CN110423756A - 特异性识别链霉素的短链dna适配体序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。本发明通过适配体筛选技术获得的四条与链霉素具有高亲和力的单链ssDNA适配体序列Ap1，Ap2，Ap3，Ap4，且利用最优适配体Ap2建立了一种基于两轮核酸外切酶III酶切循环放大和DNAzyme催化显色反应的链霉素可视化高灵敏检测方法。本发明为链霉素残留的检测提供了亲和力高、特异性高、易修饰和标记的识别元件和新型的高灵敏检测方法。

Description

特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列及其应用
技术领域
本发明涉及一组特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。
背景技术
链霉素是从链霉菌中通过纯化得到的氨基糖苷类抗生素。氨基糖苷类抗生素是以氨基环醇和氨基糖通过配糖键（氧桥）相连接为基础的。除了链霉素，食品中典型的氨基糖苷类抗生素还有卡那霉素、新霉素、庆大霉素、妥布霉素等。链霉素是最早运用于抗菌的抗生素药物之一，链霉素硫酸盐的稳定性较高。链霉素对于大多数革兰氏阴性菌（如结核杆菌）具有比较强大的抗菌性作用，因此是一种应用广泛的抗生素。但是因为链霉素引起的不良反应较多并且其本身毒性较大，长期使用链霉素对人以及动物都会造成危害，主要有耳毒性、肾毒性等。耳毒性主要表现为平衡性降低、姿势异常等，耳毒性严重则可能导致不可恢复的失聪。肾毒性表现为肾功能降低，肾毒性会随着链霉素的减小用量而逐渐恢复。除此以外，包括链霉素在内的氨基糖苷类抗生素都有导致过敏的风险，严重者致死，用药期过长存在二重感染的风险。因而现在已经逐步减少链霉素在抗菌方面的运用。
目前抗生素残留是食品安全中面临的重大问题之一。以链霉素为例，若长期食用含有链霉素的食品，食物中的链霉素会累积在人体内从而对人体产生毒害，严重者可能会引起过敏反应，并且人体内的某些细菌会因长期接触链霉素从而产生抗药性。因此，许多国家已经确定了许多抗生素的最大残留量标准。如，欧洲委员会所确定的链霉素最大残留量标准为每千克牛奶中链霉素最大检出量为200 µg，每千克猪肾中链霉素最大检出量为1000µg，每千克猪肉中链霉素最大检出量为500 µg。因此，建立经济实用并且精确高效的链霉素检测方法对食品安全有极为重大的意义。
核酸适配体是能够特异性识别并结合靶分子的单链DNA或RNA，基于适配体的生物传感检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点，与抗生素的传统检测方法，例如微生物检测法、仪器分析法等相比具有显著的优势，因而在近年来逐步得到应用。由于已报道的链霉素ssDNA适配体过长（79 nt），不利于在粗放的条件下进行大规模的检测应用，本发明筛选获得了一组链霉素特异性的新型短链ssDNA适配体，其长度在32~44 nt，缩短的链长不仅显著降低了检测时适配体方面的成本，而且大大提高了适配体在检测体系中的稳定性。同时这组适配体的亲和力较原先报道的适配体有非常显著的提高。
在基于适配体的检测方法中，由于适配体的核酸属性，靶分子的检测往往转化为核酸的杂交和扩增放大技术。常见的核酸信号放大技术有聚合酶链式反应信号放大技术、链置换反应信号放大技术、滚环扩增反应信号放大技术、基于核酸酶的信号放大技术。基于核酸酶的信号放大技术中所用酶按照其作用位点同样也分为核酸外切酶和核酸内切酶。核酸外切酶中常用的双链核酸外切酶是核酸外切酶Ⅲ（来源于大肠杆菌）和λ核酸外切酶（来源于λ噬菌体），常用的单链核酸外切酶是核酸外切酶Ⅰ（来源于大肠杆菌）。本发明中所用的核酸酶为核酸外切酶Ⅲ。核酸外切酶Ⅲ识别双链，沿着3’端至5’端的方向逐个催化水解单个核苷酸，其最适作用底物为平末端或凹末端的双链DNA。而G-四联体是4个鸟嘌呤碱基通过 Hoogsteen 氢键的配对方式形成稳定的共平面四方形的结构。在血红素存在时会与G四联体结合形成DNA酶结构，该酶可以催化双氧水氧化2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）从而产生绿色螯合物，该螯合物在420nm处有最大的吸光值，通过吸光值来间接反映G四联体的含量。本发明在筛选得到几条较短适配体的基础上，从中挑选了性能最佳的一条用于建立一种链霉素的可视化检测方法。该方法基于链置换和核酸外切酶III的剪切作用，具有灵敏度高，易操作，实验反应迅速的特点。
发明内容
本发明的目的在于克服原有链霉素适配体的不足，提供一组特异性识别链霉素的短链ssDNA适配体，该组适配体不仅在链长上远远短于已有报道的链霉素适配体，并且亲和力得到很大的提高。作为链霉素的新型识别元件，该组适配体具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记等优势，并能应用于多种检测方法的构建。在此基础上建立了一种基于两次核酸外切酶III酶切循环放大和DNAzyme催化显色反应的链霉素可视化高灵敏检测方法，并对检测条件进行优化和检测方法的特异性进行验证，最后将这种检测方法应用到牛奶样品中链霉素浓度的检测。
本发明的技术方案，特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列，能够被提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。
进一步地，其包括含有Ap1-Ap4所述序列的ssDNA，选自Ap1-Ap4所示序列中的一种或多种，具体如下：
SEQ ID No.1:
Ap1:5’-CGGATCGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGG-3’；
SEQ ID No.2:
Ap2:5’-CGTCGACGGATCGTGTTCTGCGCAGGTCGGACG-3’；
SEQ ID No.3:
Ap3:5’-CGTCGACGGATCGTGTTCTGCGCAGGTCGACG-3’；
SEQ ID No.4:
Ap4:5’-CGTCGACGGATCGTGTTTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGTCGACG-3’。
通过实验测定并比较4个序列与链霉素的解离常数Kd值（图1），得到Ap2序列的Kd=25.48±3.817 nmol/L，为4个序列中最低，即亲和力最大，由此选择Ap2为最优的链霉素适配体序列，利用该适配体构建链霉素可视化高灵敏检测方法。
特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列的应用，将其用于链霉素检测的组合物、试剂盒或芯片中。
进一步地，利用其建立一种基于两轮核酸外切酶III酶切循环放大和DNAzyme催化显色反应的链霉素可视化高灵敏检测的方法。
进一步地，链霉素可视化高灵敏检测的方法步骤为：所述适配体先与辅助探针部分配对形成双链，链霉素能与适配体特异性结合，将辅助探针释放，释放的辅助探针能与Hp1序列部分配对形成双链，利用核酸外切酶Ⅲ识别双链并从3’端水解单链的特性，将Hp1从3’端开始部分酶解，释放出辅助探针以及Hp1的剩余部分序列；
辅助探针循环利用与其它Hp1序列结合，而Hp1的剩余部分是一段能够形成G-四联体的序列，称为Hp1-G4，此过程称为第一次信号循环放大CycleⅠ；Hp1-G4序列能进一步与Hp2序列部分配对形成双链，由核酸外切酶Ⅲ对双链部分进行酶解后释放出能循环利用的Hp1-G4和剩余的另一段能形成G四联体的单链DNA，称为Hp2-G4，此过程称为第二次信号循环放大CycleⅡ；
在富含钾离子的working buffer中，Hp1-G4和Hp2-G4形成G四联体结构，在双氧水的存在下催化ABTS2-显色，由420nm处的吸光值大小反映靶标链霉素的浓度，检测链霉素。
可视化高灵敏检测方法的具体步骤如下：
（1）将100µmol/L特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列和辅助探针分别稀释至1µmol/L，各取10µL混合，在95℃下加热5min，随后冰浴10min，再放置至室温；之后加入5µL的不同浓度的的靶标链霉素溶液，在37℃孵育1h，作为待测样品；
（2）将各为100µmol/L的Hp1、Hp2在95℃下加热5min，随后在37℃孵育2h；将孵育后的Hp1、Hp2序列分别稀释至1μmol/L和1.25μmol/L，各取10μL加入到步骤（1）的反应体系中；接着，在冰上向样品中加入2µL的200U ExoⅢ、6µL酶缓冲液以及2µL dd H2O，随后在37℃反应2 h；反应结束后，在70℃下20 min灭活ExoⅢ，至此酶辅助两轮信号放大反应完成；
（3）向步骤（2）的溶液中加入10µL 20µmol/L的血红素以及400µL的working buffer，在37℃下反应1h；随后，加入20µL 50mmol/L的ABTS和10µL 99mmol/L的H2O2（样品总体系为500µL），反应10min后，在420nm处测得样品吸光值；以吸光值对链霉素浓度作图，得到标准曲线；
（4）未知浓度的链霉素样品按步骤（1）~（3）操作，所得吸光值代入标准曲线，计算出样品中链霉素的浓度。
步骤（2）所述酶缓冲液具体为10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl2和1mmol/LDTT，pH 7.0的混合液；
步骤（3）所述working buffer具体为50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NH4Cl，20mmol/LKCl和体积浓度为0.03% Triton X-100的混合液。
所述辅助探针序列Assisted probre具体如SEQ ID No.5：
5’-CGTCGACCTGCAGACTTTTTTTTTGAACAAAGCAGGTCGACG-3’；
HP1序列具体如SEQ ID No.6：
5’-
CTAGACTGGGTAGGGCGGGTTGGGCTACCCAGTCTAGGCTTTGTTCAAAAAAAAAGTCTGCAGGTCGACG-3’；
HP2序列具体如SEQ ID No.7：
5’-AGAGGGCATGGGAGTGGGTGCCCTCTCGCCCTACCCAGTC-3’。
本发明的有益效果：本发明通过筛选和亲和力分析得到链霉素的最优适配体序列，通过核酸外切酶III的特性和G-四链体的DNAzyme催化活性构建了链霉素的高灵敏检测方法。方法快速简便易操作，使用仪器简单，一般的实验条件都可以达到。为食品和环境中链霉素残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低的高特异性检测方法。
附图说明
图1 测定适配体序列Ap1、Ap2、Ap3、Ap4的Kd值的拟合曲线图。
图2 链霉素高灵敏可视化检测方法原理图。
图3 420nm处的吸光值与链霉素浓度的线性关系曲线。
具体实施方式
实施例1 用荧光法测定适配体序列的解离常数Kd值
4种核酸适配体的亲和力通过以下方法测定：在环氧基磁珠的表面修饰链霉素后封闭环氧基，得到链霉素-磁珠复合物。将带有6-羧基荧光素(FAM)标记的链霉素适配体变性后加入复合物中，轻微震荡并避光室温反应1 h。然后用400 μL 结合缓冲液（20 mmol/LTris-HCl，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，0.02% Tween20，pH 7.6）洗去未结合的适配体，重复三次。再加入150 μL洗脱缓冲液（40 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，3.5 mol/L尿素，0.02% Tween20，pH 8.0），在80℃条件下处理20 min，将环氧磁珠上被结合的核酸适配体洗脱下来，吸取上清液，重复两次，检测荧光值。进而计算链霉素与核酸适配体的结合率。
由方程：y=Bmax×free ssDNA/ ( Kd+free ssDNA)，可对每一条适配体序列的Kd值进行分析。方程中y表示核酸适配体结合的链霉素占总的链霉素的比例，即饱和度；Bmax表示最大结合位点的数目，free ssDNA表示未与链霉素结合的游离的ssDNA浓度。拟合曲线如图1所示，测得Ap1，Ap2，Ap3，Ap4的Kd值分别为72.94±10.09 nmol/L、25.48±3.817 nmol/L、38.40±8.451 nmol/L、48.81±6.772 nmol/L，均具有较高的亲和力，其中Ap2与链霉素具有最高的亲和力。
实施例2 比色法检测链霉素标准品
加入终浓度为25nmol/L、50nmol/L、75nmol/L、100nmol/L、400nmol/L、800nmol/L、1000nmol/L和1200nmol/L的链霉素进行1h的链置换反应，随后加入经过热处理和37℃孵育的Hp1（终浓度为100nmol/L）、Hp2（终浓度为25nmol/L）以及150U核酸外切酶Ⅲ进行反应，随后检测420nm处G-四联体吸光值。发现当链霉素的浓度在25-1200nmol·L-1范围内时，体系在420nm处的吸光值随着链霉素浓度的增大而逐渐增大，呈现良好的线性关系。如图3所示，线性关系式为：y=0.0913x+0.0554（x是链霉素浓度nmol/L，y是吸光度值），线性相关系数R2= 0.9936，检测限为17nmol/L。
实施例3 比色法检测链霉素特异性验证
为了验证比色法检测链霉素的特异性，向经过预处理的适配体以及辅助探针体系中分别加入5μL 100 μmol/L的卡那霉素、妥布霉素、新霉素、氨苄青霉素、庆大霉素以及链霉素进行1h的链置换反应，随后加入经过热处理和37℃孵育的Hp1（终浓度为100nmol/L）、Hp2（终浓度为25nmol/L）以及150U核酸外切酶 Ⅲ进行反应，随后检测420nm处G四联体吸光值。链霉素所在样品的吸光值要远远大于其它样品，由此可见构建的基于适配体的链霉素高灵敏检测方法具有较高的特异性。
实施例4 牛奶样品中比色法检测链霉素
向市场上销售的牛奶中添加一定浓度的标准链霉素以制备人工污染的牛奶，随后逐滴加入20% 的三氯乙酸溶液调节pH至4.6，然后在45℃中恒温水浴10min使蛋白沉淀，最后在4℃下以10000r/min的转速使样品离心25min，以此去除凝结的脂肪和蛋白质，最后得到的即为经预处理后的牛奶样品。采用与标准样品相同的条件下检测牛奶样品，测定的吸光值从标准曲线上可计算出相应的链霉素浓度。测定所得链霉素浓度与添加的链霉素浓度基本相符。
序列表
<110> 江南大学
<120> 特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 特异性识别链霉素的短链ssDNA适配体序列(Ap1)
<400> 1
cggatcgtgt tctgctttgt tctgtcgggt cgtctgcagg 40
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 特异性识别链霉素的短链ssDNA适配体序列(Ap2)
<400> 2
cgtcgacgga tcgtgttctg cgcaggtcgg acg 33
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 特异性识别链霉素的短链ssDNA适配体序列(Ap3)
<400> 3
cgtcgacgga tcgtgttctg cgcaggtcga cg 32
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 特异性识别链霉素的短链ssDNA适配体序列(Ap4)
<400> 4
cgtcgacgga tcgtgttttt gttctgtcgg gtcgtctgtc gacg 44
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 辅助探针(Assisted probre)
<400> 5
cgtcgacctg cagacttttt ttttgaacaa agcaggtcga cg 42
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> HP1序列(HP1)
<400> 6
ctagactggg tagggcgggt tgggctaccc agtctaggct ttgttcaaaa aaaaagtctg 60
caggtcgacg 70
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> HP2序列(HP2)
<400> 7
agagggcatg ggagtgggtg ccctctcgcc ctacccagtc 40

Claims (8)

1.特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列，其特征在于：能够被提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。
2.如权利要求1所述特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列，其特征在于：包括含有Ap1-Ap4所述序列的ssDNA，选自Ap1-Ap4所示序列中的一种或多种，具体如下：
SEQ ID No.1:
Ap1:5’-CGGATCGTGTTCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGG-3’；
SEQ ID No.2:
Ap2:5’-CGTCGACGGATCGTGTTCTGCGCAGGTCGGACG-3’；
SEQ ID No.3:
Ap3:5’-CGTCGACGGATCGTGTTCTGCGCAGGTCGACG-3’；
SEQ ID No.4:
Ap4:5’-CGTCGACGGATCGTGTTTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGTCGACG-3’。
3.特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列的应用，其特征在于：将其用于链霉素检测的组合物、试剂盒或芯片中。
4.如权利要求3所述特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列的应用，其特征在于：利用其建立一种基于两轮核酸外切酶III酶切循环放大和DNAzyme催化显色反应的链霉素可视化高灵敏检测的方法。
5.如权利要求4所述特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列的应用，其特征在于链霉素可视化高灵敏检测的方法为：
所述适配体先与辅助探针部分配对形成双链，链霉素与适配体特异性结合，将辅助探针释放，释放的辅助探针与Hp1序列部分配对形成双链，利用核酸外切酶Ⅲ识别双链并从3’端水解单链的特性，将Hp1从3’端开始部分酶解，释放出辅助探针以及Hp1的剩余部分序列；
辅助探针循环利用与其它Hp1序列结合；而Hp1的剩余部分是一段能够形成G-四联体的序列，称为Hp1-G4，此过程称为第一次信号循环放大CycleⅠ；Hp1-G4序列能进一步与Hp2序列部分配对形成双链，由核酸外切酶Ⅲ对双链部分进行酶解后释放出能循环利用的Hp1-G4和剩余的另一段能形成G四联体的单链DNA，称为Hp2-G4，此过程称为第二次信号循环放大CycleⅡ；
在富含钾离子的working buffer中，Hp1-G4和Hp2-G4形成G四联体结构，在双氧水的存在下催化ABTS2-显色，由420nm处的吸光值大小反映靶标链霉素的浓度，检测链霉素。
6.如权利要求5所述特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列的应用，其特征在于链霉素可视化高灵敏检测方法的具体步骤如下：
（1）将100µmol/L特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列和辅助探针分别稀释至1µmol/L，各取10µL混合，在95℃下加热5min，随后冰浴10min，再放置至室温；之后加入5µL的不同浓度的的靶标链霉素溶液，在37℃孵育1h，作为待测样品；
（2）将各为100µmol/L的Hp1、Hp2在95℃下加热5min，随后在37℃孵育2h；将孵育后的Hp1、Hp2序列分别稀释至1μmol/L和1.25μmol/L，各取10μL加入到步骤（1）的反应体系中；接着，在冰上向样品中加入2µL的200U ExoⅢ、6µL酶缓冲液以及2µL dd H2O，随后在37℃反应2 h；反应结束后，在70℃下20 min灭活ExoⅢ，至此酶辅助两轮信号放大反应完成；
（3）向步骤（2）的溶液中加入10µL 20µmol/L的血红素以及400µL的working buffer，在37℃下反应1h；随后，加入20µL 50mmol/L的ABTS和10µL 99mmol/L的H2O2，反应10min后，在420nm处测得样品吸光值；以吸光值对链霉素浓度作图，得到标准曲线；
（4）未知浓度的链霉素样品按步骤（1）~（3）操作，所得吸光值代入标准曲线，计算出样品中链霉素的浓度。
7.如权利要求6所述特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列的应用，其特征在于：步骤（2）所述酶缓冲液具体为10mmol/L Tris-HCl、10mmol/L MgCl2和1mmol/L DTT，pH 7.0的混合液；
步骤（3）所述working buffer具体为50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NH4Cl，20mmol/LKCl和体积浓度为0.03% Triton X-100的混合液。
8.如权利要求6所述特异性识别链霉素的短链DNA适配体序列的应用，其特征在于：所述辅助探针序列Assisted probre具体如SEQ ID No.5：
5’-CGTCGACCTGCAGACTTTTTTTTTGAACAAAGCAGGTCGACG-3’；
HP1序列具体如SEQ ID No.6：
5’-CTAGACTGGGTAGGGCGGGTTGGGCTACCCAGTCTAGGCTTTGTTCAAAAAAAAAGTCTGCAGGTCGACG-3’；
HP2序列具体如SEQ ID No.7：
5’-AGAGGGCATGGGAGTGGGTGCCCTCTCGCCCTACCCAGTC-3’。
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