和触发链浓度在0至1.3nM的范围内呈线性关系。线性方程为Abs＝4.554x–20.501。线性回归方程的相关系数(R2)为0.9987。
实施例4
图5为本发明所设计的妥布霉素检测系统的的可行性验证结果：图中，-代表加入妥布霉素，适配体探针(AP)，AsCas12a和报告探针(FQ-reporter)；---·线代表妥布霉素，crRNA，AsCas12a和FQ-reporter；……线代表加入AP，crRNA，AsCas12a和FQ-reporter；-·-·-线代表加入妥布霉素，AP，crRNA，AsCas12a和FQ-reporter。实验结果表明，仅在妥布霉素、适配体探针，AsCas12a和报告探针同时存在时，能够检测到强烈的荧光信号，这与检测原理相一致。
实施例5
KF聚合酶浓度优化：为了研究KF聚合酶的浓度对检测结果的影响，固定了妥布霉素浓度为1nM，设置了不同的KF聚合酶的加入量，分别为0.1U，0.2U，0.3U，0.4U，0.5U，0.6U，来探究最适的KF聚合酶浓度。结果如图6所示，当KF聚合酶浓度逐渐增加到0.5U时，荧光强度达到最高；当聚合酶量浓度高于0.5U时，荧光强度开始下降。这说明当KF聚合酶浓度在0.5U时，反应效率达到最大，所以本发明中采用0.5U的KF聚合酶进行分析，以保证较高的检测效率。
实施例6
验证设计的检测系统用于妥布霉素检测的效果：如图7所示，在实验条件下测量了不同浓度的妥布霉素溶液，分别为0pM，10pM，50pM，100pM，150pM，200pM，300pM，500pM，1000pM。在没有妥布霉素存在下，探针不能改变构象，KF聚合酶无法结合开启延伸，无法产生CRISPR-Cas12a系统的触发链，所以几乎没有产生荧光。随着妥布霉素浓度的增加，导致改变构象的探针越来越多，产生的触发链也就越来越多，所以整个系统的荧光强度越来越高。在0到1000pM范围内测量其吸光度值与妥布霉素浓度之间的相关性，结果如图8所示。图8的插图显示荧光强度和妥布霉素浓度在0至1000pM的范围内呈线性关系。线性方程为Abs＝15.989x+541.509。线性回归方程的相关系数(R2)为0.983。检测限(LOD)估计为3.719pM(信噪比为3)，根据上述结果，本发明所设计的妥布霉素检测系统性能要优于之前所报道的，对比结果见表2：
表2与现有的妥布霉素检测系统的测试对比
Figure BDA0003237303770000081
表1中，涉及的参考文献如下：
[1]Liu X,Jiang Y,Luo J,et al.A SnO2/Bi2S3-Based PhotoelectrochemicalAptasensor for Sensitive Detection of Tobramycin in Milk[J].Food Chemistry,2021,344(June 2020):128716.
[2]Han X,Zhang Y,Nie J,et al.Gold Nanoparticle Based PhotometricDetermination of Tobramycin by Using New Specific DNA Aptamers[J].Microchimica Acta,2018,185(1).
[3]Ou Y,Jin X,Fang J,et al.Multi-Cycle Signal-Amplified ColorimetricDetection of Tobramycin Based on Dual-Strand Displacement and Three-Way DNAJunction[J].Microchemical Journal,2020,156(March):104823.
[4]Nie J,Yuan L,Jin K,et al.Electrochemical Detection of TobramycinBased on Enzymes-Assisted Dual Signal Amplification by Using a NovelTruncated Aptamer with High Affinity[J].Biosensors and Bioelectronics,2018,122(July):254–262.
[5]Khajavian Z,Esmaelpourfarkhani M,Ramezani M,et al.A HighlySensitive,Simple and Label-Free Fluorescent Aptasensor for Tobramycin SensingBased on PicoGreen Intercalation into DNA Duplex Regions of Three-WayJunction Origami[J].Microchemical Journal,2021,160(PA):105657.
[6]Ma Q,Wang Y,Jia J,et al.Colorimetric Aptasensors for Determinationof Tobramycin in Milk and Chicken Eggs Based on DNA and Gold Nanoparticles[J].Food Chemistry,2018,249(January 2017):98–103.
[7]Yan S,Lai X,Wang Y,et al.Label Free Aptasensor for UltrasensitiveDetection of Tobramycin Residue in Pasteurized Cow’s Milk Based on ResonanceScattering Spectra and Nanogold Catalytic Amplification[J].Food Chemistry,2019,295(May):36–41.
[8]Jiang L,Wei D,Zeng K,et al.An Enhanced Direct CompetitiveImmunoassay for the Detection of Kanamycin and Tobramycin in Milk UsingMultienzyme-Particle Amplification[J].Food Analytical Methods,2018,11(8):2066–2075.
[9]Jin X,Chen L,Zhang Y,et al.A Lateral Flow Strip for On-SiteDetection of Tobramycin Based on Dual-Functional Platinum-Decorated GoldNanoparticles[J].Analyst,2021,146(11):3608–3616.
图9为使用蓝光发射器照射反应后的样品，从左到右妥布霉素浓度为0pM，10pM，50pM，100pM，150pM，200pM，300pM，500pM，1000pM，从图上可以看到明显的荧光强度随妥布霉素浓度增加而变强，所以本发明也可在反应完成后使用蓝光发射器照射样品实现可视化检测。
实施例7
特异性测试：为了验证其他的抗生素是否会对妥布霉素的检测造成影响，在最佳条件下，选择了妥布霉素、卡那霉素、四环素、链霉素、新霉素、氨苄青霉素、庆大霉素这七种抗生素，应用本发明中所设计的传感器同时进行检测，通过测试结果来比较验证传感器的特异性。在实验中，妥布霉素以及其他对照样品的浓度均为1nM。通过荧光分光光度仪在520nm波长处测量荧光信号强度。并将检测后的每种抗生素之间的F520的差值进行比较，以评估本研究中所设计的荧光生物传感器的特异性。
结果如图10所示，所有抗生素浓度均为1nM，所有抗生素的荧光强度都远低于检测妥布霉素时的荧光强度。因此，本发明所设计的传感器对妥布霉素具有优良的特异性。
实施例8
实际样品测试：以湖水(湖水取自南京玄武湖水样)和牛奶(卫岗纯牛奶)为实际样本，选取1mL实际样品，用1％(v/v)三氯乙酸将其pH值调至4.6后，用高速离心机12000r/min离心15min后，再用0.2μm的过滤膜过滤，并重复上述实验两次，所获得滤液放置在-4℃备用。将制得的湖水和牛奶样品用超纯水稀释100倍后，加入不同浓度的妥布霉素溶液标准品，最后取3μL样品溶液(70pM、140pM、210pM)，通过本发明实施例1的检测系统和检测方法进行实际检测。
实验结果显示表3：
实际样品测试：以湖水(湖水取自南京玄武湖水样)和牛奶(卫岗纯牛奶)为实际样本，选取1mL实际样品，用1％(v/v)三氯乙酸将其pH值调至4.6后，用高速离心机12000r/min离心15min后，再用0.2μm的过滤膜过滤，并重复上述实验两次，所获得滤液放置在-4℃备用。将制得的湖水和牛奶样品用超纯水稀释100倍后，加入不同浓度的妥布霉素溶液标准品，最后取3μL样品溶液(70pM、140pM、210pM)，通过本发明实施例1的检测系统和检测方法进行实际检测。
实验结果显示表3：
表3牛奶和湖水样品测试
Figure BDA0003237303770000101
Figure BDA0003237303770000111
由表3可以看出，样品牛奶的平均回收率为92.4％～106.7％；样品湖水的平均回收率为99.5％～105.8％。实验结果表明，不管是在牛奶样品，还是湖水样品中，通过本次所设计的生物传感器，对实际样品的加标回收率的误差均在10％以内，表明此方法能够有效的适用于实际样品的准确检测。
序列表：
SEQ ID NO：1
适配体探针AP的序列
atcatttggaggaactggagtcacaagctgaggatgtgactccaggcacttagtcaca
SEQ ID NO：2
crRNA的序列
uaauuucuacucuuguagaugcuugugacuccaguuccuc
序列表
<110> 南京林业大学
<120> 一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统及检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 妥布霉素(Tobramycin)
<400> 1
atcatttgga ggaactggag tcacaagctg aggatgtgac tccaggcact tagtcaca 58
<210> 2
<211> 40
<212> RNA
<213> 妥布霉素(Tobramycin)
<400> 2
uaauuucuac ucuuguagau gcuugugacu ccaguuccuc 40

Claims (4)

1.一种基于CRISPR-Cas12a的妥布霉素检测系统，其特征在于，包括：适配体探针AP、crRNA、AsCas12a蛋白、KF聚合酶和两端分别修饰了荧光基团和淬灭基团的报告探针；
所述适配体探针AP的序列如SEQ ID NO：1所示；所述crRNA的序列如SEQ ID NO：2所示；所述报告探针的序列为：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’。
2.采用权利要求1所述检测系统检测妥布霉素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取1μL适配体探针AP与124μL 1x Buffer A在95℃金属浴中孵育3-5min，缓慢冷却至室温，得到退火后的溶液；
(2)取1.25μL退火后的溶液，加入3μL不同浓度的妥布霉素标准溶液或待测溶液，使用1x Buffer A补齐到终体积20μL，在室温下孵育1h后，加入0.1U-0.6U的KF聚合酶、1μL dNTP和8.5μL 1x Buffer A至终体积30μL，在37℃金属浴中孵育1-2h，然后在65℃下灭活10min，得到反应液；
(3)往离心管中加入1U AsCas12a蛋白、10μL crRNA、4μL 10x buffer B和25μL水，混合后在室温下静置孵育30min，然后加入1μL步骤(2)制得的反应液、6μL报告探针、6μL 10xbuffer B，加水补齐到总体积100μL，在室温下静置反应30min后，在65℃灭活10min，最后利用荧光分光光度计测量荧光信号；
(4)根据不同浓度的妥布霉素标准溶液作妥布霉素浓度-荧光强度的标准曲线，计算回归方程，再根据待测溶液的荧光强度，计算待测溶液中妥布霉素的浓度；
步骤(1)和(2)中，所述1x Buffer A的配方为：50mM醋酸钾，20mM Tris-乙酸，10mM醋酸镁；100μg/mL牛血清白蛋白，pH 7.9；
步骤(2)中，所述10x buffer B的配方为：400mM HEPES，1M氯化钠，200mM氯化镁，pH＝7.4。
3.如权利要求2所述检测妥布霉素的方法，其特征在于，步骤(2)中，KF聚合酶的加入量为0.5U。
4.如权利要求2或3所述检测妥布霉素的方法，其特征在于，步骤(3)中，利用荧光分光光度计测量荧光信号时，设置激发波长为480nm，扫描范围为500-600nm。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114113264A (zh) * 2021-12-11 2022-03-01 郑州大学 基于exoⅲ辅助链循环和cha反应的妥布霉素双放大检测方法和应用
CN114441488A (zh) * 2021-12-03 2022-05-06 济南大学 一种基于CRISPR/Cas12a系统检测沙门氏菌的生物传感器

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5593835A (en) * 1995-05-12 1997-01-14 President And Fellows Of Harvard College Methods and kits for RNA binding compounds
CN106525795A (zh) * 2016-11-08 2017-03-22 北京化工大学 一种用于检测霉菌毒素的荧光传感器及其应用方法
WO2017197914A1 (zh) * 2016-05-17 2017-11-23 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条及其应用以及利用适配体检测黄曲霉毒素b1或m1的试纸条
CN108841828A (zh) * 2018-07-16 2018-11-20 江南大学 一种特异性识别妥布霉素的单链dna适配体及其应用
US20190136241A1 (en) * 2016-06-03 2019-05-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Aptamer-based analyte assays
CN110308289A (zh) * 2019-06-19 2019-10-08 江苏大学 氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂及应用
CN110423756A (zh) * 2019-08-05 2019-11-08 江南大学 特异性识别链霉素的短链dna适配体序列及其应用
CN110592187A (zh) * 2019-09-20 2019-12-20 江南大学 基于双重链置换和三向dna结构检测妥布霉素的比色方法
CN111876412A (zh) * 2020-06-15 2020-11-03 山东师范大学 一种荧光适配体探针及其检测方法和应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5593835A (en) * 1995-05-12 1997-01-14 President And Fellows Of Harvard College Methods and kits for RNA binding compounds
WO2017197914A1 (zh) * 2016-05-17 2017-11-23 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条及其应用以及利用适配体检测黄曲霉毒素b1或m1的试纸条
US20190136241A1 (en) * 2016-06-03 2019-05-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Aptamer-based analyte assays
CN106525795A (zh) * 2016-11-08 2017-03-22 北京化工大学 一种用于检测霉菌毒素的荧光传感器及其应用方法
CN108841828A (zh) * 2018-07-16 2018-11-20 江南大学 一种特异性识别妥布霉素的单链dna适配体及其应用
CN110308289A (zh) * 2019-06-19 2019-10-08 江苏大学 氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂及应用
CN110423756A (zh) * 2019-08-05 2019-11-08 江南大学 特异性识别链霉素的短链dna适配体序列及其应用
CN110592187A (zh) * 2019-09-20 2019-12-20 江南大学 基于双重链置换和三向dna结构检测妥布霉素的比色方法
CN111876412A (zh) * 2020-06-15 2020-11-03 山东师范大学 一种荧光适配体探针及其检测方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINGJING NIE，LUYI YUAN，KE JIN，XUYAN HAN，YAPING TIAN: "Electrochemical detection of tobramycin based on enzymes-assisted dual signal amplification by using a novel truncated aptamer with high affinity", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》 *
XIANGXIANG ZHAO，SHANSHAN LI，GUANG LIU，ZHONG WANG: "A versatile biosensing platform coupling CRISPR–Cas12a and aptamers for detection of diverse analytes", 《SCIENCE BULLETIN》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114441488A (zh) * 2021-12-03 2022-05-06 济南大学 一种基于CRISPR/Cas12a系统检测沙门氏菌的生物传感器
CN114441488B (zh) * 2021-12-03 2023-10-27 济南大学 一种基于CRISPR/Cas12a系统检测沙门氏菌的生物传感器
CN114113264A (zh) * 2021-12-11 2022-03-01 郑州大学 基于exoⅲ辅助链循环和cha反应的妥布霉素双放大检测方法和应用

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