CN105543231B - 伏马毒素b1核酸适配体链置换探针的筛选及应用 - Google Patents

伏马毒素b1核酸适配体链置换探针的筛选及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及核酸适配体的应用与开发，具体为伏马毒素B1核酸适配体链置换探针的筛选及应用。本发明公开了FB1核酸适配体链置换探针的筛选，为后续基于FB1核酸适配体链置换探针的信号放大传感技术研发奠定了基础。基于该链置换探针的FB1荧光偏振检测技术采用FB1核酸适配体作为分子识别元件，与基于抗体的免疫检测技术相比，具有成本低廉、特异性高的特点，且该技术为均相检测技术，重现性好，操作简单方便且可实现大量样品的平行检测，有助于建立适合我国国情的农产品伏马毒素监控技术体系，满足当前我国对农产品伏马毒素污染监控关键技术的迫切需要，对保障农产品消费安全和人民生命健康意义重大，应用前景广阔。

Description

伏马毒素B1核酸适配体链置换探针的筛选及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及核酸适配体的应用与开发，具体为伏马毒素B1核酸适配体链置换探针的筛选及应用。
背景技术
伏马毒素(fumonisin)是一类主要由串珠镰刀菌产生的真菌毒素。伏马毒素主要存在于玉米及其制品中，此外还存在于大米、小麦、大麦、高粱、豌豆、芦笋、啤酒、牛奶和饲料等农产品及其加工品中。调查表明：世界各国的玉米及其制品，无论是人食用的食品还是动物用的饲料，普遍都受到伏马毒素的污染，其中玉米的污染率达60％以上。目前至少已鉴定出15种伏马毒素类似物，其中伏马毒素B1(FB1)的毒性最强。研究证实，伏马毒素可引起马脑白质软化症和猪肺水肿综合症。世界卫生组织国际肿瘤研究中心(IARC)于1993年评价了伏马毒素的毒性，并将其归类为可能的人类致癌物；国际食品法典委员会(CAC)的 JECFA最近的评价结果指出其具有肾脏毒性。农产品中存在的伏马毒素已成为相关农产品安全消费、国际贸易和现代农业产业发展的限制因素，对人的健康和畜牧业发展构成潜在危害。因此，研究建立科学先进、准确可靠的伏马毒素系列监控技术，是控制我国农产品伏马毒素污染、保障农产品安全消费和人民身体健康的迫切需求。
由于伏马毒素不具有强的紫外吸收和荧光基团，因此不像其它真菌毒素那样易于分析检测。基于抗体的免疫检测技术是真菌毒素的主流检测技术，其中作为快速检测技术的荧光偏振检测技术在国外已经比较成熟，但是其所用的FB1荧光标记物如6-(4，6-二氯三嗪基)氨基荧光素(6-DTAF)相当昂贵，导致检测成本较高，不利于该技术的大面积推广应用。
核酸适配体作为一类单链寡核苷酸，与靶分子发生特异性相互作用前后空间构象会发生相应的变化，与抗体相比具有可体外筛选获得、热稳定性好、易于化学合成和修饰等优点，甚至能区分单抗无法实现的单个取代基差别的靶分子。2010年，Maureen McKeague报道了伏马毒素B1的核酸适配体(Int.J.Mol.Sci.2010，11：4864-4881；doi:10.3390/ijms11124864)，但是针对该核酸适配体的相关应用报道较少。
针对我国农产品质量安全检测的需求，充分利用荧光偏振检测技术和核酸适配体技术的优势，本发明公开了FB1核酸适配体链置换探针的筛选，并开发了基于该链置换探针的FB1荧光偏振检测技术，有助于建立适合我国国情的农产品伏马毒素监控技术体系，满足当前我国对农产品伏马毒素污染监控关键技术的迫切需要，对保障农产品消费安全和人民生命健康意义重大，应用前景广阔。
发明内容
本发明的目的在于提供一种伏马毒素B1核酸适配体的链置换探针，并提供基于该链置换探针的伏马毒素B1荧光偏振检测方法，具有特异性高、稳定性好、经济的特点。
为实现上述目的本发明采用以下技术方案：
一种伏马毒素B1核酸适配体链置换探针，所述置换探针为一段单链寡核苷酸，其序列如 SEQ ID NO：1。
所述探针5’端修饰有FAM荧光基团。
所述探针与伏马毒素B1核酸适配体互补。
所述伏马毒素B1核酸适配体序列如SEQ ID NO：6所示。
所述伏马毒素B1核酸适配体链置换探针是通过荧光光谱法和荧光偏振法筛选的。
伏马毒素B1核酸适配体链置换探针作为玉米和小麦中伏马毒素B1的荧光偏振检测分析应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明公开了FB1核酸适配体链置换探针的筛选，为后续基于FB1核酸适配体链置换探针的信号放大传感技术研发奠定了基础。
(2)本发明开发的基于该链置换探针的FB1荧光偏振检测技术采用FB1核酸适配体作为分子识别元件，与基于抗体的免疫检测技术相比，具有非常好的特异性；同时，因核酸的合成成本非常低廉，且已经商业化，大大降低了检测FB1的成本。
(3)本发明公开的基于该链置换探针的FB1荧光偏振检测技术为均相检测技术，重现性好，且操作简单方便且可实现大量样品的平行检测，有助于建立适合我国国情的农产品伏马毒素监控技术体系，满足当前我国对农产品伏马毒素污染监控关键技术的迫切需要，对保障农产品消费安全和人民生命健康意义重大，应用前景广阔。
附图说明
图1为链置换探针筛选图；
图2为链置换探针优化筛选图；
图3为荧光光谱法评价FB1核酸适配体链置换探针的活性；
图4为荧光偏振法评价FB1核酸适配体链置换探针的活性；
图5为标准工作曲线。
具体实施方式：
一种伏马毒素B1核酸适配体链置换探针，所述置换探针为一段单链寡核苷酸，其序列如 SEQ ID NO：1所示。
所述探针5’端修饰有FAM荧光基团。
所述探针与伏马毒素B1核酸适配体互补。
所述伏马毒素B1核酸适配体序列如SEQ ID NO：6所示。
所述伏马毒素B1核酸适配体链置换探针是通过荧光光谱法和荧光偏振法筛选的。
伏马毒素B1核酸适配体链置换探针作为玉米和小麦中伏马毒素B1的荧光偏振检测分析应用。
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明，具体步骤如下：
本发明中所用的FB1核酸适配体序列为2010年Maureen McKeague报道的FB1核酸适配体其序列如SEQ ID NO：6所示。与该核酸适配体互补的单链寡核苷酸序列的设计原则为：一方面要保证室温条件下杂交复合物不能解链；另一方面要保证FB1与核酸适配体结合时，能将荧光基团修饰的单链寡核苷酸片段竞争下来。
利用生物学在线计算软件(http://unafold.rna.albany.edu/)，在1×反应缓冲溶液条件下，温度参数设为37℃，DNA浓度设置为0.1uM，计算单链寡核苷酸片段与核酸适配体杂交的融链温度Tm，要求25℃≤Tm≤60℃。实验中所设计的所有单链寡核苷酸片段如表1所示， 5’端均修饰有FAM荧光基团；FB1核酸适配体及其他荧光修饰探针均由上海生工公司合成； FB1购于PRIBOLAB公司，磁性纳米粒子(直径1μm)购于郑州英诺生物科技有限公司。
表1实验中所设计的单链寡核苷酸片段
探针名称 序列(5'to3') 碱基数 Tm*/℃ 修饰
CP1 AATTGAATAAGCTGGTA 17 47.1 5'FAM
CP2 TATAAGGTAATGCGATT 17 49.8 5'FAM
CP3 GTAATTGAATAAGCTGG 17 49.1 5'FAM
CP4 CTGGTATGTGCAGAC 15 51.1 5'FAM
CP5 ACTTACTATCTAATTGAATAAG 22 51.1 5'FAM
CP6 AATTGAATAAGCTGGTA 17 50.2 5'FAM
CP7 AATTGAATAAGCT 13 37.3 5'FAM
CP8 GTAATGCGATT 11 35.6 5'FAM
CP9 GCTGGTATAAG 11 34.5 5'FAM
CP10 ACGTAATTGAATAA 14 37.4 5'FAM
CP11 GGTATGTGCAG 11 40.9 5'FAM
CP12 CACTTACTATCT 12 33.4 5'FAM
CP4-1 AAGCTGGTATGTGCA 15 52.6 5'FAM
CP4-2 AATAAGCTGGTATGT 15 46.2 5'FAM
CP10-1 GCAGACGTAATTGAA 15 49.9 5'FAM
CP10-2 TGTGCAGACGTAATT 15 49.9 5'FAM
CP10-3 GTATGTGCAGACGTA 15 51.3 5'FAM
*：Tm计算利用在线软件http://unafold.rna.albany.edu/，参数设置：DNAat 37℃，[DNA]＝1e-7 M，[Na+]＝0.105M，[Mg2+]＝0.003M。
1×反应缓冲溶液溶解的FB1核酸适配体储备液用之前经95℃5min，冰水浴5min处理。首先将FB1核酸适配体与荧光素修饰的链置换探针杂交形成杂交复合物，然后利用亲和素-生物素相互作用将该复合物组装到磁性纳米粒子表面。充分洗涤后用50nM的FB1标准溶液于 37℃温度下轻轻震荡孵育20min，进行竞争反应。同时设置已腈/水比例为1:1的混合溶液作为空白对照。离心取上清测量溶液的荧光强度。激发光波长为488nm，发射光波长为520nm。
活性链置换探针的判断标准为：FB1存在的情况下，荧光基团修饰的链置换探针能够从磁性纳米粒子上解离，上清的荧光强度较强；FB1不存在的情况下，荧光基团修饰的链置换探针不能从磁性纳米粒子上解离，上清的荧光强度较弱或无荧光。据此判断链置换探针的活性。结果如图1所示，初步筛选结果显示，CP4和CP10效果较好：CP4反应前后，上清荧光强度变化大约1200a.u.；CP10反应前后，上清荧光强度变化大约1400a.u.。由此可见，链置换探针CP4和CP10在最佳反应条件下既能与FB1核酸适配体稳定杂交，即在没有FB1存在的时候，杂交复合物不会轻易解离，因此磁分离之后上清的荧光强度比较弱；同时，这两条链置换探针又不影响FB1与核酸适配体的结合，即在FB1存在时，FB1与核酸适配体的结合能够轻松将其置换下来，因此磁分离之后上清的荧光强度有所增强。据此判断，链置换探针CP4和CP10活性较好，并用于进一步的优化。通过对链置换探针CP4和CP10的进一步截短、序列优化，我们设计了CP4-1、CP4-2、CP10-1、CP10-2、CP10-3等链置换探针，实验结果如图2所示。链置换探针CP4-2反应前后，上清荧光强度变化大约3000a.u.，荧光增强大约6 倍，活性最好。
(1)荧光光谱法评价FB1核酸适配体链置换探针的活性
利用亲和素-生物素相互作用将FB1核酸适配体与链置换探针的杂交复合物组装到磁性纳米粒子表面，充分洗涤后加入200μL含有终浓度为50nM FB1的1×反应缓冲溶液，于37℃温度下进行竞争反应20min，离心取上清测量溶液的荧光强度，激发光波长为488nm，发射光波长为520nm。同时设置已腈/水比例为1:1的混合溶液作为对照。由图3可知，FB1核酸适配体链置换探针有很高的活性：在没有FB1存在的时候，杂交复合物不会轻易解离，因此磁分离之后上清的荧光强度比较弱；在FB1存在时，FB1与核酸适配体的结合能够轻松将其置换下来，因此磁分离之后上清的荧光强度明显增强。
(2)荧光偏振法评价FB1核酸适配体链置换探针的活性
FB1核酸适配体储备液用之前经过95℃5min，冰水浴5min处理一下。然后将FB1核酸适配体和FB1链置换探针按照终浓度1:1的比例杂交：5μM FB1核酸适配体2μL，5μM FB1链置换探针2μL，10×反应缓冲溶液(200mM Tris，1M NaCl，20mM MgCl2，50mM KCl， 10mMCaCl2，pH 7.6)20μL，加纯净水调整反应体系的总反应体积到200μL。将反应混合物于37℃温度下杂交1h。然后，取10μL上述杂交复合物，100μL 10×反应缓冲溶液到一次性荧光偏振玻璃试管中，最后用纯净水稀释到1mL，混合均匀，测量反应体系的初始荧光偏振值P0。加入50nM的FB1标准溶液反应后，再测量一次反应体系的荧光偏振值P。同时设置已腈/水比例为1:1的混合溶液作为对照。由图4可知，FB1核酸适配体链置换探针有很高的活性：在没有FB1存在的时候，荧光标记杂交复合物不会轻易解离或者只有极少部分解离，因此反应前后复合物的分子量几乎没有变化，所以反应前后体系的ΔP值非常小；在FB1存在时，FB1与核酸适配体的结合能够轻松将CP4-2链置换探针置换下来，形成游离的荧光标记CP4-2链置换探针，因反应前荧光标记杂交复合物的分子量较大，反应后游离的荧光标记CP4-2链置换探针的分子量较小，所以反应前后体系的ΔP值比较大。
一种FB1核酸适配体链置换探针在检测玉米样品中伏马毒素B1上的应用，将该链置换探针应用于FB1的荧光偏振检测分析，具体步骤如下：
(1)玉米样品中FB1的提取：称取20g已粉碎的玉米样品，加入100mL磷酸盐缓冲液，振荡提取1h，过滤，滤液样品备用。
(2)杂交复合物的制备：FB1核酸适配体储备液用之前经过95℃5min，冰水浴5min处理一下。5μM FB1核酸适配体2μL，5μM FB1链置换探针2μL，10×反应缓冲溶液(200mMTris，100M NaCl，20mM MgCl2，50mM KCl，10mM CaCl2，pH 7.6)20μL，加纯净水调整反应体系的总反应体积到200μL。将反应混合物于37℃温度下杂交1h，室温下放置备用。
(3)检测步骤：
①反应前，体系荧光偏振值P0的测量：取10μL上述杂交复合物，100μL 10×反应缓冲溶液到一次性荧光偏振玻璃试管中，最后用纯净水稀释到1mL，混合均匀，测量反应体系的初始荧光偏振值P0。
②反应后，体系荧光偏振值P的测量：10μL上述杂交复合物，100μL 10×反应缓冲溶液， 50μL 0-200nM的FB1靶标溶液或者100μL样品滤液，用1×反应缓冲溶液稀释到1mL，混合均匀，37℃下反应20min，测量反应体系的最终荧光偏振值P。
最终，用P对标准溶液中FB1浓度作图获得工作曲线如图5所示，未知样品中FB1所产生的荧光强度的变化值与工作曲线对照确定其浓度。

Claims (2)

1.一种伏马毒素B1核酸适配体链置换探针，其特征在于：所述链置换探针为一段单链寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO：1所示，所述探针5’端修饰有FAM荧光基团；
所述探针与伏马毒素B1核酸适配体互补。
2.权利要求1所述伏马毒素B1核酸适配体链置换探针作为玉米和小麦中伏马毒素B1的荧光偏振检测分析应用；
将权利要求1所述的链置换探针应用于FB1的荧光偏振检测分析，具体步骤如下：
（1）玉米样品中FB1的提取：称取20 g已粉碎的玉米样品，加入100 mL 磷酸盐缓冲液，振荡提取1 h，过滤，滤液样品备用；
（2）杂交复合物的制备：FB1核酸适配体储备液用之前经过95℃ 5 min，冰水浴5 min处理一下；5 μM FB1核酸适配体2 μL，5 μM权利要求1所述的FB1链置换探针2 μL，10×反应缓冲溶液20 μL，加纯净水调整反应体系的总反应体积到200 μL；将反应混合物于37℃温度下杂交1 h，室温下放置备用；
（3）检测步骤：
①反应前，体系荧光偏振值P0的测量：取10 μL上述杂交复合物，100 μL 10×反应缓冲溶液到一次性荧光偏振玻璃试管中，最后用纯净水稀释到1 mL，混合均匀，测量反应体系的初始荧光偏振值P0；
②反应后，体系荧光偏振值P的测量：10 μL上述杂交复合物，100 μL 10×反应缓冲溶液，50 μL 0-200 nM的FB1靶标溶液或者100 µL样品滤液，用1×反应缓冲溶液稀释到1 mL，混合均匀，37℃下反应20min，测量反应体系的最终荧光偏振值P。
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