CN112326950A - 一种t-2毒素的检测方法 - Google Patents

一种t-2毒素的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种T‑2毒素的可视化检测方法，通过单链DNA适配体、样品、MOPS缓冲液振荡混匀孵育反应后，加入AuNPs孵育反应，再加入NaCl溶液孵育反应，测定待测反应液的A620/A520值，并将该值代入由T‑2标准溶液构建的线性方程中以计算得到样品中毒素浓度。本发明方法对T‑2毒素的最低检出限为0.124nM(57.8pg/mL)，本发明方法在操作过程和结果等方面均显示出明显的优势，此外，本发明方法对T‑2毒素的检测具有高选择性，在相同条件下，本发明方法并不受包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1在内的其他真菌毒素的影响。

Description

一种T-2毒素的检测方法
技术领域
本发明属于微量毒素检测技术领域，尤其涉及一种T-2毒素的检测方法。
背景技术
T-2毒素是一种具有极强毒性的真菌次级代谢产物，广泛分布于小麦、玉米、谷物和大米及其制品中。T-2毒素在体内外能够抑制DNA、RNA、蛋白质合成以及线粒体功能，具有致畸、致癌、致突变效应。根据欧洲食品安全委员会建议，人们对T-2每日允许的摄入量和急性参考剂量分别为0.02μg/kg和0.3μg/kg，这就要求有高灵敏和准确的T-2检测方法，以便正确评估人们所面临的风险。
目前能有效检测T-2的方法包括高效液相色谱、液相色谱-质谱、超高效液相色谱-串联质谱以及基于免疫分析等检测方法，但是这些方法都需要依赖昂贵的仪器，并且实际检测过程也是程序复杂、费时费力，对操作人员的专业性要求很高，并不能满足T-2的实时、快速检测的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种T-2毒素的检测方法，旨在解决上述背景技术中现有技术的不足之处。
本发明是这样实现的，本发明公开了一种T-2毒素的可视化检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)将不同已知浓度的T-2标准溶液作为样品分别执行以下操作以获得各对应的标准反应液：将40～60μL、1μM的单链DNA适配体与40～60μL样品加入到130～180μL、10mM、pH 7.0的MOPS缓冲液中，振荡混匀、室温下孵育反应1～3h，再加入200μL、10nM的AuNPs孵育20～40min，再加入40～50μL、1M NaCl溶液孵育5～20min后，得到标准反应液；
(2)将各标准反应液转移至96孔板，测得各浓度T-2标准溶液对应的A620/A520标准值，根据各A620/A520标准值绘制的吸光度线性变化的曲线，在设定浓度范围内T-2标准溶液浓度与A620/A520值呈线性关系，得出线性方程；
(3)将待测T-2溶液作为样品执行与步骤(1)相同的所述操作并得到待测反应液，具体为：将40～60μL、1μM的单链DNA适配体与40～60μL待测T-2溶液加入到130～180μL、10mM、pH 7.0的MOPS缓冲液中，振荡混匀、室温下孵育反应1～3h，再加入200μL、10nM的AuNPs孵育20～40min，再加入40～50μL、1M NaCl溶液孵育5～20min后，得到待测反应液；
将所述待测反应液转移至96孔板，测得待测反应液的A620/A520值，将该A620/A520值代入步骤(2)所述线性方程中，计算得到待测T-2溶液中T-2毒素浓度。
优选地，在步骤(1)中，将50μL、1μM的单链DNA适配体与50μL样品加入到157μL、10mM、pH 7.0的MOPS缓冲液中，振荡混匀、室温下孵育反应1～3h，再加入200μL、10nM的AuNPs孵育30min，再加入43μL、1M NaCl溶液孵育10min后，得到标准反应液。
优选地，在步骤(1)中，所述单链DNA适配体为5’-GTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAA-3’。
优选地，在步骤(1)中，所述单链DNA适配体为活化后的适配体，该活化过程为：先将适配体溶于水中，用MOPS缓冲液稀释至1μM，95℃加热5min，迅速于冰水中冷却15min后，在室温25℃放置20min。
优选地，在步骤(2)中，所述设定浓度为0.21435～10717.5nM，所述直线方程为y＝2.6×10-5+0.7666，相关系数为0.99654。
本发明克服现有技术的不足，提供一种T-2毒素的检测方法。通常情况下，AuNPs分散在溶液中呈红色，当用适当浓度NaCl处理AuNPs溶液时，AuNPs会聚集成较大颗粒，溶液会逐渐由红色变成紫色甚至蓝色。表面带有负电荷的单链DNA(ssDNA)适配体在高盐溶液中很容易吸附在AuNPs表面，保持AuNPs的稳定性，并保持溶液颜色为酒红色。然而，目标分子T-2存在时，适配体通过与目标分子结合并从AuNPs表面解吸附，导致AuNPs在高盐溶液中聚集，溶液颜色从红色变成蓝紫色。吸附在AuNPs表面的适配体数量随靶标分子浓度的变化而变化。不同浓度的适配体作为AuNPs的稳定剂，对盐诱导的聚集有不同的抑制能力，并产生不同的颜色。因此，本发明不仅可以通过吸光度值的变化，而且可以通过肉眼观察来检测目标分子T-2。
NaCl用于中和AuNPs的表面电荷，为了优化NaCl浓度，本发明将不同体积的1MNaCl(0、5、10、15、20、25、30、40、43、45、48、50、60、70、80和100μL)同200μL的AuNPs加入1.5mL离心管，再加入MOPS缓冲液至总体积为500μL。使得NaCl终浓度依次为0、10、20、30、40、50、60、80、86、90、96、100、120、140、160和200mM。孵育10min后测定A620/A520。结果如图1所示，不同NaCl浓度下AuNPs的吸收光谱的变化。分散的AuNPs在520nm处显示出较强的吸收峰，随着NaCl浓度的增加，520nm处的吸收峰急剧下降，而在620nm处出现一个新的吸收峰。520nm处吸收峰的降低和620nm处吸收峰的增强表明形成了AuNPs聚集体，因此选择A620/A520作为AuNPs分散状态的一个表征指标，A620/A520增加表示AuNPs聚集度增加，导致溶液颜色从红色变为紫色或蓝色。
随着NaCl浓度从0增加到20nM，吸光度值(A620/A520)从0.17增加到0.22，随着NaCl浓度进一步增加到86mM，吸光度值(A620/A520)迅速增加到0.76，并且在较高NaCl浓度下，吸光度值在1.02和1.16之间趋于稳定，结果如图2所示。溶液颜色的变化也证实了盐诱导下AuNPs的聚集。初始AuNPs溶液呈红色，当NaCl浓度从0增加到50mM时，颜色没有明显变化。然而，当NaCl浓度增加到60mM时，溶液变成深红色，表明在此浓度下开始形成了AuNP聚集体。当NaCl浓度进一步增加到86mM时，AuNPs溶液的颜色变为紫色或蓝色。
NaCl加入量过少会导致AuNPs表面电荷的中和作用不足，从而不会引起聚集。随着NaCl浓度的增加，离子强度也逐渐增大，AuNPs表面的负电荷被盐离子强烈屏蔽，从而在相邻的AuNPs之间产生吸引力，导致随后的聚集。当NaCl浓度进一步增加到86mM时，AuNPs溶液的颜色变为紫色或蓝色，随着NaCl浓度进一步增加，AuNPs的颜色变为透明溶液，并观察到AuNPs的沉淀。沉淀的形成使得AuNPs很难用肉眼和吸收光谱来区分颜色的变化。因此，NaCl最佳浓度为86mM。
适配体主要有两个作用：(1)快速、特异地结合T-2形成T-2适配体复合物；(2)在AuNPs表面吸附，防治盐诱导下AuNPs的聚集。为了确定适配体的最佳浓度，本发明测试了不同浓度范围20～180nM适配体偶联的AuNPs的吸收光谱，通过加入不同体积(10、20、30、40、50、60、70、80和90μL)的1μM T-2适配体溶液使得T-2适配体终浓度为20、40、60、80、100、120、140、160和180nM，用MOPS缓冲液补充至体积为457μL，孵育30min后加入43μL 1M NaCl溶液，再孵育10min后测定A620/A520。如图3所示，结果显示适配体在任何浓度下既不影响吸收光谱，也不影响AuNPs的颜色，表明适配体与AuNPs结合对AuNPs的分散性没有显著影响。当20nM适配体与AuNPs结合时，与仅添加AuNPs相比，加入86mM的NaCl后AuNPs的吸光度发生了明显变化。100和180nM适配体与AuNPs结合，加入86mM的NaCl后AuNPs的吸光度与原始AuNPs相似，起到了很好的保护效果，20nM的适配体不足以防止盐诱导下AuNPs的聚集，导致AuNPs呈现淡紫色。另一方面，AuNPs在与100～180nM适配体结合时吸光度值分别为0.37和0.36，如图4所示，100nM适配体结合到AuNPs表面在高浓度盐溶液中与AuNPs本身吸光度值类似，表明已经起到了很好的保护效果。如果添加的适配体不足，AuNPs就会部分暴露，AuNPs的聚集会变得敏感；如果适配体数量过饱和，即使添加了靶标分子，AuNPs也有可能被适配体覆盖，从而出现假阴性结果。因此，最佳适配体浓度选择为100nM。
本发明的核心创新要点在于适配体制备(活化过程使得更有利于适配体和T-2结合)、NaCl浓度的确定、适配体浓度的确定，以及综合的使用过程。特别是，本发明提出了让适配体和T-2先结合发生反应，然后加入AuNPs，未反应的ssDNA会和AuNPs结合，从而保护NaCl引起的聚集，不同浓度的T-2，和适配体结合后会导致产生不同数量的ssDNA(和T-2结合的适配体不具备保护效应，单链游离的DNA具备保护AuNPs不被聚集的能力)，因此和AuNPs结合后会产生不同程度的保护效果，导致产生不同的颜色以及A620/A520值。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明方法对T-2毒素的最低检出限为0.124nM(57.8pg/mL)，本发明方法在操作过程和结果等方面均显示出明显的优势；
(2)本发明方法对T-2毒素的检测具有高选择性，在相同条件下，本发明方法并不受包括黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和伏马菌素B1在内的其他真菌毒素的影响。
附图说明
图1是在不同浓度氯化钠溶液中AuNPs的吸收光谱；
图2是AuNPs溶液的吸光度值(A620/A520)与NaCl浓度的关系；
图3是适配体浓度对AuNPs溶液吸光度值(A620/A520比值)的影响；
图4是AuNPs的吸收光谱和100nM适配体对盐诱导下AuNPs吸收光谱的影响；
图5是AuNPs溶液的吸光度值(A620/A520比值)与T-2浓度的关系；
图6是T-2标准溶液浓度对应AuNPs溶液吸光度值(A620/A520)的标准曲线；
图7是不同浓度的黄曲霉素B1、赭曲霉素A、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1对适配体传感器的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在以下实施例1～3中，T-2的单链DNA适配体由华大基因合成，序列来源于已报道文献，具体为：5’-GTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAA-3’，T-2的单链DNA适配体使用前，先将适配体溶于水中，进一步用MOPS缓冲液稀释至1μM，95℃加热3～10min，迅速于冰浴冷却10～20min后在室温25℃放置10～30min以保证适配体形成正确的三级结构。
此外，以下T-2标准溶液的制备过程为：将浓度为1mg/mL(等同于2143.5μM)的T-2母液溶解于10％甲醇-水中，依次用水稀释至所需浓度，得到不同浓度的T-2标准溶液。
实施例1
(1)将不同已知浓度的T-2标准溶液作为样品分别执行以下操作以获得各对应的标准反应液：1.5mL离心管中，将50μL、1μM的单链DNA适配体与50μL样品加入到157μL 10mM、pH 7.0的MOPS缓冲液中，振荡混匀、室温下孵育反应2h，再加入200μL、10nM的AuNPs孵育30min，再加入43μL、1M的NaCl溶液孵育10min后，得到500μL标准反应液；
(2)将各标准反应液转移至96孔板，测得各浓度T-2标准溶液对应的A620/A520标准值，根据各A620/A520标准值绘制的吸光度线性变化的曲线，该曲线中，在0.21435～10717.5nM浓度范围内T-2标准溶液浓度与A620/A520值呈线性关系，获取该线性方程：y＝2.6×10-5+0.7666，相关系数为0.99654；
(3)将待测T-2溶液作为样品执行以下操作以获得待测反应液：1.5mL离心管中，将50μL、1μM的单链DNA适配体与50μL样品加入到157μL 10mM、pH 7.0的MOPS缓冲液中，振荡混匀、室温下孵育反应2h，再加入200μL、10nM的AuNPs孵育30min，再加入43μL、1M的NaCl溶液孵育10min后，得到500μL待测反应液；
将所述待测反应液转移至96孔板，测得待测反应液的A620/A520值，将该A620/A520值代入实施例1中的线性方程：y＝2.6×10-5+0.7666，相关系数为0.99654，计算得到待测T-2溶液中T-2毒素浓度。
实施例2
(1)将不同已知浓度的T-2标准溶液作为样品分别执行以下操作以获得各对应的标准反应液：1.5mL离心管中，将40μL、1μM的单链DNA适配体与40μL样品加入到180μL 10mM、pH 7.0的MOPS缓冲液中，振荡混匀、室温下孵育反应1h，再加入200μL、10nM的AuNPs孵育20min，再加入40μL、1M的NaCl溶液孵育5min后，得到500μL标准反应液；
(2)将各标准反应液转移至96孔板，测得各浓度T-2标准溶液对应的A620/A520标准值，根据各A620/A520标准值绘制的吸光度线性变化的曲线，该曲线中，在0.21435～10717.5nM浓度范围内T-2标准溶液浓度与A620/A520值呈线性关系，获取该线性方程；
(3)将待测T-2溶液作为样品执行以下操作以获得待测反应液：1.5mL离心管中，将40μL、1μM的单链DNA适配体与40μL样品加入到180μL 10mM、pH 7.0的MOPS缓冲液中，振荡混匀、室温下孵育反应2h，再加入200μL、10nM的AuNPs孵育30min，再加入40μL、1M的NaCl溶液孵育10min后，得到500μL待测反应液；
将所述待测反应液转移至96孔板，测得待测反应液的A620/A520值，将该A620/A520值代入上述线性方程，计算得到待测T-2溶液中T-2毒素浓度。
实施例3
(1)将不同已知浓度的T-2标准溶液作为样品分别执行以下操作以获得各对应的标准反应液：1.5mL离心管中，将60μL、1μM的单链DNA适配体与60μL样品加入到130μL 10mM、pH 7.0的MOPS缓冲液中，振荡混匀、室温下孵育反应1h，再加入200μL、10nM的AuNPs孵育40min，再加入50μL、1M的NaCl溶液孵育20min后，得到500μL标准反应液；
(2)将各标准反应液转移至96孔板，测得各浓度T-2标准溶液对应的A620/A520标准值，根据各A620/A520标准值绘制的吸光度线性变化的曲线，该曲线中，在0.21435～10717.5nM浓度范围内T-2标准溶液浓度与A620/A520值呈线性关系，获取该线性方程；
(3)将待测T-2溶液作为样品作为样品执行以下操作以获得待测反应液：1.5mL离心管中，1.5mL离心管中，将60μL、1μM的单链DNA适配体与60μL样品加入到130μL 10mM、pH7.0的MOPS缓冲液中，振荡混匀、室温下孵育反应1h，再加入200μL、10nM的AuNPs孵育40min，再加入50μL、1M的NaCl溶液孵育20min后，得到500μL待测反应液；
将所述待测反应液转移至96孔板，测得待测反应液的A620/A520值，将该A620/A520值代入上述线性方程，计算得到待测T-2溶液中T-2毒素浓度效果实施例1
取5g完好的小麦样品用25mL甲醇/水在室温下萃取50min，4000rpm离心10min去除杂质，滤液过0.22μm超滤膜。上清液用5倍体积水稀释，稀释液中加入不同浓度T-2毒素代表不同污染程度的样品。溶液用于样品中T-2毒素的检测，每个浓度重复3次。
取5g完好的玉米样品用25mL甲醇/水在室温下萃取50min，4000rpm离心10min去除杂质，滤液过0.22μm超滤膜。上清液用5倍体积水稀释，稀释液中加入不同浓度T-2毒素代表不同污染程度的样品。溶液用于样品中T-2毒素的检测，每个浓度重复3次。
以下检测结果如下表1所示：
表1小麦和玉米样品在不同水平的T-2加样回收率(n＝3)
Figure BDA0002733061400000091
由表1可以看出，提取毒素后用该方法检测T-2，玉米中T-2毒素的平均回收率在90.9～108.4％之间，相对标准偏差(RSDs)在0.7～2.81％之间；小麦中T-2毒素的平均回收率在97.83～101.36％之间，相对标准偏差(RSDs)在1.04～7.21％之间。
该方法具有良好的精密度和重现性，可用于小麦和玉米样品中T-2的检测。
效果实施例2
将50μL 1μM适配体和50μL不同浓度的T-2溶液(T-2终浓度为0.01、0.1、500、1000、2000、5000ng/mL、10μg/mL和50μg/mL，分别等同于0.0214、0.214、1071、2143、4287、10717、21435nM和107.175μM)加入到157μL MOPS缓冲液中，振荡混匀，25℃孵育反应2h确保T-2和适配体充分结合，分别加入200μLAuNPs孵育30min，再加入43μL 1M NaCl溶液孵育10min后，将反应液转移至96孔板，测得A620/A520。
结果如图5所示，当T-2浓度为0.01、0.1、500、1000、2000、5000ng/mL、10μg/mL和50μg/mL时(分别等同于0.0214、0.2143、1071、2143、4287、10717、21435和107.175μM)，随着T-2浓度的增加A620/A520比值逐渐升高，溶液颜色由红色变成蓝紫色，意味着AuNPs逐渐聚集。当T-2浓度增加到10μg/mL以上时，A620/A520比值的增加变得平缓。
结果如图6所示，在T-2一定的浓度范围内(0.1ng/mL～5000ng/mL，相当于0.21435～10717.5nM)，T-2浓度与A620/A520比值具有良好的线性关系，线性方程为y＝2.6×10-5+0.7666，相关系数为0.99654，最低检出限为0.124nM。
将本发明方法与之前的T-2检测方法相比，比较结果如下表2所示：
表2本发明检测方法与传统T-2检测方法的比较
Figure BDA0002733061400000101
由上表2可知，本发明检测方法在性能和过程方面显示出明显的优势。
效果实施例3
为了确定适配体传感器的选择性，本发明实施例分别用0.1ng/mL和1000ng/mL的黄曲霉素B1、赭曲霉素A、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1作为T-2毒素结构的类似物进行适配体传感器选择性的测试，具体为：
将50μL、1μM适配体和50μL不同浓度的黄曲霉素B1、赭曲霉素A、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1溶液(终浓度分别为1000ng/mL和0.1ng/mL)加入到157μL MOPS缓冲液中，振荡混匀，25℃孵育反应2h确保T-2和适配体充分结合。分别加入200μLAuNPs孵育30min，再加入43μL 1M NaCl溶液孵育10min后，将反应液转移至96孔板，测得A620/A520。
结果如图7所示，结果显示，其他真菌毒素如：黄曲霉素B1、赭曲霉素A、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1对该传感器的影响微不足道，表明本发明检测方法对T-2的检测具有高选择性。
对比实施例
周晓彤等人(参考文献：(1)Zhou Xiaotong,Wang Lumei,Shen Guoqing etal.Colorimetric determination of ofloxacin using unmodified aptamers and theaggtregation of gold nanoparticles[J].Microchimica Acta,2018,185(7):355.(2)周晓彤；基于核酸适配体的氧氟沙星检测方法研究[D]；上海交通大学；2019年)基于氧氟沙星和核酸适配体之间的相互作用，以及AuNPs在盐溶液中聚集和分散状态带来的吸光度和颜色的变化，通过颜色和吸光度变化就可以定性和定量检测，方法具有较高的特异性，最低检测限为3.38nM，线性范围为20～400nM，在环境或生物样品中有着较好的回收率。
但是，本发明方法与周晓彤等人的方法相比，检测限更低，为0.124nM(57.8pg/mL)，并且线性范围更大，为0.21435～10717.5nM。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种T-2毒素的可视化检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将不同已知浓度的T-2标准溶液作为样品分别执行以下操作以获得各对应的标准反应液：将40～60μL、1μM的单链DNA适配体与40～60μL样品加入到130～180μL、10mM、pH7.0的MOPS缓冲液中，振荡混匀、室温下孵育反应1～3h，再加入200μL、10nM的AuNPs孵育20～40min，再加入40～50μL、1M的NaCl溶液孵育5～20min后，得到标准反应液；
(2)将各标准反应液转移至96孔板，测得各浓度T-2标准溶液对应的A620/A520标准值，根据各A620/A520标准值绘制的吸光度线性变化的曲线，在设定浓度范围内T-2标准溶液浓度与A620/A520值呈线性关系，得出线性方程；
(3)将待测T-2溶液作为样品执行与步骤(1)相同的所述操作并得到待测反应液，将所述待测反应液转移至96孔板，测得待测反应液的A620/A520值，将该A620/A520值代入步骤(2)所述线性方程中，计算得到待测T-2溶液中T-2毒素浓度。
2.如权利要求1所述的T-2毒素的可视化检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，将50μL、1μM的单链DNA适配体与50μL样品加入到157μL、10mM、pH 7.0的MOPS缓冲液中，振荡混匀、室温下孵育反应1～3h，再加入200μL、10nM的AuNPs孵育30min，再加入43μL、1M的NaCl溶液孵育10min后，得到标准反应液。
3.如权利要求1所述的T-2毒素的可视化检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述单链DNA适配体为5’-GTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAA-3’。
4.如权利要求1所述的T-2毒素的可视化检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述单链DNA适配体为活化后的适配体，该活化过程为：先将适配体溶于水中，用MOPS缓冲液稀释至1μM，95℃加热5min，迅速于冰水中冷却15min后，在室温25℃放置20min。
5.如权利要求1所述的T-2毒素的可视化检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述设定浓度为0.21435～10717.5nM，所述直线方程为y＝2.6×10-5+0.7666，相关系数为0.99654。
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